Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональная регуляция и онтогенез медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Функциональная регуляция и онтогенез медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных"
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ РАН
На правах рукописи
ИЕРУСАЛИМСКИЙ Виктор Николаевич
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ И ОНТОГЕНЕЗ МЕДИАТОР-СПЕЦИФИЧНЫХ СИСТЕМ НЕЙРОНОВ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
0034675Э9
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
03-00-13 Физиология
^ ! г- 0
Москва — 2009 год
003467599
Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (зав. лаб. - доктор биологических наук, профессор П. М. Балабан)
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор П. М. Балабан
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, академик РАЕН Сахаров Дмитрий Антонович (Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН)
доктор медицинских наук Никитин Владимир Павлович (Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН)
доктор биологических наук, профессор Пивоваров Аркадий Саулович (Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова)
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН
Защита состоится 3 июня 2009 года в^Ч.ССчасов на заседании Диссертационного совета Д-002.044.01 по защите докторских диссертаций при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН по адресу: 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а Факс (495) 3388500, email: admin@ihna.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Автореферат разослан 2009 года
Ученый секретарь Диссертационного Совета Доктор биологических наук, профессор В. В. Раевский
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Работа нервной системы основана на реализации имеющихся морфологических связей и на их изменении при обучении и в развитии. Для установления связи между морфологией и функцией необходимо выявить и идентифицировать нервные элементы или их ансамбли. Особенностью так называемых простых нервных систем, на которых выполнено данное исследование, является наличие ограниченного числа нейронов, причем нейронов идентифицируемых, т.е. обладающих индивидуальными морфологическими и физиологическими свойствами и, в силу этого, узнаваемых в эксперименте. Основой для идентификации служат три подхода. Во-первых, морфологический: характерное положение и размер сомы, тип ветвления отростков и органы, где заканчиваются отростки. Во-вторых, электрический: тип активности, частота импульсации или ее отсутствие, определенные тормозные и возбуждающие связи с другими нейронами. В-третьих, нейрохимический: определенный тип классического медиатора или нейропептида (нейропептидов). В совокупности, эти особенности нейронов придают им уникальность и определяют их роль в поведении животного. Классификация нейронов по наличному нейроактивному веществу приводит к понятию медиатор-специфичных систем нейронов. Таких систем описано к настоящему времени много (серотонинергические нейроны, ГАМКергические нейроны и т.д.). Анализ экспрессии различных генов в нервных системах беспозвоночных выявляет все новые системы нейронов, объединенные наличием в них различных нейропептидов (Bogdanov et al 1996; Balaban et al 2001). Зачастую, экспрессия определенного гена выявляет единство среди на первый взгляд мало связанных групп и отдельных нейронов. Однако, по-видимому, единство медиатора в разнородных клетках не является случайным фактором, и нейроны в такой системе могут играть общую роль или набор ролей в целостном поведении животного (McCormick et al 1999). Поэтому принято говорить о роли медиатора в поведении. Яркий пример такого рода - серотонин в нервной системе моллюсков (Сахаров 1990; Дьяконова 2007). Хотя по мере накопления знаний в этой области картина все усложняется, медиатор-специфичные системы нейронов по-прежнему являются вполне обособленной единицей в работе нервной системы. Некоторые из этих систем представляют собой единое целое по локализации, морфологии, поведенческой роли (как нейроны, содержащие инсулин-подобные пептиды у Lymnaea - см. van Heumen, Roubos 1990). Другие подразделяются, в свою очередь, на локальные группы (компартменты), как серотонинергические нейроны Helix (Балабан, Захаров 1992). При этом отдельные
компартменты одной медиатор-специфичной системы имеют разные соматотопические организации проекций и участвуют в разных формах поведения.
Развитие в онтогенезе многих (но далеко не всех) медиатор-специфичных систем нейронов моллюсков было исследовано (Voronezhskaya, Elekes 1993; Elekes et al 1996; Croll et al 1999). Как правило, для их развития характерны определенные закономерности, отличающие их от других аналогичных систем нейронов (сроки и темпы развития, преимущественное развитие отдельных кластеров). Возрастные изменения внутри этих систем, как правило, не заканчиваются в эмбриогенезе и могут лежать в основе меняющегося с возрастом поведения животного (Marois, Carew 1997; Marois, Croll 1992). Система нейронов может меняться морфологически и в процессе обучения (Alvarez, Sabatini 2007).
Для нервных систем беспозвоночных весьма характерно численное преобладание нейронов, содержащих нейропептид (нейропептиды) над нейронами, содержащими какой-либо классический медиатор. Так, например РМЯРамид-содержащих нейронов в ЦНС улитки Helix выявлено около 1100 (Elekes, Nassel 1990), педальный пептид-содержащих нейронов - около 1300 (Pavlova, Willows 2005), а серотонинергических нейронов - всего около 250 (Hernadi et al 1989). Для большинства выявленных в ЦНС беспозвоночных нейропептидов не доказано, что они являются медиаторами, то есть непосредственно выделяются в синапсе. Напротив, показано, например, для Drosophila, что подавляющее большинство ее нейропептидов выделяется внесинаптически (Santos et al 2007). Однако, внесинаптическое выделение нейроактивных веществ вообще типично для беспозвоночных. Оно существует в различных видах: выделение веществ из сомы, из варикозностей на отростках и т.д. (Noel, Mains 1991; Szapiro, Barbour 2007). Внесинаптическое выделение вещества из конкретного нейрона может сочетаться с его синаптическим выделением (DeMiguel, Trueta 2005). Поэтому внесинаптическое выделение веществ, особенно если это -единственный способ выделения для данного вещества или данного класса нейронов, не может считаться в настоящее время критерием того, что вещество не является медиатором.
До настоящего времени большинство нейрофизиологических работ делается при явном или неявном признании теории синаптической организации нейронных сетей ("wiring transmission"), у истоков которой стоял Рамон-и-Кахал. Идея Гольджи о диффузной нервной сети (непрерывность межнейронных связей) получает все большее признание по мере накопления знаний (Zoli, Agnati 1996). Взаимодействие нейронов помимо их синаптических связей многообразно (Agnati et al 2006). Кроме электрических и химических сетевых сигналов между нейронами существуют и электрические связи через посредство экстраклеточных полей и передача химического сигнала с нейрона на нейрон, в той или иной степени минуя синапс ('volume transmission"). Эти два внешне альтернативных, а на самом
деле - взаимодополняющих способа регуляции вносят свой вклад, величина которого зависит от конкретной ситуации.
По мере накопления знаний о тех ролях, которые играют нейроактивные вещества, ситуация становится все менее описываемой: ни про одно вещество нельзя сказать, что оно участвует только в данном типе поведения или хотя бы взаимодействует только с данным типом рецепторов, как и ни про одну функцию нельзя сказать, что она зависит только от данного медиатора (Brezina, Weiss 1997). Функционально-морфологические исследования могут, тем не менее, несколько прояснить ситуацию: выявить единство разнородных клеточных элементов по их медиаторности, определить тип нейронов, экспрессирующий данное вещество, обнаружить закономерности в регуляции экспрессии данного вещества. Эта область пока изучена явно недостаточно, мало описаны изменения в экспрессии медиаторов (включая нейропептиды), вызванные возрастными изменениями или функциональными регуляциями.
Вопросам, связанным с закономерностями в возрастной и функциональной экспрессии некоторых нейроактивных веществ, и посвящена данная работа.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было исследование развития медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных животных в сопоставлении с поведением и изучение общих морфологических особенностей строения и функциональной регуляции экспрессии пептидергических систем нейронов у различных беспозвоночных. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
1. Изучить развитие ЦНС улитки Helix в онтогенезе.
2. Исследовать в ЦНС взрослых и ювенильных улиток Helix распределение серотонин- и дофаминсодержащих нейронов. Исследовать проекции серотоиинергических модуляторных нейронов педальных ганглиев у взрослых и ювенильных животных. Выяснить, какие морфологические особенности серотоиинергических нейронов в ювенильной ЦНС могут лежать в основе наблюдаемых возрастных отличий поведения.
3. Изучить онтогенетическое развитие ГАМКергических нейронов улитки Helix и исследовать их роль в поведении.
4. Провести сравнительное исследование регуляции синтеза нескольких нейропептидов в ЦНС улитки Helix (нейропептиды семейства CNP, педальный пептид, FMRFaMHfl). Изучить в ЦНС беспозвоночных, принадлежащих к различным типам (моллюски, насекомые, кольчатые черви) строение системы нейронов, содержащих нейропептиды семейства CNP, и исследовать возрастные и функциональные изменения в этой системе. Исследовать особенности проекций различных типов первично-сенсорных
нейронов в щупальцах улитки Helix в связи с их медиаторностью. Изучить морфологические основы функций нейронов, содержащих инсулин-подобные пептиды, в ЦНС улитки Helix.
Научная новизна работы.
1. Впервые описано развитие нервной системы улитки Helix в онтогенезе и составлена шкала стадий развития.
2. Впервые показано, что влияние целой группы модуляторных серотонинергических нейронов на командные нейроны оборонительного поведения осуществляется через посредство одного нейрона (Пд4). Выяснено, что в основе возрастных особенностей поведения у ювенильных животных лежит отставание в развитии серотонинергических модуляторных нейронов (меньшее число и меньшие относительные размеры нейронов).
3. Впервые описано формирование ГАМКергической системы нейронов в ЦНС улитки в эмбриональный и ранний постэмбриональный периоды жизни.
4. Впервые показано, что в ЦНС беспозвоночных различных типов нейроны, содержащие нейропептиды CNP семейства, имеют сходный тип морфологии: интернейроны, сенсорные нейроны и нейроэндокринные клетки. Показано, что экспрессия CNP нейропептидов лабильна, тогда как синтез FMRFaMHfla и педального пептида не зависит от внешних воздействий.
Научно-теоретическое и практическое значение работы.
Теоретическое значение полученных результатов состоит в выявлении морфологической основы механизма модуляции оборонительного поведения и его онтогенетических изменений. Описание развития нервной системы улитки Helix является необходимой основой для последующего изучения онтогенетического формирования медиатор-специфичных нейронных систем и отдельных нейронов. Представление о наличии различных типов регуляции экспрессии нейропептидов существенно дополняет существующие представления о работе систем пептидергических нейронов. Выявленная в филогенезе беспозвоночных морфологическая консервативность локализации сходных нейропептидов позволяет уточнить классификацию нейропептидов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В основе работы серотонинергических нейронов, модулирующих оборонительное поведение, лежат принципы компартментапизации медиатор-специфичной системы и делегирования функций, выражающиеся в определенной соматотопике проекций, меняющейся в онтогенезе.
2. Нейропептиды можно классифицировать по степени зависимости их экспрессии от возрастного и функционального состояния животного. Нейропептиды одного семейства экспрессируются в сходных функциональных типах нейронов у разных беспозвоночных животных.
Апробация работы. Материалы диссертации многократно докладывались на отечественных и международных симпозиумах и конференциях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 статьи в реферируемых журналах, из них 8 в отечественных и 15 в международных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, семи глав с изложением результатов, общего обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 3 таблицы и 87 рисунков.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. Объекты исследования Работа выполнена на беспозвоночных нескольких типов. Основные исследования проведены на виноградной улитке Helix lucorum L. Исследование моноаминергической системы нейронов выполнено на улитках видов Helix lucorum L. и Eobania vermiculata L. Развитие нервной системы и формирование ГАМК-ергических нейронов проведено на улитке Helix aspersa L. Нейропептиды CNP семейства изучались на моллюсках Helix lucorum L., Aplysia californica, Lymnaea slagnalis L., на кольчатых червях Hirudo medicinalis и Lumbricus terrestris, на насекомых Drosophila, Acheta (сверчок), Apis milliformis (пчела), Blattella germanica (таракан), Chironomus (комар).
2. 2. Ретро- и антероградиые прокраски нейронов При ретроградной прокраске нерв всасывали в микропипетку, заполненную раствором красителя. Применявшиеся красители: 4% раствор никель-лизинового комплекса или гексаметония кобальта, 10% раствор Lucifer Yellow, 10% раствор нейробиотина. Время заполнения составляло обычно 12-24 часа при 18-22°С. Дальнейшие процедуры зависели от типа красителя. В качестве фиксатора использовали 4% раствор параформальдегида в 0.1 М PBS.
Для внутриклеточного заполнения нейронов использовали микроэлектрод, заполненный либо 4% раствором гексаметония кобальта, либо 5% раствором нейробиотина. Раствор вводили давлением при помощи микроинжектора, либо ионофоретически. В первом случае процедура требовала интенсификации (описано Chase 1986). Во втором случае препараты проявляли при помощи ABC метода.
2.3. Изучение содержания металлов в нервной системе виноградной улитки
При исследовании природы тяжелого металла в нейронах церебральных ганглиев улитки была использована реакция осаждения восстановленнного серебра на молекулах сульфидов тяжелых металлов по методу Тимма и ряд химических тестов. Реакция по методу Тимма сходна с реакцией интенсификации, описанной Chase (1986). Химические тесты на присутствие ионов цинка включали в себя тесты с кислотами, реакцию Гомори на железо, реакции с ферро- и феррицианидами, тесты на цинк с дитизоном и с образованием пигмента «цинковой зелени».
2. 4. Эмбриологические исследования Кладки яиц были получены от улиток Н. aspersa. Кладки извлекали из земли и помещали в чашки Петри на влажную бумагу. Для наблюдения за живыми эмбрионами яйца извлекали из оболочек. Для исследования строения эмбрионов яйца фиксировали в 4% растворе параформальдегида. Исследовали эмбрионы на поздних стадиях развития. Для иммуноцитохимических исследований использованы животные на стадиях от трохофоры до вылупления.
2. 5. Неиммуноцитохимическое выявление моноаминов Для выявления серотонина и дофамина в нейронах использовали гистохимическую методику с глиоксиловой кислотой и метод мечения нейротоксином 5,7-DiHT. Первый метод (Salimova et al 1987) применяли на замороженных срезах ЦНС. Нейротоксин 5,7-DiHT вводили ювенильным животным путем их купания в растворе токсина (1 мг/мл) с добавлением аскорбиновой кислоты (1.4 мг/мл). Концентрация была в 50 раз выше, чем та, что используется для инъекции взрослым животным. Интервалы купания перемежались отдыхом животных. Через 4-5 недель после купания в растворе токсина нервную систему извлекали и фиксировали.
2. 6. Иммуноцитохимические методы В качестве фиксатора использовали 4% раствор ПФС. В некоторых сериях к нему добавляли 0.1% глютаровый альдегид или пикриновую кислоту (насыщенный раствор). Эксперименты выполнены как на препаратах целой ЦНС (взрослые животные и эмбрионы), так и на срезах ЦНС (замороженные и парапластовые срезы). При работе на ЦНС препараты после предварительной обработки ферментами, снятия оболочек и выдерживания в блокирующем растворе помещали в раствор первичного антитела, а затем - вторичного антитела, сделанный на блокирующем растворе. Блокирующий раствор содержал 0.5% Тритон Х-100, 0.01% азид натрия, 6% сыворотку, 5% бычий сывороточный альбумин. Время инкубации составляло 48-72 часа при 4° С. Между инкубациями препараты отмывали в блокирующем растворе. Разведение первичных и вторичных антител зависело от их типа и подбиралось экспериментально. В качестве вторичных антител мы использовали иммуноглобулины, соединенные с различными
флуоресцентными группами (FITC, TRITC, AlexaFIuor, Quantum dots) или с биотипом. В последнем случае окрашивание выявляли по обычной методике с использованием ABC комплекса.
При работе на срезах препараты, после фиксации и отмыва в PBS, либо резали на замораживающем микротоме (10-20 мкм), либо проводили по спиртам и заливали в парапласт. Толщина парапластовых срезов составляла от 5 до 20 мкм в разных сериях. После обычной процедуры регидратации срезов их использовали для иммуноцитохимического исследования. Время инкубации с первичными и вторичными антителами было меньше, чем при работе с препаратами целой ЦНС. Срезы во время инкубаций были покрыты кусочком пленки Parafilm и помещены во влажную камеру. Готовые препараты заключали в различные заливочные среды и исследовали при помощи микроскопа AxioPlan (Zeiss, Germany), снабженного устройством для ввода данных и программой анализа изображений KS-300.
Для проверки специфичности иммунного окрашивания ставили контрольные эксперименты. В первой серии опускалась стадия обработки первичными антителами. Во второй серии использовали раствор первичных антител, предварительно истощенный взаимодействием с раствором соответствующего антигена.
2. 7. Метод гибридизации in situ Данный метод позволяет выявить мРНК, кодирующую белок-предшественник изучаемого нейропептида. Мы использовали зонды к двум типам мРНК: к мРНК, кодирующей педальный пептид и FMRFaMHÄ. В качестве метки в обоих случаях служил DIG-оксигенин, выявляемый затем антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой. Последовательность процедур и состав используемых растворов описаны ранее (Bogdanov et al 1998). Методика адаптирована для работы с целыми препаратами ЦНС улитки.
2. 8. Электронно-микроскопические исследования (работа выполнена совместно с сотрудниками группы В.А.Попенко из Ин-та молекулярной биологии им. Энгельгардта)
Для изучения локализации продуктов гена HCS2 в командных нейронах клетки (выделенные из ЦНС или переживающие в культуре) фиксировали в 4 % параформальдегиде и заключали в смолу "Lowicryl К4М" по стандартной методике (Carlemalm et al 1982). Ультратонкие срезы (50-70 нм) получали на ультратоме LKB. Срезы помещали на медные или никелевые сеточки, покрытые формварово-угольной пленкой, инкубировали в 0.2 М глицине, затем в 0.5 % растворе бычьего сывороточного альбумина с 0.02 % ПЭГ и промывали в PBS. Далее срезы инкубировали 60 мин со специфическими кроличьими антителами (5-20 мкг/мл), промывали и инкубировали 45 мин с комплексами антикроличьих антител с коллоидным золотом с (размер частиц 10 нм). Срезы контрастировали 2 % водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Для проверки специфичности маркирования
срезы инкубировали с комплексами антивидовых антител с золотом без инкубации со специфическими антителами или на стадии инкубации со специфическими антителами в реакционную смесь добавляли соответствующий антиген в концентрации 0.1-0.5 мг/мл. В обоих случаях частицы золота на срезах практически отсутствовали. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-100 СХ ("Jeol", Япония).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Онтогенез виноградной улитки
3.1.1. Формирование нервной системы Helix в онтогенезе
До настоящего времени не был подробно описан ни эмбриогенез наземных легочных моллюсков, ни их нейрогенез. Развитие Helix проходит внутри яйца (эмбриональной капсулы). К моменту вылупления животное полностью сформировано. Работа выполнена на эмбрионах улиток Н. aspersa. Стадии развития эмбрионов моллюсков были описаны на моллюске Lymnaea stagnalis (Raven 1966; Mescheriakov 1975). Используя этот подход, мы исследовали развитие Helix и создали повременную шкалу развития (Рис. I). При 20° С период от откладки яиц до вылупления составляет 16 дней, нервная система развивается в период от начала формирования раковины на 9-й день до вылупления на 16-й день.
Дни
Рис. 1. Диаграмма развития эмбрионов улитки Helix при 20° С относительно оси времени, начиная со стадии трохофоры. В качестве критериев стадий развития были выбраны размер эмбриона и основные морфологические характеристики.
Мы разделили этот период на семь стадий (Е10-Е16, 56.25%-100% от общего времени развития). За 0% принято время откладки яиц, за 100% - время вылупления.
Эмбриональная раковина и нога появляются у 8.5-дневного эмбриона, через 12 часов появляется педальный синус - специализированная структура, движения которой способствуют дыханию эмбриона. На стадии ЕЮ (от появления педального синуса и до начала закручивания тела улитки) раковина покрывает заднюю треть висцеральной массы. Эмбрион вращается в капсуле со скоростью около одного оборота за 8 минут. Омматофоры различимы. В задней части эмбриона видны сердце и аорта. Заметны церебральные ганглии, соединенные церебральной комиссурой, и раздельные педальные ганглии. Церебральные и педальные ганглии не соединены коннективами. На стадии Ell появляются ринофоры. Различимы буккальные ганглии, соединенные буккальной комиссурой. Педальные ганглии соединены ростральной комиссурой. Сформированы церебро-педальные коннективы. На стадии Е12 половину тела составляет покрытая раковиной висцеральная масса, а половину -цефалический желудочек. Эмбрион напоминает миниатюрного гиппопотама (аналогичная стадия развития у прудовика была названа hippo). Хорошо различимы ринофоры и статоцисты. Сердце состоит из предсердия и желудочка. Плевро-парието-висцеральный комплекс ганглиев соединен коннективами с педальными и церебральными ганглиями. Сформирована каудальная педальная комиссура. Наблюдаются спонтанные движения глотки. Тактильная стимуляция ноги вызывает ее сокращения. На стадии Е14 наблюдаются спонтанные сокращения ноги и щупалец. Тактильная стимуляция кожи вызывает локальные сокращения ноги и оматофоров. На стадии Е15 наблюдаются спонтанные сокращения омматофоров, а тактильная стимуляция вызывает их втягивание. Сильная тактильная стимуляция различных частей тела приводит к разнообразным реакциям животного. Стимуляция щупальца вызывает сокращение щупальца и ипсилатеральной части головы. Стимуляция ростральной и хвостовой части ноги вызывает локальное сокращение кожи и частичное сокращение соответствующей ипсилатеральной части тела. Стимуляция ноги в ее средней части приводит к сокращению ипсилатерального края ноги. На последней стадии развития - Е16 - омматофоры в норме втянуты. После вылупления из яйца улитки остаются в «гнезде», питаясь остатками яйцевых оболочек, а через 3-5 дней вылезают из земли и расползаются.
3.1. 2. Развитие системы неидентифицируемых нейронов: процеребрум
Наземные моллюски обладают хорошо развитым обонянием и имеют специализированный отдел мозга, отвечающий за анализ запахов - процеребрум. Эта часть церебрального ганглия состоит из мелких нейронов и содержит в себе около половины всех клеток ЦНС. Благодаря отсутствию эндорепликации (полиплоидности) в процеребруме.
бромодеоксиуридиновый метод выявляет в нем лишь клетки, находившиеся к моменту введения бромодеоксиуридина (ВШЯ) в процессе деления. До настоящего времени зоны происхождения нейронов в ЦНС наземных моллюсков не были идентифицированы, тракты миграции не найдены. Работа была выполнена совместно с И. С. Захаровым. В разные сроки после вылупления (2 дня, 2 недели, 1 месяц) животных купали в растворе ВШЯ. Время включения метки составляло 1.5 часа (инкубация) плюс 1 час (время разложения метки в организме). Каждая из экспериментальных групп подразделялась на подгруппы, с разным временем фиксации ЦНС. Сроки составляли: 2 дня, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 2.5 месяца, 3 месяца. Клетки, меченные ВШИ., найдены во всех ганглиях ЦНС, так как эндорепликация ДНК идет в гигантских нейронах улитки в постмитотический период. В процеребрумах животных всех экспериментальных групп присутствовали нейроны, меченные ВШИ.. У животного, получившего ВШ11 в 2-дневном возрасте и зафиксированного через 2 дня, найдены сотни меченых клеток в процеребруме. У животного, получившего ВШИ. в возрасте 1 месяц и зафиксированного через 2 дня, найдены только десятки меченых клеток в процеребруме. Число новых клеток, появляющихся в процеребруме в постнатальном онтогенезе, постепенно убывает. Если период между инкубацией и фиксацией ЦНС составлял 2 дня, то меченые клетки составляли компактную группу в апикальной части процеребрума, лежавшую у основания соединительного тяжа, служащего направляющей осью, по которой новые нейроны диффундируют в формирующийся процеребрум. Таким образом, нейроны процеребрума образуются вне ЦНС и мигрируют в нее по соединительнотканному тракту. Если период между инкубацией животного и фиксацией ЦНС составлял 2 недели, то меченые клетки были видны как полоса в средней части процеребрума. При максимальном периоде между инкубацией и фиксацией (3 месяца) нейроны, меченые у животных в возрасте 2 дней после вылупления, располагаются примерно на 75% длины процеребрума, если считать от апикального его конца. Это предполагает, что примерно 25% нейронов процеребрума сформировано в период пренатального развития и в первые два дня после вылупления.
3. 2. Морфо-функциональные взаимоотношения в системе катехоламинергических нейронов виноградной улитки
Серотонин и дофамин играют важную роль в организации различных форм поведения у моллюсков. Серотонинергические нейроны педальных ганглиев модулируют оборонительное поведение улитки, что хорошо показано в целом цикле работ, выполненных в нашей лаборатории (Балабан, Захаров 1992; 7ак1шгоу е1 а1 1995). Кратко ситуация может быть изложена следующим образом: при ритмической стимуляции интестинального нерва, в котором содержатся отростки сенсорных нейронов, пресинаптических к командным
нейронам, в командном нейроне оборонительного поведения регистрируются комплексные ВПСП, которые со временем уменьшаются по амплитуде. Однако если одновременно стимулировать экстраклеточно серотонинергические нейроны из ростро-медиальной области педальных ганглиев, то ВПСП не уменьшаются, а начинают увеличиваться. Прямое действие серотонинергических нейронов на командные нейроны отсутствует, но они способны модулировать текущую активность командных нейронов. То, что проявляется в эксперименте на изолированной ЦНС, существует и на уровне целого организма, что было впрямую продемонстрировано как на полуинтактном препарате, так и в поведенческих опытах (Zakharov, Balaban 1987; 1991; Балабан, Захаров 1992; Zakharov et al 1995).
3. 2. 1. Морфология серотонинергических и дофамииергических нейронов во взрослой ЦНС
Большинство серотонинсодержащих клеток располагается кластерами в педальных ганглиях (приблизительно 155 клеток). Они расположены на дорзальной и на вентральной поверхности, соединяясь в ростромедиальной области ганглия, состоящей исключительно из серотонинергических клеток (Рис. 2). Нейроны из ростромедиальной доли (физиологически описанные как модуляторные нейроны для оборонительного поведения) посылают отростки в основном в 3 кожных педальных нерва и в 1-2 педальные нервы. Вторая большая группа серотонинергических клеток расположена в церебральных ганглиях в виде полосы на вентральной поверхности, идущей от гигантской метацеребральной клетки к
500м™
Рис. 2. Схема расположения серотонинергических (открытые кружки) и дофаминовых (черные кружки) нейронов в париетальных (вверху) и педальных (внизу) ганглиях ЦНС виноградной улитки. В каждой паре схем сверху ганглии взрослой, снизу - ювенильной ЦНС.
границе ганглия. Третья группа серотонинергических нейронов находится на границе висцерального и правого париетального ганглиев.
Дофаминсодержащие нейроны найдены в буквальных ганглиях, церебральных ганглиях (6-8 крупных дорзальных клеток и около 80 мелких на вентральной поверхности) и в педальных ганглиях (около 40).
3. 2. 2. Проекции нейронов педальных ганглиев и принцип делегирования
Внутриклеточные прокраски отдельных нейронов педальных ганглиев показали, что типы ветвления и набор нервов, куда посылают отростки нейроны, крайне вариабельны. Каждый педальный ганглий соединен 10 мышечными нервами с мышцами стенки тела. Кожа и подкожные мышцы ноги улитки иннервируются тремя педальными кожными нервами (Schmalz 1914). Именно по этим нервам в ЦНС передается информация о нанесенных тактильных стимулах, поэтому нас интересовало, где находятся тела нервных клеток, посылающих отростки в эти нервы. Ретроградные прокраски ЦНС улитки по трем кожным нервам левого педального ганглия (правые нервы связаны также и с регуляцией половой системы) показали, что во все три кожные нерва посылает свои отростки большое число нейронов, причем расположенных не только в педальных ганглиях. В педальном ганглии выкрашиваются целые скопления нейронов, включающие в себя и серотонинергические нейроны ростральной области. Многие из них посылают отростки сразу в два кожных нерва.
Рис. 3. Связи между париетальными ганглиями (где локализованы командные нейроны оборонительного поведения) и педальными ганглиями (где расположены модуляторные серотонинергические нейроны) в ЦНС улитки. А - нейроны педального ганглия, посылающие отростки в париетальные ганглии через плевро-париетальную коннективу. Черным цветом закрашены серотонинергические нейроны. Б - ветвление нейрона ЛПд4. В - ветвление нейрона ЛПаЗ.
Предполагая, что модуляторные нейроны посылают отростки к командным нейронам, мы окрашивали педальные нейроны через плевро-педальную, парието-плевральную, парието-париетальную коннективы. По мере удаления от педальных ганглиев выявлялось все меньше нейронов. В область, где расположены отростки командных нейронов, свои отростки посылает только около 10 нейронов педальных ганглиев, причем лишь один из них содержит серотонин - Pd4 нейрон (Рис. 3). Наличие развитой системы связей внутри группы серотонинергических нейронов предполагает, что модуляция осуществляется путем делегирования функций от многих нейронов данной группы - одному нейрону.
Нейроны ростро-медиальной области педальных ганглиев, как правило, униполярны (мало мелких отростков). Дендритное же дерево Pd4 нейрона охватывает основной нейропилярный тракт, идущий к ростро-медиальной области. Считается (Chase, Tolloczko 1992), что мелкие отростки вблизи тела униполярного нейрона улитки являются постсинаптической областью. Можно предположить, что мощное скопление отростков вблизи сомы Pd4 нейрона также служит для передачи на него влияний от пресинаптических нейронов. Нейрит Pd4 нейрона, обогнув тракт в ростро-медиальной области, идет в париетальные ганглии, посылая ветви в левый паллиальный; интестинальный и анальный нервы.
В наших экспериментах (работа выполнена совместно с Н. И. Браваренко) подверглась проверке гипотеза о том, что одна серотонинергическая клетка (Pd4) является а) необходимой и б) достаточной для развития эффектов модуляторных серотонинергических нейронов на командные нейроны оборонительного поведения. При изучении влияния на динамику ВПСП в командных нейронах оборонительного поведения внутриклеточной стимуляции серотонинергических нейронов из ростро-медиальной области было показано, что эффект модуляции наблюдается далеко не всегда, если внутриклеточно стимулируют нейроны, выбранные случайным образом. Однако, если внутриклеточно стимулируемый нейрон - Pd4, то наблюдается классический модуляторный эффект (увеличение амплитуды ВПСП, т.е. распривыкание), что и при экстраклеточной стимуляции ростро-медиальной области педальных ганглиев. Таким образом, этот нейрон - необходим и достаточен для развития модуляторного эффекта.
3. 2. 3. Формирование серотонинергических и дофаминергических нейронов и их проекций в онтогенезе
Нейрогенез у брюхоногих моллюсков не заканчивается моментом вылупления. Серотонинсодержащие нейроны появляются в эмбриогенезе в определенном порядке, а постнатальное увеличение их числа происходит без увеличения числа кластеров (Diefenbach, Goldberg 1990; Nolen, Carew 1994). Мы исследовали распределение серотонин- и
дофаминсодержащих нейронов в ЦНС улиток в возрасте одного месяца после вылупления. Число и распределение катехоламинергических кластеров клеток и крупных идентифицируемых нейронов в значительной степени совпадает у молодых и взрослых животных (Рис. 2). Общее число серотонинсодержащих нейронов в педальных ганглиях ювенильных животных в 4 раза меньше, чем у взрослых. У ювенильных животных на дорзальной поверхности церебральных ганглиев выявлены серотонинсодержащие нейроны, не встречающиеся во взрослом возрасте: одна большая клетка и две среднего размера. Число дофаминсодержащих нейронов совпадало у взрослых и ювенильных животных.
3. 2. 4. Ювенильная нервная система: морфологическая основа возрастных особенностей поведения
Ранее было установлено (Zakharov, Balaban 1987), что оборонительное поведение ювенильных улиток существенно отличается от поведения у взрослых: амплитуда ВПСП в командных нейронах в ответ на стимуляцию по нерву уменьшается со временем быстрее, чем у взрослых животных и добиться распривыкания стимуляцией серотонинергических нейронов ростро-медиальной области не представляется возможным. Такая же динамика привыкания наблюдается при нанесении тактильного стимула на щупальце животного. Таким образом, ювенильное животное в меньшей степени проявляет реакции на потенциально опасный стимул. Установив, что общее число серотонинергических нейронов педальных ганглиев у ювенильных животных значительно меньше, чем у взрослых животных, мы исследовали, каких именно нейронов «не хватает» в ювенильной нервной системе. Отметим, что Пд4 нейрон выявляется в эмбриональной нервной системе за два дня до вылупления животного. Нами были поставлены опыты по прокраске педальных ганглиев через плевро-педальную коннективу, 2-ой и 3-ий кожные нервы, так как большинство ростральных серотонинергических нейронов педальных ганглиев посылает отростки в эти тракты. В кожные нервы посылают отростки все нейроны, имеющие отношение к оборонительному поведению (мотонейроны, модуляторные нейроны, сенсорные нейроны).
У взрослых животных в плевро-педальную коннективу посылают отростки около 120 нейронов из ипсилатерального педального ганглия, у ювенильных животных - около 70. Это возрастное различие в основном связано с двумя кластерами, один из которых состоит из мелких нейронов в ростро-медиальной области.
Во 2-ой кожный нерв посылает свои отростки около 450 нейронов из ипсилатерального педального ганглия у взрослых животных и около 340 - у ювенильных. Около 15 ростро-медиальных нейронов окрашивается по этому нерву и у ювенильных, и у взрослых животных. Однако размеры нейронов в этой области у ювенильных животных заметно меньше, относительно размеров ганглия, чем у взрослых животных (Рис. 4).
В 3-ий кожный нерв посылает свои отростки около 140 нейронов из ипсилатерального педального ганглия у взрослых животных и около 100 - у ювенильных (Рис. 5). В ростро-медиальной области их в 2 раза меньше у ювенильных животных, чем у взрослых, а относительные размеры, как и в случае 2-го нерва, существенно уступают взрослым размерам.
Рис. 4. Схема нейронов левого педального ганглия ЦНС ювенильной (слева) и взрослой (справа) виноградной улитки, окрашенного по второму кожному нерву этого же ганглия (нерв отмечен стрелкой).
1 кн 2 кн
ПлПдК 1 МН
Заполняемые нервы
1 день 1 неделя 2 недели взрослые Возраст
ювенильные Helix
взрослые Helix
Рис. 5. А - число нейронов в педальном ганглии, посылающих отростки в (слева направо) 1,2, 3 кожные нервы этого ганглия, в плевро-педальную коннективу, в 1 мышечный нерв этого ганглия. Прокраски в ЦНС взрослого (белые столбики) и ювенильного (2 недели после вылупления, черные столбики) животного. Б -возрастная динамика числа нейронов, выявляемых в педальном ганглии при прокраске по 2 кожному нерву.
3. 3. Строение и развитие ГАМКергической системы нейронов
На ряде видов моллюсков была изучена роль ГАМК в системе пищевого поведения (Arshavsky et al 1993; Norekian 1999; Richmond et al 1986; Cooke et al 1985). ГАМК оказывала противоположные эффекты у разных видов: активация пищевой моторной активности у Clione и Helisoma, и снижение пищевой моторной активности у Limax.
У Helix было показано тормозное и возбуждающее действие ГАМК на различные идентифицированные нейроны, включая нейроны буккальных ганглиев, участвующие в пищевом поведении (Балабан с соавт 1980; Haarmeier et al 1994).
Мы изучали формирование ГАМК-ергической системы нейронов в онтогенезе Helix. В ЦНС взрослых улиток были найдены приблизительно 220 ГАМК-ергических нейронов, локализованных в буккальных, церебральных и педальных ганглиях (Рис. 6). Популяция включала четыре пары буккальных нейронов, три кластера нейронов в каждом педальном ганглии, два кластера и 6 отдельных нейронов в каждом церебральном ганглии. Во всех ганглиях и в некоторых нервах были найдены ГАМК-ергические волокна.
Рис. 6. Схема ГАМК-ИР элементов в ЦНС Helix. В париетальных ганглиях пустыми кружками показаны командные нейроны оборонительного поведения (не содержат
В эмбриогенезе первая пара ГАМК-иммунореактивных (ИР) нейронов была выявлена в буккальных ганглиях на стадии около 63-64% развития. Вслед за этим, в церебральных ганглиях появляются пять пар ГАМК-ИР нейронов. В течение последующих 30% эмбрионального развития еще три пары ГАМК-ИР нейронов появляется в буккальных ганглиях и более пятнадцати клеток в каждом церебральном ганглии. Первая пара ГАМК-ИР нейронов в педальных ганглиях найдена на 70% развития. В плевро-парието-висцеральном
ПдГ
ГАМК).
комплексе ганглиев первые ГАМК-ИР волокна найдены на стадии около 90% эмбрионального развития. В постнатальный период число ГАМК-ИР нейронов возрастало и достигло взрослого числа за четыре дня в церебральных ганглиях и в течение трех недель в педальных ганглиях. В педальных ганглиях эмбрионов выявлены ГАМК-ИР нейроны, не детектирующиеся у взрослых животных (четвертый кластер).
3. 4. Нейропептиды с постоянным типом экспрессии: инсулин-подобные пептиды моллюсков, педальный пептид, ГМКГамид
3. 4.1. Инсулин-подобные пептиды моллюсков
Семейство инсулин-подобных регуляторных пептидов было найдено как у позвоночных, так и у ряда беспозвоночных, включая насекомых, нематод, моллюсков (Claeys et al 2002). У моллюсков инсулин-подобные пептиды найдены в нейронах ЦНС. Они вовлечены в метаболизм гликогена, регуляцию роста и развития, ингибиторный контроль над клетками, синтезирующими гонадотропный гормон моллюсков (Gomot et al 1992; Geraerts, Smit 1991; Wijdenes et al 1987). Локализация и проекции нейронов, синтезирующих инсулин-подобные пептиды, мало изучены у улитки Helix. В нашей работе мы локализовали этот класс нейронов при помощи иммуноцитохимических методов, ретро- и антероградных прокрасок нейронов. Оказалось, что экспрессия инсулин-подобных пептидов у Helix чрезвычайно стабильна: они детектируются в двух группах нейронов в церебральных ганглиях общей численностью около 100 клеток (Рис. 7). Все отростки иммунореактивных нейронов заканчиваются либо в дорзальном теле (синтезирующем гонадотропный гормон), либо в церебральной артерии. Выявлены три типа строения этих нейронов: одни посылают отросток в нерв церебральной артерии, другие - в нерв дорзапьного тела, третьи - в оба этих нерва.
Рис. 7. Нейроны, содержащие инсулин-подобные пептиды, в ЦНС улитки Helix. Сокращения: НДТ-нерв дорзального тела, НЦА - нерв церебральной артерии, КомД, ПлД - комиссуральная и плевральная доли постцеребрума.
В (3-клетках поджелудочной железы млекопитающих, где происходит синтез инсулина, присутствует большое количество ионов Хп, участвующего в связывании
инсулина с белками секреторных гранул и в высвобождении инсулина из гранул (De Grootm 1989). Мы предположили, что цинк может содержаться в нейронах церебральных ганглиев улитки, содержащих инсулин-подобные пептиды. Применяя методы гистохимии, мы доказали эту гипотезу: цинк выявляется в телах и отростках нейронов, содержащих инсулин-подобные пептиды. У ювенильных животных цинк в этих нейронах не детектируется.
3. 4. 2. Педальный пептид и FAIR Гам ид
В ЦНС виноградной улитки найдено иммуноцитохимически около 1300 нейронов, содержащих педальный пептид и расположенных во всех ганглиях (Pavlova, Willows 2005). РМИРамид-содержащие нейроны (около 1100) были ранее иммунохимически выявлены во всех ганглиях ЦНС, кроме буккальных (Elekes, Nassel 1990; Marchand et al 1991). Иммуноцитохимическое окрашивание отражает наличие медиатора в нейронах. Эти данные не обязательно совпадают с данными по распределению мРНК, кодирующей медиатор. Нашей задачей было сравнить данные, получаемые двумя методами, с целью определить, зависит ли синтез этих двух нейропептидов от внешних воздействий. Помимо ЦНС, зафиксированных в нормальных условиях, мы изучали ЦНС, взятые из животных, подвергнутых болевому воздействию (разрез ноги за 4-8 часов до выделения препарата), вибрации (вращение на магнитной мешалке), условиям невесомости (полет на станциях Фотоп-М-2 и Фотон-М-3). Наши данные по распределению нейронов, содержащих педальный пептид (ПЕП), полученные иммуноцитохимическим методом и методом мРНК-гибридизации, совпадали. Нейроны найдены в церебральных ганглиях (около 15 групп). Сотни нейронов процеребрума также экспрессировали ПЕП. В педальных ганглиях нейроны, содержащие ПЕП, лежат плотной массой в каудапьной половине каждого ганглия (Рис. 8). В меньшем количестве ПЕП-содержащие нейроны найдены в плевро-парието-висцерапьном комплексе ганглиев. Ни одно из применявшихся нами воздействий не
0
V
TjiJlgp :
M
i
т
Рис. 8. Экспрессия мРНК, кодирующей педальный пептид в ЦНС улитки. А, В, Д -нормальные условия, Б, Г, Е - болевое воздействие. А, Б - церебральные ганглии; В, Г - плевро-парието-висцеральный комплекс ганглиев; Д, Е - педальные ганглии. Калибровка 500 мкм.
приводило к заметному изменению паттерна экспрессии ПЕП в ЦНС: не выявлено ни уменьшения, ни увеличения числа нейронов, экспрессирующих ПЕП (Рис. 8). Работая в рамках проекта по
исследованию влияния полета на станции Фотон на улиток, мы проанализировали ситуацию с органом равновесия - статоцистом - поскольку именно на этом органе должно, в первую очередь, отражаться влияние невесомости. Иммунохимически в каждом статоцисте были найдены 3 нейрона, содержащие ПЕП (Рис. 9). Они выявлялись как в норме, так и при различных воздействиях, включая невесомость. Однако методом гибридизации in situ эти нейроны в статоцисте не выявлялись ни в норме, ни при различных наземных воздействиях. Влияние же невесомости проявлялось в том что у животных, перенесших полет на станции Фотон-М-3 (16 животных, 32 статоциста), экспрессия была найдена в 30 статоцистах (94% случаев). У контрольных животных (11 животных, 22 статоциста) 13 статоцистов содержали по 3 нейрона, экспрессирующих педальный пептид (59% случаев).
Экспрессия FMRFaMHua носила устойчивый характер,
Рис. 9. Экспрессия педального пептида в статоцистах улитки. Вверху - экспрессия мРНК, внизу - иммуноцитохимическое окрашивание. А, А1 - норма; Б, Б - болевое воздействие, В, В1 -воздействие невесомости.
;
I
Яш
Рис. 10. Экспрессия мРНК, кодирующей РМЯРамид, в ЦНС улитки. А, Б - церебральные ганглии. В, Г - плевро-парието-висцеральный комплекс ганглиев; командные нейроны отмечены стрелками. Д, Е - педальные ганглии. А, В, Д - нормальные условия; Б, Г, Е - после болевого воздействия. Калибровка 500 мкм.
независимый от применявшихся воздействий, включая воздействие невесомости. РМЯРамид-содержащие нейроны найдены в церебральных и педальных ганглиях. В плевро-парието-висцеральном комплексе ганглиев выявлено большое количество FMRFaMHÄ-содержащих нейронов, включая командные нейроны оборонительного поведения из париетальных и плевральных ганглиев (Рис. 10).
3. 5. Нейропептиды семейства CNP: лабильная регуляция синтеза
3. 5.1. Экспрессия нейропептидов семейства CNP в ЦНС Helix
Продукт гена HCS2 виноградной улитки Helix является гибридным белком, относящимся к семейству кальций-связывающих EF-hand белков и, одновременно, предшественником семейства нейропептидов. В нормальных условиях ген HCS2 экспрессируется (выявление мРНК) только в 4 гигантских командных нейронах оборонительного поведения и в крупном нейроне левого педального ганглия. Поэтому кодируемые им нейропептиды были названы Command Neuron Peptides (CNP). При различных воздействиях (болевое воздействие, аппликация серотонина) экспрессия наблюдается также в ряде кластеров и отдельных нейронов, расположенных в плевральных, париетальных, педальных и церебральных ганглиях (Bogdanov et al 1998). Применяя антитела к CNP-нейропептидам, мы показали, что большая часть этих клеток выявляется иммуноцитохимически в отсутствие всяких воздействий на ЦНС. Общая численность иммунореактивных нейронов в ЦНС составляла около 210 в парието-висцеральном комплексе ганглиев, около 140 в педальных ганглиях, около 60 в церебральных ганглиях (Рис. 11). Иммунореактивные волокна обильно представлены во всех ганглиях (включая буккальные, где иммунореактивных клеток не найдено) и в большинстве нервов.
ПЕДАЛЬНЫЕ ГАНГЛИИ
Рис. 11. Схема расположения в ЦНС нейронов, иммунореактивных к антителам на продукты гена НС32. Черным отмечены нейроны, иммунореактивные в норме, серым -выявляющиеся после активирующих воздействий.
Такие воздействия, как длительное переживание в инкубационной среде, аппликация серотонина или кофеина, нанесение болевого стимула, приводили к увеличению числа иммунореактивных нейронов (Рис. 11). Был сделан вывод, что различные воздействия на ЦНС способны запускать процессы синтеза белка-предшественника.
Распределение предполагаемых продуктов гена HCS2 в командных нейронах париетальных ганглиев было изучено на электронно-микроскопическом уровне. Было показано, что иммунная метка локализована в секреторных гранулах, находящихся в цитоплазме. Плотность метки для нейропептидов была в два раза выше, чем для кальций-связывающего домена. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что продукты гена HCS2 являются нейромедиаторами или нейромодуляторами.
Нейроны, иммунореактивные к антителам против CNP-нейропептидов были выявлены нами также в ЦНС двух других моллюсков - Aplysia и Lymnaea.
3. 5. 2. Экспрессия нейропептидов семейства CNP в сенсорных нейронах Helix
Важнейшим источником сенсорной информации для наземных моллюсков является обоняние (Chase 1986). Улитки воспринимают запахи при помощи двух пар специализированных органов - щупалец. Щупальца участвуют и в оборонительной реакции животного. Щупальце состоит из тентакулярного ганглия, соединенного своими выростами с сенсорной подушечкой и, соответствующим нервом, с церебральными ганглиями. В сенсорной подушечке, под эпителлиапьным и мышечным слоями, находятся биполярные сенсорные нейроны (около 100 ООО на одну сенсорную подушечку). Аксоны большинства первично-сенсорных нейронов заканчиваются в тентакулярном ганглии и его выростах (Chase, Tolloczko 1986, 1989). Меньшинство (7%-10%) первично-сенсорных нейронов имеет прямые проекции в церебральные ганглии, и наличие такого дублирующего пути в сенсорном анализаторе представлялось до недавнего времени необъяснимым. Через ветвь среднего губного нерва ринофор (переднее щупальце) проецируется в две области церебральных ганглиев: процеребрум, отвечающий за анализ ольфакторной информации, и в метацеребральную область. Входя в состав среднего губного нерва, тракт от ринофора разделяется на две ветви. При помощи селективных прокрасок этих ветвей (в направлении ринофора и в направлении церебральных ганглиев) нам удалось показать, что в процеребрум посылают свои отростки нейроны тентакулярного ганглия и его выростов, а в метацеребрум посылают свои отростки первично-сенсорные нейроны сенсорной подушечки (около 7%-8%). Результаты суммированы на рис. 12.
Медиаторность первично-сенсорных нейронов изучена мало. Поскольку мы установили, что часть первично-сенсорных нейронов проецируется напрямую в
церебральные ганглии, причем в область, не связанную с анализом ольфакторной информации, то нами было сделано предположение, что эти нейроны связаны с оборонительным поведением. Командные нейроны оборонительного поведения улитки содержат FMRFaMHfl (Elekes, Nassel 1990), и нейропептиды CNP семейства (Balaban et al 2001).
МП - микропипетка, Рин - ринофор, СГН - средний губной нерв.
Мы предположили, что и сенсорные нейроны, связанные с оборонительным поведением, могут содержать CNP нейропептиды. Первично-сенсорные нейроны, иммунореактивные к антителу против CNP4 нейропептида, были нами найдены в сенсорной подушечке как ринофоров, так и омматофоров. Иммунореактивные волокна этих нейронов проецируются в метацеребральную область церебральных ганглиев. Их численность составляла 70-140 на один ринофор и 100-200 на один омматофор взрослого животного. Таким образом, СЫР-ИР рецепторы составляли часть популяции рецепторов, напрямую проецирующихся в церебральные ганглии.
3.5. 3. Экспрессия иейропептпдов семейства CNP в ЦНС Drosophila
Нейропептиды участвуют в регуляции многих физиологических процессов у Drosophila (Taghert, Veenstra 2003). Пирокинины и гормоны, запускающие линьку, обладают на С-конце группой PRLamide и являются аналогом нейропептида CNP2 улитки, а перивисцерокинины несут последовательность PRVamide на С-конце и поэтому гомологичны CNP4 нейропептиду улитки. Исходя из этого, мы предприняли поиск нейронов, содержащих CNP-подобные нейропептиды у развивающихся и взрослых мушек, в том числе,
и при болевом воздействии. Мы обнаружили СОТ-ИР клетки в мозге и в вентральных ганглиях личиночной ЦНС (Рис. 13). Они составляли три популяции: одна в вентральных ганглиях, другая в субэзофагеальном ганглии, третья - в протоцеребруме. На всех трех стадиях личиночного развития набор СЫР-ИР нейронов оставался неизменным, а размеры тел нейронов росли параллельно росту ЦНС. Во время метаморфного перехода во взрослое состояние строение некоторых идентифицируемых ИР нейронов изменилось, а часть нейронов утратила иммунореактивность. В ЦНС взрослых животных средняя и передняя группы ИР нейронов в субэзофагеальных ганглиях не выявлялись. После повреждения тела число СЫР-ИР нейронов в ЦНС взрослых насекомых достоверно увеличивалось, причем число ИР клеток совпадало с числом ИР нейронов в ЦНС личинки. Положение и морфология этих «дополнительных» клеток свидетельствует, что это те же клетки, которые выявлялись в ЦНС личинок.
Рис. 13. Расположение СЫР4-ИР (А, В) и СЫР2-ИР (Б, Г) элементов в личиночной (А, Б) и взрослой (В, Г) ЦНС Ого$орЫ1а. ИР группы клеток пронумерованы. СС - согриэ сагШасит, МАН - медиальный абдоминальный нерв. Серым отмечены нейроны, выявляющиеся после повреждающего воздействия.
3.5. 4. Экспрессия нейропептидов семейства СЫР в ЦНС ЬитЬпсиз
Кольчатый червь ЬитЪпсих является популярным модельным объектом, хотя его нейроны не идентифицированы, а нейропептиды мало изучены. Мы предприняли поиск в ЦНС ЬитЬгимз нейронов, иммунореактивных к антителам против СЫР-нейропептидов, в норме и после повреждающего воздействия. Иммунореактивные нейроны были найдены во всех ганглиях, тогда как иммунопозитивные волокна были найдены в пределах ЦНС, но отсутствовали во всех нервах. Следовательно, СЫР-иммунореактивные клетки -
интернейроны. Наибольшее число ИР нейронов найдено в подглоточном (субэзофагеальном) ганглии и следующих за ним двух ганглиях вентральной цепочки (Рис. 14). В ростро-каудальном направлении число ИР нейронов уменьшалось. После повреждения тела червя число CNP-ИР нейронов в ЦНС заметно возрастало. Как и в нормальных условиях, все ИР клетки давали проекции исключительно в медиальный и дорзо-медиальный пучки волокон внутри вентральной цепочки, будучи, т.о., интернейронами. Мы выявили также специфическое окрашивание в сенсорных клетках эпидермиса. Многочисленные периферические CNP-ИР клетки были найдены во внутреннем слое сплетения пищевода (около 110 на один сегмент тела).
Нейроны, иммунореактивные к антителам против CNP-нейропептидов были выявлены нами также в ЦНС другого кольчатого червя - Hirudo (пиявка).
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. 1. Развитие нервной системы виноградной улитки
У наиболее изученного к настоящему времени моллюска Lynmaea эмбриональное развитие занимает десять дней (Mescheriakov 1975; Morrill 1982), а у Helix этот период составляет шестнадцать дней за счет более долгого периода донервного развития. Время формирования ЦНС у обоих видов сходно (6 дней у Lymnaea и 7 дней у Helix). Стадии Е10-Е12 в эмбриогенезе Helix соответствуют раннему, среднему и позднему велигеру у Lymnaea. Стадии El 3-Е 15 у Helix соответствуют стадиям ранней, средней и поздней великонхи у Lymnaea. Отличие между эмбриональным развитием Lymnaea и Helix заключается в наличии у Helix специальной педального синуса (Fol 1880). Он является продолжением ноги в
ТУ -vr
Рис. 14. СЫР-ИР нейроныв в ЦНС Lumbricus в норме (слева) и после повреждения тела (справа). ЦГ - церебральные ганглии, СЭГ -субэзофагеальный ганглий, СГ - сегментарные ганглии.
каудальном направлении и участвует в движениях эмбриона, редуцируется перед вылуплением. Основные принципы формирования ЦНС сходны у Helix и Lymnaea. Развитие нервной системы начинается у Lymnaea в конце стадии трохофоры (ранний велигер), что соответствует у Helix 50% развития. Первыми развиваются церебральные ганглии. Ростро-каудальный градиент отчетливо прослеживается в формировании ганглиев, коннектив и комиссур. Все ганглии появлялись независимо друг от Друга, из раздельных эктодермальных закладок. Небольшое отличие между двумя видами моллюсков состоит в том, что буккальная комиссура и церебро-буккальные коннекгивы у Helix появляются на стадии Е] 1, что соответствует среднему велигеру, а у Lymnaea на стадии позднего велигера.
Изучая развитие процеребрума, мы показали, что нейроны образуются вне ЦНС и мигрируют в нее по соединительно-тканному тракту. Меченые нейроны в процеребруме вначале располагаются в его апикальной части, а затем, смещаясь по мере нарастания новых нейронов, отчасти сохраняют свое строение единого слоя, образованного в определенное время. Нейрогенез в процеребруме продолжается в постнатальный период. Число новых клеток, появляющихся в процеребруме в постнатальном онтогенезе, постепенно убывает. По-видимому, формирование процеребрума происходит в течение первых 2-3 месяцев постнатального онтогенеза. Нами не было оценено, какова скорость нейрогенеза, и насколько она меняется с возрастом в постнатальном онтогенезе. Открытым остался и вопрос о том, где именно находится зона пролиферации. При работе на Aplysia, у которого отсутствует процеребрум, был сделан вывод, что протонейроны формируются в пролиферативных зонах в стенке тела, а уже затем попадают в ганглий (Jacob, 1984; Hickmott, Carew 1991).
4. 2. Роль серотонинергнческнх нейронов в оборонительном поведении. Основа возрастных особенностей поведения
Серотонинергическая система нейронов в ЦНС Helix состоит из трех групп (компартментов). Нейроны в церебральных ганглиях связаны с сенсорным восприятием, получая информацию через нервы головной части тела. Нейроны в париетальных и висцеральном ганглиях участвуют в регуляции внутренних процессов, таких как пищеварение. Роль серотонинергических нейронов педальных ганглиев в оборонительном поведении хорошо установлена. Морфологической основой работы ростро-медиальных нейронов является наличие у них определенных проекций. Через кожные нервы осуществляются связи модуляторных нейронов с сенсорными, расположенными частью в коже (Зайцева 1992), а частью - в ЦНС (Malyshev, Balaban 2002). Клетки, расположенные в ростро-медиальной доле педального ганглия иннервируют стенку тела, и часть клеток в
кластере связана электрически, играя модуляторную роль в оборонительном поведении (Zakharov, Balaban 1991; Zakharov et al 1995).
Известно, что у брюхоногих моллюсков развитие моноаминсодержащей нейронной системы имеет две стадии: около 30-50% серотонинергических клеток существует у новорожденного животного, а остальные 50-70% добавляются к системе за несколько месяцев постнатального развития до наступления половой зрелости (Diefenbach, Goldberg 1990; Goldberg, Kater 1989; Croll, Chiasson 1989). Параллельно с процессом нейрогенеза идет последовательное развертывание форм поведения, описанное у разных видов моллюсков. Клеточные механизмы этих поведенческих изменений предполагают накопление постепенных изменений числа клеток, вовлеченных в соответствующие реакции. Наши данные показывают, что в мозге ювенильных животных число серотонинергических нейронов в педальных ганглиях приблизительно в 4 раза меньше, чем у взрослых. В случае пассивно-оборонительного поведения Helix известно, что сенситизационное увеличение амплитуды ответа отсутствует в течение первого месяца после вылупления, так же как и у взрослых животных после инъекции 5,7-DiHT, избирательно поражающего серотонинергические клетки (Zakharov, Balaban 1987). В литературе был сделан вывод, что неразвитость серотонинергической системы является причиной возрастных отличий поведения у молодых животных (Балабан, Захаров 1992; Nolen, Carew 1994). Наши данные прямо указывают на избирательное отставание появления нейронов именно в кластере серотонинергических нейронов, модулирующих оборонительное поведение. Серотонин оказывает ингибирующее влияние на рост отростков нейронов (Baker, Croll 1996). Это объясняет функциональное значение сниженного уровня серотонина в ЦНС ювенильных животных, где рост новых отростков необходим.
Каким же морфологическим способом модуляторные серотонинергические нейроны регулируют поведение виноградной улитки? Несмотря на все вариации в проекциях отдельных серотонинергических нейронов ростро-медиальной области педальных ганглиев, можно считать твердо установленным тот факт, что большинство их связей замыкается на периферии, а к командным нейронам свои отростки шлет единственный гигантский серотонинергический нейрон - Pd4. Его хорошо развитое дендритное дерево, расположенное в нейропиле ростро-медиальной области, делает возможным его синаптические связи со многими серотонинергическими нейронами в этой области. Идея, что этот нейрон суммирует и опосредует влияния от других серотонинергических нейронов, передавая их затем на командные нейроны, нашла четкое подтверждение в физиологических опытах. Таким образом, мы имеем цепочку: сенсорные нейроны - модуляторные нейроны - нейрон-делегат Pd4 - командные нейроны. Помимо наших данных, нам известен только один пример
«нейрона-делегата», описанный в литературе. Это нейрон PEI пчелы, который посылает отросток в латеральный протоцеребрум, являясь суммирующим выходным элементом для большого числа клеток Кеньона (Hammer, Menzel 1995). Он активируется широким спектром запахов и вызывает поведенческую сенситизацию.
Если для реализации влияния серотонинергических нейронов ростро-медиальной группы на командные нейроны оборонительного поведения необходим и достаточен только один нейрон, то каков смысл того, что нейроны ростро-медиальной группы, которые через него воздействуют на командные нейроны, - серотонинергические? С другой стороны, в чем важность обнаруженного нами «отставания» в развитии (по числу и размерам их сом) нейронов ростро-медиальной группы от других нейронов педальных ганглиев? Нам представляется, что оба этих факта имеют единое объяснение: помимо чисто синаптических влияний ростро-медиальных нейронов на нейрон-делегат, а нейрона-делегата - на командные нейроны, существует и параллельный, более медленный путь влияния, осуществляемый этими же серотонинергическими нейронами, а именно - влияние через относительно неадресованный выброс серотонина из тел нейронов ростро-медиальной группы. Тогда становится понятной медиаторная определенность модуляторных нейронов, а также значимость размеров их сом для реализации модулирующего влияния. Чем больше сома нейрона, тем больше там число копий ДНК и тем активнее идет синтез содержащихся в клетках веществ (включая серотонин). Таким образом, как нам кажется, в реализации модулирующего влияния серотонинергических нейронов ростро-медиальной области на командные нейроны существуют две составляющих: синаптическая, реализуемая через нейрон-делегат ЛПд 4, и составляющая, реализуемая через посредство объемной передачи медиатора (на командные нейроны и на сам нейрон-делегат). В пользу этого свидетельствуют данные о зависимости длительной фазы посттетанической потенциации от содержания серотонина в экстраклеточной среде (Малышев с соавт 1997). Предполагается, что модуляторные серотониновые рецепторы расположены на соме командных нейронов (Пивоваров, Нистратова 2003).
Часть серотонинергических нейронов как позвоночных, так и беспозвоночных действует на свои клетки-мишени двумя способами: синаптически и внесинаптически, из аксональных и сомато-дендритных зон выделения (De-Miguel, Trueta 2005). Нейроны Ретциуса пиявки выделяют серотонин из сомы при стимуляции механосенсорных путей, для этого необходимо развитие пачек импульсов (Beck et al 2001). Длительная тоническая реакция активации характерна и для модуляторных нейронов улитки (Zakharov et al 1995). Естественно предположить, что активация серотонинергических нейронов улитки
повторяющимися стимулами должна приводить к соматическому («неадресованному») выбросу серотонина.
Дефицит числа клеток в ювенильной ЦНС не обнаруживается в дофаминергической системе. Поскольку новорожденные Pulmonata - вполне автономные животные с хорошо развитыми типами поведения, можно предположить, что большинство клеточных элементов, ответственных за необходимые физиологические процессы, должно присутствовать к моменту вылупления, а постнатальный процесс нейрогенеза в основном касается модуляторных нейронов и других опосредующих клеток. Эта гипотеза предполагает, что высокая степень развития дофаминергической системы у ювенильных Helix связана с тем, что эти нейроны принадлежат к функционально необходимым клеточным элементам, например, сенсорным клеткам (Sakharov, Salanki 1980).
4.3. Развитие и роль ГАМКергических нейронов
При изучении развития ГАМКергических нейронов мы наблюдали, что рост отростков идентифицированных нейронов происходит еще и после того, как эти нейроны приобрели свой медиаторный фенотип. Второй важный факт - появление временно обладающих данным медиатором нейронов после вылупления. Ранее были описаны транзиторные нейроны, выявляемые лишь в процессе эмбриогенеза, как правило, вне ЦНС (Voronezhskaya, Elekes 1993; Croll, Voronezhskaya 1995, 1996; Voronezhskaya et al 1999). Постэмбриональные изменения в паттерне ГАМК-иммунореактивности длились 2-3 недели, что предполагает участие ГАМК в процессах, необходимых как для ювенильных, так и для взрослых животных. Marois и Croll (1992) высказали гипотезу, что целью постэмбрионального нейрогенеза в основном является развитие компенсаторных и модуляторных элементов. ГАМК-ИР нейроны первыми появились в буккальных, затем в церебральных, затем в педальных ганглиях. Более того, разница в развитии ГАМК-ИР нейронов между буккальными и педальными ганглиями была более значительной, чем общее различие в развитии этих ганглиев. Большинство ГАМК-ИР нейронов - мелкие клетки и достигают своих взрослых размеров достаточно рано. Размеры сом ГАМК-ИР нейронов относительно размеров соответствующих ганглиев были больше в эмбриональной ЦНС, чем во взрослой. Таким образом, ГАМК-ИР нейроны развивались относительно быстрее, чем нейроны других трансмиттерных фенотипов в ЦНС. ГАМК-ИР нейроны не обнаружены в субэзофагеальном комплексе ганглиев, где расположены командные нейроны оборонительного поведения. Напротив, ГАМК-ИР нейроны в буккальных ганглиях (моторный контроль пищевого поведения) и в церебральных ганглиях (координация пищевого поведения с другими формами поведения) быстро развиваются в эмбриогенезе.
Представляется вероятным участие ГАМК в пищевом поведении. Предположение об участии ГАМК в пищевом поведении было экспериментально подтверждено в работе, выполненной совместно с Н. И. Браваренко: ГАМК вовлечена в запуск пищевой двигательной активности и подавление оборонительного поведения во время активации пищевого поведения.
4.4. Нейропептиды с постоянным типом экспрессии
4.4.1. Инсулин-подобные пептиды
Мы выяснили, что экспрессия инсулин-подобных пептидов стабильно проявляется в одном и том же наборе клеток, индивидуальная морфология которых вариабельна (три типа ветвления). Таким образом, одни из этих клеток преимущественно участвуют в регуляции роста животного (выброс пептидов в кровеносную систему), а другие - в подавлении синтеза гонадотропного гормона (иннервация дорзального тела). Исходя из наших данных, можно сделать вывод, что две синергичные функции - рост тела и подавление репродуктивного поведения - регулируются двумя субпопуляциями инсулин-содержащих клеток с различающимися типами ветвления. Выявлено сходство между процессами хранения инсулина у млекопитающих и инсулин-подобных пептидов у моллюсков: и в том и в другом случае требуется цинк. По-видимому, его роль в ЦНС моллюсков та же, что и в инсулин-синтезирующих клетках млекопитающих - увеличение стабильности гексамеров молекул инсулина, через влияние на трехмерную структуру этих гексамеров (Brange, Langkjaer 1992). У ювенильных, быстро растущих, животных инсулин-подобные пептиды, видимо, не запасаются, а постоянно секретируются в гемолимфу.
4.4. 2. КМКРамид л педальный пептид
FMRFaMHÄ, возможно, является важнейшим нейропептидом у улитки, так как содержится в командных нейронах, ответственных за оборонительные реакции, включая втягивание всего тела в раковину (Elekes, Nassel 1990). FMRFaMHfl действует как непосредственно на ионотропные Na+ каналы, так и опосредованно, на соматические холинорецепторы (Cottrell 1997; Pivovarov, Walker 1996). Педальный пептид предположительно участвует в организации движений (Lloyd et al 1996). ИР волокна найдены почти во всех периферических нервах, они заканчиваются в мышцах и ресничном эпителии, что предполагает участие педального пептида в регуляции двигательной активности.
Экспрессия этих двух исследованных нами нейропептидов максимальна в норме и не может быть увеличена при различных воздействиях. Может быть, ее можно снизить
некоторыми воздействиями, что нуждается в проверке. Иммунохимический паттерн в целом совпадал с картиной экспрессии мРНК. Специфическое воздействие невесомости проявлялось в инициации синтеза мРНК, кодирующей педальный пептид, в нейронах статоциста. Возможное объяснение этого явления заключается в том, что педальный пептид мало расходуется в нейронах статоцистов в норме, и лишь воздействие невесомости приводит к его расходу и, как следствие, инициации синтеза.
4. 5. Нейропептиды CNP семейства: лабильная экспрессия у различных беспозвоночных
4.5.1. Экспрессия нейропептидов CNP семейства в нервной системе Helix
Экспрессия нейропептидов CNP семейства зависит от внешних воздействий, что проявляется как при детекции мРНК, так и самих нейропептидов. Как показывают ранее полученные данные (Balaban et al 2001) и результаты данной работы, при различных функциональных воздействиях может существенно меняться как паттерн экспрессии гена, так и паттерн иммунореактивности вещества, кодируемого этим геном, причем эти два паттерна различаются между собой. В норме экспрессия гена HCS2 происходит исключительно в гигантских париетальных интернейронах (Balaban et al 2001), тогда как число клеток, выявляемых иммунохимически в норме, было значительно больше. По-видимому, особенно активно эти нейропептиды расходуются в париетальных интернейронах. При активирующих воздействиях, когда наблюдалась максимальная экспрессия гена HCS2 (Balaban et al 2001), число клеток, выявляемых иммуноцитохимически и методом гибридизации, совпадало. По-видимому, метод гибридизации выявляет только клетки, в которых реализуется вновь возникшая потребность в синтезе вещества (из-за его расходования или увеличившейся нужды в нем), а базовый уровень содержания данного вещества в большей степени отражает метод иммуноцитохимии.
Было показано, что повышение концентрации магния ведет к полному исчезновению электрической активности командных нейронов на препарате изолированной ЦНС (Balaban et al 2001а) и к быстрой потере присущей этим нейронам иммунореактивности к продуктам гена HCS2. Таким образом, текущая электрическая активность необходима для поддержания определенного уровня синтеза белка HCS2. Логично предположить участие CNP нейропептидов в оборонительном поведении, подобно тому, как в нем участвует FMRFaMHfl, содержащийся в тех же интернейронах.
Для секретируемых нейропептидов характерна локализация в секреторных гранулах (Larsson 1977; Calegari et al 1999). Выявленный нами на электронно-микроскопическом уровне характер распределения продуктов гена HCS2 типичен для нейромедиаторов или
нейромодуляторов. Выявленные различия в распределении антител к кальций-связывающей части белка и к нейропептидам CNP3 и CNP4 указывают на прохождение процессинга белка-предшественника и существование CNP-нейропептидов в нормальных условиях.
4.5. 2. Организация сенсорных нейронов в щупальцах улитки
Мы показали, что в ольфакторной нервной системе улитки существуют два морфологически дискретных пути для восприятия сенсорной информации. Большинство первично-сенсорных нейронов сенсорной подушечки не проецируются напрямую в церебральные ганглии. Меньшинство первично-сенсорных нейронов сенсорной подушечки посылают свои отростки в нейропиль метацеребрума, минуя процеребрум. Мы предполагаем, что таким же образом организованы проекции и в омматофорах (глазных щупальцах). Небольшая часть первично-сенсорных нейронов сенсорной подушечки щупалец содержит нейропептид CNP4 и входит в состав популяции сенсорных нейронов, напрямую проецирующихся в церебральные ганглии. Мы полагаем, что прямыми проекциями обладают механосенсорные нейроны, участвующие в оборонительном поведении. Таким образом, нейропептиды семейства CNP выявляются не только в интернейронах, командных для оборонительного поведения, но и в рецепторах, участвующих в этом поведении.
4. 5.3. Экспрессия нейроиептидов CNP семейства в нервной системе Drosophila
В церебральных и субэзофагеальном ганглиях Drosophila были идентифицированы одиннадцать групп нейросекреторных нейронов (Siegmund, Korge 2001), часть из них мы по-видимому, и выявляли в своей работе. Анализ имеющейся литературы и сравнение ее с нашими данными показали, что мы, по-видимому, детектировали продукт гена htigin - Drm-РК-2 - в нейронах протоцеребрума, а пирокинины и перивисцерокинины выявлялись в нейронах субэзофагеального ганглия. Таким образом, в ЦНС Drosophila С№2-подобные и CNP4-noflo6Hbie нейропептиды колокализованы в некоторых клетках, тогда как в мозге виноградной улитки CNP2 и CNP4 нейропептиды колокализованы во всей популяции ИР нейронов. Пирокинины играют многочисленные и различающиеся роли у насекомых. Это семейство включает пептиды насекомых с разными именами: пирокинины, миотропины, нейропептиды, активирующие биосинтез феромонов (PBANs), гормон диапаузы (см. об этом подробнее у Nassel 2002). Во всех случаях С-концевая последовательность FXPRLamide является активным ядром этих пептидов.
Большая часть центральных элементов церебральной нейроэндокринной системы сохраняется в течение метаморфоза (Copenhaver, Truman 1992). Характеристика пептидов Drosophila выявляла тот же набор пирокининов и перивисцерокининов у личинок и у
взрослых насекомых (Predel et al 2004; Baggerman et al 2005). В нашей работе связанное с возрастом уменьшение числа ИР нейронов в субэзофагеальном ганглии взрослых мух восстанавливалось после повреждения тела, что предполагает консервацию клеточных элементов в метаморфозе. Поэтому мы предполагаем, что у взрослых мух происходит пространственно-специфичная остановка синтеза CNP-подобных нейропептидов. Возможно, это связано с новой ролью, которую эти клетки играют у взрослого животного.
4. 5.4. Экспрессия нейропептидов CNP семейства в нервной системе Lumbricus
CNP-ИР нейроны и волокна были найдены в ЦНС, коже и стоматогастрической системе. Популяция CNP-HP клеток составляет не более 2-3.5% общего числа нейронов в отдельном сегментарном ганглии (оценку общего числа нейронов можно найти в работе Banvolgyi et al 1994). CNP-HP нейроны - интернейроны, так как не посылают отростки в сегментарные нервы, а ИР волокна идут в составе ипсилатеральных медиального и дорзо-медиального трактов. Ростро-каудальный градиент в распределении тел иммунопозитивных нейронов, обнаруженный нами, был ранее описан для других типов иммунореактивности в ЦНС этого же животного (Sporhase-Eichmann et al 1987а; Reglodi et al 1997b; Reglodi et al 1999). Однако, паттерн иммунореактивности, выявленный нами, отличался от паттернов, ранее описанных для Lumbricus с использованием различных антител.
Обычно иммуноцитохимические работы (в том числе на Lumbricus) выполняют на препаратах ЦНС в нормальном состоянии или исследуется регенерация после повреждения ЦНС (Sporhase-Eichmann et al 1987а, b; Csoknya et al 1996; Banvolgyi et al 2000). Мы же исследовали быстрые изменения иммунореактивности, вызванные повреждением тела животного. При этом число CNP-HP нейронов в ЦНС удваивалось, к паттерну «прибавлялись» как мелкие, так и крупные нейроны. Распределение ИР нейронов менялось. Появление «новых» ИР кластеров в ганглиях вентральной цепочки после повреждения предполагает активацию синтеза в «новых» нейронах под действием повреждения. При этом, однако, не выявляется новый белок-антиген (Western blot).
Рассеянные нейроны, лежащие в субэпителиальном слое кишки и образующие внутреннее сплетение, содержат различные медиаторы (Telkes et al 1996; Lengvari et al 1992; Barna et al 2001). Мы обнаружили СЫР-ИР клетки во внутреннем субэпителиальном слое пищевода. В кишке, как и в ЦНС, CNP-ИР нейроны располагались сегментарными группами, а их число в пределах каждого сегмента было значительно выше в эпителии кишки, чем в ЦНС. Недостаток имеющейся в литературе информации не позволяет говорить о природе CNP-подобных нейропептидов в нейронах Lumbricus. Мы полагаем, что CNP-подобные нейропептиды присутствуют не только у моллюсков и насекомых, но и у червей.
выводы
1. Эмбриональный цикл развития улитки Helix aspersa составляет, при комнатной температуре, 16 дней, причем ЦНС развивается в течение последних 7 дней. Развитие ЦНС происходит в ростро-каудальном направлении. К моменту вылупления сформирована система нейронов, отвечающая за оборонительные реакции улитки.
2. Из всех серотонинергических ростро-медиальных нейронов педальных ганглиев улитки Helix lucorum только один Пд4 нейрон проецируется в плевральные и париетальные ганглии. Его стимуляция вызывает те же эффекты, что и стимуляция всей группы модуляторных нейронов. У ювенильных животных число серотонинергических нейронов в ростро-медиальной области педальных ганглиев и относительные размеры этих нейронов меньше, чем у взрослых животных, что, по-видимому, лежит в основе возрастных отличий оборонительного поведения.
3. ГАМКергическая система нейронов улитки Helix aspersa развивается как в эмбриогенезе, так и в ранний постэмбриональный период. ГАМКергические нейроны появляются на ранних стадиях формирования ЦНС в эмбриогенезе. Часть нейронов, содержащих ГАМК у ювенильных животных, перестает выявляться в ЦНС взрослых животных. ГАМК участвует в пищевом поведении улитки Helix lucorum.
4. В основе функционирования системы нейронов, содержащих инсулин-подобные пептиды в ЦНС Helix lucorum, лежит соматотопическая организация их проекций. Эти нейроны содержат цинк, по-видимому, необходимый для хранения инсулин-подобных пептидов.
5. Нейропептиды различаются по степени зависимости их синтеза от внешних воздействий. Существуют нейропептиды, экспрессия которых зависит от внешних воздействий (CNP семейство), и нейропептиды, экспрессия которых не зависит от внешних воздействий (FMRFaMUfl и педальный пептид). Пластичность зависит как от типа нейропептида, так и от того, в каких нейронах он локализован.
6. Нейропептиды CNP семейства имеют сходное морфологическое проявление у насекомых, кольчатых червей, моллюсков: их экспрессия лабильна и детектируется в интернейронах, нейроэндокринных клетках, сенсорных нейронах.
7. Около 7-8% сенсорных нейронов в щупальцах улитки Helix lucorum напрямую проецируются в метацеребральную область церебральных ганглиев (предположительно, механосенсорные нейроны). Часть из них содержит CNP нейропептиды.
СПИСОК ОСНОВНЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Захаров И.С., Иерусалимский В.Н. (1991) Роль церебральных ганглиев в организации пищевого поведения крылоногогго моллюска Clione limacina. Журн. Высш. Нервн. Деят. 41(1):85-94.
2. Zakharov IS, Ierusalimsky VN. (1992) The neuroanatomical basis of feeding behavior in the pteropod mollusc, Clione limacina (Phipps). J Comp Physiol [А]. 170(4):525-532.
3. Иерусалимский B.H., Захаров И.С., Палихова T.A., Балабан П.М. (1992) Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helix lucorum L. Журн. Высш.Нервн. Деят. 42(6): 1075-1089.
4. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С. (1992) Картирование нейронов, участвующих в иннервации стенки тела виноградной улитки. Журн. Высш.Нервн. Деят. 42(6):1116-1123.
5. Захаров И.С., Иерусалимский В.Н. (1995) Постэмбриональный нейрогенез обонятельного анализатора улитки. Доклады Академии Наук, 342, №3,418-420.
6. Zakharov I.S., V.N.Ierusalimsky, P.M.Balaban (1995) Pedal serotonergic neurons modulate the synaptic input of withdrawal interneurons in Helix. Invertebrate Neuroscience, v.l, 41-52.
7. Иерусалимский B.H., Захаров И.С., Балабан П.М. (1997) Сравнение серотонин- и дофаминергической нейронных систем у половозрелых и ювенильных наземных моллюсков Helix и Eobania. Журн. Высш.Нервн. Деят. 47(3):563-576.
8. Ierusalimsky VN, Balaban P.M. (1997) MlPs-containing cells in terrestrial snails: comparison of imimmostaining and silver intensification.. Neuroscience Research Communications 21(3), 213-221.
9. Zakharov IS, Hayes NL, Ierusalimsky VN, Nowakowski RS, Balaban PM. (1998) Postembryonic neurogenesis in the procerebrum of the terrestrial snail, Helix lucorum L. J Neurobiol. 35(3):271-276.
10. Balaban PM, Bravarenko N1, Maksimova OA, Nikitin E, Ierusalimsky VN, Zakharov IS. (2001) A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol Learn Mem. 75(l):30-50.
11. Ierusalimsky VN, Balaban PM. (2001) Ontogenesis of the snail, Helix aspersa: embryogenesis timetable and ontogenesis of GABA-like immunoreactive neurons in the central nervous system. JNeurocytol. 30(1):73-91.
12. Bravarenko N1, Ierusalimsky VN, Korshunova TA, Malyshev AY, Zakharov IS, Balaban PM. (2001) Participation of GABA in establishing behavioral hierarchies in the terrestrial snail. Exp Brain Res. 141(3):340-348.
13. Ierusalimsky VN, Boguslavsky DV, Belyavsky AV, Balaban PM. (2003) Helix peptide immunoreactivity pattern in the nervous system of juvenile aplysia. Brain Res Mol Brain Res. 120(l):84-89.
14. Boguslavsky D, Ierusalimsky V, Malyshev A, Balaban P, Belyavsky A. (2003) Selective blockade of gene expression in a single identified snail neuron. Neuroscience. 119(0:15-18.
15. Иванова Ю. Д., Леонова О. Г., Попенко В. И., Иерусалимский В. Н., Богуславский Д. В., Балабан П. М., Белявский А. В. (2004) Иммуноцитохимическое изучение локализации продуктов гена HCS2 в командных нейронах виноградной улитки. Молекулярная Биология; 38(6):1024-1032.
16. Aseyev N, Ierusalimsky V, Boguslavsky D, Balaban P. (2005) Snail peptide expression pattern in the nervous system of the medicinal leech. Brain Res Mol Brain Res. 140(l-2):99-105.
17. Ierusalimsky V, Balaban P. (2005) Morphological basis for coordination of growth and reproduction processes in the CNS of two terrestrial snails. Exp Brain Res. 161(4):465-473.
18. Коршунова Т.А., Малышев А.Ю., Захаров И.С., Иерусалимский В.Н., Балабан П.М. (2005) Функции пептида CNP4, кодируемого геном HCS2 в нервной системе Helix lucorum. Журн. Высш.Нервн. Деят. 55(1):91-99.
19. Ефимова ОИ, Иерусалимский ВН, Анохин KB, Балабан ПМ (2006) Иммуногистохимическая детекция транскрипционных факторов pCREB и c-Fos в нервной системе моллюсков. Журн. Высш.Нервн. Деят. 56:801-804
20. Ierusalimsky V N., Balaban Р М. (2006) Immunoreactivity to molluskan neuropeptides in the central and stomatogastric nervous systems of the earthworm, Lumbricus terrestris L. Cell and Tissue Research, 325:555-565
21. Ivanova IuL, Leonova OG, Popenko VI, Ierusalimsky VN, Bogusalvsky DV, Korshunova ТА, Malyshev AIu, Balaban PM, Beliavsky AV. (2006) Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cellular and Molecular Neurobiology. 26(2):127-144.
22. Ierusalimsky VN, Balaban PM. (2007) Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330(1): 169-177.
23. Ierusalimsky VN, Balaban PM. (2007) Neuropeptides of Drosophila related to molluscan neuropeptides: dependence of the immunoreactivity pattern on the ontogenetic stage and functional state. Brain Res. 1152:32-41.
Для заметок
Заказ № 96/03/09 Подписано в печать 17.03.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,25
ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Иерусалимский, Виктор Николаевич
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. СТРОЕНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ.
1. 1. 1. Сенсорные нейроны.
1. 1.2. Модуляторные нейроны.
1. 1.3. Командные нейроны.
1. 1.4. Мотонейроны.
1.2. ФОРМЫ ПОВЕДЕНИЯ УЛИТКИ И ИХ НЕЙРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
1.2. 1. Формы поведения улитки.
1. 2. 2. Обучение и память.
1. 2. 3. Пластические изменения в отдельных нейронах.
1. 2. 4. Морфологическая пластичность нейронов.
1.3. МЕДИАТОР-СПЕЦИФИЧНЫЕ НЕЙРОННЫЕ СИСТЕМЫ УЛИТКИ.
1. 4. ОНТОГЕНЕЗ ЦНС УЛИТКИ
1.4. 1. Общие принципы формирования ЦНС в эмбриогенезе.
1. 4. 2. Особенности формирования ЦНС моллюсков
1. 4. 3. Источник происхождения нейронов в ЦНС.
1. 4. 4. Пионерные нейроны в онтогенезе и их возможная роль в развитии ЦНС.42 1.4. 5. Развитие медиатор-специфичных систем нейронов в ЦНС.
1. 4. 6. Развитие форм поведения в онтогенезе моллюсков.
Глава 2 МЕТОДЫ
2. 1. ОБЪЕКТЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ.
2. 2. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2. 2. 1. Ретро- и антероградные прокраски нейронов.
2. 2. 2. Изучение содержания металлов в нервной системе.
2. 2. 3. Эмбриологические исследования.
2. 2. 4. Неиммупоцитохимическое выявление моноаминов.
2. 2. 5. Иммуноцитохимические методы.
2.2. 6. Метод гибридизации in situ.
2. 2. 7. Электронно-микроскопические исследования.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 3 ОНТОГЕНЕЗ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ
3. 1. ФОРМИРОВАНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Helix В ОНТОГЕНЕЗЕ.
3. 2. РАЗВИТИЕ ПРОЦЕРЕБРУМА.
Глава 4 МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ УЛИТКИ
4. 1. РОЛЬ МОДУЛЯТОРНЫХ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В
ОБОРОНИТЕЛЬНОМ ПОВЕДЕНИИ УЛИТКИ.
4. 2. МОРФОЛОГИЯ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ
НЕЙРОНОВ В ЦНС ВЗРОСЛЫХ ЖИВОТНЫХ.
4. 3. ПРОЕКЦИИ НЕЙРОНОВ ПЕДАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ.
4. 4. ПРИНЦИП ДЕЛЕГИРОВАНИЯ.
4. 5. ФОРМИРОВАНИЕ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ И ИХ ПРОЕКЦИЙ В ОНТОГЕНЕЗЕ.
4. 6. ЮВЕНИЛЬНАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА: МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА ВОЗРАСТНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОВЕДЕНИЯ.
Глава 5 ГАМК-ергическая СИСТЕМА НЕЙРОНОВ УЛИТКИ
5. 1. МОРФОЛОГИЯ ГАМК-ергической СИСТЕМЫ В ЦНС ВЗРОСЛЫХ УЛИТОК.Л 00 5. 2. РАЗВИТИЕ ГАМК-ергической СИСТЕМЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ.
5. 3. РОЛЬ ГАМК-ергических НЕЙРОНОВ В ПОВЕДЕНИИ.
Глава 6 НЕЙРОПЕПТИДЫ С ПОСТОЯННЫМ ТИПОМ ЭКСПРЕССИИ В ЦНС УЛИТКИ
6. 1. НЕЙРОНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИНСУЛИН-ПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ.
6. 2. ПЕДАЛЬНЫЙ ПЕПТИД И FMRFaMtm.
Глава 7 НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ МОЛЛЮСКОВ
7. 1. ЭКСПРЕССИЯ НЕЙРОПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА CNP В ЦНС Helix.
7. 2. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОДУКТОВ ГЕНА
HCS2 В КОМАНДНЫХ НЕЙРОНАХ УЛИТКИ Helix.
7. 3. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНАХ Helix
7.3. 1. Проекции первично-сенсорных нейронов щупалец.
7. 3. 2. CNP нейропептиды в первично-сенсорных нейронах щупалец.
7. 4. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У ДРУГИХ МОЛЛЮСКОВ
7. 4. 1. Нейропептиды семейства CNP в ЦНС Aplysia.
7. 4. 2. Нейропептиды семейства CNP в ЦНС Lymnaea.
Глава 8 НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У НАСЕКОМЫХ
8.1. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В ЦНС Drosophila.
8. 2. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В ЦНС СВЕРЧКА, ПЧЕЛЫ, ТАРАКАНА, КОМАРА.
Глава 9 НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У КОЛЬЧАТЫХ ЧЕРВЕЙ.
9. 1. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У ДОЖДЕВОГО ЧЕРВЯ Lumbricus.
9. 2. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У ПИЯВКИ Hirudo.
Глава 10 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
10. 1. РАЗВИТИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ.
10. 2. КЛАССИЧЕСКИЕ МЕДИАТОРЫ
10. 2. 1. Роль серотонинергических нейронов в оборонительном поведении. Основа возрастных особенностей поведения. Делегирование и дублирование.
10. 2. 2. ГАМКергическая система нейронов: развитие и роль в поведении.
10. 3. ПЕПТИДНЫЕ МЕДИАТОРЫ
10. 3. 1. Методы выявления нейронов: иммуноцитохимия - выявление наличного медиатора и РНК-гибридизация - выявление синтезируемого медиатора.
10. 3. 2. Нейроны, содержащие инсулин моллюсков.
10. 3. 3. Нейропептиды семейства CNP у виноградной улитки.
10. 3. 4. Морфологические основы функции обонятельного анализатора улитки и роль CNP нейропептидов.
10. 3. 5. Нейропептиды семейства CNP у насекомых.
10. 3. 6. Нейропептиды семейства CNP у кольчатых червей.
10. 3. 7. Классические медиаторы и нейропептиды.
10. 3. 8. Колокализация нейропептидов.
10. 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФУНКЦИЙ НЕЙРОНОВ
10. 4. 1. Сетевое или объемное проведение?.
10. 4. 2. Ограничения морфологического подхода.
10. 4. 3. Идентифицированные и идентифицируемые нейроны.
10. 4. 4. Сома и отросток: две единые, но разные части нейрона.
10. 4. 5. Существует ли соматотолия?.
10. 4. 6. Связан ли медиатор с определенной функцией и морфологией? Связана ли межвидовая консервативность нейропептидов с консервативностью их функций?.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная регуляция и онтогенез медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных"
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ МЕДИАТОР-СПЕЦИФИЧНЫХ СИСТЕМ НЕЙРОНОВ
Работа нервной системы основана на реализации имеющихся морфологических связей и на их изменении при обучении и в развитии. Для понимания того, как работают нейроны - системы нейронов — мозг, как организовано поведение, морфофункциональный подход является не только актуальным, но и необходимым. Для установления связи между морфологией и функцией необходимо выявить и идентифицировать нервные элементы или их ансамбли.
Естественно, что многие вопросы, имеющие общее значение в физиологии, могут быть особенно успешно решены на «простых» нервных системах моллюсков, насекомых, червей. Особенностью так называемых простых нервных систем, на которых выполнено данное исследование, является наличие ограниченного числа нейронов, причем нейронов идентифицируемых, т.е. обладающих индивидуальными морфологическими и физиологическими свойствами и, в силу этого, узнаваемых в эксперименте. Рекордсменом среди нейронов является нейрон R2 Aplysia, имеющий размер до 1000 микрон. Но и другие нейроны обладают часто крупными размерами. Самые крупные нейроны виноградной улитки имеют размер сомы до 250 микрон, что почти в 10 раз превышает размеры наиболее крупных нейронов позвоночных. Система гигантских тел нейронов или гигантских волокон существует у многих беспозвоночных животных: гигантские аксоны кальмаров, ракообразных и кольчатых червей, гигантские сомы нейронов гастропод. Интересно, что функция этих «гигантов» часто идентична: запуск быстрой реакции отдергивания в ответ на нанесение опасного стимула.
Основой для идентификации служат три подхода. Во-первых, морфологический: характерное положение и размер сомы, тип ветвления отростков и органы, где заканчиваются отростки. Во-вторых, электрический: тип активности, частота импульсации или ее отсутствие, определенные тормозные и возбуждающие связи с другими нейронами. В-третьих, нейрохимический: определенный тип классического медиатора или нейропептида (нейропептидов). В совокупности, эти особенности нейронов придают им уникальность и определяют их роль в поведении животного. Классификация нейронов по наличному нейроактивному веществу приводит к понятию медиатор-специфичных систем нейронов. Таких систем описано к настоящему времени много (серотонинергические нейроны, ГАМКергические нейроны и т.д.). Анализ экспрессии различных генов в нервных системах беспозвоночных выявляет все новые системы нейронов, объединенные наличием в них различных нейропептидов (Bogdanov et al 1996; Balaban et al 2001). Зачастую, экспрессия определенного гена выявляет единство среди на первый взгляд мало связанных групп и отдельных нейронов. Однако, по-видимому, единство медиатора в разнородных клетках не является случайным фактором, и нейроны в такой системе могут играть общую роль или набор ролей в целостном поведении животного (McCormick et al 1999). Поэтому принято говорить о роли медиатора в поведении. Яркий пример такого рода — серотонин в нервной системе моллюсков (Сахаров 1990; Дьяконова 2007). Хотя по мере накопления знаний в этой области картина все усложняется, медиатор-специфичные системы нейронов по-прежнему являются вполне обособленной единицей в работе нервной системы. Некоторые из этих систем представляют собой единое целое по локализации, морфологии, поведенческой роли (как нейроны, содержащие инсулин-подобные пептиды у Lymnaea - см. van Heumen, Roubos 1990). Другие подразделяются, в свою очередь, на локальные группы (компартменты), как серотонинергические нейроны Helix (Балабан, Захаров 1992). При этом отдельные компартменты одной медиатор-специфичной системы имеют разные соматотопические организации проекций и участвуют в разных формах поведения.
Развитие в онтогенезе многих (но далеко не всех) медиатор-специфичных систем нейронов моллюсков было исследовано (Voronezhskaya, Elekes 1993; Elekes et al 1996; Croll et al 1999). Как правило, для их развития характерны определенные закономерности, отличающие их от других аналогичных систем нейронов (сроки и темпы развития, преимущественное развитие отдельных кластеров). Возрастные изменения внутри этих систем, как правило, не заканчиваются в эмбриогенезе и могут лежать в основе меняющегося с возрастом поведения животного (Marois, Carew 1997; Marois, Croll 1992). Система нейронов может меняться морфологически и в процессе обучения (Alvarez, Sabatini 2007).
Для нервных систем беспозвоночных весьма характерно численное преобладание нейронов, содержащих нейропептид (нейропептиды) над нейронами, содержащими какой-либо классический медиатор. Так, например РМИРамид-содержащих нейронов в ЦНС улитки Helix выявлено около 1100 (Elekes, Nassel 1990), педальный пептид-содержащих нейронов - около 1300 (Pavlova, Willows 2005), а серотонинергических нейронов - всего около 250 (Hernadi et al 1989). Для большинства выявленных в ЦНС беспозвоночных нейропептидов не доказано, что они являются медиаторами, то есть непосредственно выделяются в синапсе. Напротив, показано, например, для Drosophila, что подавляющее большинство ее нейропептидов выделяется внесинаптпчески (Santos et al 2007). Однако, внесинаптическое выделение нейроактивных веществ вообще типично для беспозвоночных. Оно существует в различных видах: выделение веществ из сомы, из варикозностей на отростках и т.д. (Noel, Mains 1991; Szapiro, Barbour 2007). Внесинаптическое выделение вещества из конкретного нейрона может сочетаться с его синаптическим выделением (De-Miguel, Trueta 2005). Поэтому внесинаптическое выделение веществ, особенно если это - единственный способ выделения для данного вещества или данного класса нейронов, не может считаться в настоящее время критерием того, что вещество не является медиатором.
До настоящего времени большинство нейрофизиологических работ делается при явном или неявном признании теории синаптической организации нейронных сетей ("wiring transmission"), у истоков которой стоял Рамон-и-Кахал. Идея Гольджи о диффузной нервной сети (непрерывность межнейронных связей) получает все большее признание по мере накопления знаний (Zoli, Agnati 1996). Взаимодействие нейронов помимо их синаптических связей многообразно (Agnati et al 2006). Кроме электрических и химических сетевых сигналов между нейронами существуют и электрические связи через посредство экстраклеточных полей и передача химического сигнала с нейрона на нейрон, в той или иной степени минуя синапс ('volume transmission"). Эти два внешне альтернативных, а на самом деле - взаимодополняющих способа регуляции вносят свой вклад, величина которого зависит от конкретной ситуации.
По мере накопления знаний о тех ролях, которые играют нейроактивные вещества, ситуация становится все менее описываемой: ни про одно вещество нельзя сказать, что оно участвует только в данном типе поведения или хотя бы взаимодействует только с данным типом рецепторов, как и ни про одну функцию нельзя сказать, что она зависит только от данного медиатора (Brezina, Weiss 1997). Функционально-морфологические исследования могут, тем не менее, несколько прояснить ситуацию: выявить единство разнородных клеточных элементов по их медиаторности, определить тип нейронов, экспрессирующий данное вещество, обнаружить закономерности в регуляции экспрессии данного вещества. Эта область пока изучена явно недостаточно, мало описаны изменения в экспрессии медиаторов (включая нейропептиды), вызванные возрастными изменениями или функциональными регуляциями.
Вопросам, связанным с закономерностями в возрастной и функциональной экспрессии некоторых нейроактивных веществ, и посвящена данная работа. В работе исследовано развитие нервной системы улитки в онтогенезе и становление в ней некоторых медиаторных систем. Исследована роль проекций нейронов в реализации ими своих функций. Рассмотрен вопрос о том, где и как экспрессированы нейропептиды в нервной системе беспозвоночных. Сравнительное распределение нейропептидов исследовано на ряде моллюсков, червях (пиявка, дождевой червь) и некоторых насекомых.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было исследование развития медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных животных в сопоставлении с поведением и изучение общих морфологических особенностей строения и функциональной регуляции экспрессии пептидергических систем нейронов у различных беспозвоночных. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
1. Изучить развитие ЦНС улитки Helix в онтогенезе.
2. Исследовать в ЦНС взрослых и ювенильных улиток Helix распределение ссротонин - и дофамннсодержащих нейронов. Исследовать проекции серотонинергических модуляторных нейронов педальных ганглиев у взрослых и ювенильных животных. Выяснить, какие морфологические особенности серотонинергических нейронов в ювенильной ЦНС могут лежать в основе наблюдаемых возрастных отличий поведения.
3. Изучить онтогенетическое развитие ГАМКергических нейронов улитки Helix и исследовать их роль в поведении.
4. Провести сравнительное исследование регуляции синтеза нескольких нейропептидов в ЦНС улитки Helix (нейропептиды семейства CNP, педальный пептид, FMRFaMim). Изучить в ЦНС беспозвоночных, принадлежащих к различным типам (моллюски, насекомые, кольчатые черви) строение системы нейронов, содержащих нейропептиды семейства CNP, и исследовать возрастные и функциональные изменения в этой системе. Исследовать особенности проекций различных типов первично-сенсорных нейронов в щупальцах улитки Helix в связи с их медиаторностью. Изучить морфологические основы функций нейронов, содержащих инсулин-подобные пептиды, в ЦНС улитки Helix.
Научная новизна работы.
1. Впервые описано развитие нервной системы улитки Helix в онтогенезе и составлена шкала стадий развития.
2. Впервые показано, что влияние целой группы модуляторных серотонинергических нейронов на командные нейроны оборонительного поведения осуществляется через посредство одного нейрона (Пд4). Выяснено, что в основе возрастных особенностей поведения у ювенильных животных лежит отставание в развитии серотонинергических модуляторных нейронов (меньшее число и меньшие относительные размеры нейронов).
3. Впервые описано формирование ГАМКергической системы нейронов в ЦНС улитки в эмбриональный и ранний постэмбриональный периоды жизни.
4. Впервые показано, что в ЦНС беспозвоночных различных типов нейроны, содержащие нейропептиды CNP семейства, имеют сходный тип морфологии: интернейроны, сенсорные нейроны и нейроэндокринные клетки. Показано, что экспрессия CNP нейропептидов лабильна, тогда как синтез РМБРамида и педального пептида не зависит от внешних воздействий.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В основе работы серотонинергических нейронов, модулирующих оборонительное поведение, лежат принципы компартментализации медиатор-специфичной системы и делегирования функций, выражающиеся в определенной соматотопике проекций, меняющейся в онтогенезе.
2. Нейропептиды можно классифицировать по степени зависимости их экспрессии от возрастного и функционального состояния животного. Нейропептиды одного семейства экспрессируются в сходных функциональных типах нейронов у разных беспозвоночных животных.
Заключение Диссертация по теме "Физиология", Иерусалимский, Виктор Николаевич
ВЫВОДЫ
1. Эмбриональный цикл развития улитки Helix aspersa составляет, при комнатной температуре, 16 дней, причем ЦНС развивается в течение последних 7 дней. Развитие ЦНС происходит в ростро-каудальном направлении. К моменту вылупления сформирована система нейронов, отвечающая за оборонительные реакции улитки.
2. Из всех серотонинергических ростро-медиальных нейронов педальных ганглиев улитки Helix lucorum только один Пд4 нейрон проецируется в плевральные и париетальные ганглии. Его стимуляция вызывает те же эффекты, что и стимуляция всей группы модуляторных нейронов. У ювенильных животных число серотонинергических нейронов в ростро-медиальной области педальных ганглиев и относительные размеры этих нейронов меньше, чем у взрослых животных, что, по-видимому, лежит в основе возрастных отличий оборонительного поведения.
3. ГАМКергическая система нейронов улитки Helix aspersa развивается как в эмбриогенезе, так и в ранний постэмбриональный период. ГАМКергические нейроны появляются на ранних стадиях формирования ЦНС в эмбриогенезе. Часть нейронов, содержащих ГАМК у ювенильных животных, перестает выявляться в ЦНС взрослых животных. ГАМК участвует в пищевом поведении улитки Helix lucorum.
4. В основе функционирования системы нейронов, содерясащих инсулин-подобные пептиды в ЦНС Helix lucorum, лежит соматотопическая организация их проекций. Эти нейроны содержат цинк, по-видимому, необходимый для хранения инсулин-подобных пептидов.
5. Нейропептиды различаются по степени зависимости их синтеза от внешних воздействий. Существуют нейропептиды, экспрессия которых зависит от внешних воздействий (CNP семейство), и нейропептиды, экспрессия которых не зависит от внешних воздействий (FMRPaMHH и педальный пептид). Пластичность зависит как от типа нейропептида, так и от того, в каких нейронах он локализован.
6. Нейропептиды CNP семейства имеют сходное морфологическое проявление у насекомых, кольчатых червей, моллюсков: их экспрессия лабильна и детектируется в интернейронах, нейроэндокринных клетках, сенсорных нейронах.
7. Около 7-8% сенсорных нейронов в щупальцах улнтки Helix lucorum напрямую проецируются в метацеребральную область церебральных ганглиев (предположительно, механосенсорные нейроны). Часть из них содержит CNP нейропептиды.
СПИСОК СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Захаров И. С, Иерусалимский В. Н. (1991) Роль церебральных ганглиев в организации пищевого поведения крылоногогго моллюска Clione limacina, Журн. Высш. Нервн. Деят. 41(1):85-94
2. Zakharov IS, Ierusalimsky VN (1992) The neuroanatomical basis of feeding behavior in the pteropod mollusc, Clione limacina (Phipps). J Comp Physiol [А]. 170(4):525-532
3. Иерусалимский В. H., Захаров И. С., Палихова Т. А., Балабан П. М. (1992) Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helix lucorum L. Журн. Высш. Нервн. Деят. 42(6): 1075-1089
4. Иерусалимский В. Н., Захаров И. С. (1992) Картирование нейронов, участвующих в иннервации стенки тела виноградной улитки. Журн. Высш. Нервн. Деят. 42(6): 1116-1123
5. Захаров И. С., Иерусалимский В. Н. (1995) Постэмбриональный нейрогенез обонятельного анализатора улитки. Доклады Академии Наук 342(3):418-420
6.1. S. Zakharov, V. N. Ierusalimsky, P. М. Balaban (1995) Pedal serotonergic neurons modulate the synaptic input of withdrawal interneurons in Helix. Invertebrate Neurosciencel:41-52
7. Иерусалимский В. H., Захаров И. С., Балабан П. М. (1997) Сравнение серотонин-и дофаминергической нейронных систем у половозрелых и ювенильных наземных моллюсков Helix и Eobania. Журн. Высш. Нервн. Деят. 47(3):563-576
8. Ierusalimsky VN, Balaban РМ (1997) MlPs-containing cells in terrestrial snails: comparison of immunostaining and silver intensification. Neuroscience Research Communications 21(3), 213-221
9. Zakharov IS, Hayes NL, Ierusalimsky VN, Nowakowski RS, Balaban PM. (1998) Postembryonic neurogenesis in the procerebrum of the terrestrial snail, Helix lucorum L. J Neurobiol. 35(3):271-276
10. Balaban PM, Bravarenko N1, Maksimova OA, Nikitin E, Ierusalimsky VN, Zakharov IS (2001) A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol Learn Mem. 75(l):30-50
11. Ierusalimsky VN, Balaban PM (2001) Ontogenesis of the snail, Helix aspersa: embryogenesis timetable and ontogenesis of GABA-like immunoreactive neurons in the central nervous system. JNeurocytol. 30(1):73-91
12. Bravarenko N1, Ierusalimsky VN, Korshunova ТА, Malyshev AY, Zakharov IS, Balaban PM (2001) Participation of GABA in establishing behavioral hierarchies in the terrestrial snail. Exp Brain Res. 141(3):340-348
13. Ierusalirasky VN, Boguslavsky DV, Belyavsky AV, Balaban PM (2003) Helix peptide immunoreactivity pattern in the nervous system of juvenile aplysia. Brain Res Mol Brain Res. 120(l):84-89
14. Boguslavsky D, Ierusalimsky V, Malyshev A, Balaban P, Belyavsky A (2003) Selective blockade of gene expression in a single identified snail neuron. Neuroscience. 119(1):15-18
15. Иванова Ю. Jl., Леонова О. Г., Попенко В. И., Иерусалимский В. Н., Богуславский Д. В., Балабан П. М., Белявский А. В. (2004) Иммуноцитохимическое изучение локализации продуктов гена HCS2 в командных нейронах виноградной улитки. Молекулярная Биология; 38(6):1024-1032
16. Aseyev N, Ierusalimsky V, Boguslavsky D, Balaban P (2005) Snail peptide expression pattern in the nervous system of the medicinal leech. Brain Res Mol Brain Res. 140(l-2):99-105
17. Ierusalimsky V, Balaban P. (2005) Morphological basis for coordination of growth and reproduction processes in the CNS of two terrestrial snails. Exp Brain Res. 161(4):465-473.
18. Коршунова Т. А., Малышев А. Ю., Захаров И. С., Иерусалимский В. Н., Балабан П. М. (2005) Функции пептида CNP4, кодируемого геном HCS2 в нервной системе Helix lucorum. Журн. Высш. Нервн. Деят. 55(1):91-99
19. Ефимова О. И., Иерусалимский В. Н., Анохин К. В., Балабан П. М. (2006) Иммуногистохимическая детекция транскрипционных факторов pCREB и c-Fos в нервной системе моллюсков. Журн. Высш. Нервн. Деят. 56:801-804
20. Ierusalimsky VN, Balaban PM (2006) Immunoreactivity to molluskan neuropeptides in the central and stomatogastric nervous systems of the earthworm, Lumbricus terrestris L. Cell Tissue Res. 325:555-565
21. Ivanova IuL, Leonova OG, Popenko VI, Ierusalimsky VN, Bogusalvsky DV, Korshunova ТА, Malyshev AIu, Balaban PM, Beliavsky AV (2006) Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cellular and Molecular Neurobiology. 26(2): 127-144
22. Ierusalimsky VN, Balaban PM (2007) Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330(1): 169-177
23. Ierusalimsky VN, Balaban PM (2007) Neuropeptides of Drosophila related to molluscan neuropeptides: dependence of the immunoreactivity pattern on the ontogenetic stage and functional state. Brain Res. 1152:32-41
Автор выражает свою искреннюю благодарность всем людям, с которыми ему пришлось вместе работать, и у которых он смог многому научиться. Прежде всего -своему многолетнему и неизменному руководителю и другу, замечательному ученому, П. М. Балабану. А также коллегам, вместе с которыми выполнены некоторые части данной работы: Н. И. Браваренко, И. С. Захарову, В. Н. Мац, А. Ю. Малышеву, А. В. Белявскому, Д. В. Богуславскому. Я благодарю также всех сотрудников нашей лаборатории за их дружеское участие и неизменный интерес к моей работе.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Иерусалимский, Виктор Николаевич, Москва
1. Абрамова МС, Нистратова ВЛ, Москвитин АА, Пивоваров АС (2005) Метиотепин-чувствительные серотониновые рецепторы вовлечены в постсинаптический механизм сенситизации оборонительной реакции виноградной улитки. ЖВНД 55:385-392
2. Абрамова МС, Москвитин АА, Пивоваров АС (2006) Влияние ингибиторов синтеза белка на сенситизацию оборонительной реакции виноградной улитки и потенциацию холиночувствительности командных нейронов. ЖВНД 56:355-362
3. Абрамова МС, Палихова ТА, Пивоваров АС (2007) Гетеросинаптическая потенциация холинергических возбуждающих постсинаптических ответов командных нейронов виноградной улитки. ЖВНД 57:712-720
4. Андрейкович ЕВ (1969) Биология размножения виноградной улитки в Литве. Труды АН Лит. ССР. Т. 5. №1 (48). С.111.
5. Аракелов ГГ (1980) Интегративные процессы в идентифицированном нейроне виноградной улитки, имеющем две триггерные зоны. ЖВНД 30:1030-1036
6. Балабан ПМ, Захаров ИС, Мац ВН (1985) Прижизненное избирательное окрашивание серотонинергмческих нервных клеток 5,7-диокситриптамином. Докл. АН СССР. Т. 283. С. 735.
7. Балабан ПМ, Захаров ИС, Саакян СА (1980) Действие ГАМК на командные нейроны улитки Helix lucorum. Журн Эвол Биохим Физиол 16:261-265
8. Балабан ПМ, Захаров ИС (1992) Обучение и развитие (общая основа двух явлений). Москва, Наука
9. Балабан ПМ (2007) Клеточные механизмы пластичности поведения в простых нервных системах. Росс физиол журн им. И.М. Сеченова 93:521-530
10. Боровягин ВЛ, Сахаров ДА (1968) Ультраструктура гигантских нейронов тритонии. Атлас. М,: Наука, 1-32
11. Браваренко НИ, Балабан ПМ, Соколов ЕН (1982) Организация сенсорного входа системы командных нейронов. ЖВНД 32:94-99
12. Браваренко НИ, Малышев АЮ, Воронин ЛЛ, Балабан ПМ Эфаптическая обратная связь в идентифицированном синапсе наземного моллюска. (2004) ЖВНД 54:565-572
13. Вепринцев БН., Гелеткж ВИ, Костенко МА (1976) Культивирование нервных тканей моллюсков Lymnaea stagnalis и Helixpomatia. в кн. Руководство по культивированию нервной ткани. М, с. 190-209
14. Галанина ГН, Захаров ИС, Максимова OA, Балабан ПМ (1986) Роль гигантской серотонинсодержащей клетки церебрального ганглия в организации пищедобывательного поведения улитки. Журн высш нерв деят Т. 36. С. 110
15. Дьяконова BE (2007) Поведенческие функции серотонина и октопамина: некоторые парадоксы сравнительной физиологии. Усп. физиол. наук 38:3-20
16. Ефимова ОИ, Иерусалимский ВН, Анохин KB, Балабан ПМ (2006) Иммуногистохимическая детекция транскрипционных факторов pCREB и c-Fos в нервной системе моллюсков. ЖВНД 56. 801-804
17. Зайцева ОВ (1992) Структурная организация сенсорных систем улитки. ЖВНД 42:1132-1149
18. Иванова-Казас ОМ (1977) Сравнительная эмбриология беспозвоночных. М., Наука, 312 с.
19. Иерусалимский ВН, Балабан ПМ (1985) Низкопороговая область генерации потенциалов действия в соматической мембране нейронов моллюсков. Нейрофизиология; 17:15-19
20. Иерусалимский ВН, Балабан ПМ (1986) Величина потенциала, наведенного на нервной клетке моллюсков в низкочастотном электрическом поле. ЖВНД 36: 163-169
21. Иерусалимский ВН, Балабан ПМ (1988) Влияние экстраклеточного электрического поля на генерацию импульсной активности и входное сопротивление идентифицированных нейронов виноградной улитки. Изв. АН СССР, сер. Биол. 2: 284-292
22. Иерусалимский ВН, Балабан ПМ (1988) Локализация зон генерациии потенциалов действия в нейронах виноградной улитки. Нейрофизиология 20: 90-98
23. Иерусалимский ВН, Захаров ИС, Палихова ТА, Балабан ПМ (1992) Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helix lucorum. ЖВНД 42(6): 1075-1089
24. Кикнадзе ИИ, Колесников НН, Лопатин ОЕ (1975) Хирономус Chironomus thummi Kieff. (лабораторная культура). В кн. Объекты биологии развития, М., Наука с 95-128
25. Козырев СА, Никитин ВП, Шерстнев ВВ (2007) Синапс-специфическая пластичность в командных нейронах при обучении виноградных улиток в условиях действия ингибиторов каспаз. Бюлл Эксп Биол Мед 144:605-608
26. Коршунова ТА, Малышев АЮ, Захаров ИС, Иерусалимский ВН, Балабан ПМ (2005) Функции пептида CNP4, кодируемого геном HCS2, в нервной системе Helix lucorum. ЖВНД. Т.55, №1.91-99
27. Кэндел Э (1980) Клеточные основы поведения. М, Мир
28. Максимова OA, Балабан ПМ (1983) Нейронные механизмы пластичности поведения. М, Наука
29. Малышев АЮ, Браваренко НИ, Пивоваров АС, Балабан ПМ (1997) Влияние уровня серотонина на постсинаптически индуцированную потенциацию ответов нейронов улитки. ЖВНД 47:553-563
30. Медвинский АБ, Перцов AM (1979) Взаимодействие волокон при распространении возбуждения в гладкомышечной и миокардиальной тканях Биофизика, 24:135-140
31. Михальцев ИЕ, Дьяконова ТЛ, Набокин ПИ, Громенко ДЛ, Маслов ЮА (1980) Квазиэлектростатичеекое воздействие па одиночный нейрон: частотная модуляция активности и возбуждение. Биофизика, 25:1027-1033
32. Михальцев ИЕ, Дьяконова ТЛ, Набокин ПИ, Громенко ДЛ, Маслов ЮА (1981) Квазиэлектростатичеекое воздействие на одиночный нейрон: следовые явления и сопоставление с внутриклеточным возбуждением. Биофизика, 26:94- 98
33. Никитин ВП, Козырев СА (2005) Протеинкиназа С избирательно вовлечена в механизмы долговременной синапс-специфической пластичности. Бюлл Эксп Биол Мед 139 6:604-607
34. Никитин ВП (2006) Новый механизм синапс-специфической нейрональной пластичности. Росс Физиол Журн им ИМ Сеченова 92:402-419
35. Никитин ВП, Козырев СА (2006) Влияние смысловых олигонукпеотидов к мРНК раннего гена zif268 на механизмы синапс-специфической пластичности. ЖВНД 56:499-505
36. Лисачев ПД, Третьяков ВП (1988а) Структурные основы организации моторной программы оборонительного рефлекса виноградной улитки//Простые нервные системы. Тез. докл. Л.: Наука,. С. 167—169
37. Лисачев ПД, Третьяков ВП (19886) Распределение отростков нейронов ЛПаЗ и ППаЗ в нервах педальных ганглиев виноградной улитки//Журн высш нерв деят Т. 38. N 6. С. 11132—1137
38. Палихова ТА, Абрамова МС, Пивоваров АС (2006) Холинергические сенсорные входы к командным нейронам виноградной улитки. Бюлл Эксп Биол Мед 142:244-247
39. Пивоваров АС, Дроздова ЕИ (1992) Идентификация холинорецепторов на соме нейронов ЛПаЗ и ППаЗ виноградной улитки. Нейрофизиология 24:77-86
40. Пивоваров АС, Нистратова ВЛ (2003) Модуляторные серотониновые рецепторы на соме командных нейронов виноградной улитки. Бюлл Эксп Биол Мед 136:132-134
41. Погорелая ИХ, Скибо ГГ, Троицкая НК (1980) Структурные особенности изолированных и перфузированных нейронов моллюсков Helixpomatia. Нейрофизиология, 12:297-302
42. Русинов ВС, Эзрохи ВЛ (1967) О возможности эфаптического взаимодействия нейронов посредством создаваемого ими внеклеточного электрического поля. ЖВНД, 17:947-955
43. Русинов ВС (1969) Доминанта. Электрофизиологические исследования. М., Медицина
44. Салимова НБ, Милошевич И (1987) Серотонинсодержащие нейроны в ганглиях активных и зимующих улиток Helix lucorum. Докл АН СССР Т. 294. С. 1261.
45. Сахаров ДА Генеалогия нейронов. М.: Наука, 1974. 184 с.
46. Сахаров ДА (1990а) Интегративная функция серотонина у примитивных Metazoa. Журн. общ. Биологии 51:437-449
47. Сахаров ДА (19906) Множественность нейротрансмиттеров: функциональное значение. Журн. эвол. биохимии и физиологии 26:733-741
48. Соколов ЕН (1973) О роли пейсмекерного потенциала нейрона в механизме поведенияю ЖВНД, 23:1241-1243 ,
49. Соколов ЕН (1981) Нейронные механизмы памяти и обучения. М., Наука, 144 с.51,52.53,54.
-
Иерусалимский, Виктор Николаевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.13
- Развитие нервной системы у личинок иглокожих
- Онтогенез медиаторных систем мозга
- Формирование трансмиттер-специфических нейронов и поведения в развитии пресноводных легочных моллюсков
- Пространственно-временная динамика нейромедиаторных веществ и развитие нервной системы в онтогенезе стрекающих
- Влияние вторичных посредников на кратковременную пластичность холинорецепторов идентифицированных нейронов виноградной улитки
