Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы пространственно-временной организации мезодермы в раннем развитии рыб

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Розанова, Наталья Владимировна, Москва

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ПЕРЕДАЧИ ИНФОРМАЦИИ РАН

УДК 577.218:591

РОЗАНОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

МЕХАНИЗМЫ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МЕЗОДЕРМЫ

В РАННЕМ РАЗВИТИИ РЫБ

Специальность 03.00.30 - биология развития

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1999

Научный руководитель доктор биологических наук В.П.Божкова

тема: МЕХАНИЗМЫ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МЕЗОДЕРМЫ В РАННЕМ РАЗВИТИИ РЫБ.

Не рождение, супружество или смерть, а гаструляция на самом деле является наиважнейшим событием в вашей жизни

Льюис Волперт (1893)

МОСКВА 1999

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

ВВЕДЕНИЕ--------------------------------------------------------------------------------------1

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. Раннее эмбриональное развитие костистых рыб-----------------------8

1. Строение яйца вьюна, оплодотворение, дробление--------------9

2. Гаструляция-------------------------------------------------------------10

3. Ранняя дифференцировка некоторых тканей--------------------17

ГЛАВА 2. Некоторые характеристики раннего

эмбрионального развития амфибий (Хепорив 1аеу1з)----------------20

1. Строение яйца и дробление-----------------------------------23

2. Гаструляция------------------------------------------------------25

ГЛАВА 3. Механизмы формирования мезодермы у амфибий------------------31

ГЛАВА 4. Пространственно-временная организация мезодермы в

зародышах костистых рыб------------------------------------------------42

ГЛАВА 5. Роль щелевых контактов (ЩК) в эмбриональном развитии.

Ранняя компартментализация зародыша-------------------------------47

1. Формирование канала ЩК---------------------------------------------48

2. Генное семейство коннексинов, тканевое

распределение коннексинов в эмбриогенезе-------------------------53

3. Свойства проницаемости щелевых контактов

и различия, связанные со спецификой коннексинов-----------------56

4. Сигнальные пути включающие взаимодействие

через ЩК-------------------------------------------------------------------57

5. Динамика и пространственные особенности физиологических свойств ЕЦК в развивающихся зародышах.

Коммуникационные компартменты-----------------------------------58

Заключение-----------------------------------------------------------------62

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материал и методика-------------------------------------------------------------------------64

1. Получение икры вьюна-------------------------------------------------64

2. Краткие морфологические характеристики раннего развития вьюна.

3. Особенности приготовления гистологических препаратов

ранних зародышей костистых рыб:

а) гистологическая проводка----------------------------------------------65

б) заливка в парафин--------------------------------------------------------66

в) методы окраски-----------------------------------------------------------68

4. Микрохирургические методы------------------------------------------72

а) изолирование бластодермальных шапочек;

б) культивирование эксплантатов, инкубационные среды.

5. Метод микроинъекций при работе с флуоресцентными красителями,некоторые характеристики используемых красителей (Люциферового желтого, флуоресцеин-декстрана,

диамино-2-фенилиндола, флуоресцеина)------------------------------73

6. Обработка ранних зародышей вьюна дорсализующим фактором Li Cl---------------------------------------------------------------77

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА1. Роль цитоплазматических связей бластомеров с желточной

клеткой в детерминации и регионализации мезодермы у рыб--------79

1.1 .Формирование бластодермы и желточного синцитиального слоя-----------------------------------------------------------79

1.2.Изучение локализации мезодермальной закладки в ранних зародышах с помощью флуоресцентных меток (флуоресцеин изотиоционат-декстрана)------------------------------------------------------91

1.3. Изучение потенций к развитию мезодермы в

v изолированных бластодермах------------------------------------------------93

1.4. Анализ вклада клеток базального слоя бластодермы в мезодермальную дифференцировку на модели

развивающихся эксплантантов-----------------------------------------------99

ОБСУЖДЕНИЕ----------------------------------------------------------------107

ГЛАВА2. Значение ЩК для ранней компартментализации

мезодермы у рыб---------------------------------------------------------------120

2.1. Изучение пространственно-временных изменений проницаемости ЩК с помощью

флуоресцентных красителей--------------------------------------------120

2.2. Коммуникационные компартменты в ранних зародышах рыб. Дорсо-вентральная ассиметрия,

ее проявление в ионной селективности каналов--------------------133

2.3. Соответстие коммуникационных компартментов различным морфологическим структурам

развивающегося зародыша----------------------------------------------135

2.4. Исследование влияния электрического

поля на характер диффузии ионов красителей через ЕЦК--------140

2.5. Изменение границ коммуникационных компартментов в результате дорсализации

зародышей, вызванной ионами Li+.-----------------------------------141

ОБСУЖДЕНИЕ------------------------------------------------------------146

ЗАКЛЮЧЕНИЕ------------------------------------------------------------------------------155

ВЫВОДЫ-------------------------------------------------------------------------------------161

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ---------------------------------------------------------------—166

ВВЕДЕНИЕ

Как известно, общий план строения развивающегося организма устанавливается в процессе гаструляции. В это время предетерминированные к различной судьбе клетки, мигрируя, формируют различные зародышевые листки. Клетки, образующие впоследствие энтодермальные и мезодермальные ткани, попадают внутрь зародыша, а будущие эктодермальные производные и зачатки нервной ткани располагаются по его поверхности. У позвоночных мезодерма является наиболее рано специфицирующейся тканью, которая одновременно подвергается достаточно детальной регионализации. Под регионализацией подразумевается то, что клетки в разных участках мезодермы коммитируются (предназначаются) к дифференцировке в разные специализированные типы. Из дорсальной области мезодермы, в частности, образуется хордомезодерма, которая становится "организатором", формирующим ось тела будущего зародыша. Клеточной спецификации мезодермы предшествует активация ранних зиготических генов Wnt 11, no tail, goosecoid, sna-1, eve-1 и др., некоторые из которых начинают работать уже на бластуле. Интересно, что клетки, активно экспрессирующие эти гены, расположены в краевой области бластодермы (Stachel et al., 1993; Hammerschmidt and Nusslein-Volhard , 1993; Thisse et al., 1993; Schulte-Merker et al., 1994; Talbot et al., 1995), причем экспрессия этих генов внутри краевой области подвергается пространственно-временной регуляции. На сегодняшний день точно известно, что молекулярная ассиметрия развития наступает еще до морфологической. Так, в бластодерме имеется ассиметрия в локализации таких ранних мезодермальных генов рыбы, как goosecoid ( Stachel et al., 1993; Schulte-

Merker et al., 1994 ) и fork head (Jesuthasan and Strahle, 1996) уже на стадии сферы. Показано для zebrafish, что на стадии сферы бластулы становится различим интенсивный сигнал zbmp-2 (Nikaido et al., 1997), локализация которого в бластодерме ассиметрична.

В последние десятилетия были обнаружены и молекулы, регулирующие экспрессию генов, участвующих в формировании мезодермального препаттерна

(работы проводились в основном на амфибиях). К ним относятся белковые факторы из семейств TGF-b, Wnt, FGF и др. (Sive et al., 1993; Kessler and Melton,1994; Slack et al., 1994; Doniach et al., 1995). Аналогичные факторы были обнаружены и у костистых рыб ( Cho et al., 1991; Lemaire et al., 1995; Talbot et al., 1995; Fisher et al., 1997; Furthauer et al., 1997). С каждым годом число обнаруженных морфогенов увеличивается. Существует, по-видимому, значительно большее количество факторов, пока еще неидентифицированных, участвующих в формообразовательных процессах и имеющих сложную взаимную регуляцию (Lemaire et al., 1996). Результатом их деятельности в конечном счете является формирование определенной препаттерной дифференцировки, в частности, мезодермальной.

Идентичности молекулярных механизмов развития мезодермы у амфибий и костистых рыб противостоит несхожесть процессов морфогенеза, в основе которых лежат различия. , между дискоидальным типом дробления рыб и меробластическим типом дробления амфибий. То обстоятельство, что зародыши рыб в последнее время становятся наиболее широко изучаемыми на ' молекулярном уровне объектами биологии развития, говорит о необходимости

проведения детального анализа их клеточных механизмов. Нашей основной задачей было изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании препаттерна мезодермы у зародышей рыб и изучение его развития на стадиях вплоть до раннего сомитогенеза. На первом этапе работы нас интересовало взаимодействие бластомеров с желточной клеткой. Изучение взаимодействия бластомеров с желтком представляется нам важным потому, что зиготические гены, связанные с мезодермальной дифференцировкой, локализуются на стадии поздней бластулы в базальном слое бластодермы, примыкающем к желтку (Schulte-Merker et al., 1992; Stachel et al., 1993; Joly et al., 1993; Schulte-Merker et al., 1994). В процессе развития зародыша возможны два механизма взаимодействия бластомеров с желточной клеткой: переход из нее по цитоплазматическим связям в базальный слой бластодермы материала желтка (материнских факторов) еще до формирования желточного синцитиального слоя (Игнатьева, 1979), и переход низкомолекулярных веществ в бластомеры через высокопроницаемые межклеточные контакты - gap junctions или щелевые контакты (ЩК) (Potter et al., 1966) после формирования ЖСС. Возможно, что именно взаимодействия бластомеров с желтком посредством перечисленных двух механизмов лежат в основе формирования препаттерной генной активности. Важное значение желточной клетки в морфогенезе мезодермы и раннее предполагалось в работах по культивированию изолированных бластодерм рыб (Oppengeimer, 1936; Kostomarova, 1969; Rott et al., 1978 и др.). О важной роли желточной клетки в формировании дорсо-вентральной ассиметрии сообщали и другие работы (Long, 1983; Bozhkova et al., 1994; Mizuno et al.,1996). В недавней

работе Страла и Джисутасана (Jesuthasan and Strahle, 1996) были обнаружены субклеточные механизмы ассиметрии желточной клетки. Так, в желточной клетке различные вещества могут транспортироваться по микротрубочкам, причем процесс этот ассиметричен и в его основе лежит ассиметрия организации микротрубочек кортекса. Показано, что микротрубочки желтка на стадиях дробления входят в краевые бластомеры. Такая транспортировка веществ из желтка возможна, по данным авторов, до стадии 32-х клеток. Однако, цитоплазматические потоки в желтке у зародышей вьюна и данио наблюдаются не только в период дробления, но и позже, вплоть до средней гаструлы (Светлов, 1962). Многие детали процессов взаимодействия бластомеров с желтком не известны. Неясно также, когда заканчивается перенос морфогенетических веществ из желтка в зародыш по цитоплазматическим тяжам.

Трансплантационные эксперименты на рыбах показывают, что клетки становятся детерминированными к мезодермальной дифференцировке не ранее стадии средней гаструлы (Но and Kimmel, 1993). Только детерминированным клеткам свойственно автономное развитие, до этой стадии развитие клеток зависит от окружающих их тканей, как сообщают упомянутые авторы. После прекращения цитоплазматических связей большое значение для клеток приобретают межклеточные взаимодействия через молекулы адгезии и по каналам ЩК. Среди молекул клеточной адгезии, по-видимому, кадгеринам принадлежит ведущая роль при объединении клеток в ткани (Fujimono et al., 1990). Так, для зародышей амфибий было показано участие в адгезии клеток материнского ЕР-кадгерина (Heasman et al., 1994b ). Вполне вероятно участие в

этом процессе белков Wnt семейства и белков катенинового типа (TGF семейства) (Olson and Moon, 1992; Bradley et al, 1993; Kelly et al., 1995). Для зародышей рыб адгезионные молекулы еще не идентифицированы.

Известно, что у большинства зародышей уже ранние бластомеры связаны ЩК, в результате чего небольшие молекулы и ионы (менее 1000 Да) свободно проходят между клетками (см. лит. обзор, ниже). Если каналы ЩК еще не компактизированных зародышей мыши блокировать соответствующими антителами, то несмотря на продолжающиеся деления, клетки теряют способность компактизоваться (Lee et al., 1987). Похоже, что ЩК играют важную роль в синхронизации морфогенетических процессов на клеточном уровне. Однако, их влияние на механизмы формирования мезодермы и ее регионализации все еще далеки от понимания. Какая роль отводится индукционным потокам, обеспечиваемым лиганд-рецепторными взаимодействиями в этом процессе, а какая клеточным взаимодействиям через ЩК, до конца не ясно.

Предполагая, что на самых ранних стадиях потоки цитоплазмы из желточной клетки в бластомеры обеспечивают пространственное распределение материнских детерминант, необходимых для активации зиготических генов, индукции и регионализации мезодермы, мы изучили, во-первых, в течение какого периода развития существуют цитоплазматические связи между бластомерами и ЖК у зародышей вьюна и данио. Мы также описали динамику и пространственную картину процесса разобщения бластомеров с ЖК и выяснили, что этот процесс завершается только на поздней бластуле. Во-вторых, прерывая

цитоплазматические потоки, микрохирургически отделяя бластодерму от желточной клетки, мы проанализировали состояние бластодерм после изоляции в отношении наличия в них потенции к развитию хордомезодермы. Наши данные по изоляции бластодерм дополнили раннее проведенные работы (Kostomarova, 1969; Ротт и др., 1978) и позволили дать им альтернативную трактовку. В частности, мы показали, что повреждение нижнего слоя клеток, целостность которых нарушалась при механическом отделении от желтка, и последующая инкубация в натриевом физиологическом растворе существенно сказываются на их потенциях к развитию. При попытке сохранить эти клетки инкубацией в растворе KCl выяснилось, что процент дифференцированных структур в инкубируемых бластодермах увеличивался. Эти же опыты по культивированию позволили уточнить область бластодермы, в которой локализуются хордоме-зодермальные детерминанты после переноса их из желтка. Мы показали, что детерминанты достигают бластодерму уже на стадии 32 бластомеров. До этого момента дифференцировка в эксплантатах отсутствовала даже при инкубации бластодерм в растворе KCl. Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что мезодермальные детерминанты попадают из желтка в бластомеры по цитоплазматическим связям в период от первых делений дробления до, по крайней мере, средней бластулы. С помощью маркирования флуоресцеин -декстраном (ФД) клеток, имеющих цитоплазматические связи с ЖК, мы показали, что окрашенные на ранней бластуле клетки являются потомками многих тканей, в том числе и потомками презумптивной хорды, однако после стадии 6,5-7 часов развития (13-14 т0) хордальный зачаток развивается уже

более автономно от желтка, тогда как включение меченных клеток в параосевую (сомитную) мезодерму еще продолжается. Похоже, что поступление хордоме-зодермальных детерминант из желтка в бластомеры заканчивается на этой стадии. Это предполагает, что передаваемая по цитоплазматическим связям информация может участвовать в регионализации мезодермы.

Изучая свойства ЩК методом переноса флуоресцентных красителей, различающихся величиной электростатического заряда: флуоресцеина (ФЛ), люциферового желтого (ЛЖ) и диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ), мы впервые обнаружили, во-первых, что каналы ЩК могут избирательно пропускать вещества, различая их по заряду. Во- вторых, мы показали, что свойства ЩК различны в разных областях зародыша на стадиях бластулы и гаструлы. Так, будущая мезодерма в целом отличается по свойствам ЩК от будущей эктодермальной области. Имеются и дорсо-вентральные отличия в ЩК внутри мезодермы. При этом, однако, участок презумптивной хорды не образует ЩК с желточной клеткой и близлежащими клетками параосевой мезодермы и представляет собой изолированный компартмент по всем изученным красителям. Эти данные предполагают, что в процессе детерминации клетки мезодермы проиобретают особые свойства ЩК, способствующие поддержанию их специфичности.

Надеемся, что в целом наши данные окажутся полезными для дальнейших исследований раннего эмбриогенеза рыб и их мезодермы, в частности.

ГЛАВА 1. РАННЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ КОСТИСТЫХ РЫБ

Основные механизмы развития всех костистых рыб очень сходны, отличаясь лишь по времени развития разных органов или систем органов в отношении друг к другу (Timmermans, 1987). Так, яйца костистых рыб по характеру распределения в них цитоплазмы и желтка в большинстве случаев относятся к типу телолецитальных, а по соотношению этих компонентов - к полиплазматическим. Зрелое яйцо находится на метафазе второго деления созревания. Оболочка яйца состоит из хорошо развитой zona radiata и примыкающей к ней наружной оболочки ворсинчатого строения. У всех костистых рыб в оболочке яиц имеется одно микропиле, расположенное в области анимального полюса яйца. Оно представляет собой воронкообразное углубление поверхности оболочки, которое переходит в короткий концевой каналец. Каналец открывается на внутренней поверхности zona radiata. Диаметр концевого канала соответствует ширине головки спермия. У поверхности цитоплазмы находится слой кортикальных альвеол. В области анимального полюса, в районе микропиле, расположено ядро. Боль