Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инсулин-рецепторные взаимодействия в эволюции позвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Инсулин-рецепторные взаимодействия в эволюции позвоночных"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ имени И. М. СЕЧЕНОВА

///Г

На правах рукописи УДК 576.11 : 612.349

ЛЕЙБУШ Борис Наумович

ИНСУЛИН-РЕЦЕПТОРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ в эволюции ПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.04 _ БИОХИМИЯ

АВТОР ЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

^ & Тг***¿с/и {ъЛыьь *** -с-«/Г /£? ^

ЛЕНИНГРАД 1989

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова Академии наук СССР.

Официальные оппоненты: . доктор биологических наук профессор Н. Н. НИКОЛЬСКИЙ доктор биологических наук профессор В. Г. ШАЛЯПИНА доктор биологических наук профессор Р. Н. ЭТИНГОФ

Ведущее учреждение — Институт эндокринологии и химии гормонов АМН СССР (Москва).

Защита состоится « » 1989 г. в часов

на заседании специализированного совета Д00.89.01 при Институте

эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова АН СССР по адресу: 194223, Ленинград, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан « » 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук профессор

М. Н. МАСЛОВА

ВВЕДЕНИЕ

. Актуальность проблемы. Гормональные системы организма, как и коммуникативные системы 2 целом, являются результатом эволюционйого развития. Познание того, как эти системы возникли, в каком направлении ала их эволюция и как в ходе эволюции происходила интеграция входящих в системы элементов, представляет задачу большой теоретической важности. Наука, занимающаяся этими вопросами, сравнительная эндокринология, относится к числу наиболее быстро прогрессирующих в ваши дни. При рассмотрении проблем эволюции гормональных систем внимание исследователей все больше привлекают гормональные рецепторы. Интерес к их эволюционной истории обусловлен важной ролью рецепторов в системе передачи гормонального сигнала клетке и поддерживается постоянно увеличивающимся потоком информации по их структуре и функциональной организации у высших животных.

Инсулин является одним из важнейших регуляторов метаболизма и роста на всем протяжении эволюции животного мира.Вопросы эволюционной истории этого гормона давно интересуют исследователей. Работами многих из них накоплен большой фактический материал, касающийся происхождения инсулина, его функциональной роли на разных этапах эволюции, а такие особенностей его структуры у разных видов. Все эти исследования вплотную подводят к необходимости охарактеризовать в сравнительно-филогенетическом аспекте свойства рецепторов гормона и создают для этого необходимую базу.

Однако пока проблема инсулияовых рецепторов в эволюции не получила большого развития. Работы в этом направлении не носят систематического характера и охватывают небольшой круг объектов. Более того, некоторые важные аспекты проблемы (например, регуляция рецепторов у низших позвоночных) совсем не затронуты исследованиями. В этих обстоятельствах дальнейиее накопление материала по характеристике кнсулиновых рецепторов у животных разного эволюционного уровня представляется важной задачей.

я

Данная работа посвящена анализу некоторых функциональных свойств инсулиновых рецепторов позвоночных. Работа воз-

никла как логическое продолжение многолетних исследований по эволюции инсулиновой регуляции, проводимых в лаборатории эволюции биохимических систем коммуникации Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова АН СССР (Лейб-сон, 1979, 1981, 1983; Плисецкая, 1975; Перцева, 1989). Основой для нее послужил накопленный в лаборатории большой фактический материал по регуляции инсулином метаболизма у низших позвоночных, по определению содержания инсулина в крови многих из них, наконец, по выделению и расшифровке аминокислотной последовательности некоторых инсулинов рыб.

Одним из подходов при рассмотрении инсулиновых рецепторов в эволюции является изучение в сравнительно-филогенетическом плане инсулин-рецепторных взаимодействий. Такой подход позволяет сосредоточить внимание на тех аспектах рецеп-торной функции, которые имеют отношение к восприятию клеткой гормонального сигнала, но также дает возможность рассмотреть рецептор с точки зрения его роли в регуляции чувствительности клетки к гормону. Анализируемый с точки зрения взаимодействия с гормоном, рецептор выступает в качестве компонента гормональной системы, а его эволюционная история представляется частью эволюции гормональной системы как целого.

С указанных позиций в данной работе рассмотрены инсулин-рецепторные взаимодействия у позвоночных разного эволюционного уровня. Целью работы было охарактеризовать свойства инсулиновых рецепторов позвоночных, имея в виду оценить вклад ре-цепторного компонента в эволюцию инсулиновой гормональной системы. В соответствии с этим задачами работы было: I) изучить связывающие параметры инсулиновых рецепторов позвоночных -от круглоротых до млекопитающих, - сравнить их по таким показателям, как чувствительность к гормону и избирательность; 2) сопоставить изменчивость рецепторов с изменчивостью инсулинов в ходе эволюции позвоночных; 3) сравнить рецепторы высших и низших позвоночных по способности реагировать на смещения уровня инсулина в крови, для чего у низших позвоночных сопоставить связывание инсулина тканями с его изменениями в крови в ходе преднерестового голодания (минога, горбуша); у высших позвоночных (крыса) рассмотреть влияние на рецепторы острой инсулиновой недостаточности, вызванной введением ан-

тиинсулиновой сыворотки, и in. Yitxo на примере рецепторов глюкагона проанализировать влияние повышения уровня гормона на состояние рецепторов.

Научная новизна. Впервые на материале, охватывающем представителей круглоротых, рыб, птиц и млекопитающих, проведено сравнение связывающих свойств инсулиновых рецепторов в таких тканях, как печень, сердечная и скелетная мышца.го-ловной мозг. Раньше в сравнительно-филогенетическом плане исследовались только рецепторы эритроцитов. Опыты дали основание говорить о присущей всем инсулиновым рецепторам позвоночных консервативности связывающей функции.

Для оценки функциональной изменчивости рецепторов в сопоставлении с функциональной изменчивостью инсулинов поставлены опыты по вытеснению связанного меченого инсулина рядом немеченых инсулинов, принадлежащих видам от круглоротых до млекопитающих. Впервые такого рода опыты проведены на мозга-. вых и печеночных рецепторах разного эволюционного уровня.Сде-лан вывод о ббльаей изменчивости инсулинов по сравнению с изменчивостью рецепторов в эволюции.

Впервые показано, что число связывающих мест в ряде твд-яей-нишеней млекопитающего значительно выше, чем в соответствующих тканях низших позвоночных.

Впервые охарактеризовано состояние рецепторов инсулина в период преднерестовой миграции у миноги и горбуши.Выявлено отсутствие у обоих видов реакции рецепторов на снижение в ходе миграции уровня инсулина в крови. Показанное в этих условиях у горбуши снижение числа инсулинсвязывающих мест в головном мозгу является первым пока случаен сдвигов со стороны мозговых рецепторов в естественных условиях. Впервые обнаружен важный факт отсутствия даун-регуляции у миног, выявленный при введении им инсулина.

Существование даун-регуляции рецепторов глюкагона в печени крысы, ранее предполагавшееся только на основании косвенных данных, продемонстрировано прямыми экспериментами in vitro. В этих же экспериментах впервые показана способность инсулина в относительно небольших дозах усугублять стимулируемую глюкагоном убыль рецепторов, что вносит новый элемент.в проблему взаимоотношений между двумя гормонами.

■ - б -

Впервые для изучения регуляции рецепторов в условиях обратишь сдвигов в уровне инсулина использовано введение анти-иясулиновой сыворотки крысе. Проанализированы в опытах in vitro последствия такого введения. Показано, что введение крысе АИС инициирует ответ со стороны рецепторов в виде повышения числа связывающих мест на мембране печени, имеющее обратимый характер. Этой реакции предшествует относительно непродолжительное повышение аффинности печеночных рецепторов, обусловленное связывание)! икк комплексов инсулин-антитело.

Теоретическая и практическая значимость. Проведено сравнительное изучение связывающих свойств инсулинового рецептора у позвоночных разного эволюционного уровня, что дало возможность судить об эволюционной изменчивости рецептора в сопоставлении с функциональной изменчивостью инсулина.Полученные данные раскрывают важный аспект проблемы эволюции инсу-линовой регуляции, характеризуя события, происходящие в ходе эволюции позвоночных на периферии инсулиновой гормональной системы - в тканях и клетках-мишенях. Эти данные имеют и более общее значение, обусловленное вниманием современной науки к проблеме эволюции гормональных систем вообще.

Раскрыты некоторые неизвестные ранее аспекты функционирования инсулинового регудяторного механизма в таких специфических условиях, как преднерестовая миграция у круглоротых и рыб. Это существенно как для оценки состояния инсулиновой регуляции у этих видов, так и с точки зрения проблемы регуляции рецепторов уровнем гормона в филогенезе позвоночных.

Получены экспериментальные данные, которые способствуют более углубленному пониманию такого важного феномена, как даун-регуляция рецепторов. В частности, они дают основание ставить вопрос о влиянии на даун-регуляцию одновременного связывания клеткой двух лигандов (на примере рецепторов глюкагонаХ а также показывают, что быстрые и обратимые изменения числа рецепторов могут быть получены при манипуляциях с физиологическими концентрациями гормона.

Опыты с введением антиинсулиновой сыворотки крысе демонстрируют возможность повысить аффинность печеночных рецепторов инсулина за счет создания в крови высокого титра антиин-сулиновых антител. Эти опыты позволяют ставить вопрос об уча-

стии печеночных рецепторов гормона в элиминации иммунных коя-плексов. Данный аспект работы может прёдставить практический интерес в связи с проблемой антител к инсулину в крови больных сахарным диабетом.

При Осуждении вопроса о роли рецепторных факторов в эндокринной патологии в расчет должен быть принят сделанный в работе вывод о высокой эволюционной консервативности (и, следовательно, функциональной прочности) инсулинового рецептора.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Связывающие характеристики иясулиповых рецепторов за 400-500 млн. лет эволюции позвоночных не изменились сколько-нибудь значительно. Функциональной консервативности рецептора противостоит относительно высокая изменчивость самих инсу-линов. Иначе говоря, при наличии двух рядов взаимодействующих молекул в эволюции позвоночных флюктуации в одной из них выражены сильнее, чем в др.угоы.

2. При сходстве связывающих параметров рецепторов виды позвоночных могут различаться по количеству инсулинсвязываю-щих мест в однах и тех же тканях. Количество связывающих мест может находиться в обратной зависимости от биологической активности инсулина у данного вида, а в ряде случаев определяется положением вида на эволюционной шкале: у высших позвоночных количество связывающих мест в некоторых тканях выие,чеы у низших. Количество связывающих мест в эритроцитах не находится в какой-либо связи с двумя указанными обстоятельствами.

3. Участие рецепторов в повышении эффективности инсулинового регуляторного механизма в ходе эволюции позвоночных обусловлено: а) повышением числа инсулинсвязывавщих мест в ряде тканей-мишеней высших позвоночных по сравнению с низшими; б) увеличением с повышением температуры скорости связывания инсулина, что ставит теплокровных в более выгодное положение по сравнению с холоднокровными; в) более высокой регулируемостью рецепторного пула уровнем гормона у высших позвоночных.

Апробация работы. Материалы исследования были доложены и обсуждены на 2-й Всесоюзном съезде эндокринологов, на 1-м Всесоюзном съезде биофизиков, на 8-ы и 9-м Совещаниях по эво-

люционкой физиологии памяти акад. Л.А.Орбели, на мзвдународ-ном симпозиуме „Эволюция панкреатических островков" (Левин-град, 1975), на Всесоюзном симпозиуме „Регуляторная роль мембран в процессе дифференцировки и пролиферации клеток" (Пу-щино, 1983), на 5-й Всесоюзной конференции по биохимии мышц, на 1-й рабочем совещании „Протоонкогены, онкогены, факторы роста" (Тарту, 1986), на 2-й Всесоюзной конференции по ней-: ронаукаи, на биохимической секции Ленинградского общества физиологов, биохимиков и фармакологов имени И.М.Сеченова.

Апробация работы проходила на заседании Секции молекулярных основ эволюции функций Института эволюционной физиологии и биохимии вмени И. 1!.Сеченова АН СССР.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов с их обсуждением, заключения, выводов и списка литературы ( источников). Материал изложен на страниц содержит рисунк и таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования в работе были речная минога Ьат-petra fluviatiiia (круглоротые), два вида костистых рыб: СКОрпева Scorposna porous И горбуша Oocorhyncb.ua gorbuscha, птицы (куры породы Леггорн кросс-288) и млекопитающие (крыоы линии Вистар). Исследования проводили на печени (изолированные гепатоциты и плазматические мембраны), сердечной и скелетной мышцах (сарколеммальные препараты), головном мозге (микросомальная фракция) и на эритроцитах. Были использованы кристаллические инсулин и глюкагон свиньи (фирма ^Дилли, США), полученные в нашей лаборатории кристаллические инсулины скор-пены (Юнев и др., 1975) и горбуши (Русаков, Бондарева, 1979), инсулин ииксины (предоставлен д-ром С.Змдинои /Швеция/).

Плазматические мембраны печени получали по методу Невилла (Seville, 1968), несколько модифицированному в случае печени рыбы; изолированные гепатоциты крысы получали перевариванием коллагеназой по методу Берри и Френда в модификации Селгена (seigen, 1976), кур - тем же методом с изменениями

(Уханова, Лейбуш, 1988). Сарколеммальные препараты сердечной и скелетной шшц получали методой Кидвая (ыд»а! et а1., 1973) в нашей модификации (Лейбуш, Бондарева, 1979). Микро-сомальная фракция головного мозга (фракция 20000 была получена по методу Хавранковой (Натгалооуа et а!., 1973), эритроциты - путем центрифугирования взвеси клеток крови в фиколл-верографине (аааЪМг et а1., 1973).

Инсулин метили с помощью хлорамина Т, используя фирмы „Изотоп", очищали на целлюлозной колонке и злюировали 6%-ным раствором бэа. Полученный препарат имел специфическую активность 6,8-7,5 МБк/мкг (180-200 мкКи/мкг). Глюкагон метили тем же методом, очищали на целлюлозной колонке и злюировали 50%-ным раствором этанола. Полученный препарат имел специфическую активность 8,8-9,7 МБк/икг (240-260 мкКи/мкг).

Эксперименты состояли в определении специфического связы-

Т9Е ТОС

вания -^Г-инсулина или а^1-глюкагона соответствующим материалом в присутствии возрастающих концентраций немеченого лига-нда в подходящем буфере (состав буфера зависел от вида ткани). Инкубационная смесь помимо мембран или клеток (соответственно рассчитывалась концентрация белка или количество клеток на мл) содержала'меченый лиганд (0,1-0,2 нМ) и немеченый (0-1000 нг/мл инсулина; 0-1000 нМ глюкагона). Время инкубации определялось временем выхода на плато при данной температуре. Температура инкубации в сравнительных экспериментах, как правило, составляла (исключения для изолированных клеток оговариваются и учитываются при обсуждении результатов). В автономных сериях экспериментов (таких, как опыты с введением крысе антител к инсулину) температура устанавливалась в соответствии с принятой в литературе для данного материала.По окончаний инкубации аликвоты инкубационной смеси (по 0,10,2 мл) 2-3 минуты центрифугировали в холодном буфере при скорости 2500 надосадочную видкость сливали и после повторения процедуры считали радиоактивность осадка. В кандом опыте ставили контроль на неспецифическое связывание (инкубация материала с инсулином 30 мкг/мл или с глюкагоном 5000 нМ). Неспецифичеёкое связывание всегда вычитали.

Кривые, выражавшие зависимость связывания меченого ли-ганда от немеченого, преобразовывали в координатах Скэтчар-

да и определяли равновесные константы диссоциации (Кд) и число связывающих иаст (сайты на клетку или ноли на белок мембран). Наличке в случае инсулиновых рецепторов нелинейного (вогнутого вовнутрь) графика Скзтчарда расценивали как показатель гетерогенности связывающих мест и анализировали в соответствии с моделью двух классов рецепторов ( Kaim et ai., 1974). Оценку селективности связывающих мест для инсулина , проводили в опытах по вытеснению связанного 12^1-инсулина свиньи немечеными инсулинами свиньи, горбуши, скорпены и ми-ксины. Сродство данных инсулинов к рецепторам оценивали относительно свиного, сродство которого принято за 100%.

Радиоиммуннологическое определение инсулина в крови проводили методом пробирок, обработанных антителами.Метод был предложен для определения гормона роста (Catt et ai., 1970 ) и адаптирован нами для инсулина (Лейбуш, 1971). Антиинсулино-вая сыворотка была получена на морских свинках при иммунизации их смесью свиного и бычьего инсулинов (Бондарева, 1970). Содержание белка в мембранах определяли по Лоури (Lowry et al., 1951).Для суждения о степени обогащения препаратов мембранами в ходе их получения использовали определение маркера плазматических мембран 5'-нуклеотвдазы в гомогенатах и мембранных препаратах (soiyman, Trams, 1972). Содержание неорганического фосфата оценивали по Зйблу (Eibi,Lands,1969).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I.Сравнительное изучение связывания инсулина рецепторами

позвоночных разного эволюционного уровня -характеристика инсулинсвязывающих мест в некоторых тканях

1.1« Влияние рН на связывание. Опыты поставлены на мембранах печени крысы, мембранах печени скорпены, мембранах мозга миноги и горбуши. Во всех случаях специфическое связывание *251-инсулина при изменении рН менялось очень сильно. Во всех случаях оптимум связывания приходился на рН 7,5-8,0 и смещение от оптимума в кислую и щелочную стороны приводило к быстрому понижению связывания.

1.2. Влияние температуры на связывание. Опыты поставлены на мембранах печени крысы, мембранах печени скорпены (температура воды в момент вылова 18-20°С), мембранах мозга миноги

(температура воды в момент вылова 4-6°С). Во всех случаях скорость связывания *251-инсулина была наибольшей при 30-37°С, ниже при 15-24°С и еще ниже при 4°С. Соответственно понижению скорости связывания удлинялось время выхода связывания на плато. Но величина связывания с понижением температуры увеличивалась, что также наблюдалось у всех видов.В системах m vitro к изменениям температуры может быть чувствителен сам рецепторный белок, его мембранное окружение, а также тканевые протеазы, ответственные за деградацию как рецептора, так и меченого инсулина. Многообразие факторов обусловливает неодинаковую устойчивость мембран к температуре и ответственно за отсутствие полного совпадения хода кривых температурной зависимости у разных видов. Тем не менее основные тенденции и прежде всего тенденция к ускорении процесса при повышении температуры наблюдались как у теплокровных,так и у холоднокровных, при этом максимальная скорость связыва-. ния у тех и других наблюдалась при 30-37°С.

1.3. Равновесные параметры связывания. Типичная для ин-сулиновых рецепторов высших животных криволияейность графика Скэтчарда наблюдалась у всех изученных объектов. Во всех тканях всех видов выявлялись два класса связывающих мест с Кд соответственно Ю-9 и I0~3 М (табл.1). Хотя в пределах класса величины констант варьировали, однако с учетом разнородности материала вариации должны быть расценены как умеренные. Об этом же говорит отсутствие больших расхождений в Кинг» определяемых как концентрация немеченого лиганда, необходимая для 50% вытеснения метки: в тканях крысы величины константы колебались от 1,7 до 4,2 нМ, в тканях миноги - от 3,3 до 4,2 нМ.

Сравнительная оценка количества связывающих мест (табл. 2) в случае мембранных препаратов сталкивается с определенными трудностями, обусловленными разнородностью исходного материала. Возможность сравнения определялась наличием сходного обогащения препаратов маркером мембран (5'-нуклеотидазой) по отношению к гомогенату, сопоставлением уровней неспецифического связывания меченого инсулина мембранами (определяемого при прочих равных условиях содержанием в препаратах нерецеп-торных примесей). С учетом всех привходящих обстоятельств

Таблица I Специфическое связывание -^1-инсулина тканями позвоночных: равновесные константы диссоциации (Кд) и константы ингибирования (Кинг)

Класс Вид

Ткань

высокое низкое сродство сродство

Кинг(нМ)

Млеко- Крыса питающие

Печень

ротые

клетки 2,7 30,7 4,2

мембраны 1,7 23,0 2,8

Скелетная мышца 2,1 37,5 2,7

Мозг 2,3 53,0 1,7

Кура Печень

клетки 2,0 38,0 2Д

Скелетная мышца 1,0 29,3 1,3

Эритроциты 2,3 86,0 3,0

Скор- Мозг 4,0 59,0 5,0

пена Печень

мембраны 0,5 25,0 0,3

Горбу- Сердечная мышца 0,9 61,7 1,0

ша Мозг 1,9 70,0 2,0

Минога Сердечная мышца 3,2 22,8 3,3

Мозг 3,7 97,0 4,2

Эритроциты 2,5 61,0 3,3

* п

Температура инкубации 20 С.

♦ ♦ О у

Температура инкубации 15 С (в других случаях температура инкубации 4°С).

сделано заключение о том, что I) количество инсулансвязывающих мест в печеночной, мышечной и, возможно, в мозговой ткани низших позвоночных в несколько раз ниже, чем в соответствующих тканях крысы; 2) количество инсулинсвязывающих мест в тканях кур (печень, скелетные мышцы) также ниже, чем в тканях крысы;

Таблица 2 Специфическое связывание *251-инсулина тканями позвоночных: максимальная емкость в расчете на клетку или на белок мембран

Мякгчшальиая Процент связыва-Материал "аксиальная щшс мвС1 с вы_

емкость связы сокиц ср0дств0ц

Клетки (места связывания в расчете на клетку)

Гепатоциты крыс^ 260000 20

Гепатоциты кур 40000 6

Эритроциты человека 68 3

Эритроциты кур 670 3

Эритроциты миног 150 3

-13

Мембраны (моли связанного инсулина х 10 в расчете на мг белка)

Печень крысы, 62,0 17

Печень скорпены 7,2 4

Скелетная мышца крысы 13,7 6

Скелетная мышца кур 2,3 5

Сердечная мышца горбуши 1,7 5

Сердечная мышца миноги 3,5 II

Мозг крысы 12,3 17

Мозг скорпены 2,2 7

Мозг горбуши 5,6 5

Мозг миноги 5,2 8

* п

Температура инкубации 20 С.

* * л

Температура инкубации 15 С (в других случаях температура инкубации Л°С).

3) количество инсулиносвязывающих мест в эритроцитах не находится в какой-либо связи с эволюционным положением вида.

1.4. Относительное сродство связывающих мест к гомо- и гетерологичным инсулинам. Опыты проводились на мембранах головного мозга крысы, горбуши и миноги с использованием инсу-линов свиньи, горбуши и миксины (табл.3), на эритроцитах Ю-

Таблица 3 Относительное сродство инсулинов свиньи,горбуши и ыиксины к иозговыи рецепторам инсулина крысы, горбуши и миноги

Щеточник мембран

Источник «Рис? |____горбуша_________минога_____

инсулина относи- относи- относи-к тельное тг /»\ тельное к /М\ тельное линг сродст- линг сродст- инг сродство^) во(%) во(%)

Свинья 1,7 Ю~9 100 2,0 Ю-9 100 4,2 Ю"9 100 Горбуша 2,6 КГ9 65 8,3 Ю~9 24 6,7 Ю~9 63 Миксина 13,2 Ю~9 13 42,0 Ю~9 5 30,0 Ю~9 14

Таблица 4 Относительное сродство инсулинов свиньи,горбуши и скорпены к печеночным рецепторам инсулина крысы и скорпены

Источник инсулина

Источник мрибран

крыса

скорпена

инг

(И)

относительное сродст-К, во {%)

инг

относитель-(11) ное сродство \%)

Свинья 4,0 Ю~9 100 ' 0,3 Ю-9 100

Горбуша 5,2 Ю"9 77 0,6 ю~9 50

Скорпена 18,4 Ю~9 22 2,0 КГ9 15

дневных куриных эмбрионов с использованием тех ¡¡.з инсулинов, на печеночных мембранах печени крысы и скорпены с использованием инсулинов свиньи, горбуши и скорпены (табл.4). Рецепторы всех видов и всех тканей отдавали предпочтение инсули-нам с более высокой биологической активностью. Биологическая активность в ряду инсулинов убывает в порядке: инсулин свиньи, инсулин горбуши, инсулин миксины (или инсулин свиньи, инсулин горбуши, инсулин скорпены). В этом ке порядке независимо от вида ткани и вида животного убывали сродство дан-

ных инсулинов к рецептору. То обстоятельство, что рецепторами независимо от их происхождения лучше связываются более активные инсулины, означает, что вовлеченные во взаимодействие с рецепторами участки молекул гормона от вида к виду могут различаться, тогда как соответствующие им участки рецеп-торных молекул у разных видов сходны между собой.Следователь-но,изменчивость инсулина и изменчивость рецептора не син±ро-низированы в эволюции.Существенно,что высокая селективность присуща рецептору круглоротых (наиболее примитивные позвоночные) в той же мере, как и рецептору млекопитающих, а рецептору эритроцитов 10-дневных куриных зародышей в той же мере, как и дефинитивному рецептору.

1.5. Обсуждение результатов. Полученные данные свидетельствуют о высокой функциональной консервативности инсули-нового рецептора позвоночных. Этот факт,ранее показанный пра исследовании связывания инсулина эритроцитами (Мц^ео et ад.,,. 1979) в настоящей работе, впервые установлен применительно к рецепторам главных мишеней гормона-мышц и печена и, что дол» но быть отмечено специально, применительно к рецепторам головного мозга, имеющего структурные отличия от периферических рецепторов. Константность связывающих параметров инсули-нового рецептора на всей пути эволюции от круглоротых до млекопитающих согласуется с данными о его структурной консервативности, подтверждаемой не только одинаковой доменной организацией рецептора у позвоночных, но и обнаружением такого ке рецептора у дрозофилы.Функциональной консервативности рецептора противостоит относительно большая функциональная изменчивость инсулина (биологическая активность инсулинов от инсулина миксины до инсулина кур варьирует в десятки раз,тогда как равновесные константы связывания в изученном ряду позвоночных различались для каждого класса связывающих мест не более, чем в 8 раз).

С точки зрения большей вариабельности инсулинов у позвоночных существенно обнаружение у кур значительно меньшего числа связывающих мест, чем в соответствующих тканях крысы. При наличии у тех и других сходных уровней инсулина в крови (Колычев, 1988) правомерно видеть в меньшем количестве связывающих мест у кур реакцию на значительно более высокую по

сравнению с крысиный метаболическую активность куриного инсу-лана. Наличие такого рода реципрокных соотношений позволяет видеть х вариабельности числа рецепторов у разных видов реакцию на зядовые особенности инсулинов. Следовательно, видовые различия з биологической активности инсулинов, выявляемые in vitro, не обязательно реализуются в условиях целого организма.

Более низкое по сравнению с крысой число связывающих мест изученных низших позвоночных сочетается с относительно низкой биологической активностью их инсулинов и не компенсируется более высоким содержанием инсулина в их крови.Это дает основание полагать, что в ходе эволюции позвоночных (у теплокровных) имело место повышение как активности инсулинов, так в числа связывающих мест в тканях-мишенях, что может быть расценено как фактор, повывающий эффективность работы системы.

При отсутствии на уровне инсулин-рецепторных взаимодействий видовых адаптацнй к температурному фактору (у холоднокровных и теплокровных оптимум связывания приходится на одни и те же температуры) переход к теплокровности мог способствовать повышению эффективности инсулиновой регуляции на рецепторнои уровне также за счет повышения скорости оборота рецепторов и более быстрого включения гормона в регуляцию метаболизма.

2. Проблема регуляции инсулиновых рецепторов у низших позвоночных

В свете задачи оценить вклад рецепторов в эволюцию гормональной системы инсулина у позвоночных представлялось важным в сравнительном плане рассмотреть вопрос о1 регуляции рецепторов при смещениях уровня инсулина в крови. Феномен даун-регуляции, хорошо охарактеризованный у высших животных, у низших ранее никогда не изучался. С целью его выявления в этом случае было проведено определение специфического связывания ^51-инсулина тканями миноги и горбуши в период нерестовой миграции. Хотя оба вида далеко отстоят друг от друга в филогенезе, они имеют сходную экологию и сходные механизмы регуляции жизненного цикла: в преднерестовый период мино-

ги и горбуши не питаются и живут за счет траты ранее накопленных запасов; после, нереста они гибнув. Существенно, что с началом голодания з их крови начинает снижаться уровень инсулина и это снижение в том или ином темпе продолжается вплоть до Гибели особей (Плисецкая и др., 1976; Максимович и др., 1978; Бондарева в др., 1980).

2.1. Связывание инсулина рецепторами миноги в динамике преднерестового голодания. Специфическое связывание ха>1-ин-сулина эритроцитами, плазматическими мембранами сердечной ш-яцы и мембранами головного мозга определяли в период о августа (миноги морской стадии) по май (рис.1).Содержание инсулина в крови в это время показано на рисунке. Уровень связывания гормона эритроцитами за период наблюдения снижался до следовых количеств. Тенденция к понижению (уровень связывания 6,3% в августе и в мае) инелась и в случае сердечной мышцы. Связывание гормона мозговыии мембранами по дан- . ным за три года существенно, не изменялось. Все колебания были обусловлены изменениями числа связывающих мест, тогда как их аффинность оставалась на одном уровне.

2.2. Реакция иноулиновых рецепторов миноги на гиперин-сулинемию. вызванную введением гормона извне. Опыты ставила на зимующих миногах и на миногах, выловленных сразу после вхождения в реку осенью. Инсулин (смесь свиного и бычьего) вводили из расчета 20 ЕД на кг веса. Уровень инсулина в крови после введения повышался у осенних миног в 30 раз, у зимних более чем в 80 раз (в обоих случаях пик подъема через 3 часа после введения). Определение связывания гормона рецепторами сердечных и мозговых мембран на протяжении б (осенние миноги) и 8 (зимние) часов после введения не выявило реакции на гиперинсулинемию. Ожидать такую реакцию со стороны сердечных рецепторов инсулина дает основание наличие их даун-регуляции у высших животных. В случае мозговых рецепторов ожидать даун-регуляцию также имеются основания, поскольку мозг круглоротых проницаем для инсулина (Бредбери, 1983).

2.3. Связывание инсулина рецепторами горбуши в период нерестовой миграции. Специфическое связывание ^&1-инсулииа мембранами сердечной мышцы и мозговыми определяли в период с июля по сентябрь (стадии зрелости с Ш по У1). Изменения в

Л

VIII

-мозг ъва'. сердце авш • эритроцит«

XI

XI XII I

Рис.1. Инсулин крови и связывание инсулина эритроцитами, мембранами сердечной мышцы и мембранами головного мозга миног в преднерестовый период. По горизонтали - месяцы года. По вертикали справа - специфическое связывание 1251-инсулина в % к радиоактивности в пробе в расчете на 1,5 мг/мл белка мембран или на 1,75 Ю9 клеток/мл, слева -инсулин крови (нг/мл).

Рис.2. Инсулин крови и связывание инсулина мембранами головного мозга и сердечной мышцы горбуши в преднерестовый период.

По горизонтали - стадии зрелости гонад: Ш (море), Ш-1У (река, устье), 1У (река перед нерестом), У (нерест), У1 (после нереста). По вертикали - слева специфическое связывание *251_ЯНСуЛИНа (нг/1,5 мг белка), справа -уровень инсулина в крови по отношению к стадии Ш-1У, принятой за 100$.

уровне инсулина крови показаны на рис.2. Связывание инсулина рецепторами сердечной мышцы в ходе миграции сниналось вдвое на пути от устья реки до точки нереста и возвращалось к ис-

ходному в предгибельной стадии. Связывание инсулина мозговыми рецепторами было наивысшим в морской стадии, снижалось при переходе в реку и продолжало снижаться вплоть до нереста. Динамика в обоих случаях определялась изменением числа связывающих мест, но не Кд.

2.4. Обсуждение результатов. Понижение уровня рецептор-ного связывания инсулина в ходе преднерестовой миграции может быть вторичным: вследствие клеточной деградации (рецепторы эритроцитов миноги) или общего замедления белкового синтеза (включая замедление синтеза рецепторного белка),наблюдаемого при мобилизации в период длительного голодания тканевых компонентов. Однако само по себе снижение базального уровня связывания не объясняет отсутствия реакции рецепторов на изменения в содержании инсулина в крови. Регуляция числа рецепторов основана на регуляции инсулином эндоцитоза рецепторов и их внутриклеточной деградации, но не их синтеза. Из того факта, что инсулин контролирует только соотношение между количеством рецепторов на мембране и внутри клетки, следует, что регуляция уровнем инсулина в принципе возможна в любой точке нерестовой миграции. Тем более показательна независимость связывания от динамики снижения инсулина в этот период и отсутствие реакции рецепторов миног на повышение его уровня. В то же время ясно, что речь не может идти о невозможности регуляции рецепторов вообще у данных видов, поскольку в основе феномена лежа? простые клеточные механизмы. Очевидно, проявлению рецепторного ответа препятствуют факторы, специфичные для данной экологической ситуации. Речь может идти о сочетании таких факторов, как низкая температура среди обитания и замедление тканевого метаболизма в условиях дефицита источников энергии, об опосредованном влиянии на механизм регуляции стресса (у горбуши). Не исключается и появление в преднерестовый период специфических ингибиторов механизма. Экология миног и горбуши в конечной стадии их жизненного цикла такова, что в это время регуляция метаболизма базируется, в частности, на снижении инсу-лярной функции, как за счет снижения продукции гормона, так 13 снижения инсулинового сигнала на рецепторном уровне (что показано в данной работе). Последнее достигается не только

за счет уменьшения числа рецепторов в тканях, но и за счет блокирования их регуляции. Отключение механизма отрицательной связи в системе инсулин-рецепторы в этот период биологически оправдано, но сама возможность такого отключения, подавления регуляторных механизмов экологическими факторами, позволяет ставить вопрос о недостаточной эволюционной закрепленности этого механизма у низших позвоночных.

3. Некоторые аспекты регуляции рецепторов у высших

позвоночных (на материале 'инсулиновых и глюкагоновых рецепторов печени крысы)

Материал по высшим позвоночным включен в работу, исходя из основной ее задачи - дать сравнительную характеристику ре-цепторной функции у позвоночных разного эволюционного уровня, но кроме того он позволяет проанализировать некоторые аспекты лиганд-рецепторных взаимодействий, ранее не затронутых з литературе. Рассмотрены две модели. На модели изолированных гепатоцитов крысы, проинкубированных с глюнагоноц, рассмотрено влияние на рецепторы повышения концентрации лиганда в клеточном окружении. На модели острой ансулинозой недостаточности, вызванной введением крысе антаинсулиновой сыворотки, изучено влияние противоположной ситуации.

3.1. Даун-регуляция глюкагоновых рецепторов изолированных гепатоцитов крысы и влияние на нее инсулина и зпадзрмаль-ного Фактора роста. Предполагать даун-регуляцию глюкагоновых рецепторов можно было на основании таких фактов, как иятер-нализация глюкагона в изолированных гепатоцитах крыс (ваг-razzone et ai.,1984-) и транслокация в клетку ковалетно меченных по *251-глюкагону рецепторов (watanabe et al., 1984-). Тем не менее собственно даун-регуляция этих рецепторов в модельных опытах in vitro показана не была. Задача состояла в демонстрации феномена и в изучении факторов, влияющих на его проявление. Поскольку в основе даун-регуляцни всех пептидных гормонов лежат принципиально сходные механизмы,материал позволял иллюстрировать вопрос о регуляции рецепторов в интересующем нас сравнительном аспекте.

Опиты состояли в преинкубации изолированных гепатоцитов крысы (I.I06 клеток/мл) в трис-буфере с немеченым глюкагоноы

в концентрациях от 10 до 5000 нЫ в течение двух часов при 37°С. Далее клетки отмывали от гормона в закисленном буфере и использовали для определения специфического связывания ■^1-глюкагона. Было показано, что преинкубация приводит к понижению связывания. Эффект зависел от концентрации дативного глюкагона: при 10 нМ связывание *251-глюкагона снижалось на 20%, при 100 нМ на 50%; дальнейшее увеличение концентрации эффекта не увеличивало. При замене трнса на гепес зависимость эффекта от концентрации была другой: для снижения связывания 1251-глюкагона на 20% требовалась преинкубация клеток с 100 нМ нативного гормоне, на 50% - с 5000 нМ. Эффект преинкубации зависел от температуры: снижения связывания метки после преинкубации не наблюдалось, когда она велась при 15 и 23°С, а при 37°С она была более эффективной, чем при 30°С. Опыты по конкурентному вытеснению меченого глюкагона немеченым выявляют в изолированных гепатоцитах крысы один класс связывающих мест с Ед порядка 10"^ М (Уха-нова, Лейбуш, 1988). В настоящей работе показано, что эффект преинкубации обусловлен уменьшением числа связывающих мест в клетках, .тогда какь их сродство к лиганду не меняется.

Имея в виду анализ внутриклеточной судьбы связавшегося глюкагона, были поставлены опыты по влиянию на специфичес-

трс >

кое связывание * 1-глюкагона ингибитора лизосомальной деградации хлорохина в дозе^О,2 нМ. Инкубация клеток с этим агентом приводила к повышению специфического связывания в 2 раза, что свидетельствовало о накоплении недеградированного лиганда в клетке.

Совокупность полученных данных позволила охарактеризовать уменьшение связывания меченого глюкагона клетками после их преинкубации с немеченым как проявление даун-регуляции глюкагоновых рецепторов. Отсутствие эффекта преинкубации при температурах ниже 23°с и максимальное его проявление при 37° давало основание предполагать, что в основе феномена лежит имеющий аналогичные температурные характеристики эндоцитоз рецепторов. Разное проявление феномена при преинкубации клеток с гормоном в трис- и гепес-буфере объясняется тем, что первый в отличие от второго является ингибитором рециклиро-

вания рецепторов (снетку et а1., 1982). Следовательно, фактор рециклирования существенно влияет на проявление даун-регуляции глюкагоновых рецепторов. Чувствительность гепато-цитов к хлорохину указывает на то, что поступающий.в клетки гормон подвержен деградации в лизосомальном конлартменте.Однако относительная непродолжительность экспозиции клеток с глюкагоном (2 часа) позволяет предполагать, что эффект пре-инкубации в данном случае обусловлен влиянием глюкагона на перераспределение рецепторов, а не на их внутриклеточную деградацию.

Поскольку регуляция глюкагоном своих рецепторов в гепа-тоцитах крысы основана на использовании механизмов, аналогичных тем, которые используют в этом случае другие лиганды пептидной природы, возникает вопрос, не наблюдается ли при одновременном действии нескольких лигандов интерференция их эффектов. С целью проверки этого предположения было изучено влияние на даун-регуляцию глюкагоновых рецепторов инсулина, физиологического антагониста глюкагона, и эпидерыального фактора роста, функционально с глюкагоном не сопряженного, но имеющего рецепторы на печени. Дозы каждого из этих лигандов были подобраны с расчетом, чтобы достичь полной оккупации рецепторов. Опыты показали, что инсулин в относительно небольших дозах (5-10 нМ) потенцирует эффект глюкагона, а в субмаксимальных и максимальных (100-200 нМ) - янгибнрует его.В то ке время ЭФР потенцирующим действием не обладал и ингибиро-вал эффект глюкагона только в предельно высоких концентрациях (25 нМ) и лишь в небольшой степени (рис.3).

Можно предположить, что ингибирование убыли глюкагоновых рецепторов большими дозами инсулина обусловлено конкуренцией между инсулиновыми и глюкагоновыми рецепторами за общий путь зндоцитоза, а потенцирующее влияние небольших доз инсулина конкуренцией между инсулиновыми и глюкагоновыми рецепторами за механизм рециклирования (последнее могло бы означать, что пути внутриклеточного процессинга янсулняовых и глюкагоновых рецепторов совпадают, а рецептор зпидериаль-яого фактора роста использует другие пути). Вопрос требует изучения. С физиологической точки зрения опыты представляют интерес в том отношении, что в них выявлен новый аспект от-

Рис.3. Связывание глюкагона изолированными гепатоциташ

крысы и влияние на него преинкубации клеток с глюкагоном, глюкагоном совместно с инсулином и глюкагоном совместно с ЭФР.

По вертикали - специфическое связывание *^51-глюкаго-на в процентах к максимуму. В ранках - концентрации гормонов, с которыми проводили преинкубации. Звездочки - различие достоверно по сравнению с преинкубацией с одним глюкагоном. ¡»Температура преинкубации 37°С. Буфер трис-НС1.

ношений между инсулином и глюкагоном на уровне клетки: повышение уровня инсулина в крови не только тормозит секрецию глюкагона (иивег, 1985),НО и понижает чувствительность к нему печеночной клетки, стимулируя описанным выше способом освобождение ее поверхности от глюкагоновых рецепторов. Это обстоятельство должно быть принято во внимание при рассмотрении вопроса о гормональной регуляции метаболизма в клетках печени.

3.2. Связывание инсулина инсулиновыми рецепторами печени крысы в условиях внутривенного введения анаиинсулиновой сыворотки (АИС). Задача опытов состояла в изучении регуляции рецепторов в условиях острых и обратимых сдвигов в уровне гормона в крови. АИС нейтрализует эндогенный инсулин и вызывает

острую иясулиновую недостаточность, проявлением которой является гипергликемия длительностью несколько часов. На этом фоне изучалась способность печеночных рецепторов инсулина связывать гормон.

Крысам весом 150-180 г в хвостовую вену вводили I мл АИС или такое же количество неиммуяной сыворотки морской свинки (НС). После введения АИС у крыс наблюдалась гипергла-кеиия, пик которой приходился на 2 часа после введения (превышение сахара крови над контрольным уровней в 4-4,5 раза). К 4 часам сахар крова приходил к норме. В промежуток времени от I мин. до 4 часов от момента введения крыс забивали, извлекали у них печень и после промывания ее физраствором гомогенизировали на холоду и получали плазматические мембраны по методу Невилла. Определяли специфическое связывание мембранами *251-инсулияа (буфер Кребс-Рингера фосфатный, рН 7,8, температура 24°С, время инкубации 3 часа).

Как показали опыты, введение АИС приводит к повышению специфического связывания мембранами меченого гормона (максимально в 3 раза), что в принципе могло быть истолковано как проявление ответа рецепторов на снижение базального уровня инсулина, однако два обстоятельства указывали на то, что ситуация на самом деле более сложна. Во-первых, связывание начинало повышаться сразу после введения АИС, то есть по существу до развитая проявлений инсулиновой недостаточности, а, во-вторых, механизм повышения в разное время после введения АИС был различным (табл.5). В первые 30 мин. после введения повышалась аффинность рецепторов, тогда как общее число связывающих мест на мембране было нормальным, через 2 часа после введения и в более поздние сроки повышалось, наоборот,число связывающих мест, тогда как аффинность возвращалась в норме. К 4 часам связывание проявляло тенденцию к снижению, что происходило также за счет снижения числа связывающих мест.

В свете полученных данных возникала необходимость провести анализ влияния АИС на печеночные рецепторы инсулина в экспериментах in vitro. С этой целью были поставлены опыты на изолированных гепатоцитах крысы, которые инкубировали с меченым инсулином в присутствии разных концентраций АИС

Таблица 5 Влияние внутривенного введения АИС на специфическое связывание 1251-инсулина

плазматическими мембранами печени крысы

!

ВИДcSl^e- Константы'аффин^осГи f¡^¡¡ ДЗ®

сыворотки и время после введения

ского свя-

«ТЯ? JSSS JSSÍ -нь я- gj-

(хю9-м-1) (^.ri)иальная кая кая

НС

АИС I мин

5-30

120-150 мин

240 мин

14,0+1,4 (п в 5)

22,0 (п = I) 43,6+3,8 (п » 3) 29,3+4,4 (п в 4) 20,0 (п= 2)

1,0

0,8 9,0+0,7 1,2 7,8

3,0 0,7 0,9

2,7 .10,0+0,9 2,7 7,3 0,6 29,4+4,0 3,8 25,2 1,0 11,0 1,6 9,4

(разведения от 1:100000 до 1:50) и на плазматических мембранах интактных крыс, которые преинкубировали с АИС в разведениях от 1:10000 до 1:10, отмывали при физиологическом рН и затем использовали для определения связывания *251-инсулина (данная модель больше соответствовала ситуации, при которой изучали эффекты АИС в опытах in vivo).

3.3. Связывание инсулина инсулиновыми рецепторами печени крыс при добавлении АИС к изолированным гепатоцитам и плазматическим мембранам интактных крыс. Как в опытах на ге-патоцитах, так и на мембранах было показано, что подобно тому, как это имело место после введения антител крысе, специфическое связывание 1251-инсулина повышается (рис.4).

Повышение связывания меченого инсулина зависело от концентрации АИС и было максимальным при разведениях 1:1000 и 1:5СОО в случае изолированных гепатоцитов и 1:10 и 1.20 в

Рис.4. Влияние АИС и НС на связывание инсулина изолированными гепатоцитаыи крысы. I - контроль (буферный раствор), 2 - НС, 3 -АИС. По вертикали - специфическое связывание *251-инсулина в % к максимуму. По горизонтали - время в мин. Сыворотки в разведении 1:1000. Буфер Кребс-Рингер-гепес. Температура инкубации 37°С. Концентрация клеток 1.10^/мл.

случае мембран.

Повышение связывания при инкубации клеток вместе с АИС и меченым инсулином логично рассматривать как следствие влияния на клетку иммунных комплексов, образующихся в растворе. Однако в случае мембран, когда метка добавляется после отмывания от АИС, возможность образования таких комплексов не очевидна. Однако было показано, что они образуются в этом случае на мембране и что предпосылкой для этого является наличие на интактной печеночной мембране связанного с рецепторами инсулина, с которыми антитела могут вступать во взаимодействие. В литературе присутствие такого инсулина постулировалось на основании опытов с диссоциацией связанного с печеночными мембранами инсулина, в которых показано существование медленно диссоциируемого компонента (Donner, Corin, 1^80). В нашем случае на это указывала иммунноспецифичность

эффекта преннкубации: отмытые от АИС мембраны были способны к повышенному связыванию меченого инсулина только в том случае, если для преннкубации использовали АИС к свиному инсулину. Применение для этих целей других иммунных и неиммунных сывороток эффекта не давало. В частности, эффект не был полу-чан при обработке мембран АИС к инсулину горбуши, содержащей антитела, с которыми практически н,е имеет перекреста инсулин млекопитающих (Русаков, Бондарева, 1979).

Итак, на мембране антитела удерживаются за счет связывания их инсулином, в свою очередь связанного со своими рецепторами. Заякоривание в таких тройных комплексах даже небольшого количества двухвалентных антител в условиях использования для преинкубации высоких концентраций АИС способствует образованию „сетевых структур" и делает неэффективным отмывание. В этом случае добавление к мембранам после процедуры отмывания меченого инсулина приведет к тем же последствиям, что и добавление АИС и меченого инсулина одновременно.

Убедившись в возможности взаимодействия рецептора с иммунными комплексами, следовали показать, что взаимодействие этих комплексов с рецептором возможно только через инсулин. С этой целью было изучено влияние АИС на диссоциацию двух связанных с мембранами инсулинов: ^I-инсулина свиньи и *^1-инсулина горбуши. АИС резко замедляла диссоциацию первого (увеличивая полувремя Диссоциации с lb до НО минут) и не влияла на диссоциацию второго. Инсулин горбуши в отличие от инсулина свиньи не взаимодействует с использованной в этих опытах АИС к инсулину млекопитающих (Русаков, Бондарева,1979), следовательно, в опытах с этим инсулином иммунные комплексы образоваться не могли. Следовательно, образование таких комплексов есть условие влияния АИС на диссоциацию связанного инсулина, то есть на свойства рецептора.

Принципиальным был вопрос о механизме повышения связы-

трс

вания А4-°1-инсулина при действии АИС in vitro. Как показали опыты по конкурентному вытеснению связанного с мембранами, обработанными АИС, ^51-инсулина немеченым инсулином, таким механизмом является повышение аффинности связывающих мест. Повышения числа связывающих мест не наблюдалось ни при каких разведениях АИС (табл.б).

Таблица 6

TPS

Специфическое связывание 1-инсулина плазматическими мембранами печени крысы, ' преинкубированными с НС и с АИС

Вид сыворотки Константы аффинности Максимальная емкость связывания (иола х Ю"13/0,2 мг белка менбран)

высокое сродство хЮ9 Г1 низкое сродство хЮ8 Г1

НС 0,4 0,5 13,4

АИС

1:500 0,8 1,0 13,4

1:100 1,0 I,? 12,6

1:20 1,1 2,0 14,0

Итак, опыты показали, что при взаимодействии инсулина с антителами образующиеся иммунные комплексы способны изменять связывающие характеристики инсулинового рецептора печена крысы, именно повышать его константу сродства. Механизм такого повышения не вполне ясен. По нашему мнению, существенно то, что при действии АЙС с рецептором связывается не инсулин,как таковой, а инсулин в комплексе с антителом. Утяжеление лиган-да (и, вероятно, изменение его информации) вторично может вызвать изменение конформации рецептора, а также изменение его взаимосвязей с иикроокружениея в мембране. Полученные данные представляют интерес с точки механизмов изменения аффинности инсулинового рецептора в печени крысы, однако,имея в виду задачу работы, более существенно подчеркнуть, что она позволяют объяснить феномен повышения аффинности печеночных рецепторов инсулина сразу после введения АЙС крысе. Очевидно, и в этом случае причиной изменений свойств рецепторов и повышения на этой основе связывания лиганда было взаимодействие рецепторов с иммунными комплексами, являющимися результатом связывания антителами эндогенного инсулина. Можно предполо-кить, что этот механизм имеет значение для элиминации комплексов из кровяного русла и в этом отношении полученные данные представляют интерес для дальнейшего анализа. Однако,

не менее существенно то, что in vitro ни на клетках,ни на мембранах не воспроизводился более поздний эффект, вызываемый введением АИС крысе, именно повышение числа рецепторов. Отставлевяость этого эффекта во времени, появление его на пике гипергликемии и исчезновение по мере нормализации сахара крови позволяют видеть в нем регуляторвый феномен,ответ рецепторов ва острую кнсулнновую недостаточность как таковую. Если это так, то следует прийти к выводу, что относительно кратковременное понижение базального уровня инсулина в крови крыс (обусловленное в данном случае не только его элиминацией из кровотока в составе иммунных1 комплексов, но и истощением Б-клеток после их первоначальной стимуляции после введения АИС) способно привести к двухкратному повышению числа инсулинсвязывающих мест на мембране печецочных клеток. Судя по быстроте развития феномена, речь идет о перераспределении рецепторов - увеличении их числа на поверхности клетки за счет уменьшения их внутриклеточного пула. Возможные механизмы этого - замедление инсулинзависимого эндоцитоза рецепторов и, по-видимому, повышенное их рециклирование. Существенно, что это достигается манипуляциями с физиологическими концентрациями инсулина. Восприимчивцрть рецепторного пуда к относительно небольшим флюктуацням уровня инсулина указывает на важную роль рецепторов в регуляции чувствительности печеночной клетки к этому гормону.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инсулиновая гормональная система возникла задолго до появления позвоночных и уже у самых примитивных из них, кругло-ротых, представлена всеми своими компонентами: инсулия-проду-цирующими клетками в стенке кишки, циркулирующим в крови инсулином, клетками-мишенями (Плисецкая, 1975; barsen, 1976 ? Eadin, 1982). За время эволюции позвоночных система претерпела определенные преобразования, расширившие ее функциональные возможности. В немалой степени этому способствовала миграция инсулия-продуцирующих клеток из стенки кишки и объединение их в органах Лангерганса, что создало условия для значительного повышения массы островковой ткани и явилось предпосылкой для создания механизмов, обеспечивающих более тонкую регуляцию секреции гормона (Gortaan et al., 198З).

Задача данной работы состояла в том, чтобы осветить события, которые происходят в ходе эволюции на периферия системы,именно на уровне инсулин-рецепторных взаимодействий.

Как показало исследование, инсулиновый рецептор уже у нруглоротых обладает всеми качествами,необходимыми для адекватного восприятия инсулинового сигнала - высоким связывающим сродством и высокой селективностью.Сопоставленив свойств рецепторов от круглоротых до млекопитающих не выявило заметной динамики в изменении этих свойств, что позволяет говорить о высокой консервативности инсулин-связывающей функции рецептора позвоночных, функциональная консервативность на- . кладывается на структурную, подтверждаемую не только одинаковой доменной организацией рецептора у позвоночных, но и обнаружением сходного по структуре рецептора у дрозофилы.

Функциональная консервативность инсулинового рецептора есть та постоянная, которая должна быть пронята во внимание при анализе инсулин-рецепторных взаимодействий у позвоночных. Переменной здесь являются свойства самого инсулина,об-. условленные возможностью появления з его иолекуле в ходе эволюции аминокислотных занен. В общей, в ходе эволюции позвоночных биологическая активность'авсулинов повышается, но разброс здесь велик и отдельные инсулшш могут различаться по биологической активности в десятки раз. Однако означает ли это, что иноулиновая регуляция у данного вида находится в прямой зависимости от особенностей его инсулина? Ответить на этот вопрос следует отрицательно, в частности, потому, что еще одной переменной является экспрессия инсулиновых рецепторов у разных видов. Так в нашей исследовании выявлено относительно меньшее число инсулинсвязывающах мест в тканях кур по сравнению с тканями крысы, что логично увязать с значительно более высокой биологической активностью инсулина птиц по сравнению с активностью инсулинов млекопитающих. Этот, так же как и другие приводимые в литературе факты, позволяет видеть в рецепторах механизм,вносящий существенные коррекции в действие инсулина в условиях целого организма.

Функциональная консервативность инсулинового рецептора не снимает вопроса о роли рецепторов в расширении функциова-льных возможностей гормональной системы в ходе эволюции позво-

ночных. В этом отношении существенный является повышение числа инсулинсвязывающих мест в некоторых тканях-шшенях высших позвоночных по сравнении с низшими. Необходимо при этом подчеркнуть, что инсулины млекопитающих обладают более высокой метаболической активностью, чем инсулины миксины, горбуши и скорпены, то есть феномен повышения связывания в данном случае не может быть расценен как компенсаторный. Объективно к повышению эффективности системы приводит также консервативность ответа рецепторов на повышение температуры: наличие максимальной скорости связывания при 30-37°С у холодно^ и теплокровных животных ставит последних- в более выгодные условия в смысле стабильности кругооборота рецепторов.

Характеристика рецепторов как компонентов гормональной системы предполагает изучение их регуляции. Наиболее ярким проявлением регуляции рецепторов в рамках системы у высших позвоночных является даун-регуляция.В работе изучено несколько проявлений данного вида регуляции у высших животных. На изолированных гепатоцитах крыс продемонстрирован феномен даун-регуляции глюкагоновых рецепторов, в основе которого лежат механизмы, аналогичные тем, что и для даун-регуляции других пептидных лигандов. В этих опытах показано, что общность механизмов может быть причиной своеобразной интерференции,когда даун-регуляция рецепторов одного лиганда может влиять на проявления ее рецепторами другого. Существенно, что такого рода взаимоотношения установлены для рецепторов инсулина и глюкагона, гормонов-антагонистов, работающих в сопряжении друг с другом. Далее показано, что феномен даун-регуляции,но в обратном его проявлении может быть получен в условиях острой и обратимой инсулиновой недостаточности у крыс, достигаемой однократным введением антиинсулиновой сыворотки. Возможность повышения числа рецепторов при манипуляциях, приводящих к относительно кратковременному снижению базального уровня инсулина в крови, свидетельствует о том, что по крайней мере в случае печени крысы рецепторноыу фактору принадлежит серьезная роль в регуляции инсулинового сигнала на клеточном уровне. В этих же опытах выявлен своеобразный феномен повышения аффинности инсулиновых рецепторов в печени при связывании ими комплексов инсулин - антитело, заслуживающий

дальнейшего экспериментального анализа.

физиологнчность регуляции рецепторов уровнен гордона, показанная в литературе и выявленная на нашей эксперимвнталь-ноы материале, обусловила необходимость исследовать вопрос на низших позвоночных. В качестве модели быле выбрана естественное голодание в преднерестовый период у миноги и горбуиц характеризующееся, в частности, снижением уровня инсулина з их крови. Однако в этом случае, так же как и при введении миноге высоких доз инсулина, ответа' со стороны рецепторов получено не было и, более того, в преднерестовый период выявлялась тенденция к понижению связывания инсулина на фоне понижения его уровня в крови. Естественно, что показанное отсутствие регуляции рецепторов не означает, что она у назиих позвоночных невозможна, но мы ниееы дело со своеобразной экологической ситуацией, в которой она не проявляется.Инерт-ность рецепторного ответа в период преднерестового голодания выгодна организму: пониженная потребность в инсулине в условиях истощения метаболических ресурсов реализуется как на уровне секреции, так я на уровне потребления клеткой инсулина. Тем не менее, представляет интерес сама возможность подавления экологическими факторами р'егуляторного феномена,' в основе которого лежат фундаментальные клеточные ыеханизма(рэ-гулируеше инсулином эндоцитоз рецепторов и их внутриклеточная деградация). По нашему мнению, это указывает на определенную слабость функциональной сиотеиы у низших позвоночных. Если это так, то прогресс состоял в вовлечении функционально консервативного и эволюционно древнего инсулинового рецептора в более совершенную систему взаимосвязей с лигандом. Вероятно, ключевым фактором в этом был переход к теплокровности, создающей условия для повышения скорости связывания ли-ганда, ускорения кругооборота рецепторов и повышения их синтеза как следствие общего повышения уровня тканевого метаболизма.

ВЫВОДЫ

I. Инсулинсвязывающие места в тканях миноги, горбуши, скорпены, куры и крысы сходны по таким параметрам, как зависимость связывания от рН и температуры, форма графика Скзт-

чарда (криволинейного во всех случаях), величина раввовесных конотант связывания. У всех видов и во всех исследованных ткаякх мявлены два класса связывающих мест с равновесными констаятаии диссоциации порядка Ю~9 и Ю-8 К.

2. При связывании инсулинов разного происхождения преимущество имеют инсулины с более высокой метаболической активностью, а не более близкие виду, не котором изучается связывание. Сродство связывающих мест к инсулинам свиньи, горбуши, скорпены и миксины убывает в той же последовательности,в каком убывает активность гормонов.

3. Число меот связывания инсулина-? кур меньше, чем в соответствующих тканях (печень, скелетная мышца) крыс.Это стоит в связи с более высокой биологической активностью инсулина птиц по сравнению с инсулинами млекопитающих..

4. Количество инсулинсвязывающих мест в печеночной, мышечной и мозговой тканях низких позвоночных (минога, костис-хые рыбы) в несколько раз ниже, чем в соответствующих тканях крысы при наличии у низших позвоночных инсулинов с меньшей биологической активностью, чем у млекопитающих. Количество связывающих мест в. эритроцитах не находится;в какой-либо связи с эволюционным положением вида.

5. У низших позвоночных (минога, горбуша) снижение инсулина в крови в динамике преднерестового голодания не вызывает повышения связывания инсулина тканями, а в некоторых случаях (эритроциты миноги, мозговые мембраны горбуши) уровень связывания определенно снижается.

6. Введение миногам, как входящим в реку на нерест, так и зимующим, инсулина в дозе 2 ОЩ на кг/веса не приводит к понижению связывания инсулина мозговыми рецепторами и рецепторами сердечной мышцы, несмотря на повышение в десятки раз уровня инсулина в крови.

7. При преинкубации изолированных гепатоцитов крысы с немеченым глюкагоном в течение 2 часов при 37°С выявляется феномен даун-регуляции глюкагоновых рецепторов: уменьшение в отмытых клетках числа связывающих мест, зависящее от концентрации глюкагона и температуры преинкубации.

8. Даун-регуляцию глюкагоновых рецепторов в гепатоцитах крысы усиливают относительно небольшие (5-10 нМ) концентра-

ции инсулина, но не эпвдермальннй фактор роста. В концентрациях, необходимых для полной оккупации собственных рецепторов, инсулин и в меньшей степени ЗФР частично ингибяруют даун-регуляцию рецепторов глюкагона.

9. Внутривенное введение крысам антииясулиновой сыворотки приводит к повышению сахара в крови и значительному повышению связывания -^I-инсулина плазматическими мембранами печени, извлеченной в разное время после введения. Повышение связывания в первые 30 мин. после введения АИС обусловлено повышением аффинности инсулинсвязывающих мест, а через 2 часа и поззе - повышением их числа без изменения сродства.

10. Повышение связывания ^I-инсулина наблюдается пра добавлении АЙС к изолированным гепатоцитан или плазматическим мембранам печени интактных крыс. Повышение в данной случае обусловлено только повышением аффинности связывающих мест, но не их числа и обусловлено взаинодействиен печеночных рецепторов инсулина с комплексами инсулин - антитело.

11. В ходе эволюции позвоночных имеет место повышенно эффективности инсулин-рецепторного взаимодействия за счет: а) повышения числа инсулинсвязывающих мест в тканях-мииенях высших позвоночных по сравнению с низшими; б) повышения око-рости связывания и кругооборота рецепторов при переходе к теплокровности; в) более всокой регулируемости рецепторного пула уровнем гормона у высших позвоночных.

Список опубликованных работ по материала?! дассертацип

1. Лейбуш Б.Н. Взаимодействие инсулина с его рецепторами в

шшцах: специфическое связывание инсулина-^^I изолированной диафрагмой крысы. - Доклады АН СССР, 1976,т. 226, с,964-967.

2. Plisetskaya Е., leibush В.И., Bondareva 7. The secretion

of insulin and its role in cyclostome3 and fishee. -Ins Ehe evolution of pancreatic islets. Ed. Ъу Grillo I.A.I., belbson I.., Epple A. Pergamon Press, Oxford, 1976, p.251-269.

3. Ieibson i., Plisetskaya В., beibush В. The coaparatlve

study of mechanism of Insulin action on muscle earbo-

hydrate metabolism. - In» The evolution of panoreatio islets. Ed. by Orillo, T.A.X., Leibson Ъ., Bpple A. Pergamon Press, Oxford, 1976, p.345-362.

4. Лейбсон I.Г., Плисецкая Э.И., Лейбуи Б.Н. Сравнительный

подход при изучении действия инсулина на углеводный обмен мышц. - В кн.: Эволюционная эндокринология поджелудочной железы (под ред. Э.м.Плисецкой, Л.Г.Лейб-сона). Л., Наука, 1977, с.185-190.

5. Лейбуш Б.Н., Бондарева В.М. Взаимодействие инсулина с его

рецепторами в мышцах: специфическое связывание инсулина-125! плазматическими мембранами скелетной мышцы крысы: - Пробл.эндокрин. Москва, 1979, т.25, fö 3, с. 57-62.

6. Лейбуш Б.Н. Сравнительное изучение связывания инсулина

скорпены scorpaena porous и инсулина свиньи специфическими рецепторами мышечных плазматических мембран. -Журн. эвол.биох.физиол., 1979, т.15, К» 5, с.491-495.

7. Лейбуш Б.Н., Бондарева В.М., Лейбсон Л.Г. Свойства рецеп-

тора инсулина по донным сравнительного изучения. - В кн.: 2-й Всесоюзный съезд эндокринологов. Тезисы секционных докладов. Л., 1980, C.3IS-3I7.

8. Лейбуш Б.Н., Бондарева В.И. Инсулиновый рецептор плазмати-

ческих мембран клето^ печени морского ерша scorpaena porous в сравнении с рецептором млекопитающих. - Журн. эвол.биох.физиол. 1981, т.17, № 2, с.141-147.

9. Лейбуш Б.Н., Бондарева В.М. Анализ инсулин-рецепторных вза-

имодействий в плазматической мембране печени крыс с использованием антител к инсулину. - Биохимия, 1982, т.47, 1 10, с.1687-1694.

10. Лейбуш Б.Н., Бондарева В.М. Модуляция свойств инсулиново-

го рецептора антителами к гормону. В кн.: 1-й Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов стендовых сообщений. М., 1982, т.1У, с.123.

11. Лейбуш Б.Н. Рецепторы инсулина в эволюции позвоночных. -

В кн.: Вопросы эволюционной физиологии. Восьмое совещание по эволюционной физиологии. Л., Наука, 1982, с.17^

12. Лейбуш Б.Н. Инсулиновые рецепторы головного мозга в эволю-

ции позвоночных. Журн. эвол.биох.физиол., 1983, т.19,

' 16 с.407-413.

13. Лейбущ Б.Н., Колычев А.П., Бондарева В.М. Инсулиновые

рецепторы эритроцитов в онтогенезе кур. - В кн.: Тезисы 1-го съезда белорусских геронтологов. Минск,

1983, с.104.

14. Лейбуш Б.Н., Колычев А.П., Бондарева В.М. Инсулиновые

v рецепторы эритроцитов в онтогенезе кур. - Онтогенез,

1984, т.15, й 3, с.290-296.

15. Кузнецова Л.А., Лейбуш Б.Н., Колычев А.П., Перцева М.Н.

Гормональные рецепторы эмбриональной мышцы. - В кн.: Тезисы 5-й Всесоюзной конференции по биохимии шшц. Тбилиси, 1985, с.59.

16. Лейбуш Б.Й., Бондарева B.Ii., Уханова М.В. Отсутствие ре-

гуляции числа рецепторов инсулина уровнем гормона у балтийской миноги. - В кн.: Вопросы эволюционной физиологии. Девятое совещание по эволюционной физиологии. Л., Наука, 1986, с.59.

17. Лейбуш Б.Н. Инсулиновый рецептор, его структура и органи-

зация. - В кн.: Физиология гормональной рецепции (под ред. В.Г.Шаляпиной), Л., Наука, 1986, с.165-201.

18. Лейбуш Б.Н., Бондарева В.М. Рецепторы инсулина речной ми-

ног я LantpetTa fluviatiüa в период преднерестового голодания. - 1урн. звол.биох.физиол., 1987, т.23, № 2, с.193-198.

19. Лейбуш Б.Н., Солтицкая Л.П., Уханова М.В. Реакция инсули-

новых рецепторов миноги lampetra fluviatilisHa гипер-инсулинемшо, вызванную введением гормона. - Журн.эвол. биох.физиол., 1987, т.23, № 4, с.468-472.

20. Колычев А.П., Лейбуш Б.Н. Связывание инсулина рецептора-

ми плазматических мембран скелетных шшц кур в онтогенезе. - Онтогенез, 1987, т.18, tö I, с.59-66.

21. Бондарева В.М., Лейбуш Б.Н. К вопросу об инсулиновой си-

стеме мозга. - В кн.: Фундаментальные достижения ней-рохимии - медицине. Горький, 1987, с.94-95.

22. Колычев A.D., Лейбущ Б.Н. Связывание инсулина рецептора-

ми плазматических мембран печени кур в онтогенезе. -Онтогенез, 1988, т.19, fe I, с.59-61.

23. Уханова М.В.,-Лейбуш Б.Н. Связывание глюкагона изолиро-

ванныни гепатоцитами кур. - Журн.эвол.биох.физиол., 1988, т.24, Кг 4, с.509-515.

24. Бондарева В.М., Лейбуш Б.Н., Русаков Ю.И. Выделение ин-

сулина из ткани мозга крыс и его биологическая характеристика. - Нейрохимия, 1988, т.7, № 2, с.268-273.

25. Бондарева В.М., Лейбуш Б.Н. Инсулин мозга: получение,би-

ологическая характеристика, ^связывание с рецепторами. - в Кн.: П Всесоюзная конференция по нейронаукам. Тезисы докладов. Киев, 1988, с.92-93.

Ш-340// . Подписано к печати /5. О/. 29 . Заказ 30

Тираж ЮО , формат бумаги 60x84 1/16, печ.л. Бесплатно,

ПО - 3 "Ленуприздата".

191104 Ленинград, Литейный пр., дом № 55.