Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение и характеристика нового цитохрома дельта-типа в яйцах сиговых рыб

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и характеристика нового цитохрома дельта-типа в яйцах сиговых рыб"

• 1 • РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

ВАЛШОК ДМИТРИЙ СЕМЕНОВИЧ

уж 577.547.963.4

ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ШТОХРОМА Ъ-ТША

в япцах сиговых рыб.

03.00.04-0иологичо екая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мссква-1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории витаминов и физиологически активных соединений Института биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук,

В.Я.Быховский кандидат биологических наук, В.Ю.Арцатбанов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Р.А.Звягильская

доктор биологических наук,

Г.Г.Новиков

Ведущая организация: Московский институт тонкой химической технологии им. Ы .В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится 16 ИЮНЯ 1992 года в 10 часов на заседании специализированного совета (К 002.96.01.) по присуждении степени кандидата наук в Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1).

Афтореферат разослан 20 МАЛ 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов

•<" I -I-

2.,

Отдэл i, ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Проблема качественного и количественного состава, а также функций пигментов в яйцах рнб уже многие года привлекает к себе внимание ученых. Это обусловлено, превда всего,- существованием связи между содержанием пкткентов в яйцах рыб и качеством половых продуктов (Соин,19£3; Михулин,1973; Галактионова, 1983).- Кроме того, известно, что природные пигменты в большинстве случаев являются физиологически акгавными соединениями, функционирование которых сопряжено с гизненно важными процессами, происходящими в организмах (Бриттон.1985).

Основу пигментации яиц большинства еядов рыб составляют каротиноидные пигменты (Никулин,1981). Однако, почти ничего не известно о биохимических процессах происходящих в желтке яиц рнб и роли пигментов в этих процессах. Важным классом пигментов являются гемопротещщ и, в частности, цитохромы, причем наиболее распространенными и разнообразная! по функциям является цитохромы b-типа. Эти цитохромы принимают участие в различных окислительно-восстановительных реакциях и злектронперэносящиг цепях организмов, обеспечивая выполнение важнейших для шзнедеятельности организмов функций (Lemberg, Barret,1973). На настоящий момент, все выделенные из организма позвоночных нивотных цитохромы b являются типичными мембранными белками. Лишь цитохром Ъ^ из эритроцитов способен растворяться в воде.

Обнаружение в желтке яиц сиговых рыб нового водорастворимого цитохрома Ъ, названного нами цитохромом Ь560 представляет интерес для более полного и глубокого познания этого типа гемопротэидов. Кроме того, сиговые рыбы,имеют . большое рыбоз.озяйствэнное значение; состав гелтка яиц этих рыб и процесса, протекаксциз в нем в период эмбрионально - личиночного развития до сих пор мзло

изучены. Позтоо^ исследование цитохрома как функционального

компонента лейка, является составной частьв решения этой проблемы.

В настощзЕ работе проведано изучение нового пигмента гемопротеядной природы - цитохрома обнаруженного в

водорастворимой фракции шщ сиговых рнб.

Цель работа: Цель дайной работы -заключалась б изучешш нового гамопротеидг из яиц сиговых рыб. В связи с этим бшш поставлена слодаэдзз задачи: внлснить природу этого соединения, определить его локализацию и роль в создании окраски яиц, установить концентрации я данакаку ее изменения в яйцах различных видов сиговых раб в процессе эмбрионально^ - личиночного развития; ш явить видоспециЗячность данного гемопротеида для яиц сиговых рыб; разработать методы его выделения и очистки; исследовать структуру п сесЁства, а также наметить подходы к выяснению функций этого соединения в яйцах сиговых рыб.

Научная воказна работы: Впервые обнаружен и изучен новый водорастворимый цитохром о-тыла: цитохро.м ^¿д- Получены спектральшз хздззктерЕСтшси цитохрома, исследована его гемовая группа. Опреде^гна: стандартный редоке потенциал, молекулярная масса и скорости окисления кислородом и перекисью водорода, а таксе скорость восстановления цитохрома в хивнх яйцах в условиях дефщита кислорода. Выяснено, что степень Еосстановленности цитохрома в развивахиихся яйцах зависит от концентрации кислорода в воде. Установлена концентрация цитохрома и прослежена динамика ее изменения в процессе эмбрионально - личиночного развития различных видов сиговых рыб. Показано, что цитохром является биохимическим наркером семейства сиговых рыб (Соге§ст.1баа).

Практическое значение работы: Результаты, полученные в

работе являются вкладом в фундаментальные представления о цитохромах Ъ-типа. Ваявлелний систематикесхкй признак сиговых рнб (сем.Coregonióas) является одщш из некзегах биохпшпэских признаков, присущих исключительно этому ceií3ücT37. н используется з систематике рт<5. В ходе гкпоявения исгледсвскня рззработкза оригинальная нетодкха эндеягвия и счистки цжкирсма

г Результаты работа üu..i:.í гелоясепы на ссв-KBCSSCU СаС8Д2:2С! ВЬООрЪЮрШ ВНТ8К2ЕОВ :г z леооратсьта

шиукатога рзстснкй КЕСтитута бяохжив кл.Д.Н.Бадп Р.1К; на трзтьем Всзсоюзном сов&е'гнкй по доетсзвядш-? рабпм (Тольятти, ISK8>; нэ четвертей Всесоюзном ccn-.vxtrsn no бтюлски снгсеых ркО (Ео!ЮгдаЛ390); кг местом оврогеСскг< гшкагсгзчесш« колтрзссо (Будзяьвт, 1SSB); па шядунгродзс;« самгозгдас ас бпояогки ч рьзвззеипя ют-овкг рпб (КвоСек,15ЭЭ).

По 'чятс-глгзлгм ;л^ссср?аит'-з спублжовзуо 8

печгтзлп. pacer.

Зйеелртвтюнчгя тя^стя состоит ад вавтшя, обзора детер;меурн, ольсааля гояэдав исс.тадо1Ч*ЕЯй, Езлоквния результатов psíora и iri обсуядепля, шяодез У- стеска лктзргтурн. Лнсйзрт-ыгчок-тоя работа яглегелз пз 1Н¥ страницах гзгшянздшеног'о текста, еклгзчоэт 4 таблицы л 18 ргсуяхоз.

ГШЗРИДЛ П МЕТОДЫ ксседовакм Объектом пспдедсвади£ была гонада, $1Йца и я»а tO гадов раб, отшсягзгсся к 16 семействам, в том число II епдое ситожп раб.

• Гонада и ?2аа раб либо звиерезжггж я храня® при -20°С, лксю фшяггсенг-пи наагденгаи раствором хлерида натрия и хранили при -4°С.

-А-

сдор^-опдодотадрение, хранение, транспортировку и инкубацию сиговых рыб выполняли, руководствуясь методикой (ЧерняеЕ и др.,1987).

Спектральнае характеристики яиц получали путем регистрации абсолютных спектров оптического поглощения, снятых непосредственно с живого объекта.

Разделение яиц на фракции осуществляли методом центрифугирования гоыогената (Никулин,1978).

ГельДшгьтрацстэ препаратов цитохрома осуществляли на колонках с сефарозой 6B-CL и сефадексом G-75 и G-100.

Концентрирование образцов цитохрома осуществляли методом ультрафильтрации под давлением.

Ионобменная хроматография. Для ионобменной хроматографии использовали анионобменные носители: дкдт? сефадекс Л-50 "Pharmacia" и ДЕАЕ Био Гель A "Bio-Rad".

Взаимодействие цитохрома Ъ^-q_с. окисью углерода опреде-

ляж при регистрации дифференциальных спектров восстановленного в присутствии СО цитохрома относительно восстановленного цитохрома. Окись углерода получали по стандартной методике (Исмаилов и др..1979).

Цитохром с сксидазнуд активность измеряли спектрофотометри-чески по уменьшению величины а максимума (550 нм) в спектре поглощения восстановленного цитохрома с («=28 мМ~*см~*) в буфере, содержащем 50 idf фосфат pH 6,5.

Пиридин гежщюмовые спектры регистрировали по методу Фолка (Folk,1964).

Электрофорез белков в градиентном (5-20$) полиакриламидном геле (ПАДГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу (Laemll,1970).

Определение молекулярной массы цитохрома методом гель фильтрации осуществляли на колонке с сефадексом С-75 (1000x10 мм) (Амйгеюз,1964).

■ Стандартный редокс потенциал цитохрома определяли при

регистрации относительных дифференциальных спектров цитохрома в присутствии редокс медиатора дихлорфенолиндофенола со стандартным редокс потенциалом +217 мВ (Досон и др.,1991).

Концентрации балка определяли го методу (Ъошгу еГ а.1,1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Спектрофотометрическое исследование наганных неоплодотворен-ных яиц сиговых рыб (рис.1г) показало, что их пигментация обусловлена наличием каротшоидов (максимумы поглощения 462, 492 нм), липидов (наклон спектра в коротковолновой области) и соединения с максимумами при 424, 529 и 5в0 нм, характерными для гемопротеидов - цитохромов Ь-типа.

Наличие каротшоидов и липидов в яйцах реб общеизвестно. Имеется большое количество данных о количественном и качественном составе этих пигментов и о возможной их функциональной роли (Микулин,1978). Наличие в желтке яиц рыб цитохрока Ь-типа не было описано раннее и похазано нами впервые.

Для выяснения локализации пигментов в яйцах сиговых рыб, яйца были разделены методом центрифугирования гомогената на фракции, содержащие плазму, жировые капли и водорастворимую часть желтка.

Спектральный анализ плазменной части яиц показал незначительное содержание в ней каротиноидных пигментов (рис.1а).

Спектры, снятые с жировых капель желтка (рил.16) имели три характерных для каротлноидов максимума в областях 426, 465 и 492

Рис.1. Абсолютные спектры оптического поглощения целых яиц (г) и отдельных фракций яиц (а-в) Оаунтовско-го сига (сл.ьатп): а-спектр поглощения плазменной части яиц; б-игрових капель желтка; в-водорастворимой фракции жопка в 0,2 М фосфатном буфере рН 5,5 и г-целых яиц в воде.

нм, совпадающих с каротиноидными максимумами живых яиц (465, '492 нм).

Спектры собственно иелтка имели максимумы характерные для цптохромов Ъ, а таю:е слабо Еыраженные каротиноидные максимумы (рис.1в).

Спектры плззш и жировых капель лишены характерных для гемопротеида максимумов поглощения. Это указывает на отсутствие заметных количеств гемопротеида в этих фракциях.

Для выявления еидовой специфичности цитохрома нами были

проанализироваш яйца 40 видов рыб из 16 семейстЕ, в том числе яйца II видов сиговых рыб.

Наличие или отсутствие цитохрома определяли методом дифференциальной спектроскопии супернатанта гомогената яиц. При помоии этого метода удалось исключить влияние других оптически активных соединений гелтка, не дащих дифференциальных (восстановленный - окисленный) спектров и получить четкую спектральную характеристику цитохрома.

Цнтохром í)gg0 был обнаружен в яйцах всех проанализированных нами видов сиговых рыб, независимо от места обитания, экологии размножения и других факторов.

В яйцах подавляющего большинства рыб из других систематических групп, в том числе близких к сиговым семейстз Salmónidas, Thymalllüae, 0sofrióos не было обнаружено каких-либо соединений, способных давать дифференциальные (восстановлений - окисленный) спектры.

Приведенные выше результаты не вызывавт сомнения в специфичности штохрсма для яиц сиговых рыб. Поэтому ¡rajara считать, что обнаружен четкий биохимический признак семейства Coregcnldae.

Это тем более вахно, что в систематике раб существует очень мало биохимических признаков. В основном, систематики используют морфологические признаки взрослого организма. Лишь сравнительно недавно стали применять кариологические метода, метод гибридизации ДНК, а такте учитывать особенности эмбрионального развития организма (Решетников,1980).

Обнаруженный наш систематический признак сиговых рыб является одним из немногих биохимических признаков к, на наш взгляд, несомненно, подтверждает справедливость выделения сиговых

рыб в отдельное семейство.

Количество цитохрома определяли по величине «-максимума в дифференциальном спектре супернатанта гоыогената. Значения концентраций цитохрома в яйцах различных видов сиговых рыб, выраженные в нмал цитохрома ва грамм яиц, приведены в таблице I.

Таблица I.

КОНЦЕНТРАЦИЯ ЦИТОХРОМА Ъ~-п В ШЩ СИГОВЫХ РЫБ.

Л Вид Концентрация цитохрома нмол/г

В начале развития Перед шклевом

1. Сагеёапиз ЪтагеХиз

ЬдххгеХиз 3.59 2,00

2. СЛ.р1<ЗзсМаа 6,12-6,35 1,90

3. СЛ.тагаетюШез 6,67 -

4. СЛ.Ъаип.г1 4,38 -

5. С.аХЫйа 4,65-6,32 -

6. С.сшЛстпаНз 0,97-1,14 -

7. С.с1иреа?агв1з 2,59-4,57 -

8. С.ашИзип. 4.41 2,20

9. С.тгазиз 1,02-2,46 0,90

10. С.реХей 3,45 1,90

11. С.запИпе11а 4,81 -

12. СЛидт 1,88-2,90 -

13. Бгепобиз 1еис1сПЩз

1еис1сМ1гуз 0,83-1,05 -

14. ЗЛ.пеЪта 9,52 -

15. Ргозор1ит сдИтиЗгасеит 1.14 -

Из таблицы видно, что максимальные и минимальные значения концентрация в пределах семейства отличаются более чем на порядок. Минимальная концентрация в яйцах белорыбицы (SA.leucich.thy3) - 0,83 нмол/г,' максимальная в яйцах нельмы (8.1.пе1ш) - 9,52 нмол/г.

Значительные колебания концентраций цитохрома имеют место как в пределах всего семейства, так и в пределах отдельных родов. Однако, у разных особей одного вида,"обитапцих как в одном, так и в разных водоемах и даже на разных континентах, концентрация цитохрома варьирует незначительно.

Попытки найти корреляции мевду количествам цитохрома в яйцах и экологическими факторами обитания рыб, физическими параметрами яиц, а таксе особенностями размногения и развития яиц разных видов сиговых рыб не дали результата.

Исследование динамики изменения концентрации цитохрома в процессе эмбрионально-личиночного развития сиговых рыб было выполнено на яйцах байкальского омуля (С.сшХсгпшИз), иссык-кульского, севанского и баунтовского сигов (СЛаиагегиа) и белорыбицы (Б Леи£1сШ1гуз).

■ У всех видов рыб паблюдали сходную картину (рис.2). При оплодотворений и набуханиц яиц происходило уменьшение концентрации цитохрома из-за увеличения массы яиц, вызванного обводнением. С момента начала дробления (I сутки) до стадии начала пигментации глаз (33 сутки) каких-либо значительных изменений концентрации цитохрома не происходило. Со стадии пигментации глаз начиналось постепенное уменьшение концентрации цитохрома. После вылупления личинки (75 сутки) происходило резкое падение концентрации цитохрома, обусловленное высокой скоростью резорбции содержимого желтка. Окончательное исчезновение цитохрома совпадало с моментом

нмол/г

о •L t-

20

80

Рис. 2. Изменение концентрация цитохрома Ъ560 в процессе эмбрионально-личиночного развития сига (С. Iauaretu3).

1-неоплодотворенные яйца;

2-оплодотворенные яйца;

3-морула;

4-бластула;

5-желточная пробка;

6-пигментация глаз;

7-выклев;

8-14 дней после выклева.

полного рассасывания желточного мешка (93 сутки).

Таким образом установлено, что цитохром сохраняется в желтке на протяжении всего процесса эмбрионально-личиночного развитая вплоть до полного рассасывания желточного мешка, а его количество уменьшается пропорционально использованию содержимого желточного' мешка.

Так как обнаруженный нами цитохром исследовался впервые, необходимо было разработать методы выделения и очистки этого соединения (табл.2).

В процессе отработки методов очистки цитохрома, было установлено, что при значениях pH 8,0-8,5, при которых обычно проводят эксперименты с белками яиц рыб (Ol In, Decken, 1990),

4

Таблица 2.

ОЧИСТКА ЦИТОХРОМА ИЗ ЯИЦ СИГА.

Этапы очистки Белок иг X Гем Ь нмол 5 Гем й/белок (нмол/кг) Очистка

А. Супернатант гомогената 448,8 100 26,6 100 0,059 (I)

Б. Первое деление на сефадексе С-75 54,5 12,1 10,9 41 0,200 3.4

В. Деление на сефарозе бВ-СЬ 31,9 7,1 7,1 26,7 0,227 3,8

Г. Второе деление на сефадексе <3-75 10,6 2,4 4,1 15,4 0,387 6,5

исследуемый нами цитохром был нестабилен и терял геиовув группу в процессе хранения и фракционирования, особенно щи ионобменной хроматографии. Поэтому, при работе с цитохромом т использовали 50-200 мМ фосфатный буфер с рН 6,0-6,5.

Яйца сиговых рыб гомогенизировали, отделяли оболочки процеживанием через капроновую сетку и центрифугировал! при 22000 С в течение 40 минут. Образовавшуюся в результате центрифугирования водорастворимую часть желтка извлекали шприцен и подвергали гельфильтрации на колонке с сефадексом в-75 (15x500 мм), уравновешенной 50 мМ фосфатным буфером. При этом удавалось за короткий промежуток времени (3 часа) фракционировать большой объем водорастворимой части желтка (5-6 мл) и отделить цитохром от большей части высокомолекулярных белков и их агрегатов.

Затем препараты цитохрома концентрировали год давлением на мембранном фильтре ии-10 до 0,5-1,0 мл и подвергай гельфильтра-

ции на колонке с сефарозой 6В-С1 (15x1000 мм) для полного отделения высокомолекулярных белков. В результате была получена низкомолекулярная фракция белков желтка, содержащая два основных полипептида с молекулярной массой 17 и 20,4 кДа (рис.3.1). Содержание в подученном препарате полипептида с ир 17 кДа более чем на порядок превосходило содержание полипептида с Ыг 20,4 кДа.

Для разделения низкомолекулярной фракции, препарат цитохрома наносили на колонку с сефадексом 6-75 (10x800 мл), уравновешенную 50мМ фосфатным буфером рН 6,5,содержащим 0,1 Ы глюкозу.

Дальнейшая очистка цитохрома оказалась невозможной, так как при ионобменной хроматографии и даже при повторной гельфильтрации происходило почти полное исчезновение характерных спектров поглощения цитсорома. Необходимо отметить, что уменьшение

123456769

2.

29,5-"

14,3-г: Г

30

45

Рис.3. (I) Электрофорез в градиентном (5-20%) 1ШГ в присутствии ДСН содержимого фракций, образовавшихся в результате гельфильтрации. 1,2-стандартные белки, 3-фракция Ш2Л, 4-^6, 5-*28, 6-Л30, 7-Л32, 8-Я34 и Э-ШЭ. Цифры сбоку - молекулярные массы стандартных белков в кДа.. (2) Профиль элвдии низкомолекулярной фракции белков с колонки с сефадексом 0-75 (1x80 см): а-оптическая плотность белков при 280 нм; б-оптическая плотность тема при 420 нм.

оптической активности цитохрома наблюдалось с самых первых этапов фракционирования гомогената и прогрессировало по мэре очистки цитохрома (табл.2). Было установлено, что потеря оптической активности цитохрома происходит лишь в процессе фракционирования. При хранении даже максимально очищенного препарата каких либо значительных изменений в. спектра поглощения не наблюдали.

Попытки стабилизировать белок какими-либо соединениями, обычно используемыми для этих целей, не дали положительного результата.

Чтобы опредилить какой из двух полипептидов, содержащихся в максимально очищенном препарате, соответствует белковой части цитохрома Ъ^д был выполнен электрофорез содержимого фракций, образовавшихся после гельфильтрации на колонке с сефадекссм 0-75 (10x800 км) (рис.3). Было установлено, что фракция )!30, содержащая максимальное количество цитохрома по абсолютному спектру поглощения (рис.3.2.), содержит максимальное количество полипептида с иг 20,4 кДа. Во фракции ШЭ (рис. 3.2.) практически отсутствует гем, однако, явно выражена полоса с Ыг 14 кДа (рис.3.1). Выраженность полосы с Мг 20,4 кДа на электрофореграмме полностью соответствует концентрации гема во фракциях.

Для определения природы гема максимально очищенный препарат цитохрома обрабатывали кислым ацетоном. Гем при этом экстрагировался в ацетон. Пиридин гемохромовые спектры исследуемого гема и стандартного протогема IX приведены на рисунке 4. Из рисунка видно, что пиридин гемохромовые спектры исследуемого гема и стандартного гемивэ полностью совпадают.

Таким образом, было установлено, что гем, входящий в состав прсстетической группы исследуемого нами цитохрома, есть нековапентно связанный протогем 1Х. Следовательно, обнаруженный

400 500 600 ни

Рис.4. Пиридин гемохромовый спектр тема из цитохрома Ь5б0 (а) и стандартного" гемина (б).

наш гемопротеид является цитохромом Ь-типа.

Для получения спектральных характеристик был использован максимально очищенный препарат цитохрома. Спектры поглощения цитохрома регистрировали при 20°С (рис.5 и Бб) и в жидком азоте при 77°К (рис.6а). Абсолютный спектр поглощения восстановленного цитохрома при 20°С имел три характерных максимума при 424, 529 и 560 нм (рис.5а). Соотношение главных максимумов г Л» составляло 5,2/1. Абсолютный спектр поглощения окисленного цитохрома имел единственный хорошо выраженный максимум при 416 нм (рис.56). Дифференциальный спектр цитохрома (восст. - окисл.) при 20°С имел

-15424

400 500 600 ни

Рис.5. Абсолютные спектры оптического поглощения максимально очищенного препарата восстановленного (а) и окисленного (б) цитохрома Ъ560 (20°С, рН6,5).

три характерных максимуа при 428, 529 и 560 нм и минимум при 412 нм (рис.66), а при 77°К три максимума при 427 , 528 и 559 нм и минимум при 411 нм (рис.ба). Соотношение главных максимумов дифференциального спектра составляло 4,3/1.

Восстановленной цитохром не связывал СО и CJT и окислялся кислородом и перекисью водорода. Окисленный цитохром не восстанавливался цитохромом с, NAD(P)H и восстанавливался аскорбатом с высокое скоростью.

Скорость окисления цитохрома определялась спектрофотометри-чески при регистрации уменьшения максимума в а-полосе абсолютного спектра восстановленного цитохрома. На рисунке 7 приведены кинетики окисления цитохрома Ь5б0 кислородом воздуха (а) и 0,01 мМ НрОр (б). Для оценки приведен спектр максимально восстановлен-

400 500 600 им

Рис.6. Дифференциальные (восстановленный окисленный) спектры максимально очищенного препарата цитохрома Ъ560 при 77°К (а) и при 20°С (б), рН 6,5.

ного (в) и максимально окисленного (г) цитохрома в длинноволновой области в этих условиях. Видно, что максимальная скорость окисления цитохрома кислородом соответствует полуокислэнию тема за 28 минут. Скорость окисления цитохрома 0,01 мМ Я^О^ соответствует полуокислению тема за 2,4 минуты, то есть более чем на порядок превосходит скорость окисления кислородом.

Установленная нами скорость окисления цитохрома Ь5б0 кислородом воздуха довольно низка и уступает на несколько порядков скорости окисления классических оксидаз. Так, время полуокисления кислородом единственной оксидазы Ь-типа, цитохрома о, составляет от 0,001 до 0,02 секунд (Арцатбанов и др.,1991).

520 580 им

Рис.7. Определение скорости окисления штохрома ^560 110 измен9низ° оптической плотности в спектре поглощения цитохрома при 560 нм. (а) - динамика изменения степени восстановленности цитохрома после отделения . полностью восстановленного цитохрома от восстановителя, (Ö) - после отделения от восстановителя и добавления 0,01 мМ В^0г, (в) и (г) - спектрн полностью окисленного и полностью восстановленного цитохрома в длинноволновой области, соответственно.

Тем не менее, необходимо отметить, что скорость обменных процессов в яйцах сиговых рыб должна быть приспособлена к медленному развитию зародыша при низких температурах (около 0°С). В этих условиях выявленная скорость восстановления кислорода цитохромом может быть вполне физиологичной. Это подтверждает и тот факт, что в нормально развивающихся яйцах большинства видов сиговых рыб цитохром на протяжении почти всего периода эмбрионально-

личиночного развития находится в значительной степени в окисленном состоянии.

Стандартный редокс потенциал цитохрома определяли при регистрации относительных дифференциальных спектров в присутствии редокс медиатора дихлорфэнолиндофенола со стандартным редокс потенциалом +217 мВ (Досон и др.,1991). На рисунке 8 изображены теоретические кривые титрования одноэлектронного переносчика с редокс потенциалом +193 мВ в линейных (а) и логарифмических (б) координатах. Видно, что экспериментальные точки, полученные при титровании цитохрома Ь^^, хорошо описываются теоретическими кривыми.

Молекулярную массу (¿Гр) цитохрома определяли двумя методами: по гельфильтрации на колонке с сефадексом в-75 (10x800 мм) и по электрофорезу в градиентном (5-20%) ПААГ в присутствии ДСН. По данным гельфильтрации Ир цитохрома составила 36300 Да (рис.96). По данным электрофореза Нг цитохрома составила 20400 Да (рис.9а). Эти результаты указывают на то, что в водном растворе цитохром, по—видимому, образует агрегаты из двух мономеров или достаточно прочные комплексы с другими белками.

Для выяснения функциональной роли цитохрома нами была проведена серия опытов с живыми развивающимися яйцами. Мы проследили изменение редокс состояния цитохрома в яйцах различных видов сиговых рыб в процессе эмбриогенеза. Было установлено, что в незрелых яйцах и в зрелых яйцах в момент овуляции цитохром находится в восстановленном состоянии. После оплодотворения и набухания цитохром окисляется и в яйцах большинства сиговых рыб не изменяет сЕоего редокс состояния. В яйцах белорыбицы удалось наблюдать восстановление цитохрома на стадии мелкоклеточной корули, затем к моменту начала обрастания цитохром окислялся.

Рис.8. Определение стандартного редокс потенциала цитохрома &5б0. Через экспериментальные точки проведет теоретические кривые титрования одноэлектронного переносчика со стандартным редокс потенциалом +193 мВ в линейных (а) и в логарифмических (0) координатах.

Ч

I

,14.3

,20,1 —ЦИТ

5 ЦИг

5 ЦКг

Рис.9. Определение молекулярной массы цитохрома ^560 то Л03®01 электрофореза в градиентном (5-20%) ПААГ в присутствии ДСН (а) и по данным гельфильтрации на колонке с сефадексом 6-75 (10x800 мм) (б). Цифры на рисунке - молекулярные массы стандартных белков в кДа.

вновь восстанавливался на стадии замыкания желточной .пробки и окислялся к моменту начала органогенеза, не претерпевая в дальнейшем изменений редоке состояния.

Удалось, также, наблюдать частичное восстановление цитохрома при инкубации яиц в воде с низким содержанием кислорода. В зависимости от исходного содержания кислорода в воде, количества яиц на единицу объема и площади поверхности воды восстановление наблюдали через 12-48 часов.

В яйцах, помещенных в оптическую кювету (1x1 см), продутую в течение нескольких минут азотом, наблюдалось более быстрое восстановление цитохрома. На рисунке 10 приведена динамика восстановления цитохрома Ъ560 в еивых яйцах ряпушки в условиях дефицита кислорода. Видно, что в течение некоторого времени с

начала эксперимента степень восстановленное™ цитохрома не менялась. Затем происходило постепенное увеличение скорости восстановления до достижения максимального значения, после чего скорость восстановления уменьшалась. . Такая динамика изменения скорости восстановления цитохрома, на наш взгляд, связана с присутствием на начальных этапах эксперимента некоторого количества кислорода, концентрация которого уменьшается с течением времени за счет восстановления цитсхромом и дыхания зародыша. Поэтому, действительная скорость восстановления цитохрома должна быть значительно выше полученного значения. Как видно из рисунка 10, максимальная скорость восстановления цитохрома в условиях эксперимента соответствует полувосстановлению гема за 28 минут.

Приведенные выше эксперименты убедительно показывают, что редокс состояние цитохрома в' развивающихся яйцах сиговых рыб зависит от концентрации кислорода. Мы предполагаем, что кислород и (или) Нмогут быть физиологическими акцепторами электронов для цитохрома.

Рис.10. Скорость восстановления цитохрома Ь^д в живых яйцах ряпушки (С. а1Ъи1а), помещенных в продутую азотом оптическую кювету (1x1 см), Изображенная

на рисунке кривая показывает изменение оптической плотности в спектре поглощения цитохрома при 560 нм.

Водрос о физиологических донорах электронов для цитохрома в-аелтке яиц в этой работе не изучался. Однако, било установлено, что, in vitro, хорошел восстановителем'для цитохрокз Ь5б0 является аскорбат. Анализ физических к гимачвскьх свойств цатохрсиа b-g.-,, а также игензизся с литературе др^еиэ о фувкцьих ыитохромов Ь-язд&, йшеп; к ццтохрому позволяют иредпологеть, что

scsi.íosem,;:: дозорекп алектрсаов kofyr быть ради-яшг органических юлекул, в тон число, возьвкзо, радикала ¿знпэсоз, хотя его? вопрос требует огдзльисго ззучевия.

На oegosfe »ровздбйа^х ьакк эксперкаею-ов к обобцения шекапся в литературе дшпях об особенностях сатеза божов зздгка риб ш считаем что оОнаруагшшй нас* в яйцах ситовах риб цктохром ио йр-лязтся случайна; или анортита запасные веществом гвлхка, а статезерустся и ¡гзбирзтбльно накадлявзетса яйцеклеткой для осуяестпяешй: сирзделеЕшз:, аоеггезво asrac-кся-даатшх, фуаящай в гдохке ящ в процоссс эмбриогенезе.

вывод;'

1. Е tíüiox СЗГ02КХ рыб Обзаруксн .ЧОи^'1 Гь.ССПрСЮИД, веслиэ спектрьльш^: свойств к природа гековой грутлг: которого воззглйал отвести его к нктохро.\'.см b-тша.

2. Цатогржл является видоспзша^ичпш для сиговых рнб и koi:ut рассматриваться как бпогпшкеалй маркер семейства.

3. Щггохро«; bggQ - ЕодсрастзорЕ.аш цктохром с тзекулярной i.'.accci! 20403 Да, докалйзсгвнЕай в водсрзстворшой части í:s:»tke ЛЕЦ CETOBUX рыб. 310 ОДНОЗЛеКТрОЕННИ ЕИЗК0СПЕБ0ВЦ£ ГеКОЛрОТсЕД со стандартна: родохс потзндкалок -¡-193 кВ. Цптохром нз связывает окись углерода и цнавЕД, но окпгляятся кислородом и перекисью ьодореда и восстанавливается асхорбатой.

Количество цитохромэ з яйцах различных видов сиговых рыб варьирует от 0,83 до 9,52 тюл/г. Б пределах отдельного вида концентрация нитохрома колеблется незначительно. У некоторых видов цитохрем вносит значительный вклад в создание окра cm яиц.

5. Цятохро:« находится в желтке яиц на протяжении всего процесса эмбрионально - ллтшночного развития и меняет свое редокс состояние Е ?.га?/зпт сшгадотЕорения н набухания яиц, г также е стает на изменение концентрации кислорода в еоде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО iE SE ДИССЕРТАЦИИ.

1. Черняев S.A., Арцатбанов В.30., ' Млкулш А.Е., Запошок Д.С. Штгохром "О" в лсре сиговых рыб. - Вопросы ихтиологии, I9S7, т.27, bsh.5, с.857-269.

2. Чзрпяэв S.A., Арцзтбзпоз B.D., Мшсулгн А.Е., Валгсок Д.С. Особенности пигментации икры сиговых рнС. - В сборшжс: Биология сиговых рыб. 1938, c.I52-IS0.

3. Валгаок Д.С. Качественная состгв и локализация тгаентоз в икре сиговых рыб. - Тез. докл. III Всесоюзного cobssshhh по лосссевидшм рыбам. Тольятти, 1938, с.46-43.

4. Черняав H.A., Арцатбанов B.D., Валяиок Д.С., Микулин А.Е. Штохром о в икре сиговых рыб, как биохимический .»ларкер семейства Coregontäae. - Тез. докл. III Всесоюзного совещания по лососевид-ным рыбам. Тольятти, 1988, с.372-374.

5. G.Tcherniaev, V.Artzatbanov, A.Hiculiti, D.Yalytishok. The cytochrome Ь-typa in the eggз of Coreganldae ham a familis tnarüer. - Abstracts Sixth congress of european ichthyologists. Budapest, 1988, p.192.

6. Валшок Д.С. Пигментация икры. - В сборнике Пелядь Coregonus peled (Gaelin,1788): Систематика, морфология, экология.

-24-

продуктивность. 1989, с.203-205.

7. Валшок Д.С. Изучение функциональной роли цитохрома b-типа в икре сиговых рыб. Тез. докл. ли Всесоюзного совещания по биологии сиговых рыб. Вологда, 1990, с.5-6.

8. Tcherniaev G.A., Valyushok D.S., Artzatbcmov Y.Yu., Miteulin Л.Е. Cytochrom b^g in the eggs of wMteflsh as biochemical marker of Caregonldae Family. Canadian Journal of fisheries and aquatic sciences, 1992, in press.