Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ механизмов внутриклеточно индуцированной потенции в нейронах виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малышев, Алексей Юрьевич, Москва

ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ РАН

на правах рукописи

МАЛЫШЕВ Алексей Юрьевич

УДК 615.78+612.821.6

АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНО ИНДУЦИРОВАННОЙ ПОТЕНЦИАЦИИ В НЕЙРОНАХ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

03.00.13 - физиология человека

и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., профессор П.М. Балабан

Москва - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................................4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................9

A. МОДЕЛИ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ У БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

1. Гетеросинаптическое облегчение..............................10

2. Гомосинаптическое облегчение...................................14

3. Ассоциативное обучение у морского моллюска Her missenda......................................................................15

B. МОДЕЛИ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ У ПОЗВОНОЧНЫХ

1. Долговременная потенциация в нейронах гиппокампа............................... ....................................17

2. Внутриклеточно индуцированая потенциация........21

ГЛАВА II. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ.......................25

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Эффект внутриклеточной тетанизации командного нейрона............................................................................................31

3.2. Эффект тетанизации афферентных входов на командные нейроны.........................................................................................33

3.3. Изменения пассивных характеристик мембраны командного нейрона после внутриклеточной

тетанизации.....................................................................................36

3.4. Эксперименты с тестирующей стимуляцией моносинаптических нейронов.....................................................38

3.5. Внутриклеточная тетанизация может вызывать долговременную депрессию.......................................................41

3.6. Роль посттетанической гиперполяризации в развитии первой фазы потенциации..........................................................43

3.7. Сезонная зависимость выраженности посттетанической потенциации.................................................................................47

3.8. Зависимость долговременной фазы посттетанической потенциации от уровня серотонина.........................................51

3.9. Роль ионов кальция в индукции посттетанической потенциации...................................................................................55

3.10. Роль каскадов вторичных посредников в развитии посттетанической потенциации.................................................58

3.11. Влияние ингибитора ХО-синтазы на развитие посттетанической потенциации.................................................66

ГЛАВА IV. ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Особенности ВКИП в командных нейронах.........................69

4.2. Зависимость ВКИП от сезона и уровня серотонина...........70

4.3. Роль кальция в индукции ВКИП.............................................73

4.4. Участие каскадов вторичных посредников во ВКИП.........75

4.5. Роль окиси азота в развитии ВКИП........................................76

4.6. Возможная функциональная роль ВКИП в неассоциативном обучении.................................................................79

4.7. Гипотетическая схема механизмов индукции и поддержания ВКИП.......................................................................81

ВЫВОДЫ............................................................................................................84

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................85

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время практически общепризнанным является тот факт, что изменение эффективности синаптической передачи лежит в основе механизмов обучения и памяти (см., например, Kandel et al., 1995; Bliss and Collingridge, 1993). Одной из наиболее разработанных моделей для изучения синаптической пластичности на позвоночных является долговременная потенциация (ДП) - длительное увеличение амплитуды ответов нейронов на тестирующий стимул, возникающее после высокочастотной стимуляции афферентных входов (Воронин, 1982). Однако, несмотря на долгую историю изучения ДП, до настоящего времени отсутствуют прямые доказательства того, что механизмы ДП имеют какое-либо отношение к механизмам обучения и формированию следов памяти (Johnston, 1997; Voronin et al., 1994). В этой связи особенно привлекательными кажутся исследования на более простых организмах, например, таких как моллюски. В самом деле, с одной стороны было показано, что у моллюсков можно выработать оборонительные и пищевые условные рефлексы, что является проявлением процедурной (недекларативной) памяти (Максимова, Балабан, 1976, 1985; Никитин, Козырев, 1991; Walters et al., 1979; Alkon, 1974). С другой стороны, благодаря относительно простому строению нервной системы и крупным нейронам, на моллюсках можно детально описать нервные сети, контролирующие те или иные поведенческие акты. Затем, анализируя нервную сеть, контролирующую ту форму поведения, которая подверглась изменению в процессе обучения, можно определить локализацию и

механизмы пластических перестроек. Подобная задача была блестяще выполнена школой Кендела на модели рефлекса отдергивания жабры у морского моллюска аплизии (Kandel et al., 1995). Однако оказалось, что клеточные механизмы, определяющие обучение у аплизии по некоторым важным характеристикам отличаются от механизмов синаптической пластичности, обнаруженным на позвоночных. Главное отличие состоит в том, что в отличие от ДП нейронов позвоночных, сенситизация нейронов аплизии, определяющих отдергивание жабры, запускается не высокочастотным разрядом в нейронах, а воздействием химического фактора - медиатора серотонина (Bruneiii et al., 1976). В связи с этим особенно интересными кажутся те модели обучения на моллюсках, в которых используются механизмы индукции синаптической пластичности, применяемые при исследованиях на нейронах позвоночных - высокочастотная стимуляция пре- или постсинаптического нейрона.

Одной из посылок настоящей работы явился тот факт, что при выработке сенситизации на наземной улитке Helix болевой стимул вызывает в командных нейронах оборонительного поведения

U и U /"«( _ <J _

высокочастотный спаиковыи разряд. С другой стороны, известно, что подобный стимул вызывает сенситизацию интактной улитки, т.е. на слабый тактильный стимул животное начинает отвечать выраженной оборонительной реакцией (Balaban and Bravarenko, 1994). Ранее было показано фасилитирующее влияние на командные нейроны серотонина, выделяющегося при нанесении сенситизирующего воздействия (Zakharov et al., 1995). Однако неясно, вносит ли

высокочастотный спайковый разряд в командном нейроне какой-либо вклад в развитие данной сенситизации.

Вопрос о том, участвует ли постсинаптический нейрон в развитии синаптической пластичности у моллюсков дискутировался в литературе довольно долго. К моменту начала настоящей работы наиболее распространенной точкой зрения было отрицание значения постсинаптической клетки в пластических перестройках у беспозвоночных животных. Высказывались даже идеи, что филогенетически первой появилась пресинаптическая пластичность, а затем уже, у позвоночных животных, дополнительно возникли постсинаптические механизмы. Причиной подобного рода воззрений, по-видимому, послужила работа из лаборатории Кендела (Carew, 1984), в которой экспериментально доказывалось, что активация постсинаптической клетки не является ни необходимым, ни достаточным условием для индукции синаптического облегчения, лежащего в основе ассоциативного обучения у аплизии. Тем не менее, в 1994 году из лаборатории Глянцмана вышла работа, в которой сообщалось, что долговременная потенциация в культуре нейронов аплизии может быть индуцирована сочетанием высокочастотной стимуляции пресинаптичсекой клетки с деполяризацией постсинаптического нейрона (Lin and Glanzman, 1994), то есть впервые прямо указывалось на возможную роль постсинапса в индукции синаптического облегчения у моллюсков. В том же году была опубликована статья (Kuhnt et al., 1994), в которой была продемонстрирована возможность индукции долговременной потенциации в нейронах гиппокампа посредством высокочастотной

тетанизации постсинаптического нейрона, что подчеркивает важную роль постсинапса в развитии пластических перестроек у позвоночных. В связи с этим возник вопрос, возможно ли индуцировать синаптическое облегчение путем высокочастотной стимуляции постсинаптического нейрона у моллюсков без афферентной активации.

Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов потенциации, возникающей после внутриклеточной тетанизации командного нейрона (имитирующей вышеописанный спайковый разряд).

Главные задачи.

1. Исследовать возможность индукции синаптической потенциации путем внутриклеточной тетанизации постсинаптического нейрона в изолированной ЦНС моллюска.

2. Определить роль ионов кальция в выработке внутриклеточно индуцированной потенциации (ВКИП) синаптических ответов командных нейронов.

3. Выяснить роль серотонина в индукции ВКИП.

4. Определить, какие вторичные посредники вовлечены в поддержание ВКИП.

5. Исследовать, вовлекаются ли какие-либо ретроградные мессенджеры в развитие ВКИП.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность выработки синаптической потенциации на нейронах моллюска путем внутриклеточной тетанизации постсинаптического нейрона. Обнаружено, что, как и в аналогичных моделях синаптической пластичности на позвоночных животных, запускающим механизмом

ВКИП у моллюсков является увеличение концентрации кальция в постсинаптическом нейроне. Показано, что серотонин не является запускающим механизмом ВКИП в отличие от широко известных моделей гетеросинаптического облегчения у беспозвоночных; однако присутствие серотонина необходимо для реализации долговременной фазы потенциации. Последнее может лежать в основе выявленной сезонной зависимости выраженности ВКИП: долговременная потенциация вырабатывается только в весенне-летний период. Впервые показана возможность участия окиси азота в пластических перестройках у беспозвоночных животных.

Научно-практическая ценность работы. Анализ механизмов ВКИП расширяет представления теоретической физиологии о механизмах обучения и памяти на клеточном уровне в ЦНС животных. Кроме того, совокупность представленных данных о пластических свойствах постинаптического нейрона может найти применение при конструировании нейрокомпьютерных кибернетических систем.

ГЛАВА I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В 1949 г. Дж. Хеббом был предложен механизм, определяющий функциональные изменения эффективности синаптической передачи, которые могут лежать в основе ассоциативного обучения. Хебб предположил, что увеличение силы синапса может происходить когда возбуждение пресинаптического нейрона совпадает по времени и вносит вклад в генерацию спайка в постсинаптическом нейроне (Hebb, 1949). Хотя исходно принцип Хебба был ориентирован на онтогенетическую пластичность, такую как формирование "клеточных ансамблей", он имел колоссальное значение для понимании нейрональных механизмов обучения (см., например, Bienenstock et. al., 1982; Carew et al., 1984; Bliss and Collingridge, 1993; Lin and Glanzman, 1994). В дальнейшем, благодаря бурному развитию исследований на беспозвоночных, в первую очередь на моллюсках, выяснилось, что помимо возможности изменения эффективности синапса с задействованием только двух (пре- и постсинаптической) клеток, существуют ситуации, в которых сила синапса изменяется под воздействием некоторго третьего, модулирующего элемента. Подобный вид пластичности получил название гетеросинаптическая пластичность, или, если рассматривать только облегчение синаптической передачи - гетеросинаптическое облегчение (ГСО).

1.1 МОДЕЛИ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ У

БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ 1.1.1. Гетеросинаптическое облегчение.

Одной из наиболее популярных моделей для исследования механизмов синаптической пластичности на беспозвоночных является рефлекс отдергивания жабры у морского моллюска Aplysia californica, на базе которого довольно легко можно выработать условнорефлекторную реакцию. На этом объекте выполнено такое огромное количество работ, что стоит поподробнее остановиться на описании самой модели. Поведенческий феномен выработки вышеназванного рефлекса состоит в том, что сочетание сильной болевой стимуляции хвоста животного (в ответ на который происходит сокращение жабры) со слабой тактильной стимуляцией сифона (которая в норме ничего не вызывает) приводит к тому, что одна тактильная стимуляция сифона вызывает отдергивание жабры (Carew et al., 1971). Клеточные основы данного рефлекса были детально описаны в целом ряде работ. Было найдено, что существуют примерно 24 сенсорных нейрона, иннервирующих кожу сифона, которые дают возбуждающие входы на группу, состоящую из 6 мотонейронов иннервирующих жабру (Byrne et al., 1978; Kandel et al., 1995). Помимо этого в описываемом рефлексе участвуют как минимум еще одно звено, состоящее из сенсорных нейронов, иннервирующих хвост и возбуждающих особые фасилитирующие нейроны, активация которых обеспечивает сенситизацию сенсомоторного синапса в цепи рефлекса

втягивания жабры (Castelucci and Kandel, 1976). Было показано, что фасилитирующим агентом в случае сенситизации у Аплизии является серотонин (Bruneiii et al., 1976). Одним из первых предложенных объяснений сенситизирующего эффекта серотонина было предположение, что серотонин, действуя через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы активирует потенциал-зависимые кальциевые каналы и, таким образом, увеличивая количество входящего в пресинаптическую терминаль кальция, приводит к возрастанию выброса медиатора из пресинапса (Klein and Kandel, 1978). В дальнейшем было найдено, что помимо прямого действия на кальциевые каналы, цепочка серотонин - цАМФ вызывает также частичную блокаду потенциалзависимых калиевых каналы и, т.о., снижение выходящего калиевого тока. Последнее приводит к увеличению длительностии спайка (т.е. длительности деполяризации) в пресинаптической терминали, что в свою очередь также ведет к возрастанию внутриклеточного кальция и увеличению количества выбрасываемого медиатора (Boyle et al., 1984). Дополнительно, с использованием квантового анализа, было продемонстрировано что основным механизмом поддержания ГСО является увеличение выброса медиатора (Dale et al., 1988). Выяснилось, что помимо цАМФ зависимого пути, при индукции потенциации в сенсо-моторном синапсе Аплизии воздействие серотонина вызывает также активацию протеинкиназы С, которая, в свою очередь, приводит к увеличению выброса медиатора по механизму, не связанному с расширением спайка (Ghirardi et al., 1992).

Однако было понятно, что вышеописанные изменения не могут объснить долговременные эффекты сенситизации, длящиеся до суток и более. Было найдено, что аппликация ингибиторов синтеза белка блокирует развитие долговременной потенциации, однако никак не влияет на кратковременную стадию последней (Montarolo et al., 1986; Schacher et al., 1993). Дальнейшие исследования показали, что вызванное серотонином увеличение концентрации цАМФ запускает фосфорилирование особого транскрипционного фактора CREB (Dash et al., 1990; Kaang et al., 1993), участие которого в процессах, связанных с обучением и памятью было продемонстрировано на многих позвоночных и беспозвоночных животных (Bailey et al., 1996).

Таким образом, более чем 20-летняя история изучения клеточных механизмов рефлекса оттдергивания жабры у Аплизии показала исключительно пресинаптический характер выработки и поддержания этой простейшей формы синаптической пластичности (Kandel et al., 1995). И только совсем недавно были опубликованы две работы из лаборатории Кендела в которых было показано, что для формирования ассоциативной формы обучения на основе рефлекса отдергивания жабры необходимо участие постсинаптического нейрона (Bao et al., 1997, 1998). В этих работах было продемонстрировано, что введение в постсинаптический нейрон кальций-хелатирующего агента EGTA сильно ослабляет индуцированную серотонином сенситизацию сенсомоторного синапса аплизии. Тем не менее, по мнению авторов, поддержание рассматриваемой потенциации осуществляется благодаря пресинаптическим механизмам (Bao et al., 1997, 1998).

Помимо пресинаптических механизмов ГСО была

продемонстрирована возможность участия постсинаптических механизмов в этой модели синаптической пластичности. Так, на гигантских метацеребральных нейронах Helix aspersa серотонин увеличивал ответы, вызванные ионофоретической апликацией ацетилхолина (Сторожук, Антонов, 1980, 1986). В другой работе, выполненной на изолированной ЦНС аплизии было найдено, что вызваная аппликацией серотонина фасилитация ответов на аппликацию возбуждающего медиатора блокируется введением в постсинаптическую клетку ингибиторов синтеза белка (Trudeau and Castelluchi, 1995) Таким образом, в этой работе было убедительно продемонстрировано участие постинаптического нейрона в индукции сенситизации синаптического соединения, участвующего в рефлексе отдергивания жабры. Сравнительно недавно была опубликована работа в которой сообщалось, что долговременная потенциация сенсомоторного синапса аплизии, вызванная сочетанной стимуляцией нерва хвоста и сенсор�