Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных

Мелехова, Ольга Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

МЕЛЕХОВА ОЛЬГА ПЕТРОВНА

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.30. - Биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2005|\

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Москоского государственного университета им М. В. Ломноосова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор медицинских наук, профессор доктор физико-математических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Корочкин Леонид Иванович Чернавский Дмитрий Сергеевич

Котелевцев Сергей Васильевич

Ведущая организация:

Институт биологии развития РАН им. М. К. Кольцова

Защита состоится 15 декабря 2005 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им М. В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 15 ноября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Е. Н. Калистратова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Последние десятилетия в развитии эмбриологии ознаменованы большими успехами в генетическом анализе эмбриогенеза. Центральной догмой биологии развития является представление о специализации клеток как результате дифференциальной активности генов. Успехи молекулярной генетики сделали возможным открытие сначала у дрозофилы, а затем и у амфибий и млекопитающих специфических регуляторов, включающих последовательные этапы раннего развития животных. Идентифицированы гены и их продукты, управляющие ранним развитием и участвующие в аксиализации зародыша и начальных процессах дифференцировки, В последние годы существенно изменились представления о механизмах эмбриональной индукции. Основные представления о формировании пространственной организации эмбрионального организма сводятся к тому, что в зиготе существует неравномерное распределение морфогенов - материнских белков - специфически включающих определенные группы генов, продукты которых в свою очередь служат регуляторами следующих фаз развития. Обнаружено существование некоторых морфогенов в неактивной форме, так что для начала их действия необходим дополнительный механизм активации (например, путем ограниченного протеолиза, высвобождающего активные центры морфогена).

Наследуются не только морфологические черты организма, но и сама динамическая картина его развития. Если первая наследственная программа зачастую может быть описана через свои ключевые моменты, связанные с экспрессией определенных (специфических) групп генов, то вторая программа еще далеко не изучена. В этой программе, по-видимому, заложена пространственно-временная организация онтогенеза. В раннем развитии это могут быть те процессы, динамика и распределение которых во времени развития и во внутреннем пространстве зародыша обеспечивают саму возможность экспрессии генов.

Остается открытым вопрос о характере пространственно-временной программы эмбриогенеза. Многими экспериментами показано, что эта программа заложена в цитоплазме зиготы, а реализуется последовательной активацией экспрессии генов, Эпигеномный механизм регуляции раннего развития в свою очередь должен подчиняться пространственно-временным закономерностям, которые и определяют компетенцию и детерминацию различных эмбриональных зачатков.

Начальные условия и параметры порядка пространственно-временной программы индивидуального развития организма не ясны. Задача их определения актуальная не только с точки зрения моделирования основных процессов эмбриогенеза - клеточного размножения, цитодифференцировки и морфогенеза - и познания механизмов их координации, но также и с практической целью определения причин и прогноза возникновения аномалий развития и эмбриональной смертности.

Информационный обмен, присущий всем живым системам, приводит не только к изменению ее специфичес

плиС oStmiuuicfi, связанных с опреде-

РОС. национальная!

БИБЛИОТЕКА

¿"■ffSif J

11" III« i»

ленными наборами структур и ферментов, но и к регуляции ее энергетического состояния. Нами был выбран один из энергетических показателей клеточного метаболизма: уровень свободнорадикальных процессов. Можно считать, что показатель отражает скорость энергетического протока в клетке. Окислительные процессы, протекающие в организме с участием сободных радикалов - активных форм кислорода (АФК) - привлекают в последние годы большой интерес. Сейчас показано, что АФК могут вызывать в клетках те же реакции, как и развивающиеся под действием специфических регуляторов: активацию или ингибирование ферментных систем или генной активности (Sauer е.а., 2001). Особенностью реакций с участием АФК является высокий энергетический выход, зачастую сопровождаемый хемилюминесценцией. Предполагается, что АФК могут играть сигнальную роль в биоинформационных процессах (Saran, Bors, 1989). В систему окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке включены ферментные комплексы митохондрий, микросом и ядра, генерирующие АФК, ферментативные и низкомолекулярные антиоксиданты (СОД, каталаза, глутатионпероксидаза, витамины С и Е), сигнальные АФК и система мембран, меняющая физико-химическое состояние под действием АФК Например, состояние митохондриальных мембран и активность синтеза АТФ регулируются этой системой. Свободные радикалы возникают в нормальном метаболизме, а также характеризуют ранние этапы повреждения клеток при любых патологиях («окислительный стресс»).

Достижения молекулярной генетики ставят перед нами задачу выяснения механизмов связи СР-реакций как параметра окислительно-восстановительного гомеостаза клетки с процессами регуляции экспрессии генов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа посвящена обоснованию роли развития свободнорадикальных процессов как пермиссивного фактора детерминации эмбриональных зачатков, определяющего созревание компетенции в раннем развитии (период пре-детерминации) и готовности к структурно-функциональным перестройкам клеток перед началом специализации.

Задачи:

1. Получить карты распределения относительных концентраций СР в клеточных популяциях зародыша на последовательных стадиях развития.

2. Исследовать субклеточную локализацию и биохимические субстраты СР-реакций.

3. Исследовать механизмы дифференциальной чувствительности эмбриональных зачатков к повреждениям.

4 Полученные данные применить для биотестирования качества водной среды .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

В работе впервые показано фундаментальное значение флукгуаций

энергетического метаболизма для формирования компетенции эмбриональных зачатков и их чувствительности к слабым повреждающим воздействиям, соответствующей периодам детерминации.

Впервые применен оригинальный экспериментальный подход, позволивший обнаружить универсальный неспецифический механизм детерминации, включающей развитие свободнорадикальных реакций и лежащий в основе повышенной чувствительности. В серии многолетних исследований автором был открыт универсальный метаболический параметр, характеризующий эмбриональные клетки в периоде детерминации (вступления в многоступенчатый процесс цитодифференциации). Таким параметром оказалось активное развитие свободнорадикальных процессов. Модифицированная автором для эмбрионапьнальных объектов (амфибии, рыбы) методика радиоавтографического выявления свободных радикалов (CP) (Козлов, 1970) является универсальным способом исследования детерминирующихся эмбриональных зачатков in situ без использования традиционных для этой цели приемов микрохирургии Результаты исследований раннего развития амфибий, в которых использовался этот метод, позволили сформулировать гипотезу о ключевой роли свободнорадикальных реакций в пространственно-временной координации процессов морфогенеза и цитодифференцировки в эмбриогенезе (Мелехова, 1976, 1977, 1990). На основе этих и других исследований (Остроумова, Белоусов, Михайлова, 1977) была разработана модель параметрического управления дифференцировкой (Chernavskii, Solyanik, Belousov, 1980), которая акцентирует внимание на возможной роли неспецифического метаболизма в начальной дивергенции клеточной популяции.

Проблема эпигене!ической программы раннего развития имеет фундаментальное теоретическое значение. Исследование механизмов такой программы важно также в практическом плане для понимания причин аномалий развития и эмбриональной смертности.

Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, что подтверждено авторскими свидетельствами и патентами Разработаны и запатентованы способы оценки жизнеспособности репродуктивного материала гидробионтов и биотестирования качества природной среды. Результаты работы применены в области биотехнологии для оценки методов и условий культивирования и консервации репродуктивного материала животных, а также в области экологической экспертизы природных водоисточников и качества очистки сточных вод. Материалы диссертации включены автором в лекционные курсы.

Материал диссертационной работы представляет оригинальное направление в области теоретической и экспериментальной эмбриологии, которое открывает также новые пути в исследовании механизмов влияния экологических факторов на эмбриогенез.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Всесоюзное совещание «Аспекты клеточной дифференцировки на глазу позвоночных как модельном объекте», Москва, 1973г.; Конференция мо-

лодых ученых морфологов, Москва, 1974г.; V Всесоюзное совещание эмбриологов, Москва, 1974г.; VI Всесоюзное совещание эмбриологов, Москва, 1981г.; I Всесоюзный биофизический съезд, Москва, 1982г; VII Всесоюзное совещание эмбриологов, Ленинград, 1986г.; Ill совещание по применению лазеров в биологической медицине, Москва, 1983г.; симпозиум СЭВ «Свободные радикалы и биостабилизация», София, 1987г.; Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987г.; International Conference on Regulation of FR-reactions, Varna, Bulgaria, 1989; III Всесоюзная конференция по хронобиологии, Ташкент, 1990г.; Regional meating of Internation Union of Physiological sciences, Prague, 1991; I Biophysician Congress of Turkey, 1991; Международная конференция «Народный экологический опыт и современность в природе, машинах и обществе», 1985г.; Международная конференция «Фундаментальные аспекты охраны окружающей среды и экология человека», Томск, 1995г.; Международная конференция, Владивосток, 1996г.; Международная конференция «Биоразнообразие наземных и почвенных беспозвоночных на Севере», Сыктывкар, 1999г.; Международная научно-практическая конференция «Экология речных бассейнов», Владимир, 1999г.; Международная экологическая конференция «Новое в экологии и безопасность жизнедеятельности», СПб, Балтийский государственный технический университет, 2000г.; Российская конференция «Радиохимия-2000», СПб, 2000г.; Международная конференция «Энергетика-2000», Обнинск, 2000г.; III Всероссийская конференция «Физические проблемы экологии», Москва, 2001г.; II Международный симпозиум по биоиндикаторам, Сыктывкар, 17 - 19 сентября 2001г.; Международный конгресс «Экватек-2002», Москва, 2002г.; Международная конференция «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах», Москва, 2002г.; Международная конференция «Разнообразие и управление ресурами животного мира в условиях хозяйственного освоения европейского севера», Сыктывкар, 2002г.; Международная конференция «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных», Саранск, 2005г.; Международный конгресс «ВэйстТэк 2005», Москва, 2005г.

Глава 1. СВОБОДНОРАДИКАЛЪНЫЕ ПРОЦЕССЫ В НОРМАЛЬНОМ РАЗВИТИИ АМФИБИЙ

1.1. Методический подход

Далее будут продемонстрированы данные о CP-процессах в развитии зародышей Anura, полученные в основном на природной икре травяной лягушки (в некторых случаях - шпорцевой лягушки).

Работа велась преимущественно на одном виде животных в течение достаточно длительных отрезков времени, включающих смену фаз развития. Было получено описание поведения одного параметра субклеточного энергетического метаболизма - интенсивности CP-реакций - при проведении измерений in situ в системе целого организма радиоавтографическим вариантом метода привитой сополимеризации (Козлов, 1970). Описание представляли в виде распределения процесса в целом зародыше, т.е. в виде карт (Мелехова, 1976, 1977). Затем полученные описания сопоставляли с хронологией и локализацией основных фаз морфогенеза и дифференцировки. Уровень СР-реакций хорошо отражает интегральную скорость окислительного метаболизма клетки и физико-химическое состояние мембран (что существенно для их реактивности). CP-реакции очень чувствительны к различного рода внешним воздействиям на клетку.

Результаты подсчетов обрабатывали статистически: определяли показатели дисперсии, затем статистическую достоверность найденных региональных различий в концентрации метки определяли по критерию Стьюдента (Р > 0,95).

Поскольку применение t-критерия основано на отличии распределения экспериментальных данных от нормального (Гауссова) распределения, проверяли, подчиняются ли наши экспериментальные данные без введения дополнительных условий закону нормального распределения. Графическое изображение распределения всей совокупности дат, полученных на поперечном срезе нервной трубки и эктодермы (ст. 20), без разделения на условные участки, дало кривую нормального распределения. Группировка дат по условным участкам среза, т.е. применительно к образующимся структурам глазного зачатка выявила достоверные региональные различия концентрации метки.

1.2. Исследование топографии свободнорадикальных реакций в нормально развивающемся зародыше

Во время дробления существенно различаются по уровню энергообмена области презумптивной энтодермы и дорсального кортекса, способные при пересадках направлять развитие других частей зародыша в различных направлениях (Curtis, 1962; Nieuwkoop, 1969). Эта региональность повторяет различия в скорости энергообмена в соответствующих участках цитоплазмы начинающего дробиться яйца. Активация ядер начинается в области зародыша, характеризующейся наиболее высоким уровнем радикалообразования.

Эти факты позволяют предполагать участие СР-процессов в становлении ци-топлазматической локализации морфогенетических потенций, молекулярная сущность которого не вполне ясна.

Представление о «цитоплазматической локализации» позволяет рассматривать детерминацию зародышевых листков как функцию взаимодействия цитоплазмы их клеток, унаследованной от разных участков сегрегированной цитоплазмы яйцеклетки, с геномом. Картина распределения СР во время дробления приводит к предположению, что кортикальная реакция оплодотворенного яйца связана с наличием антиоксидантов в кортексе. Заметна высокая концентрация зерен серебра по следу мужского пронуклеуса и в области слияния пронуклеусов. Эти первичные области репрессированного и активированного энергообмена могут обусловить заметные впоследствии различия активности радикалообразования в презумптивных эктодерме и энтодерме.

Итак, в начале дробления наиболее высок уровень СР-процессов в районе расположения будущей энтодермы, затем, после индукционного воздействия энтодермы, начинают выделяться по активности радикалообразования клетки презумптивной мезодермы (рис. 1, стадии 2, 5). В презумптивной эктодерме уровень энергообмена остается низким до начала гаструляции. После индукционного контакта с хордомезодермой начинается стойкая активация энергообмена в презумптивном нейробласте((рис. 1, стадии 9. 13. 16). Однако этот процесс отчасти начинается и спонтанно во время гаструляции, что заметно по некоторому приросту скорости радикалообразования во всем эктобласте, а также и в презумптивном нейробласте еще до контакта с индуктором. В развивающемся глазном зачатке уровень СР-процессов на стадиях 19-21 более высок в стенках глазного пузыря, уравнивается с уровнем СР-процессов в линзовой эктодерме во время их индукционного контакта ((рис I. стадия 19). Все сказанное приводит к заключению, что для прохождения процессов индукции необходим определенный уровень энергетической готовности клеток. Поскольку уровень энергообмена в клетках реагирующей системы после контакта неизменно возрастает, можно предположить, что индукция связана не только с переходом веществ, специфически воздействующих на геном, но и с действием неспецифических факторов, активирующих и стабилизирующих процессы обязательного метаболизма, которые идут в зародышевых клетках в большой степени за счет окисления желтка.

Степень детерминированности, т.е. биологический возраст клеток зачатков органов зародыша, по нашим данным, пропорциональна суммарной относительной интенсивности в них СР-процессов за время от начала развития до исследуемого момента. Это не противоречит принятому представлению об уровне латентной дифференцировки частей зародыша как функции суммарной продолжительности интеркинетических состояний их клеток (Детлаф, 1965), так как на протяжении клеточного цикла наибольшее количество СР генерируется, по-видимому, в течение периодов в! и (Козлов, личное сообщение).

гтчь 17%

Стадия 9. Гаорум

< 2 Д 4 $ « т зоны и мер»

шШ

133**671» Н? лонм тапере

Стадия 13 пляямяя Г9СТРУМ

Рис. 1. Регионадьность СР реакций у зародышей травяной лягушки (данные авторадиографии).

Слева - схема сагиттального или поперечного среза зародыша на разных стадиях развития. На схемах участки, в которых подсчитывали зерна восстановленного серебра, разделены условными границами. Штриховкой отмечены только те участки, где разность концентраций треков по отношению к соседним участкам статистически достоверна. Интенсивность штриховки на схемах срезов качественно отражает отличие концентрации СР в соответствующем участке от среднего уровня этой концентрации по всему срезу или по органу, в котором находится рассматриваемый участок. Справа - гистограмма распределения концентрации зерен восстановленного серебра (треков). На оси абсцисс - зоны замеров на срезе, на оси ординат - концентрация зерен восстановленного серебра С/100 мкм2. Цифры над гистограммами указывают процентное отличие (ДС/Сср, %) концентрации зерен в данном участке от среднего уровня. Вертикальными линиями у вершины столбцов показаны величины а среднего квадратичного отклонения).

Спямя 16- Рянияя ней рул*

1 : э * ь КС »нн мира

Рис. 2. Изменения среднего уровня СР-реакций по мере развития зародыша. —— в головном отделе нервной трубки, а после стадии 24 - в сетчатке; —--в линзообразующей эктодерме, а после стадии 24 - в линзе; О -головной отдел нервной трубки; Д - сетчатка; • - эктодерма; А - линза.

Стадо» развития

1.3. Изменения общего уровня свободнорадикальных реакций во время зародышевого и личиночного развития травяной лягушки.

На протяжении позднего эмбрионального и личиночного периодов развития обнаружены три больших подъема уровня СР, общих для всех исследованных органов (рис. 2). Первый из них предшествует началу активного кровообращения и вылуплению зародыша из оболочек и соответствует по времени активному перекисному окислению в мембранах желточных гранул, делающему их содержимое доступным действию окислительных ферментов. Эти процессы приводят к возрастанию средней относительной концентрации СР в зародыше в 7 - 10 раз. Второй подъем интенсивности СР-реакций наступает, когда у личинки прорывается анальное отверстие и исчезают наружные жабры, в связи с чем изменяются процессы пищеварения и дыхания (ст. 33). Начало третьего подъема средней интенсивности СР-процессов в организме

личинки прослеживается перед метаморфозом (ст. 45 - 50) Таким образом, каждый из этих «пиков» СР-реакций соответствует по времени физиологической перестройке в организме личинки, что, по-видимому, определяет «критический период развития».

1.4. Субклеточная локализация свободнорадикальных реакций в эмбриогенезе бесхвостых амфибий.

Как показано ранее, в эмбриогенезе бесхвостых амфибий локальное повышение уровня свободнорадикальных (СР) реакций устойчиво коррелирует по месту и времени с процессами детерминации (Мелехова О.П, 1976а, б), которые можно определить как приобретение и стойкое сохранение в генетическом аппарате клеток состояния готовности к активности определенных для каждого типа ткани групп генов и репрессии остальной части генома. В то же время причинно-следственная взаимосвязь этих процессов со СР-реакциями не ясна. Для исследования такой связи проведены эксперименты, выявляющие субклеточную локализацию СР-реакций. Результаты представлены на рис. 3.

I п т

Стадии развития зародыша

Рис. 3. Распределение относительной концентрации СР (ИС полиакриламида) в субклеточных фракциях зародышей бесхвостых амфибий на разных стадиях эмбриогенеза: а) 1 - суммарная фракция; 2 - митохондрии; 3 -меланосомы; 4 - желточные гранулы; б) 1 - «тяжелые» ядра: 2 -«легкие» ядра; I - гаструла; II -хвостовая почка; ///-личинка.

Обобщенные данные о количестве метки, включавшейся в каждый тип органелл, выражали в виде процента от общего количества метки, приходящегося на все анализируемые фракции.

Часть материала на стадии гаструлы обрабатывали методом гистоав-торадиографии.

Таблица 1. Распределение относительных концентраций СР в субклеточных компонентах зародышей амфибий на разных стадиях эмбриогенеза (методы ПС, фракционирования и радиометрии)

Субклеточная фракция Стадия развития зародыша

Гаст- Хвостовая Личинка

рула почка

Ядра :

суммарная 26,1 27,2 6,7

«тяжелые» 16,7 18,8 4,0

«легкие» 9,4 8,4 2,7

Митохондрии 9,5 6,8 51,1

Меланосомы 31,3 43,5 26,1

Желточные гранулы 33,0 23,5 16,0

Данные, полученные методом гистоавторадиографии, показывают, что в клетках гаструлы амфибий радикапообразование более активно в ядрах, чем в цитоплазме. При этом отношение концентрации метки в ядрах и цитоплазме в эктодермальных клетках существенно меньше (2 : 1), чем в энтодермальных (10 : 1). Опыты с выделением субклеточных фракций показывают, что в эмбриональных клетках до конца эмбриогенеза наиболее активное радикалооб-разование обнаруживается в ядрах, желточных гранулах и меланосомах. Доля же включения метки в митохондрии на стадиях гаструлы и хвостовой почки не превышает 10% от общей суммы. К началу личиночного периода развития происходит значительное увеличение содержания CP в митохондриальной фракции и уменьшение - в ядерной. Таким образом, в тот период развития, когда интенсивно идет детерминация зачатков зародыша (стадии гаструлы и хвостовой почки), наблюдается активное радикапообразование в ядрах. Позже, при переходе к периоду терминальной дифференцировки (стадия личинки), вклад ядер в общий уровень радикалообразования падает, но резко возрастает вклад митохондрий. Соотношение интенсивности радикалообразования в ядрах клеток энтодермы и эктодермы гаструлы, полученное методом гистоавторадиографии (таблица 2), подтверждается и на изолированных ядрах. Включение метки происходит более эффективно в «тяжелые» ядра энтодермы, чем в «легкие» ядра эктодермы, что особенно заметно на стадиях гаструлы и хвостовой почки; эти различия сглаживаются к личиночному периоду. Эти первичные клеточные типы, выделяющиеся во время гаструляции, уже в раннем развитии различаются по некоторым признакам. Так, для энтодермы характерна более ранняя детерминация, определяемая микрохирургическими методами (Nieuwkoop, 1969), более ранняя активация транскрипционной функции ядер (Bacharova, Davidson, 1966), большая ее интенсивность

(Woodland, Gurdon, 1968) (рис. 4), а также более медленная по сравнению с эктодермой пролиферация. Таким образом, первые три процесса в энтодер-мальных клетках идут по времени параллельно с интенсивным ядерным ра-дикапообразованием. В то же время более высокий уровень пролиферации в эктодермальных клетках наблюдается на фоне меньшего (по сравнению с энтодермальными клетками) содержания CP-центров в их ядрах.

гРНК

Стадии развития по Ньюколу

Рис. 4. Изменение интенсивности синтеза транспортной (/и) и гетерогенной (г) РНК в процессе развития шпорцевой лягушки в пересчете на 1 клетку (по Woodland and Gurdon, 1968).

Таблица 2. Распределение относительных концентраций СР* в клетках гаструлы бесхвостых амфибий

Локализация измерений Концентрация зерен восстановленного серебра (на 25 мкм2)

Эктодерма: ядра Цитоплазма 22,6 ± 4,6 11,7± 2,5

Энтодерма: ядра Цитоплазма 43,5 ± 5,5 4,1 ±0,5

* Использованы методы привитой сополимеризации и гистоавторадиографии

Высокий уровень включения метки в желточные гранулы объясняется, по-видимому, интенсивно идущими в эмбриогенезе процессами утилизации желтка, в которых определенную роль может играть перекисное окисление липидов, поскольку желток представляет собой фосфолипопротеидный ком-

плекс. Значительная доля включения метки в меланосомы связана, вероятно, с существованием стабильных CP состояний в меланине. Изменение содержания метки в меланосомах при развитии зародыша может быть объяснено с точки зрения гипотезы об участии меланина в системе антиокислительной защиты клеток (Сакина и др., 1980). Значительное увеличение включения метки в митохондрии по времени совпадает с изменением физиологического статуса зародыша, а именно с началом кровообращения и подготовкой к активному движению и питанию при переходе к личиночному периоду жизни.

1.5. Биохимические субстраты свободнорадикальных реакций.

Определен вклад различных биохимических фракций зародышевых клеток в процессы образования метаболических свободных радикалов в различные периоды эмбриогенеза: во время дробления (преобладание реплика-ционных процессов в ядрах), бластуляции (включение транскрипционной функции ядер), гаструляции и начального органогенеза (первичная диффе-ренцировка и активный морфогенез, период детерминации специфической генной экспрессии), вылупления (переход к периоду терминальной диффе-ренцировки в начале личиночной жизни).

Материалы по 50 - 100 зародышей и личинок травяной и шпорцевой лягушек.

Методы ПС и радиометрия. Сроки инкубации с меченым индикатором - 3 ч (в сериях I, 2) и 1 ч (в сериях 3, 4). В некоторых опытах зародышей после включения импульсной метки (в течение 50 мин) отмывали и далее инкубировали еще 15 ч, а затем подвергали химическому фракционированию с целью исследовать дальнейшие метаболические превращения меченых сополимеров. Результаты пересчитывали на концентрацию субстрата: липидов (взвешивание после выпаривания), концентрацию РНК и ДНК определяли спектрофотометрически по A.C. Спирину, белка - по Лоури.

Характер распределения метки по биохимическим фракциям зародышевых клеток хорошо воспроизводился для всех стадий развития. Обобщенные данные о радиоактивности каждой фракции выражали в процентах от суммарной радиоактивности всех исследованных фракций данного возраста зародышей. Для проверки предположения об участии CP-реакций в процессах фосфорилирования проводили также опыты с одновременной инкубацией зародышей на предгаструляционных стадиях в растворе динитрофенола (концентрация 5 • 10'3 М) и мономера ИС-АА с последующей радиометрией, а также дальнейшие наблюдения за развитием зародышей, подвергнутых действию динитрофенола. Изучали также воздействие синтетического антиокси-данта ионола на уровень CP-реакций и ход развития зародышей.

Результаты наших опытов, представленные в табл.3, свидетельствуют о том, что CP-реакции принимают большое участие в метаболизме зародышевых клеток и, возможно, служат одним из связующих звеньев нуклеинового, белкового и липидного обмена.

Радикалообразование в липидах в эмбриональном периоде идет гораздо активнее, чем у личинок; включение метки во фракцию ДНК наиболее высокое во время дробления, когда синтез ДНК имеет максимально возможную для данного вида животных скорость, а затем снижается и остается примерно на одном уровне во время всего исследованного периода. Включение метки во фракции РНК и белков увеличивается с возрастом, особенно резко в периоды, предшествующие активации транскрипции (ранняя бластула) и специфического белкового синтеза (органогенез).

Значительная доля метки в раннем эмбриогенезе включается во фракцию липидов, причем малая (3 - 6%) по весовому отношению часть ее -фракция кислых липидов, основную часть которой составляют фосфоинози-тиды, - оказывается наиболее значимой по содержанию CP (до 67% общей радиоактивности образца выделенных липидов (табл.4). Дополнительное время жизни зародышей после отмывки от меченого мономера |4С-АА еще в 1,5 раза увеличивает процент включения метки именно во фракцию кислых липидов. Компоненты плазматических мембран - фосфоинозитиды (ФИ) являются веществами, необходимыми для опосредования клеткой внешних сигналов, - вторичными мессенджерами (Berridge, Irvine, 1984, Berridge, 1993). В передаче сигнала внутри клетки участвует кальций, который активирует про-теинкиназу, и этим актом начинается каскад фосфорилирования белков, ведущий к ответной реакции клетки. Изучен путь воздействия через систему фосфоинозитидов на процессы клеточного деления: при этом активируется механизм обмена ионов, выкачивающий ионы водорода из клетки, в результате чего повышается внутриклеточный рН.

Можно предположить, что включение метки ИС-АА во фракции ДНК и РНК, ДНР и РНП, а также в белки в значительной мере связано именно с фосфорилированием цитоплазматических и ядерных белков. Подтверждением этого служат опыты с инкубацией зародышей в предгаструляционном периоде в присутствии динитрофенола (ДНФ) и ,4С-АА одновременно (табл.5). Действие разобщителя окислительное фосфорилирование ДНФ вдвое снижает уровень радикалообразования, оцениваемый по реакции свободноради-кальной сополимеризации, и прекращает развитие зародыша (гаструляция не наступает, хотя жизнь зародыша еще некоторое время продолжается).

Данные, приведенные в табл.5, показывают, что при дополнительной инкубации в течение 15 час происходит перераспределение включившейся импульсной метки: доля ее в белках растет (от 26 до 35%), а в липидах уменьшается почти вдвое (с 9,5 до 5%), но при этом изменяется соотношение меченых липидных компонентов. По-видимому, в этих процессах главную роль играют именно ФИ, так как в опыте Б (табл 2) доля радиоактивности ФИ в радиоактивности всей фракции липидов повышается также примерно в 1,5 раза.

Накопление метки МС-АА в белковой фракции, по-видимому, связано с возникновением CP-состояний фермент-субстратных комплексов при работе окислительно-восстановительных ферментов, а также, возможно, идет и за

счет каскада актов фосфорилирования при работе системы фосфоинозитид-ных мессенджеров.

Свободнорадикальные состояния в липидах, детектируемые методом привитой сополимеризации, также могут иметь различное происхождение. Большая их часть возникает в клетках при аутоокислении мембранных липи-дов с образованием перекисей, содержащих непредельные карбоновые кислоты Активные радикалы этого происхождения могут непосредственно атаковать мембраносвязанные белки или нуклеиновые кислоты, модифицируя их функции Показано также, что может иметь место радикалообразование в ядерных мембранах. Процессы свободнорадикального окисления в липидах могут быть связаны с изменением скорости пролиферации клеток (Алесенко, Бурлакова и др., 1975, 1984). Наличие СР-состояний в метаболизме ФИ, обнаруженное в нервных волокнах (Лимаренко и др., 1969) и эмбриональных клетках низших позвоночных (настоящая работа), указывает на существование еще одного пути влияния регуляторной системы внутриклеточных промоторов и ингибиторов СР-реакций на формирование клеточного ответа -через вторичные мессенджеры. Работой той же системы может объясняться и накопление метки 14С-АА во фракциях РНП и ДНП вследствие фосфорилирования гистонов и негистоновых ядерных белков, так как процессы фосфорилирования ядерных белков также имеют решающее значение для функционирования ядра, а фосфорилирование в ядерных порах и затем при инициации посттранскрипционной регуляции экспрессии генов.

Таким образом, свободнорадикальные реакции могут играть существенную роль в регуляции процессов дифференцировки, связанной с последовательной инициацией транскрипции и трансляции в эмбриональных клетках.

Таблица 3. Возрастная динамика участия СР-реакций в липидном, нуклеиновом и белковом обмене у зародышей шпорцевой лягушки

Возраст за- Радиоактивность образца, % от суммарной

родышей Липиды РНК (РНП) ДНК Б

(ДНП) елок

Мо- 3 27 22 1

рула 7 34 25 4

Бластула 31 30 15 10

Нейрула 16 47 13 39

Личинка 8 33

Таблица 4. Возрастная динамика относительного уровня радикалообра-зования во фракциях общих липидов и полифосфоинозитидов

Возраст зародышей Радиоактивность образцов, расп/мин/мг липида

Общие липиды (1) Полифосфои-нозитиды (2) Процентное отношение 1:2

Поздняя гаструла 19,90 11,70 5

Позняя нейрула 43,50 9,37 9,0

Средняя хвосто- 19,01 12,80 2

вая почка 2,0

7,3

Таблица 5. Метаболические превращения привитых сополимеров у зародышей травяной лягушки

Радиоактивность фракции, % Вариант опыта*

А В

Липиды 9,6 7,2

РНК (РНП) 50,0 61,0

ДНК (ДНП) 13,0 49 11,0

Белки 26,0 11 19,0

*А - инкубация в течение 50 мин (на стадии поздней гаструлы) и немедленное фракционирование, Б - инкубация в течение 50 мин на стадии поздней гаструлы, отмывка, фракционирование через 15 ч на стадии средней хвостовой почки; В - инкубация в течение 50 мин на стадии средней хвостовой почки и немедленное фракционирование

Таблица 6. Влияние ДНФ на интенсивность радикалообразования у зародышей травяной лягушки на стадии бластулы

Вариант опыта Радиоактивность пробы, М ± о, расп/мин/мг ДС Р,% Срок наступления гаструляции

Инкубация без ДНФ Инкубация с ДНФ 1698±126 835±85 51% Через Зч Не наступает

* Оценка по интенсивности реакции привитой сополимеризации 14С-АА.

Таблица 7. Влияние антиоксиданта ионола на интенсивность радикалообразования у зародышей травяной лягушки на стадии поздней бластулы

Радиоак-

Вариант тивность пробы, АСР=(О Дальней-

опыта М ± а, -К)/К шее развитие

расп/мин/мг

Инкубация 15760 - Гаструля-

без ионола ±154 ция без отклоне-

ний

Инкубация в присутствии 10" 3М ионола 8353 ± 701 46% Гаструля-ция не завершается

Воздействие антиоксиданта ионола также снижает уровень СР-реакций в зародыше на 46% и прекращает вскоре его развитие.

Проведен анализ свободнорадикальных процессов в липидах, выделенных из зародышей и личинок травяной и шпорцевой лягушек. Метод ПС и радиометрии Липиды из зародышей и личинок лягушки экстрагировали по методу Фолча. Фиксацию липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии (пластинки Merk с накопителем) с использованием «метчика» фосфитидилинозитола. Таким образом, достигали разделения кислых липидов на пластинках в системе растворителей - хлороформ : метанол : аммиак (9 : 7 : 2). Радиоактивность полученных на пластинках фракций измеряли после их растворения методом жидкостной сцинтилляции. Для более точной идентификации концентраций свободных радикалов по фракциям липидов применяли также метод контактной авторадиографии, экспонируя пластинку с разделенными фракциями липидов и «метчиком» в контакте с рентгеновской пленкой.

Для определения весовых соотношений фракций фосфолипидов был применен метод денситометрического сканирования пластинок на приборе «Хромоскан-3» с автоматическим количественным расчетом фракций.

Результаты: свободнорадикальные процессы в липидах, выделенных из эмбрионов и личинок травяной и шпорцевой лягушек, развиваются активно во фракциях фосфоинозитидов, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхо-лина.

Наиболее высокий уровень свободнорадикальных реакций характеризует фосфоинозитиды, причем в пересчете на весовые единицы уровень метаболических СР-реакций в фосфоинозитидах в несколько раз выше, чем в других мембранных фосфолипидах.

Возрастная динамика СР-реакций: периоде детерминации (нейрула) по сравнению с периодом наиболее активной пролиферации (бластула) и терминальной дифференцировки (личинка) уровень СР-процессов в фосфоинозитидах наиболее высок. Относительное количество фосфоинозитидов в мембранах на стадии бластулы, нейрулы и личинки остается почти постоянным, тогда как содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина к личиночному периоду падает.

Исследована также возрастная динамика скорости обмена фосфатных групп в фосфоинозитидах, выделенных из зародышей и личинок травяной лягушки. Объекты инкубировали в присутствии радиоактивного фосфора в течение одного часа, затем выделяли липиды, разделяли их на фракции методом тонкослойной хроматографии и измеряли радиоактивность фракций методом жидкостной сцинтилляции. Результаты исследования показывают, что соотношение фосфатидил-инозитол-4,5-дифосфатов и фосфатидилинозитола

более высоко в течение эмбриогенеза (стадии гаструлы, нейрулы, хвостовой почки), и вдвое понижается в личиночном периоде.

Таким образом, 1) обмен фосфоинозитидов в эмбриональных клетках включает реакции, идущие по свободнорадикальному механизму и 2) активность обмена фосфоинозитидов, как и общая интенсивность СР-процессов наиболее высока в периодах эмбриогенеза, связанных с детерминацией (запуском дифференцировки).

Таблица 8. Относительное содержание различных фракций фосфолипи-дов у зародышей н личинок травяной лягушки

Фракции фосфолипидов Условные весовые единицы по данным денситометрии (пересчет)

Зародыши на стадии нейруляции Личинки вскоре после вылупления

Фосфатидилхолин 0,0330 0,0198

Фосфатидилэтаноламин 0,0187 0,0133

Фосфоинозитиды 0,0081 0,0101

Фосфатидилсерин 0,0032

* Применены методы: экстракция липидов, тонкослойная хроматография, определение соотношений фракций фосфолипидов метолом денситометрического сканирования пластинок (прибор Хромоскан-3) с автоматическим количественным расчетом фракций)

Относительное количество более насыщенного фосфотидилхолина на 50% уменьшается после вылупления, фосфоинозитидов - увеличивается на 25%, фосфатидилэтаноламина (менее насыщенного) увеличивается на 41%. Мембраны становятся более пластичными. При этом интенсивность фосфорного обмена в фосфоинозитидах наиболее высока в эмбриональном периоде и вдвое понижается в личиночном.

1.6. Обсуждение результатов.

Участие ядра и цитоплазмы в системе СР-реакций

в эмбриональных клетках.

Как показывают приведенные результаты, после оплодотворения по уровню радикалообразования значительно различаются центрально-вегетативная и субкортикальная зоны яйца, а в последней достоверно различаются ее дорсальная и вентральная части. Детальный анализ автографов показывает, что первичные области с повышенным уровнем окислительного метаболизма, видимо, располагаются в районах окружения мужского и женского пронуклеусов. Возможно, что первичным индуктором перекисного окисления липидов и радикалообразования в ооплазме являются факторы, внесенные при оплодотворении спермием. В области центрально-

вегетативной цитоплазмы интенсивность радикалообразования растет затем много быстрее, чем в анимальной части яйца.

К началу десинхронизации дробления анимальных и вегетативных бластомеров (с 32-клеточной стадии) начинается заметное включение метки в ядра вегетативных бластомеров, а к стадии морулы ядерно-цитоплазматическое отношение включение равно 1 (рис. 5). После этого в том же регионе изменяется структура клеточного цикла (появляется фаза в] и замедляются деления). Перед включением транскрипционной функции пре-зумптивно-энтомезодермальных ядер в них начинается быстрый рост активности радикалообразования (до 10-кратного ее увеличения). Область меченых ядер по мере развития от ранней к поздней бластуле распространяется таким образом, что на вентральной стороне достигает поверхности зародыша, а на дорсальной доходит до границ области с первоначально низким уровнем радикалообразования в цитоплазме.

Дорсальная губа бластопора закладывается по границе области слабо-меченных и сильномеченных ядер. Во время гаструляции резко активируются СР-процессы как в цитоплазме, так и в ядрах клеток презумптивного нейроб-ласта, контактирующих с хордомезодермальным слоем. Аналогичное резкое повышение уровня СР-процессов в эктодерме наблюдается при развитии глазного зачатка в условиях индукционного контакта линзовой эктодермы со стенкой глазного пузыря. Последующие морфогенетические процессы - перемещение внутрь хордомезодермы, поляризация клеток при образовании нервных валиков, а в глазном зачатке образование хрусталиковой плакоды -снижают уровень СР в этих зачатках.

Таким образом, начало заметного радикалообразования в ядрах бластомеров во время дробления предшествует удлинению клеточного цикла, а примерно 10-кратный рост уровня СР в ядрах сопровождает активацию транскрипционной функции (рис 6); локализация же этих процессов, вероят-

Рис. 5. Включение метки 14С акриламида в ядра и цитоплазму эмбриональных клеток травяной лягушки (данные авторадиографии). Кривая 1 -экодерма (микромеры); кривая 2 - энтодерма (макромеры); Д - 32 бластомера; М - морула; РБ - ранняя бластула; СПБ -средняя и поздняя бластула; РГ - ранняя гаструла; ПБ -поздняя гаструла.

Д м РБ СПБ рг пг

но, задается при ооплазматической сегрегации. Морфогенетические движения клеток возникают в районах зародыша с высоким уровнем СР-реакций; в последующих процессах морфогенеза (поляризации клеток, инвагинационных перемещений) этот уровень снижается.

В клеточных группах, входящих в индукционное взаимодействие, соотношения интенсивностей СР-реакций таковы, что до начала их контакта высокой скоростью радикалообразования обладает индуктор, а во время контакта уровень СР-реакций повышается в реагирующей эктодерме и уравнивается в обоих зачатках.

Данные, полученные методом авторадиографии (с использованием 14С-полиакриламида), показывают, что в клетках зародышей амфибий после бластуляции радикалообразование более активно в ядрах, чем в цитоплазме (см табл. 1 и 2 в разд. 1.4)

Все эти данные убеждают в неслучайном характере распределения СР-реакций на всех исследованных стадиях развития эмбрионов амфибий и позволяют предполагать связь этих метаболических реакций с процессами детерминации эмбриональных зачатков.

О возможном участии CP-процессов в механизмах регуляции эмриогенеза.

Полученные нами данные проливают свет на последовательность событий, подготавливающих гаструляционный процесс.

Внедрение спермия в яйцеклетку вызывает разрыхление ее плазматической мембраны и, по-видимому, инициирует перекисное окисление липи-дов. Процесс свободнорадикального окисления распространяется в связи с перемещениями мужского ядра. Последствием этого может быть инициация окисления в желточных гранулах. Желток представляет собой не только энергетический субстрат, но может играть известную регуляционную роль в мор-фогенетических процессах. При деструкции желточных гранул освобождаются протеазы, возможно, принимающие участие в деблокировании материнских матриц и морфогенов (Slaughter, Triplett, 1977). CP-реакции имеют цепной характер и распространяясь по липидной фазе мембранных структур, захватывая новые области и инициируя изменения физико-химического со-

Рис. 6. ▲ - разброс интенсивности СР реакций; ■ - рост интенсивности СР реакций; • - синтез РНК в ядрах клеток эмбриона (зона стадии 2, рис. I).

4 t

Стадии развития

стояния мембран органелл, что связано и с активацией функциональной активности этих органелл, в частности - митохондрий, окружающих женское ядро. В желточных гранулах обнаружен также материнский белок активин (Asashima, 1998), участвующий в передаче дорсального мезодермапьного сигнала (Kornell a. Kimelman, 1994).

Протеазы из желточных гранул могут участвовать также в деблокировании других материнских факторов - Vgl, ВМР4, относящихся к суперсемейству белков - трансформирующих факторов - TGF-ß. Суперсемейство TGF-ß играет ключевую роль в выборе пути развития и дифференцировке клеток (Hogan, 1996). Сигналы TGF-ß опосредуются семейством рецепторных протеинкиназ и влияют на регуляцию клеточных циклов. В замедлении клеточных циклов принимают непосредственное участие и АФК (Алесенко, Бур-лакова и др., 1975). Показано также, что АФК могут выступать как субклеточные посредники в регуляции экспрессии генов и трансдукции сигналов (Allen, Tresini, 2000). Характерно, что к стадии 32 - 64 бластомера область преимущественной активации CP-реакции локализуется в районе организационного центра Ньюкупа, при этом быстро активируются CP-процессы в ядрах, возможно, вследствие непосредственной инициации со стороны цито-плазматических мембранных органелл (Каган, 1980). Процесс может идти с самоускорением за счет того, что первичная активация CP-реакций в цитоплазме деблокировала факторы TGF-ß, а их высвобождение в свою очередь активирует мембраносвязанную НАДФ'Н-оксидазу, что приводит в свою очередь к усилению внутриклеточного образования АФК (обзор: Бурлакова и др., 2001). Таким образом, CP-реакции могут участвовать в замедлении клеточных циклов, что является первым приложением «паттерна» ооплазматиче-ской сегрегации.

В разделе 1.5 показано, что развитие CP-реакций в значительной мере связано с метаболизмом фосфоинозитидной системы внутриклеточных мес-сенджеров (Мелехова и др., 1988). Сейчас известно, что автономная фосфои-нозитидная система имеется и в ядре, и в развитии амфибий эта система активируется к стадии 64 бластомеров (Berridge, 1993). Первым признаком активации метаболических процессов в районе организатора Ньюкупа является сначала появление флуктуаций в концентрации CP-процессов в ядрах, затем быстрый ее рост, и после этого - включение транскрипционной функции ядер (6). Стадия средней бластулы является переломной для зародыша, еще и потому, что клетки презумптивной мезодермы приобретают способность к перемещению. Вероятно, это тоже связано с развитием CP-окисления в этом зачатке, т.к. для перемещения необходимо оптимальное фазовое состояние плазматических мембран, обеспечивающее их пластичность.

Отметим, что в начале гаструляции наиболее интенсивно развиваются CP-реакции в организаторе Шпемана - дорсальной губе бластопора - и в районе прехордальной пластинки. Сейчас известно, что в этих районах локализована преимущественная активация многих генов и секреторных протеинов, связанная с организацией осевого зачатка (обзор: Stennard, 1997).

Мы отмечали также, что при индукционном взаимодействии хордоме-зодермы и нейроэктодермы во время гаструляции активируются СР-процессы в нейробласте. Возможно, это связано с переходом в нейроэктодерму микро-сом (Каган и др., 1975) и инициации распада желточных пластинок после индукционного взаимодействия (Уанно, 1962).

Активация СР-процессов во взаимодействующих частях индукционных систем глазного зачатка отмечена нами и ранее (Мелехова, 19766). Активное перемещение и поляризация клеток, вероятно, связаны с расходом того запаса фосфорилированных белков, который формировался при повышении уровня СР-реакций перед началом морфогенетических движений, а также с расходом энергосубстрата - желтка, освобождением внутриклеточного пространства, снятием блока ингибиторов, что в совокупности ускоряет возможность инициации трансляции и терминальной дифференцировки. Отметим, что скорость синтеза АТФ в митохондриях также связана с циклами перскисного окисления липидов их мембран (Дмитриев, 1997).

Заключение.

Изложенные данные дают нам основание сформулировать следующую гипотезу: СР-окисление может быть отнесено к категории процессов, сопрягающих уровни регуляции целого организма зародыша и его субклеточных реакций; пространственно-временная организация раннего развития может осуществляться при участии градиентов скорости СР-процессов на основе неравномерного распределения антиоксидантов в ооплазме; уровень латентной дифференцировки клеток зародыша определяется соотношением запасов желтка и скорости его окисления, в которую свой вклад вносят различные энергозависимые морфогенетические процессы; эти необратимые процессы могут играть роль «песочных часов», вместе с циклическими биохимическими реакциями отсчитывающих биологический возраст зародышевых клеток

1.7. Временная организация свободнорадикальных процессов в развитии амфибий.

Становление суточного ритма СР-процессов в эмбриогенезе.

Опыт ставили в феврале при постоянной температуре 17° в условиях естественной смены дня и ночи на зародышах, полученных от гипофизиро-ванных травяных лягушек. Фиксацию материала производили через каждые 3 часа в течение первых 6 суток развития, начиная с момента оплодотворения. Методы: ПС, гистоавторадиография, радиометрия. Изменения концентрации СР состояний у зародышей травяной лягушки периода раннего развития носят ярко выраженный колебательный характер, причем колебания интенсивности СР реакций ритмичны (рис. 7).

Однако суточный ритм включения метки С14 лабилен на протяжении всего исследования. В основном ритм носит полифазный характер, причем основные максимумы приходятся на вечерние часы. По своим характерным

особенностям ритм CP процессов у зародышей травяной лягушки сходен с таковым у личинок периода преметаморфоза. Взрослые травяные лягушки -насекомоядные животные, ведущие ночной образ жизни. Их личинки питаются растительными остатками и активны по преимуществу в дневные часы. Наш опыт показывает, что интенсивность CP процессов у зародышей Rana temporaria с самого начала развития оказывается выше в вечерне-ночные часы, чем в утренне-дневные. Возможно, что эту особенность ритма CP процессов можно рассматривать как адаптивно-обусловленную и наследуемую.

Рис. 7. Суточная динамика (изменение числа треков) CP процессов в эмбриогенезе травяной лягушки на разных стадиях развития зародышей (по Ка-бару и Маро): 1 - в хордомезо-дерме, 2 - в развивающейся нервной системе, 3 - в туловищной эктодерме, 4 - в энтодерме. По оси абсцисс: верхняя строка - время суток, нижняя строка - стадии развита развития. На схемах срезов зачернены области подсчета треков.

Исследован также характер суточных колебаний интенсивности СР-реакций в различных областях зародыша Rana temporaria, начиная с ранних стадий развития. Фиксацию материала производили в течение 5 суток, начиная с момента гаструляции, через каждые 3 часа. Во всех исследованных закладках зародышей Rana temporaria выявлены достоверные колебания уровня CP-процессов. Как правило, во всех областях зародыша колебания CP синхронны. Исключение представляет период нейруляции, когда синхронность сохраняется только в пределах индукционно связанных образований.Во время нейруляции (3-й сутки развития) ритм CP-процессов существенно изменяется, особенно резко нарушаясь в закладках, участвующих в индукционном

процессе. Непосредственно после нейруляции (4-е сутки) ритм колебаний уровня ГР во всех закладках становится синхронным, обнаруживая характерные максимумы в 5 и 14 час. В последующие сутки характер ритма существенно не меняется, добавляется лишь максимум в 20 час.

На протяжении 15 час, начиная от стадии ранней гаструлы, уровень СР достоверно выше в хордомезодерме по сравнению с презумгттивной нервной пластинкой. Уровень СР-процессов в период нейруляции (3-й сутки развития) значительно выше в хордомезодерме и контактирующей с ней нервной пластинке, чем в экто- и энтодерме.

Наличие градиента в уровне СР между индуктором (хордомезодермой) и реагирующей тканью (презумптивной нервной пластинкой) в начале их индукционного взаимодействия может быть связано с особым физиологическим состоянием клеток хордомезодермы, необходимым для индуцирующего воздействия. На стадии поздней гаструлы интенсивность СР-процессов в хордомезодерме и контактирующей с ней презумптивной нервной пластинке одинакова. До конца исследования клетки индуктора и реагирующей ткани по своему физиологическому состоянию, оцениваемому по уровню СР, остаются в динамическом равновесии.

Исключительно высокий уровень СР в хордомезодерме и контактирующей с ней нервной пластинке в период нейруляции (3-й сутки развития), по сравнению с уровнем СР в энтодерме, утверждает наличие различного рода дорсовентральных метаболических градиентов на этой стадии.

Время как фактор развития.

Полезно для обсуждения проблемы биологического возраста ввести понятие «скорость энергетического протока» в живой системе, ее «энергиро-ванность». Последняя - интегральный показатель энергетического обмена, который зависит от поступления извне субстратов биологического окисления, скорости их окислительного фосфорилирования в клетках (она, в свою очередь, зависит от состояния мембранных структур и конформационного состояния ферментов) и, наконец, скорости расходования биологической энергии, АТФ, для выполнения жизненных функций клетки.

Тогда функциональная активность биологической системы, будет периодически уменьшаться и расти в зависимости от соотношения скоростей образования и расхода энергозапасов. «Барьер необратимости», соответствующий смене фаз развития, может возникать в связи с образованием или деградацией каких-либо ключевых структур в клетке или организме.

В развитии организма отсчет индивидуального времени начинается с оплодотворения, а точнее - с начала перестроек в мембране и цитоплазме яйцеклетки, вызванных контактом со спермием.

Самыми очевидными процессами, связанными с течением индивидуального времени, в начале эмбриогенеза являются клеточные деления (сравнимые с маятниковыми часами) и необратимое развитие - образование в образующемся множестве клеток разнокачественных клеточных популяций -зародышевых листков, их взаимное перемещение, начало процессов формо-

образования клеточной дифференцировкн ("песочные часы"). Т.А. Детлаф в 60х г.г. предложила в качестве такой безразмерной единицы измерения продолжительности эмбрионального развития (и отдельных его фаз) длительность клеточного цикла в периоде синхронного дробления (т0). В это время продолжительность клеточного цикла - самая короткая за всю жизнь организма. Она измеряется только временем синтеза ДНК и процесса митоза.

Согласно утверждению Т.А. Детлаф, уровень латентной дифференцировкн (т.е. мера необратимых изменений клона эмбриональных клеток) пропорционален суммарной продолжительности интерфазной активности их ядер.

Начало процессов дифференцировкн, т.е. начало «старения» всего организма и отдельных популяций эмбриональных клеток связывают обычно с появлением и последующим удлинением фаз С| и в2 в клеточном цикле. Если мы обозначим меру необратимых морфофункциональных изменений организма как его «биологический возраст», то можно сказать, что биологический возраст зародыша определяется необратимыми процессами морфогенеза, роста и дифференцировкн клеток. Морфогенетические процессы происходят на основе матриц и энергосубстратов, запасенных в оогенезе. Поэтому все затраты на эти процессы, как энергетические, так и исходного «строительного материала», включены в баланс иного рода, чем в сформированном организме, имеющем развитые функциональные системы. По сравнению с ним, зародыш - менее открытая система: он осуществляет только диффузный газообмен с окружающей средой; обмен веществом - т.е. питание и выделение еще не происходят. Поэтому биологический возраст зародыша можно измерять скоростью течения «метаболического времени», т.е. скоростью расхода субстратов и накопления отходов метаболизма. Для зародыша животных, в яйцеклетках которых содержится такой четко структурированный энергосубстрат как желток (пластинки, гранулы), подходит как мера его «биологического возраста» скорость и степень утилизации желтка. Потребление кислорода целым зародышем является также показателем, характеризующим общую интенсивность его метаболизма и скорость развития. Способом, позволяющим сравнить течение «метаболического времени» даже в отдельных зачатках зародыша. Относительная скорость протока в энергетических системах клетки может бьггь измерение путем регистрации высокореакционноспособных полупродуктов биологического окисления и фосфорилирования - свободных радикалов. Выявление свободных радикалов с помощью введения в живые зародыши радиоактивного индикатора и последующего анализа радиоавтографов на гистологических срезах этих зародышей позволяет получить информацию об относительной интенсивности энергообмена в разных зачатках зародыша. Как накопление, так и расход АТФ и других макроэргов повиди-мому отражаются в динамике. Все основные процессы развития энергозави-симы. Поэтому показатель, отражающий общий уровень энергетического метаболизма в клетках зародыша, является важной их характеристикой. Как показано в первой части работы, при исследовании эмбриогенеза низших позвоночных этим методом оказалось, что фазы компетенции и детермина-

ции в каждом отдельном зачатке эмбриона характеризуются высокими концентрациями свободных радикалов в его клетках. Этот факт, вероятно, отражает ускорение расхода энергосубстратов, повышение скорости потребления кислорода, образования АТФ, процессов фосфорилирования, связанных с подготовкой и самими актами рецепции на клеточных мембранах и реализацией ответа клетки на полученные сигналы, в частности - с активной работой фосфоинозитидной системы.

Процессы специализации клеток, характеризующие начало образования зачатков органов эмбриона, связаны с постепенным появлением метаболических различий внутри дотоле однородной клеточной популяции. Стадии инициации очень важны для будущей судьбы клеток, т.е. направления их дифференцировки и морфогенеза. Инициация вначале обратимых различий в скорости деления, способности к движению, физико-химических характеристиках мембран, т.е. в количественных показателях неспецифических процессов жизнедеятельности эмбриональных клеток приводит в конце концов к появлению стойких различий, которые связаны с синтезом специфических для каждого клеточного типа транскриптов и белков. В раннем развитии удалось в некоторых случаях показать причинную связь неспецифических процессов утилизации желтка с высвобождением из желточных гранул ферментов, деблокирующих активность морфогенов (Slaughter, Triplett, 1975), а также самих морфогенов (Asashima, 1998). Инициация начала и определение направления дифференцировки четко зависят от биологического возраста не только всего зародыша, но и отдельных его клеточных популяций. Клетки, в которых раньше начался процесс латентной дифференцировки и замедлились деления, являются более продвинутыми по степени своего развития, как бы более старшими. Потенции к развитию «старших» клеточных популяций, вступивших на путь специализации, сужаются. Чувствительность к индуцирующим дифференцировку стимулам, готовность к началу специализации, т.е. состояние компетенции возникает в эмбриональных клетках в четкой связи с временем и является внутренне присущим им свойством, возникающим и угасающим в определенной фазе развития эмбриона и неодновременно во всех его клетках. Известна четкость пространственно-временной организации развития, которая обеспечивает совпадение перемещения клеток в нужное место в определенный момент, возникновение компетенции к ответу на индуцирующий сигнал в зачатке-реципиенте и формирование способности к передаче этого сигнала в зачатке-индукторе. Известнейшей моделью, иллюстрирующей все эти закономерности, является индукция хордомезодермой нейрального типа дифференцировки в эктодерме при их взаимодействии во время гаструляции.

Результаты наших исследований показывают значительное повышение уровня CP-процессов в индукторе и реагирующем зачатке - вначале автономное, а затем уравнивающееся во время индукционного взаимодействия (рис. 7). Предполагают связь возникновения и угасания компетенции с наличием определенных мембранных рецепторов к индукторам. Предполагают также, что в этом явлении могут играть существенную роль некие неспецифические

метаболические факторы, «разрешающие» передачу индукционного сигнала от мембраны к ядру, или же изменение параметров мембраны, реактивности микрофиламентов, - т.е. приобретение клеткой способности реагировать на индукционное воздействие.

Опыт генетического анализа раннего развития у амфибий и насекомых также обращает наше внимание на ключевую роль деблокаторов морфогенов - веществ, управляющих экспрессией генов (Корочкин, 2002).

До сих пор не ясна природа тех эндогенных процессов, благодаря которым эмбриональные клетки приобретают компетенцию к тому или иному типу дифференцировки. Наши эксперименты по выявлению свободных радикалов в клетках зародыша позволяют предполагать, что эти эндогенные процессы связаны с неспецифической подготовкой клеток к началу дифференцировки и включают как один из основных моментов "метаболическое время" или клеточный "биологический возраст".

В будущей мезодерме и нейральной эктодерме активность ядерного радикалообразования заметно повышается тогда и там, когда и где начинают действовать индукционные системы, описанные П. Ньюкупом и Г. Шпема-ном, ко1да «старшие» зачатки индуцируют запуск дифференцировки в «младших». Можно предположить, что каскады фосфорилирования, начинающиеся в цитоплазме, приводят к изменению структуры клеточного цикла и физико-химического состояния хроматина, что и является предпосылкой дифференцировки. Эти неспецифические процессы могут быть отнесены к пермиссивным факторам, от которых зависит возможность вступления на путь специализации, но не ее направление (т.е. не активация определенных генов).

Заключение.

Рассмотрение всей последовательной картины свободнорадикальных реакций в раннем развитии амфибий позволяет заключить, что весь запас "метаболического времени", отведенного природой на эмбриогенез данного вида, задается исходным соотношением субстратов, промоторов и ингибиторов свободнорадикального окисления в яйцеклетке. Разница «биологического возраста» отдельных клеточных популяций определяется количеством актов клеточных делений (маятниковые часы) и расходом субстратов на энергетическое обеспечение морфогенеза ускоряющим ход «песочных часов».

Все эти процессы обеспечивают «метаболический порог» вступления клеточных популяций зародыша в дифференцировку. Таким образом, энергообмен оказывается координатором разнообразных процессов раннего развития в целостной пространственно-временной программе.

Таким образом, скорость окислительных процессов может считаться параметром порядка, определяющим начальные этапы дифференциации в эмбриональном развитии. «Энергетический паттерн» зародыша заложен в цитоплазме материнской клетки (яйца), в виде характерного неравномерного распределения субстратов и ингибиторов окислительных процессов.

Промотором окисления субстратов является внедрение в яйцо отцовской клетки.

В результате нелинейного развития окислительных процессов в яйце, дробящемся на дочерние клетки, возникает динамический «энергетический паттерн» - характерное распределение зон с высокой и низкой скоростями окисления. По границам этих зон впоследствии проходят морфологические процессы бифуркации - дифференциация зачатков зародыша - будущих органов и отделов тела.

Таким образом, пространственно-временная программа раннего развития носит эпигеномный характер, выражается в соотношении скоростей энергетических процессов в эмбриональных зачатках. По-видимому, неравновесное развитие энергетических процессов является одним из условий дивергенции клеточных популяций зародыша и начала специализации клеток.

Какие наиболее принципиальные следствия дает обнаружение энергетического параметра порядка? Прежде всего - это само существование энергетического «паттерна» развития будущих структур. Важно, что тот же «паттерн» является и программой апоптоза - неслучайной гибели высокоэнерге-тичных клеток под воздействием повреждающих факторов, т.е. возникновения уродств.

Глава 2. МЕХАНИЗМЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ПОВРЕЖДАЮЩИМ ФАКТОРАМ

Целью этой части работы было исследование механизмов чувствительности эмбриональных клеток к повреждающим факторам. Детерминация генной экспрессии и процессы дифференцировки закономерно сочетаются в эмбриогенезе с перемещениями клеток, изменениями их форм, чувствительности к сигналам и повреждениям, а также скорости пролиферации. Мы предполагаем, что контроль генной активности в процессе дифференцировки является частью эпигеномной пространственно-временной программы развития. Моменты инициации экспрессии генов, также как и подготовка к морфо-генетическим процессам, обеспечиваются энергетически с участием свобод-норадикальных реакций. Известно, что время клетки наиболее неустойчивы на пике энергетического метаболизма (Бауэр, 1935; Кондрашова, 1979).

Основными задачами этой части работы были:

изучение вариаций чувствительности эмбриональных клеток к электромагнитным излучениям и некоторым химическим токсикантам в зависимости от возраста зародышей и фазы дифференцировки отдельных клеточных популяций и анализ нарушений развития при воздействии повреждающих факторов в критические периоды эмбриогенеза, связанные с детерминацией основных систем органов.

Объекты исследования: зародыши травяной и африканской шпорцевой лягушек, полученные в лабораторных условиях. В качестве повреждающих воздействий использовали электромагнитное излучение - тотальное рентгеновское и сфокусированное на отдельных эмбриональных зачатках лазерное (длины волн 632 нм и 337 нм), а также химические токсиканты - растворы

хлорида меди, пестициды, нефтепродукты и др. Обсуждается роль активных форм кислорода (АФК) в качестве сигнальных молекул, запускающих каскад ответных реакций на изменение окислительно-восстановительного состояния клеток. АФК могут также выступать посредниками активации экспрессии генов. Под их действием перестраивается и физико-химическая система регуляции клеточного метаболизма мембранами. Уровень свободных радикалов отражает устойчивость или неустойчивость клетки к внешним воздействиям: чем он выше, тем легче клетка выводится из стационарного состояния. Чувствительность эмбриональных зачатков или целых зародышей оценивали экспрессно по изменению уровня CP-реакций (методом привитой сополиме-ризации (ПС), а в более поздние сроки - по клеточной гибели, нарушениям морфогенеза и дифференцировки, скорости развития и изменениям жизнеспособности эмбрионов.

2.1. Радиочувствительность зародышей травяной лягушки.

При анализе сравнительной радиочувствительности различных клеточных групп, учитывали две основные группы их физиологических свойств. Радиочувствительность как таковая связана с легкостью выведения живой системы из стационарного состояния, реактивностью, лабильностью и обычно коррелирует с метаболической активностью данной группы клеток (Gray, 1951, Кузин, 1970, Кудряшов, 2004). Для оценки ее, очевидно, возможно применение физико-химических методов выявления CP, которые позволяют зарегистрировать ранние этапы скрытого лучевого поражения. Результирующее проявление лучевого поражения, регистрируемое интегральным показателем (выживаемость клеток или организма), определяется также активностью ре-параторных систем, способностью к адаптации. При этом длительность латентного периода реализации лучевого поражения в значительной мере определяется интенсивностью пролиферации.

Изучали радиочувствительность зачатков поздней нейрулы (рис. 8).

С целью выяснить, насколько изменение концентрации MP в зачатке глаза в первые часы после облучения зависит от степени его дифференцировки; коррелирует ли первичная реакция дифференцирующихся клеток на облучение с морфологическим эффектом облучения, наблюдаемым в более поздние сроки; подтвердится ли в условиях нарушенного рентгеновским облучением (РО) развития найденная в первой части работы корреляция между локальными повышениями уровня CP-реакций и периодами детерминации и перехода к дифференцировке.

Облучение проводили в дозе 300 р на установке РУД 100/20 при напряжении ЮОКв, силе тока 3 ма и мощности дозы 400 р/мин., тотально, на воздухе.

Условия фиксации и гистологические и радиоавтографическую методики (см. гл. 1).

Митозы и некрозированные клетки подсчитывали в тех же условных участках срезов, где и концентрацию метки.

Стадия 20 300 г

(6 час после облучения)

I 4-

Стадия 20 _ _ 300 г —25

* 121

«1 4»!

Пигментмый __

Нин (4) кя

Эктодерме

84%

<0%

т Хрусталик

¡тш

Рис. 8. а) Распределение относительных концентраций СР в глазном зачатке через 6 часов после рентгеновского облучения (300 рентген) на стадии 20; б) концентрация СР и морфология лучевого поражения глаза на 3 сутки (стадия 25) после рентгеновского облучения на стадии 20. Цифры под гистограммами указывают № участка (на схеме среза), где определена концентрация СР.

Результаты исследования распределений относительных концентраций СР, а также распределения митозов и некротизированных клеток в глазном зачатке после РО представлены в виде карт-схем, чтобы иметь возможность наглядно сравнить их с результатами первой части работы.

Смертность и аномалии развития у облученных головастиков. После облучения в дозе 300 р (0,252 кДж/см2) на стадиях 18-20 (поздняя нейрула) во время личиночного периода (до метаморфоза) гибнут 50 - 70% зародышей и личинок. У 20 - 25% личинок отмечена микрофтальмия. В 4 глазах из 24, обработанных гистологически, был резко нарушен морфогенез: глазные зачатки у личинок представляли собой маленькие почкообразные выросты стенки мозга, не достигающие эктодермы. По сравнению с контрольными, облученные зародыши и личинки отстают на 1 - 2 стадии в развитии, отставание не одинаково у различных особей.

Наиболее радиочувствительными как по экспрессной оценке (сдвиг уровня СР-реакций), так и по отсроченным эффектам (клеточная гибель, нарушения морфогенеза и дифференцировки) являются зачатки в стадии детерминации. Прослеживали сосояние глазного зачатка (Мелехова, 19766); облучение применяли на последовательных стадиях развития, и наиболее уязвимыми оказались детерминирующиеся клеточные популяции. Радиочувствительность более интенсивно пролиферирующих клеточных популяций этих

зачатков относительно ниже. По-видимому, во время облучения был нарушен морфогенез глазного пузыря и процесс индукции линзы.

Предполагается, для осуществления процессов индукции необходим определенный уровень энергетической готовности клеток. Вероятно, индукция связана с возможным действием не только специфических факторов, определяющих индивидуальность активируемых генов, но и с влияниями другого типа, активирующими и стабилизирующими процессы обязательного метаболизма. (см. гл. 1).

2.2. Чувствительность эмбриональных зачатков к локальному лазерному облучению.

Материал зародыши вьюна и травяной и шпорцевой лягушек. Определяли чувствительность к лазерному облучению зародышей на стадиях дробления, гаструляции и нейруляции. Варьировали локусы воздействия, руководствуясь картами презумптивных зачатков и картами распределения концентраций свободных радикалов (рис.1). Облучение: гелий-неоновым лазером ЛГ-75 непрерывного действия (А. - 633 нм) и импульсным лазером на азоте ЛГИ-21 (к = 337 нм) с частотой импульсов 100 Гц. Мощность контролировали измерителем ИМО-2; диаметр пучка варьировали с помощью диафрагм; температуру в локусе облучения измеряли с помощью термопары медь-константан, заточенной в форме микроножа и вводимой в зародыш так, чтобы избежать прямого нагрева термопары от лазерного луча.

Пролиферативную активность в разных регионах зародыша изучали, подсчитывая митотический индекс (на серийных гистологических срезах), свободные радикалы выявляли методами ПС и гистоавторадиографии. Прослеживали наличие аномалий, изменения темпа развития облученных зародышей до вылупления.

Дифференциальная чувствительность различных регионов зародышей амфибий к локальному лазерному облучению И у лягушки, и у вьюна эмбрионы во время дробления относительно менее чувствительны к лазерному излучению, сфокусированному на части поверхности эмбриона. Гораздо большая чувствительность проявляется при гаструляции и нейруляции, и в этих периодах развития сильно различается реактивность различных групп клеток. Наибольшее поглощение и наибольший локальный нагрев происходят на анимальном полюсе эмбриона, где самая большая концентрация пигмента. Здесь уже под лучом или через несколько минут образуется дефект в поверхностном слое клеток, характеризующийся вначале нарушением межклеточных контактов (МК), а затем - иногда слиянием и вакуолизацией поврежденных клеток. В этой зоне зародыша клетки активно делятся и происходит быстрое замещение погибших клеток. На слабо пигментированном вегетативном полюсе зародыша ни первичные, ни отдаленные по времени дефекты не возникают. В начале гаструляции наиболее значительными являются последствия облучения важного в морфогенетическом отношении района дорсальной губы бластопо-

ра, где клетки поверхностного слоя поляризуются и инвагинируют, что является условием детерминации. Доза облучения, которая не нарушает процессы дробления, нанесенная во время гаструляции в эту область, в 100% случаев нарушает правильность перемещения клеточного пласта и процессы детерминации, что приводит к характерным уродствам в спинном отделе зародыша (полному отсутствию экто- и мезодермальных структур) и затем - к гибели эмбриона. При облучении на стадии ранней нейрулы участка нервной пластинки, где в момент облучения происходит детерминация зачатков глаза и уха, удается разделить процессы отторжения клеточного материала и нарушения развития. При воздействии светового луча с плотностью мощности 120 мвт/мм2, не вызывающем клеточной гибели, через сутки после облучения наблюдали отставание в развитии органов чувств на облученной стороне головы. Влияние на гаструля-гтю амфибий чсмерного изучения от ра ¡личных источников Нарушения развития при локальном световом воздействии зависят также от частотных характеристик излучения и могут быть связаны со специфическими фотохимическими реакциями. Появление выпуклого (неотторгающегося) первичного дефекта с нарушением клеточных контактов, при воздействии лучом азотного лазера (X = 337 нм) происходит при малой плотности мощности и при отсутствии теплового эффекта.

Для оценки исходного метаболического состояния эмбриональных клеточных популяций мы использовали следующие показатели: уровень синтеза ДНК, оцениваемый по включение 3Н-тимидина; уровень митотической активности и интенсивность радикалообразования, оцениваемую по реакции ПС. В районе дорсальной губы бластопора ранней гаструлы как митозы, так и меченые 3Н-тимидином ядра встречаются крайне редко. Здесь происходит генерализованная активация экспрессии многих генов, определяющих формирование осевого зачатка ^еппагс!, 1997). В то же время этот зачаток эмбриона резко выделяется высоким уровнем СР-процессов. На анимальном полюсе ранней гаструлы меченых тимидином ядер встречается больше, чем в дорсальной губе бластопора. Уровень СР-процессов в этой зоне в 6 раз ниже, чем в дорсальной губе бластопора. Клетки этой зоны более устойчивы. На стадии ранней нейрулы в районе глазного зачатка уровень СР на 20% выше, чем в соседних участках нервной пластинки; по уровню же митотической активности они не различаются.

Приведенные данные позволяют заключить, что чувствительность эмбриональных клеток к локальному лазерному облучению повидимому определяется не их пролиферативной активностью, а повышенным уровнем сво-боднорадикальных реакций и процессами активации экспрессии генов. При этом возникающее в результате облучения поражение мембран и клеточных контактов может оказаться решающим для нарушений процессов морфогенеза и детерминации эмбриональных клеток. Это приводит к возникновению характерных аномалий развития. Таким образом, локальное лазерное облучение Может быть ИСПОЛЬЗОВаНО ДЛЯ исг.тгеппврния мехяннчмпи чм^рь

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

33 С-Петербург

ОЭ Ж я* *

огенеза.

2.3. Чувствительность зародышей к химическим воздействиям.

Объектом исследования были гаструлы травяной и шпорцевой лягушек. Измерения уровня свободнорадикальных реакций осуществляли с помощью метода ПС в нашей модификации и радиометрии. Инкубировали зародыши в присутствии токсикантов различной природы в концентрациях, близких к предельно допустимым для рыбохозяйственных водоемов.

В таблице 9 обобщены результаты экспрессного биотестирования качества воды по метаболическому критерию на гаструлах амфибий и проверка заключения в период до поздней хвостовой почки (около 2 сут). Для биотестирования токсичности были выбраны вещества различной природы. Ориентиром при выборе их концентрации служили представления о предельно допустимых концентрациях химических соединений, принятых Минрыбводом для рыбоводных водоемов. Применение чувствительных эмбриональных тестов показало, что концентрации различных веществ, считающиеся допустимыми, оказывают явное токсическое действие на ранние стадии развития.

Токсическое действие испытываемых веществ определяется по метаболическому критерию экспрессно - в течение 90 мин при помещении объекта в загрязненную среду. Величина отклонения измеряемого показателя (уровня СР-реакций) от контроля сильно различается при действии разных токсикантов. Эти различия могут характеризовать степень повреждения. Однако динамика ответа метаболической системы на внешние воздействия обычно носит сложный фазовый характер. Химические вещества - токсиканты могут быть либо ингибиторами, либо промоторами окислительных свободнорадикальных реакций. Наши многочисленные эксперименты на различных биотестах свидетельствуют о том, что абсолютная величина отклонения уровня метаболических СР-реакций от контроля в первые часы воздействия имеет диагностическое значение и в тех случаях, когда достигает более чем 30 - 40%, коррелирует с началом патологических процессов в организме. В приведенных примерах значительные сдвиги уровня окислительного метаболизма (СР-реакций) в первые 90 мин адаптации к загрязненной среде соответствуют гибели большей части зародышей через 2 сут.

Нами показано участие свободнорадикальных реакций в работе фос-фоинозитидной системы усиления и внутриклеточного переноса химического сигнала (см. гл. 1). По-видимому, этот метаболический механизм участвует как в обеспечении процессов детерминации эмбриональных клеток, так и в снижении порога их чувствительности к повреждающим воздействиям. Способ универсален, так как примененная нами индикаторная реакция характеризует быстрый нсспецифический ответ тест-объекта на воздействие химических соединений различной природы, прогностический ответ может быть получен в течение 1 сут; чувствительность способа высокая: например, определяется токсичность таких концентраций солярового масла и медного купороса, которые считаются допустимыми в рыбоводной практике; как значительно менее токсичное вещество определяется биостимулятор - янтарная кислота.

Таблица 9. Определение эмбриотоксичности различных химических соединений по метаболическому критерию (объект - гасггрулы шпорцевой лягушки).

Испытываемое Концентрация Удельная ра- (К-0)/К,* Заключение Гибель / уродство

вещество доли диоактивность, % по экпрессному (суммарно за 2 сут)

ПДК** имп./мин.шт биотестированию

Вода (контроль) - - 141 - Нетоксично -

Медный купорос 0,040 10 ПДК 234 66 Токсично Гибель 100%

0 ПДК 201 43 (1 Гибель 60%

0,004 0,1 ПДК 176 25 Низкая токсичность Гибель 20%

Янтарная кисло- 0,100 10 ПДК 228 61 Токсично _

та 0 ПДК 180 28 Нетоксично -

Соляровое масло 0,010 ПДК 702 398 Токсично Гибель 40%, уродств

0 0,1 ПДК 1651 1070 20%

0,001 Гибель 20%

Хлористый ли- 1,500 10 ПДК 325 130 Гибель 100%

тий 0 ПДК 238 69 __ То же

0,150 0,1 ПДК 296 110 41 Гибель 50%, замедлен-

0 ное и аномальное раз-

0,015 витие 50%

ДЦТ следы (К,Г 5354 3700 Гибель 100%

0,100 К, 396 180 _ << То же

Атразин 269 91 _ _ц_

266 89 (с

*0 - опыт, К - контроль * * Значения ПДК, принятые для рыбоводных водоемов. "* К| - концентрация условная.

Предлагаемый способ запатентован (патент № 20738682 от 20.02.1997) и может быть использован в водной токсикологии, при испытаниях побочного действия фармакологических препаратов, пищевых концентратов, кормовых добавок, при испытаниях экологической чистоты технологий, связанных со сбросом сточных вод, при составлении прогноза изменений в популяциях различных водных животных в трансформированных сбросом сточных вод экосистемах.

2.4. Гравитационная чувствительность зародышей амфибий

Метод исследования - клиностатирование зародышей амфибий различного возраста. Фактор гравитации - существенная особенность среды, в которой совершается как филогенетическое, так и онтогенетическое развитие организмов. Поэтому вероятно его участие в регуляции различных этапов эмбриогенеза, особенно у животных, развивающихся вне материнского организма. Цель настоящей работы заключалась в исследовании гравитационной чувствительности зародышей амфибий на различных этапах эмбриогенеза.

Метод ■ однократное клиностатирование по 2,5 часа, отбирали по 100 - 200 икринок из природных кладок. Скорость вращения 18 об/час при радиусе вращения 20 мм. При этом центробежная сила не превышает 10" g, и скорость вращения выше скорости возвращения инвертированного яйца в исходное положение. Икринки вращали прикрепленными и их положение в клино-стате контролировали визуально Прижизненные наблюдения вели в течение эмбрионального и всего личиночного периода. Аномалии развития возникали в результате клиностатирования на всех перечисленных стадиях (рис 9.). Это наблюдение противоречит существующему представлению об исключительной гравитационной чувствительности зародыша лишь на стадиях, предшествующих дроблению.

Результаты клиностатирования зародышей различных возрастов имеют свои особенности (табл. 2). В пяти первых сериях опытов мы получили высокий процент аномалий дробления. В самом раннем варианте опыта это сегрегация желточных гранул и затрудненное дробление вегетативного полюса яйца. Во всех сериях опытов были получены зародыши с искривленными осевыми зачатками, микроцефалы, макроцефалы, зародыши с некротическими изменениями в различных отделах тела. Для разных серий опытов оказалось характерным преобладающее поражение различных отделов тела (рис. 9). Морфологическое описание аномальных зародышей с учетом состояния органов, зависящих в своем развитии от различных индукторов, позволяет предполагать ход событий, обусловивших появление соответствующих уродств.

Клиностатирование морулы приводит к возникновению самого большого количества и разнообразия поражений нейрулы. Для зародышей, клино-статированных на стадии ранней гаструлы, очень характерны макроцефалия и

дисплазия конечностей (рис 9, опыт 7).

Опыт) Опыт 2 Опыт 3 Опыт 4

Рис. 9. Аномалии развития эмбрионов травяной лягушки, связанные с нарушениями развития осевого зачатка. В овальной рамке слева - аномалии развития задней ко-нечнсти; справа - микроф-тальмия.

Полученные нами результаты могут быть интерпретированы в свете данных о некоторых факторах, определяющих локализацию осевого зачатка и его дифференцировку у амфибий. Осуществление детерминирующего воздействия кортекса серого серпа происходит в промежутке времени между началом дробления и стадией 8 бластомеров (Curtis, 1962). Возможно, эта активация ядер на спинной стороне зародыша причинно связана с наличием детерминирующего действия кортекса серого серпа (Brächet et Malpoix, 1971). В настоящее время известно, что аксиализация зародыша определяется ступенчато, совместным действием ряда специфических факторов. В цитоплазме яйца, преимущественно в вегетативной части, локализуется продукт материнского гена Vgl в неактивном состоянии. Предполагается, что его активация происходит при воздействии специфической протеазы, взаимодействие с которой происходит при гравитационно-зависимом повороте оплодотворения. Активированный морфоген Vgl участвует в индукционном сигнале, исходящем от энтодермы и детерминирующем мезодерму (Smith, 1989, Gilbert е.а., 1996). Следующие морфогенетические события связаны с активацией генов и протеинов организатора Шпемана, свойства которого формируются под влиянием Ньюкуповского центра. Детерминирующее нейрапизацию эктодермы воздействие хордомезодермального зачатка и правильность структуры всего осевого зачатка зависят от морфогенетических перемещений клеток на дорсальной стороне зародыша (Spemann a. Mangold, 1924, Winkblauer, 1996).

Процессы формирования осевого зачатка связаны на всех этапах с

межклеточными взаимодействиями, которые могут быть нарушены изменением направления вектора гравитации. Известно, что поддержание «пространственного гомеостаза» требует затрат энергии (Nace, 1983, Alpatov е.а., 1992). Отмечено, что в условиях невесомости содержание насыщенных жирных кислот в мембранных липидах понижено, а количество и размеры митохондрий редуцированы (Tairbekov, 1990). Таким образом, наиболее чувствительными к фактору гравитации должны быть детерминирующиеся зачатки.

Смещение детерминирующего фактора относительно уже отчасти детерминированного материала приводит к диспропорции скорости гаструля-ции в латеральном направлении (Pasteels, 1964). В этом случае развивается равномерно асимметричный зародыш. При клиностатировании зародышей на стадии морулы и ранней гаструлы мы существенно нарушаем процесс индукции мезодермы и второй этап детерминации осевого зачатка, связанный с действием индукционной системы Шпемана. Появление в наших опытах высокого процента аномалий нейрул после клиностатирования на ранней гаст-руле совпадает с периодами детерминации соответствующих структур, выявленными Джилкристом (1933). Опыты с клиностатированием могут дать новые экспериментальные модели для изучения механизмов детерминации, а также и морфогенеза некоторых зачатков. При клиностатировании в чувствительный к повреждениям период детерминации глазного зачатка (Лопашов, Строева, 1963) наблюдалась микрофтальмия.

Детерминированность клеток закрепляется в результате кумуляции многих влияний. Дезориентируя зародыши в поле земного притяжения в разные фазы их развития, мы воздействуем на разные уровни этой цепи взаимодействий, приводящих к дифференцировке осевого зачатка и различных органов зародыша.

Соответственно основным этапам детерминации и диффференцировки осевого зачатка, можно отметить и уровни регуляции нарушений этого процесса после клиностатирования.

2.5. Чувствительность зародышей амфибий к сверхмалым дозам биологически активных веществ.

Зародыши амфибий применены для биотестирования сверхмалых доз лекарственного средства метилурацила фармакопейного. Использовали эмбриональный биотест - зародышей шпорцевой лягушки. В качестве испытуемого биологически активного соединения применили метилурацил фармакопейный (производное пиримидина), анаболик, влияющий на процессы пролиферации и способствующий заживлению ран (лекарственная доза - 20мг/кг веса тела человека).

Для изучения воздействия препаратов МФ зародышей помещали на 24 часа в испытуемый раствор (в опытах использовали концентрации МФ - 1 ■ 10"'%).

Интенсивность радикалообразования определяли методом ПС и сцин-тилляционной радиометрии. Прослеживали результаты длительного воздей-

ствия по показателям жизнеспособности эмбрионов (скорость и аномалии развития).

Воздействие сверхмалой концентрации метилурацила фармакопейного (МФ) - 10"4% приводило к заметным метаболическим изменениям (сдвиг уровня СР-реакций за физиологические пределы) и также к значительному отставанию в развитии - только при тестировании с помощью эмбриона на критической стадии (поздняя бластула). В более поздний срок эффект не выражен.

Таблица 10. Влияние тестируемого вещества на интенсивность радика-лообразования у зародышей шпорцевой лягушки. Инкубация 24 часа + |4С-АА в течение последних 2 часов, конечное разведение 0/,1 мкКи/мл (3,7 кБк/мл)

Проба Концентрация вещества в % Радиоактивность пробы на особь, ёрш/мг ± а А, %

Т -20°С. Возраст зародышей в начале опыта - начальная гаструла

Контроль — 81,46 ±19,3 —

МФ 1 • 10-4 92,81 ±3,95 13,93

Т 18°С Возраст зародышей в начале опыта - начальная гаструла

Контроль — 142,65 ±34,45 —

МФ 1 • Ю'4 160,25 ± 24,25 13,25

Т 15°С Возраст зародышей в начале опыта - поздняя бластула

Контроль — 15,3 —

МФ 1 • 10"4 20,3 32,67

Таблица 11. Влияние тестируемого вещества на скорость развития эмбрионов шпорцевой лягушки. Продолжительность инкубации 24 часа Температура 13"С Стадия развития в начале инкубации - поздняя бластула (13 Гц от начала дробления)

Проба Концентрация вещества, % Стадия развития в конце инкубации Скорость развития в тц/сут

Контроль Поздняя гаструла (28 -32 т0) - 85% зародышей. Начальная нейру-ла (35т0) - 15% зародышей 17 у 85% зародышей. 22 у 15% зародышей. Среднее - 19

МФ 1- 10" Начальная гаструла -(20 т0) 100% зародышей 7т0 у 100% зародышей

Таблица 12, Продолжительность инкубации 24 часа Температура 13°С. Стадия инкубации - средняя гаструла (24 - 25 г» от начала дробления)

Проба Концентрация вещества, % Стадия развития в конце инкубации Скорость развития (то/сут)

Контроль Начальная нейрула -(35 - 36 т0) 30% зародышей И - 12 у 30% зародышей. 13 у 70% зародышей

МФ 1 • ю-4 Начальная нейрула -(35 - 36 т0) 100% зародышей И - 12 у 100% зародышей

Таблица 13. Продолжительность инкубации 24 часа Температура 17°С. Стадия развития зародышей в начале инкубации - начальная гаструла (20 гв от начала дробления).

Проба Концентрация вещества, % Стадия развития зародышей в конце периода инкубации Скорость развития (то/сут)

Контроль Поздняя нейрула у 50% зародышей (45 - 49т0). Ранняя хвостовая почка у 50% зародышей (50 - 54т0) 25 - 34. В среднем 30

МФ 1 • 10" Поздняя нейрула (47т0) у 32%. Ранняя хвостовая почка (52т0) у 35%. Средняя хвостовая почка (59т0) у 33%. 27 у 32% зародышей. 32 у 35% зародышей. 39 у 33% зародышей.

2.6. Модификации морфогенеза как средство изучения механизмов развития

В эмбриогенезе в сложном ансамбле межмолекулярных и межклеточных взаимодействий большую роль играют информационные слабые сигналы из внешней среды и от соседних клеток и зачатков. Они, по-видимому, действуют через «тоническую» (энергетическую) систему регуляции клеточных процессов. Повреждающие (тератогенные) воздействия нарушают в разные периоды развития различные звенья цепочки этих взаимодействий. Таким образом, через энергетическую систему регуляции воздействие передается прежде всего на самое чувствительное звено морфогенетических процессов, что через достаточно короткое время визуализируется через характерные для каждой стадии аномалии развития. Поражаются всякий раз детерминирующиеся, наиболее энергозависимые зачатки. Характерные аномалии возникают в силу того, что поражается первый по времени энергозависимый процесс, участвующий после воздействия в образовании определенного органа.

Поскольку все регуляционные явления в клетке связаны с фосфорили-рованием компонентов реакций, большое значение имеет тот факт, что неспецифические стрессовые реакции в клетке идут с образованием активных форм кислорода, инициируют процессы перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран и нарушают внутримембранные потоки энергии, связанные в митохондриях с синтезом АТФ (Дмитриев, 1997). Если в наших опытах по

регистрации CP-реакций время инкубации зародыша с индикатором невелико и приходится на первую фазу токсического стресса, - то наблюдается повышение уровня CP, если же срок инкубации длительный, наблюдаем снижение уровня CP, связанное уже с повреждением мембран и модификацией их основных свойств, что в конечном счете нарушает морфогенетические процессы.

Развитие стрессовой реакции во времени имеет фазный характер и зависит от исходного физиологического состояния зародыша и от дозы воздействия. Первая фаза стресса связана с развитием ПОЛ, что характерно для самых различных патологий. Вторая фаза (мобилизации или резистентности) связана с повышенным уровнем синтеза и расхода АТФ. В то же время в мембранах митохондрий и микросом развиваются деструктивные процессы, что приводит к снижению уровня функциональной активности мембран микросом и митохондрий, общего уровня окислительного метаболизма, фосфо-рилирования и общей патологии клетки.

Скорость протока в энергетической системе клетки, которую хорошо отражает уровень свободнорадикального окисления, является важным прогностическим признаком при определении физиологического состояния и реактивности клетки. Явления окислительного стресса с участием АФК и перекисного окисления липидов являются универсальной характеристикой ранних стадий многих патологий, в том числе эмбриопатий (Wells с.а., 1997, Bedaiwy е.а., 2002).

Основываясь на этих предпосылках, мы разработали и опробовали на различных биологических моделях метод биоиндикации стрессорного влияния среды на организм водных животных, применяющийся сейчас в водной токсикологии (Мелехова и др., 1990; Мелехова и др., 1989; Мелехова и др., 2000). В этой разработке использован модифицированный нами для определения сдвига уровня свободнорадикапьных реакций у гидробионтов изотопный метод ПС.

Глава 3. СПОСОБЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЙ ВОДНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ И ПРИНЦИПЫ ЭМБРИОМОНИТОРИНГА

Полученные нами данные убедительно свидетельствуют также о необходимости введения эмбриологического мониторинга в общую систему мониторинга водной среды. Актуальность этой задачи несомненна, так как антропогенные загрязнения водоемов приводят к неуклонному снижению численности популяций водных, в том числе промысловых, животных и нарушениям водных биоценозов, а загрязнение источников питьевого водоснабжения является одной из наиболее распространенных причин заболевания людей.

Традиционно оценка качества водной среды основывается на данных химического и дозиметрического анализа В прикладной экологии при оценке антропогенного воздействия на среду широко распространено понятие о пре-

дельно допустимых концентрациях различных веществ-загрязнителей, являющихся побочными продуктами хозяйственной деятельности человека.

Руководствуясь таблицами ПДК и ПДУ, определяют аналитическими методами экологическое качество среды, и в том числе питьевой воды. В источниках питьевой воды определяют также наличие взвешенных частиц, цвет и запах, биологическое загрязнение (в основном, патогенными микроорганизмами). Однако такой подход является недостаточным по нескольким причинам.

Антропогенные загрязнения действуют на живые организмы, и в том числе на человека, в самых различных сочетаниях, комплексно. Их интегральное действие можно оценить только по реакции живых организмов или сообществ Кроме того, многие ксенобиотики (чуждые для биосферы вещества) накапливаются в организме, и в результате этого длительное воздействие даже малых концентраций этих веществ вызывает патологические изменения в организме. Наконец, известен парадоксальный эффект малых доз многих биологически активных соединений, когда сверхслабые дозы (ниже ПДК) оказывают на организм более сильное действие, нежели средние дозы и концентрации.

3.1. Методологический подход: биотестирование загрязнения водной среды по метаболическому критерию

В условиях техногенного воздействия на природные экосистемы снижение численности популяций водных животных происходит в значительной мере за счет эмбриональной и личиночной смертности. Эмбрионы и личинки представляют наиболее чувствительные к повреждающим факторам фазы жизненного цикла гидробионтов. В московских и подмосковных водоемах за последние 20 лет катастрофически возрос процент уродливых личинок лягушек и жаб. Отмечено появление рыб с нарушениями эмбрионального морфогенеза, т.е. с различными аномалиями (асимметрия тела, циклопия и т.д.). В пригородных водоемах и малых реках, по данным гидробиологического мониторинга, исчезли многие виды гидробионтов. Процессы воспроизведения организмов - это сложная цепь взаимообусловленных событий, любое из звеньев которой может быть нарушено воздействием токсичной среды.

В раннем эмбриогенезе имеются особо чувствительные к повреждающим воздействиям фазы («критические периоды» по П.Г. Светлову). Повышенная чувствительность в эти периоды связана также с развитием свободно-радикальных реакций. Эмбрионы амфибий в критических фазах развития могут служить в качестве биотестов для оценки токсичности, вызванной химическими или электромагнитными загрязнениями водной среды (Мелехова, 1994 г.; Мелехова и Коссова, 1997 г., патент № 2073868.). Оценка эмбриоток-сичности водной среды позволяет заключить, что концентрации химических поллютантов, считающиеся допустимыми для взрослых животных, являются критическими (вызывающими аномалии развития и смертность) для эмбрионов. Таким образом, методы биомониторинга, основанные на изучении пара-

метров гомеостаза лишь взрослых гидробионтов, недостаточно информативны для прогноза воспроизведения популяций. Все это свидетельствует о необходимости разработки программы эмбриологического мониторинга как части общей системы биологического контроля состояния природной среды.

При всей важности осуществления мониторинга на всех уровнях (крупномасштабного слежения за экологическими изменениями путем спутниковой и аэрофотосъемки), организация контроля за экологическими изменениями посредством биотеста, как системы раннего предупреждения, выявляющей даже начальные изменения в состояни живых существ разных видов до их исчезновения с рассматриваемой территории, представляется особенно перспективным.

Измерение адаптационного стресса как способ оценки загрязнения среды В нормальных условиях организм реагирует на воздействие среды посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатиче-ских' механизмов Эти механизмы поддерживают оптимальное протекание процессов развития. Под воздействием неблагоприятных условий эти механизмы могут быть нарушены, что приводит к состоянию стресса. Универсальным показателем изменения гомеостаза тест-организма является состояние стресса при попадании из «чистой» среды в «загрязненную».

Выбор измеряемого параметра и тест-реакции Одной из наиболее важных характеристик гомеостаза, высоко чувствительных к стрессовому воздействию среды, является энергетическая стоимость физиологических процессов Наиболее экономичный энергетический обмен имеет место лишь при строго определенных условиях среды, которые могут быть охарактеризованы как оптимальные.

В процессе жизнедеятельности всех аэробных организмов в ходе нормальных реакций кислородного метаболизма образуются супероксидные радикалы и другие формы активного кислорода (АФК). Различные воздействия могут увеличивать образование супероксидных радикалов. Эти радикалы и продукты их превращения могут подавлять активность ферментов, разрушать нуклеиновые кислоты, вызывать деградацию биополимеров, изменять проницаемость мембран. Высокий уровень образования супероксидных радикалов токсичен и может вызвать гибель организма. Уровень их образования, слегка превышающий базовый, может стимулировать рост клеток и играет важную роль в процессе канцерогенеза.

Под действием окислительного стресса может происходить повреждение ДНК. Один из механизмов такого повреждения включает прямое окисление нуклеиновых кислот, другой - переваривание ДНК. Основополагающим принципом биотестирования является именно наличие контроля - оптимального уровня, любые отклонения от которого свидетельствуют о наличии

' Гомеоста) - постоянство внутренней среды организма; гомеостатические механизмы - обеспечивают приспособление (адаптацию) к среде и сохранение жизнеспособности организма.

стрессового воздействия.

Окислительный стресс можно измерять по изменению общего уровня свободных радикалов в клетках тест-обьекта. Кроме активных форм кислорода (супероксид-радикалов) в общий уровень СР (свободнорадикальных)-реакций вносят свой вклад метаболические СР - промежуточные продукты окислительно-восстановительных реакций. Среди них - гидро- и липопере-кисные радикалы, возникающие при аутоокислении мембранных липидов. При повреждающих воздействиях перекисное окисление липидов развивается тем более активно, чем выше степень повреждения клеток. Перекисные радикалы могут взаимодействовать с молекулами белков и нуклеиновых кислот, нарушая основные функции клеток и тем самым - гомеостаз организма.

Скорость протока в энергетической системе клеток, которую хорошо отражает уровень СР, является важным прогностическим признаком при определении физиологического состояния и измерении силы стресса всего организма.

Основываясь на эффекте сополимеризации, мы предложили радиометрический количественный метод для биотестирования различных загрязнений водной среды. Этот метод был нами успешно использован для определения критического уровня различных загрязнений воды, приводящего к нарушению жизнеспособности биотестов. Многие вещества в концентрациях, на несколько порядков ниже летальных, оказывают повреждающие действия на биотесты. Это повреждение выявляется экспрессно по нашему метаболическому критерию и подтверждается в долгосрочных экспериментах (снижение жизнеспособности популяции: гибель, замедление и нарушения развития и т.д.). Тест-объектами могут служить различные гидробнонты (дафнии, эмбрионы амфибий и рыб, морские беспозвоночные и т.п.).

Метод был применен для тестирования качества очистки сточных вод на Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате, а также в экологической экспертизе природных и питьевых водоисточников в Восточном Казахстане и в Мордовии, причем данные биотестирования бьши подтверждены результатами как химических анализов воды, так и долгосрочными наблюдениями биоты. Метод запатентован. По чувствительности, экспрессности и экономичности существенно превосходит другие методы аналогичного назначения.

3.2. Проведение токсикологических исследований на различных тест-объектах

Проведены запатентованными методами токсикологические исследования на различных объектах с применением различных биологически активных веществ и поллютантов. Результаты приведены в таблице.

Таблица 14. Данные токсикологических исследований на различных тест-объектах

I ест- Тести- Действую- Сдвиг ДСР Отдаленный Заключение

объект руемое щая концен- уровня СР- морфологиче-

вещество трация реакций ский эффект

Дафнии Метилу- 0,0001% -66% Увеличивается Концентра-

Daphnia рацил 0,0005% -25,2% скорость роста ция дейст-

magna (культу- фармакопейный венна

ра) (анаболик, тера-певтич. доза для чел. 20 мкг/л)

Моллюск Трифени- 10"' мг/л 550% Гибель 100% Токсичная

Lymnea лолово- за 48 час летальная

stagnalis хлорид, компо- концентрация

нент про- 103 мг/л -46% Нарушения Токсично

мышлен- внутр. органов,

ных сто- снижение по-

ков требл. 02

10*'мг/л -50% 2е поколение: молодь ослаблена, ее обмен нарушен Витальная концентрация. Токсична по отдаленному эффекту

Колонии СиС12 12,5 мкг/л -А3% Дегенерация Все концен-

гидроид- (фоновая полипов 35% трации дей-

ного по- концен- 25 мкг/л -50% 41% ствующие

липа Obelia трация в Белом 50 мкг/л -41% 50%

loveni море 7-9 мкг/л)

Личинки СиС12 12,5 мкг/л -23% Нарушение СиС12 во

(средняя (фоновая двигательной всех кон-

нектохе- концен- активности у центрациях

та) мно- трация в 50% особей токсична

гощетин- Белом 25 мкг/л 50% Нарушение

кового море 7-9 двигательной

червя №ге!Б мкг/л) активности у 80% особей

унепБ 50 мкг/л 118% Нарушение двигательной активности у 100% особей

Заключение.

1. Определены сверхмалые дозы анаболика метилурацила, стимулирующие рост дафний. Сдвиг уровня СР в первые часы воздействия позволяет оценить действенность примененной концентрации.

2. Концентрация поллютанта, считающаяся вительной и определенная нами как токсичная, действительно вызывает при хроническом применении тяжелые последствия для моллюсков.

3. Применение метода ПС на чувствительных к чистоте воды морских объектах позволяет регистрировать изменения уровня окислительного метаболизма в ответ на воздействие даже малых концентраций поллю-тантов.

3.3. Метаболический критерий для оценки жизнеспособности репродуктивного материала ценных видов рыб после криоконсервации

Для успешного решения научных и практических проблем по сохранению биоразнообразия важно предпринять меры по совершенствованию аква-культуры, в том числе путем включения в нее криотехнологий и создания низкотемпературных генных банков половых продуктов и тканей, которые при определенных условиях могут оказаться удобными, надежными и единственно возможными способами искусственного воспроизводства и генетического улучшения некоторых видов рыб.

В настоящее время не существует достаточно объективных методов определения жизнеспособности спермы животных по степени их повреждения после криоконсервации. Наиболее распространенным способом определения жизнеспособности спермы после криоконсервации является оценка качества спермы рыб по ее двигательной активности. Однако этот способ является недостаточно достоверным и воспроизводимым. Кроме того, подвижность сперматозоидов не характеризует степень их повреждения в процессе криоконсервации и не всегда коррелирует с их жизнеспособностью и оплодотворяющей способностью, которая является основным показателем качества спермы.

В предложенном нами способе для оценки степени криоповреждения спермы использован метод, ориентированный на метаболический критерий -

интенсивность свободно-радикальных реакций.

Этот способ позволяет определить криоповреждения в сперматозоидах перед закладкой проб на долгосрочное хранение в криобанк, что способствует сокращению расходов на обслуживание биохранилищ Экономия от предварительного (предзакладочного) контроля криоповреждений заявленным методом составляет около 30 ООО рублей (патент № 2233142, 2004 г.).

Способ универсален, нетрудоемок, прост в выполнении, обладает достаточной чувствительностью определения и может быть использован при разработке условий замораживания и оттаивания спермы, криопротекторов и сред для ее замораживания, а также при разработке других способов ее сохранения.

3.4. Принципы эмбриомониторинга водной среды.

Таким образом, по реакции эмбриональных биотестов действие различных поллютантов в концентрациях, равных ПДК для рыбохозяйственных водоемов (согласно перечню 1990г.), оцениваются как токсичные.

При этом изменения уровня СР-процессов в ранние сроки воздействия по-видимому, можно считать первичным ответом тест-объекта. Можно предположить, что первичной мишенью токсического воздействия являются мембраны эмбриональных клеток, т.к. нами было показано участие СР-реакций в метаболизме фосфоинозитидной системы в эмбриогенезе (гл. 1).

Таблица 2. Тестирование загрязнения природных вод с помощью личиночных и эмбриональных биотестов.

Проба воды Биотест Индикаторные А СР (инкуб. 2ч.), % Изменения, отдаленные последствия (инкуб. 48ч.) Заключение Выявленные пол-лютанты

Мордовия, колодец в деревне Нейрулы шпорц. лягушки 430 Гибель 100% Токсично Радионуклиды + нитраты

Мордовия, р. Инсар ниже г. Саранска м_ 490 Гибель 100% Токсично Тяжелы металлы и нитраты

Р. Сатис, близ г. Са-ров н_ 45 Гибель 80% Токсично Повышенное содержание трития

ББС, морская вода у Личинка (поздняя 48 Нарушения двигат. актив- Токсично Нефтепродукты

склада ГСМ

нектохе-та) мно-гоше-тинк червя

ности (100% особей)

Заключение. Таким образом, мы предлагаем включить в систему комплексного биомониторинга водоемов эмбриональные биотесты. В эмбриомо-ниторинг входит два вида мероприятий: 1) обследование кладок гидробио-нтов в природных водоемах в сезон икрометания с подсчетом процента погибших и аномальных зародышей, 2) тестирование токсичности проб исследуемой воды в лабораторных условиях с использованием эмбрионов лабораторных гидробионтов, исходно адаптированных к чистой воде.

При этом первичное состояние адаптационного стресса оценивается по реакции привитой сополимеризации, характеризующей сдвиг уровня свободных радикалов. Затем фиксируются через 1 - 3 суток морфогенетические изменения, т.е. выявляется хроническая токсичность. Также биотестирование позволяет экспрессно выявить в акватории наиболее загрязненные участки и затем провести химический анализ соответствующих проб.

При организации таких наблюдений в системе мониторинга желательно также знать источники и виды основных загрязнений, иметь сведения о видовой структуре водного ценоза, сроках нереста гидробионтов, представляющих различные трофические уровни.

ГЛАВА 4. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ВОДОИСТОЧНИКОВ НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ.

4.1. Биотестирование сточных вод производства целлюлозы методом радикальной сополимеризации

Тестирование сточных вод сульфатного производства целлюлозы на водных беспозвоночных (эндемическом виде моллюсков и на лабораторной культуре дафний) мы проводили о. Байкал, в районе сброса сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината.

Были тестированы сточные воды Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (БЦБК), прошедшие полный цикл очистки, а также используемые в промышленных очистных сооружениях флоккулянты.

Как показывают наши данные, стоки Байкальского ЦБК, прошедшие полный цикл очистки, в течение первых 6 ч воздействия на инкубируемых дафний достоверно снижают (на 26,4%) у этих объектов уровень СР-реакций. В хронических опытах в ИЭТ при действии неразведенных сточных вод зачастую наблюдали гибель дафний (до 100% в некоторых сериях опытов). Воздействие сточных вод в разведении 1 : 10 на дафний приводит также в первые часы инкубации к достоверному сдвигу уровня СР-реакций.

Помещение моллюсков в сточные воды ЦБК, как в неразведенные, так и в разведенные 1:10, приводит в течение 48 ч опыта к достоверному сниже-

нию уровня СР-рсакций соответственно на 49 и 52%. В обоих случаях также отмечены изменения гепатопанкреаса и оборонительная реакция (выделение слизи).

Результаты наших исследований показали, что используемые в практике в промышленных очистных сооружениях флоккулянты ПАА и ВПК-402 также далеко не безразличны для биологических объектов, чувствительных к загрязнению воды, влияют на их окислительный метаболизм и, возможно, тем самым снижают их устойчивость к естественным стрессорным факторам внешней среды

Таким образом, применяемые на БЦБК способы очистки сточных вод не гарантируют защиту водных ценозов от опасного загрязнения.

4.2. Биотестирование в комплексной экологической экспертизе территорий. Восточный Казахстан

Проведено биотестирование природных вод Восточного Казахстана согласно комплексной программе, утвержденной администрацией Восточно-Казахстанской области. По результатам выполнения всей комплексной программы был представлен доклад экспертов Верховному Совету и Правительству Республики Казахстан.

В этой разработке для оценки качества природных вод и питьевых водотоков использовался для определения сдвига уровня свободнорадикальных реакций у гидробионтов радиоактивный индикатор (авторское свидетельство № 1546904, 1996 г.), биотестом служили дафнии (лабораторная культура).

Обнаружили, что пороговые концентрации, действующие на измеряемый метаболический параметр у дафний, находятся в области ниже принятых значение ПДК; в модельных опытах концентрационные зависимости влияния солей меди, определяемого по метаболическому критерию, имеют фазовый характер- летальные и сублетальные концентрации резко угнетают СР-реакции, а витальные концентрации (близкие к пороговым) повышают уровень этих реакций; оба типа динамики метаболических изменений служат признаком патологии; оценка состояния природных вод по метаболическому критерию показала, что взятые из большинства водоисточников в исследуемых районах проб воды резко повышают уровень СР-реакций и, следовательно, токсичны для биотестов.

4.3. Биотестирование природных вод в респ. Мордовия,в районах, подвергшихся воздействию радиоактивных выпадений после аварии на Чернобыльской АЭС

В 1994 - 96 г. г. с нашим участием проведены работы по комплексному обследованию радиационной обстановки в Республике Мордовия: определение уровней комплексного загрязнения окружающей среды радионуклидами и химическими поллютантами, оценка возможных синергетических эффектов. Объект: культура дафний. Метод: способ биоиндикации загрязнений водной среды (авт. свид. № 1409179,1986г.).

4.4. Биологический контроль экологического состояния природных вод в районе расположения предприятия атомной промешленности.

В 2002 - 2003 г.г. были предприняты комплексные исследования вод р. Протвы в окрестностях ГНЦ РФ - ФЭИ с целью обнаружения влияния сточных вод ФЭИ на экологическое качество речной воды. Применена группа методов биологического контроля. Результаты тестирования токсичности воды были получены с помощью нового метода оценки по измерению адаптационного стресса у рачков Daphnia magna (запатентован в МГУ).

В гл. 4 работы представлены данные биотестирования сточных и природных вод, полученные запатентованными нами методами, включенные в регламент проведения комплексной экологической экспертизы. По результатам работы можно заключить, что наши данные в основном хорошо согласуются с выводами долгосрочных наблюдений видового состава гидробионтов в загрязненных и чистых водоемах. Таким образом, метаболический экспресс-анализ на простых биотестах дает возможность сделать первичное заключение о наличии опасных для биоты загрязнений. Однако в дальнейшем требуется идентифицировать источник опасности с применением аналитических методов. Необходимо отметить, что предложенный нами метод мониторинга дает возможность выявить интегральное действие на биотесты различных комбинаций поллютантов.

Включение биотестирования в комплексную экспертизу экологического состояния промышленного района позволило отметить также резкое ухудшение состояния здоровья людей на территории, где результаты биотестирования и биоиндикации указывают на токсичность воды в природных и питьевых водоисточниках.

ГЛАВА 5. ЯВЛЕНИЯ САМООРГАНИЗАЦИИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ.

РОЛЬ ДИНАМИЧЕСКОГО ХАОСА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ СИСТЕМАХ.

5.1. Явления самоорганизации в эмбриогенезе.

Согласно теории самоорганизации внутреннее пространство эмбриона можно рассматривать как активную нелинейную среду, проявляющую неравномерную чувствительность к внешним воздействиям и демонстрирующую пороговые эффекты и характерные метаболические параметры; эти параметры флуктуируют под воздействием возмущений, способных самопроизвольно усиливаться или исчезать (диссипировать). В таких средах возможны необратимые процессы, которые можно локализовать в пространственно-временные структуры.

Синергетика предлагает определенные правила и признаки для бифуркационных путей развития. Можно интуитивно представить себе применимость этих правил к эмбриогенезу, особенно к дихотомическому появлению первых дифференцировок. «Параметры порядка» - другое синергетическое

понятие, помогающее описать иерархию возникающих структур. Этот термин определяет ограничение числа степеней свободы, присущего некоей сложной непрерывной системе; согласно параметрам порядка выстраиваются все остальные параметры системы.

Стабильные состояния, которых система стремится достичь и в которых она некоторое время пребывает, определены термином «аттракторы». Представляется, что понятие «аттрактор» близко к эмбриологическому понятию «паттерн», которым характеризуют ожидаемую структуру эмбриона.

Клетки ведут себя и согласно специфическим химическим сигналам, которые влияют на совершенно определенные молекулярные реакции, и в соответствии с энергетической регуляцией, которая определяет, возможны ли вообще восприятие управляющего сигнала и реакция на него со стороны клеток. Таким образом, в начальный период индивидуального развития, то есть до того как включено функционирование собственного генома, вероятность управляющей роли энергетических параметров высока. Мы избрали один из энергетических индикаторов, - уровень свободнорадикальных реакций. Свободные радикалы (СР) формируются как промежуточный продукт различных окислительно-восстановительных реакций. Их общий уровень может считаться одним из параметров окислительно-восстановительного гомеостаза. По своей природе такой индикатор интегрален, то есть, представляет общую концентрацию СР в испытуемом объекте. Представляется, что СР могут послужить мерой для скорости энергообмена (запасения и расходования энергии) в клетке. Мы регулярно проводили измерения в последовательно сменяющихся фазах эмбрионального развития. Чтобы выявить распределение СР реакций в эмбрионе, был использован метод авторадиографии. В конечном счете мы могли сравнить отдельные области яйцеклетки или группы клеток по распределению СР в пределах гистологического среза исследуемого эмбриона (гл. 1).

Мы установили, что в результате оплодотворения возникало неравномерное распределение СР реакций (плотность треков). Вслед за этим в результате дробления появлялась многоклеточная область, в которой СР реакции носили признаки самоускорения (рис. 1), В этой области относительная концентрация СР проявляла резкие беспорядочные (не привязанные к какой-либо определенной клетке) флуктуации. Очень скоро плотность СР в этой области увеличивалась на порядок. Затем, клеточные циклы замедлялись и начиналась экспрессия генов, указывая на возникновение дифференцировки (рис.2) В области эмбриона, которая осталась «низкоэнергетической», вышеуказанные события наступали позже, но также начинались с нарастанием энергообмена (ростом уровня СР).

В любой из последующих фаз развития детерминация (бифуркация) клеточных типов всегда начинается с разделения на области пониженной и области повышенной энергии (рис. 10). В фазе органогенеза эмбриональная индукция становится главным механизмом координирующим расположение дифференцируемых клеточных типов по отношению друг другу. Подобный «энергетический паттерн» был обнаружен в различных индукционных систе-

мах: индуктором оказывался старший (по биологическому возрасту) зачаток, отличавшийся более высоким энергетическим уровнем. В результате контакта с индуктором, в «младшем» зачатке повышался уровень энергообмена, и это предшествовало дифференцировке.

Рис. 10. Бифуркации интенсивности СР реакций в зачатке хрусталика, предшествующие дифференцировке клеток и формированию зон хрусталика у травяной лягушки. Изменения ЛС/Сср относительной концентрации СР происходят в хрусталике во время детерминации и дивергентной дифференци-ровки отдельных групп его

клеток: О - линзообразующей

эктодермы, • - переднего эпителия, □ - первичных волокон; и ■ - вторичных волокон.

На стадиях 19-22 величина ДС/Сср показывает на сколько процентов уровень СР процессов в детерминированном линзовом зачатке отличается от среднего уровня СР процессов в эктодерме.

На стадиях 23-33 величина ДС/Сср показывает отличие относительной концентрации СР процессов в отдельных участках дифференцирующейся линзы от средней концентрации СР процессов для линзы в целом.

На пике энергообмена, в период детерминации (когда выбирается один из альтернативных путей дифференцировки), клетки становятся неустойчивыми и высокочувствительными. Они реагируют даже на слабые повреждающие воздействия (включая воздействие загрязненной среды) нарушением дифференцировки. Как результат, могут возникать аномалии (уродства). Эти эффекты носят статистический характер и ответ на повреждения индивидуален. Учитывая такие явления, мы разработали и запатентовали метод индикации загрязнения водной среды. Представляется вероятным, что при нормальном развитии подобная повышенная чувствительность и неустойчивость клеточных популяций является критическим условием для явлений компетенции. Последние возникают самопроизвольно в определенные моменты индивидуального времени как способность воспринимать сигналы для начала дифференцировки.

5.2. Роль динамического хаоса в развитии.

Судя по экспериментальным данным, состояния неустойчивости, закономерно возникающие при эмбриогенезе, являются необходимым условием

для дифференцировки и развития эмбриона Энергетический метаболизм представляет собой фактор, который управляет наступлением состояния неустойчивости По-видимому, области неустойчивости локализованы в индивидуальном времени и внутреннем пространстве эмбриона в соответствии с эпигеномной программой. Последняя должна быть изначально встроена в цитоплазму яйцеклетки через неравномерное распределение субстратов, промоторов и ингибиторов CP реакций. Эта программа реализуется через соотношение между скоростями энергообмена, присущими различным областям развивающегося эмбриона.

Можно ожидать, что критические количества субстратов, промоторов и ингибиторов энергообмена, а также соотношение этих количеств должны служить элементами, формирующими индивидуальное время, изначально зарезервированное для эмбриогенеза определенных видов. Индивидуальный возраст определенных клеточных популяций определяется потребленными долями энергосубстратов.

Отметим еще раз, следующее условие вхождения в период дифференцировки: энергетический метаболизм должен достигнуть максимального уровня и, таким образом, привести систему в состояние высокой неустойчивости и лабильности. Это условие предполагает определенную непредсказуемость судьбы каждой клетки, то есть коррелирует с понятием хаотического состояния (D. Ruelle, 2001). Более того, заметная хаотическая компонента представляется необходимым элементом в явлении перехода между двумя различными гомеостатическими (детерминированными) состояниями развивающейся системы.

При любой неопределенности нормальное развитие в целом по-прежнему представляется высоко детерминированным и исключительно воспроизводимым. Следовательно, временная неопределенность выбора из альтернативных путей дальнейшего развития, который всем клеткам предстоит сделать, предполагает понятие динамического или «детерминированного хаоса». Действительно, при закономерном течении развития и проявление упомянутого «необходимого» хаотического состояния, и пути выхода из него посредством рационального выбора, по-видимому, управляются непосредственно эпигеномной программой как явлением высшего иерархического уровня. И далее, скорость окислительно-восстановительных CP реакций представляется тем параметром порядка, который может контролировать наступления событий дифференцировки в эмбриогенезе.

Таким образом, в развитии зародыша реализуются принципы как детерминизма, так и самоорганизации. Первый принцип выражен в генетической программе развития и всех биохимических возможностей организма. Второй принцип реализуется посредством цепных самоускоряющихся процессов CP-окисления, которые, изменяя состояние мембранного аппарата и энергетических систем клетки, приводят ее в неустойчивое состояние. Это определяет время и место активации экспрессии генов и начала морфогенети-ческих событий. '

Выводы

В работе выдвинута и экспериментально обоснована гипотеза «эпигенетической программы» эмбриогенеза. Подробно исследовано поведение одного из параметров энергетического метаболизма - общего уровня свободных радикалов. Для выявления свободных радикалов применен метод привитой сополимеризации в сочетании с гистоавторадиографией и радиометрией.

1. Получены карты распределения относительных концентраций свободных радикалов в зародышах бесхвостых амфибий на последовательных стадиях развития.

2. Локальное повышение уровня СР, опосредующее скорость энергетического обмена, соответствует формированию компетенции эмбриональных зачатков, и характеризует предбифуркационный период детерминации.

3. Временная организация СР-процессов в эмбриогенезе определяется трехвершинными суточными ритмами СР-процессов в зародышах, общим повышением уровня СР-реакций в периоды, предшествующие смене гомео-статических механизмов, а также локальными различиями уровня СР в отдельных зачатках, характеризующими их «биологический возраст» и участие в индукционных системах.

4. В эмбриональном периоде высокий уровень радикалообразования в ядрах и желточных гранулах предшествует началу транскрипции и сопровождает детерминацию зародышевых листков.

5. В личиночном периоде, при дифференцировке зачатков, наиболее высокий уровень радикалообразования обнаружен в митохондриях.

6. При измерении уровня радикалообразования в различных биохимических фракциях обнаружено преимущественное участие СР-реакций в ли-пидном обмене (главным образом во фракции полифосфоинозитидов).

7. Наибольшая чувствительность зародыша и его зачатков к повреждающим факторам (рентгеновскому и лазерному облучению, химическим и гравитационным воздействиям) характеризует детерминирующиеся группы клеток, отличающиеся в норме повышенным уровнем радикалообразования.

8. Характер аномалий развития, возникающих после повреждающих воздействий на эмбрионы и личинки, отражает поражение наиболее уязвимых - детерминирующихся - зачатков, и может служить как для детекции слабых доз повреждающих факторов, так и для изучения механизмов развития.

9. Предложены принципы эмбриомониторинга качества водной среды, разработаны и внедрены способы оценки ее токсичности, основанные на применении эмбриональных тест-объектов в критических фазах развития и тест-реакции - измерении адаптационного стресса с помощью выявления изменений уровня свободнорадикальных реакций.

10. Разработанные и запатентованные методы применены в комплексной экологической экспертизе природных вод. Полученные результаты сопоставлены с результатами определения качества вод другими биологическими и аналитическими методами..

11. На основе полученных данных на примере амфибий предложена гипотеза «эпигенетической программы» эмбриогенеза, заложенной в цито-

плазме зиготы соотношением субстратов, промоторов и ингибиторов свобод-норадикального окисления. Согласно этой гипотезе, самоорганизация энергетических процессов в раннем развитии может определять формирование свойства компетенции и затем подготавливает бифуркационное поведение детерминирующихся зачатков. Параметром порядка, определяющим общую динамику этих процессов, может служить уровень свободнорадикальных окислительно-восстановительных реакций.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ О.П. МЕЛЕХОВОЙ

Всего по теме диссертации опубликовано 88 работ

1. Мелехова О.П., Родина Г.П., Попов В.В., Козлов Ю.П. Суточные колебания интенсивности свободнорадикальных процессов у личинок травяной лягушки. // Журнал общей биологии, т. 33 № 2,1972 г. стр. 223 - 229

2. Рябова Л.В., Мелехова О.П., Попов В.В. Суточные ритмы интенсивности свободнорадикальных процессов в энтодерме зародышей травяной лягушки // ДАН СССР, т. 215 вып. 2, 1974г. стр. 491 - 493.

3. Рябова Л.В., Мелехова О.П., Попов В.В. Суточная динамика интенсивности свободнорадикальных процессов в онтогенезе травяной лягушки. // ДАН СССР, т.217 вып. 6, 1974г. стр. 1439 - 1442

4. Мелехова О.П., Рябова Л.В., Попов В.В., Кузнецов Е.В.. Влияние гравитационных перегрузок на индукцию слуховой капсулы у зародышей травяной лягушки. //ДАН СССР, т.222, вып.6, 1975 г. 4 стр.

5. Мелехова О.П. Свободнорадикальные процессы в эмбриогенезе Anura. // В: Онтогенез, т.7, №2, 1976. стр. 131-140.

6. Мелехова О.П., Шилейко Л.В., Бурлакова О.В. Клиностатирование зародышей амфибий различного возраста. // Сб.: «Организм и сила тяжести», Вильнюс, 1976 г., 16 стр.

7. Мелехова О.П. Физико-химические аспекты дифференцировки глазного зачатка у Anura. // Автореферат канд. дис. М., МГУ, 1976 г. 25 стр.

8. Мелехова О.П. Некоторые физико-химические аспекты дифференцировки глазного зачатка у Anura. // Журнал общей биологии, №2, 1977 г. стр. 285 -294.

9. Мелехова О.П., Стволинский С.Л., Коссова Г.В., Ружейникова Е.И., Туро-вецкий В.Б. Субклеточная локализация свободнорадикальных процессов в эмбриогенезе бесхвостых амфибий. // Изв. АН СССР №2, 1982 г. стр. 297 -300.

10. Мелехова О.П., Бузинова Н.С., Колосова Л.В., Коссова Г.В. Об особенностях интоксикации прудовика обыкновенного трифенилоловохлоридом. // НДВШ биол. науки, №5, 1987 г. стр. 65 - 68.

П.Лазарев В.В., Мелехова О.П., Цаплин B.C., Яресько Ю.И. Способ определения жизнеспособности эмбрионов рыб. // Авт. свид. № 1409179, 1988 г. 3 стр.

12. Мелехова О.П., Бузинова Н.С., Колосова Л.В., Коссова Г.В. Способ био-

индикации загрязнения водной среды. // Авт свид. № 1546904, 1988 г. 3 стр. 13 Мелехова О.П., Коссова Г.В., Лимаренко И.М., Туровецкий В.Б. Исследование уровня свободных радикалов в различных биохимических фракциях в эмбриогенезе. // В: Изв. АН СССР в.5, 1988 г. стр. 851 - 856.

14. Мелехова О.П., Колосова Л.В., Коссова Г.В. Бузинова Н.С. Применение метода привитой сополимеризации для оценки загрязнения водной среды на примере легочных моллюсков. // Кн.: Уч. пособие «Методы биотестирования качества водной среды». М., МГУ, 1988 г. стр. 67 - 74.

15. Мелехова О.П. Физико-химические характеристики системы пространственно-временной организации эмбриогенеза Anura // «Клеточная репродукция и процессы дифференциации». Колл. моногр. Л., Наука, 1990 г. стр. 30 -51.

16. Мелехова О.П., Лимаренко И М., Коссова Г.В., Козлов Ю.П., Бейм A.M. Биоиндикация стоков промышленного производства целлюлозы методом радикальной полимеризации. // НДВШ биол. науки, №5, 1990 г. стр. 106 -115.

17. Мелехова О.П Способ определения действующей дозы электромагнитного излучения на эмбрионах водных животных. // Справка о приоритете на изобретение № 93002686 (002367 HB). 3 стр.

18. Мелехова О.П. Способ отбора клеточных тест-систем для оценки повреждающего воздействия электромагнитного излучения. // Справка о приоритете на изобретение № 93002686 (00366 HB). 3 стр.

19 Мелехова О.П. Оценка эмбриотоксичности водной среды. // Изв. РАН, сер. биол. №4, 1994 г. стр. 661 - 666.

20. Мелехова О.П., Коссова Г.В., Лимаренко И.М., Падалка С.М. Измерение адаптационного стресса как средство биотестирования качества водной среды. // Сб.: «Механизмы адаптации». Томск, 1996 г. 3 стр.

21. Мелехова О.П. Применение радиоиндикаторного метода выявления свободных радикалов для изучения механизмов детерминации в эмбриогенезе низших позвоночных. // Кн.: Уч. пособие «Методы эмбриологических исследований». М., МГУ. 1996 г. 9 стр.

22. Мелехова О.П., Коссова Г.В. Способ определения эмбриотоксичности химических соединений и их комплексов. // Патент № 2073868 от 20.02.1997.

23. Melekhova O.P. Free-Radical Reactions in Animals: Applications in the Testing Technique of Environment HII International Conference on Bioradicals, Yama-sata, Japan, October 12-16, 1997. P.4

24. Melekhova O.P., Kossova G.V., Limarenko I.M., Padalka S.M. Disclosure of subsmall radiation doses through radical copolymerization in embryo biotests. // Moskva-Obninsk, Intern. Conf. Biodosimetry, 1998. P.2.

25. Мелехова О.П. Время как фактор развития. // Сб.: «Пространственно-временная организация онтогенеза». М., 1988. сс. 24 - 38.

26. Melekhova O.P., Limarenko I.M., Kossova G.V. An Assesment of waterpollu-tions by measuring FR-reactions. // Bulg., Varna, in "Int. Conf. on regulation of FR-reactions", 1989. p.l.

27. Melekhova O.P., Kossova O.V., Limarenko I.M. Free Radicals in lipids of Am-

fibian Embrions // Bulg., Varna, in "Int. Conf. on regulation of FR-reactions", 1989. p.l.

28. Melekhova O.P. On the Physiology of lower vertebrate embriocells. // Regional meating of Int. Union. Of Physiological sci. Prague, 1991. p.l.

29. Мелехова О.П Метаболические «песочные часы» эмбриогенеза у низших позвоночных. // III Всес. конф. по хронобиол. Ташкент, 1990 г. 1 стр.

30. Мелехова О П. Предпосылки синергетической модели пространственной организации эмбриогенеза. // «Синергетика» №1. М., МГУ, 1998. сс. 130 -136.

31. Мелехова О.П , Силина F. К., Фокин B.C. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию. // Брошюра, М., РГО-ТУПС, 2000 г. 2 п.л.

32. Мелехова О П. Явления самоорганизации в эмбриогенезе. // Сб.: «Синергетика» №3, М„ МГУ, 2000 г сс. 319-325.

33. Мелехова О П. Исследование нарушений развития гидробионтов как средство оценки загрязнений водной среды (Study of the Faults in the Development of Hydrobionts as a Way to Estimate Pollutions in the Water Environment). // Труды II Международного симпозиума по биоиндикаторам, 17-19 сентября 2001 г., в сб.: «Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга». Сыктывкар, 2001 г. с. 130.

34. Мелехова О.П. Роль динамического хаоса в эмбриогенезе. // Сб.: «Синер-гетика-6», М., Изд. МИФИ, 2003 г. стр. 165 - 173.

35. Melekhova O.P. Embryogenesis as a model of a developing system. // Formal Description of Developing Systems (NATO Sciences Series), Kluwer Academic Publishers, 2003, pp. 269-276.

36. Мелехова О.П., Цветкова JI.И., Докина О.В., Пронина Н.Д., Коссова Г.В., Падалка С.М., Миленко В.М. Патент на изобретение «Способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации». // Патент № 2233142, Бюл. №21 от 27.07.2004 г. Справка о приоритете от 21.01. 2003 г. 7 стр

37. Мелехова О.П., Егорова Е.И., Коссова Г.В., Падалка С.М. Биологический контроль экологического состояния природных вод в районе расположения предприятия атомной промышленности. // Сб.: «Биотехнология и проблемы охраны биоразнообразия». М., МГУ 2004 г. стр. 110-113.

38. Мелехова О.П., Цветкова Л.И., Докина О.В., Пронина Н.Д., Коссова Г.В., Падалка С.М. Метаболический критерий для оценки жизнеспособности репродуктивного материала ценных видов рыб после криоконсервации. // Сб.: «Биотехнология и проблемы охраны биоразнообразия». М., МГУ, 2004 г. стр. 124-126.

39. Мелехова О.П. Принципы эмбриомониторинга водной среды. // Сб.: «Биотехнология, экология, охрана окружающей среды». М., МГУ, 2005 г. 8 стр.

40. Мелехова О.П. Влияние локального лазерного облучения на эмбриональные клетки низших позвоночных. // Сборн. трудов БИО-ЭМИ 2005. Калуга, 2005 г. 7 стр.

41. Melekhova O.P. Universal Mechanism of Highly Nonlinear Effects of Envi-

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 15.11.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 773. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

M¿>¿T/?

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мелехова, Ольга Петровна

Введение. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна и практическое значение.

Положения, выдвигаемые на защиту.

Реализация результатов работы.

Апробация работы.

ПРОБЛЕМА ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

РАЗВИТИЯ. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение.

1. Характерные особенности эмбриогенеза как модели развивающейся системы.

2. Термодинамические теории развития.

3. Теории аксиальной упорядоченности эмбриогенеза.

4. Современные представления о координационных механизмах в раннем эмбриогенезе.

5. Факторы запуска дифференцировки.

6. Некоторые принципы регуляции метаболизма. Свободнорадикальпые процессы как параметр окислительно-восстановительного гомеостаза клетки.

7. Свободнорадикальные процессы в эмбриогенезе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных"

2.1. Радиочувствительность зародышей и личинок травяной лягушки . 92

2.2. Чувствительность эмбриональных зачатков к локальному лазерному облучению.97

2.3. Чувствительность зародышей к химическим воздействиям.107

2.4. Гравитационная чувствительность зародышей амфибий.112

Клиностатирование зародышей амфибий различного возраста.112

Возможные причины аномалий развития.116

2.5. Чувствительность зародышей амфибий к сверхмалым дозам биологически активных веществ. 123

2.6. Модификации морфогенеза как средство изучения механизмов развития. 125

2.7. Развитие стрессовой реакции во времени. 126

Заключение. 130

Глава 3. СПОСОБЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

ВОДНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ И ПРИНЦИПЫ ЭМБРИОМОНИТОРИНГА. 131

Введение. 131

3.1. Методологический подход: биоиндикация загрязнения водной среды по метаболическому критерию. 132

3.2. Регламент биотестирования. 141

3.3. Проведение токсикологических исследований на дафниях. 143

3.4. Определение концентрационных зависимостей эффекта метилурацила фармакопейного на показатели физиологического состояния дафний: уровень свободнорадикальных реакций, скорость роста и плодовитость. 145

Заключение. 149

3.5. Применение метода привитой сополимеризации для оценки загрязнения водной среды на примере легочных моллюсков. 150

3.6. Морские и пресноводные биотесты. 155

3.7. Метаболический критерий для оценки жизнеспособности репродуктивного материала ценных видов рыб после криоконсервации. 160

3.8. Принципы эмбриомониторинга водной среды. 163

Глава 4. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ВОДОИСТОЧНИКОВ

НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ. 165

4.1. Биотестирование сточных вод производства целлюлозы методом радикальной сополимеризации. 165

4.2. Биотестирование природных вод Восточного Казахстана. 171

Обсуждение результатов. «Экологический диагноз» г. Зыряиовска. 195

4.3. Биотестирование природных вод в респ. Мордовия,в районах, подвергшихся воздействию радиоактивных выпадений после аварии Чернобыльской АЭС. 198

Результаты биотестирования интегральной токсичности воды по метаболическому критерию. 198

Выводы.204

4.4. Биологический контроль экологического состояния природных вод в районе расположения предприятия атомной промышленности.209

Результаты исследования и их обсуждение.212

Заключение.213

Глава 5. ЯВЛЕНИЯ САМООРГАНИЗАЦИИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ.

РОЛЬ ДИНАМИЧЕСКОГО ХАОСА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ

СИСТЕМАХ.214

5.1. Явления самоорганизации в эмбриогенезе.214

5.2. Роль динамического хаоса в развитии.216

ВЫВОДЫ.218

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.221

Публикации О.П. Мелеховой по теме диссертации.245

Введение.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние десятилетия в развитии эмбриологии ознаменованы большими успехами в генетическом анализе эмбриогенеза. Основные представления о формировании пространственной организации эмбрионального организма сводятся к тому, что в зиготе существует неравномерное распределение морфогенов - материнских белков - специфически включающих определенные группы генов, продукты которых в свою очередь служат регуляторами следующих фаз развития. Обнаружено существование некоторых морфогенов в неактивной форме, так что для начала их действия необходим дополнительный механизм активации (например, путем ограниченного протеолиза, высвобождающего активные центры мор-фогена). Позже координирующим механизмом развития становятся индукционные взаимодействия зачатков.

Наследуются не только морфологические черты организма, но и сама динамическая картина его развития. Если первая наследственная программа может быть описана через ключевые моменты, связанные с дифференциальной экспрессией специфических генов в определенных зачатках зародыша, то вторая программа, определяющая пространственно-временную организацию развития, не ясна. По-видимому, она носит эпигеномный характер и определяет время и место активации экспрессии генов, закономерности формирования компетенции и время детерминации эмбриональных зачатков. Многими экспериментами показано, что такие регулирующие факторы заложены уже в цитоплазме зиготы, однако не известно, каким образом в реализации пространственно-временной программы развития сочетаются принципы генетического детерминизма и самоорганизации.

Начальные условия и параметры порядка пространственно-временной программы индивидуального развития организма не ясны. Задача их определения актуальна не только с точки зрения моделирования основных процессов эмбриогенеза - клеточного размножения, цитодифференцировки и морфогенеза - и познания механизмов их координации, но также и с практической целью определения причин и прогноза возникновения аномалий развития и эмбриональной смертности.

Информационный обмен, присущий всем живым системам, приводит не только к изменению ее специфических особенностей, связанных с определенными наборами структур и ферментов, но и к регуляции ее энергетического состояния. Нами был выбран один из показателей клеточного метаболизма: уровень свободнорадикальных (СР) процессов. Можно считать, что этот показатель отражает скорость энергетического протока в клетке. Окислительные процессы, протекающие в организме с участием свободных радикалов - активных форм кислорода (АФК) — привлекают в последние годы большой интерес. Развиваются представления о системе окислительно-восстановительного гомеостаза клетки, в которую включены сигнальные АФК, ферментные комплексы митохондрий, мик-росом и ядра, генерирующие АФК, ферментативные и низкомолекулярные анти-оксиданты. Под действием АФК перестраивается и физико-химическая система регуляции клеточного метаболизма мембранами, в результате изменяется функциональная активность клетки (Бурлакова и др., 2001). Полагают, что АФК могут выступать как субклеточные посредники в регуляции экспрессии генов (Allen, Baiin, 1989), что было показано и нами (Мелехова, 1976, 1977). Особенностью свободнорадикальных (СР) реакций является высокий энергетический выход, зачастую сопровождаемый хемилюминесценцией. Предполагают, что АФК могут играть сигнальную роль (Saran, Bors, 1989; Воейков, 2000) и также характеризовать уровень энергетических процессов в клетке (Кометиани, Каюшин, 1964; Дмитриев, 1997). Свободные радикалы возникают в нормальном метаболизме, а также характеризуют ранние этапы повреждения клеток при любых патологиях («окислительный стресс»).

Современные достижения генетики развития ставят перед нами задачу выяснения механизмов связи СР-реакций как параметра окислительно-восстановительного гомеостаза и энергообмена клетки с процессами регуляции экспрессии генов.

Цель и задачи исследования

Работа посвящена обоснованию координационной роли свободнорадикальных процессов в эмбриогенезе как пермиссивного фактора детерминации эмбриональных зачатков. Этот фактор может определять созревание компетенции в раннем развитии (период предетерминации) и готовности к структурно-функциональным перестройкам клеток перед началом специализации. Основные задачи работы заключались в том, чтобы

• получить карты распределения относительных концентраций СР в клеточных популяциях зародыша на последовательных стадиях развития.

• исследовать субклеточную локализацию и биохимические субстраты СР реакций.

• исследовать механизмы дифференциальной чувствительности эмбриональных зачатков к повреждениям.

• применить полученные данные для биотестировапия качества водной среды.

Научная новизна и практическое значение

В работе впервые показано фундаментальное значение флуктуаций энергетического метаболизма для формирования компетенции эмбриональных зачатков и их чувствительности к слабым повреждающим воздействиям, соответствующей периодам детерминации.

Впервые применен оригинальный экспериментальный подход, позволивший обнаружить универсальный неспецифический механизм детерминации, включающей развитие свободнорадикальных реакций и лежащий в основе повышенной чувствительности. В серии многолетних исследований автором был открыт универсальный метаболический параметр, характеризующий эмбриональные клетки в периоде детерминации - активное развитие свободнорадикальных процессов. Модифицированная автором для эмбриональнальных объектов (амфибии, рыбы) методика радиоавтографического выявления свободных радикалов (Козлов, 1970, 1973) является универсальным способом исследования детерминирующихся эмбриональных зачатков in situ без использования традиционных для этой цели приемов микрохирургии Результаты исследований раннего развития амфибий, в которых использовался этот метод, позволили сформулировать гипотезу о ключевой роли свободнорадикальных реакций в пространственно-временной координации процессов морфогенеза и цитодифференцировки в эмбриогенезе (Мелехова, 1976, 1977, 1990). На основе этих и других исследований (Остроумова, Белоусов, Михайлова, 1977) была разработана модель параметрического управления дифференцировкой (Chernavskii, Solyanik, Belousov, 1980), которая акцентирует внимание на возможной роли неспецифического метаболизма в начальной дивергенции клеточной популяции.

Проблема эпигенетической программы раннего развития имеет фундаментальное теоретическое значение. Исследование механизмов такой программы важно также в практическом плане для понимания причин аномалий развития и эмбриональной смертности.

Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, что подтверждено авторскими свидетельствами и патентами. Разработаны и запатентованы способы оценки жизнеспособности репродуктивного материала гидробионтов и биотестирования качества природной среды. Результаты работы применены в области биотехнологии для оценки методов и условий культивирования и консервации репродуктивного материала животных, а также в области экологической экспертизы природных водоисточников и качества очистки сточных вод. Материалы диссертации включены автором в лекционные курсы.

Положения, выдвигаемые на защиту

1. Свободнорадикальные процессы участвуют в пространственно-временной регуляции эмбриогенеза в периодах предетерминации и преддифференци-ровки как факторы, определяющие компетенцию клеток и готовность к активному синтезу специфических продуктов.

2. Существенную роль в инициации процессов дифференцировки в эмбриогенезе вносят свободнорадикальные процессы в фосфоинозитидах и цепях трансдукции сигналов от мембраны к ядру.

3. Биохимический фон чувствительности детерминирующихся эмбриональных клеток к повреждающим агентам включает исходно повышенный уровень и неравновесное распределение CP-реакций в эмбрионах.

4. Модификации эмбрионального развития гидробионтов могут служить для оценки загрязнения водной среды, а также для тестирования биологической активности различных факторов и могут применяться в системе биомониторинга.

Реализации результатов работы

По результатам работ получены следующие авторские свидетельства и патенты:

1. Мелехова О.П., Бузинова Н.С., Колосова J1.B., Коссова Г.В. Способ биоиндикации загрязнения водной среды. // Авт. свид. № 1546904, 1988 г.

2. Лазарев В.В., Мелехова О.П., Цаплин B.C., Яресько Ю.И. Способ определения жизнеспособности эмбрионов рыб. //Авт. свид. № 1409179, 1988 г.

3. Мелехова О.П., Коссова Г.В. Способ определения эмбриотоксичности химических соединений и их комплексов. // Патент № 2073868 от 20.02.1997.

4. Мелехова О.П., Цветкова Л.И., Докина О.В., Пронина Н.Д., Коссова Г.В., Падалка С.М., Миленко В.М. Патент на изобретение «Способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации». // Патент № 2233142, Бюл. № 21 от 27.07.2004 г. Справка о приоритете от 21.01.2003 г.

Имеется акт о внедрении изобретения № 1546904 на Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате для оценки качеств очистки сточных вод: Акт о внедрении изобретения (авт. свид. № 1546904) на БЦБК для тестирования сточных вод БЦБК, а также некоторых флоккулянтов от 10.04.90.

Получены также справки о приоритете:

1. Мелехова О.П. Способ определения действующей дозы электромагнитного излучения на эмбрионах водных животны. // Справка о приоритете № 93002686(002367 HB).

2. Мелехова О.П. Способ отбора клеточных тест-систем для оценки повреждающего воздействия электромагнитного излучения. // Справка о приоритете № 93002686 (00366 HB).

Разработанные методы применены в комплексной экологической экспертизе:

• В Восточном Казахстане (по итогам экспертизы имеется доклад экспертов правительству Республики Казахстан);

• В республике Мордовия (по заказу республиканского Министерства экологии, по результатам экспертизы представлен отчет экспертов);

• В районе расположения предприятия атомной промышленности (г. Обнинск).

Апробация работы

VI Всесоюзное совещание эмбриологов, Москва, 1981г.; I Всесоюзный биофизический съезд, Москва, 1982г.; VII Всесоюзное совещание эмбриологов, Ленинград, 1986г.; III совещание по применению лазеров в биологии и медицине, Москва, 1983г.; симпозиум СЭВ «Свободные радикалы и биостабилизация», София, Болгария, 1987г.; Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987г.; International Conference on Regulation of FR-reactions, Varna, Bulgaria, 1989; III Всесоюзная конференция по хронобиологии, Ташкент, 1990г.; Regional meating of Internation Union of Physiological sciences, Prague, 1991; I Biophysician Congress of Turkey, 1991; Международная конференция «Фундаментальные аспекты охраны окружающей среды и экология человека», Томск, 1995г.; Международная конференция «Биоразпообразие наземных и почвенных беспозвоночных на Севере», Сыктывкар, 1999г.; Международная научно-практическая конференция «Экология речных бассейнов», Владимир, 1999г.; Международная конференция «Новое в экологии и безопасность жизнедеятельности», СПб, 2000г.; Российская конференция «Радиохимия-2000», СПб, 2000г.; Международная конференция «Эпергетика-2000», Обнинск, 2000г.; III Всероссийская конференция «Физические проблемы экологии», Москва, 2001г.; II Международный симпозиум по биоиндикаторам, Сыктывкар, 2001г.; Международный конгресс «Экватек-2002», Москва, 2002г.; Международная конференция «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах», Москва, 2002г.; Международная конференция «Разнообразие и управление ресурсами животного мира в условиях хозяйственного освоения европейского севера», Сыктывкар, 2002г.;

Международная конференция «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных», Саранск, 2005г.; Международный конгресс «ВэйстТэк 2005», Москва, 2005г.; III Международная конференция «Электромагнитные излучения в биологии», Калуга, 2005г.

ПРОБЛЕМА ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ РАЗВИТИЯ. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение

Упорядоченность и организованность являются важнейшими фундаментальными свойствами живых систем. Исследование этих свойств имеет основополагающее значение для понимания процессов индивидуального развития. Эти явления начали исследовать на современной научной основе лишь к середине XX в. Первая половина XX в. в биологии развития прошла под флагом физико-химических идей. Исследования целостности развития организмов как перехода из более вероятного состояния в менее вероятное (более организованное) приводили некоторых исследователей к противопоставлению физических и биологических закономерностей. Процессы интеграции, регуляции и управления в эмбриогенезе получили новое освещение с развитием теории информации, кибернетики, синергетики, термодинамики открытых неравновесных систем. В последние десятилетия достижения генетики развития и молекулярной биоэнергетики позволяют подойти к новому уровню понимания координационных механизмов в эмбриогенезе.

Развитие многоклеточного организма характеризуется тремя видами закономерно сочетающихся необратимых процессов: ростом и делением клеток, специализацией клеток (цитодифференцировкой) и становлением формы отдельных органов и всего организма (морфогенезом).

Эмбриональное развитие животных протекает с обязательной сменой фаз -крупных периодов, каждый из которых характеризуется определенными гомео-статическими механизмами.

Эти фазы связаны с созданием «барьеров необратимости» и последовательно определяют биологический возраст, то есть, соответствующие морфо-физиологические состояния эмбриона, а именно:

• в пределах первой фазы (дробления) клеточные деления приводят к появлению многоклеточного эмбриона (бластула);

• клеточные популяции различного качества появляются в следующей фазе -гаструляции;

• у позвоночных в фазе нейруляции появляется осевой зачаток;

• в пределах следующей фазы (органогенез), происходит дифференцировка, которая приводит к формированию органов.

Вслед за этим низшие позвоночные вылупляются из капсулы, чтобы начать период личиночной жизни с активным движением и питанием. Каждый переход между фазами связан с возникновением состояния неустойчивости к внешним воздействиям и повышенной восприимчивости к повреждениям. Таким образом, упомянутые переходы можно считать критическими периодами развития (8Шс-сатй, Светлов, 1978, Пучков, 1978, Гилберт, 1993). Ч.Х. Уоддингтон (\Vaddington, 1962) представлял развитие как «морфогенетический ландшафт», в котором периоды широких потенций, детерминации и чувствительности к внутренним и внешним воздействиям чередуются с периодами устойчивого программированного развития.

Эти разномасштабные процессы в живом зародыше должны быть объединены системой регуляций на организменном уровне, корректирующих субклеточные процессы таким образом, что обеспечивается закономерность смены фаз развития и интеграция процессов дифференцировки и морфогенеза. Эта система регуляций обеспечивает целостность развития организма зародыша и его реакций на внешние воздействия.

Одним из основных вопросов, волнующих исследователей, был и остается до сих пор вопрос о том, насколько преформирован (генетически детерминирован) процесс развития организма? В последние годы, в связи с развитием нового направления науки - синергетики - этот вопрос приобрел несколько иное выражение и более широкий смысл: каким образом в развитии не только зародыша, но и любой живой системы, сочетаются принципы детерминизма и самоорганизации? На протяжении многих поколений эмбриогенез любого организма в основном воспроизводится с высокой точностью. Однако каждая отдельная группа клеток может вести себя не строго определенным образом. В соответствии с принципом детерминизма, пласт однородных клеток зародыша не может без внешнего стимула детерминироваться в двух разных направлениях. По принципу же самоорганизации в таком пласте может спонтанно возникать неоднородность.

Различные теории развития ищут объяснения явлениям различных иерархических уровней, представленных процессами разных временных и пространственных масштабов.

Причинно-следственные связи смены фаз развития изучаются на уровне целого организма, в масштабе всего эмбриогенеза или целой жизни. Термодинамические теории рассматривают весь процесс развития как эволюцию к термодинамически устойчивым состояниям (Бауэр, Пригожин, Зотин и др.).

Явления цитодифференцировки и морфогенеза могут быть исследованы на протяжении одной фазы развития, в отдельной клеточной популяции. Применение современного молекулярно-генетического анализа стало возможным в результате развития экспериментальных микрохирургических методов трансплантации и эксплантации зачатков и разработки моделей для исследований in vitro (обзоры: Михайлов, 1988, Гилберт, 1993 - 1995, Корочкин, 2002). Концепция дифференцировки как результата дифференциальной активности генов была разработана на основе опытов по трансплантации ядер, а также ДНК-РНК-гибридизации.

Тестирование морфогенетических свойств гетерогенных индукторов и ростовых факторов проводят in vitro на эксплантатах эктодермы ранней гаструлы амфибий. Разработка метода гибридизации нуклеиновых кислот in situ и методов иммуноферментного анализа сделала возможными успехи молекулярно-генетического исследования раннего развития.

С самого начала эмбрион представляет собой сложную систему: сама яйцеклетка обладает изначально неоднородной цитоплазмой, которая затем обеспечивает самоорганизацию сложной структуры организма в целом. Другими словами, формирование эмбрионального организма не нуждается в особом внешнем воздействии и, следовательно, может рассматриваться как самоорганизующийся объект.

Последние достижения эмбриологии связаны с генетическим анализом процессов развития. В эмбриогенезе параллельно идут процессы морфологического усложнения зародыша и прогрессивной спецификации (дифференцировки) каждого его зачатка. Гены, управляющие ранним развитием, можно условно подразделить на «гены разметки» (морфогенеза) и «гены специализации» (Нейфах, 1993). Первые обеспечивают процессы ограниченной диффузии морфогенов и триггерной реакции клеток (зачатков органов) на них, а вторые дифференциальную активность «генов роскоши» и синтез специфических белков, определяющих специализацию клеточных типов.

Сразу после оплодотворения начинается не только пространственная организация эмбриона, но и отсчет индивидуального времени его жизни. Отсчет индивидуального времени в эмбриогенезе связан с процессами двух типов: циклами клеточных делений («маятниковые часы») и ходом необратимых процессов («песочные часы») дифференцировки (специализации клеток), роста и морфогенеза.

Появление специфических типов клеток является очевидным результатом дифференциальной активности генов. В пространственно-временной организации дифференциальной транскрипции значительную роль играет открытая A.A. Нейфахом периодичность морфогенетической функции ядер (МФФЯ) (Нейфах, 1961, 1962). Речь идет о том, что (на фоне непрерывной транскрипции) информационная РНК, обеспечивающая формообразовательные процессы, синтезируется как бы «квантованно», в ограниченные промежутки времени. Именно эти периоды развития являются наиболее чувствительными к повреждающим факторам, как например, ингибиторы транскрипции, ионизирующая радиация. В раннем развитии периоды МФФЯ обеспечивают наступление следующей фазы развития всего зародыша, при подготовке органогенеза в каждом зачатке также проявляется такая периодичность МФФЯ (Корочкин, 2002). Таким образом, для эмбриогенеза характерна дифференциальная активность генов во времени и в пространстве. У зародышей низших позвоночных первый период МФФЯ отмечен на стадии бластулы, когда подготавливаются гаструляционные процессы. Чувствительность к повреждающему воздействию наиболее велика в период МФФЯ, а проявляется поражение позже - с началом гаструляции.

Явление МФФЯ объясняет с молекулярно-генетических позиций сущность критических периодов развития (Броун, 1897, Стоккард, 1921, Гольдшмидт, 1927, 1932, Светлов, 1978,Дыбан, 1968, Токин, 1987).

Пространственно-временная регуляция эмбриогенеза представляется, в мо-лекулярно-генетическом аспекте, как результат взаимодействия генетической программы клеток со специфическими регуляторами генной экспрессии, - так называемыми морфогенами, распределенными в зародыше неравномерно (Корочкин, 2000, Корочкин, Михайлов, 1999). В некоторых случаях исследователи обнаруживали гены и их продукты, которые управляли определенными морфоге-нетическими явлениями. Тем самым у некоторых животных была частично раскрыта детальная мозаичная картина причинно-пространственной организации.

По современным представлениям, дифференциальная экспрессия генов в эмбриогенезе носит многоуровневый характер. Регуляция осуществляется и на уровне транскрипции, и на уровне трансляции, и при посттрансляционных событиях (время жизни, активация, транспорт продуктов). На каждом уровне можно выделить «триггер» всего каскада процессов, активаторы и ингибиторы каждого звена. В итоге создается неравномерное распределение генопродуктов в зародыше - основа «позиционной информации».

1.2. Характерные особенности эмбриогенеза как модели развивающейся системы

Считывание генетической информации при эмбриогенезе происходит постепенно и, первоначально, управляется архитектурой яйцеклетки. Только что оплодотворенная яйцеклетка уже имеет сложную структуру, в которой заложен план строения, - так называемый «паттерн» будущего организма. В этом паттерне намечены координатные оси и отделы организма и, следовательно, предопределено размещение основных актов дифференцировки.

Для всех многоклеточных (М^агоа), необходимой фазой развития является дробление, - быстрые клеточные деления; оно завершается при достижении определенного критического количества клеток. Предполагается, что появившиеся при этом клетки обладают широким выбором путей дифференцировки (широкими потенциями развития).

В пределах этой популяции клеток постепенно нарастает качественное разнообразие; начало процесса дифференцировки носит бифуркационный характер. Такое разнообразие впервые проявляется как только клетки приобретают количественные отличия в неспецифических свойствах, таких, как скорость деления, реакции на внутренние и внешние воздействия и общий уровень окислительных процессов.

Процесс дифференцировки (специализации) возможен только для группы клеток, чье количество достигло определенного критического значения. Диффе-ренцировка начинается с латентного периода - детерминации, при которой «судьба клетки» становится предопределенной на генном уровне; при этом потенциал развития уменьшается, хотя не видно ни биохимических, ни морфологических изменений. Для начального периода эмбриогенеза характерен заблаговременный синтез матриц, необходимых для наступающей фазы развития. Эти матрицы, способные к быстрой активации, до некоторого момента сохраняются в неактивном состоянии.

Типичным предвестником периода детерминации является состояние компетенции. В этом состоянии клетки чрезвычайно чувствительны к слабым стимулам и готовы реагировать на них переходом к дифференцировке. В состоянии компетенции клетки обладают широкими потенциями развития. Более того, клетки становятся чрезвычайно восприимчивыми по отношению к повреждающим воздействиям, так что судьба каждой клетки неопределенна и может меняться под влиянием ближайшей окружающей среды.

Состояние компетенции, то есть, особой чувствительности к стимулам, вызывающим дифференцировку, является эндогенным свойством. Оно возникает или угасает в прямой связи с возрастом этих клеток, то есть, на определенных стадиях развития эмбриона, и существует не синхронно во всех зачатках эмбриона. Один и тот же сигнал порождает различные реакции и специфические виды синтеза в клетках разной степени «зрелости», то есть различного биологического возраста. В настоящее время молекулярно-генетические аспекты этих явлений активно изучают. Вероятнее всего эти явления контролируются мембранными рецепторами, а также метаболическими факторами, обеспечивающими передачу сигнала в пределах данной клетки. При всех современных знаниях, мы по-прежнему не вполне понимаем природу эндогенных процессов, которые делают клетки компетентными по отношению к любому виду дифференцировки.

Дифференцировки, приводящие к появлению различных видов клеток и развитию органов, координируются в значительной мере через взаимные контакты: «старшие» зачатки индуцируют (инициируют) дифференцировку в «младших» зачатках. Важная роль в раннем эмбриогенезе принадлежит также явлению «позиционной информации» (\Volpert, 1983; Оигс1оп е! а1., 1994, 1995, 1996). Благодаря последней, клетки дифференцируются в соответствии с их расположением в эмбрионе. Полагают, что градиенты распределения «морфогенов» (веществ, регулирующих экспрессию генов) между клетками, как и различия между последними в отношении пороговой чувствительности к этим «морфогенам», ответственны за различные направления дифференцировки.

Характерной для ранних фаз развития эмбриона является способность к «эмбриональной регуляции», выражающейся в восстановлении нормального пути развития вслед за устранением, перемешиванием или добавлением клеточного материала. Важно только чтобы позиционная информация была введена до того, как наступило состояние устойчивой детерминации клеточного материала.

Следует также должным образом учитывать основную макроскопическую динамику развития, сходную для различных видов животных. Мы полагаем, что место и время начала событий морфогенеза и дифференцировки, то есть, возникновения координированной иерархии органов, следует единой эпигеиомной пространственно-временной программе (Мелехова, 1990,1998,2000).

1.3. Термодинамические теории развития

Э.С. Бауэр (Бауэр, 1930, 1935) построил общую теорию жизненных явлений

- включая обмен веществ, раздражимость и возбудимость, онтогенез и филогенез

- на основе единого термодинамического принципа - устойчивого неравновесия. Э.С. Бауэр показал, что, исходя из фундаментальных свойств живых систем, их прогрессивная эволюция направлена в сторону увеличения способности извлекать энергию из окружающей среды и превращать ее в энергию динамических струкур, способных совершать работу по поддержанию неравновесия со средой. Э.С. Бауэр считал, что процессы развития и роста организмов сопровождаются непрерывным уменьшением свободной энергии структур, т.е. удельной свободной энергии организма. Во время оогенеза происходит «перезарядка» организма и яйцеклетка приобретает более высокий потенциал (уровень свободной энергии структур). Общая же свободная энергия растет в процессе развития и роста, достигает максимума к моменту прекращения роста и затем начинает снижаться, при этом начинается старение. Термодинамика неравновесных состояний (в отличие от равновесной) использует понятия не энтропии и свободной энергии как таковые, а скорости изменения этих функций (т.е. продукция энтропии, уменьшение удельной свободной энергии и т.п.).

Приближение организмов в процессе развития и роста к равновесному состоянию Бауэр характеризует уменьшением удельной свободной энергии (соотнесенной с весом). Бауэр считал, что свободная энергия структур проявляется в особом активном «деформированном» состоянии живых белков. Действительно, энергия внутриклеточных структур зависит от их фосфорилированного состояния.

По современным представлениям центральным пунктом энергетики клеток является система АДФ ^ АТФ, выполняющая роль унифицированного аккумулятора энергии (Скулачев, 1969). Т.е. энергия пищи фиксируется вначале в виде свободной эиергии АТФ.

Изучение механизма окислительного фосфорилирования привело к появлению хемиосмотической теории, согласно которой энергия окислительных процессов сначала трансформируется в мембранных потенциал митохондрий, а затем переводится в энергию макроэргических связей АТФ (Скулачев, 1972; Рэкер, 1979; Николе, 1985 и др.). Бауэр также считал, что «деформированное» состояние белков является источником электрического мембранного потенциала. Таким образом, возможный путь экспериментальной проверки идей Э. Бауэра состоит в исследовании клеточных энергетических процессов в развивающемся организме. Содержание АТФ в клетках определяется скоростями ее сиитеза и распада. Скорости окислительных реакций, гликолиза, уровень потребления кислорода, концентрация АТФ в зародышах различных животных были предметом многих исследований, подтвердивших в основном правильность теории Э. Бауэра в приложении к процессам развития, роста и старения животных (Зотин, Зотина, 1993;).

Теория Пригожина-Виам (Prigogine, ¡Угат, 1946, 1960). Эти исследователи предлагают принцип минимальной скорости продукции энтропии в стационарном состоянии и вводят понятие «критерий эволюции» открытых систем: изменение диссипативной* функции, связанной с термодинамическими потоками и силами.

В живых системах протекают одновременно десятки тысяч химических реакций и, соответственно, термодинамических процессов. Поэтому непосредственно исследовать изменения диссипативной функции в развитии не представляется возможным. Но поставщик энергии для всех метаболических процессов -окислительные процессы и гликолиз (энергетический метаболизм). По энергетическому метаболизму можно судить о потенциальных возможностях системы диссипация - рассение; диссипировать энергию. To-есть можно представить удельную диссипативную функцию как величину пропорциональную интенсивиости потребления кислорода" и интенсивности гликолиза (Зотин, Зотина, 1993). ¥ = qo2 + 4gi

В аэробных условиях величина qgi пренебрежимо мала и критерий эволюции живых систем приобретет вид: dqo2 / dt < 0.

Согласно теории Пригожина-Виам развитие, рост и старение приближает организм к конечному стационарному равновесному состоянию и сопровождаются непрерывным уменьшением удельной продукции энтропии, диссипативной функции и, соответственно, удельной скорости теплопродукции организма. Эти представления были приняты многими биологами, хотя далеко не все экспериментальные факты укладывались в рамки этой теории. В раннем онтогенезе организмы представляют собой системы далекие от равновесия, и их поведение описывается нелинейными функциями.

В частности, на ранних стадиях онтогенеза многих животных были обнаружены максимумы показателей энергетического метаболизма (Озернюк, 1985, Озериюк, Леляпова, 1985).

С именем И.Р. Пригожина связано также представление о развитии как процессе самоорганизации, механизмом которого является образование «дисси-пативных структур» (Prigogine, Nicolis, 1971; Эйген, 1973, Николис, Пригожин, 1979; Пригожии, 1983; Николис, Пригожин, 2003). Суть этих представлений в том, что при возрастании неравновесности системы достигается порог стабильности, за которым обнаруживаются периодические или апериодические колебания, спонтанное нарушение пространственной однородности или образование упорядоченных структур. Устойчивость этих структур поддерживается протоком энергии через систему: притоком энергии (или оттоком из нее). Так как эти структуры возникают в открытых сильно неравновесных системах и сопровождаются интенсивной диссипацией энергии, они были названы «диссипативны-ми». Теория диссипативпых структур имеет термодинамическое обоснование и математический аппарат. Науку о самоорганизации называют также «Синергетикой» (Haken, 1973; Хакен, 1980). В этой актуальной области появляется много работ, связанных с моделированием процессов морфогенеза и дифференцировки в эмбриональном развитии.

Критерий эволюции по Пригожину-Виам основан на принципе минимальной скорости продукции энтропии ¥ = min, тогда критерий эволюции d^F / dt < 0*. Этот критерий эволюции действителен для систем, близких к равновесию (или же слабо нелинейных). Он показывает, что в процессе изменения термодинами" Интенсивность - скорость потребления 02 единицей массы тела Уравнение второго начала термодинамики имеет вид: djS / dt > 0, где djS / dt - продукция энтропии. ческих систем происходит уменьшение интенсивности диссипации энергии, которая в стационарном состоянии достигает минимальной величины. В сильно нелинейных системах скорость диссипации может не быть постоянной (но так же стремится к минимальной).

Феноменологическая теория онтогенеза, разработанная А.И. Зотиным и его сотрудниками (Зотип, 1974, 1988, Зотин, Зотина, 1993), эта теория рассматривает развитие, рост и старение организмов, учитывая их основные особенности: открытость, нелинейность и «организованность» (т.е. наличие механизмов саморегуляции), причем используется понятие отрицательной энтропии - «негэнтро-пии» (Бриллюэн, 1960). Согласно теории А.И. Зотина, критерий эволюции живых нелинейных организованных систем включает колебания величины диссипатив-иой функции в стационарном состоянии, а также возможность длительного уклонения от стационарного состояния за счет негэптропийных эффектов или изменения внутренних параметров под действием управляющих систем. Таким образом допускается, что развитие является немонотонным процессом, проходящим через смену фаз и гомеостатических механизмов.

Предполагается, что для организма характерны два типа стационарных состояний: одно из них - устойчивое состояние в отдельный момент времени, другое - конечное стационарное состояние, к которому организм эволюционизирует в процессе жизни.

Предложено назвать процесс приближения организмов к конечному стационарному состоянию «конститутивным», а процессы временного уклонения и последующего восстановления текущего стационарного состояния - индуци-бельными (Озернюк и др., 1971, Огегпуик е1 а1., 1973). «Феноменологическая теория» на большом экспериментальном материале рассматривает все основные этапы и феномены развития: оогенез, эмбриогенез, рост, старение, регенерацию, канцерогенез.

Согласно этой теории процесс развития сопровождается общим снижением функции внешней диссипации. Но каждый новый организм должен иметь вначале достаточно высокий уровень этого процесса. «Перезарядка» происходит во время оогенеза, когда возникает эффект негэптропии, связанный с накоплением информации в ооцитах и усложнением их организации. В оогенезе таким образом происходит значительное конститутивное уклонение от состояния устойчивого неравновесия, однако это не противоречит законам термодинамики, т.к. устойчивое уклонение ооцитов от стационарного состояния может происходить за счет сопряженных процессов в других частях организма матери.

В период эмбриогенеза и перехода к личиночному состоянию также возможны периоды уклонения от стационарного состояния. В дальнейшем, с возрастом происходит постоянное снижение удельной диссипативной функции, нарушаемое процессами индуцибельного уклонения от стационарного состояния при повреждениях, при регенерации, а также при злокачественном росте. Эти явления отклонения от конститутивного приближения к стационарному состоянию рассматривают как случаи «омоложения» отдельных частей организма.

Последовательные приложения этой теории имеют практическое значение. Речь идет о «митохондриальной концепции» старения и канцерогенеза, открывающей некоторые перспективы борьбы с этими явлениями. Согласно этой концепции, митохондрии являются центральным звеном механизмов старения и омоложения живых систем. У аэробных организмов в периодах «конститутивного омоложения» (оогенез и начало постэмбрионалыюго периода) происходит увеличение количества митохондрий, концентрации митохондриальных мембран, активности дыхательных ферментов (Озершок, 1985, Озернюк и др., 1987, 2000). При канцерогенезе - возрастает количество дефектных митохондрий, ослабляется их функция. При старении уменьшение производства митохондриальных мембран и их функционирования является основной причиной снижения энергетического обеспечения организмов и снижения основного обмена (Зотин, Зотина, 1993), а в целом - ослабления гомеостаза. Одной из причин этого явления считают повреждение свободными радикалами митохондриальной ДНК (Miguel, 1980, 1983, 1984 и др., Козлов, 1973 и др.).

Таким образом, термодинамические теории онтогенеза рассматривают крупномасштабные фазы индивидуального развития целого организма, их общую картину и направленность - от оогенеза до смерти. Сопоставляя термодинамические параметры (продукцию энтропии, удельную функцию диссипации, свободную энергию) с метаболическими процессами и показателями гомеостаза клетки и организма, исследователи приходят к выводу, что управляющие параметры развития относятся к сфере энергетического метаболизма.

Работы последних десятилетий (Зотин, Зотина, 1993, Озернюк, 1992, 2000) обосновывают митохондриальную концепцию развития и старения. Однако в этой концепции не рассматриваются подробно представления о дифферепциров-ке эмбриональных клеток (как результате дифференциальной активности генов).

1.4. Теории аксиальной упорядоченности эмбриогенеза

Изучение этих явлений требует экспериментального подхода с позиций целостного организма. Важнейшим фактором пространственной организации эмбриогенеза является установление осей яйца (анимально-вегетативной - во время онтогенеза - и дорсовентральной - при оплодотворении), с чем и связана «разметка» отделов тела зародыша.

Важнейшей исторической вехой развития целостных представлений об эмбриогенезе явилось открытие Г. Дришем закона эмбриональных регуляций, т.е. экспериментальное обоснование утверждения, что судьба эмбрионального зачатка есть функция его положения в целом зародыше (Н. Driesch, 1892).

Важнейшим фактором пространственной организации эмбриогенеза является установление осей яйца (анимально-вегетативной - во время оогенеза - и дор-совентральной - при оплодотворении и ооплазматической сегрегации), с чем и связана «разметка» отделов тела зародыша.

П. Чайлд развил концепцию метаболических градиентов (в частности, градиентов окислительного метаболизма и градиента реактивности при повреждающих воздействиях) как основной причины осевой упорядоченности эмбриогенеза (Child, 1941). Источником наведения градиентов, по Чайлду, является внешняя среда. Теория П. Чайлда оказалась весьма плодотворной. Основные эксперименты Чайлда выполнены на гидроидах. Одной из теорий градиентов является также количественная теория «органицина» Далька и Пастельса. Согласно этой теории детерминация эмбрионального зачатка определяется количественным распределением гипотетического фактора органицина, которое зависит от соотношения градиентов желтка и дорсовентрального кортикального градиента (Pasteeis, 1942; Dalque et Pasteeis, 1937).

В современных представлениях идеи Чайлда дополнены представлениями о динамической природе полярной упорядоченности, в которой играют роль диффузионные градиенты и факторы межклеточной и внутриклеточной сигнализации.

Дальнейшее развитие аналитических моделей упорядоченности образования структур в эмбриогенезе принадлежит Л. Волперту и его группе (Wolpert, 1969, 1972).

В основе моделей Л. Волперта лежит представление о «позиционной информации» в виде регулирующего градиента особого морфогена или каких-либо метаболитов в организме зародыша. Интерпретация этой информации клетками расположенными по градиенту зависит от порогов их чувствительности к концентрации морфогена и затем проявляется в том или ином типе дифференциров-ки. Согласно теории Волперта, явление позиционной информации универсально для всех регулирующихся живых систем, а «коды» интерпретации этой информации могут быть видоспецифичными.

Таким образом, согласно этой модели достигается разнообразие фенотипов при сохранении основного эпигенетического механизма. Возможные механизмы интерпретации позиционной информации в этих работах не обсуждаются.

Поведение аксиально-упорядоченных систем рассматривает также модель А. Гирера и X. Майнардта (Gierer, Meinhardt, 1972). Авторы предполагают, что в аксиально-упорядоченных системах протекают два различных процесса, взаимодействия между которыми приводят к плавному распределению клеток по состояниям (например, дифференцировки). Один из них способен активировать небольшую соседнюю область (как например при эмбриональной индукции). Второй процесс - ингибирование большой области, где подавляется формирование индуцированных первым процессом структур. Предполагается, что скорость диффузии активатора и ингибитора разные и что для каждого из них имеется источник и (или) сток, что и дает начало полярности.

Эта модель основана на системе дифференциальных уравнений. Она принадлежит к группе уравнений реакций с диффузией, используемых для описания распределения морфогена в ткани. Первый пример таких моделей дала классическая работа А. Тьюринга (Turing, 1952). Возможные механизмы действия морфо-генов и регуляции развития в этих работах не рассматриваются.

Б. Гудвин (Goodwin, 1976, 1979) предложил иной подход к моделированию пространственно-временной упорядоченности в эмбриогенезе, основанный на свойствах цитоплазматической мембраны и кортекса яйцеклетки.

Основой начального события поляризации может служить «метаболическая возбудимость» мембраны. Присутствие аллостерических ферментов, способных к активации и ингибированию специфическими лигандами, может привести к возникновению в мембране волн активности. При этом от одного локального источника (стимула) могут возникать периодически повторяющиеся волны, которые создают устойчивый морфогенетический градиент. Проблема эпигенетического управления клеточными циклами в работах Б. Гудвина рассматривается в связи с установлением полярности в эмбриогенезе и процессами дифференцировки. При этом предполагается важная морфогенетическая роль простых метаболитов как модуляторов мембран и их воздействие на локальный метаболизм, что приводит к упорядоченной физиологической или структурной гетерогенности в развивающихся клеточных популяциях. Считается, что одна волна не создает устойчивого морфогенетического градиента, требуется периодичность волн от одного источника. Градиент на мембране поддерживается установлением равновесия между образованием метаболита в результате периодической активности источника и его высвобождением из комплекса с мембранным белком. Такая система лабильна, обладает высокой реактивностью, т.е. способна к саморегуляции. Мембранная волновая модель объясняет устойчивость морфогенетического поля к центрифугированию, гомогенизации и др. воздействиям.

Автор предполагает, что биохимическая природа «волнового морфогена» связана с работой вторичных мембранных мессеиджеров, например цАМФ. В этом случае в результате каскада фосфорилирования в яйцеклетке возникает сигнал с пространственным распределением энергии. Ответом на такой сигнал может быть узнавание белками соответствующих лигандов и специфические взаимодействия в определенных пространственных областях зародыша. В качестве примера таких явлений автор рассматривает возникновение полярной оси после оплодотворения или партеногенетической активации у водорослей Fucus и Pelve-tia и поляризацию миксамеб Dictiostellum discoideum при их агрегации.

Основой пространственно-временной организации дробления зиготы Б. Гудвин считает поляризованное «кортикальное поле», имеющее электрическую природу. Автор считает главным носителем апимально-вегетативной и дорсовен-тральной полярности кортикальный слой яйца, который и во время дробления сохраняет свое единство благодаря сети десмосом. Однако эта объединяющая функция кортикального слоя начинает ослабевать по мере проявления мезодер-мальной дифференциации и усиления связей между мезодермальными клетками.

Кооперативные взаимодействия бластомеров объясняются с другой точки зрения «теорией Фрелиха»: дальнодействующей когеренции на основе высокой диэлектрической поляризуемости биологического материала (Фрелих, 1980). Для яйцеклеток многих животных показано возникновение после оплодотворения и дальнейший рост электрического потенциала на мембране, происходящий благодаря притоку метаболической энергии и градиентам концентраций ионов на мембранах. «Полевая связь» и в целом эмбрионе определяется силами дальнодействующей когерентности (Риус, Гудвин, 1984).

Примеч.: в случае партеногенетической активации воздействующий агент наводит градиент извне).

Непосредственно на объяснение факторов, обеспечивающих целостность развивающихся организмов, направлены представления о морфогенетическом поле А.Г. Гурвича (Гурвич, 1944, 1991). А.Г. Гурвичем открыты при помощи биодетекции слабые электромагнитные излучения делящихся клеток в УФ-диапазоне («митогенетические лучи»). Позже такое излучение было зарегистрировано Г.М. Франком. На основе этого открытия А.Г. Гурвич предположил существование клеточных полей, слагающихся в «актуальное поле» многоклеточной структуры, управляющее морфогенезом эмбрионального зачатка посредством влияния на направление вновь образующихся митотических веретен. Важно при этом, что митогенетическое излучение является триггером вторичного излучения в биодетекторе, вызывающим каскад реакций митоза. Позже были обнаружены сверхслабые излучения погибающих клеток. Также с помощью фотоэлектронных умножителей было обнаружено и исследовано у широкого круга биообъектов в 60е годы XX в. явление сверхслабой хемилюминесценции - излучения в желто-зеленой области спектра, обусловленного рекомбинацией свободных радикалов при окислительных метаболических процессах (Тарусов, Эмануэль, Бурлакова и мн. др.).

Сейчас хорошо известно, что все жизненные процессы запускаются, регулируются и осуществляются с использованием электрических полей и сигналов. На этом основаны многие методы физиологической и медицинской функциональной диагностики (ЭЭГ, ЭКГ и др.). Многие исследователи считают, что за счет энергии электронновозбужденных соединений (свободных радикалов) в живых клетках постоянно осуществляются энергоемкие процессы, модулируется активность ферментов, физико-химическое состояние мембран. При этом генерируются сверхслабые излучения в разных областях спектра, которые играют функциональную роль. Возможно, что создаваемое электронновозбужденными частицами слабое электромагнитное поле и излучения, сопутствующие его ос-цилляциям, имеют информационное значение (Ревии и др., 2002).

В последние десятилетия Ф.-А. Попп и его коллеги показали, что клетки, многоклеточные организмы и даже их сообщества излучают когерентные электромагнитные волны (Popp, 1989, 1992), что может быть основой их взаимодействий (Белоусов, Воейков, Попп, 1997).

Понятие «морфогенетического поля» употреблялось и без указаний на его природу некоторыми исследователями, как характеристика свойств внутреннего пространства зародыша, т.к. процессы формообразования нельзя объяснить исходя из поведения и свойств единичных клеток. Так А.Г. Гурвич в своих ранних работах ввел понятие «морфогенетического поля», где целое определяется как сумма векторных полей отдельных клеток, возникающих при определенной ориентации веретен деления.

Гексли и де Бер понимали «поле» как область однородности, в которой определенные регулирующие факторы действуют одинаково (ср. понятие «поля проспективного зачатка органа» как «гармонической эквипотенциальной системы, клетки которой инструктированы к формированию любой части этого органа» (Гилберт, 1995). Шпеманн также использовал понятие «поле организатора». П. Чайлд применял сходное понятие «доминантной области» для характеристики наиболее физиологически активной области зародыша.

Н.К. Кольцов рассматривал морфогенетическое поле как силовое поле фи-зическо-химической природы (Кольцов, 1936). Исходная конфигурация этого поля определяется полярностью и компартментализацией ооцита и яйца. В ходе развития разные пункты силового поля характеризуются разностью потенциалов электрических, химических, температурных, механических и т.п.). Такое неравновесие физико-химических процессов определяет токи веществ в зародыше, поведение отдельных бластомеров и в дальнейшем - усложнение силового поля и расчленение зародыша. При этом по мере развития в зародыше образуются центры с высокой разностью потенциалов (аналог «доминантных областей» Чайлда). С точки зрения Н.К. Кольцова, не существует исключительно индуцирующих или индуцируемых зачатков: роль зачатков в индукционной системе определяется соотношением активности физиологических процессов. В настоящее время феномен морфогенетического поля понимают как равнодействующую межклеточных взаимодействий, которая и направляет формообразовательные перемещения клеточного материала.

План строения животных и, в том числе, амфибий формируется в результате целой цепи событий раннего развития, в основе которых лежит неоднородность химической организации яйцеклетки. Само развитие ооцита представляет собой последовательное формирование гетерогенности его цитоплазмы. В период оогенеза функционируют почти все уникальные последовательности ДНК; в яйцеклетке амфибий в конце оогенеза содержится набор разнообразных мРНК и белков, многие из которых станут функционально активными гораздо позже. Таким образом, ядро ооцита обеспечивает будущие стадии развития. Л.И. Корочкин отмечает, что феномен «морфогенетического поля» реально существует. Он имеет не внешнюю по отношению к зародышу, а генетическую природу и представляет собой равнодействующую межклеточных взаимодействий, которая и направляет формообразовательные перемещения клеточного материала (Корочкин, 2002).

1.5. Современные представления о координационных механизмах в раннем эмбриогенезе

Основными механизмами обеспечения целостности зародыша в раннем развитии являются ооплазматическая сегрегация и эмбриональная индукция.

Формирование плана строения зародыша амфибий включает следующие события:

• Во время оогенеза создается анималыю-вегетативная полярность ооцита, определяющая затем передне-заднюю ось эмбриона; ооцит радиалыю симметричен.

• При оплодотворении закладывается билатеральная симметрия и дорсовен-тральная ось эмбриона; это является следствием гравитационно-зависимого поворота оплодотворения (Gerhardt е.а., 1986, Pasteeis, 1964) и образования серого серпа на дорсальной стороне.

В последние годы установлено, что аксиализация яйца управляется сложными системами генов, среди которых выделяют основные группы (Корочкин, 2002):

• Материнские гены, функционирующие во время оогенеза. Их продукты -так называемые «морфогены» - (в неактивном состоянии) неравномерно распределены в цитоплазме яйца.

• Гены-активаторы, влияющие на стабильность морфогена и его градиента.

• Гены-антагонисты основного морфогена и их активаторы.

• Каскад структурных генов, активируемый основным морфогеном и обеспечивающий формообразовательные процессы.

Таким образом, дифференциальная экспрессия генов носит многоуровневый характер. Регуляция осуществляется и на уровне транскрипции, и на уровне трансляции, и при посттрансляционных событиях (время жизни, активация и транспорт продуктов). На каждом уровне можно выделить «триггер» всего каскада процессов, активаторы и ингибиторов каждого звена. В итоге создается неравномерное распределение генопродуктов в зародыше - основа «позиционной информации».

Во время оогенеза и при оплодотворении создается также неравномерное распределение энергоресурсов и морфогенов в цитоплазме яйцеклетки, которое и является основой позиционной информации. По современным представлениям, морфоген - это продукт материнских генов, индуктор, который способен по-разному определять путь дифференцировки (судьбу) многих клеток-мишеней, находящихся в зоне его эффективных концентраций (действие на расстоянии от места синтеза и секреции). Диффузия морфогена приводит к формированию в зародыше «морфогенетических градиентов». Наиболее важный момент - способность окружающих клеток к восприятию различных концентраций морфогена как различных информационных сигналов.

В результате градиент единичного морфогена может привести к формированию в исходно гомогенной клеточной массе нескольких субпопуляций с различными направлениями дифференцировки. Это должно обеспечиваться дифференциальной экспрессией материнских и зиготических генов. Экспрессия генов в раннем эмбриогенезе регулируется как на уровне транскрипции, так и трансляции, и в посттрансляционных процессах.

Градиент даже одного морфогена может координировать пространственное распределение различных типов клеток, если пороги их чувствительности к этому морфогену различны.

В эмбриональном развитии позвоночных градиенты морфогенов играют ведущую роль в формировании осевого зачатка, регионализации мезодермы и нейро-эктодермы. Молекулярная природа этих морфогенов и механизмы их действия исследованы лишь в конце XX в., хотя само существование морфогенов было известно давно (обзор: Михайлов, 1988, 1989).

Используя in vitro эмбриональную эктодерму и один из недавно охарактеризованных морфогенов - активин - Дж. Гердоп показал, что эмбриональные клетки способны детектировать весьма низкие концентрации морфогена (от 20 пикограмм), отвечать на двухкратное измеение концентрации морфогена изменением направления дифференцировки. Морфоген может не только активировать, но и репрессировать наборы генов в одних и тех же клетках-мишенях в зависимости от их положения в градиенте (Gurdon, 1994, 1995, 1996).

В дальнейшем основным механизмом пространственно-временной координации развития является эмбриональная индукция: все раннее развитие позвоночных животных представляет цепь взаимодействий «индуктор - компетентная реагирующая ткань».

Индукция - это взаимодействие клеток, побуждающее к дифференцировке. Индукция представляет собой один из регуляторных механизмов, обеспечивающих детерминацию того или иного клеточного типа в развитии. Возникновение каждого типа клеток является отражением и реализацией определенного паттерна генной активности, установившегося при детерминации.

Индукция является механизмом выбора пути дифференцировки одним зачатком эмбриона под влиянием другого, принимая во внимание, что окончательная (терминальная) гистотипическая дифференцировка является результатом нескольких последовательных двоичных выборов.

Как детерминация, так и последующая реализация соответствующей дифференцировки представляет суммарный результат, обусловленный собственными свойствами клеток и внешними регулирующими воздействиями. Все развитие зародыша можно рассматривать как каскад индукций, происходящих на фоне физиологического «созревания» клеток, изменений порогов их чувствительности к тем или иным путям дифференцировки.

Первым по времени проявлениям таких взаимодействий в эмбриогенезе является закладка Ныокуповского центра организации (индукция мезодермы) на стадии от 64 бластомеров до средней бластулы, в дорсальных бластомерах вегетативной части зародыша. В клетках презумптивной мезодермы индуктор вызывает экспрессию гена Brachyury, продукт которого активирует гены, контролирующие образование мезодермы.

В пространственно-временной организации дифференциальной транскрипции значительную роль играет открытая A.A. Нейфахом (1961) периодичность морфогенетической функции ядер (МФФЯ). Речь идет о том, что (на фоне непрерывной транскрипции) информационная РНК обеспечивающая формообразовательные процессы синтезируется как бы «квантованно», в ограниченные промежутки времени. Именно эти периоды развития являются наиболее чувствительными к повреждающим факторам, как, например, ингибиторы транскрипции, ионизирующая радиация. В раннем развитии периоды МФФЯ обеспечивают наступление следующей фазы развития всего зародыша, при подготовке органогенеза в каждом зачатке также проявляется такая периодичность МФФЯ (Корочкин, 2002).

Таким образом, для эмбриогенеза характерна дифференциальная активность генов во времени и в пространстве. У зародышей низших позвоночных первый период МФФЯ отмечен на стадии бластулы, когда подготавливаются га-струляционные процессы (Нейфах, 1961, 1962). Чувствительность к повреждающему воздействию наиболее велика в период МФФЯ, а проявляется поражение позже - с началом гаструляции.

Транскрипция начинается неодновременно во всех зачатках зародыша амфибий (Bachvarova, Davidson, 1967, обзор: Davidson, 1986), т.е. можно говорить о дифференциальной транскрипции. Дифференциальная транскрипция обеспечивается взаимодействием продуктов многих регуляторных генов, контролирующих в итоге функциональное состояние соответствующих участков ДНК. Среди этих генов могут существовать основные регуляторы, которые запускают весь каскад подчиненных регуляторных и структурных генов (Геринг, Gehring, цит. по: Корочкин, 1999, 2002, Lawrence, 1992), обеспечивающих формообразовательный процесс. Ключевая роль при этом принадлежит гомеозисным генам.

В средней бластуле лягушки согласно опытам П. Ньюкупа (1969) мезодерма индуцируется благодаря воздействию энтодермы. Что же представляет собой вещество-индуктор?

Индуктор должен обладать следующими свойствами: изменять направление дифференцировки реагирующей ткани (в эксперименте), его секреция или активация должна быть локализована в индукционной системе.

Эти свойства характерны для нескольких семейств белковых факторов: TGF-ß (трансформирующий рост фактор), Wnt, FGF (фактор роста фибробла-стов), Hg (Heghehog), обнаруженных в эмбрионах Х.1. на этой стадии. Наиболее изучен путь передачи сигнала от белков суперсемейств TGF-ß, в состав которого входят: Vg-1, активин, BMP (Gilbert et al., 1996).

Все эти факторы неактивны до момента специфического протеолитического расщепления прообласти и активной части молекулы. Активированный фактор TGF-ß может секретироваться в межклеточное пространство и передавать сигнал тем клеткам, которые расположены в соответствующем месте и обладают рецепторами к TGF-ß. Активация рецептора приводит к фосфорилированию белков SMAD, передающих сигнал в ядро к транскрипционному фактору. Известно, что продукт генов TGF-ß влияет на гомеозисные гены. Белок Vg-1 является уникальным по своей способности организовать полную дорсальную ось. Известно, что Vg-1 - это продукт материнского гена, имеется в цитоплазме яйца, преимущественно в вегетативной части. Активацию его связывают с поворотом оплодотворения, когда происходит гравитационнозависимое перемещение пласта тяжелых гранул желтка по отношению к кортикальному слою и анимальной части яйца (Gerhardt е.а., 1986). Высказана гипотеза о том, что специфическая протеаза находится в анимальной части и при повороте оплодотворения оказывается только в области дорсального организатора, где и активирует Vg-1 (Gilbert е.а., 1996, Erickson е.а., 1995). Известно также, что TGF-ß ингибирует вступление клеток в S-фазу цикла.

Членом того же суперсемейства белков TGF-ß индукторов мезодермы является и другой материнский фактор - активин, который уже в яйцеклетке содержится в желточных пластинках. Экспрессия его гена не определяется до стадии морулы (Asashima, цит. по: Корочкин, 2002). Активин активирует экспрессию других мезодермальпых генов и также активирует движение клеток (Kelly, 1994, Slack, 1995, Smith, Howard, 1992).

Источником последующих индукционных влияний в образовании осевого зачатка на дорсальной стороне эмбриона является «Шпеманновский организатор» (дорсальная губа бластопора), свойства которого формируются на стадии бластулы. Все эти события определяют течение гаструляции и затем собственно формирование осевого зачатка.

Таким образом, первый этап пространственной регуляции будущего морфогенеза связан с ооплазматической сегрегацией. Результатом ооплазматической сегрегации является «разметка» осей и будущих отделов тела.

Важное формообразующее событие - индукция мезодермы, связано с последующим образованием центра начала гаструляции - организатором Шпемаи-на (область дорсальной губы). Классические эксперименты Ньюкупа по конъюгации эксплантантов анимального и вегетативного полюсов продемонстрировали, что вегетативные клетки эндодермы способны вызвать в анимальных шапочках образование мезодермальпых тканей (Niewkoop, 1969, 1973). Тип ткани, развивающийся в подобных «сэндвичах», зависит от дорсовентральной полярности эндодермальных фрагментов. Таким образом, Первичная индукция происходит до включения генома зародыша на стадии средней бластулы за счет материнских факторов, накопленных в оогенезе. После этого третий индукционный сигнал распространяется от организатора по маргинальной зоне и анимальному полушарию зародыша (Рис. 1).

Область организатора получила свое название после опытов Шпеманна по пересадке дорсальной губы бластопора на вентральную сторону зародыша, в результате чего развивалась эктопическая вторая ось (Spemann and Mangold, 1924).

В последние несколько лет усилия многих исследований были направлены на идентификацию молекул, вовлеченных в индукцию осей и дифференцировку мезодермы. В настоящее время известны некоторые компоненты дорсального и вентрального путей.

Wnt: путь передачи дорсального сигнала. Формирование дорсальной оси у Xenopus зависит от цитоплазматических компонентов. В результате взаимодействия одного из членов белкового семейства Wnt с соответствующим рецептором, активируется цитоплазматический белок Dishevelled, ингибирующий проте-инкиназу GSK-3p (Sokol, 1996). GSK-3J3 ингибирует дорсальный путь передачи сигнала, влияя на стабильность Р-катенина (Wylie, 1996). При активации Dishevelled ингибирующее действие GSK-3P подавлено, уровень цитоплазматического Р-катенина возрастает, и (3-катенин переходит в ядро в комплексе с транскрипционным фактором Tcf-З. Комплекс Р-катенин/Тс£3 действует как транскрипционный фактор, стимулируя wnt-активируемые гены, такие, как goosecoid (gsc) -транскрипционный фактор, участвующий в организации головных структур (Cho, 1991) и Samois - материнский ген, способный формировать эктопическую дорсальную ось (Lemaire, 1995).

В течение долгого времени для объяснения причин индукции различных тканей в ходе развития привлекались модели морфогенетических градиентов (Huxley, 1934), согласно которым клетки направлялись по тому или иному пути дифференцировки в зависимости от концентрации сигнальной молекулы (Dalcq and Pasteels, 1937). Однако в ходе исследований последних лет были обнаружены секреторные антагонисты таких индукторов, как BMP (bone morphogenic protein) (Thomsen, 1997) и Wnt. Поэтому теория морфогенов перестала быть единственным объяснением принципов развития.

Антагонистом Wnt являете Frzb - секретируемый белок, подобный внеклеточному амино-концевому домену рецептора Wnt-Frizzeled (Wang, 1997). В отсутствие Wnt GSK-Зр фосфорилирует цитоплазматический Р-катенин и вызывает его деградацию. Передачи сигнала внутрь клетки не происходит (Zorn, 1997). Но Frzb не единственный антагонист сигнального пути Wnt. гСс

Рис. 1. Трехсигнальная модель эмбриональной индукции (по Smith, 1989). На стадии ранней бластулы вегетативная часть зародыша посылает два сигнала: вентральный индуцирует вентральную мезодерму, а дорсальный - организатор Шпеманна. Во время гаструляции организатор посылает третий, дорсализирую-щий сигнал в маргинальную зону. Из области МЗ формируется мышечная ткань, и только из самой вентральной Ml - кровяные островки.

Обозначения-. А - анимальное полушарие; VV - вентральная вегетативная область; DV -дорсальная вегетативная область; VM - вентральная мезодерма; О - организатор Шпеманна (дорсальная мезодерма); - Ml, М2 и МЗ - в разной степени дореализированная мезодерма.

Cerberus - секреторный фактор, экспрессирующийся на стадии гаструлы в районе организатора, предполагается, что он участвует в индукции головных структур (Bouwmeester, 1996). Недавно было установлено, что Cerberus является ингибитором сигнального пути Wnt во время раннего развития эмбрионов Xenopus.

Исходя из того, что области экспрессии обоих антагонистов сигнального пути Wnt перекрываются в районе дорсальной губы, можно предположить, что организатор - источник множества ингибиторов Wnt, которые выполняют роль тонких регуляторов индукционных взаимодействий.

ВМР-4: вентральный путь передачи сигнала. Классические эксперименты Шпеманна и его коллег (обзор Smith, 1989) привели к созданию дорсовентраль-ной модели развития. В этих экспериментах дорсальный эксплантат пересаживали на вентральную сторону нормального зародыша, в результате у него развивалось два осевых комплекса, причем значительная часть тканей второй дорсальной оси образовывалась из вентральной ткани зародыша. На вентральной стороне при нормальном развитии из эктодермы образуются клетки кожи, а при пересадке донора с дорсальной стороны - нервная трубка, происходит нейральная индукция. Модель получила дополнительную поддержку после экспериментов по культивированию дорсальных и вентральных эксплантатов (Smith, 1989). При совместном культивировании дорсальных и вентральных эксплантантов в виде «сэндвичей», в последних возникали хорда и сомиты. Результаты этих экспериментов были интерпретированы так, что вентральные ткани способны лишь пассивно воспринимать специфические сигналы центра Ныокупа и организатора Шпеманна, и, в отличие от дорсальных, не являются источником индукционных влияний. Однако, исследования последних лет показали, что вентральная ткань является источников активного вентрализующего сигнала, антагониста дорсальным индукторам - ВМР-4 - члену суперсемейста TGF-P (transforming growth factor).

Суперсемейство TGF-P играет ключевую роль в выборе пути развития и дифференцировке клеток (обзор Hogan, 1996). Два материнских фактора, вовлеченных в формирование мезодермы, являются членами семейства TGF-P: акти-вин (Cornell and Kimelman, 1994) и ВМР-4 (обзор Harland, 1994). Первый является дорсализующим фактором, а второй - вентрализующим. Сигналы TGF-P опосредуются семейством рецепторных протеинкиназ. Эти рецепторы подразделяются на две группы: передающие сигнал (класс 1) и лиганд-связывающие (класс 2). Взаимодействие ВМР-4 с рецепторами ведет к фосфорилированию рецепторов класса 1 и последующему фосфорилированию цитоплазматических белков (Candía, 1997). Сигнальный путь ВМР-4 необходим для индукции вентральной мезодермы. Оказалось, что при отсутствии передачи сигнала ВМР-4, вентральная мезодерма дорсализуется и связано это с тем, что при элиминировании эндогенного сигнала ВМР-4, на вентральной стороне появляются дорсальные факторы (Wilson and Hammati-Brivanlou, 1995).

Таким образом, два совершенно разных воздействия могут вызвать дорса-лизацию мезодермы - воздействие дорсальных индукторов организатора Шпе-манна и отсутствие сигнального пути ВМР-4. De Roberis и Harland показали, что индукторы дорсальной мезодермы - chordin и noggin связывают ВМР-4 с высокой степенью аффинности (Sasi, 1995; Zimmerman, 1996). Таким образом, факторы, секретируемые организатором, не только действуют как активные индукторы, но и блокируют действие вентрализующих агентов.

Разносторонняя подготовка клеток к гаструляции осуществляется в период дробления. На материнских матрицах синтезируются важнейшие для процессов дробления белки: гистоны, тубулии, рибонуклеотидредуктазы и др. Активация яйца запускает также циклические процессы, отныне отсчитывающие индивидуальное время жизни зародыша. В начале развития все они связаны с циклами деления оплодотворенного яйца. В регуляции клеточных делений важную роль играют белки «циклины» (Evans е.а., 1983), синтез которых идет на материнских и-РНК и запускается белковым фактором созревания. Циклины разрушаются в ходе митоза и вновь транслируются в S-фазе; в регуляции каждого цикла участвует также фактор созревания (он также синтезируется на материнских и-РНК), его присутствие необходимо для деструкции ядерной оболочки и начала митоза; после завершения митоза фактор созревания блокируется фосфорилированием. В регуляции клеточных циклов участвует также Ca.

Механизмы регуляции клеточного цикла универсальны, и их нарушение ведет к началу опухолевого роста. В настоящее время показано, что все онкогены', а также протоонкогены" являются компонентами общих сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, морфогенетические процессы и диффе-ренцировку клеток. «Мотором» клеточного цикла служат активности сменяющих друг друга циклин-зависимых киназ. Циклин-зависимая киназа - каталитическая субъединица холоферментного комплекса, для которой циклин является актива-торной субъединицей. Активность всего комплекса регулируется также фосфорилированием - дефосфорилированием регуляторных белков, ответственных за начало фазы G| или за переход в митоз. Действие многих протоонкогенов направлено на регуляцию этого комплекса. Продукты известных онкогенов часто являются факторами роста, клеточными рецепторами или белками внутриклеточ онкогены - клеточные или вирусные (вносимые вирусом) гены, экспрессия которых может вести к развитию новообразования. протоонкогены - клеточные гены, усиление функции которых превращает их в онкогены ных сигнальных путей (Olsson, Pfeifer-OIsson, 1987). Также и многие протоонко-гены являются компонентами сигнальных путей, ответственных за активацию циклиновых комплексов в ответ на действие пептидных факторов роста. При этом запускаются также каскады фосфорилирования, ведущие к транслокации сигнальных молекул из цитоплазмы в ядро, где они также фосфорилируют и активируют множество субстратов, в т.ч. факторы транскрипции. В результате при опухолевом росте и при действии митогенов повышается экспрессия гена цикли-на. Если этот процесс идет с положительной обратной связью (самоускорением) - возникает опухоль. Сейчас идентифицирован целый ряд генов и их продуктов, участвующих наряду с циклинами в регуляции клеточных циклов.

На ранних стадиях у Xenopus отсутствуют фазы Gl и G2. Фактор, стимулирующий созревание (MPF), побуждает клетку к переходу из S-фазы в М-фазу, а цитостатический фактор (CSF) может удерживать клетку в состоянии митоза, стабилизируя MPF. При инактивации CSF ионами кальция инактивируется и MPF, тогда клетка переходит в S-фазу. Видимо, MPF действует путем изменения структуры ядерной оболочки: он гиперфосфорилирует три основные белка ядерной оболочки, при этом оболочка деполимеризуется и разрушается и происходит конденсация хроматина. Примерно после 12-ти клеточных циклов скорость деления клеток резко снижается, т.к., видимо, появляются недостающие фазы цикла, нарушается синхронность делений и начинается транскрипция генома зародыша (Newport, Kirschner, 1982, a, b, 1984).

Рецепторы факторов роста характеризуются тирозиназной активностью, резко возрастающей при связывании с фактором роста. При этом активируется фосфоинозитольный путь к делению клетки (Margolis е.а., 1989, Berrige, 1993). Появление способности клеток реагировать на действие факторов роста может иметь большое значение в развитии.

Таким образом, возникает регуляторная петля, поддерживающая активность транскрипционных факторов и контролируемых ими генов, обеспечивающих репликацию ДНК.

Можно перечислить этапы регуляции митогенного сигнала: ростовые факторы, рецепторные тирозинкиназы, адаптеры, белки семейства Ras, эффекторы Ras, киназы, транскрипционные факторы, циклин. Упоминавшиеся уже продукты TGF-ß являются ключевыми факторами передачи ингибиторных сигналов, связывая циклин-зависимые киназы, ответственные за начало S-фазы.

Кроме этих специфических факторов регуляции клеточного цикла, в работе часов дробления участвуют и другие процессы, связанные с энергообменом. Это глютатиоповый окислительно-восстановительный цикл, который определяет периодичность синтеза белка через периодичность образования полисом, а также периодическое перемещение в ядро и активацию ДНК-полимеразы (Mano, 1968, 1975). SH-белки участвуют также в возбуждении волн сокращения поверхности яйца при дроблении (Нага, 1977).

Важную роль в циклах дробления играет такой внутриклеточный универсальный посредник как кальций, основные пути мобилизации которого связаны с фосфоинозитидной системой (De Lisie, Welsh, 1992). Периодическое связывание Са осуществляется при сборке микротрубочек веретена деления. При разборке веретена Са освобождается и направляется к кортексу, где активирует динеин-подобную АТФ-азу, что необходимо для сокращения микрофиламентов при прохождении борозд дробления.

Окислительно-восстановительный цикл клетки связан также с процессами перекисного окисления липидов в мембранах. Эти процессы идут с образованием свободных радикалов. Свободнорадикальные реакции также вносят вклад в неспецифическую регуляцию клеточного цикла: чем активнее они идут, тем более замедляются циклы; образование свободных радикалов ведет к удлинению фазы Gj в клеточном цикле (Бурлакова, 1967; Алесенко и др., 1975,1984).

На стадии средней бластулы клетки приобретают дифференциальную подвижность (Davidson, 1986). Первыми ее приобретают будущие клетки мезодермы. Таким образом, стадия средней бластулы в развитии амфибий имеет важнейшее формообразовательное значение.

Гаструляцию Xenopus в первом приближении считать обусловленной тремя процессами - инвагинацией, инволюцией и эпиболией.

При индукции мезодермы у Xenopus непосредственный контакт между клетками необязателен, они могут располагаться на некотором расстоянии друг от друга. Отсюда следует, что индуцирующим агентом является диффундирующее вещество. Оказалось, что вместо бластомеров вегетативного полушария можно использовать фактор роста фибробластов (FGF), который индуцирует клетки из области анимального полюса к развитию по мезодермальному пути. Образование мезодермы можно также индуцировать трансформирующим фактором /?2 (TGF-p2). Действие FGF, как правило, вызывает развитие вентральных производных мезодермы (например, клеток крови), a TGF-p2 в основном индуцирует дорсальные производные (например, мышцы). Нормальные эмбрионы Xenopus содержат мРНК, кодирующую FGF, а мРНК белка Vgl, относящегося к семейству TGF-p2, не только присутствует в яйцеклетке, но, как было показано, локализована в области вегетативного полушария яйцеклетки и ранних эмбрионов.

Во время гаструляции у позвоночных происходят значительные изменения в клеточной морфологии, клеточной адгезии и клеточных движениях. Они приводят к образованию трех зародышевых листков - внешнего (эктодермы), внутреннего (эндодермы) и мезодермы между ними. У амфибий, в начале гаструля-ции дорсальная мезодерма инволюирует через дорсальную губу и движется к анималыюму полюсу по внутренней стороне крыши бластоцеля. Эндодерма втягивается внутрь, а эктодерма к концу гаструляции покрывает весь зародыш снаружи. Процесс гаструляции направляют регионально-специфичные клеточные движения: 1) эпиболия клеток анимального полюса; 2) конвергентные растяжения и латеро-медиальная интеркаляция клеток маргинальной зоны и 3) миграция клеток мезодермы по крыше бластоцеля (Keller and Tibbets, 1989; Winklbauer, 1990; Wilson and Keller, 1991).

Факторами активации адгезии к внеклеточному матриксу являются белки интегрины (рецепторы фибронектипа (Winklbauer, 1990, 1996), их антагонистами являются SPARC и тепасцин (Engel, 1987; Sage, 1989).

За межклеточную адгезию ответственна группа белков кадгеринов (Takeichi, 1995). В яйце обнаружены материнские кадгерины (Choi, 1990; Ginsberg, 1991; Herzberg, 1992), экспрессируемые в области всех будущих зародышевых листков. Зиготические кадгерины начинают экспрессироваться после активации зародышевого генома, они влияют на клеточную подвижность, адгезивные свойства клеток и участвуют в процессе нейральной и эпидермальной дифферен-цировки (Choi a. Gambiner, 1989; Detrick, 1990).

Продукты некоторых генов Шпеманновского организатора определяют способность клеток к миграции и поляризации: так, продукты генов семейства Wnt ингибируют элонгацию, а активин - (индуктор мезодермы) является индуктором элонгации и движения клеток (Moon, 1993; Slack, 1994). Активин в неактивном состоянии имеется уже в яйце и содержится в желточных пластинках (Asashima, 1998).

1.6. Факторы запуска дифференцировки

Современный этап создания теорий дифференцировки связан с изучением молекулярно-генетического контроля индивидуального развития (обзоры: Михайлов, 1993; Корочкин, 1997, 2002).

Основная проблема, решаемая при этом, состоит в установлении механизмов возникновения разнообразия клеточных типов, в каждом из которых обнаруживаются специфические белки и, следовательно, работают специфические группы генов, на основе единого наследственного аппарата оплодотворенной яйцеклетки. Центральным вопросом современной эмбриологии является расшифровка сложного пути от активации экспрессии генов до формирования признака организма в онтогенезе. Типы дифференцированных клеток отличаются друг от друга не только по специфическим белкам («белкам роскоши»), обеспечивающим специализацию клеток, но также и по особенностям обязательного метаболизма (и, соответственно, по «белкам домашнего хозяйства»), по способности к делению, движению, восприятию сигналов из макро- и микросреды (т.е. по рецептор-ным белкам) (Трумэн, 1976; Туманишвили, 1977; Гилберт, 1993 - 95; Белоусов, 1993; Корочкин, 2002 и др.). Процесс дифференцировки эмбриональных клеток -длительный, многоступенчатый, и начинается с неспецифического «созревания». Уже в течение первых делений дробления цитоплазма вентральных и дорсальных бластомеров различается по специфическому маркеру эпидермиса (Epi-1), обнаруженному только на вентральной стороне (Phillips е.а., 1989). В то же время, клетки дорсальной эктодермы еще до контакта с хордомезодермой синтезируют специфический нейральный маркер - гликопротеид адгезии N-CAM (Dixon, Kint-ner, 1989).

Наряду со специфическими факторами, известны также заведомо неспецифические искусственные факторы индукции. Например, сильное вегетализирую-щее влияние оказывает белок-лектин конканавалин А, действующий на клеточную поверхность и связывающий мембранные гликопротеины. Значительный сдвиг развития эмбриональных тканей в сторону переднедорсальной мезодермы вызывают ионы лития, действие которых связано с подавлением некоторых звеньев фосфоинозитолыюго пути внутриклеточной регуляции. Имеются данные о нейрализующем действии форболового эфира, также влияющего на эту систему регуляции (нарушающего ресинтез фосфоинозитидов) (Берридж, 1985). Получены данные о возрастании в клетках эктодермы концентрации универсального фермента системы внутриклеточной регуляции - протеинкиназы С; цАМФ также способствует нейральной индукции. Надо отметить, что любые воздействующие извне па клетку факторы влияют в конечном счете на регуляторные контуры, связанные с универсальными посредниками - фосфатидил-инозитольной системой, Са, цАМФ. Поэтому специфика реакций во многом определяется свойствами реагирующих клеток.

Программа (направление) дифференцировки эмбриональных клеток определяется при детерминации. Л.И. Корочкин (2002) выделяет в пути дифференцировки клеточных популяций в эмбриогенезе следующие этапы:

• Компетенция (способность к детерминации) - определенное физиологическое состояние клеток зачатка, позволяющее воспринимать сигналы индуктора. Созревание компетенции происходит автономно и компетенция зависит от времени.

• Детерминация и преддифференцировка - установление транскрипционного паттерна, включение определенных генетических локусов и, соответственно, ограничение проспективных потенций зачатка, т.е. выбор пути будущей дифференцировки. В этом периоде специфические транскрипты появляются, но транскрипция не происходит, т.к. матрицы заблокированы (Сергеев, Ениколопов, Кузин, Корочкин, 1990).

• Протодифференцировка: активно строится неспецифическая система синтеза белка, ограничивается митотическая активность, обнаруживаются следы специфического синтеза.

• Дифференцировка: утрата митотической активности, резкий рост концентрации специфических продуктов.

• Терминальная дифференцировка: максимальная активность синтеза специфических продуктов, образование специфических структур, формирование гистотипического фенотипа.

Таким образом, в эмбриогенезе выявляются два типа детерминационных процессов, соответствующих различным этапам пути клеточной дифференцировки.

Первый характеризует клеточную популяцию зародышевого листка и определяет поведение клеток в гаструляции, их «физиологическое созревание»: мембранные и рецепторные системы, продолжительность клеточных циклов, способность к перемещению. Выявленные гены этого этапа кодируют протеазы, необходимые для деблокирования материнских матриц, и киназы - для внутриклеточной передачи сигналов. При этом регуляция экспрессии материнских генов происходит на уровне трансляции.

Второй этап детерминации связан с регуляцией транскрипции и трансляции тканеспецифичных генов, причем заметное появление специфичного продукта предваряется подготовкой субклеточных структур к синтезу белка. При этом критерием детерминации является появление специфических транскриптов, а развитие процесса трансляции, возможно, требует дополнительного сигнала (Корочкин и др., 1990; Eguchi, Watanabe, 1986).

По нашим данным, в обоих случаях маркером детерминации является развитие свободнорадикальных реакций, свидетельствующее об ускорении «энергетического протока» в эмбриональных клетках и обновлений мембранных структур.

A.A. Караванов (1990) отмечает, что маркерами детерминации являются: метилирование определенных групп генов; появление в ДНК участков гиперчувствительности к эндонуклеазе (Weintraub, Groudine, 1976); специфические факторы включения и выключения генов.

Критерием детерминации является специфическая транскрипция (Gurdon, 1987). Однако транскрипты не проходят процессинг (Eguchi, Watanabe, 1986) без дополнительного сигнала. Работами Слотера и Триплета (1975) показана связь такого сигнала с распадом желточных гранул.

Нашими работами (Мелехова, 1976, 1977) показано на глазном зачатке амфибий, что маркером детерминации также является самоускоряющееся развитие свободнорадикальных процессов.

Детерминация - центральное событие в раннем развитии; этим термином определяют последовательное сужение широких проспективных потенций эмбриональной клетки вплоть до единственной программы терминальной диффе-ренцировки. Состояние детерминации экспериментально определяется методами трансплантации или эксплантации исследуемого зачатка. Изучение детерминации как феномена, определяющего ход развития, составляло основной предмет экспериментальной эмбриологии (Ру, 1988; Шпемани и Мангольд, 1924; Филатов, 1929; Светлов, 1978; Корочкин и мн.др. Обзоры: Светлов, 1978; Корочкин, 2002).

Физиологические методы изучения детерминации вошли в употребление в XX в.; они связаны с повышенной реактивностью детерминирующихся зачатков. Применяются внешние факторы, модифицирующие развитие. Это направление работ начато с исследований П. Чайлда, продолжено и разработано П.Г. Светловым и А.П. Дыбаном (обзор: Светлов, 1978). По существу, это направление в своих истоках связано с тератологией (Сент-Илер, 1830 и мн. др.) и современной концепцией критических периодов развития (Стоккард, 1920, Светлов, 1978).

Первые и решающие для жизнеспособности эмбриона детерминационные события связаны с установлением плана строения и происходят во время дробления и гаструляции: это детерминация мезодермы и затем - детерминация ней-рального зачатка, происходящие путем индукционных взаимодействий.

Как уже было сказано, накопление описательной молекулярной информации и опытов с генетическим манипулированием развитием привело к изменению системы представлений о нейральной индукции и о механизмах выбора эмбриональными клетками нейрального пути развития (т.е. детерминации). Но и теперь проблемы индукции и детерминации полностью не решены.

Большая часть информации о нейральной индукции получена на амфибиях и в частности на зародышах шпорцевой лягушки.

Опыты Г. Шпеманна и X. Мангольд (1924) показали, что имплантированная на вентральную сторону зародыша-реципиента дорсальная губа бластопора способна рекрутировать эктодермальные клетки реципиента к началу несвойственной им в норме нейральной дифференцировки. В результате трансплантации дорсальной губы бластопора в пределах эктодермального поля формируются зачаток центральной нервной системы, а также сомиты и вторичная кишка. При этом дорсальная губа бластопора задает также и передне-заднюю полярность зародыша-двойника (отсюда название - «Шпеманновский организатор»).

Вентральная эктодерма еще до наступления гаструляции коммитирована к развитию в эпидермис. Под влиянием «организатора» она утрачивает способность к синтезу эпидермальных маркеров (например, эпимуцина, цитокератинов) и в ней начинают обнаруживаться транскрипты нейроспецифических генов (т.н. архэнцефалическая индукция). Часто это явление называют «директивной» индукцией, так как изолированная эктодерма гаструлы амфибий в эксплантате способна к самодифференцировке в эпидермис. Индуктор же отменяет эту программу и включает «нейральный» путь развития.

По-видимому, «Шпеманновский организатор» секретирует целый набор различных сигнальных молекул, что приводит к двум сопряженным процессам: ингибированию эпидермальной дифференцировки и активации нейрального пути развития в дорсальной эктодерме. В то же время «организатор» обладает и мезо-дермализирующим действием.

Феномен «гетерогенной индукции», открытый в ЗОе годы XX в. поставил под сомнение возможность узкой специфичности действия эмбриональных индукторов. Многие экспериментальные данные (в т.ч. полученные группой Г. Шпеманна) позволили предполагать, что индуцирующий неспецифический сигнал лишь активирует программу, заложенную в самих реагирующих клетках (опыты Шпеманна и Шоттэ по индукции ротового аппарата, нейрализующее действие сублетального цитолиза, открытое Гольтфреттером).

Неудачи первых попыток идентификации индуцирующих веществ привели к необходимости исследования молекулярно-биохимических свойств самих реагирующих клеток до и после воздействия индукторов (Михайлов, 1984, 1988,1990; Saxen, 1979, 1989),

Новый подход к исследованию эмбриональной индукции был основан на поиске функциональных аналогов эмбриональных индукторов среди известных биологически-активных факторов. Было показано, что фактор роста фибробла-стов млекопитающих - охарактеризованный ранее индивидуальный полипептид, оказывает сильное индуцирующее действие на эктодерму гаструлы, вызывая в ней формирование мезодермальных производных (Slack е.а., 1987; Slack, 1991). Вскоре было показано, что супернатанты из-под различных клеточных линий также характеризуются мезодермализующей активностью. Это позволило идентифицировать соответствующие белки.

По аналогии были получены из супернатантов от клеточных линий и идентифицированы белки, обладающие нейрализующим действием. Это позволило идентифицировать и клонировать соответствующие гены, с помощью метода гибридизации in situ изучить их экспрессию в «Шпеманновском организаторе», индуцировать или блокировать их активность в развитии и т.д.

Таким образом, биология развития вступила в новую фазу, связанную с успехами генетического анализа (Тидеман и др., 1993; Grunz, 1997; Harland, 1997 и ДР-)

Опыты с трансфильтровой индукцией показали, что нейрализующие факторы «Шпемапновского организатора» - секретируемые и способные к диффузии сигнальные молекулы (Saxen, 1961, 1979, 1989). Методом гибридизации in situ показана первоначальная их экспрессия в области организатора Шпеманна. Одним из первых естественных агентов, секретируемых в «Шпеманновском организаторе», оказался полипептид ноггин. В яйце имеется его материнская иРНК. Зи-готическая экспрессия начинается в дорсальной губе бластопора («организатора»). Инъекции м-РНК ноггина в оплодотворенные яйца шпорцевой лягушки или в бластоцель приводили к преобладанию головных структур в первом случае и к эффектам нейрализации эктодермы во втором (Zimmermann, 1996, Kelly, 1995, Hawley, 1996).

Другими нейрализующими факторами, секретируемыми в «организаторе», оказались фоллистатин - ингибитор эпидермальной дифференцировки (Hawley, 1995, Kelly, 1995), первые транскрипты которого были обнаружены в начале га-струляции, и активип (Kelly, 1995). Активин в неактивной форме обнаружен в яйце в желточных пластинках (Asashima, 1998), экспрессия его начинается со стадии средней бластулы в зоне организатора; он поляризует клетки при инъекции, активирует их движение (Smith, Howard, 1992).

Так же в «Шпеманновском организаторе» экспрессируется секретируемый полипептид хордин, дорсо-специфичный фактор, впервые обнаруживаемый на стадии поздней бластулы в той же области - «презумптивного организатора», где и продолжается его экспрессия в течение гаструляции (Hawley, 1996, Sasai, 1995). Инъекции м-РНК хордина в вентральную область бластулы амфибий приводит к образованию вторичного осевого комплекса. В эксплантатах эктодермы гаструлы хордин вызывает пейрализующий эффект. Специфичным ингибитором хордина является секретируемая металлопротеаза Xolloid. Инъекция мРНК хордина ведет к экспрессии нейральных маркеров N-CAM и NF-M в отсутствии мезодермы (Sasai, 1995).

Нейрализующее действие хордина связано с его способностью инактивиро-вать ВМРз-фактор, способствующий эпидермальной дифференцировке (Willson, Hemmati-Brivanlon, 1995,1997).

К дорсо-специфичным белкам относится также церберус (Salic, 1997), введение мРНК которого в ранние зародыши способствует образованию дополнительных голов. Экспрессия этого гена также связана с «Шпеманновским организатором». В том же районе зародыша идентифицированы еще несколько ростовых факторов млекопитающих, которые в опытах с эксплантатами нейрализуют эктодерму гаструлы амфибий. Одни из них принадлежат к семейству трансформирующих факторов роста (TGFS), другие - к семейству факторов роста фиброб-ластов (FGF). Отметим, что факторы TGF - ß являются ингибиторами пролиферации (Lawrence, 1984, Roberts е.а., 1985, Heine е.а., 1987); факторы FGF также обусловливают утрату рецепторов к митогенным сигналам (Olwin, Hauschka, 1988).

В том же районе зародыша отмечена экспрессия гомеобокс-содержащих генов Xlim-1 и Siamois, которые способствуют индукции головных структур.

В общей сложности в зоне Шпеманновского организатора удалось идентифицировать семь секреторных протеинов и около десяти генов, которые можно разделить на следующие группы: гены, кодирующие секреторные протеины, го-меобоксные гены и гены, включающие Т-домен (Stennard, 1997). Все они участвуют в ранних этапах дифференцировки зародыша.

Таким образом, по современным представлениям, нейральная индукция является многоступенчатым процессом, в котором участвует ряд различных по своей природе и эффектам сигнальных агентов, синтезируемых именно «Шпеманновским организатором». При этом детерминация нейрального пути развития в эктодерме представляет собой результат антагонистических взаимодействий между активаторами и ингибиторами, препятствующими нейрализации. Это, в частности, было показано в опытах, где концентрированные среды из-под эктодер-мальных клеточных суспензий предотвращали нейрализацию целых фрагментов эктодермы в «сэндвичах» с дорсальной губой бластопора. Интересно, что дезагрегация клеток и вентральной, и дорсальной эктодермы без дополнительных воздействий способствует нейральной дифференцировке (превращению в нейроны) (Grunz, 1997).

В настоящее время наиболее признанным из представлений о механизмах нейральной индукции является модель «нейрального уклонения». Это означает, что эктодерма ранней гаструлы амфибий изначально детерминирована к эпидер-мальному пути развития. Если нарушить процесс эпидермальной дифференцировки диссоциацией эктодермы, инактивацией рецепторов ВМР4 и т.п., то эктодерма уклоняется от эпидермального пути и способна осуществить нейральный путь дифференцировки.

Многие исследователи считают, что основная функция различных нейраль-ных индукторов «Шпеманновского организатора» состоит в ингибировании эпидермальной дифференцировки.

Однако, А.Т. Михайлов отмечает, что при этом упускается из виду, что эксплантаты эктодермы гаструлы амфибий способны к самонейрализации - при сохранении клеточных контактов (у аксолотлей), при изменении свойств клеточных мембран под действием некоторых лектинов, например, конканавалина А, при активации внутриклеточных протеинкиназ и аденилатциклаз. Эти факты обращают наше внимание на участие неспецифичных факторов в механизмах индукции и активации эндогенных нейрализующих факторов в эктодерме.

Обнаруженное в последние годы многообразие нейральных индукторов может быть связано не только с различными функциями ингибирования эпидер-малы-юй и активацией нейральной дифференцировки, но также и с формированием компетенции эктодермальных клеток и пространственно-временными векторами.

Эмбриональные клетки кардинально отличаются от дифференцированных соматических клеток многими чертами своей структуры и метаболизма.

В раннем развитии клетки амфибий содержат многочисленные желточные гранулы, цитоплазма содержит многие регуляторные молекулы в зарепрессиро-ванном состоянии, ядро транскрипционно неактивно, объем цитоплазмы велик (ядерно-плазменное отношение нарушено), двухфазные клеточные циклы проходят очень быстро, эндомембранный комплекс менее развит, синтез белка не активен.

Поэтому первый этап подготовки к началу дифференциации - это неспецифическая активация и «созревание» клеток: синтез или демаскировка мембранных рецепторов, активация внутриклеточных сигнальных путей, включение транскрипционной функции ядра и активация аппарата синтеза белка.

Второй этап детерминации связан уже с активацией тканеспецифических генов, причем это происходит поэтапно через последовательные бифуркации (дивергенцию клеточных популяций) и постепенное сужение потенций к развитию. Гомеостатические и координирующие механизмы при этом различны: первый этап - «предетерминации» - управляется на эпигенетическом уровне: продукты материнских генов, ремоделирование хроматина ядер, активация транскрипционных факторов, инициация трансляции.

Концепция параметрического управления дифференцировкой (Чернавский, Соляник, Белоусов, 1980) акцентирует внимание на возможной роли неспецифического метаболизма в начальной дивергенции эмбриональной клеточной популяции. Математическая модель показывает, что при выходе популяции из неустойчивого состояния в некоторых условиях спонтанно возникает «бифуркация» работы генома на два устойчивых состояния - т.е. дифференцировка. В этой модели в качестве исходных использованы наши данные о повышении интенсивности свободнорадикальиых реакций в периоды соответствующие компетенции и детерминации эмбриональных зачатков у амфибий (Мелехова, 1976, 1977) и данные Т.В. Остроумовой (Остроумова, Белоусов, Михайлова, 1977).

Достижения молекулярной генетики развития ставят перед нами актуальную задачу выяснить механизмы связи свободнорадикальиых реакций как параметра окислительно-восстановительного гомеостаза клетки с процессами регуляции экспрессии генов, непосредственно участвующих в специализации клеток. Эти явления развертываются на микроуровне, во временных масштабах отдельных стадий развития. Система окислительно-восстановительного гомеостаза клетки по современными представлениям включает мембранные системы, от фазового состояния которых зависит активность мембраносвязанных ферментов. Такие явления как фазовое состояние фосфолипидов мембран, генерация АТФ, индукция нестабильности генома и реактивность клетки связаны с системой окислительно-восстановительного гомеостаза, частью которой является свобод-норадикальное окисление.

1.7. Некоторые принципы регуляции метаболизма. Свободнора-дикальные процессы как параметр окислительно-восстановительного гомеостаза клетки

Метаболические процессы в живых клетках упорядочены во времени и во внутриклеточном пространстве. Клетка является открытой неравновесной системой, постоянно создающей и поддерживающей характерные структуры, что необходимо для роста и выживания. С термодинамической точки зрения для этого необходим постоянный проток энергии через систему. В клетках животных энергия получается при окислении органических веществ в ряде ферментативных реакций, сопряженных с синтезом АТФ. Окисление - общий процесс удаления электронов. Перенос электронов от углерода и водорода к кислороду энергетически выгоден. Обычно такой перенос электронов происходит ферментативным путем, постепенно. Макромолекулы находятся в метастабилыюм состоянии и нуждаются в энергии активации для перехода в более стабильную форму. Это осуществляется ферментами. Для ферментативных процессов важным моментом является узнавание субстрата и образование фермент-субстратного комплекса, которое происходит благодаря конформационному взаимодействию. Это значительно увеличивает скорость реакции. Большая часть энергии, выделенной в реакциях окисления, расходуется на образование АТФ в процессе митохондриального окислительного фосфорилирования. Сопряжение эндергонических реакций синтеза с экзэргоническими реакциями окисления осуществляется через порционный гидролиз АТФ, что и обеспечивает упорядоченность реакций в клетке (поддержание специфического состава внутриклеточной среды, перенос информации и организацию структур, самоорганизация цитоплазмы, способность клетки к перемещениям). Однако существует и иной путь - неферментативного окисления (см. ниже).

Можно отметить две стороны регуляции клеточного метаболизма: специфическую (через конформационные взаимодействия и узнавание) и тоническую (через порционную подачу энергии).

По современным представлениям, в регуляции метаболизма в эукариотиче-ских клетках ключевое участие принимают мембраны. Мембраны ответственны за компартментализацию (направленность во времени и пространстве) метаболических реакций, их интеграцию, активный транспорт ионов и ряда веществ, а также за явления возбудимости и передачу информационных сигналов. Благодаря компонентам плазматических мембран осуществляется прием информации: внешний сигнальный фактор действует на рецепторы мембраны, активируя их, и начинается каскад передачи сигнала с участием фосфорилирования: от белков-преобразователей в мембране к ферментам-усилителям, активирующим вторичные внутриклеточные мессенджеры (малые молекулы и ионы: цАМФ, цГМФ, инозитол-1,4,5-трифосфат (1Рз), диацилглицерол, ионы Са2+). В частности, контакт спермия с мембраной яйцеклетки вызывает триггерную реакцию с участием

2+ фосфоинозитидной системы и Са , которая приводит к быстрой физиологической перестройке (активации) яйцеклетки (Berrige, Irvine, 1984; Гилберт, 1993). Помимо роли белков-рецепторов, ионных каналов и насосов, важной частью регуляции метаболизма является состав и фазовое состояние фосфолипидов мембран (Бурлакова, Эммануэль, 1965; Козлов, 1973; Бурлакова и др., 2001). В биомембранах локализованы важнейшие ферментные системы клетки, и от состояния фосфолипидных мицелл зависит скорость многих ферментативных процессов. Содержание фосфолипидов в мембранах органелл и клеток разных тканей специфично. В мембранных структурах происходит превращение и аккумуляция энергии. Фосфолипиды мембран играют большую роль в процессах гидролиза АТФ и, возможно, синтеза АТФ (Козлов, 1975; Каюшин,1961, 1967; Кометиани, 1962, 1963; Бржевская и др., 1967, 1968; Дмитриев, 1997). Митохондриальные мембраны содержат большое количество ненасыщенных фосфолипидов, что делает их особенно чувствительными к прямому воздействию кислорода. Предполагается, что циклы свободнорадикального перекисного окисления-восстановления липидов митохондриальных мембран влияют на скорость процессов окислительного фосфорилирования (Дмитриев, 1986, 1997). В микросомах обнаружены ферментативная (НАДФ*Н-зависимая) и неферментативпая (аскор

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА бат-зависимая) системы ПОЛ, характеризующие состояние электрон-транспортной цепи этих органелл и их функциональное состояние (Рис. 2).

Система окислительно-восстановительных процессов составляет основу жизнедеятельности клетки и организма. Кислород играет ключевую роль в энергетике аэробных клеток. Основное количество кислорода расходуется в ферментативных реакциях окислительного фосфорилирования (клеточного дыхания) в митохондриях и в процессах микросомального окисления.

Небольшая часть поглощаемого кислорода восстанавливается нефермента-тивпым путем, через образование активных форм кислорода (АФК), являющихся свободными радикалами (СР) или быстро порождающими СР. Молекула кислорода в исходном состоянии является триплетпой, т.е. имеет на валентных орбита-лях два электрона с параллельными спинами. Прямая реакция такой молекулы с сипглетной (какими являются основные доноры электронов в клетке) невозможна. Для активации кислорода необходим переход его в возбужденное синглетное состояние.

Это происходит при участии металлов с переменной валентностью или при взаимодействии со свободными радикалами. При этом кислород превращается в свободный радикал. При возбуждении кислорода и его превращениях образуются активные формы кислорода (АФК). При взаимодействии органических молекул с АФК возникают органические свободные радикалы (СР) (Герасимов и др., 1998). СР характеризуются наличием неспаренного электрона на молекулярной или внешней атомной орбите, что придает им парамагнитные свойства и исключительно высокую реакционную способность. Рекомбинация СР энергетически выгодна, и участие СР в промежуточных этапах биохимических реакций снижает энергию активации (Козлов, 1973; Нонхибел, 1982). В нормальном метаболизме интактных клеток часть молекулярного кислорода генерирует эндогенные АФК. Важнейшими из них являются супероксидный анион-радикал (Ог5), синглетный кислород (О21), пероксид водорода (Н2О2), гидроксидный радикал (ОН*), а также оксид азота (N0) (рис.-схема). АФК закономерно возникают в процессах мито-хондриального (оксидазного) и микросомального (оксигеназного) окисления, при функционировании НАДФ*Н-оксидаз. Основными местами их образования в клетке являются митохондрии, эндоплазматический ретикулюм и ядерная мембрана (обзор: Бурлакова и др., 2001).

СР могут атаковать молекулу ДНК и вызывать в ней образование радикалов, что может приводить к копформационным изменениям.

Воздействие АФК на липиды мембран вызывает в них активацию перекис-ного окисления с образованием высокореакционных перекисных радикалов. Субстратами свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) являют

УЛг

ШнкАЫ егидрогеназ;

АТФ Ж синтазг цитохрои с убнхинон супероксиддисмутаза ксантиноксндаза гипоксантин ксантин

Оз 02 флавин- ОНЧ-ОН-4^/^: \ оксид*«/ X/ Си 1-е, ии / Ог + ОН +ОН"

НАД(Ф)Н оксидаза

ЙзОгГ^^-- н

4--глутатнокпероксидаза супероксиддисмутаза

Н+

ОН + N03

I Н+ огюо

НАДН НАД+ Н2°"~-^ глутатионпероксидаза

АДФ АТФ

Рис. 2. Метаболическая генерация активных форм кислорода в клетке. В заштрихованных овалах - сенсорные молекулы, в светлых кругах - молекулы проокси-дантов (по Е.Б. Бурлаковой и др., 2001 г.).

Рис. 3. Схема цепных СР процессов перекисного окисления липидов (липоперок-сидации) в клетке. Обозначения: ЬН - восстановленные молекулы липида, Ь - радикал липида, ЬО - алкоксил-радикал, ДН - донор водорода (по Ю.Б. Кудряшову, 2004) ся прежде всего полиненасыщенные ацилы фосфолипидов — важнейших структурных компонентов биологических мембран (Козлов и сотр., 1965 - 1975). Определенная упаковка белков и фосфолипидов в мембране, наличие в ней биостабилизаторов и антиоксидантов препятствует чрезмерному развитию ПОЛ. Действие любых хаотропных агентов различных факторов, вызывающих разрыхление мембран и конформационные изменения в их компонентах, вызывает самоускоряющееся развитие ПОЛ (Рис. 3).

Результатом этих процессов являются изменения проницаемости мембраны и активности мембраносвязанных ферментов. Предполагается, что эти процессы лежат в основе биологического эффекта слабых доз излучений и других химических и физических факторов на клетки и организмы (Козлов, 1973; Бурлакова и др., 1975, 2001). Таким образом, мембранный механизм усиления слабых повреждающих воздействий может лежать в основе реакции биологических объектов на различные стрессорные факторы (Бурлакова, 1994). Быстрое развитие СР-реакций сдерживается стабилизирующим участием антиоксидантов. Антиокси-данты при этом переходят также в СР-состояние. Но такие СР быстро рекомби-нируют и образовывают цепь СР-реакций.

Многие годы развитие ПОЛ в мембранах изучали в основном в связи с патологическими процессами после облучения, при канцерогенезе и т.д. Было показано, что изменение уровня СР-процессов характеризует ранние этапы различных патологических процессов. Однако важнейшим обстоятельством является необходимость определенного уровня свободнорадикальных процессов, и в том числе перекисного окисления липидов, для осуществления метаболических процессов в интактной клетке. В последние годы развиваются представления о системе окислительно-восстановительного гомеостаза клетки и об информационной роли СР в этой системе. Речь идет о единой прооксидантно-антиоксидантной системе, включающей механизмы управления клеточным метаболизмом через физико-химические изменения мембран. Прооксидантная часть этой регуляционной системы включает все процессы, протекающие с участием молекулярного кислорода. Антиоксидантная часть представлена антиокислительными ферментами - ка-талазой, супероксиддисмутазой, глутатионредуктазой, глутатионпероксидазой -и соединениями, содержащими БН-группы (глутатион, цистеин), а также такими антиоксидантами как токоферол, убихинон, витамины С, Е, К (Бурлакова, Храпо-ва, 1985; Бешепга, 1999; Бурлакова и др., 2001), присутствующие в мембране и стабилизирующие ее.

Важным компонентом системы окислительно-восстановительного гомеостаза клетки являются мембраны, физико-химическое состояние которых (пластичность, жидкостность) зависит от уровня свободнорадикального окисления липидов и накопления перекисей. Активация ПОЛ ведет к изменению липидов и накопления перекисей. Активация ПОЛ ведет к изменению проницаемости мембран и функциональной активности ассоциированных с ними ферментов. Адаптационной реакцией мембран является изменение состава липидов: ускорение выхода легко окисляемых, наиболее ненасыщенных и замену их более резистентными к окислению (Бурлакова, Храпова, 1985). Это снижает скорость ПОЛ и возвращает ее к стационарному уровню. Таким образом, изменения концентрации АФК связаны с функциональным состоянием клеток. В этой системе регуляции сенсорную роль играют молекулы, воспринимающие биологически значимые сигналы об оксигенированности среды. Это супероксидный радикал (О2"), Н2О2 и оксид азота (Волин и др., 1998; Semenza, 1999). Условия гипоксии увеличивают активность ферментных систем, генерирующих АФК в разных ком-партментах. Изменение уровня сигнальных АФК приводит к запуску митоген-активируемых протеинкиназ, активирующих факторы транскрипции и экспрессию генов, влияющих на перестройку метаболических процессов.

Некоторые авторы доказывают влияние окислительного стресса па активность генов. Предполагается, что АФК служат субклеточными посредниками в регуляции экспрессии генов, а также в трансдукции сигналов (Allen, Tresini, 2000, Somansundaram, 2000). При облучении и стрессовых воздействиях увеличение продукции АФК является сигналом к быстрым и долгосрочным адаптационным реакциям. Вначале активируются ранние регуляторные гены - протоонкогены и у, стресс-белки, а затем - поздние структурые гены, в т.ч. Ca -АТФ-азы, антиокси-дантных ферментов (Малышев, Манухина, 1998; Iyer, Lehnart, 2000).

При различных повреждающих воздействиях АФК запускают активацию предсуществующих транскрипционных факторов посредством их фосфорилиро-вания при помощи активируемых митогенами протеинкиназ (МАРК). Эти транскрипционные факторы взаимодействуют с хроматином, вызывая активацию экспрессии генов белков стресса. Таким образом, CP участвуют в передаче информационных сигналов в клетке, изменяя режим ее работы (переключение на деление или специфическую функцию).

Свободные радикалы участвуют в интеграции клеточного метаболизма также и благодаря энергетическим особенностям реакций с их участием. АФК генерируются во всех частях клетки, они быстро взаимодействуют друг с другом, взаимопревращаясь, а также индуцируя в химических компонентах клетки (белках, нуклеиновых кислотах, углеводах, липидах) образование свободнорадикаль-ных состояний и перекисей. При окислительных процессах генерируется энергия электронного возбуждения, которая при определенных условиях может безизлу-чательно переноситься по системе быстро, на значительные расстояния, и впоследствии либо излучаться, либо тратиться на совершение физической или химической работы (Сент-Дьерди, 1960). При поглощении энергии высокой плотности происходит фотомодуляция активности ферментов и запускаются те или иные физиологические процессы в клетках (Баскаков, Воейков, 1996). Открытие фундаментального значения генерации электронного возбуждения в регуляции клеток принадлежит А.Г. Гурвичу («митогенетическое излучение»). Обнаружено, что необходимым фактором возникновения этого излучения является контакт реакционных систем с кислородом (Белоусов, Воейков, Попп, 1997). Важно, что свободные радикалы в биологических системах могут вызывать развитие цепных разветвленных реакций, что является механизмом усиления первичного слабого воздействия, порождающего АФК. В последующих фазах клеточного ответа радикалы рекомбинируют, цепные процессы обрываются.

АФК, таким образом, оказывают регуляторное действие на биологические системы за счет особых энергетических свойств реакций с их участием, возможности миграции энергии электронного возбуждения внутри клетки и во внеклеточной среде и благодаря эффекту усиления исходно слабых сигналов.

1.8. Свободнорадикальные процессы в эмбриогенезе

Свободнорадикальные процессы и регуляторная про- и антиоксидантная система играют важную роль в репродукции и эмбриогенезе.

При оплодотворении возникают явления «дыхательного взрыва». Одно из первых событий при оплодотворении - активация НАДФ*Н-оксидаз в мембранах яйцеклетки и спермия. Супероксиддисмутаза присутствует в сперматозоидах, ее активность пропорциональна подвижности спермиев. Продукция CP и антиокси-даптов у млекопитающих значительно возрастает при овуляции, во время и после имплантации. Супероксид играет важную роль в усилении текучести мембран при имплантации (Duran Reyes G. е.а., 1998).

У млекопитающих внутриутробный период жизни проходит при низких значениях рОг. Использование аэробного гликолиза энергетически обеспечивает плод. Гиперпродукция АФК приводит к возникновению аномалий (Fantel, Persin, 2002; Johnson, Nasr-Esfahani, 1994). Защитную роль играют антиокислительные ферменты - супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза и др. Матричные РНК этих ферментов имеются в ооцитах, эмбрионах и яйцеводах (Guerin е.а., 2001).

Белок Вс1-2, защищающий митохондриальные и ядерные мембраны от повреждений, связанных с развитием CP-реакций, играет важную роль в эмбриогенезе (Korsmeyer, 1993). С возрастом эмбриона увеличивается усиление системы антиоксидантов. Важную роль в защите от АФК играет желточный мешок (Zaken е.а., 2000; Hyungsuk е.а., 2001). У эмбрионов мыши зоны гибели клеток совпадают с зонами активной продукции АФК (Salas-Vidal е.а., 1998). Тератогенный эффект многих ксенобиотиков реализуется при их активации эмбриональными ци-тохромами Р450 и другими прооксидантными ферментами с образованием сво-боднорадикальных интермедиатов. Предполагается, что CP-механизм вовлечен в общий механизм эмбриопатий (Wells е.а., 1997). АФК регулируют явления апоп-тоза, необходимые в развитии органов зародыша.

Для исследования CP в биологических системах применяются три основные группы методов. Радиоспектроскопические методы (метод электронного парамагнитного резонанса - ЭПР (Завойский, 1944), метод двойного электронно-ядерного резонанса - ДЭЯР (Hide, 1964, 1967), а также метод спин-меток (McConnell, 1967)) регистрируют большей частью долгоживущие СР. Эти методы дают возможность оценить не только количество CP в системе, но и получить сведения о структуре радикалов и идентифицировать CP различной природы. Метод ЭПР позволяет одновременно контролировать и изменение концентраций CP, и изменение валентности ионов металлов, что дает возможность при исследовании ферментных систем судить и о том, с какими изменениями валентности связана активность фермента, и о характере первичных и вторичных реакций в процессах ферментативного катализа (Ingram, 1969). Метод ДЭЯР позволяет исследовать электронную структуру и конформационные превращения СР-состояний биологических макромолекул. Применение спиновых зондов дает возможность получать информацию об участии CP в конформационных перестройках клеточных мембран (Кольтовер, 1972, 1974). CP-реакции в биологических системах изучают также по сопровождающей их люминесценции (Владимиров, Литвин, 1959; Шляпинтох и др., 1961). Методом хемилюминесценции может быть получена информация как об интенсивности окислительных деструктивных процессов в клетках, так и о наличии в них защитной ингибиторной системы эндогенных антиоксидантов; при этом исследуются CP-реакции с участием корот-коживущих продуктов липидного происхождения (Владимиров и Арчаков, 1972; Эммануэль и др., 1965; Иванов, 1966; Петрусевич, 1967; Тарусов и др., 1961; Владимиров, 2000). Наконец метод привитой сополимеризации (ПС) (Козлов, Тарусов, 1961; Козлов, 1970), основанный на высокой реакционной способности CP, в силу чего CP инициируют полимеризацию ненасыщенных мономерных соединений-индикаторов. При этом образуются сополимеры - комплексные соединения полимеризованного индикатора и инициирующего радикала. Этот метод позволяет оценить их относительную концентрацию в клетке in vivo и ее орга-пеллах, ее изменения при различных воздействиях на организм, а также выявить гистологическую локализацию меченых привитых сополимеров методом авторадиографии. Метод ПС высокочувствителен и дает возможность сравнивать относительные суммарные концентрации долго- и короткоживущих CP в небольших группах клеток, что обуславливает перспективность его применения на эмбриологических объектах.

Этим методом было показано участие CP-процессов в работе Na, К-АТФазы, в транспорте Са через мембрану, в передаче нервного импульса, по нервному волокну, в процессах микросомального окисления ксенобиотиков, явления индукции CP-окисления липидов, в зрительной рецепции (работы лаборатории физико-химии мембран МГУ: Гулак, Данилов, Каган, Козлов, Коссова, Ко-телевцев, Лимаренко, Новиков, Ситковский, Третьяк и др., обзор: Козлов, 1973).

В наших работах с применением этого метода было показано участие СР-процессов в детерминации эмбрионального глазного зачатка и характерная их локализация в индукционных системах (Мелехова, 1976а,б, 1977).

Заключение

• Основные термодинамические теории развития связывают управляющие факторы эмбриогенеза с процессами энергообмена.

• В эмбриогенезе сочетаются принципы генетического детерминизма и самоорганизации.

• Генетический анализ развития показал, что в эмбриогенезе экспрессия сложной системы генов осуществляется на основе взаимодействия активирующих и тормозящих влияний.

• До начала экспрессии собственного генома зародыша регуляция развития осуществляется на уровне трансляции материнских матриц.

• В дальнейшем развитии регуляция на уровне трансляции заранее синтезированных матриц также играет большую роль.

• По мере развития в зародыше возникают центры активации экспрессии генов, локализованные в известных индукционных системах.

• Современные представления о природе и метаболической роли свободно-радикальных процессов в клетке позволяют предполагать их ключевую роль в пространственно-временной организации эмбриогенеза.

• Метод выявления свободных радикалов по реакции привитой сополимери-зации меченого индикатора в сочетании с гиставторадиографией позволяет исследовать свободные радикалы в зачат ках органов in situ.

• Нами ранее показано участие свободнорадикальных процессов в процессах детерминации зародышевых клеточных популяций и повышение их чувствительности к повреждающим слабым воздействиям.

Исходя из этого, задачами нашей работы являются: получение карт распределения относительных концентраций CP в клеточных популяциях зародыша на последовательных стадиях развития; исследование субклеточной локализации и биохимических субстратов СР-реакций, а также исследование механизмов дифференциальной чувствительности эмбриональных зачатков к повреждениям. Полученные данные применить для биотестирования качества водной среды.

Эти сведения должны послужить обоснованию развиваемых нами представлений о координирующей роль свободнорадикальных процессов в эмбриогенезе.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Мелехова, Ольга Петровна

выводы

В работе выдвинута и экспериментально обоснована гипотеза «эпигенетической программы» эмбриогенеза. Подробно исследовано поведение одного из параметров окислителыю-восстановителыюго гомеостаза — общего уровня свободных радикалов. Для выявления свободных радикалов применен метод привитой сополимеризации в сочетании с гистоавторадиографией и радиометрией.

3. Временная организация СР-процессов в эмбриогенезе определяется трех-вершинными суточными ритмами СР-процессов в зародышах, общим повышением уровня СР-реакций в периоды, предшествующие смене гомеостатических механизмов, а также локальными различиями уровня СР в отдельных зачатках, характеризующими их «биологический возраст» и участие в индукционных системах.

6. При измерении уровня радикалообразования в различных биохимических фракциях обнаружено преимущественное участие СР-реакций в липидпом обмене (главным образом во фракции полифосфоинозитидов).

- измерении адаптационного стресса с помощью выявления изменений уровня свободнорадикальпых реакций.

11. На основе полученных данных на примере амфибий предложена гипотеза «эпигенетической программы» эмбриогенеза, заложенной в цитоплазме зиготы соотношением субстратов, промоторов и ингибиторов свободнорадикального окисления. Согласно этой гипотезе, самоорганизация энергетических процессов в раннем развитии может определять формирование свойства компетенции и затем подготавливает бифуркационное поведение детерминирующихся зачатков. Параметром порядка, определяющим общую динамику этих процессов, может служить уровень свободнорадикальных окислительно-восстановительных реакций.

5.6. Заключение

В 5 части работы представлены данные биотестирования сточных и природных вод, полученные запатентованными нами методами, включенные в регламент проведения комплексной экологической экспертизы. По результатам работы можно заключить, что паши данные в основном хорошо согласуются с данными долгосрочных наблюдений видового состава гидробиоптов в загрязненных и чистых водоемах. Таким образом, метаболический экспресс-анализ на простых биотестах дает возможность сделать первичное заключение о наличии опасных для биоты загрязнений. Однако в дальнейшем требуется идентифицировать источник опасности с применением аналитических методов. Необходимо отметить, что предложенный нами метод мониторинга дает возможность выявить интегральное действие на биотесты различных комбинаций поллютаптов.

Глава 5.

ЯВЛЕНИЯ САМООРГАНИЗАЦИИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ. РОЛЬ ДИНАМИЧЕСКОГО ХАОСА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ СИСТЕМАХ

5.1. Явления самоорганизации в эмбриогенезе

Согласно теории самоорганизации внутреннее пространство эмбриона можно рассматривать как активную нелинейную среду, проявляющую неравномерную чувствительность к внешним воздействиям и демонстрирующую пороговые эффекты и характерные метаболические параметры; эти параметры флуктуируют под воздействием возмущений, способных самопроизвольно усиливаться или исчезать (диссипировать). В таких средах возможны необратимые процессы, которые могут быть локализованы в пространственно-временные структуры.

Клетки ведут себя и согласно специфическим химическим сигналам, и в соответствии с энергетической регуляцией, которая определяет, возможны ли вообще восприятие управляющего сигнала и реакция на него со стороны клеток. Таким образом, в начальный период индивидуального развития, то есть до того как включено функционирование собственного генома, вероятность управляющей роли энергетических параметров высока. Мы избрали один из метаболических индикаторов, - уровень свободиорадикальиых реакций. Свободные радикалы (СР) формируются как промежуточный продукт различных окислительно-восстановительных реакций, в том числе характеризующих синтез АТФ (Коме-тиани, Каюшин, 1964) и фазовое состояние фосфолипидов митохондриальных мембран (Дмитриев, 1997). Их общий уровень может считаться одним из параметров окислительно-восстановительного гомеостаза. По своей природе такой индикатор интегрален, то есть, представляет общую концентрацию СР в испытуемом объекте. Представляется, что СР могут послужить мерой для скорости энергообмепа (запасения и расходования энергии) в клетке.

Установлено, что в результате оплодотворения возникало неравномерное распределение СР реакций (плотность треков). Вслед за этим в результате дробления появлялась многоклеточная область, в которой СР реакции носили признаки самоускорения (рис. 1). В этой области относительная концентрация СР проявляла резкие беспорядочные (не привязанные к какой-либо определенной клетке) флуктуации. Очень скоро плотность СР в этой области увеличивалась на порядок. Затем, клеточные циклы замедлялись и начиналась экспрессия генов, указывая на возникновение дифферепцировки (рис. 4). В области эмбриона, которая осталась «иизкоэнергетической», вышеуказанные события наступали позже, но также начинались с нарастанием энергообмена (ростом уровня СР).

В любой из последующих фаз развития детерминация (бифуркация) клеточных типов всегда начинается с разделения на области пониженной и области повышенной СР-активности (рис. 21). В фазе органогенеза эмбриональная индукция становится главным механизмом координирующим расположение дифференцируемых клеточных типов по отношению друг другу. Подобный «энергетический паттерн» был обнаружен в различных индукционных системах: индуктором оказывался старший (по биологическому возрасту) зачаток, отличавшийся более высоким уровнем СР. В результате контакта с индуктором, в «младшем» зачатке повышался уровень СР-реакций, и это предшествовало дифференциров-ке.

Стадии развития

Рис. 21. Бифуркации интенсивности СР реакций в зачатке хрусталика, предшествующие дифференцировке клеток и формированию зон хрусталика у травяной лягушки. Изменения ДС/Сср относительной концентрации СР происходят в хрусталике во время детерминации и дивергентной дифференцировки отдельных групп его клеток: о - линзообразующей эктодермы, • - переднего эпителия, □ - первичных волокон; и ■ - вторичных волокон.

Как результат, могут возникать аномалии развития. Эти эффекты носят статистический характер и ответ на повреждения индивидуален.

Таким образом, на пике энергетического метаболизма, в момент бифуркации - выбора одного из альтернативных путей дальнейшего развития клетки становятся высокочувствительными и способны резко реагировать нарушением дифференцировки на сверх-слабые химические или физические воздействия. Это состояние может быть названо «детерминированным хаосом» (Аршинов, Буданов, 1994). При загрязнении среды, окружающей зародыш, это приводит к возникновению характерных уродств. Проблема механизма тератогенеза (возникновения уродств) очень актуальна, т.к. например эмбриональная смертность у человека в результате нарушений развития достигает 50%, и в последние годы растет число детей с врожденными уродствами. У животных тератогенез приводит к снижению численности популяций и вымиранию.

В нормальном развитии эта повышенная чувствительность, видимо, является необходимым условием компетенции - спонтанно возникающей в определенный момент «внутреннего времени» способности к восприятию сигналов к началу дифференцировки.

На основе этих результатов нами разработаны новые способы биоиндикации загрязнений окружающей среды на эмбриональных биотестах, на которые получены авторские свидетельства. Тот же метод позволяет обнаруживать и исследовать влияние сверхмалых доз химических и физических факторов на эмбриональное развитие.

Представляется вероятным, что при нормальном развитии подобная повышенная чувствительность и неустойчивость клеточных популяций является критическим условием для явлений компетенции. Последние возникают самопроизвольно в определенные моменты индивидуального времени как способность воспринимать сигналы для начала дифференцировки.

6.2. Роль динамического хаоса в развитии

Судя по экспериментальным данным, состояния неустойчивости, закономерно возникающие при эмбриогенезе, являются необходимым условием для дифференцировки и развития эмбриона. Энергетический метаболизм и изменения окислительно-восстановительного гомеостаза клетки представляют собой факторы, которые управляют наступлением состояния неустойчивости. Условием неустойчивости, судя по нашим данным, является повышение уровня и неравномерности распределения СР-реакций. Это предполагает определенную непредсказуемость судьбы каждой клетки, то есть коррелирует с понятием хаотического состояния (Ruelle, 2001). Заметная хаотическая компонента представляется необходимым элементом в явлении перехода между двумя различными гомеостатиче-скими состояниями развивающейся системы. По-видимому, области неустойчивости локализованы в индивидуальном времени и внутреннем пространстве эмбриона в соответствии с эпигеномной программой. Последняя должна быть изначально встроена в цитоплазму яйцеклетки через неравномерное распределение субстратов, промоторов и ингибиторов СР реакций. Эта программа реализуется через соотношение между уровнями энергообмена и свободиорадикальных процессов, присущими различным областям развивающегося эмбриона.

Можно ожидать, что критические количества субстратов, промоторов и ингибиторов свободиорадикальных реакций, а также соотношение этих количеств должны служить элементами, формирующими индивидуальное время, изначально зарезервированное для эмбриогенеза определенных видов. Индивидуальный возраст определенных клеточных популяций определяется потребленными долями энергосубстратов. Интенсивность окислительно-восстановительных СР реакций представляется тем параметром порядка, который может контролировать наступления событий дифференцировки в эмбриогенезе.

Таким образом, в развитии зародыша реализуются принципы как детерминизма, так и самоорганизации. Первый принцип выражен в генетической программе развития и всех биохимических возможностей организма. Второй принцип реализуется посредством цепных самоускоряющихся процессов СР-окисления, которые, изменяя состояние мембранного аппарата и энергетических систем клетки, приводят ее в неустойчивое состояние. Это определяет время и место активации экспрессии генов и начала морфогенетических событий.

Д.С. Чернавский (2004) считает, что параметрическое управление эмбриогенезом осуществляется на всех его стадиях. При этом дифференцировка начинается тогда, когда концентрация некоторого неспецифического фактора превышает пороговое значения (Чернавский, Соляник, Белоусов, 1980, 1985). Наши исследования (Мелехова, 1976, 1990, 2000, 2003) раскрывают конкретные пути реализации такого управления в эмбриогенезе низших позвоночных.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мелехова, Ольга Петровна, Москва

1. Азарашвили A.A., Соколова З.А., Фарберов А.И., Попов В.В. Становление суточного ритма деления клеток сетчатки личинок прудовой лягушки в различных условиях освещения. // Научн. докл. высш. школы, биол. науки, 1970 г. т.1, стр. 21 27.

2. Айзеиштадт Т.Б. Цитология оогеиеза. М.: Наука, 1984. 248 стр.

3. Алесенко A.B., Бурлакова Е.В., Красильников В.А. Участие фосфолипидов в образовании контактов нуклеиновых кислот с ядерным матриксом в процессах репликации и транскрипции // Структура и функции клеточного ядра. Пущино, 1984 г. стр. 163 764.

4. Алесенко A.B., Бурлакова Е.Б., Вайнсон A.A. Изменение антиокислительных свойств липидов на разных стадиях клеточного цикла. // Антиоксиданты. М.: Наука, 1975 г.

5. Алесенко A.B. Роль липидов и продуктов перекисного окисления в биосинтезе и функциональной активности ДНК. // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука, 1981 г. стр. 3 16.

6. Алесенко A.B. Роль липидов в передаче информационных сигналов клеточной пролиферации и экспрессии онкогенов. // Биоаптиоксидапты: теоретические и прикладные аспекты. / Под ред. У.К. Ибрагимова и Е.Б. Бурлаковой. Ташкент: ФАН, 1995 г. стр. 83 112.

7. Аллен Б., Инграм Д. Образование неспаренных электронов в макромолекулах в результате ультрафиолетового облучения. // Свободные радикалы в биологических системах. М.: Изд-во иностр. лит., 1963 г. стр. 259.

8. Алов И.А., Красильникова Н.В. Суточные ритмы митозов разных органов белых мышей и крыс. // Докл. АН СССР, 1962 г. т. 142, №4. стр. 933 935.

9. Апашева J1.M., Король В.М., Строганов Н.С. Кинетика изменений концентрации свободных радикалов и биологических показателей при интоксикации элодеи. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1979 г. №6, стр. 934 937.

10. Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны. ВГУ, 2000 г.

11. Архипенко Ю.В. Повреждение ион-транспортных систем кардиомиоцитов при стрессе. // Свободные радикалы и стабилизаторы. София, 1987 г. стр. 10.

12. Аршинов В.И., Буданов В.Г. Синергетика эволюционный аспект. Самоорганизация и наука. М.: ИФ РАН, Арго, 1994 г.

13. Ашофф Ю. Биологические ритмы: в 2х т. М.: Мир, 1986 г.

14. Бауэр Э.С. Теоретическая биология. М. — J1.: ВИЭМ, 1935 г. 207 стр.

15. Бауэр Э. Физические основы в биологии. М.: Мособлисполком, 1930 г. 103 стр.

16. Белоусов Л.В. Понятие детерминации в свете теории самоорганизации. // Механизмы детерминации. М.: Наука, 1990 г. стр. 13 18.

17. Белоусов Л.В., Дорфман Я.Г., Черданцев В.Г. Быстрые изменения формы и клеточной архитектуры изолированных фрагментов эмбриональных тканей амфибий как экспериментальная модель морфогенеза. // Онтогенез, 1974 г. т. 5, №4, стр. 323-333.

18. Берридж М.Дж. Молекулярные основы внутриклеточной коммуникации // В мире науки. 1985 г. №12, стр. 98 109.

19. Биологические процессы в загрязняемых модельных водоемах. М.: Изд-во МГУ, 1981 г.

20. Биологические часы. Сб. М.: Мир, 1964 г.

21. Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов». Ред. В.М. Захаров, Д.М. Кларк. М.: 1993 г.

22. Биргер Т.П. Метаболизм водных беспозвоночных в токсической среде. Киев, Наукова думка, 1979 г.

23. Блюменфельд Л.А., Калмаисон А.Э. Спектры электронного парамагнитного резонанса биологических объектов. // Биофизика, 1957 г. т.2, №5. стр. 552 -565.

24. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг. // Соросовский образовательный журнал, 2001 г. т.7, №4 (65), стр. 21-28.

25. Босток К., Симнер Э. Хромосома эукариотической клетки. М.: МИР, 1981 г. стр. 158.

26. Бржевская О.Н., Каюшин Л.П., Кондрашова М.Н., Марипов Б.Н., Неделина О.С. и Шекшеев Э.М. Связанные с окислением субстрата и накоплением энергии сигналы ЭПР метаболирующих митохондрий. // Биофизика, 1967 г. т. 12, стр. 839-845.

27. Бржевская О.Н., Неделина О.С. ЭПР метаболизирующих митохондрий при работе III пункта фосфорилирования. // Биофизика, 1969 г. 14, стр. 647 651.

28. Бузинова Н.С., Данильченко О.П. Функциональное состояние прудовика. // Биологические процессы в модельных водоемах. М.: Изд-во МГУ, 1984 г. стр. 103- 124.

29. Бузинова Н.С., Данильченко Ю.П. Реагирование моллюсков Lymneae stag-nalis L. на загрязнение. П. Физиолого-биохимические изменения. // Биол. п., 1984 г. № 1, стр. 55-61.

30. Бурлакова Е.Б., Эмануэль Н.М. // Фихико-химические основы авторегуляции в клетках. М.: 1965 г. стр. 44.

31. Бурлакова Е.Б., Алесенко A.B., Молочкииа Е.М., Пальмина Н.Л., Храпова Н.Г. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975 г. 214 стр.

32. Бурлакова Е.Б. Действие сверхмалых доз. // Вестник РАН, 1994 г. т. 64, стр. 425-431.

33. Бурлакова Е.Б. О возможной роли свободнорадикального механизма в регуляции размножения клеток // Биофизика. 1967 г. т. 12. стр. 82 88.

34. Бурлакова Е.Б. Роль антиокислителей в физико-химических процессах регулирования размножения клеток. // Тр. МОИП, секц. биофизич., 1968 г. т.28, стр. 15-23.

35. Бурлакова Е.Б. и др. Влияние липидов мембран на активность ферментов. Черноголовка, 1978 г. 35 стр.

36. Бурлакова Е.Б., Михайлов В.Ф., Мазурик В.К. Система окислительно-восстановительного гомеостаза при радиационно-индуцируемой нестабильности генома. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001 г. т.41, №5. стр. 489 499.

37. Вайнерт Э., Вальтер Р., Ветцель Т. и др. Биоиндикация загрязнений наземных экосистем. М.: Мир, 1988 г. 348 стр.

38. Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции. // Соросовский образовательный журнал. 1999 г. т.5, №6 (43), стр. 25 32.

39. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. // Энциклопедия. Современное естествознание, т.8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000 г. стр. 271 279.

40. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная гибель клетки. // Соросовский образовательный журнал, 2000 г. т.6, №9 (58), стр. 2-9.

41. Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972 г. 252 стр.

42. Вернадский В.И. Мысли натуралиста. М.: 1944 г.

43. Газарян К.Г., Тарантул В.З. Геном эукариот. М.: МГУ, 1983 г. стр. 216.

44. Герасимов A.M., Деленян Н.В., Шаов М.Т. Формирование системы противо-кислородной защиты организма. М., 1998 г.

45. Гераськин С.А. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки. // Радиационная биология. Радиоэкология, 1995 г. т.35,№5, стр. 571 -508.

46. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. / Пер. с англ. М.: Мир, 1997 г. 624 стр.

47. Гердон Дж. Регуляция функции генов в развитии животных. М.: Мир, 1977, 196 стр.

48. Гилберт С. Биология развития: в Зт. М.: Мир, 1993 1995 г.г.

49. Голичепков В.А., Иванов Е.И., Никерясова E.H. Эмбриология. М.: Academia, 2004 г. 219 стр.

50. Гололобова М.Г. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958 г. 53, 9. стр. 118 122. 1959 г. Бюлл. эксп. биол. и мед. 54, 3, стр. 94 - 97.

51. Грунц X. Механизмы компетенции ранних эмбриональных тканей // Онтогенез. 1978 г. Т.9, стр. 427 438.

52. Гудвин Б. Аналитическая физиология клеток и развивающихся организмов. М.: Изд-во Мир, 1979 г. 287 стр.

53. Гурвич А.Г. Принципы аналитической биологии и теории клеточных полей. М.: Наука, 1991 г. 288 стр.

54. Дабагян Н.В., Мелехова О.П., Слепцова J1.A. Тезисы докл. V Всесоюзн. совещания эмбриологов. М.: Наука, 1974 г.

55. Дабагян Н.В., Слепцова J1.A. Травяная лягушка Rana Temporaria L. // Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975 г. стр. 442.

56. Дабагян Н.В., Слепцова J1.A. Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975 г. Таблицы нормального развития Rana temporaria, стр. 448.

57. Дабагян Н.В., Строева О.Г., Шерешева E.JI. Индукция зачатка радужины хрусталиком в регенерате сетчатки у головастиков бесхвостых амфибий. // Докл. АН СССР. 1966 г. т. 167, стр. 953 956.

58. Детлаф Т.А., Руднева Т.Б. Шпорцевая лягушка Xenopus laevis D. // Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975 г. стр. 392

59. Детлаф Т.А. Продолжительность интеркинетических состояний клеток, клеточные деления и дифферепцировка. // Клеточная дифференцировка и индукционные механизмы. М.: Наука, 1965 г. стр. 193 -203.

60. Детлаф Т.А. Понятия «детерминация» и «коммитирование» в исследованиях закономерностей индивидуального развития. // «Механизмы детерминации». М.: Наука, 1990 г. стр. 5 12.

61. Дильман В.М. Большие биологические часы. М.: Знание, 1986 г.

62. Динерман A.A. Роль загрязнителей окружающей среды в нарушении эмбрионального развития. // Симпозиум. М.: Медицина, 1980 г.

63. Дмитриев Л.Ф. Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах. // Докт. диссерт. (научн. доклад). М., 1997 г.

64. Дмитриев Л.Ф. Механизмы энергетических превращений при дыхании и фотосинтезе: роль фосфолипидной мембраны. // Биофизика. 1995 г. т.40, стр. 74 -85.65

Информация о работе

Мелехова, Ольга Петровна
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.30

Диссертация

Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы