Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Осфрадиальные сенсорные системы моллюсков
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Осфрадиальные сенсорные системы моллюсков"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
КАМАРДИН
Николай Николаевич
ОСФРАДИАЛЬНЫЕ СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ МОЛЛЮСКОВ
03.00.13 - физиология человека и животных
АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 1998
Работа выполнена на кафедре общей физиологии Биолого-ночвен факультета Санкт-Петербургского государственного университета
Научный консультант;
академик А.Д. Ноздрачев Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН Я.И. Старобогато! доктор медицинский наук, профессор Д.П.Матюшкин доктор биологических наук, профессор М.И. Сологуб
Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН
Защита состоится "_" _ 1998 г. в 16 часов на засед;
диссертационного совета Д 063.57.19 по защите диссертаций на соиск ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербурп государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская ] 7/9, ауд. 90).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горь Санкт-Петербургского государственного университета.
Автореферат разослан "_" _1998 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук
Н.Д.Ещенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Среди важнейших проблем современной шогии большое место занимают исследования регулирующих и гегрирующих систем, обеспечивающих целостность организма и его гагособительные реакции. Сравнительно - физиологические исследования 1вной, мышечной и сенсорных систем позвоночных и беспозвоночных вотных привели к заключению о принципиальном сходстве ювополагающих физиологических механизмов [Коштоянц, 1950; Сахаров, 4; Крепе, 1979; Орбели, 1979; Костюк, Крышталь, 1981; Шеперд, 1987; гников и др., 1994; Kandel, 1976]. В этой связи изучение сенсорных систем позвоночных животных представляется весьма актуальным, так как они толняют в поведении принципиально аналогичную сенсорным системам .воночных функцию, а также представляет большой интерес в сравнителыю-люционном аспекте, способствуя решению основной задачи, поставленной >ед эволюционной физиологией - познание путей функциональной эволюции ■анизмов [Гинецинский, 1970; Орбели, 1979].
Важным звеном в деятельности нервной системы позвоночных и позвоночных животных является ганглий, который выполняет гегративную функцию, являясь местом конвергенции сенсорной информации амыкания рефлексов [Шеррингтон, 1969]. Академик А.А.Ухтомский доказал чествование принципа конвергенции для всех уровней нервной системы томский, 1978]. В настоящее время структура синаптических связей и шологические свойства отдельных нейронов и нейронных популяций ледованы в ганглиях беспозвоночных [Куффлер, Николе, 1979; Kandel, 1976; 9; Alkon et al„ 1978; Willows, 1978; Benjamin, 1983; Syed, Winlow, 1991 и др.] и воночных животных [Черниговский, 1960; 1967; Скок, 1970; Ноздрачев, 8; Ноздрачев, Пушкарев, 1980; Ноздрачев, Чернышева, 1989; Скок, Иванов, 9; Фатеев, 1998].
В различных группах животных повторяются общие черты организации вных центров, например, наличие сенсорных, моторных и интернейронов, наружено удивительное сходство в развитии ганглиев моллюсков и ганглиев сферической нервной системы позвоночных [Bulloch, 1985]. Именно тому беспозвоночные, и в частности, моллюски, стали классическим >ектом для исследования многих фундаментальных вопросов нервной тельности.
В жизнедеятельности живых организмов особую роль играет химичеа состав внешней и внутренней сред. Знание механизмов анализа ср( животными зачастую определяет полноту наших представлений об поведении. У водных животных существуют различные рецепторные систи позволяющие отслеживать изменяющиеся параметры среды и химичес сигналы [Бронштейн, 1977; Акоев, Алексеев, 1985; Акоев, Андрианов, И Мантейфель, 1991; Atema, 1989]. У моллюсков таким органом являе осфрадий, гомологичный у всех классов типа Mollusca. Однако, мор физиологические особенности этого уникального в животном м рецепторного образования, объединяющего в себе свойства рецептора и цен первичной обработки сигнала, изучены еще недостаточно. Мало представл< в литературе и данные о функциональной эволюции осфрадия в различ1 группах Mollusca.
Анализу отмеченных выше проблем и ряда связанных с ними вопро посвящено настоящее исследование.
Цель и задачи исследования. Целью выполняемой работы явил сравнительное морфофизиологическое исследование осфрадиаль рецепторной системы у представителей Polyplacophora, Bivalvia и Gastropt Исследование включает в себя описание ультраструктурной организа осфрадиальной рецепторной поверхности и типов рецепто] электрофизиологических свойств клеток и особенностей синаптичес контактов в осфрадиальных ганглиях и ганглиях ЦНС.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительный ультраструктурный анализ осфрадиев i основных групп моллюсков (Polyplacophora, Bivalvia, Gastrope отличающихся по степени сложности и функциональной значимс осфрадиев.
2. Проанализировать наиболее общие, повторяющиеся у различных гр особенности организации рецепторной поверхности и сенсорных элементе осфрадиях.
3. Оценить основные пути эволюции рецепторных клеток осфрадиального ганглия у моллюсков. Исследовать особенности нейрогене синаптогенеза в осфрадии моллюсков с помощью метода культуры ткани.
4. Изучить электрофизиологические свойства осфрадиальных органов разномодальных внешних воздействиях. Проанализировать физиологичеа фармакологически свойства мембран нейронов осфрадия.
5. Выяснить возможные центральные нейрональные проекции осфрадия в [глии ЦНС. Оценить роль осфрадиев в адаптивном поведении моллюсков.
6. Оценить участие аденилатциклазной системы и ионов Са2+ в генерации шарного рецепторного потенциала осфрадия.
Научная новизна результатов. Впервые проведен комплексный анализ рфологических, ультраструктурных и физиологических особенностей зрадиев трех основных групп типа Mollusca. Показано, что на основе «»дифференцированной интраэпителиальной рецепторной клетки, вдающей полимодальной чувствительностью, в процессе эволюции эмируются специализированные, имеющие особую ультраструктурную анизацию, рецепторные органы, участвующие в пищевом и сигнальном $едении животных. Выявлены основные закономерности эволюции (спторных клеток и всего органа. Особая роль в этом процессе отводится )рмировавшемуся осфрадиальному ганглию, синаптическая организация "орого напоминает организацию обонятельной системы насекомых и тоночных животных. Впервые получены органотипические культуры орадиеп пресноводных и морских моллюсков, ультраструктурный анализ юрых подтвердил обнаруженные in vivo особенности нейрогенеза зрадиального ганглия. Получены электрофизиологические данные о ютвительности осфрадиев к аминокислотам, мочевине, сахарам и гнантной воде. Выяснено, что в осфрадиальном ганглии в результате (вичной обработки информации выделяются качественные и количественные •актеристики воздействия. Впервые идентифицированы по уфологическим, электрофизиологическим и фармакологическим 'актеристикам клетки, расположенные на поверхности осфрадия. югистрированы мембранные токи, вызванные воздействием химических и (иаторных веществ. Выявлено, что в процессе генерации ПД участвуют ионы
а образование продленных ПД происходит за счет нарушения выходящих иевых токов. Входящий кальциевый ток формируется за счет хжопороговых электровозбудимых кальциевых каналов L-типа. Показана гь Са2+ и аденилатциклазной системы в генерации суммарного рецепторного :енциала осфрадия. Продемонстрирована реакция идентифицированных ¡ронов, ответственных за дыхание, и каудо-дорзальных клеток на муляцшо осфрадия. Выяснено, что осфрадий может модулировать сателъный ритм и релизинг гормона овуляции у прудовика. В поведенческих периментах выявлена роль осфрадия в реакции хоминга у литоральных
моллюсков, принадлежащих к различным систематическим группам. Показ высокая степень корреляции между питанием представителей Caenogastropoc, строением их осфрадиев.
Научно-практическая ценность. Результаты работы имеют болы значение для формирования целостного представления об эволюции функ) хеморецепторных образований у животных. Они необходимы для пополне наших знаний о механизмах нейрофилогенеза, в основе которого ле: онтогенетические особенности его формирования. Наряду с высо пластичностью выделяются общие принципы функционирования структурные модули, повторяющиеся и не меняющиеся на протяже; миллионов лет эволюции моллюсков. Это формирование обособленн эпителиального участка, объединяющего опорные клетки, организован™ виде зон и связанные с рецепторными клетками нескольких морфологичес типов. В непосредственной близости располагается периферический ганп где осуществляется первичная обработка сенсорной информации, результа которой могут быть локальные рефлексы на уровне самого рецепторн органа. Установленные в исследовании принципы нейрональной организа осфрадиального органа, основанные на принципе параллелизма, дол> присутствовать и присутствуют в других хемосенсорных органах, что позвс в будущем разрабатывать методы диагностики и лечения врожденны приобретенных нарушений в работе хемосенсорных систем человека. Кр того, результаты исследования могут быть использованы в моделировали создании искусственных хемосенсоров и технических устройств анаг качества воды.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Гипотеза об исходной полимодалыюй чувствительности осфрад! моллюсков, которая в процессе эволюции становится специализирован!« преобладанием 1-2 модальностей. Этот процесс сопровождается обособлен рецепторных и опорных клеток, которые формируют разделенный на з эпителиальный орган со сложно устроенным периферическим ганглием.
2. В основе трансдукции химического стимула в осфрадиальных нейрс лежат известные для насекомых и позвоночных животных механизмы лиг рецепторных взаимодействий, опосредуемых кальций-зависи аденилатциклазной системой. В генерации распространяющегося потенщ участвуют потенциал-зависимые входящие кальциевые Ь-токи.
3. Осфрадаальный ганглий, состоящий из различных клеточных [уляций, является периферическим центром обработки сенсорной юрмации, имеющим сложную синаптическую организацию, включающую колько типов синаптических контактов с различными медиаторами и ропептидами. Импульсация осфрадиального нерва направляется в [ьшинство ганглиев ЦНС и содержит информацию о качестве стимула и его мениых параметрах.
4. Формирование сложной синаптической структуры осфрадиального глия является следствием генетически закрепленных механизмов, связанных нейрогенезом этого рецепторного органа, и воспроизводится в анотипической культуре.
5. Осфрадий участвует в регуляции многих жизненноважных для глюсков функций, включая дыхание, осморегуляцию, размножение, касание убежища.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на vi научном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1978); 2-ой союзной конференции по биологии шельфовых зон (Владивосток, 1982); ференции молодых ученых МГУ (Москва, 1983); 2-ом Всесоюзном ещании по химической коммуникации животных (Москва, 1983); V союзном симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Пущино, 1984); союзной конференции "Физиология медиаторов. Периферический синапс" зань, 1984); IX National Congress of Anatomy, Histology and Embriology :ven, Bulgary, 1985); Всесоюзной конференции "Простые нервные системы и значение для теории и практики" (Казань, 1985); Всесоюзном совещании ория параллелизмов А.А.Заварзина и современная биология" (Ленинград, 6); XIII Всесоюзном совещании по изучению моллюсков (Ленинград, 1987); ,1 Всесоюзном совещании по химической коммуникации животных (Москва, 9); "Химические сенсоры" (Ленинград, 1989); Экологической конференции У (Ленинград, 1989); X Всесоюзном совещании по эволюционной иологии (Ленинград, 1990); Всесоюзной конференции "Простые нервные темы" (Минск, 1991); IX Всесоюзном совещании по изучению моллюсков нинград, 1991); YII Всесоюзном симпозиуме "Механизмы сенсорной епции" (Москва, 1992); XI International Malacological Congress (Siena, Italy, 2); International Symposium "Mechanisms of Sensory Chemoreception in tebrates" (Пущино, 1992); Regional Meeting of the International Society for ;rtebrate Neurobiology (ISIN) "Simple Nervous System" (Пущино, 1994); 8th
Symposium on Invertebrate Neurobiology (Tihany, Hungary, 1995); IV IBRO W Congress of Neuroscience (Kyoto, Japan, 1995); 25th Gottingen Neurobiol Conference (Gottingen, Germany, 1997); Regional Meeting of the Internati< Society for Invertebrate Neurobiology (ISIN) "Simple Nervous System" (Mora 1997); IV Conference of Hungarian Neurobiology Society (Godollo, Hungary, 19 Neurotox'97 (Aarhus, Denmark, 1997); V Conference of Hungarian Neurobiol Society (Debrecen, Hungary, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано в отечествен и зарубежной печати 35 работ, отражающих основные положения научн исследования.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 403 страни машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описа методических приемов и объектов исследования, девяти i экспериментальной работы (каждая из которых содержит неболы литературную предпосылку, результаты исследования и заключитель коментарии), заключения, выводов и списка литературы, включающего наименований, в том числе 118 отечественных и 387 иностранных источни: Работа иллюстрирована 3 таблицами и 117 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Методические приемы и объекты исследования
Для исследования электрофизиологических свойств осфрадиаль органов и одиночных нейронов использовались вне- и внутриклеточ отведения с одновременной регистрацией и компьютерным анали импульсных процессов. Выходы обоих усилителей соединялись с 4х-каналь; осциллографом и параллельно на независимые входы АЦП типа PCL81i (США), вмонтированного в персональный компьютер Pentium-166.
Регистрация токов осфрадиальных нейронов осуществлялась конфигурации целая клетка (whole cell) [Hamill et al., 1981]. Для этой i использовался усилитель Axopatch 200В (Axon Instruments, CII соединенный с осциллографом Tektronix 2214 и аналого-цифро конвертером ADH3110 в компьютере IBM АТ-286. Электроды изготавлш из боросиликатного стекла диаметром 1,3 мм (World Precision Instruments методом двухэтапного вытягивания на пулере типа Korf-730 (США). П
гягивания кончик пипетки оплавлялся. Сопротивление заполненного ктрода составляло 5-7 мОм при диаметре кончика 1,5-3,0 мкм. Плотный такт электрода с клеткой имел сопротивление 3-5 Юм. Установление :окоомного контакта в положении "целая клетка" осуществляли коротким пульсом отрицательного давления или толчком тока в 1,3 мА, подаваемого >ез усилитель. Мембранные токи регистрировались при значении фильтра 2Гц.
Морфологическая часть исследования проводилась несколькими годами, включая ретроградное окрашивание осфрадиальных нейронов 5(6)->боксифлуоресцеином по методу, предложенному Дж.Кеменешем (Kemenes et 1991), и внутриклеточное окрашивание тем же красителем череч пэтч-гетку. Для светооптических исследований осфрадиев и органотипических [ьтур применяли метод Бильшовского (Меркулов, 1969). Для ТЭМ и СЭМ ктронно-микроскопических исследований применяли фиксацию в 2.5% ¡творе глутальдегида на 0,1 молярном фосфатном буфере с последующей [таксацией в 1,3% OsC>4. После обезвоживания в этаноле осфрадии заливали в шдит или Эпон-812. Ультратонкие серийные срезы готовили на микрототоме B-III, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и )сматривали в микроскопе Hitachi Н-300. Для СЭМ после обезвоживания ¡параты подвергали сушке при критической точке в приборе НСР-2 фирмы achi. Цитохимическое выявление кальция проводили с помощью эоантимоната (Wick, Hepler, 1982) в сочетании с обработкой параллельных ийных срезов ЭГТА (5 ммоль/л) для контроля специфичности полученного дка.
Для изучения генетически детерминированных связей между отдельными кронами в момент формирования новых органотипических структур была гользована методика культивирования в диффузионных камерах (Евгеньева, '6). Камеры имплантировали в спинные подкожные лимфатические полости •ушки-реципиента или в лучи морской звезды в случае культивирования зрадиев морских моллюсков. Полученные культуры исследовали под СЭМ и овили препараты, окрашенные по Бильшовскому.
Основой для математической и статистической обработки импульсных ;ледоватеяьностей служила цифровая запись, полученная с помощью АЦП и 1нящаяся в памяти компьютера Pentium-166 в виде data files. Для дальнейшей тистической обработки полученные файлы импортировались в )граммный пакет "Статистика" (США). В той же программе проводился 1стерный анализ.
Список исследованных видов представлен в соответствующих главах, работе использовались животные, принадлежащие к трем классам ти Mollusca. Всего исследованы представители 6 семейств Polyplacophora, семейства Lamellibranchia и 20 семейств Gastropoda. Общее количесг: использованных животных составило 1700.
Применялся стандартный физиологический раствор для прудовика (SF следующего состава (в ммоль/л): NaCl 44, KCl 1.7, CaCh 4, MgCh 1.5, HEPES (pH=7.4 доводился с помощью NaOH).
Для пэтч-кламп экспериментов в условиях фиксации тока в качест экстраклеточного раствора использовали SPS, пэтч-пипетки заполня. стандартным раствором (в ммоль/л): KCl 20, КОН 43.5, аспартат 10, ЭГТА HEPES 25.7 (рН=7.3 поддерживали с помощью HEPES).
Для регистрации Са2+-токов в условиях фиксации напряжен использовали следующие растворы: экстраклеточный (в ммоль/л) - ТЕД < HEPES 10, MgCh 1.5, BaCh 4, тетродотоксин 0.001 (рН=7.3 с помощью ТЕ ОН); внутриклеточный (в ммоль/л) - CsCl 44, MgCh 1.5, HEPES 10, ЭГТА 5,1ч АТФ 1 (рН=7.2 с помощью ТЕА-ОН).
Для регистрации К+-токов в условиях фиксации напряжения применя экстраклеточный раствор (в ммоль/л) - KCl 1.7, Ы-метил-О-глюкамин 87 HEPES 10, CaCh 4, MgCh 1.5, 4-аминопиридин 0.5, тетродотоксин 0.0 (рН=7.4 с помощью NaOH); внутриклеточный раствор (в ммоль/л) - KCl ' MgCh 1.5, CaCh 4, HEPES 10, ЭГТА 5 (pH=7.4 с помощью NaOH). В рабе использовались реактивы производства фирм Sigma и Fluka.
2. Хеморецепторные осфрадиальные органы моллюсков и организация их рецепторной поверхности.
Представители класса Polyplacophora являются одними из Han6oj древних моллюсков, сохранивших ряд примитивных признаков, одним которых является наличие слабо дифференцированных осфрадиев. Осфрад Lamellibranchia располагается на оси жабр и характеризуется зональностьк расположении секреторных и ресничных опорных клеток. У представится четырех архаичных семейств Archaeogastropoda осфрадии напомина: осфрадиальные органы Lamellibranchia и располагаются на жаберной оси. исследованных нами представителей 20 семейств Gastropoda обнаруже; разнообразные осфрадиальные органы с мультисенсорнь» хеморецепторными и механорецепторными клетками, которые в сочетанш опорными обеспечивают развитие этого рецепторного органа. Эволюи
[¡радия сопровождается увеличением общей рецепторной поверхности.
Предложенная схема (рис.1) иллюстрирует вероятный процесс ^образования осфрадия из участка сенсорного эпителия, расположенного над звро-висцеральным нервным стволом, как это наблюдается у Ро1ур1асор1юга , в обособленный сложноустроенный рецепторный орган, имеющий щиальный осфрадиальный ганглий, хищных Caenogastropoda (6).
Рис. 1. Схема вероятной эволюции осфрадиев Mollusca.
Одним из обязательных путей усложнения рецепторной поверхности ляегся образование латеральных, по отношению к рецепторной, ресничных н. Этот процесс имеет место в классе Lamellibranchia (2) и в классе Gastropoda, ttorinidae (4). Дальнейшим преобразованием осфрадиального органа у lenogastropoda является образование регулярных складок на рецепторной
Caenogastropoda (3-
LameUibrs
Polyplacophora (1)
поверхности, на базе которых формируется осфрадий ктенидиального типа 6). Этот основополагающий процесс может происходить у примитивн брюхоногих без формирования латеральных ресничных участков (Pilia CampaniUidae) или не затрагивая их (Cerithiidae, Strombidae). Рода Prosobranchia и Opisthobranchia не вызывает сомнений. Процессы упроще! организации осфрадиев касаются периферической эпителиальной ча< рецепторного органа, которая теряет зональность и уменьшается в разме] (7). Сходное строение имеют осфрадии примитивных морских Pulmon (Siphonaria) (8). Возможно, это указывает на родство этой группы примитивными Opisthobranchia. У пресноводных Pulmonata осфрадий имеет j эпителиального канала, окруженного осфрадиальным ганглием (9).
Проведенный электронно-микроскопический анализ обнаруя несколько морфологическиз типов рецепторных клеток в осфрадиях Mollui На рис. 2 представлена схема вероятной эволюции рецепторных клето] Gastropoda.
Механорецепториые клетки
в
Примитивная мультисенсорная клетка
Рис. 2. Гипотетическая схема эволюции рецепторных клеток осфрадии Mollusca.
Примитивным видом является интраэпителиальная слабо >ференцированная клетка с микроворсинками и несколькими цилиями, ггупающими над рецепторной поверхностью (1). Очевидно, примитивная епторная клетка была мультисенсорной, обладала общим химическим ством, механорецептивными свойствами и имела рецепторные белки к оторым сигнальным химическим молекулам. На начальных этапах люции (2) она сохранила все перечисленные свойства, но переместилась в альные отделы эпителия, при этом образовался периферический отросток с [ичной для дендрита ультраструктурой. В дальнейшем из мультисенсорной тки (2) образовались два типа хеморецепторных клеток с 1-2 ¡отмененными цилиями, один локализован в рецепторной зоне (3), второй оне щели под расширенными микроворсинками опорных клеток (4). Из гьтисенсорной клетки (2) также, по-видимому, берут начало ;анорецепторные клетки с пучком выступающих над поверхностью цилий, полагающиеся в рецепторной зоне (5) и рядом с зоной щели (6). У ричноводных морских Ри1топаш наблюдается упрощение организации (7), шедшее к потере ресничек и преобладанию химической чувствительности.
3. Централизация нервных клеток и формирование осфрадиального
ганглия.
Наиболее распространенной в настоящее время гипотезой о шсхождении нервных клеток и тканей является специализация |вичн0чувствующих клеток, расположенных в эпителиальном слое и дощих на апикальной поверхности чувствительный отросток, эвичночувствующие клетки мигрировали под эпителий. Из тех клеток, орые сохранили связь с окружающей средой, произошли сенсорные >роны, а потерявшие ее превратились в интернейроны и мотонейроны клемишев, 1964].
Процесс миграции рецепторных клеток из эпителия, очевидно, идет ггепенно, о чем говорит скопление рецепторных клеток на разном удалении сенсорного эпителия. Опускание нервных клеток из слоя эпителия [ровождается формированием глиальной оболочки вокруг периферических юстков. Этот процесс связан с фундаментальной особенностью нейрогенеза засцикуляцией. Мигрировавшие под эпителий сенсорные клетки имеют голярную, изредка мультиполярную, форму. Обособление групп нейронов, тачающих уни- и мультиполярные ганглнозные клетки, объединенные [аптическими контактами, очевидно, является минимально достаточной уктурой для обработки хемосенсорной информации. Такая структура несет
в себе бесспорно примитивные, предковые черты организации, указывают на начальные процессы агрегации нейронов и образования кластеров i первичных нейрональных модулей. Именно здесь аксоны рецептор* нейронов образуют химические синапсы с дендритоподобными отростке ганглиозных клеток. На дистальных ветвлениях дендритов удал обнаружить шипикоподобные структуры, которые представляют собой тон выросты дендрита длиной до 0,8 мкм и диаметром около 0,1 мкм. Болы часть синаптических контактов образуется в основании шипиков. Как прави это химические синапсы с везикулами одного диаметра примерно 50 нм, соответствует пузырькам, содержащим ацетилхолин. Шипикоподоб1 структуры являются, очевидно, универсальным механизмом межнейрош интеграции. Они описаны для нейропиля плоских червей, аннелид общественных насекомых [Лагутенко, 1981; Coss, Perkel, 1985]. Не вызыв сомнений интегрирующая роль дендритных отростков этих клеток. Болы часть обнаруженных синапсов имеет аксо-дендритическую природу, правило, конвергентного типа.
Несмотря на отсутствие обособленного осфрадиального ганглия пластинчатожаберных обнаружены все необходимые элементы рефлектор] организации со сложными синаптическими механизмами, позволяющ! осуществлять первичную обработку сенсорного сигнала на периферии, могут также замыкаться некоторые эффскторные механизмы. Описанные Unionidae принципы образования осфрадиального ганглия как первичн интегративного центра характерны и для брюхоногих моллюсков.
4. Экспериментальное исследование морфогенеза осфрадия в диффузионных камерах.
Проявление автономных генотипических потенций клеток изолированных эксплантатов особенно заметно при культивирова смешанных реагрегатов клеток, в состав которых входят различные tkí Осфрадиальные органы, представляющие собой слой эпителиальных клег объединенный с нервным ганглием, являются интересным объектом культивирования. На 3-5 день нахождения диффузионных камер в лягу Rana temporaria наблюдалось размножение и миграция клеток из импланта' расселение их по поверхности миллипорового фильтра. Их тела им округлую форму с диаметром около 5 мкм. Они перемещаются по поверхнс фильтра с помощью ламеллоподий. Первоначальные контакты между 6т расположенными нейритами при движении клеток сохраняются, постепе
вращаясь из обычных адгезионных в специфические синаптические такты, содержащие везикулы с трансмиттерами и типичные для нейрошшя радия ш vivo пре- и постсинаптические структуры, разделенные аптической щелью. Наличие структур с синаптическими везикулами тось наблюдать на поперечных срезах культуры на 5-7 день [лантирования. Кроме аксо-дендритических контактов нами обнаружены в ьтуре ткани аксо-аксональные синаптоподобные структуры. В этом случае нейрита имеют близкий диаметр и образуют одинаковые (около 0,6 мкм) усферические синаптические бляшки. Имеется синаптическая щель 25 нм. южие структуры легко обнаружить на срезах нейропиля осфрадиального глия Viviparus. Обычно как в пре-, так и в постсинаптических частях людаются округлые везикулы большого диаметра (до 100 нм), а аптическая щель равна 20 нм.
С увеличением срока культивирования от 7 до 14 дней значительно хичивается число выселившихся из имплантата клеток. Они начинают пировать 2-3-слойные культуры мелких клеток, соединенных между собой откими и тонкими отростками. Диффузная ячеистая сеть сплетения остков претерпевает процесс магистрализации. При этом места случайных тактов нейритов в некоторых случаях превращаются в зоны фасцикуляции, формирования групп волокон. Одновременно с объединением волокон исходит формирование и рост новых нейритов вдоль нерва, что находит г отражение в строении ганглиев и нервов ш vivo.
На ранних сроках культивирования (3-5 дней) также выявляются ночные клеггки, имеющие булавовидное расширение с пучком коротких ий. Подобные клетки, имеющие сформированные пучки цилий с типичным ором трубчатых фибрилл, обнаружены на поперечных срезах шипоровых фильтров.
Проведенное исследование культуры ткани подтвердило некоторые зепленные генетически особенности формирования осфрадиев у различных ов моллюсков. 1. Форма нейрона зависит от движения нейробласта. ¡)ференциация нейрона с установлением свойственных ему синаптических ¡ей есть следствие направленного роста или движения в направлении к гке или органу-мишени. 2. Электрические синапсы формируются раньше тческих и являются результатом преобразования обычных адгезионных точных контактов в растущей нервной структуре. 3. Образование идущих в ом направлении небольших нервов, соединяющих периферические епторные структуры с центральными, является следствием фасцикуляции. 4.
В культуре формируются все виды синаптических контактов и дендрит! шипиков, обнаруженных в осфрадиальных ганглиях in vivo.
5. Электрофизиологическое исследование реакции осфрадиев на изменение физико-химических параметров среды.
В литературе данные об осморецепторной функции осфрад ограничены и противоречивы. Стимуляция осфрадиев Acanthopleura gemma, Clione limacina разбавленной в два раза морской водой приводила возрастанию активности нерва, причем реакция носила тонический сл адаптивный характер. При стимуляции осфрадия Lymnaea stagnalis сахаро (100 ммоль/л) рисунок разряда нервных волокон с потенциалами высо: амплитуды (ВАА) в большинстве экспериментов сохранял фоновый характе то время как нервные волокна со средней и низкой амплитудами (Н/ внеклеточной активности отвечали изменением средней частоты импульса] или чаще перераспределением активности.
Понятие общей химической чувствительности предполах реагирование клеток на растворы солей, причем для этого не требу« специальных рецепторных механизмов. В основе процесса рецепции N лежит динамика электрических потенциалов на мембране хеморецептор: клетки [Самойлов, 1983]. NaCl (50 ммоль/л) апплицировался на осфрадиалы канал, в то время как осфрадиальный ганглий находился в физиологичеа растворе с концентрацией NaCl равной 40 ммоль/л. В такой постанс эксперимента NaCl обычно вызывал увеличение внеклеточной активност среднем на 79 ± 20% при п=16 для НА А и на 50 ± 32% для ВАА (п=10) (рис Наряду с увеличением средней частоты импульсации происходит измене паттерна разряда.
Основными органическими веществами, содержащимися в водной сре; играющими ведущую роль в пищевом поведении животных, являются caxaj аминокислоты. Воздействие на рецепторные окончания осфрадия живоро растворов глутаминовой кислоты (10-8 - Ю-2 моль/л) приводит к увелича суммарной частоты потенциалов действия в нерве. Реакция носит тоничеа медленно адаптирующийся характер. Несколько раз нам удаг зарегистрировать импульсацию нейронов осфрадиального ганглия на ф медленно развивающейся волны суммарного рецепторного потенци поверхности в ответ на стимуляцию последней раствором глутамино кислоты (Ю-4 моль/л).
60
20
-20
-60
100
Рис. 3. Изменение внеклеточной активности внутреннего париетального нерва при стимуляции осфрадия Lymnaea stagnalis.
При стимуляции осфрадия L-аспартатом в осфрадиальном нерве Lymnaea гgnalis было зарегистрировано достоверное увеличение ВАА в среднем на 86 20% по сравнению с фоном (рис.3). Механизм действия простейшей инокислоты мочевины на осфрадий заметно отличается. Во всем следованном диапазоне концентраций (10-3 - Ю-2 моль/л) получено стоверное снижение средней частоты импульсации без ее перераспределения. >стоверное значение реакции было получено для НАА группы нервных локон, оно равняется -50 ± 25% при n=l 1.
Для прудовика сигналом к формированию кладок является смена воды, в торой содержатся моллюски. Известно, что длительное содержание шпосков в аквариуме с непроточной водой приводит к уменьшению числа адок [Ter Maat, 1982]. Пересадка животных в аквариум с чистой водой эмулирует секрецию гормона каудо-дорзальными клетками церебрального аглия и активизацию процесса формирования кладок. Нами впервые была едпринята попытка связать биоэлектрическую активность осфрадия с этим номеном. Для протока использовалась вода из аквариума, в котором в *ение нескольких дней содержались прудовики. Стимулом служила чистая да. Аппликация на осфрадиальный канал чистой воды приводит к
увеличению частоты как ВАА, так и НАА потенциалов в нерве. Обе реакщ достоверно отличаются от фоновой активности и составляют для ВАА 50 22% и для НАА 65 ± 15% при п=15. Реакция обычно носит тоншГесю характер для ВАА, и фазный быстро адаптирующийся для НАА. Д: суммарного импульсного потока характерна реакция "отдач* наблюдающаяся через 15-20 с после смены воды. Очевидно, осфрадиальнь орган помимо постоянной тонической импульсации, идущей в ЦНС и i каудо-дорзальные клетки, может выступать как "on-off" рецепте сигнализирующий о моменте смены неблагоприятных для размножен условий среды на благоприятные. Проведенное исследован продемострировало мультисенсорный характер осфрадиальных рецепторш органов у моллюсков, принадлежащих к классам, имеющим различи} экологию.
6. Морфофизиологические и фармакологические характеристики нейронных популяций, образующих осфрадиальный ганглий.
Окрашивание через осфрадиальный нерв 5,6-карбоксифлуоресцеин< подтверждает полученные ранее данные о размере, типе и распределен нейронов в осфрадиальном ганглии.
Рис. 4. Идентифицированные нейроны осфрадиального ганглия Lymnaea siagnalis.
Прежде всего это касается 3 больших нейронов белого цвета диаметром 100 мкм, расположенных в месте выхода осфрадиального нерва и дающих в о отростки, что хорошо видно в случае успешного внутриклеточного •ашивания через пэтч-пипетку (рис.4). У Lymnaea эти нейроны были «тифицированы как ганглионарные нейросекреторные клетки [Соколов и , 1980]. Через нерв окрашивалось большое количество мелких клеток (20-30 л в диаметре), локализованных в месте выхода осфрадиального нерва, :руг эпителиального канала, а также на дорзальной и вентральной ¡ерхностях осфрадиального ганглия. Некоторые из них при триклеточном окрашивании имеют псевдоуниполярную и типичную для сорных клеток биполярную форму. Один из отростков направляется в фадиальный нерв, а другой к нейропилю или осфрадиальному каналу.
Эксперименты проводили на ганглионарных (GCi-з) и предположительно сорных (SC) клетках осфрадия в методике "patch-clamp" в условиях ксации тока и напряжения. Клетки GCi-з обладали мембранным геициалом до -60 мВ (п=74) и спонтанной, более или менее регулярной, пульсной активностью равной 0,1-0,2 имп/с. Активность клеток GCi-з бедна (аптическими потенциалами. В большинстве экспериментов NaCl (10 оль/л; п=7), апплицированный на поверхность осфрадия, вызывал юляризацию мембраны и увеличение частоты потенциалов действия в 4-з. Раствор L-аспартата (Ю-5 моль/л; п=11) вызывал подобное NaCl ¡ствие на мембрану клеток GCi-з (табл.1).
Табл. I.
)тветы GCi-з и SC клеток осфрадиального ганглия на нейротрансмиттеры и
химические стимулы.
Общее количество клеток Количество клеток, отвечающих возбуждением Количество клеток, отвечающих торможением Количество клеток, не отвечающих на раздражение
GCi-з SC GC..3 SC GC..3 SC GCi-j SC
гйротрансмиттеры
(етилхолин 10-5-10-6 моль/л 15 15 2 13 10 2 3 0
ротонин 105-10^ моль/л 18 13 17 10 1 3 0 0
iMK Ю-6 моль/л 10 11 0 2 10 1 0
ЖРамид Ю-6 моль/л 7 5 1 0 6 5 0 0
шическне стимулы
lCI 102 моль/л 9 6 7 0 1 5 1 1
асггартат (О5 моль/л 11 4 9 0 1 4 1 0
Сенсорные клетки, расположенные на дорзалыгой поверхно осфрадиального ганглия, по-иному отвечали на химические стимулы, контрольных условиях эти мелкие клетки имели неритмическую спайков активность с быстрыми и медленными синаптическими потенциала Мембранный потенциал БС составляет от -40 до -55 мВ (п=39). ЫаС1 ( моль/л; п=5) и Ь-аспартат (Ю-3 моль/л; п=4), апплицированные на поверхно осфрадия, приводят к гиперполяризации мембраны БС и уменьшению чаете разряда (рис. 5).
Л
о о t}
туи
mi
m-и
sc i...т.
ШМ
M
Рис. 5. Patch-clamp whole cell регистрация в условиях фиксации тока.
A, Б - реакция GCi-з на микроперфузию растворами
NaCl (Ю-2 моль/л) и L-аспартата (Ю-5 моль/л). МП=-40 м!
B, Г - реакция SC на предъявление тех же растворов. МП=-34 м
В условиях одноэлектродной фиксации потенциала увеличе концентрации NaCl в омывающем осфрадий растворе на 10 mmoj: приводило к появлению в SC выходящего тока величиной 2-3 нА. См опытного раствора на SPS возвращала ток к нулевому уровню (рис. 6, верх кривая). Замена омывающего осфрадий раствора на безнатриевый, где N был заменен на тетраэтиламмоний хлорид (TEA) в эквимоляр! концентрации, приводит к инверсии тока, вызванного аппликацией NaCl ммоль/л), при том же значении потенциала фиксации (-80 мВ). Регистрируем ток имеет меньшую амплитуду (>2.0 нА) и более крутой передний фронт (р 6, нижняя кривая). Применение TEA позволило идентифицировать йот природу регистрируемого тока. Его входящая составляющая являем вероятно, натриевой или кальциевой, не блокируемой TEA, а выходяща
шиевой, как было показано для вкусовых клеток позвоночных ¡Ътс1етапп, >96].
t ( s )
Рис. 6. Patch-clamp whole cell регистрация мембранных токов SC в условиях фиксации потенциала мембраны.
Нейроны GCi-з деполяризовались и возбуждались ГАМК (Ю-6 моль/л; =11) и серотонином (Ю-5 моль/л; п=17), но гиперполяризовались и 1гибировались ацетилхолином (106 моль/л; п=10) и FMRF-амидом (10-4 оль/л; п=6) (табл. I). В условиях фиксации потенциала аппликация Ацх (105 оль/л) на поверхность ганглия вызывала появление выходящего тока, среднее гачение которого составляло 11,6 ± 5,7 нА при п=8 и использовании SPS. отенциал инверсии (Едщ) для GCm находится в пределах О мВ, что ¡ответствует данным полученным для клеток буккального ганглия Helix matia [Witte et al., 1985]. Выходящий ток может быть обусловлен изменением 1- и/или К+ проводимости. Замена Na+ в омывающем осфрадий растворе на ЕА снижает амплитуду ответа на 30% и увеличивает время необходимое для ^поляризации. Использование TEA в омывающем растворе не блокирует элностью К+ выходящий ток, очевидно, помимо ионов К+ в шерполяризационном ответе GCi-з участвуют также ионы С1\ Калиевый »ходящий ток может также активизироваться высвободившимися из ¡утриклеточных депо ионами Са2+.
В мелких сенсорных клетках ГАМК (10б моль/л; п=10) вызывал вдленно развивающуюся длительную гиперполяризацию и торможение 1стоты разряда. В большинстве экспериментов серотонин (Ю-6 моль/л; п=10) ;поляризовал мембрану и вызывал длительную спайковую активность, ¡храняющуюся также после отмывки. Однако в трех случаях серотонин
вызывал слабую гиперполяризацию и торможение в мелких клетках (табл.1 Ацетилхолин (Ю-6 моль/л; п=10) также деполяризовал мембрану ЗС увеличением частоты разряда и мембранных осцилляции. РМИР-амид (1С моль/л; п=5) гиперполяризовал сенсорные клетки и уменьшал частоту разряд эффект не снимался при отмывке. Таким же образом действовал раствс ГАМК (10-6 Моль/л; п=10).
Ответы, вызываемые нейротрансмиттерами в ганглиоиарных и мелю сенсорных клетках осфрадия, избирательно блокировались антагонистами, ганглиоиарных клетках вызванные серотонином деполяризация и увеличен! частоты ПД блокировались после 20-30-секундной аппликации антагонисп серотонина миансерина (10-6 моль/л; п=10). ГАМК-агонист баклофен (1( моль/л; п=7) вызывал подобный ГАМК ответ, однако ни один из них 1 блокировался ГАМК-антагонистом пикротоксином (10-5 - ИИ моль/л; п=8). 8С клетках эффект серотонина также блокировался миансерином (10^ моль/ п=7), после 15-минутной отмывки только более высокие концентращ серотонина были способны вновь деполяризовать мембрану и восстанови спайковую активность. Антагонист холинергических никотиновых рецептор« гексаметоний (10-6 , 10-3 моль/л; п=4) блокировал вызванную Ацх (Ю-6 моль/ п=4) деполяризацию и увеличение частоты разряда в мелких сенсорнь клетках.
Нами зарегистрированы ПД большой длительности при смене БРБ ) раствор, в котором бьш заменен на ТЕА и Ваг+. ПД сохраняли св( нормальный ритм в безнатриевом растворе и увеличивали амплитуду на 25 при увеличении концентрации Са2+ в омывающем растворе в 2 раза в опыта? ОС|.з и на 13% в БС. Процент увеличения амплитуды ПД в двукратнс кальциевом растворе у вСю, типичных нейросекреторных клеток, выше достоверно отличается от такового у сенсорных нейронов.
В условиях фиксации потенциала порог активации входяще кальциевого тока колеблется от -20 до 0 мВ при максимуме около 30-40 м Среднее значение амплитуды кальциевого тока для ОС)-з нейронов составля -13,6 ± 3,0 нА при п=7 и -10,3 ± 5,0 для БС при п=9. Основой д фармакологической классификации кальциевых каналов является их реакц на дигидропиридины. Обнаружено блокирование кальциевых токов сенсорн] клеток нифедипином (Ю-2 ммоль/л) (рис.7). Кальциевые токи нейрон осфрадия оказались нечувствительными к со-конотоксину (Ю-2 ммоль/л). В же время они блокировались полностью Сс12+ (5x10"2 ммоль/л) и частично ммоль/л раствором СоСЬ на 7 ммоль/л Са2+ физиологическом раство]
шжение амплитуды кальциевого тока Со2+ было получено для обеих групп йронов осфрадия и легко отмывалось в течение 3-5 мин проточным юиологическим раствором.
Рис. 7. Оригинальная запись кальциевых токов SC при одноэлектродном клампировании напряжения мембраны.
А - 2хСа2+- физиологический раствор. Б - нифедипин (10*2 ммоль/л).
Hp = - 50 мВ.
Сопоставление электрических пороговых характеристик Са2+ тока в фрадиальных нейронах с данными фармакологического анализа позволяет нести зарегистрированные кальциевые токи к L-типу. Подобные токи исаны для нейронов Aplysia [Nerbonne, Gurney, 1987] и каудо-дорзальных еток (CDC) церебрального ганглия прудовика [Kits, Mansvelder, 1996].
Регистрируемый калиевый ток имел пороговое значение около -20 мВ и растал с каждым приращением амплитуды тестирующего импульса, шликация 4-аминопиридина (до 102 ммоль/л) и апаина (Ю*1 ммоль/л) не азывает заметного влияния на величину калиевого тока. В то же время TEA окирует как Са2+-зависимый, так и потенциал-зависимый калиевые токи, «чем Са2+-зависимый компонент более чувствителен, что соответствует иным литературы [Hermann, Gorman, 1981; Crest et al., 1990]. Потенциал-зисимый калиевый ток не блокируется полностью даже 40 ммоль/л створом TEA. Внутриклеточный раствор с CsCl (4 ммоль/л) через 3 мин лностыо блокирует потенциал-зависимый калиевый выходящий ток.
Наличие в осфрадии прудовика клеток, способных генерировать ПД безнатриевом растворе, не является неожиданностью, так как известно, чтс большинстве нервных клеток моллюсков Са2+ участвует в деполяризации часто приводит к формированию ПД. Неконтролируемый вход слишк большого количества Са2+ в клетку или нарушение реполяризационн: процессов, в которых ведущую роль играют ионы калия, приводит образованию плато-потенциалов.
7. Участие аденилатциклазной системы и ионов кальция в генерации суммарного рецепторного потенциала осфрадии живородки,
В ответ на стимуляцию Ь-глутаминовой кислотой зарегистрирова медленное изменение постоянного потенциала рецепторной поверхнос осфрадия, представляющее собой, вероятно, суммарный рсцспторн. потенциал (СРП) чувствительных нейронов. Воздействие растворов глутаминовой кислоты на осфрадий вызывает возбуждение периферическ отростков рецепторных клеток, которое выражается в появлении вол: деполяризации. Зависимость амплитуды СРП от концентраи стимулирующего раствора имеет вид экспоненциальной кривой.
С целью установления возможной связи механизмов генерации СРГ Са2+-активируемой аденилатциклазной системой рецепторная поверхно! осфрадиального органа была подвергнута воздействию веществ, влияющих компоненты аденилатциклазного цикла. Теофиллин (4-10 ммоль/л) вызыв; увеличение амплитуды СРП, генерирующегося в ответ на аппликац растворов глутаминовой кислоты, на 170% по отношению к нор: Аналогичное действие оказывает кофеин в тех же концентрациях. Подобн же эффект, но менее выраженный (73%), наблюдается при добавлении перфузат ЫаР (4 ммоль/л). В то же время воздействие на рецепторн поверхность осфрадия Си2+ снижало амплитуду СРП, вызванного аппликащ глутамата, на 51%.
Для рецепторных клеток осфрадия роль Са2+ в рецепции до нап исследований не была показана. Введение в проток забуференного раствс ЭГТА (Ю-4 моль/л) приводит к достоверному снижению амплитуды СРП 29% от средней величины ответа, возникающего при действии глутамино! кислоты (Ю-4 моль/л). Сходным образом действует бескальциев физиологический раствор, а именно - уменьшает амплитуду медленн< суммарного потенциала на 21,5% . По-видимому, увеличение внутриклеточ! концентрации кальция необходимо для активации протеинкиназ
енилатциклазы и его недостаток, вызванный отсутствием тока из внешней зды в опытах с бескальциевым раствором и ЭГТА, приводит к снижению плитуды СРП, вызванного воздействием глутаминовой кислоты.
Нельзя также исключить непосредственную роль кальциевых токов в терации рецепторного потенциала. Они могут быть чисто кальциевыми, а кже кальций-зависимыми натриевыми [Schild et ai., 1990]. Для изучения этого проса мы применили известный блокатор потенциал-зависимых кальциевых налов производное верапамила - D-600. Одновременное применение D-600 Vs моль/л) и глутаминовой кислоты (10-4 моль/л) приводит к достоверному ижению амплитуды СРП на 41,5% по отношению к средней амплитуде цепторных потенциалов, вызванных воздействием глутаминовой кислоты И моль/л). Следовательно, кроме кальциевых токов в процессе генерации >П могут принимать участие и натриевые.
Целью цитофизиологического исследования было сравнение локализации i2+ в нормальных условиях и при действии на рецепторную поверхность утаминовой кислоты (10'4 моль/л). На поперечных срезах осфрадия гктронно-плотный осадок цитохимической реакции был обнаружен в орных и в рецепторных клетках и их отростках. Контролем кальциевой ироды преципитата явилась обработка поверхности осфрадия до фиксации створом ЭГТА (10'5 моль/л) в течение 5 минут. Исследование ультратонких гзов не обнаружило гранул осадка в структурах, в которых он ентифицировался в норме. Воздействие на рецепторную поверхность фрадия глутаминовой кислоты привело к изменению локализации осадка роантимонатной реакции. Наблюдается уменьшение количества электронно-отных гранул в цитоплазме и митохондриях периферических отростков цепторных клеток. Отмечается локализация преципитата вблизи внутренней верхности плазматической мембраны. Если связать эти факты с еньшением количества осадка в межклеточном пространстве, то можно едположить, что часть внеклеточного лабильного пула кальция переходит из ешней среды во внутриклеточную, участвуя в генерации рецепторного тенциала и/или в его проведении по плазмалемме в область тела клетки, гдй оисходит преобразование градуального электрического процесса в тенциал действия. D-600 блокирует транспорт Са2+ через мембраны, уществляемый посредством медленных кальциевых каналов L-типа [Frank, 86]. В то же время в литературе имеются данные, указывающие на тормозное йствие D-600 на выход ионов кальция из внутриклеточных депо: [тохондрий, везикул и каналов гладкой эндоплазматической сети [Striggow,
Ehrlich, 1996]. При воздействии D-600 в периферических отрост рецепторных клеток нами обнаружено накопление Са2+ во внутриклеточ! депо и снижение общей концентрации кальция в цитозоле. Обрабо осфрадия ионами меди, блокатором аденилатциклазы клеток, также приво к перераспределению осадка. Отсутствует осадок, связанный с плазмалемм и значительно снизилась общая плотность пироантимоната кальцш цитоплазме периферических отростков рецепторных клеток. Мелкие гран; продукта реакции наблюдаются лишь в митохондриях и везикулах. Наруше Na/Ca обмена оуабаином также влияет на распределение оса пироантимоната кальция в рецепторных и опорных клетках.
8. Взаимодействия нейронов ЦНС прудовика при стимуляции осфрад)
Гигантская педальная клетка (RPeDi) обладает ритмической спонтан активностью, изменение которой зависит от широкого синаптическ притока, приходящего на этот интернейрон из висцеро-париетальной i ЦНС. Связанные моносинаптически интернейроны VÜ4 висцерального, правого париетального и RPeDi правого педального ганглиев образ устойчивую нейрональную сеть, способную генерировать ритм дыхатель движений у прудовика [Syed et al., 1992; Winlow, Syed, 1992].
Мы обнаружили, что стимуляция осфрадия приводит к изменен ритмической спонтанной активности этой клетки. L-аминокислоты вызыв общее торможение спонтанной активности RPeDi, которое может выража' в снижении средней частоты ПД за единицу времени или в изменении рис) разряда из регулярного в пачечный. Существующие между да интернейронами {RPeDi и VD4) реципрокные тормозные влияния завися-внешнего синаптического притока и, в частности, могут в значитель степени модулироваться афферентной импульсацией из осфрадия. В реаи клетки RPeDi и связанных с ней моносинаптически мотонейронов (A-clu была обнаружена специфичность, выражающаяся в различении качс вещества, действующего на осфрадий.
Раствор мочевины и аминокислот в концентрации 10 ммоль/л вызь снижение ответной реакции нейрона RPeDi. Сахароза (100 мосмоль) торм< активность RPeDi, тогда как раствор NaCl в такой же осмотиче( концентрации вызывает возбуждение в гигантской педальной клетке (рис. 8
Экспериментально было показано, что CDC в момент синхрон спонтанной активности (~1 час) выделяют гормон, инициирующий овуляг При отведении от CDC, расположенных в разных ганглиях, наблюда
кция торможения, вызванная стагнантной водой, которая приводит к образованию относительно регулярной спайковой активности в пачечную с межутками между вспышками активности от 15 до 50 с. Мы попытались
!0 /о
;о
(О
о
10
50 !0
Рис.8. Изменение импульсной активности нейронов ЦНС при стимуляции осфрадия.
снить химическую природу стимула, вызывающего реакцию ибирования биоэлектрической активности CDC. Для этого осфрадий купировался NaCl, L-аспартатом и мочевиной. NaCl в концентрации 5x10 2 ъ/л, приготовленный на дистиллированной воде, вызывал снижение готы спайковой активности при одновременной деполяризации мембраны гки. Перерезка внутреннего паллиального нерва уничтожала обнаруженные <ции в CDC.
Таким образом, в прямом электрофизиологическом эксперименте пось показать участие периферической сенсорной информации в регуляции кции размножения и дыхания у прудовика.
9. Возможная роль осфрадиев в адаптивном поведении моллюсков.
Ориентация животных в неоднородном запаховом поле предполагает л-ие нескольких сенсорных систем [Atema, 1989]. Осфрадий, очевидно, сит свою специфическую информацию и участвует в формировании
Сахароза (0,1 моль/л).
п=6
п=7
NaCl
(50 ммоль/л) п=15
Аминокислоты
(10 ммоль/л)
11=24
:§ipi
n=10 j
11=17
n=7
ет RPcD, I ' | A-cluster
n=5
Мочевина
(10 ммоль/л)
сложных поведенческих ориентационных реакциях таких как пищев половое поведение, хоминг.
Нами было исследовано поведение 5 видов литоральных моллюск принадлежащих к различным классам (табл. II). В наших опытах моллю< извлекались из природных укрытий и пересаживались в произвольн направлении и на произвольное расстояние, но в пределах среднего удалет от "дома". При такой методике постановки опытов животные не мо1 оставить свежих следов, которые могли бы указать им направление покинутое убежище, хотя наличие старых отрицать не представлял« возможным. Так или иначе, моллюски с разной вероятностью (Р) отыскив; свой "дом" среда десятков чужих (табл. И). Только для акмеи можнс уверенностью сделать вывод об отсутствии хоминга.
Таблица II
Частота возвращения моллюсков при различных воздействиях
на их убежища и рецепторные органы.
Вид Р Воздействие на рецепторы Воздействие на убежища
1 2 3 4 ССЦ гексан изоля1.
тритон Х-100 А Б а
АсапИюр1еига gemmata 0,69 0,25 0,30 . . 0,18 0,83 0,35 0,20
Я1рИопаг1а grisea 0,72 . - 0,52 0,53 - - - 0,21
$1]>1юпаг1а <>р. 0,60 0,22 - 0 - 0,11
Ра1е11а сареп$1я 0,40 0 - 0,39 - - .
Тез1шИпаИа (еяхеИсНа 0,17 - - - - - - - -
Примечание: Р - частота возвращения моллюсков в норме; 1 - при воздействии трито Х-100 на рецепторы осфрадия; 2 - на рецепторы головной лопасти; 3 -экстирпации головных щупалец; 4 - при обработке убежища 70° этило) спиртом; А, Б - при обработке убежища гексаном без удаления раств (А) и с удалением (Б); а, б - при полной (а) или частичной (б) изоля убежища.
Установка препятствий вокруг "дома" не уничтожала реакцию хомиш сифонарий и хитонов, а по литературным данным и у пателлид [Не\уаи, 19 В то же время изоляция "дома" цементом или пластилином сниж вероятность возвращения животных в 3-5 раз (табл. II). Полученные фа] подтверждают высказанную гипотезу о важной роли запаха "дома"
иентации моллюсков. Обработка "дома" CCI4 после пересадки животных иводила к тому, что моллюски не находили его в большинстве случаев =0,18) как на следующий день, так и через неделю. По-видимому, ССЦ, таясь сильным органическим растворителем, смывает как запаховое цество, так и многокомпонентную слизь моллюска, в которой оно апочено.
Важным вопросом является идентификация рецепторного органа, зетственного за хоминг у моллюсков. Удаление щупалец у сифонарий лишь шачительно уменьшает частоту возвращения животных (Р=0,52). Известно, 5 и для пателлид экстирпация головных щупалец оказалась неэффективной =0,39). Обработка тритоном Х-100 головных лопастей хитона только 1жает реакцию хоминга до Р=0,30. Вероятно, что в таком сложном эрдинированном поведенческом акте, как хоминг, участвуют не только говиые щупальца, но и другие хемосенсорные системы, в частности })радии, имеющиеся у всех исследованных животных. Аппликация тритона 100 на осфрадии хитона и сифонарии снижает вероятность возвращения вотных до 0,25, а у пателлид приводит к гибели большого числа опытных вотных (табл. II).
1-Pearson г
0 0.5 1 1.5 2
Простой осфрадии РАСТИТЕЛЬНОЯДНЫЕ Простой со складками Ктспадпальяый осф.
ХИЩНЫЕ Рецепторная зона Ресничная зона Разветвл. лепестка Секреторная зона ФИЛЬТРАТОРЫ
0 0.5 1 1.5 2
Linkage Distance
Рис. 9. Кластерный анализ степени связи строения осфрадиев Caenogastropoda с типом питания.
Результаты нашего исследования позволили выявить связь между эбенностями строения осфрадиев и способом питания животных. Ранее о
—
■
■
!l-
возможности такой связи указывалось в работах Г.Хаспрюнера и Дж.Тэйл* [Hazsprunar, 1983-1987; Taylor, Miller, 1989]. Мы использовали в своей раб признаки, полученные при ультраструктурном анализе более 33 семей Caenogastropoda. Признаки строения (10) и 3 основных способа питан хищничество, фильтрационное (детритоядное) и травоядное - группировал по методу Ward. Между полученными кластерами определялась велич) связи.
Результаты анализа представлены в виде дендрограмм. На рис проиллюстрирована связь между формой осфрадия, его организацией способом питания моллюсков. Простая организация осфрадия в виде вал: коррелирует с питанием растениями. Имеются исключения, питающи детритом представители сем. Aporrhaiidae имеют осфрадии так же в в валика [Taylor, Miller, 1989]. Сложный осфрадий ктенидиальной фор характерен хищным моллюскам и фильтраторам (рис.9). Следователь можно утверждать, что осфрадий в той или иной мере связан с пищев поведением. Осфрадий не является единственным рецепторным орган ответственным за пищевое поведение. Появившиеся в эволюции позд осфрадиев, головные щупальца и ринофоры принимают на себя значителы часть дистантной хеморецепции.
ВЫВОДЫ
1. На основе проведенного сравнительного ультраструктурного анал осфрадиев у представителей трех классов Mollusca (Polyplacophora, Bivai Gastropoda) представлен вероятный исторический путь развития осфрадии простого скопления рецепторных клеток до сложноорганизованн рецепторного органа с обособленным периферическим гангш осуществляющим обработку сенсорной информации.
2. Возможное направление морфофизиологической эволю] рецепторных клеток осфрадия и их ультраструктуры повторяет известный п развития нервной системы из ресничных клеток эктодермы. Миграция эпителий рецепторных клеток сопровождается удлинением периферическ отростка и специализацией структур, ответственных за восприятие, а та может приводить к формированию субэпителиальных нервных стволо! ганглиев.
3. В осфрадиальных органах представителей исследованных клас Mollusca обнаружены основные виды синаптических контактов. Впер показана способность клеток осфрадия к росту и формирова! органотйпической структуры в условиях культуры ткг
^демонстрирована возможность восстановления рецепторных ресничных еток и нейронных сетей de novo с синаптическими и проводящими ементами, типичными для осфрадиальных ганглиев in vivo.
4. Впервые установлены реакции одиночных клеток осфрадия прудовика
химические вещества и нейротрансмитгеры. В ганглионарных и
цепторных нейронах описаны потенциал- и лиганд-зависимые мембранные ки. Зарегистрированы электровозбудимые входящие кальциевые токи, аствующие в генерации ПД и классифицируемые как L-токи, а также щадящие потенциал- и Са2+-зависимые калиевые токи, ответственные за поляризацию мембраны.
5. Медленный суммарный рецепторный потенциал поверхности осфрадия teer экспоненциальную зависимость от концентрации вызывающей его L-утаминовой кислоты. С использованием фармакологического анализа жазано, что в его генерации участвует кальций-зависимая аденилатциклазная стема. Цитохимическим методом выявлено перераспределение Са2+ в [топлазматических структурах периферических отростков рецепторных еток при действии L-глутаминовой кислоты.
6. Компьютерный анализ импульсной активности нерва свидетельствует :уществовании в осфрадиалыюм ганглии двух путей кодирования сенсорной [формации. Первый заключается в изменении средней частоты импульсации нейронах осфрадия, второй - в изменении паттерна их спонтанной тивности.
7. В ганглиях ЦНС обнаружены нейроны, на которые проецируется [формация из осфрадия. Это интернейроны дыхательного центра (RPeDi, З4), связанные с ними мотонейроны (A-группа) и каудо-дорзальные йросекреторные клетки, выделяющие гормон овуляции.
8. На основании электрофизиологических и поведенческих экспериментов гдвинута гипотеза о предковой, изначальной полимодальной вствителыюсти осфрадия. Дальнейшая эволюция осфрадиев идет путем яожнения и специализации этого органа, приводящим к доминированию ;ной сенсорной модальности над другой.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Камардин H.H., Цирулис Т.П. Электронно-микроскопическое следование осфрадия прудовика // Цитология.- 1980.- Т.22, N3.- С.266-270.
2. Соколов В.А., Камардин H.H., Зайцева О.В., Цирулис 1 Осфрадиальная сенсорная система брюхоногих моллюсков II Сенсор системы,-Л., 1980,-С.159-176.
3. Kamardin N.N. Faune Aquatique. Cahier de cours.- Conakry: IPG-1980.- 153 p.
4. Камардин H.H. Хоминг у морского легочного моллюска Siphon grísea II Биология шельфовых зон Мирового океана. Тез. докл. 2-ой Bcecoi конф. по морской биологии. Ч.2.- Владивосток, 1982.- С.180.
5. Камардин H.H. Исследование хоминга у морского легоч^ моллюска Siphonaria grísea L. // Вестник ЛГУ.- 1983.- N15,- С.101-104.
6. Камардин H.H. Морфологическое исследование поверхности осфрг Murex saxatilis II Молодые ученые биофака МГУ.- 1983,- ДепонироЕ ВИНИТИ, N1504.
7. Камардин H.H., Цирулис Т.П. Сравнительное электро! микроскопическое исследование хеморецепторов брюхоногих моллюско Тез. докл. II Всесоюзн. совещ. по химической коммуникации животных,-1983,- С.35.
8. Камардин H.H. Ультраструктура поверхности осфрадия мурекс Арх. анат. гистол. и эмбриол.- 1984,- Т.86, N6,- С.20-25.
9. Камардин H.H. Изучение синаптической организа периферического хеморецепторного органа моллюсков методом культ ткани II Физиология медиаторов. Периферический синапс.- Тез. дога Всесоюзн. симп.- Казань, 1984,- С.114-116.
10. Камардин H.H. Цилиарные структуры в осфрадии Murex saxati Цитология,- 1985,- Т.27,- С.986-989.
11. Камардин H.H. Ультраструктура осфрадия Siphonaria grisea (Molli Pulmonata) // Арх. анат. гистол. и эмбриол,- 1985,- Т.89, N9,- С.81-84.
12. Камардин H.H. Сравнительный анализ ультраструкту! организации хеморецепторных осфрадиальных органов у моллюско Простые нервные системы. 4.1. Тез. Всесоюзн. конф,- Казань, 1985,- C.83-8Í
13. Kamardin N.N., Tsirulis Т.P. Possible evolution of chemosen osphradial system of molluscs // Proc. IX Natl. Congr. Anat. Histol. Embr Pleven, 1985.- P.43.
14. Камардин H.H. Ультраструктура осфрадия живородки Viviparu, (Mollusca, Prosobranchia) // Арх. анат. гистол. и эмбриол,- 1986,- Т.90, N2,- С 45.
15. Камардин H.H. Строение и синаптическая организация осфрадия 1стинчатожаберного моллюска Unió pectorum II Арх. анат. гистол. и 5риол.- 1986,- Т.91, N8,- С.5-10.
16. Камардин H.H. Структурно-функциональная организация осфрадия >еднежаберного моллюска Murex saxatilis И Тез. докл. Всесоюзн. совещ. :ория параллелизмов А.А.Заварзина и современная биология". Цитология.-6,- Т.28, N10,- С.1134.
17. Камардин H.H. Сравнительное электронно-микроскопическое ледование осфрадиев моллюсков // Моллюски. Результаты и перспективы их ледований. Автореф. докл. 8 Всесоюзн. совещ. по изучению моллюсков,- Л., П.- С.218-220.
18. Kamardin N.N. Abrege de neurophysiologie.- Tulear: CUR, 1988,- 65 p.
19. Kamardin N.N. Le role probable de l'osphradium dans le homing des llusques marins littoraux Acanthopleura gemmata Blainv. (Polyplacophora), honaria grísea L. et Siphonaria sp. (Gastropoda, Pulmonata) // Mesogee.- 1988,-;8.- P. 125-130.
20. Камардин H.H. Исследование хоминга у хитона Acanthopleura tmata (.Polyplacophora, Mollusca) II Вестник ЛГУ.- 1989.- Сер.З, вып.1, N3.-¡8-62.
21. Камардин H.H. Соотношение тентакулярной и осфрадиалыюй горецепторных систем в эволюции моллюсков И Тез. докл. X Всесоюзн. ещ. по эволюционной физиологии, посвящ. памяти Л.А.Орбели,- Л., 1990,17-68.
22. Камардин H.H. О роли хеморецепции в хоминге у морских -оральных моллюсков // Проблемы химической коммуникации животных,-:Наука, 1991,-С.129-136.
23. Камардин H.H. Электронно-микроскопическое исследование зрадия у хитонов (Polyplacophora, Chitonida) Н Тез. докл. 9 Всесоюзн. совещ. изучению моллюсков.- Л., 1991,- С.94.
24. Тэйлор Дж.Д., Камардин H.H. Эволюция рецепторных клеток юсенсорного осфрадиального органа у переднежаберных моллюсков osobranchia, Gastropoda) II Сенсорные системы.- M., 1992.- Т.6, N3,- С.78-82.
25. Taylor J.D., Kamardin N.N. Structure and evolution of the nogastropod osphradium // Abstr. 11-th Intern. Malacol. Congr.- Siena, 1992,17.
26. Kamardin N.N., Taylor J.D. Synaptic organization of osphradial sen: organs in mollusc // Simple Nervous Systems. Abstr. Region. Meeting of IS] Pushchino, 1994,- P.18.
27. Kamardin N.N. The electrical responses of osphradial nerve and cen neurons to chemical stimulation of Lymnaea osphradium // Acta Biol. Hung.- 19 V.46, N2-4,- P.315-320.
28. Kamardin N.N. The morphometrical study of synaptic vesicles in neuropil of osphradial sensory organs in Mollusca /I Abstr. of 4th IBRO Congres Neuroscience.- Kyoto, 1995,- P. 164.
29. Камардин H.H., Сиренко Б.И. Электронно-микроскопичес исследование осфрадиальных органов у хитонов (Polyplacophora) // Rutheni 1996,- Т.6, N1.- С.73.
30. Kamardin N.N. The electrical responses of osphradial nerve and cer neurons to chemical stimulation of Lymnaea osphradium II Neurobiology Invertebrates. Simple and Complex Regulatory Systems.- Budapest: Akad.Ki; 1996,- P.315-320.
31. S.-Rozsa K., Kamardin N.N. Characterization of osphradial system ant changes under the influence of heavy metals in Lymnaea stagnalis L. (Gastropod Abstr. IVConf. Hung. Neurobiol. Soc.- Godollo, 1997,- P. 17.
32. Kamardin N.N., Szucs A., S.-Rozsa K. The osphradial multisen; system of Lymnaea stagnalis L. // Proc. 25th Gottingen Neurobiology Cc Gottingen, 1997,- V.II.- P.845.
33. S.-Rozsa K., Kamardin N.N., Szucs A. Neurotoxic effect of HgCh on osphradial sensory system of Lymnaea stagnalis L. (Gastropoda, Pulmonale* Neurotox'97. Diversification in toxicology: man and environment.- Abstrai Pharm.Toxicol.- 1997,- V.80, suppl.III.- P3-10.
34. Kamardin N.N., Szucs A., S.-Rozsa K. The study of osphradial nen cells population by patch-clamp whole cell method // Simple nervous systei Moscow, 1997,- P.26.
35. S.-Rozsa K., Kamardin N.N., Szucs A. Characterization of multisen; osphradial system in Lymnaea stagnalis L. (Gastropoda) If Abstr. V Conf. Hi Neurobiol. Soc.- Debrecen, 1998,- P. 12.
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Камардин, Николай Николаевич, Санкт-Петербург
И: $3-3/М- *
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
О С Ф Р АД И А ЛЬ МЫ Е СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ МОЛЛЮСКОВ 03.00.13 - физиология человека и животных
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант: академик
А.Д.Ноздрачев
Санкт-Петербург
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А - аксон
Ап - анальная папилла
АГ - аппарат Гольджи
А-А - аксо-аксональный синапс
А-Д - аксо-дендритический синапс
Бт - базальное тельце реснички
Бм - базальная мембрана
в - везикулы
Г - ганглий
Гк - глиальная клетка
Гл - гликокаликс
ГЭР - гранулированный эндоплазматический ретикулум
Д- дендрит
д - десмосома
К - ктенидий
Ко - коллаген
Кр - корешок реснички
J1 - лепесток
м - митохондрия
МВ - мышечное волокно
Мв - микроворсинка
Мз - зона мерцательных клеток
Мк - мерцательная клетка
МП - мантийная полость
Мт - микротрубочка
Н - нога
Нк - нервная клетка
Нп - нейропиль Нр - нерв
Не - нервный ствол
НСг - нейросекреторная гранула
НСк - нейросекреторная клетка
Нт - нейротрубочка
Ок - опорная клетка
ОС - осфрадий
ОСП - осфрадиальная поверхность Пг - пигментная гранула
ПО - периферический отросток рецепторной клетки
Р- рибосома
р - ресничка
Рк - рецепторная клетка
Рп - рецепторная поверхность
С - синапс
Сг - секреторная гранула Сз - зона секреторных клеток Ск - секреторная клетка Ст - соединительная ткань Ц - центриоль ц - цилия
ЦО - центральный отросток рецепторной клетки Ш - шипик Щ - зона щели Я - ядро
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение................................................ 5
Обзор литературы....................................... 12
А. Хеморецепция у беспозвоночных животных............ 12
Б. Формирование основных групп Mollusca и
их осфрадиальная система........................... 31
Глава 1. Методические приемы и объекты, использованные
в работе........................................ 44
1.1. Электрофизиологические методы исследования........ 44
1.1.1. Микроэлектродная регистрация биоэлектрической активности.................. 44
1.1.2. Пэтч-кламп регистрация в условиях
фиксации тока и напряжения................... 47
1.1.3. Регистрация внеклеточной активности осфрадиального нерва и суммарного рецепторного потенциала осфрадиальной поверхности................................. 48
1.1.4. Экспериментальные камеры.................... 49
1.2. Морфологические методы исследования.............. 50
1.2.1. Ретроградное и внутриклеточное
окрашивание осфрадиальных нейронов.......... 50
1.2.2. Методы световой микроскопии.................. 51
1.2.3. Методы электронной микроскопии............... 52
1.2.3.1. Трансмиссионная электронная микроскопия .. 52
1.2.3.2. Цитохимическое выявление кальция.......... 53
1.2.3.3. Сканирующая электронная микроскопия...... 54
1.2.3.4. Метод замораживания-скалывания
с мацерацией цитоплазмы 0s04..........................55
1.3. Методика культивирования осфрадиев
в диффузионных камерах....................................................55
1.4. Методика поведенческих экспериментов..........................57
1.5. Статистическая и математическая обработка результатов..........................................................................57
1.6. Объекты исследования........................................................59
1.7. Экспериментальные растворы............................................60
Глава 2. Хеморецепторные осфрадиальные органы Mollusca
и их структура....................................................................62
2.1. Осфрадии представителей класса Polyplacophora..............62
2.2. Осфрадии представителей класса Bivalvia.....................82
2.3. Осфрадии представителей класса Gastropoda....................92
2.3.1. A rchaeogastropoda........................................................92
2.3.2. Caenogastropoda............................................................100
2.3.3. Opisthobranchia..............................................................137
2.3.4. Pulmonata........................................................................140
Глава 3. Организация рецепторной поверхности
осфрадиальных органов....................................................151
3.1. Ресничные или мерцательные клетки..................................151
3.2. Микроворсинчатые опорные клетки......................163
3.3. Секреторные клетки................................................................165
3.4. Рецепторные клетки..............................................................167
3.4.1. Рецепторные клетки осфрадиев Polyplacophora............168
3.4.2. Рецепторные клетки осфрадиев Lamellibranchia..........169
3.4.3. Рецепторные клетки осфрадиев Gastropoda..................171
Глава 4. Дифференциация и централизация нервных
клеток осфрадиального органа..........................................183
4.1. Специализация рецепторных клеток..................................183
4.2. Погружение рецепторных клеток под эпителий и
формирование осфрадиального ганглия.............. 185
Глава 5. Экспериментальное исследование морфогенеза
осфрадия в диффузионных камерах................ 209
5.1. Морфогенез и синаптическая организация
осфрадия живородки ( Viviparus sp.)........................210
5.2. Культивирование эксплантатов осфрадиальной оси
и лепестков осфрадия Buccinum undatum............ 218
Глава 6. Электрофизиологическое исследование реакции осфрадиев на изменение физико-химических параметров среды.............................. 221
6.1. Эфферентная активность, приходящая на осфрадий ... 221
6.2. Влияние механостимуляции и осмотического давления
на импульсную активность осфрадиального нерва .... 225
6.3. Влияние хлористого натрия на импульсную активность осфрадиального нерва........................... 233
6.4. Воздействие органических соединений на импульсную активность осфрадия............................ 239
Глава 7. Морфофизиологические и фармакологические характеристики нейронных популяций, образующих осфрадиальный ганглий............. 254
7.1. Распределение осфрадиальных нейронов в ганглии . .. 255
7.2. Эффект NaCl и L-аспартата на осфрадиальные
нейроны...................................... 257
7.3. Действие нейротрансмиттеров на мембрану осфрадиальных нейронов........................ 261
7.4. Исследование мембранных токов
осфрадиальных нейронов....................... 270
Глава 8. Участие аденилатциклазной системы и ионов кальция
в генерации суммарного рецепторного потенциала осфрадия живородки.......................... 284
8.1. Электрофизиологическое исследование суммарного рецепторного потенциала осфрадиальной
поверхности.................................... 286
8.2. Электронно-микроскопическое определение локализации Са2+ в рецепторных клетках осфрадия живородки...... 294
Глава 9. Взаимодействие нейронов ЦНС прудовика
при стимуляции осфрадия....................... 301
9.1. Исследование реакции отдельных нейронов дыхательной цепи прудовика на осфрадиальную стимуляцию..... 302
9.2. Влияние осфрадиальной импульсации на активность каудо-дорзальных клеток церебрального ганглия прудовика..................................... 313
Глава 10. Возможная роль осфрадиев в адаптивном
поведении моллюсков......................... 321
10.1. Исследование хоминга у морских литоральных моллюсков.................................... 321
10.2. Связь формы и ультраструктурной организации осфрадиев с питанием моллюсков .............. 330
Заключение......................................... 334
Выводы............................................ 356
Литература......................................... 358
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Среди важнейших проблем современной биологии большое место занимают исследования регулирующих и интегрирующих систем, обеспечивающих целостность организма и его приспособительные реакции. Сравнительно-физиологические исследования нервной, мышечной и сенсорных систем позвоночных и беспозвоночных животных привели к заключению о принципиальном сходстве основополагающих физиологических механизмов [Коштоянц, 1950; Сахаров, 1974; Крепе, 1979; Орбели, 1979; Костюк, Крышталь, 1981; Шеперд, 1987а; 19876; Сотников и др., 1994; Kandel, 1976]. В этой связи изучение сенсорных систем беспозвоночных животных представляется весьма актуальным, так как они выполняют в поведении принципиально аналогичную сенсорным системам позвоночных функцию, а также представляют большой интерес в сравнительно-эволюционном аспекте, способствуя решению основной задачи, поставленной перед эволюционной физиологией - познание путей функциональной эволюции организмов [Гинецинский, 1970; Орбели, 1979].
Важным звеном в деятельности нервной системы позвоночных и беспозвоночных животных является ганглий, который выполняет интегративную функцию, являясь местом конвергенции сенсорной информации и замыкания рефлексов [Шеррингтон, 1969]. Академик А.А.Ухтомский доказал существование принципа конвергенции для всех уровней нервной системы [Ухтомский, 1978]. В настоящее время структура синаптических связей и физиологические свойства отдельных нейронов и нейронных популяций исследованы у беспозвоночных [Куффлер, Николе, 1979; Kandel, 1976; 1979; Alkon et al., 1978; Willows, 1978; Benjamin, 1983; Syed, Winlow, 1991a; 1991b; и др.] и позвоночных
животных [Черниговский, 1960; 1967; Скок, 1970; Ноздрачев, 1978; Ноздрачев, Пушкарев, 1980; Ноздрачев, Чернышева, 1989; Скок, Иванов, 1989; Фатеев, 1998].
В различных группах животных повторяются общие черты организации нервных центров, например, наличие сенсорных, моторных и интернейронов. Обнаружено удивительное сходство в развитии ганглиев моллюсков и ганглиев периферической нервной системы позвоночных [Bulloch, 1985]. Именно поэтому беспозвоночные, и в частности моллюски, стали классическим объектом для исследования многих фундаментальных вопросов нервной деятельности.
В жизнедеятельности живых организмов особую роль играет химический состав внешней и внутренней сред. Знание механизмов анализа среды животными зачастую определяет полноту наших представлений об их поведении. У водных животных существуют различные рецепторные системы, позволяющие отслеживать изменяющиеся параметры среды и химические сигналы [Бронштейн, 1977; Акоев, Алексеев, 1985; Акоев, Андрианов, 1989; Мантейфель, 1991; Atema, 1989]. У моллюсков таким органом является осфрадий, гомологичный у всех классов типа Mollusca. Однако, морфофизиологические особенности этого уникального в животном мире рецепторного образования, объединяющего в себе свойства рецептора и центра первичной обработки сигнала, изучены еще недостаточно. Мало представлены в литературе и данные о функциональной эволюции осфрадия в различных группах Mollusca.
Анализу отмеченных выше проблем и ряда связанных с ними вопросов посвящено настоящее исследование.
Цель исследования Целью выполняемой работы явилось сравнительное морфофизиологическое исследование осфрадиальной рецепторной
системы у представителей Polyplacophora, Bivalvia и Gastropoda. Исследование включает в себя описание ультраструктурной организации осфрадиальной рецепторной поверхности и типов рецепторов, электрофизиологических свойств клеток и особенностей синаптических контактов в осфрадиальных ганглиях и ганглиях ЦНС.
Задачи исследования
1. Провести сравнительный ультраструктурный анализ осфрадиев трех основных групп моллюсков (Polyplacophora, Bivalvia, Gastropoda), отличающихся по степени сложности и функциональной значимости осфрадиев.
2. Проанализировать наиболее общие, повторяющиеся у различных групп особенности организации рецепторной поверхности и сенсорных элементов в осфрадиях.
3. Оценить основные пути эволюции рецепторных клеток и осфрадиального ганглия у моллюсков. Исследовать особенности нейрогенеза и синаптогенеза в осфрадиях моллюсков с помощью метода культуры ткани.
4. Изучить электрофизиологические свойства осфрадиальных органов при разномодальных внешних воздействиях. Проанализировать физиологические и фармакологические свойства мембран нейронов осфрадия.
5. Выяснить возможные центральные нейрональные проекции осфрадия в ганглии ЦНС. Оценить роль осфрадиев в адаптивном поведении моллюсков.
6. Оценить участие аденилатциклазной системы и ионов Са2+ в генерации суммарного рецепторного потенциала осфрадия.
Научная новизна результатов
Впервые проведен комплексный анализ морфологических, ультраструктурных и физиологических особенностей осфрадиев трех
основных групп типа Mollusca. Показано, что на основе мало дифференцированной интраэпителиальной рецепторной клетки, обладающей полимодальной чувствительностью, в процессе эволюции формируются специализированные, обладающие особой ультраструктурной организацией рецепторные органы, участвующие в пищевом и сигнальном поведении животных. Выявлены основные закономерности эволюции рецепторных клеток и всего органа. Особая роль в этом процессе отводится сформировавшемуся осфрадиальному ганглию, синаптическая организация которого напоминает организацию обонятельной системы насекомых и позвоночных животных.
Впервые получены органотипические культуры осфрадиев пресноводных и морских моллюсков, ультраструктурный анализ которых подтвердил обнаруженные in vivo особенности синаптогенеза осфрадиального ганглия.
Получены электрофизиологические данные о чувствительности осфрадиев к аминокислотам, мочевине, сахарам и стагнантной воде. Выяснено, что в осфрадиальном ганглии в результате первичной обработки информации выделяются качественные и количественные характеристики воздействия. Впервые идентифицированы по морфологическим, электрофизиологическим и фармакологическим характеристикам клетки, расположенные на поверхности осфрадия. Зарегистрированы мембранные токи, вызванные воздействием химических и медиаторных веществ. Выявлено, что в процессе генерации ПД участвуют ионы Са2+, а образование продленных ПД происходит за счет нарушения выходящих калиевых токов. Входящий кальциевый ток формируется за счет высокопороговых электровозбудимых кальциевых каналов L-типа. Показана роль Са2+ и аденилатциклазной системы в генерации суммарного рецепторного потенциала осфрадия.
Продемонстрирована реакция идентифицированных нейронов, ответственных за дыхание, и каудо-дорзальных клеток на стимуляцию осфрадия. Выяснено, что осфрадий может модулировать дыхательный ритм и синтез гормона овуляции у прудовика.
В поведенческих экспериментах выявлена роль осфрадия в реакции хоминга у литоральных моллюсков, принадлежащих к различным систематическим группам. Показана высокая степень корреляции между питанием Саепо^азиоройа и строением осфрадия.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Гипотеза об исходной полимодальной чувствительности осфрадия у моллюсков, которая в процессе эволюции типа становится специализированной с преобладанием 1-2 модальностей. Этот процесс сопровождается специализацией рецепторных и опорных клеток, которые формируют разделенный на зоны эпителиальный орган со сложно устроенным периферическим ганглием.
2. В основе трансдукции химического стимула в осфрадиальных нейронах лежат известные для насекомых и позвоночных животных механизмы лиганд-рецепторных взаимодействий, опосредуемых кальций-зависимой аденилатциклазной системой. В генерации распространяющегося потенциала участвуют потенциал-зависимые входящие кальциевые Ь-токи.
3. Осфрадиальный ганглий, состоящий из различных клеточных популяций, является периферическим центром обработки сенсорной информации, имеющим сложную синаптическую организацию, включающую несколько типов синаптических контактов с различными медиаторами и нейропептидами. Импульсация осфрадиального нерва направляется в большинство ганглиев ЦНС и содержит информацию о качестве стимула и его временных параметрах.
4. Формирование сложной синаптической структуры осфрадиального ганглия является следствием генетически закрепленных механизмов, связанных с нейрогенезом этого рецепторного органа, и воспроизводится в органотипической культуре.
5. Осфрадий участвует в регуляции многих жизненноважных для моллюсков функций, включая дыхание, осморегуляцию, размножение, отыскание убежища.
Научно-практическая ценность
Результаты работы имеют большое значение для формирования целостного представления об эволюции функций хеморецепторных образований у животных. Они необходимы для пополнения наших знаний о механизмах нейрофилогенеза, в основе которого лежат онтогенетические особенности его формирования. Наряду с высокой пластичностью выделяются общие принципы функционирования и структурные модули, повторяющиеся и не меняющиеся на протяжении миллионов лет эволюции моллюсков. Это формирование обособленного эпителиального участка, объединяющего опорные клетки, организованные в виде зон и связанные с рецепторными клетками нескольких морфологических типов. В непосредственной близости располагается периферический ганглий, где осуществляется первичная обработка сенсорной информации, результатом которой могут быть локальные рефлексы на уровне самого рецепторного органа. Установленные принципы нейрональной организации осфрадиального органа должны присутствовать и присутствуют в других хемосенсорных органах, что позволит в будущем разрабатывать методы диагностики и лечения врожденных и приобретенных нарушений в работе хемосенсорных систем человека. Кроме того, результаты исследования могут быть использованы в моделировании и создании искусственных хемосенсоров и технических устройств анализа качества воды.
Материалы, представленные в диссертации, используются в учебном процессе при чтении курсов лекций по "Сравнительной физиологии" и "Биофизики рецепции" на биолого-почвенном факультете СПбГУ и "Нейрофизиологии беспозвоночных" на биологическом факул
-
Камардин, Николай Николаевич
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 1998
-
ВАК 03.00.13
- Абдоминальный сенсорный орган двустворчатых моллюсков-новая модельная система для исследования механотранстдукции
- Анализ механизмов внутриклеточно индуцированной потенции в нейронах виноградной улитки
- Двустворчатые моллюски семейства Sphaeriidae Южного, Среднего Урала и юга Западной Сибири
- Моллюски голоцена Южно-Минусинской котловины
- Пресноводные гребнежаберные моллюски Западной Сибири
