Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

Озерова, Светлана Геннадиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца"

ОЗЕРОВА Светлана Геннадиевна

003469071

Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

Специальность 03.00.2S - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4

Москва - 2009

003469071

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Минин Андрей Александрович

доктор биологических наук Шарова Наталья Петровна

доктор биологических наук Катруха Алексей Генрихович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Защита диссертации состоится 20 мая 2009 г. в ' J ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26. http://idbras.comcor.ru/ e-mail: idbras@bk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26).

Автореферат разослан 20 апреля 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, п уУ /

кандидат биологических наук J&f/c/ ^.Б. Абрамова

e-mail: ele0806@vandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Под активацией яйцеклетки в широком смысле понимают переход из состояния покоя к развитию. Активация происходит в процессе оплодотворения. Вопрос о том, какие клеточные и молекулярные механизмы задействованы в активации яйцеклетки, изучается на протяжении многих лет на самых разных живых объектах.

Для рыб характерно внешнее осеменение, при котором половые клетки выводятся в водную среду, где и происходит их слияние. Если осеменение не произошло, в неоплодотворенном яйце начинаются некоторые изменения, аналогичные происходящим при нормальном развитии, в частности повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция, экзоцитоз кортикальных гранул, образование оболочки оплодотворения. Для обозначения этого явления в литературе используются термины «спонтанная активация», «автоактивация». Природа включения спонтанной активации яйца рыб, равно как и активации при оплодотворении, остается неясной.

Изучение спонтанной активации имеет важное значение при решении некоторых проблем рыборазведения. Искусственное разведение рыб предполагает в качестве одной из задач разработку методов получения зрелых половых продуктов и проведение искусственного оплодотворения. Проблема сохранения у яйца способности к оплодотворению осложнена тем, что при попадании в водную среду икра рыб спонтанно активируется и теряет эту способность. В связи с этим особенно актуальным представляется изучение природы сигналов активации, а также возможности (механизмов) их ингибирования.

Разнообразные сигнальные процессы, приводящие к активации яйцеклетки, в настоящее время широко исследуются с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии. Главное внимание в этих работах уделяется сигнальной роли ионов кальция при активации. Повышение концентрации ионов кальция в яйце при активации может указывать на их роль в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул, как одного из типов секреции.

кортикальном слое яйца. Разные типы гранул имеют различную чувствительность к веществам, вызывающим искусственную активацию яйцеклеток. Для некоторых видов рыб отмечено, что при активации кальциевая волна ни по времени, ни пространственно не совпадает с экзоцитозом кортикальных гранул. Все это делает актуальным изучение возможной роли диацилглицеринового сигнального пути в активации яйца рыб.

Единым механизмом реализации кальциевого сигнала в клетке является связывание ионов кальция при повышении их концентрации с белками. Изучение состава и свойств кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке и обеспечивающих кальциевую сигнализацию, позволит расширить представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих протекание процесса активации у рыб.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение клеточных и молекулярных механизмов активации яйцеклетки рыб, определяющей начало включения программы развития. Изучались сигнальные процессы, приводящие к активации яйца, а также компоненты яйцеклетки, обеспечивающие ее реализацию.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать роль подмембранного актинового цитоскелета в процессе спонтанной активации, в частности в экзоцитозе кортикальных гранул.

2. Исследовать влияние форболовых эфиров на процесс образования оболочки оплодотворения у двух карповых рыб: вьюна (Л/лу^г/гаад/о.ш'/к,) и данио (ВгасИус/апю гепо).

3. Исследовать влияние состава среды инкубации на активацию яйцеклеток вьюна (Мк^гпт /ои/7«) и данио (ВгасИус1ато гепо), а также влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению у яйцеклеток данных видов рыб.

4. Исследовать влияние искусственного изменения концентрации ионов кальция на процесс формирования оболочки оплодотворения у вьюна.

5. Идентифицировать кальцийсвязывающие белки, присутствующие в ооцитах данио.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе впервые показано, что ингибиторы протеаз лейпептин и апротинин подавляют процесс спонтанной активации у рыб. Полученные данные открывают возможность для создания искусственных сред, позволяющих длительное время сохранять икру рыб, способную к оплодотворению, что представляет большой практический интерес для развития аквакультуры.

Также впервые установлено активирующее действие форболовых эфиров на процесс формирования оболочки оплодотворения у яйцеклетки рыб.

Был разработан микрометод выделения кальцийсвязывающих белков.

Протеомный анализ выделенных белков с использованием масс-спектрометрии позволил впервые идентифицировать в виде запасенных белков ооцита аннексины А5, А13.1, Ala, А2а и белок копии III, содержащий С2-калыдайсвязывающий домен.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза» (Москва, 2001); конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2004); конференции «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ: 4 статьи в рецензируемых журналах и тезисы двух докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (203 источника). Работа содержит 17 рисунков и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структура кортикального слоя неоплодотворенной яйцеклетки вьюна и ее изменения при спонтанной активации

Строение кортикального (поверхностного) слоя цитоплазмы яйцеклеток различается у разных видов рыб, что сказывается на особенностях протекания экзоцитоза кортикальных гранул в процессе активации. Структура кортикального слоя и кортикальных гранул яйца вьюна ранее описаны не были. На первом этапе мы изучали микроструктуру кортикального слоя яйца вьюна и ее изменения, происходящие при активации яйцеклетки в воде. Прижизненные наблюдения активированной яйцеклетки сочетались с изучением световых и электронных фотографий кортикальной области яйца до и после активации.

На рисунке 1 представлена фотография неактивированного яйца вьюна, находящегося в полостной жидкости, и того же яйца после 10 минут инкубации в воде. Неактивированное яйцо вьюна достигает 1,2 мм в диаметре, яйцевая оболочка плотно примыкает к поверхности яйца (рис. 1А). Оболочка яйца состоит из хорошо развитой zona raáiata, толщина которой составляет примерно 4 мкм, и примыкающей к ней наружной оболочки ворсинчатого строения (рис. ЗА). При высоком увеличении можно видеть узкое щелевидное пространство толщиной около 0,4 мкм между плазматической мембраной и zona radiata - перивителлиновое пространство, в котором находятся микроворсинки, отходящие от поверхности яйца (рис. ЗА, Б).

В периферическом слое цитоплазмы зрелых неактивированных яиц вьюна содержатся секреторные органеллы - кортикальные гранулы, которые представляют собой пузырьки округлой или овальной формы диаметром от 4 до 25 мкм, окруженные мембраной, расположенные в один ряд. Гранулы разного размера распределены случайным образом. При этом в области анимального полюса присутствуют лишь единичные ранулы мелкого размера (рис. 2А).

При помещении неактивированного яйца вьюна в воду происходит экзоцитоз кортикальных гранул. При этом содержимое гранул выделяется под оболочку яйца и обводняется, что приводит к расширению перивителлинового пространства, которое при малом увеличении выглядит как прозрачная зона, отделяющая яйцевую оболочку от поверхности плазматической мембраны на значительное расстояние (рис. 1Б). За счет увеличения перивителлинового пространства, а также в результате набухания размеры активированного яйца увеличиваются до 1,7 мм в диаметре (рис. 1Б).

Рис. 1. Образование оболочки оплодотворения у яйца вьюна при активации в воде. (А) - неактивированное яйцо вьюна в полостной жидкости. (Б)- яйцо вьюна через 10 минут после инкубации в воде. Масштабная линейка 1мм (А, Б).

На электронных фотографиях видно, что кортикальные гранулы, митохондрии и частицы диаметром 25-30 нм (по-видимому, рибосомы) отделены от плазматической мембраны яйца слоем фибриллярного материала толщиной 0,05-0,15 мкм (рис. ЗА, Б), который представляет собой сеть актиновых микрофиламентов.

На полутонких срезах яйца, инкубированного 10 минут в воде, в периферическом слое цитоплазмы кортикальные гранулы отсутствуют (рис. 2Б). Толщина слоя актиновых микрофиламентов составляет 0,15-0,3 мкм (рис. ЗГ), что превышает толщину этого слоя в неактивированном яйце (рис. ЗА).

Рис. 3. Влияние инъекции фаллоидина на толщину

подмембранного цитоскелета.

(А, Б) - подмембранная область интактного неактивированного яйца вьюна. (В)- подмембранная область яйца вьюна в месте инъекции 10 нл фаллоидина (1 мг/мл). (Г)-подмембранная область интактного яйца вьюна через 10 минут инкубации в воде. Стрелками и скобкой обозначена толщина слоя актиновых микрофиламентов. КГ - кортикальные гранулы. ZR- zona radia/a. Масштабная линейка 1 мкм (А, В, Г). Масштабная линейка 0,5 мкм (Б).

Рис. 2. Полутонкие срезы яйца вьюна. (А) - интактное неактивированное яйцо вьюна в полостной жидкости. (Б) -интактное яйцо вьюна через 10 минут инкубации в воде. Кортикальные гранулы показаны стрелками. Ап - анимальный полюс яйца. Масштабная линейка 0,1 мм (А, Б).

Влияние изменения концентрации ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцеклетках вьюна

Участие ионов кальция в процессе экзоцитоза кортикальных гранул у вьюна мы изучали путем искусственного изменения концентрации ионов кальция в яйце. В первом варианте опытов в неоплодотворенное яйцо инъецировали раствор хелатора этих ионов- ЭГТА. Во втором случае инъецировали растворы, содержащие разные концентрации свободных ионов кальция. Об экзоцитозе кортикальных гранул судили по отхождению оболочки оплодотворения в месте инъекции, которое наблюдали под бинокулярной лупой.

В яйцеклетку вьюна инъецировали 10 нл PIPES буфера, содержащего 20 мМ ЭГТА и инкубировали 5 минут в полостной жидкости. В процессе инкубации каких-либо изменений морфологии яйцеклетки отмечено не было. Затем яйцо помещали в воду. При этом в месте инъекции ЭГТА образование оболочки оплодотворения не происходило (рис. 4Б), что мы объясняем локальным подавлением в этой области экзоцитоза кортикальных гранул. В качестве контроля в неактивированное яйцо вьюна инъецировали 10 нл 100 мМ PIPES буфера и затем активировали в воде. При этом происходило отделение оболочки оплодотворения по всей поверхности яйца (рис. 4А).

Во втором варианте опыта в неактивированное яйцо вьюна инъецировали 10 нл раствора, содержащего 2 мМ свободного кальция. Яйцо инкубировали в полостной жидкости. При этом наблюдалось локальное образование оболочки оплодотворения в области инъекции (рис. 4В). Активация была локальной даже при инъекции большой концентрации кальция - 10 нл буфера, содержащего 10 мМ свободного кальция (рис. 4Г). Если такие частично активированные большой концентрацией кальция яйца помещались в воду, то оболочка оплодотворения отделялась по всей поверхности яйца.

Тот факт, что инъекция кальция в неоплодотворенное яйцо, находящееся в полостной жидкости, вызывала локальное образование оболочки оплодотворения, может указывать на взаимосвязь между повышением концентрации ионов кальция и экзоцитозом кортикальных гранул. Однако обращает на себя внимание то обстоятельство, что при инъекции кальция образования оболочки оплодотворения по всей поверхности яйца не происходит.

Рис. 4. Влияние инъекции ЭГТА и Са2+ на экзоцитоз кортикальных гранул и активацию яйца. (А) - яйцо, инъецированное 10 нл 100 мМ PIPIES буфера, инкубированное 5 минут в полостной жидкости и активированное в воде (контроль). (Б) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с ЭГТА (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, рН 7,2), инкубированное 5 минут в полостной жидкости и активированное в воде. (В)- яйцо, инъецированное 10 нл буфера с 2 мМ свободного кальция (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, 22 мМ СаС12, рН 7,2), инкубированное 10 минут в полостной жидкости. (Г)- яйцо, инъецированное 10 нл буфера с 10мМ свободного кальция (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, 30 мМ СаСЬ, рН 7,2), инкубированное 10 минут в полостной жидкости, (о)-место инъекции. Масштабная линейка 1 мм.

Участие актиновых микрофиламентов в активации яйца: влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул у вьюна

Исследования, проводившиеся ранее в нашей лаборатории, выявили, что у вьюна в кортикальном слое яйца расположена сеть актиновых микрофиламентов, состоящая из гамма-актина. В ряде работ на соматических секреторных клетках было показано, что для слияния секреторных гранул с плазматической мембраной необходима реорганизация кортикального слоя актиновых филаментов (Aunis, Bader, 1988; Cheek, Burgoyne, 1987).

В своей работе мы исследовали роль актиновых филаментов в процессе экзоцитоза кортикальных гранул в яйце вьюна с помощью микроинъекций фаллоидина - вещества, предотвращающего деполимеризацию фибриллярного актина.

В неактивированное яйцо инъецировали раствор фаллоидина в 2-4% DMSO (диметилсульфооксид). Концентрация фаллоидина составляла 0,1; 1 и 2 мг/мл. Инъецированные яйца инкубировали 5 минут в полостной жидкости, затем помещали в воду. О влиянии фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул судили по образованию оболочки оплодотворения в месте инъекции, которое наблюдали под бинокулярной лупой при малом увеличении.

Процесс экзоцитоза и реорганизацию кортикального слоя яйца регистрировали также на ультраструктурном уровне с использованием световой и электронной микроскопии области инъекции.

В качестве контроля в неактивированное, находящееся в полостной жидкости яйцо инъецировали 10 нл 2% или 4% ЭМБО. Затем яйца переносили в воду, при этом по всей поверхности яйца наблюдалось равномерное образование оболочки оплодотворения.

При инъекции 10 нл раствора фаллоидина в концентрации 0,1 и 1 мг/мл после активации яйца в воде наблюдалось локальное подавление образования оболочки оплодотворения в месте инъекции (рис. 5В, Г). На рисунке 5 видно, что яйцевая оболочка отделяется от поверхности плазматической мембраны по всей поверхности яйца, кроме области действия фаллоидина, размеры которой определяются количеством введенного вещества.

На полутонких срезах видно, что в области инъекции фаллоидина (левая часть яйца на рис. 5Д) экзоцитоз кортикальных гранул подавлен. Кортикальные гранулы располагаются в основном под плазматической мембраной, а некоторая часть их - в виде небольших скоплений во внутренней части яйца (рис. 5Д). В интактной области яйца (правая половина среза на рис. 5Д) кортикальные гранулы отсутствуют, что указывает на их нормальный экзоцитоз.

При инъекции больших доз фаллоидина (20 нл, 2 мг/мл) на электронных микрофотографиях можно наблюдать непрерывный слой кортикальных гранул на некотором расстоянии от плазматической мембраны (рис. 5Е).

Толщина слоя актиновых микрофиламентов в области инъекции фаллоидина составляла 0,4-1,5 мкм (рис. ЗБ), что существенно выше по сравнению с толщиной этого слоя в неактивированном яйце, равной 0,05— 0,15 мкм (рис. ЗА).

В ходе проведенных экспериментов нами было выявлено локальное подавление экзоцитоза кортикальных гранул в месте инъекции фаллоидина. Полученные данные позволяют предполагать, что в неактивированном яйце актиновые микрофиламенты могут служить барьером, препятствующим экзоцитозу кортикальных гранул. В процессе спонтанной активации, как и при оплодотворении, вероятно, происходит реорганизация и временное разрушение этого барьера.

Результаты наших исследований вполне согласуются с исследованиями, проведенными на соматических секреторных клетках, в которых было показано, что реорганизация подмембранного актинового цитоскелета обеспечивает секреторным гранулам свободный доступ к месту экзоцитоза на плазматической мембране.

Рис. 5. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул. (А) - неактивированное яйцо в полостной жидкости; (Б) -яйцо через 10 минут после инкубации в воде; (В, Г) - яйца, инъецированные фаллоидином: (В) - 10 нл, 1 мг/мл и (Г) - 10 нл, 0,1 мг/мл. (Д)- полутонкий срез яйца, инъецированного 10 нл фаллоидина (1 мг/мл). (Е) - полутонкий срез яйца, инъецированного 20 нл фаллоидина (2 мг/мл). (о) - место инъекции. Стрелками обозначены кортикальные гранулы (Д, Е).

Влияние ингибиторов протеаз лейпептина и апротинина на спонтанную активацию яйца вьюна и данио и на их последующую способность к оплодотворению

При нересте попадающая во внешнюю водную среду икра разных видов рыб через определенное время теряет способность к оплодотворению. Это связано со спонтанной активацией яйца, сопровождающейся образованием оболочки оплодотворения. В экспериментальных условиях, при выдерживании икры в какой-либо искусственной среде или в полостной жидкости, она также может утрачивать способность к оплодотворению. Характеристики процесса спонтанной активации: время активации, состав солевой среды, компоненты, предотвращающие спонтанную активацию, -значительно варьируют у разных видов рыб. В нескольких работах показана защита яйца данио от спонтанной активации в солевых физиологических растворах с декстрозой и БСА (Becker, Hart, 1999; Lee et al., 1999).

Мы изучали способность сред разного состава предотвращать спонтанную активацию яйцеклеток двух видов рыб - вьюна и данио. Для этого небольшие порции икры вьюна и данио в течение 10 минут инкубировали в средах разного состава, а также в полостной жидкости вьюна и сыворотке крупного рогатого скота. Активацию оценивали по образованию оболочки оплодотворения. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Табл. 1. Влияние сред разного состава на образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио

Название среды Вьюн *) Данио *) Источник

Раствор Рингера для золотой рыбки 4- 4- Ivanenkov et al., 1990, собственные данные

Бескальциевый раствор Рингера 4- Ivanenkov et al., 1990, собственные данные

РНХЭ + декстроза + + Becker К.А., Hart N.H., 1999, собственные данные

РВЗЗ + альбумин 4- 4- Lee K.W. et al, 1999, собственные данные

НЕЖБ 4- 4- Собственные данные

Сыворотка крупного рогатого скота - - Собственные данные

Полостная жидкость - - Собственные данные

*) Знаком (+) обозначены среды, в которых через 10 минут инкубации наблюдалось образование оболочки оплодотворения более чем у 90% яиц, знаком (-) - те, в которых в течение данного времени оболочка не образовывалась.

Как видно из таблицы, активация икры вьюна и данио не происходила только при инкубации в полостной жидкости и в сыворотке крупного рогатого скота, ингибирующее активацию действие которых сохранялось даже при разведении в 10 раз. Некоторые из полученных нами данных отличаются от литературных. Возможно, несовпадение результатов объясняется обнаруженным нами эффектом полостной жидкости сохранять свои ингибирующие свойства при разведении. Неоплодотворенные яйцеклетки рыб при их получении в лабораторных условиях погружены в полостную жидкость. При любых манипуляциях с яйцеклетками отделить их полностью от полостной жидкости, не повредив, невозможно. Если икру инкубировать в небольших объемах солевой среды, то ингибирующий эффект может быть обусловлен не составом среды инкубации, а действием веществ полостной жидкости. При постановке экспериментов мы брали количество тестируемой среды, более чем в 10 раз превосходящее объем взятой в опыт икры. В работах, из которых мы брали рецепты сред, количественные параметры разведения икры, к сожалению, не приводятся.

Мы также исследовали влияние ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц вьюна и данио. Были использованы ингибиторы протеаз широкого действия и разной природы - лейпептин, низкомолекулярный ингибитор, и апротинин, белковый ингибитор протеаз. Влияние ингибиторов на процесс спонтанной активации оценивали по образованию оболочки оплодотворения.

Небольшие порции икры вьюна (30-50 икринок) инкубировали в солевом растворе HENKS с концентрациями лейпептина от 0,005 до 1мМ. В качестве контроля икру в тех же условиях инкубировали в растворе HENKS без лейпептина. При инкубации неоплодотворенной икры с различными концентрациями лейпептина более 90% икринок в каждой порции оставались неактивированными (у этих икринок мы не наблюдали образования оболочки оплодотворения). В контроле через 10 минут все яйца активировались. Столь же высокий процент неактивированных яиц (около 90%) был отмечен и при увеличении времени инкубации икры в среде с ингибитором до двух часов.

Нами был экспериментально рассмотрен вопрос, сохраняет ли икра, инкубированная в солевой среде с лейпептином, способность к оплодотворению и дальнейшему развитию. Для этого небольшие порции икры, полученной от разных самок вьюна, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов в растворе HENKS с различными концентрациями лейпептина от 0,005 до 1 мМ. В качестве контроля икру от тех же самок при тех же условиях инкубировали 2 часа в полостной жидкости вьюна. Затем икру в опыте и контроле оплодотворяли. Подсчет развивающихся зародышей производили через 24 часа после оплодотворения. Результаты опытов представлены на рисунке 6.

20 -У 0 ■

<? Л?

> 100 -90 -80 -70 -60 -50 -40 30 -20 -10 -

мМ

80 -60 -I

40 20 0

О- о

^ ^ с

л? ^

мМ

% 10080 -60 -40 -

20-Н 0 -

^ „.Ф.Ф.Ф (У? 14 мМ

Рис. 6. Выживаемость зародышей вьюна, полученных из икры, инкубированной перед оплодотворением с различными концентрациями лейпептина.

Процент выживших зародышей в опыте и контроле рассчитывали по формуле Ыж./ТЧобщ. Иобщ. - количество икринок в пробе. Иж. - количество зародышей, выживших через 24 часа после оплодотворения. В контрольных опытах икру инкубировали в полостной жидкости, так как в растворе НЕЫКБ без ингибиторов протеаз икра вьюна в течение 10 минут полностью активируется и теряет способность к оплодотворению. Цифрами 1, 2, 3, 4 обозначены порции икры от разных самок.

При инкубации неоплодотворенной икры вьюна в растворе НЕМКБ с 1 мМ лейпептина в течение суток 95-100% яиц оставались неактивированными, но при этом икра полностью утрачивала способность к оплодотворению.

Для изучения влияния апротинина на спонтанную активацию яиц вьюна использовали следующие концентрации ингибитора: 1; 0,5 и 0,25 мг на 1 мл среды. Было показано, что апротинин в указанных концентрациях предотвращает спонтанную активацию яиц вьюна. При концентрации

апротинина 1 мг на 1 мл среды 85% яиц вьюна сохраняли способность к оплодотворению.

Аналогичные эксперименты были проведены на икре данио. Лейпептин в концентрации 1мМ также предотвращал спонтанную активацию икры данио. В то же время апротинин в концентрации 1мг на 1мл среды не оказывал ингибирующего эффекта на процесс спонтанной активации яиц данио.

Различия в действии апротинина на процесс спонтанной активации икры вьюна и данио можно объяснить разной доступностью и особенностями структуры протеаз-мишеней в яйце разных видов рыб. Видоспецифичность действия других ингибиторов протеаз на сохранение яйцом способности к оплодотворению была отмечена и в работах на золотой рыбке и радужной форели (Hsu, Goetz, 1993; Coffman, Goetz, 2000).

Влияние форболовых эфиров на образование оболочки оплодотворения у вьюна

Повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция рассматривают как триггер многих внутриклеточных процессов при активации. В своей работе мы изучали зависимость процесса активации не только от ионов кальция, но и от активности протеинкиназы С (РКС). Искусственными активаторами РКС являются форболовые эфиры, структурные аналоги диацилглицеролов. С помощью этих веществ исследуется роль РКС в самых разных внутриклеточных процессах. Так, было показано, что форболовые эфиры вызывают активацию яйцеклеток шпорцевой лягушки (Bernent, Capeo, 1989; Grandin, Charbonneau, 1991) и млекопитающих (Sun et al., 1997). Данные о влиянии форболовых эфиров на процесс активации яйца рыб в литературе отсутствуют.

Для изучения влияния форболовых эфиров на активацию яиц вьюна необходимо было в первую очередь найти среду инкубации, в которой не идет спонтанная активация. Поэтому небольшие порции зрелой неоплодотворенной икры вьюна и данио инкубировали в течение 10 минут в 2 мл полостной жидкости. Затем в полостную жидкость добавляли один из форболовых эфиров: ТФА (12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат), ФДБ (форбол-12,13-дибутират) и РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) до концентрации 0,1-1 мкМ. Процесс активации оценивали по образованию оболочки оплодотворения. Примерно через 5 минут после добавления к икре любого из форболовых эфиров у 90-95% яйцеклеток как вьюна, так и данио наблюдалось образование оболочки оплодотворения. При этом активация под действием форболовых эфиров происходила несколько медленнее, чем в воде, что может указывать на разнокачественность процессов, происходящих в том и другом случаях.

Неактивированную икру вьюна инкубировали также 10 минут в 2мл раствора HENKS с 1 мМ лейпептина. Затем в пробу добавляли РМА до

концентрации 0,1-1 мкМ, что вызывало образование оболочки оплодотворения у 95% инкубированных икринок.

Обнаруженная нами активация икры рыб под действием форболовых эфиров, позволяет предположить, что процесс формирования оболочки оплодотворения может идти с участием РКС, при этом действие ее осуществляется на более поздних этапах сигнальных путей относительно процессов, связанных с активностью протеаз.

Идентификация кальцийсвязывающих белков

Включение программы развития в яйце, т.е. его активация, предполагает наличие в нем всех необходимых компонентов, запасенных в процессе оогенеза. Одним из универсальных сигнальных механизмов активации яйца у самых разных видов животных является кратковременное повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция. В частности, результаты наших экспериментов указывают на участие ионов кальция в процессе образования оболочки оплодотворения при активации у вьюна.

Роль ионов кальция в передаче сигналов в клетке определяется исключительно их взаимодействием с различными кальцийсвязывающими белками. Поэтому одной из задач наших исследований стало изучение кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке рыб.

Ранее в нашей лаборатории было показано наличие в яйцеклетках вьюна кальцийсвязывающих белков: кальмодулина и S100, относящихся к суперсемейству EF-hand-содержащих белков (Ivanenkov et al., 1993). Были начаты исследования кальцийсвязывающих белков семейства аннексинов у вьюна. Мы продолжили исследования белков группы аннексинов у рыб на другом лабораторном объекте - данио, для которого мог быть применен метод идентификации белков с использованием масс-спектрометрии. Этот подход применим только в том случае, если имеются данные по массам триптических пептидов, полученные на основе известной аминокислотной последовательности исследуемого белка. Переход на новый объект был обусловлен тем, что, в отличие от вьюна, геном данио известен, аннотированы гены аннексинов, известна полная аминокислотная последовательность этих белков.

Общим молекулярным свойством аннексинов является их способность обратимо связываться с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция in vitro. На основе этого их свойства нами был разработан микрометод выделения аннексинов из ооцитов данио. Идентификацию выделенных белков проводили по следующей схеме: из ооцитов данио выделяли кальцийсвязывающие белки. Смесь белков разделяли методом одномерного либо двумерного электрофореза. Индивидуальные белковые пятна и полосы из гелей вырезали и исследовали методом Peptide Mass Fingerprint. При этом для повышения достоверности результатов полосу

белка одной и той же молекулярной массы из разных гелей и разных выделенных образцов белков анализировали многократно.

Масс-спектрометрический анализ белковых полос одномерного и двумерного электрофореза позволил идентифицировать в ооцитах данио аннексины А5, Ala, А2а и А13.1 и копин III (табл. 2). Причем, как видно из таблицы, аннексины А13, Al и А2 представлены только одной формой белка, хотя известно, что у данио имеются три изоформы Al и по две А2 и А13, кодируемые разными генами.

Табл. 2. Идентификация образцов белков, выделенных из зрелых ооцнтов данио кальцийзависимым переосаждением с кислыми фосфолипидами

Название белка Номер в базе Номер Значимость

данных фрагмента определения в

UniGene геля *) разных опытах (scores**)

Аннексии Ala GI|31419751 11,2 57, 100

Аннексии А2а GI|38566042 II 77,80,91, 100

Аннексии А5 GI|40254660 III, 1 151,80, 68

Аннексии А13.1 GII13397821 11,3 73, 94, 124

Копин III GI129571133 I 101,168

*) Римскими цифрами обозначены фрагменты геля двумерного фореза, арабскими - одномерного, фотографии гелей не приведены.

**) В соответствии с протоколом метода достоверно идентифицированными считаются белки, для которых значение scores выше 50 (р<0.05).

Копины относятся к суперсемейству белков, содержащих кальцийсвязывающий С2-домен. Так же, как и аннексиновый домен, С2-домен белков в присутствии ионов кальция взаимодействует с кислыми фосфолипидами мембраны. Вероятно, именно это позволило выделить белок данного семейства из гомогената ооцитов данио методом, который мы разработали для выделения аннексинов. Такой метод выделения копинов ранее не был описан.

Наличие кальцийсвязывающего белка копина III в виде запасенного белка в ооцитах показано впервые.

мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио

Одним из ранних событий, происходящих при активации яйца, является инициация белкового синтеза на запасенных в процессе оогенеза

мРНК. В ходе настоящей работы мы анализировали не только кальцийсвязывающие белки, но также их мРНК, наличие которых, наряду с запасенными белками в случае раннего включения трансляции, может обеспечивать протекание процессов, связанных с активацией.

Из ооцитов данио мы выделяли тотальную РНК и анализировали ее методом ОТ-ПЦР. В реакции использовали праймеры, специфичные к наиболее вариабельным 5'-концевым последовательностям аннексинов А13.1, А13.2 и АЗ. В ходе реакции ОТ-ПЦР для всех исследуемых аннексинов были получены одиночные ПЦР-продукты (рис. 7). Далее полосы были вырезаны из геля, образцы ДНК выделены и секвенированы. Нуклеотидные последовательности анализированных фрагментов показали их полную идентичность соответствующим участкам известных последовательностей аннексинов А 13.1, А13.2 и АЗ.

А Б

Рис. 7. Электрофорез в 2% агарозном геле ПЦР-продуктов, полученных в ходе реакции ОТ-ПЦР с использованием тотальной РНК данио и праймеров, специфичных к 5 -концевым последовательностям аннексинов: (А) - аннексина А13.1; (Б) - аннексина АЗ (1) и аннексина А13.2 (2). К- контроль. Цифрами 500, 600 обозначен размер в парах оснований маркерной ДНК.

Таким образом, мы показали наличие в ооцитах данио мРНК А13.1, А13.2 и АЗ. Аннексии А13.1 был идентифицирован в ходе работы на белковом уровне в смеси выделенных белков, а для А 13.2 и АЗ наличие белков показано не было. Вероятно, трансляция аннексинов А 13.2 и АЗ происходит на более поздних стадиях развития яйца на запасенных мРНК.

Для аннексина А13 млекопитающих в эпителиальных клетках было показано существование двух сплайс-форм белка, которые отличаются друг от друга делецией 41 аминокислитного остатка (рис. 8). То, что в ходе реакции ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными для аннексинов А13.1 и А 13.2, нами были получены одиночные полосы ПЦР-продуктов, длины которых соответствовали ожидаемому размеру, может свидетельствовать об отсутствии альтернативных сплайс-форм мРНК А13.1 и А13.2 в ооцитах данио.

AtrO

Й8 | 7S 04 I TO 33 ТЭ 6П 101 ?S IIS •Mtttfiou A 13 1 ^ * ml

I I г r

75 9* 170 33 79

08 101

I 1 fT

1935 16« lUO i£6 I5A4 «13 «04

Гея ниигкгмия A 13.1. \>вм«глма 24

AVO

UP [ 75

»70 33 79 «в IOI 75 IU 348

170 33 79 €3101 75

ГГТГ

H Г-J, , 1.0 . □ П il

9942 <083 2688 1071723 413 4251 4419 3251

«РНК IIM iHMI I I

ИЗОФОРМА &

Рис. 8. Схема экзон-интронной структуры и сайтов потенциального альтернативного сплайсинга генов аннексинов А13.1, А13.2 данио и гена А13 млекопитающих.

На рисунке представлена схема экзон-интронной структуры генов аннексина А 13.1 (А) и А 13.2 (Б) данио и А13 (В) млекопитающих, а также структура соответствующих генам мРНК. Серыми блоками обозначены экзоны, с указанием их размера (сверху). Белыми блоками обозначены интроны, с указанием их размера (снизу). Голубым цветом обозначены нетранслируемые 5' и 3' области мРНК аннексинов, красным - экзон, присутствующий только в мРНК изоформы b аннексина млекопитающих. AUG - место начала трансляции.

На рисунке 8 стрелками показано положение праймеров, с использованием которых были получены 5'-концевые последовательности кДНК аннексинов А13.1 и А13.2. Потенциальные участки альтернативного сплайсинга находятся внутри области, ограниченной праймерами.

Кроме того, на других парах праймеров нами были получены полноразмерные кДНК аннексинов А13.1 и А13.2, которым соответствовали мРНК с открытой рамкой считывания. В ходе дальнейшей работы полученная полноразмерная кДНК аннексина А13.2 была клонирована и экспрессирована в бактериальной системе.

Проведенное сравнение аминокислотных последовательностей аннексинов А13.1 и А13.2 показало высокую степень гомологии двух белков. Аминокислотные последовательности аннексинов AI3.1 и AI3.2 имеют характерную для аннексинов структуру: высокое сходство С-концевых участков и высокую вариабельность N-концевых последовательностей. Основные различия у двух аннексинов наблюдаются в N-концевых участках белков (рис. 9). Существование таких высоко гомологичных белков являться иллюстрацией широко распространенного у рыб явления дупликации генов. Такие различия, как V9-T9 и Y11-F11 могут быть связаны с теоретически предсказуемой возможностью разной постгрансляционной модификации аннексинов А13.1 и А13.2: треонин (Т) и тирозин (Y), в отличие от валина (V) и фенилаланина (F), могут фосфорилироваться разными протеинкиназами.

MGNCQPTIVPYEDFD А13.1

MGNVQPTITPFEDFD А13.2

Рис. 9. Сравнение N - концевых последовательностей аннексинов А13.1 и А13.2 данио. Красным цветом обозначены аминокислотные остатки, являющиеся потенциальными сайтами фосфорилирования.

В отличие от рыб, у млекопитающих имеется только один ген аннексина А13 и альтернативность посттрансляционной модификации может реализоваться за счет существования разных сплайс-форм белка.

Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2

Для экспрессии белка аннексина AI3.2 в клетках Е. coli была получена конструкция на основе вектора pQE30.

Рекомбинантный белок AI3.2 из лизата бактерий выделяли двумя способами: методом очистки на Ni-NTA агарозе согласно протоколу фирмы «Qiagen» и методом осаждения с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция. Второй метод использовался нами для выделения нативных белков аннексинов из ооцитов данио. Используя метод переосаждения с фосфолипидами, из лизата бактерий было выделено около 1 мг рекомбинантного белка AI3.2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных данных по влиянию ингибиторов протеаз на процесс спонтанной активации нами предложена следующая гипотеза, объясняющая механизм спонтанной активации яйца рыб. На поверхности яйца имеются протеазьг, участвующие в процессе активации яйца, возможно, за счет расщепления рецепторов, активируемых протеазами. В полостной жидкости рыб, как и в крови и тканевой жидкости, имеются эндогенные ингибиторы протеаз. При разведении полостной жидкости в условиях, когда икра попадает в водную среду во время нереста, ингибиторы перестают действовать и икра активируется протеазами. Мы предполагаем, что лейпептин и апротинин предотвращают спонтанную активацию, выполняя ту же роль, что и эндогенные ингибиторы полостной жидкости, а именно ингибируют протеазы на поверхности яйца, которые могут гидролизовать активируемые протеазами рецепторы на поверхности яйца.

В ходе проведенных экспериментов нами было показано, что форболовые эфиры в концентрации 0,1-1 мкМ вызывают образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио. Заслуживает внимания тот факт, что для яйцеклеток рыб этот эффект был обнаружен впервые. Вопрос, в какой каскад реакций и на какой именно стадии включаются форболовые эфиры в ходе процесса активации, требует дальнейшего изучения. Активирующий яйцо эффект форболовых эфиров наблюдался нами на фоне действия ингибиторов протеаз, что указывает на предшествование активирующего действия протеаз этапу, на котором действуют форболовые эфиры.

Исследование кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетках рыб, представляет особый интерес для изучения процесса активации яйца, тесно связанного с кальциевой сигнализацией. Различные кальцийсвязывающие белки в последние несколько десятилетий активно изучаются у самых разных организмов. Большое внимание уделяется белкам группы аннексинов, поскольку их внутриклеточные функции до сих пор остаются неизвестны. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце как автономной клетке является первым необходимым шагом в изучении их функций. В ходе проведенной работы нами было установлено присутствие в ооцитах данио аннексинов А5, А 13.1, А2а, Ala в виде запасенных белков, а также материнских мРНК аннексинов АЗ и А 13.2. Впервые в ооцитах данио с использованием метода масс-спектрометрии был идентифицирован белок копин 111.

Результаты данного исследования являются оригинальными, вносят значительный вклад в изучение процесса активации яйцеклетки - одной из фундаментальных проблем биологии развития и клеточной биологии.

выводы

1. Стабилизация актиновых микрофиламентов локально подавляет формирование оболочки оплодотворения и экзоцитоз кортикальных гранул в яйцеклетке вьюна при спонтанной активации.

2. Впервые показано участие форболовых эфиров, искусственных активаторов протеинкиназы С, в процессе образования оболочки оплодотворения яйца рыб.

3. Впервые показано, что ингибиторы протеаз лейпептин и апротинин подавляют процесс спонтанной активации яйцеклеток вьюна и данио, при этом сохраняя их способность к оплодотворению.

4. Искусственное повышение концентрации ионов кальция в яйце вьюна вызывает, а понижение подавляет образование оболочки оплодотворения.

5. В ооците данио впервые идентифицированы кальцийсвязывающие белки аннексины: А5, А 13.1, А2а, Ala. Показано присутствие материнской мРНК аннексинов АИЛ, А13.2 и A3.

6. Впервые в ооците данио обнаружен белок копин III, относящийся к семейству кальцийсвязывающих белков, содержащих С2-домен.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ivanenkov V.V., Minin A.A. and Ozerova S.G. Phalloidin inhibits cortical granule exocytosis and ooplasmic segregation in loach eggs // Cell Differentiation and Development. 1990. V. 29. P. 21-36.

2. Минин A.A., Озерова С.Г., Хайдарова H.B., Зарайский А.Г. Изучение белка группы аннексинов в раннем развитии рыб. II. Определение полной аминокислотной последовательности // Онтогенез. 2002. Т. 33. №4. С. 264267.

3. Озерова С.Г., Минин A.A. Изучение белков группы аннексинов в раннем развитии рыб. IV. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце данио с использованием масс-спектрометрии // Онтогенез. 2008. Т. 39. №3. С. 222-226.

4. Минин A.A., Озерова С.Г. Спонтанная активация яиц рыб предотвращается ингибиторами протеаз // Онтогенез. 2008. Т. 39. №5. С. 1-5.

Тезисы конференций

5. Озерова С.Г. Две изоформы аннексина А13 в яйце Brachydanio rerio //Онтогенез. 2005. Т. 36. № 3. С. 236-237.

6. Озерова С.Г., Минин A.A. Изучение кальцийсвязывающих белков группы аннексинов у рыб: свойства и экспрессия в раннем развитии // Материалы конференции, посвященной 80-летию со дня рождения A.A. Нейфаха «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006).

Заказ № 70/04/09 Подписано в печать 13.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Озерова, Светлана Геннадиевна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Активация яйца.

1.1. Возможные способы активации яйца рыб.

1.2. Спонтанная активация яйца рыб.

1.3. Искусственная активация яйца рыб.

1.4. Активация яйца при гиногенезе у рыб.

2. Сохранение яйцом способности к оплодотворению в разных условиях.

2.1. Происхождение полостной жидкости у рыб.

2.2. Состав полостной жидкости у рыб.

2.3. Функции полостной жидкости у рыб.

2.4. Изучение влияния ингибиторов протеаз на процесс активации и оплодотворения.

3. Особенности организации кортикального слоя зрелого яйца рыб.

3.1. Строение неоплодотворенного яйца медаки.

3.2. Строение неоплодотворенного яйца данио.

3.3. Кортикальные гранулы рыб.

3.3.1. Строение и состав кортикальных гранул рыб.

3.3.2. Образование кортикальных гранул в ооцитах рыб.

4. Общие закономерности экзоцитоза кортикальных гранул в яйце.

4.1. Экзоцитоз кортикальных гранул у осетровых рыб.

4.2. Особенности экзоцитоза кортикальных гранул у костистых

5. Роль экзоцитоза кортикальных гранул в блокировании полиспермии.

5.1. Полиспермия как следствие замедления и подавления экзоцитоза кортикальных гранул.

6. Роль подмембранного цитоскелета яйца в экзоцитозе кортикальных гранул.

7. Участие ионов кальция в процессе активации яйца.

7.1. Источники ионов кальция и механизмы его высвобождения

7.2. Са - зависимые сигнальные процессы активации яйца.

7.3. Особенности распространения волны кальция на примере костистых рыб: медаки (Oryzias latipes) и данио (Brachydanio rerio).

7.3.1. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце медаки.

7.3.2. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце данио.

8. Участие ионов кальция в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул.

8.1. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул у рыб.

9. Влияние форболовых эфиров на экзоцитоз кортикальных гранул.

10. Кальцийсвязывающие белки.

10.1. EF - hand белки.

10.1.1. Кальмодулин.

10.1.2. S- 100 белки.

10.2. Аннексины.

10.3. С2 — кальцийсвязывающие белки.

Глава II. Материалы и методы.

1. Объекты исследований. Способы получения половых продуктов.

2. Выделение и очистка смеси аннексинов из зрелых яиц вьюна.

3. Выделение и очистка аннексинов из зрелых яиц данио.

4. Масс-спектрометрический анализ белков, выделенных из ооцитов данио.

5. Иммунизация лабораторных животных.

6. Выделение и очистка поликлональных антител к белку 31кДа.

7. Иммунологический анализ материала яиц вьюна и данио.

8. Иммунологический анализ образцов различных тканей вьюна.

9. Получение Зл- концевой нуклеотидной последовательности аннексина 31 кДа.

10. Определение размеров мРНК аннексина 31 кДа данио.

11. Получение 5"-концевой нуклеотидной последовательности аннексина 31 кДа данио.

12. Получение 5'-концевых последовательностей кДНК аннексинов А13.1, А13.2 и A3 данио.

13. Получение полноразмерных кДНК аннексинов А13.1 и А13.2.

14. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина

А13.2.

15. Микроинъекции.

16. Световая и электронная микроскопия.

17. Определение количества актина в яйце вьюна.

Глава Ш. Результаты.

1. Влияние ионов кальция и фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна.

1.1. Строение кортикального слоя яйца вьюна и экзоцитоз кортикальных гранул.

1.2. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна.

1.3. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул.

2. Влияние сред различного состава на спонтанную активацию яйца вьюна и данио.

2.1. Изучение влияния сред разного состава на процесс спонтанной активации икры вьюна и данио.

2.2. Влияние лейпептина и апротинина - ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц вьюна и данио и на их последующую способность к оплодотворению.

2.3. Влияние форболовых эфиров на активацию яиц вьюна и данио.

3. Идентификация кальцийсвязывающих белков, присутствующих в ооцитах данио и яйцеклетках вьюна.

3.1. Выделение белков группы аннексинов из яиц рыб.

3.2. Получение моноспецифических поликлональных антител к белку 31кДа вьюна.

3.3 Исследование распределения белка 31кДа в разных тканях вьюна.

3.4. Получение и анализ кДНК, содержащей полноразмерную кодирующую последовательность белка с молекулярной массой 31 кДа данио.

3.5. Идентификация аннексинов, выделенных из ооцитов данио.

3.6. Идентификация в ооцитах данио копина Ш.

3.7. мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио.

3.8. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2.

Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца"

Актуальность тёмы.

Изучение спонтанной активации имеет важное значение при решении некоторых проблем рыборазведения: Искусственное разведение рыб предполагает в качестве одной из задач разработку методов получения' зрелых половых, продуктов и проведение искусственного оплодотворения. Проблема сохранения у яйца способности к оплодотворению осложнена тем, что при попадании в водную среду икра рыб спонтанно активируется и теряет эту способность. В связи с этим особенно актуальным представляется изучение природы сигналов активации, а также возможности (механизмов) их ингибирования.

Однако существует Са2+-независимая секреция. Например, секреция в тромбоцитах под действием эндогенного диацил глицерина или его искусственных аналогов форболовых эфиров может происходить и без изменения концентрации внутриклеточного кальция: Возможно, что секреторный ответ в этом случае обеспечивается за счет стимуляции протеинкиназы С. Участие форболовых эфиров в процессе активации яйцеклетки показано для разных видов животных. О возможном существовании более чем одного механизма регуляции экзоцитоза в яйцеклетке свидетельствуют экспериментальные данные многих работ. Электронно-микроскопические исследования показывают, что популяция кортикальных -гранул неоднородна по строению, размеру и распределению в кортикальном слое яйца. Разные типы гранул имеют различную чувствительность к веществам^ вызывающим: искусственную активацию яйцеклеток. Для; некоторых видов? рыб отмечено, что при активации кальциевая волна ни по времени, ни пространственно не совпадает с экзоцитозом кортикальных гранул. Все это делает актуальным изучение возможной- роли диацилглицеринового? сигнального пути в акгивации яйца рыб.

Единым механизмом реализации кальциевого сигнала- в клетке является! связывание ионов кальция при повышении их концентрации с белками. Изучение состава и свойств кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке и обеспечивающих кальциевую сигнализацию, позволит расширить -представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих протекание процесса активации у рыб:

Цель и задачи исследования:

Целью настоящей диссертационной работы было изучение клеточных и молекулярных механизмов активации яйца; которая г определяет начало включения программы развития. Исследовались три стороны, определяющие протекание этого процесса: Во-первых, изучались механизмы процессов; предотвращающих активацию. Во-вторых, сигнальные процессы- приводящие к активации яйца, а также компоненты* яйцеклетки, обеспечивающие ее реализацию. • '

Были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать влияние форболовых эфиров на процесс образования оболочки оплодотворения у двух карповых рыб: вьюна (Misgiirnus fossilis) и данио (Brachydanio rerio). э

3. Исследовать влияние состава среды инкубации на активацию яйцеклеток вьюна (Misgurnus fossilis) и данио {Brachydanio rerio), а также влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению у яйцеклеток данных видов рыб.

5. Идентифицировать кальцийсвязывающие белки, присутствующие в ооцитах данио.

Научная новизна работы.

В работе впервые* показано влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению яиц костистых рыб вьюна и данио.

Впервые показано активирующее действие форболовых эфиров на процесс формирования оболочки оплодотворения у яйцеклеток рыб.

Был разработан микрометод выделения кальцийсвязывающих белков. Протеомный анализ выделенной смеси с использованием масс-спектрометрии позволил впервые идентифицировать в виде запасенных белков ооцига данио аннексины А5, А13.1, Ala, А2а и копин 1П, содержащий С2-кальцийсвязывающий домен.

Научная и практическая значимость работы

Выявлены новые компоненты сигнальных путей процесса активации у рыб. Показано, что форболовые эфиры - искусственные активаторы протеинкиназы С, оказывают активирующее действие на яйцо рыб в сигнальном каскаде на более поздних этапах, чем действие протеаз. Изучена роль актинового цитоскелета яйца в экзоцитозе кортикальных гранул при активации. Полученные данные вносят вклад в изучение фундаментальной проблемы биологии развития - механизма активации яйцеклетки.

Обнаружено, что процесс спонтанной активации подавляется ингибиторами протеаз. Это открывает новые возможность для разработки искусственных сред, позволяющих продолжительное время сохранять икру рыб, способную к оплодотворению. Этот результат имеет большую потенциальную значимость для развития аквакультуры.

Работа полностью* выполнена в Институте биологии развития* им. Н.К. Кольцова РАН, поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты. № 93-04-07372-а; 98-04-48247-а; 01-04-48943-а; 05-04-48975-а).

Публикация результатов исследования* иапробация работы.

Материалы^ диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории экспериментальной эмбриологии Института биологии развития' им. Н.К. Кольцова РАН; на конференции «Молекулярные механизмы* процессов онтогенеза» (Москва, 2001 г.); на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 2004 г.; на конференции «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006 г.).

По материалам диссертации опубликовано четыре статьи, все в рецензируемых журналах и тезисы двух докладов.

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, t

Работа проводилась в лаборатории экспериментальной эмбриологии, им. Д.П. Филатова Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Научное руководство осуществлял к.б.н. А. А. Минин.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Озерова, Светлана Геннадиевна

Основные выводы

5. В ооците данио впервые идентифицированы кальцийсвязывающие белки аннексины: А5, А13.1, А2а, Ala. Показано присутствие материнской мРНЕС аннексинов А13.1, А13.2 и A3.

6. Впервые в ооците данио обнаружен белок копии III, относящийся к семейству кальцийсвязывающих белков, содержащих С2 домен.

Заключение

На основании полученных данных по влиянию ингибиторов протеаз на процесс спонтанной активации нами предложена следующая гипотеза, объясняющая механизм спонтанной активации яйца рыб. На поверхности яйца имеются протеазы, участвующие в процессе активации яйца, возможно, за счет расщепления рецепторов, активируемых протеазами. В полостной жидкости рыб, как и в крови и тканевой жидкости, имеются эндогенные ингибиторы протеаз. При разведении полостной жидкости в условиях, когда икра попадает в водную среду во время нереста, ингибиторы перестают действовать и икра активируется протеазами. Мы предполагаем, что лейпептин и апротинин предотвращают спонтанную активацию, выполняя ту же роль, что и эндогенные ингибиторы полостной жидкости, а именно ингибируют протеазы на поверхности яйца, которые могут гидролизовать активируемые протеазами рецепторы на поверхности яйца.

В ходе проведенных экспериментов нами было показано, что форболовые эфиры в концентрации 0,1-1 мкМ вызывают образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио. Заслуживает внимания тот факт, что для яйцеклеток рыб этот эффект был показан впервые. Вопрос, в какой каскад реакций и на какой именно стадии включаются форболовые эфиры в ходе процесса активации, требует дальнейшего изучения. То, что активирующий яйцо эффект форболовых эфиров наблюдался нами на фоне действия ингибиторов протеаз, указывает, что активирующее действие протеаз предшествует этапу, на котором действуют форболовые эфиры.

Изучение кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетках рыб, представляет особый интерес для изучения процесса активации яйца, тесно связанного с кальциевой сигнализацией. Различные кальцийсвязывающие белки в последние несколько десятилетий активно изучаются у самых разных организмов. Особый интерес представляют белки группы аннексинов, их внутриклеточные функции до сих пор остаются неизвестны. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце как автономной клетке является первым необходимым шагом в изучении их функции. В ходе проведенной работы нами было показало присутствие в ооцитах данио аннексинов А5, А13.1, А2а, Ala в виде запасенных белков, а также материнских мРНК аннексинов A3 и А13.2. Впервые в ооцитах данио с использованием метода масс-спектрометрии был идентифицирован белок копии Ш.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Озерова, Светлана Геннадиевна, Москва

1. Астауров Б.Л. Зачаточный партеногенез у осетровых рыб (Acipenser stellatus, Ac. guldenstadti, Huso huso) //ДАН СССР. 1951. Т. 78. № 1. С. 173-176.

2. Васецкий С.Г., БетинаМ.И., Кондратьева О. Т. Индуцированный диплоидный гиногенез у вьюна (Подавление I мейотического деления) // ДАН СССР. 1988. Т. 300. № 6. С. 1482-1484.

3. Гинзбург А.С. О механизме блокирование полиспермии у осетровых рыб // ДАН СССР. 1960а. Т. 130. № 2. С. 473-476.

4. Гинзбург А.С. Блокирование полиспермии при оплодотворении яиц осетровых и лососевых рыб и роль кортикальных гранул (альвеол) в этом процессе // Журн. общ. биол. 19606. Т. 21. № 6. С. 419-429.

5. Гинзбург А.С. Соединение гамет без активации у лососевых рыб // Журн. общ. биол. 1963. Т. 24. № 2. С. 106-119.

6. Гинзбург А.С. Оплодотворение у рыб и проблема полиспермии. М. Наука. 1968. 358 с.

7. Гомельский Б.И., Рекубратский А.В., Емельянова О.В. и др. Получение диплоидного гиногенетического потомства карпа с помощью тепловой обработки развивающейся икры // Вопр. ихтиол. 1989. Т. 29. Вып. 1. С. 168-170.

8. Детлаф Т.А. Кортикальные гранулы и вещества, выделяющиеся из анимальной части яйца в период активации у осетровых рыб // ДАН СССР. 1957. Т. 116. № 2. С. 341-344.

9. Детлаф Т.А. Динамика кортикальных изменений и происхождение коллоида перивителлинового пространства в яйцах осетровых рыб при оплодотворении и искусственной активации//Журн. общ. биол. 1961. Т. 22. № 6. С. 411-424.

10. Зотин А.И. Механизм образования перивителлинового пространства у яиц лососевых рыб // ДАН СССР. 1954. Т. 96. № 2. С. 421-424.

11. Зотин А.И. Физиология водного обмена у зародышей рыб и круглоротых. М. Изд-во АН СССР. 1961. 317 с.

12. Зуссман М. Биология развития. М. Мир. 1977. 301 с.

13. Иванов М.Ф. Яйцевые оболочки рыб, их сравнительная морфология и экологическое значение. Вест. ЛГУ. 1956. № 21 (серия биол., № 4). С. 79-90.

14. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэттену. М. Мир. 1983. Т. 1. 357 с.

15. Кирпичников B.C. Генетика и селекция рыб. JI. Наука. 1987. 519 с.

16. Костомарова А.А., Нейфах А.А. Метод отделения бластодермы у зародышей вьюна и возможности его применения // Журн. общ. биол. 1964. Т. 25. № 5. С. 386-388.

17. Минин А.А., Земсков Е.А., Хайдарова Н.В. Фосфорилирование in vitro протеинкиназой С и казеинкиназой 2 белков группы аннексинов из яиц вьюна Misgurnusfossilis //Биохимия. 1998. Т. 63. № 9. С. 1258-1262.

18. Минин А.А., Иваненков В.В., Мещеряков В.Н. Выделение и идентификация изоформ актина на разных стадиях развития вьюна Misgurnus fossilis II Биохимия. 1987. Т. 52. № 2. С. 342-347.

19. Минин А.А., Хайдарова Н.В. Изучение белка группы аннексинов в раннем развитии рыб. I. Идентификация белка его биосинтез в эмбриогенезе // Онтогенез. 1998. Т. 29. № 3. С. 165-169.

20. Рекубратский А.В., Грунина А.С., Барминцев В.А., Голованова Т.С., Чудинов О.С., Абрамова А.Б., Панченко Н.С., Купченко С.А. Мейотический гиногенез у севрюги, русского осетра и стерляди // Онтогенез. 2003. Т. 34. № 2. С. 121-131.

21. Суворов Е.К. Основы ихтиологии. 2-е. Изд. «Советская наука». 1948. 579 с.

22. Abassi Y., Carroll D., Giusti A.F., Belton R., Foltz K.R. Evidence that Src-type tyrosine kinase activity is necessary for calcium release at fertilization in sea urchin eggs // Dev. Biol. 2000. V. 15. P. 206-219.

23. Albrieux M., Sardet C., Villaz M. The two intracellular Ca2+release channels, ryanodine receptor and inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, play different roles during fertilization in ascidians //Dev. Biol. 1997. V. 189. P. 174-185.

24. Aliva-Sakar A.J., Kretsinger R.H., Creutz C.E. Membran-bound 3D structures reveal the intrinsic flexibility of annexin VI // J. Struct. Biol 2000. V. 130. P. 54-62.

25. Aunis D., Bader F.M. The cytoskeleton as a barrier to exocytosis in secretory cells // J. Exp. Biol. 1988. V. 139. P. 253-266.

26. Barwise J; Walker J.H. Annexins П, IV, V and VI relocate in response to rises in intracellular calcium in human foreskin fibroblasts // J. Cell Sci. 1996. V. 109. P. 247-255.

27. Bazzoli N., Godinho H.P. Cortical alveoli in oocytes of freshwater neotropical teleost fish //Boll. Zool. 1994. V. 61. P. 301-308.

28. Beams H.W., Kessel R.G., Shih, C.Y., Tung H.N. Scanning electron microscope studies on blastodisc formation in the zebrafish, Brachydanio rerio II J. Morphol. 1985. V. 184. P. 41-49.

29. Becker K.A., Hart, N.H. The cortical actin cytoskeleton of unactivated zebrafish eggs: spatial organization and distribution of filamentous actin, nonfilamentous actin, and myosin//Mol. Reprod. Dev. 1996. V. 43. P. 536-547.

30. Becker K. A., Hart N.H. Reorganization of filamentous actin and myosin-П in zebrafish eggs correlates temporally and spatially with cortical granule exocytosis // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 97-110.

31. Bement W.M., Capco D.G. Activators of protein kinase С trigger cortical granule exocytosis, cortical contraction, and cleavage furrow formation in Xenopus laevis oocytes and eggs //J. Cell Biol. 1989. V. 108. № 3. P. 885-892.

32. Bianchi R., Pula G., Ceccarelli P., Giambanco I., Donato R. S-100 protein binds to annexin П and pi 1, the heavy and light chains of calpactin I // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1160. P. 67-75.

33. Billard R., Christen R., Cosson M.P., Letellier R., Renard R., Saad A. Biology of the gametes of some teleost species // Fish Physiol. Biochem. 1986. V. 2. P. 115-120.

34. Blaxter J.H.C. Herring rearing -1. The storage of herring gametes // Mar. Res. Scot. 1955. № 3. P. 1-12.

35. Boeck A. Om Silden og Sildefiskerierne navnlig om det norske vaarsildfiske af Axel Boeck // Christiania. 1871. Цит. noKupfferC. 1878.

36. Brummett A.R., Dumont J.N. Initial stages of sperm penetration into the egg of Fundulus heteroclitus II J. Exp. ZooL 1979. V. 210. P. 417-434.

37. Brummett A.R., Dumont J.N. Cortical vesicle breakdown in fertilized eggs of Fundulus heteroclitus И J. Exp. Zool. 1981. V. 216. P. 63-79.

38. Burgoyne R.D., Cheek T.R., O'Sullivan A.J. The control of cytoskeletal actin and exocytosis in intact and permeabilized adrenal chromaffin cells: role of calcium and protein kinase С // Cell Signal. 1989. V. 1. P. 323-334.1. Л I

39. Busa W.B., Nuccitelli R. An elevated free cytosolic Ca wave follows fertilization in eggs of the frog, Xenopus laevis //J. Cell Biol. 1985.V. 100. P. 1325-1329.

40. Bush C.P., Weis J.S. Effects of salinity on fertilization success in two populations of Fundulus heteroclitus //Biol. Buil. 1983. V. 164. P. 406-417.

41. Carroll J. The initiation and regulation of Ca2+signaling at fertilization in mammals // Semin. Cell. Dev. Biol. 2001. V. 12. P. 37-43.

42. Carroll E.J, Epel D. Isolation and biological activity of the proteases released by sea urchin eggs following fertilization // Dev. Biol. 1975. V. 44. P. 22-32.

43. Carroll D.J., Jaffe L.A. Proteases stimulate fertilization-like responses in starfish eggs //Dev. Biol. 1995. V. 170. P. 690-700.

44. Chambers E.L., Pressman B.C., Rose B. The activity of sea urchin eggs by the divalent ionophores A23187 and X-537A // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. V. 60. P. 126-132.

45. Cheek T.R., Burgoyne R.D. Nicotine-evoked disassembly of cortical actin filaments in adrenal chomaffin cells // FEBS Lett. 1986. V. 207. P. 110-114.

46. Churchill G.C., O'Neill J.S., Masgrau R., Patel S., Thomas J.M., Genazzani A.A., Galione A. Sperm deliver a new second messenger NAADP // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 125-128.

47. Cbbbold P.H., Rink T.J. Fluorenscence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium //Biochem. 1987. V. 248. P. 313-328.

48. Coffman M.A., Goetz F. W. TOPs (trout ovulatory proteins) are partially responsible for the anti-proteolytic activity found in trout coelomic fluid // Biol. Reprod. 1998 V 59. P. 497-502.

49. Coffinan M.A., Pinter J.H., Goetz F.W. Trout ovulatory proteins: site of synthesis, regulation, and possible biological function // Biol. Reprod. 2000. V. 62. P. 928-938.

50. Coward K., Bromage N.R, Hibbitt O., Parrington O.J. Gamete physiology, fertilization and egg activation in teleost fish // Rev. Fish Biol. Fish. 2002. V. 12. № 1. P. 33-58.

51. Coward K.5 Parrington J. New insight into the mechanism of egg activation in fish // Aquat. Living Resour. 2003. V. 16. P. 395-398.

52. Cox L.J., Larman M.G., Saundres C.M., Hashimoto K., Swann K., Lai F.A. Sperm phospholipase CC, from humans and cynomolgus monkeys triggers Ca oscillation, activation and development of mouse oocytes // Reproduction. 2002. V. 124. P. 611-623.

53. Creuts C.E., Pazoles C.J., Pollard H.B. Identification and purification of an adrenal medullary protein (synexin) that causes calcium-dependent aggregation of isolated chromaffin granules // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. P. 2858-2866.

54. Crivici A., Ikura M. Molecular and Structural Basis of Target Recognition by Calmodulin//Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. V. 24. P. 85-116.

55. Cross N.L. Initiation of the activation potential by an increase in intracellular calcium in eggs of the frog, Rana pipiens II Dev. Biol. 1981. V. 85. P. 380-384.

56. Dabrowski К., Glogowskia J., Ciereszkoa A. Effects of proteinase inhibitors on fertilization in sea lamprey (Petromyzon marinus) // Comparative Biochemistry and Physiology. Part В: Biochemistry and Molecular Biology. 2004. V. 139. P. 157-162.

57. Danker P., Low I., Hasselbach W., Wieland T. Interaction of actin with phalloidin: polymerization and stabilization of F-actin // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 400. P. 407-414.

58. Dedman J.R., Kaetzel M.A. Annexins // In Guidebook to Cytoskeletal and Motor Proteins. Kreis, Т., and Vale, R. (eds). 1994. Oxford: Oxford University Press. P. 26-28.

59. Deguchi R. Fertilization causes a single Ca(2+) increase that fully depends on Ca(2+) influx in oocytes of limpets (Phylum Mollusca, Class Gastropoda) II Dev. Biol. 2007. V. 304. P. 652-663.

60. Digonnet C., Aldon D., Leduc N., Dumas, C., Rougier, M. First evidence of a calcium transient flowering plants at fertilization // Development. 1997. V 124. P. 2867-2874.

61. Dong, J.B., Tang, T.S., Sun, F.Z.Xenopus and chicken sperm contain a cytosolic soluble protein factor, which can trigger calcium oscillations in mouse eggs // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 268. P. 947-951.

62. Ducibella Т., LeFevre L. Study of protein kinase С antagonistson cortical granule exocytosis and cell-cycle resumption in fertilized mouse eggs // Mol. Reprod. Dev. 1997. V. 46. P. 216-226.

63. Eckberg R.E., Miller A.L. Propagated and nonpropagated calcium transient during egg activation in the annelid, Chaetopterus II Dev. Biol. 1995. V. 172. P. 654-664.

64. Endo Y, Mattei P, Kopf G.S, Schultz R.M. Effects of phorbol esters on mouse eggs: dissociation of sperm receptor activity from acrosome reaction-inducing activity of the mouse zona pellucida protein, ZP3 // Dev. Biol. 1987. V. 123. P. 574-577.

65. Ernst J.D. Annexin 1П translocates to the periphagosomal region when neurophils ingest opsonized yeast // J. Immunol. 1991. V. 146. P. 3110-3114.

66. Farado A., Nishizuka Y. Protein kinase С in transmembrane signalling // FEBS Lett. 1990. V. 268. P. 350-354.

67. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Cell Chem. 1975. V. 250. № 10. P. 4007-4021.

68. Feldmeth C.R., Waggoner J.P. Field measurements of tolerance to extreme hypersalimty in the California killifish, Fundulus parvipinnis. Copeia. 1972. P. 592-594.

69. Fluck R., Abraham V., Miller A., Galione A. Microinjection of cyclic ADP-ribose triggers a regenerative wave of Ca2+ release and exocytosis of cortical alveoli in medaka eggs // Zygote. 1999. V. 7. № 4. P. 285-292.

70. Foerster R.E. Effect of retention of spermatozoa and ova of sockeye salmon, Oncorhynchus nerka, in water ad without addition of water, on fertility I I J. Fish Res. Bd Can. 1965. V. 22. № 6. P. 1503-1521.

71. Fulton B.P., Whittingham D.G. Activation of mammalian oocytes by intracellular injection of calcium //Nature. 1978. V 273. P. 146-151.

72. Galione A., McDougall A., Busa W.B., Willmont N., Gillot I., Whitaker M. Redundant mechanism of calcium-induced calcium release underlying calcium waves during fertilization of sea urchin eggs // Science. 1993. V. 261. P. 348-352.

73. Galione A., Patel S., Churchill G.C. 2000. NAADP-induced calcium release in sea archin eggs // Cell Biol. 2000. V. 92. P. 197-204.

74. Garczynski M.A., Goetz F. W. Molecular characterization of a unique RNA transcript that is highly upregulated at the time of ovulation in the brook trout (Salvelinus fontinalis) ovary //Biol. Reprod. 1997. V. 57. P. 856-864.

75. Gerke V. Identification of a homologue for annexin VII (sinexin) in Dictyosielium discoideum 111. Biol. Chem. 1991. V. 226. P. 1809-1826.1. Л I

76. Gerke V., Greutz C.E., Moss S.E. Annexins: linking Ca signaling to membrane dynamics // Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 449-459.

77. Gerke, V., Moss, S.E. Annexis: From Structure to Function // Physiol. Rev. 2002. V. 82. P. 331-371.

78. Gilkey J.C., Jaffe L.F., Ridgway E.B., Reynolds G.T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryziaz latipes I I J. Cell Biol. 1978. V. 76. P. 448466.

79. Gillot I., Whitaker M. Imaging calcium waves in eggs and embryos // J. Exp. Biol. 1993. V. 184. P. 213-219.

80. Giusti A.F., Xu W.Q., Hinkle В., Terasaki M. Jaffe L.A. Evidence that fertilization activates starfish eggs by sequential activation of a Src-like kinase and phospholipase С gamma//J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 16788-16794.

81. Glabe C.G., Vacquier V.D. Egg surface glycoprotein receptor for sea urchin sperm bindin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 881-885.

82. Goetz F.W., Coffinan M.A. Storage of unfertilized eggs of rainbow trout {Oncorhynchus mykiss) in artificial media // Aquaculture. 2000. V. 184. P. 267-276.

83. Gould M., Stephano J.L. Electrical responses of eggs to acrosomal protein similar to those induced by sperm // Science. 1987. V. 235. P. 1654-1656.

84. Gould M., Stephano J.L. Peptides from sperm acrosomal protein that initiate egg development // Dev. Biol. 1991. V. 146. P. 509-518.

85. Gould M., Stephano J.L., Holland L.Z. Isolation of protein from Urechis sperm acrosomal granules that binds sperm to eggs and initiates development // Dev. Biol. 1986. V. 117. P. 306-318.

86. Grandin N., Charbonneau M. Intracellular pH and intracellular free calcium responses to protein kinase С activators and inhibitors in Xenopus eggs // Development. 1991. V. 112. N 2. P. 461-470.

87. Greene C. W. Physiological studies of the chinook salmon // Bull. U. S. Bureau of Fisheries. 1940. V. 24. P. 429-456.

88. Gulyas B.J. Cortical granules of mammalian eggs // Int. Rev. Cytol. 1979. V. 63. P. 357-392.

89. Haley S.A., Wessel G.M. The cortical granule serine protease CGSP1 of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus, is autocatalytic and contains a lowdensity lipoprotein receptor-like domain//Dev. Biol. 1999. V. 211. P. 1-10.

90. Hart N.H., Donovan M. Fine structure of the chorion and site of sperm entry in the egg ofBrachydanio //J. Exp. Zool. 1983. V. 227. P. 277-296.

91. Hart N.H., Fluck R.A. Cytoskeleton in teleost eggs and early embryos: contributions to cytoarchitecture and motile events // Curr. Top. Dev. Biol. 1995. V. 31. P. 343381.

92. Hart N.H., Yu S.F. Cortical granule exocytosis and cell surface reorganization in eggs of Brachydanio //J. Exp. Zool. 1980. V. 213. P. 137-159.

93. Hayes F.R., Darcy D.A., Sullivan C.M. Changes in the inorganic constituents of the developing salmon eggs //J. Biol. Chem. 1946. V. 163. № 3. P. 621-631.

94. Hochstrasser K, Albrecht G.J, Schonberger O.L, Rasche B. An elastasespecific inhibitor from human bronchial mucus // Hoppe-Seyler's Z Physiol. Chem. 1981. V. 362. P. 1369-1375.

95. Hollinger T.G., Schuetz A.M. "Cleavage" and cortical granule breakdown in Rana pipiens oocytes induced by direct microinjection of calcium // J. Cell Biol. 1976. V. 71. P. 395-401.

96. Horner V.L., Wolfner M.F. Transitioning from egg to embryo: Triggers and mechanisms of egg activation //Dev. Dyn. 2008. V. 237. P. 527-544.

97. Jaffe L.F. Classes and mechanisms of calcium waves // Cell Calcium. 1993. V. 14. P. 736-745.

98. Jaken S. Protein kinase С isozymes and substrates // Curr Opin Cell Biol. 1996. V. 8. №2. P. 168-173.

99. Jellerette Т., He C.L., Parys J.B., Fissore R.A. Downregulation of the inositol 1,4,5-triphosphate receptor in mouse eggs following fertilization or parthenogenetic activation//Dev. Biol. 2000. V. 223. P. 238-250.

100. Kajikawa M., Kaibushi K., Matzubara Т., Kikkawa U., Takai Y., Nishizuka Y. A possible role of protein kinase in signal-induced lysosomal enzyme secretion // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V. 116. P. 743-750.

101. Kanoh Y., Yamamoto T.S. Removal of the membrane of the dog salmon egg by means of proteolytic enzymes //Bull. Jap. Soc. Sci. Fisheries. 1957. V. 23. № 3. P. 116-172.

102. Kille R.A. The activation times of the lamprey egg a correction // Exp. Cell Res. 1961.V. 24. №1. P. 195-198.

103. Kinsey W.H., Shen S.S. Role of Fyn kinase in calcium release during fertilization of the sea urchin egg // Dev. Biol. 2000. V. 225. P. 253-264.

104. Kinsey W H., Wu W., Macgregor E. Activation of Src-family PTK activity at fertilization: role of the SH2 domain //Dev. Biol. 2003 V. 264. P. 255-262.

105. Юте D:, Kline J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg // Dev. Biol. 1992. V. 149. P. 80-89.

106. Kline D., Stewart-Savage J. The timing of cortical granule fusion, content dispersal, and endocytosis during fertilization of the hamster egg: an electrophysiological and histochemical study//Dev. Biol. 1994. V. 162. P. 277-287.

107. Krajhanzl A., Nosek J., Monsigny M., Kocourek J. Direct visualization of endogenous lectins in fish oocytes by glycosylated fluorescent cytochemical markers //Histochem. J. 1984. V. 16. P. 426-428.

108. Kretsinger R.H. Structure and evolution of calcium modulated proteins // CRC Crit. Rev. Biochem. 1980. V. 8. P. 119-174.

109. Kretsinger R. Calmodulin and myosin-light chain kinase: how helices are bent // Science. 1992. V. 258. P. 50-51-.

110. Kubota H.Y., Yoshimoto Y., Yoneda M., Hiramoto Y. Free calcium wave upon activation in Xenopus eggs //Dev. Biol. 1987. V. 119. P. 129-136.

111. Mathavan S., Lee S.G., Мак A. et al. Transcriptome analysis of zebrafish embryogenesis using microarrays // PLos Genet. 2005. V. 2. № 1. P. 260-276.

112. Minin A.A., Ivanenkov V.V. Ca2+-dependent phospholipid and actin-binding proteins: synthesis and heterogeneity in embryos of the loach // First Europ. Symp. on Calcium Binding Proteins. Bruxelles. 1989. P. E9.

113. Mizote A., Okamoto S., Iwao Y. Activation ofXenopus eggs by proteases: possible involvement of a sperm protease in fertilization // Dev. Biol. 1999. V. 208. P. 79-92.

114. Moss S.E., Morgan R. The annexins // Genome Biol. 2004. V.5. № 4. P. 219-226.

115. Myers J.M., Hershberger W.K. Artificial spawning of tilapia eggs // J. World Aquacul. Soc. 1991. V. 22. P. 77-82.

116. Niksirat, H., Sarvia, K., Mojazi Amiri В., Hatef, A. Effects of storage duration and storage media on initial and post-eyeing mortality of stored ova of rainbow trout Oncorhynchus mykiss II Aquaculture. 2007a. V. 262. P. 528-531.

117. Niksirat H., Sarvi K., Mojazi Amiri, В., Karami, M., Hatef, A. In vitro storage of unfertilized ova of endangered Caspian brown trout (Salmo trutta caspius) in artificial media//Anim. Reprod. Sci. 2007b. V. 100 . P. 356-363.

118. Nishizuka Y. The molecular geterogeneity of protein kinaze С and its implication for cellular regulation//Nature. 1988. V. 334. P. 661-665.

119. Ohta T, Iwamatsu T, Tanaka M, Yoshimoto Y. Cortical alveolus breakdown in the eggs of the freshwater teleost Rhodeus ocellatus ocellatus I I Anat. Rec. 1990. V. 227. P. 486-496.

120. Parrington J., Davis L.C., Galione A., Wessel. G. Flipping the switch: how a sperm activates the egg at fertilization // Dev. Dyn. 2007. V. 236. P. 2027-2038.

121. Polzonetti V., Cardinali M., Mosconi G., Natalini P., Meiri I., Carnevali O. Cyclic ADPR and calcium signalling in sea bream (Sparus aurata) egg fertilization // Mol. Reprod. Dev. 2002. V 6. P. 213-217.

122. Raz T, Skutelsky E, Amihai D, Hammel I, and Shalgi R. Mechanisms leading to cortical reaction in the mammalian egg // Mol. Reprod. Dev. 1998. V. 51. № 3. P. 295-303.

123. Rhee S.G. Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase С // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 281-312.

124. Roeder A.D., Gard D.L. Confocal microscopy of F-actin distribution in Xenopus oocytes //Zygote. 1994. V. 2. P. 111-124.

125. Rongish В., Kinsey W.H. Transient nuclear localization of Fyn Kinase during development in zebrafish // Anat. Rec. 2000. V. 260. P. 115-123.

126. Runft L.L., Jaffe L.A., Mehlmann L.M. Egg activation at fertilization: where it all begins //Dev. Biol. 2002. V. 245. P. 237-254.

127. Sakai N., Burgess S., Hopkins N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin // Mol. Mar. Biol. Biotech. 1997. V. 6. P. 84-87.

128. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

129. Sardet C., Dumollard R., McDougall A. Signals and calcium waves at fertilization // Semin. Cell Dev. Biol. 2006. V. 17. P. 223-225.

130. Sars G.O. On the spawning and development of the codfish // Ann. Rep. U. S. Fish Comm. for 1873-1878. 1876. V. 3. P. 212-222.

131. Sato K., Tokmakov A.A., Iwasaki Т., Fukami Y. Tyrosine kinase-dependent activation of phospholipase Cgamma is required for calcium transient in Xenopus egg fertilization. //Dev. Biol. 2000. V. 224. P. 453-469.

132. SchaferB.W., Heizmann C.W. The S-100 family of EF-hand calcium-binding proteins: functions and pathology // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21. P. 134-140.

133. Selbert S., Fischer P., Pongratz D., Stewart M., Noegel A.A. Expression and localization of annexin VII (synexin) in muscle cell // J. Cell Sci. 1995. ,V. 108. P. 85-92.

134. Selman K., Wallace R.A., Barr V. Oogenesis in Fundulus heteroclitus. V. The relationship of yolk vesicles and cortical alveoli I I J. Exp. Zool. 1988. V. 246. P. 42-56.

135. Sharma D., Kinsey W.H. Regionalized calcium signaling in zebrafish fertilization // Int. J. Dev. Biol. 2008. V. 52. P. 561-570.

136. Stainhardt R.A., Epel D. Activation of sea urchin eggs by a calcium ionophore // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 1915-1919.

137. Stainhardt R.A., Epel D., Carroll E. J., Yanagimachi R. Is calcium ionophore a universal activator for unfertilized eggs? // Nature. 1974. V. 252. P. 41-43.

138. Streisinger G., Walker C., Dower N., Knauber D., Singer F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish I Brachydanio rerio/ II Nature. 1981. V. 291. P. 293-296.

139. Strieker S.A. Repetitive calcium waves induced by fertilization in the nemertean worm Cerebratulus lacteus II Dev. Biol. 1996. V. 176. P. 243-263.

140. Swann K. Ca oscillations and sensitization of Ca release in unfertilized mouse eggs injected with a sperm factor // Cell Calcium. 1994. V. 15. P. 331-339.

141. Swann K, Ozil J.P. Dynamics of the calcium signal that triggers mammalian egg activation//Int. Rev. Cytol. 1994. V. 152. P. 183-222.

142. Swann K., Saunders C.M., Rogers N.T., Lai F.A. PLCzeta(zeta): a sperm protein that triggers Ca2+ oscillations and egg activation in mammals // Semin. Cell Dev. Biol. 2006. V. 17. P. 264-273.

143. Takayama S., Hamaguchi A., Ojima Y. and Kusa M. On the mosaic organization of cortical alveoli in eggs of carp-funa hybrids // Annot. Zool. Jap. 1961. V. 34. № 3. P. 128-131.

144. Tawia S.A., Lopata A. The fertilization and development of mouse oocytes following cortical granule discharge in the presence of a protease inhibitor // Human reproduction. 1992. V. 7. P. 1004-1009.

145. Tesarik J., Testart J. Treatment of sperm-injected human oocytes with Ca ionophore supports the development of Ca2+oscillation // Biol. Reprod. 1994. V. 51. P. 385-391.3 3

146. Tesoriero J.V. The distribution and fate of H-glucose and H-galactose in oocytes of Oryzias latipes II Cell Tissue Res. 1980. V. 209. P. 117-129.

147. Tomsig J.L., Snyder S.L., Creutz C.E. Identification of targets for calcium signaling through the copine family of proteins. Characterization of a coiled-coil copine-binding motif// J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 10048-10054.

148. Trifaro J.M., Rodriguez del Castillo A., Vitale M.L. Dynamic changes in chromaffin cell cytoskeleton as a prelude to exocytosis // Mol. Neurobiol. 1992. V 6. P. 339-358.

149. Wang W.H., Sun Q.Y., Hosoe M., Shioya, Y. and Day, B.N. Quantified analysis of cortical granule distribution and exocytosis of porcine oocytes during meiotic maturation and activation//Biol. Reprod. 1997. V. 56. P. 1367-1382.

150. Webb S.E., Miller A.L. Calcium signalling during embryonic development // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V. 4. P. 539-551.

151. Wessel G.M., Brooks J.M., Green E., Haley S., Voronina E., Wong J., Zaydfudim V., Conner S. The biology of cortical granules // Int. Rev. Cytol. 2001. V. 209. P. 117-206.

152. Whitaker M. Calcium at fertilization and in early development // Physiol. Rev. 2006. V. 86. P. 25-88.

153. Whitaker M.J., Swann K. Lighting the fuse at fertilization // Development 1993. V. 117. P. 1-12.

154. Wieland Т., De Vries J.X., Schafer A., Faulstich H. Spectroscopic evidence for the interaction of phalloidin with actin //FEBS Lett. 1975. V. 54. P. 73-75.

155. Wolenski J.S., HartN.H. Scanning electron microscope studies of sperm incorporation into the zebrafish (Brachydanio) egg // J. Exp. Zool. 1987. V. 243. P. 259-273.

156. WolfD.P. The cortical response inXenopus laevis ova //Dev. Biol. 1974. V. 40. P. 102-115.

157. Wu W., Kinsey W.H. Fertilization triggers of Fyn kinase in the zebrafish egg // Int. J. Biol. 2000. V. 44. P. 837-841.

158. Yamamoto T. Physiology of fertilization in fish eggs // Int. Rev. Cytol. 1961. V. 12. P. 361-405.

159. Yamamoto T. Mechanism of breakdown of cortical alveoli during fertilization in the medaka, Oryzias latipes //Embryologia. 1962. V. 7. № 3. P. 228-251.

160. Yamamoto K., Onozato H. Electron microscope study on the growing oocyte of the goldfish during the first growth phase // Mem. Fac. Fisheries Hokkaido Univ. 1965. V. 13. P. 79-106.

161. Yoshimoto Y., Iwamatsu Т., Hirano K., Hiramoto, Y. The wave pattern of free calcium release upon fertilization in medaka and sand dollar eggs // Dev. Growth Differ. 1986. V. 28. P. 583-596.

Информация о работе

Озерова, Светлана Геннадиевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы