Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование трансмиттер-специфических нейронов и поведения в развитии пресноводных легочных моллюсков

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Формирование трансмиттер-специфических нейронов и поведения в развитии пресноводных легочных моллюсков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им, Н,К, Колццм

На правах рукописи. УДК 594.38: 612.829.

ВОРОНЕЖСКАЯ Елена Евгеньевна

ФОРМИРОВАНИЕ ТРАНСМИТТЕР-СПЕЦИФИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ И ПОВЕДЕНИЯ В РАЗВИТИИ * ПРЕСНОВОДНЫХ ЛЕГОЧНЫХ МОЛЛЮСКОВ.

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат

Диссертации на соиасаниа ученой степени кандидата биологических наук.

Москва, 1995 г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из задач нейробиологми развития является изучение феномена функционального созревания нервных клеток и последующего объединения их в координированные нейрональные системы, обеспечивающие формирование поведенческих актов. Каждому моменту развития нервной системы соответствует определенная качественная и количественная нейротренсмиттерная мозаика. Это связано с тем. что в процессе созревания индмзидуальной нервной клетки в определенное время начинается экспрессия спзцифического нейротрансмитгера. Важная роль этих веществ еще на донервных стадиях развития в регуляции таких важных процессов как первые дгдания дробления, ранние межклеточные взаимодействия, регуляцмя морфогенетических перемещений клеток была впервые установлена в кгчале 60-х годов (см. Бузников, 1987, Нейротрансммиттеры в эмбриогенезе, М., Наука) и с тех пор подтверждается многими исследованиями. Не подвергается сомнению роль медиаторов в формировании и управлении поведением взрослого организма. Однако • промежуточный период, между функционированием медиатора на донервных стадиях развития и его действием в зрелой нервной системе, только в последнее время стал привлекать внимание исследователей.

Существует много публикаций, авторы которых прослеживают корреляции между состоянием нейротрансмиттерных систем и становлением функций различных отделов нервной системы в онтогенезе. Однако огромное число клеток, составляющих нервную систему позвоночных животных и многообразие и сложность свойственного им поведения делают детальное исследование этого вопроса чрезвычайно сложным. В связи с этим, беспозвоночные, нервная система которых содержит относительно небольшое число клеток, а поведенческий репертуар может быть сведен к набору ограниченного числа простых поведенческих актов, представляют большой интерес. Они являются идеальной моделью, позволяющей изучать описанные явления не только на уровне феноменов и корреляций, но также и на уровне функционирования отдельных (часто идентифицированных) клеток и генов. Работы последних лет показывают, что результаты, полученные при

исследовании простых нервных систем, успешно переносятся на более сложные нервные системы высших позвоночных, и тем самым, имеют важное значение для понимания принципов и механизмов, лежащих в основе формирования зрелого мозга.

С этой точки зрения, пресноводные легочные моллюски, один из хорошо изученных объектов эмбриологии, с одной стороны, и нейрофизиологии, с другой, предоставляют исследователям удачную модель для изучения фундаментальных вопросов нейробиологии.

Одним из феноменов, несомненно играющих важную роль в процессах онтогенеза, является временная экспрессия медиатора на некоторых отрезках развития определенными клетками формирующейся нервной системы. Такие нейроны получили название транзиторных нейронов и были найдены и описаны у некоторых позвоночных (см. обзор Tublrtz, Сотр. Biochem. Physiol. 1993,105С: 147-154). Однако значение этого феномена и его механизм(ы) до настоящего времени не изучены подробно ни на одной из имеющихся известных моделей.

В контексте гипотезы об иктегративной функции медиаторов (Сахаров, 1983) каждый нейротрансмитгер выполняет в нейронной системе не только функцию передатчика, но и обеспечивает целесообразное согласованное состояние, являющееся частью поведенческого репертуара. Так, на многих модельных объектах хорошо изучены антагонистические поведенческие программы, интегрируемые катехоламинами и серотонином, а также FMRFaMHflOM и знкефапинами.

Цель и задачи исследования

Целью нашой работы было: (1) изучить формирование систем различной эргичности в онтогенеза пресноводных легочных моллюсков и саязь этих систем с возникновением и становлением поведенческих актов, контролируемых у взрослых животных этими медиаторными системами; (2) выяснить, присутствуют пи транзиторныв нейроны в онтогенезе моллюсков, и определить их функциональное значение.

Конкретными зкспериыентальныии задачами данного исследования стали: (1) изучение формированиякатехоламин- (КА), серотонин- (5НТ) и

РМКРамид-ергической (РМЯРа) систем в эмбриогенезе нескольких видов водных легочных моллюсков; (2) определение момента возникновения и созревания поведенческих актов, контролируемых у взрослых особей изучаемыми нвйрональными системами; (3) поисктранзиторных нейронов; (4) определение возможного функционального значения транзиторных нейронов.

Научная новизна результатов.

Впервые проведено детальное исследование формирования катехоламин- и РМЯЯамид-ергичзской нервных систем в змбрмо- и постэмбриогенезе у ряда представителей пресноводных легочных моллюсков. Уточнены детали развития серотснинергической системы в развитии тех же животных. Впервые со всех исследованных системах обнаружены тракзчторные нейроны, экспрессирующие медиатор только на определенном отрезке онтогенеза.

Описаны сходство и различия в возникновении и развитии разных медиаторных систем на ранних этапах эмбриогенеза у родственно близких видов пресноводных легочных моллюсков. Полученные результаты позволяют внести существенные изменения в представления о прохождении раннего нейрогеза у моллюсков. В частности, продемонстрировано, что первые клетки, экспрессирующие медиэторы, появляются на периферии, за пределами формирующейся ЦНС. Растущие аксоны ранних клеток формируют опорные пути, вдоль которых происходит в дальнейшем дифференцировка центральных ганглиев и рост соединяющих ганглии номиссур и коннектив.

Выявлены различия в созревании систем различной медиаторной эргичности. Увеличение числа клеток, экспрессирующих медиатор в процессе развития, происходит в случае моноаминергических (КА, 5НТ) систем благодаря возникновению новых кластеров нейронов. В случае пептидергической (РМИРамид) системы аналогичное возрастание числа нейронов происходит посредством добавления новых клеток внутри уже сущзствугащих кластеров. Обсуждается возможное функциональное значение выявленного различия.

Изучено формирование локомоторного, пищевого и респираторного поведения в развитии большого прудовика. Выявлены корреляции между

возникновением поведенческих актов и управляющих нейрональных систем а эмбриогенезе.

Проведено исследование действия специфических антагонистов рецепторов и токсического аналога дофамина на развитие нервной системы и формирование дофаминзависимого поведения. При долговременном применении на зародышах моллюска одного из стандартных блокаторов рецепторов дофамина - галоперидола - обнаружен ранее не известный способ действия этого вещества - существенное снижение уровня нейрональных моноаминов. Проверка на ткани зрелого мозга подтвердила, что такой способ действия наблюдается также и для части популяции катехоламинергических нейронов ЦНС. Эти результаты позволяют дать новую трактовку эффективности хронического галоперидола как антипсихотического лекарственного средства.

Научно-практическое значение мботы.

Полученные данные представляют новый взгляд на процессы нейрогенеза у представителей типа Mollusca.

Представлено детальное описание развития нервных систем различной медиаторной специфичности для ряда модельных объектов нейробиологии и биологии развития. Изучено формирование поведения в процессе онтогенеза одного из наиболее популярных объектов нейрофизиологии - большого прудовика. Высказано предложение об использовании данного моллюска о качестве удобного тест-объекта для изучения и быстрого тестирования действия различных фармакологических агентов. Результаты, полученные при анализе действия хронического галоперидола на клетки зрелого мозга улиток позволяют дать новую трактовку эффективности этого широко применяемого в медицинской практике антипсихотичесхого лекарственного средства.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции 'Сигнальные молекулы и поведение* (Пущино, 1989), на X Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии поев. ЛАОрбели (Ленинград, 1990), на региональной конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных (ISIN) "Простые нервные системы' (Минск, 1991), на совещании по морфогенетически активным веществам

"Морфоген III" (Пущино, 1992), на конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 1993), на международной конференции ISIN "Простые нервные системы" (Пущино, 1994), на IV международной конференции по нейробиологии моллюсков "SYMON" (Амстердам, 1994), на ежегодном собрании американского общества по нейронаукам (Майами, 1994).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 64 страницах машинописного текста и состоит из введения, 9 глав (обзор литературы, объекты и методы иследований, 7 глав результатов и их обсуждения), заключения, выводов и иллюстраций. Иллюстрации включают 6 таблиц и 37 микрофотографий и рисунков. Список литературы включает 199 источников.

Публикации. По результатам, представленным к защите, опубликованы 7 статей в отечественных и международных журналах, а также 7 тезисов докладов в трудах региональных и международных съездов и конференций, 2 статьи в настоящее время находятся в печати.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В главе представлена история и причины интереса к изучению нервной системы беспозвоночных животных. Приводятся данные по развитию нервной системы и ее роли в различные периоды жизни беспозвоночных, в частности эмбриональные нейрональные перестройки, пути возникновения и последующей реорганизации нервной ткани во время метаморфоза и дальнейшего развития. Рассматриваются некоторые особенности нейрогенеза брюхоногих моллюсков, отличающие их от других беспозвоночных, а также позвоночных. Отсутствие таких явлений, как начальная избыточность и запрограммированная смерть нейронов позволяют некоторым авторам высказать предположение о принципиальном отличии развития моллюсков от большинства животных других групп. Приводится гипотеза об интегративной функции медиаторов и примеры трансмиттер-зависимого поведения. Представлены имеющиеся в литературе данные по возникновению клеток разной медиаторной эргичности в развитии гастропод и выявленные корреляции с формирующимся поведением.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основным объектом исследований служили эмбрионы и ювенильные особи большого прудовика, Lymnaaa stagnate (лабораторная колония). Для выяснения общности выявляемых феноменов использовались о качестве сравнения другие представители семейства Lymnaeaidae: Lymna&a auricularia и Physa fontinalis; а также представители близкородственного семейства Planorbidae: Planorbis planorbis, Planorbarius cormus, Hatisoma trivolvts и Biomphalaria glabarus. Почти все из перечисленных видов были представлены как особями из лабораторной культуры, так и собранными в природе. В наших экспериментах не было выявлено отличий между культуральными и дикими моллюсками.

Стадии развития эмбрионов выделялись на основании комплекса морфологических, морфометричесхих и поведенческих признаков. Нами было составлено соотношение различных способов классификации стадий рэзэития большого прудовика. Применяемое процентное обозначение позволяет из учитывать разницу а абсолютных сроках развития зародышей улиток различных видов. По данной методике этапы развития обозначаются в процентах по отношению ко времени всего процесса эмбриогенеза. За 100% принимается время от первого клеточного деления (Е0) до момента вылупления (Е100). Такое обозначение стадий развития применялось о работе.

Основное внимание уделялось среднему этапу развития пресноводных легочных моллюсков: начиная со стадии трохоФоры (стадия Е15), прохождения нескольких стадий велигера (Е28-Е45), вступления в метаморфоз и его прохождение (Е45-Е65), дальнейший рост и вылуплвние (Е65-Е100). При изучении развития поведения наблюдения производились за зародышами асах перечисленных стадий развития. Для гисто- и иммуноцитохимического изучения, а также для различных фармакологических воздействий использовали эмбрионов на тех стадиях развития, когда происходят ключевые изменения в морфологии, строении нервной системы и поведении зародышей. Выделение стадий поетаибрионапьиошо развития большого прудовика проводилось на основании метода, предложенного Кроллом и Шиассоном (Стой and Chiasson, 1989). По данным упомянутых авторов для всех улиток с

s

соотношением длина/ширина раковины равным 2-2.5 верно соответствие между длиной раковины и уровнем развития созревающей нервной системы. Согласно их классификации выделяется 6 стадий постэмбрионального развития: Р1 (1.4-2.5 мм, только что вылупившиеся), Р2-РЗ (2.6-6.2 мм, молодые подрастающие), Р4-Р5 (6.3-15.9 мм, зрелые подрастающие), Р6 (16.025 мм, молодые взрослые, достигшие стадии полового созревания).

Наблюдение за развитием поведения зародышей проводилось визуально под бинокуляром. Принимали во внимание следующие показатели, характер ресничного вращения раннего зародыша внутри яйца, перемещения внутри яйца, возникновение движений ноги, головы, сокращения колумеллярной мускулатуры, момент прикрепления к внутренней поверхности яйца и характер скольжения по ней, начало работы буккального аппарата, буккальный ритм при вылуплении и при активации пищевого поведения 1 % раствором сахарозы на следующий день после выхода из яйца, динамику вылупления, начало дыхания атмосферным воздухом. Для графической регистрации двигательных процессов использовали модификацию микромеханографической установки (Лабас и др., 1982).

Нейроны различной медиаторной специфичности выявляли на разных стадиях эмбрио- и постэмбриогенеза с использованием общепринятых методов иимуно- и гистохимии (непрямой метод Стернбергера (1979), глиоксилатный люминесцентный по Де ла Toppe (1980)) в модификациях оптимальных для препаратов пресноводных моллюсков.

Использовали инкубацию извлеченных из кокона яиц в галоперидоле и метилэргометрине {Г.Рихтер, LEK, 1 мкМ), инъекцию под яйцевую оболочку 6-гидроксидофамина и 5,7-дигидрокситриптамина (Sigma, 10 мкМ), FMRFaMyyja (Sigma, 0.1 ммМ) и антител к нему (Incstar, 1:10). Для инкубации вещества разводились на отстоенной водопроводной воде, для инъекций - на физиологическом растворе для зародышей прудовика (Taylor, 1973).

Препараты изучали и фотографировали под микроскопами Axioplan, Janaval, МЛД-1 с соответствующими фотонасадками.

Работа была выполнена в 1989-1994тг. в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. Основная

часть экспериментов проводилась на Кропотовасой биостанции Института биологии развития (Каширский р-н Московской области). Часть морфологических исследований выполнена совместно с сотрудниками отделения экспериментальной зоологии Балатонского лимнологического института (Тихань. Венгрия) и кафедры физиологии и биофизики Университета Dalhousie (Галифакс, Канада).

Глава 3. РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ МОТОРИКИ У ЗАРОДЫШЕЙ ПРУДОВИКА LYMNAEA STAGNAUS.

Эмбриональная моторика появляется у зародыша на достаточно продвинутой стадии развития (ст. Е15, поздняя гаструла). Первой различимой ее формой является равномерное вращение зародыша в капсулярной жидкости.

Со ст. Е40 (велигер) вращение, до того непрерывное, начинает прерываться спонтанными паузами. На ст. Е45 (поздний велигер) появляются также и вызванные паузы во вращении зародыша.

На ст. Е55 появляется другая форма перемещения зародыша внутри яйца - реснички передней трети ноги используются для осуществления скользящей локомоции по оболочке яйца.

На ст. Е60 продолжается прогрессирующее снижение общей моторной активности зародыша. Остановки, во время которых он свободно зависает в капсулярной жидкости, становятся все более длительными. Хорошо выделяются, пока еще редкие, спонтанные мышечные движения: подтягивание задней части ноги к раковине, вентральные флексии ноги, боковые повороты ноги относительно раковины.

На ст. Е75 увеличивается область подошвы, участвующая в скользящем (ресничном) движении по стенке капсулы. Оно значительно медленнее (оборот за 7-10 мин) ресничного вращения в капсулярной жидкости, которое постепенно сходит на нет. Описанные выше спонтанные мышечные движения становятся более частыми. Впервые появляются движения пневмостома: диаметр дыхательного отверстия может изменяться, вплоть до полного закрытия. Наблюдается мышечный ответ (резкий'подъем головы) на

прикосновение области губ к стенке яйца. На зтой стадии извлеченный из яйца зародыш способен втягиваться в раковину.

Со ст. Е80 впервые отмечаются одиночные редкие движения буккальной мускулаиуры (около 5 за 10 мин). Выдвижение (протракция) радулы может повторяться несколько раз, не сменяясь ретракцией. Начиная с этого возраста и до вылупления формируется "нормальный" буккальный цикл.

На СТ.Е90 подошва ноги полностью распластана по стенке капсулы как при движении зародыша, так и во время остановок. Локомоторная активность представлена скользящей локомоцией. Появляются боковые изгибы ноги, позволяющие зародышу изменять направление движения. Наблюдаются уже не одиночные движения буккальной массы, а эпизоды ритмической активности, продолжительностью от 0,5 до 4 мин и частотой 11-15 циклов в мин. Они перемежаются паузами. Не наблюдается связи между эпизодами буккальной и локомоторной активности.

Непосредственно перед вылуплением, на ст. Е100, зародыш занимает практически весь объем капсулы и очень редко передвигается внутри яйца, • совершая только повороты передней части тела. Длительные периоды полного покоя (до 30 мин) сменяются столь же длительными периодами непрерывной буккальной активности. Частота движений не больше, чем на предыдущей стадии. Можно видеть, как с помощью радулы зародыш проделывает отверстие в капсулярной мембране и высвобождается из яйца. Стереотипные движения, которые наблюдаются при вылуплении и сразу после него, подобны одному из известных типов локомоции взрослых особей - так наз. "terrestrial locomotion", которая характерна для передвижения моллюсков при низком уровне воды.

Глава 4. ФОРМИРОВАНИЕ КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В РАЗВИТИИ ЛЕГОЧНЫХ МОЛЛЮСКОВ.

Впервые специфическое свечение катехоламинов вызванное реакцией с глиоксиловой кислотой появляется у зародышей лимнвид на стадии ЕЗО (раннего велигера) в паре крупных клеток, расположенных несколько латеральнее и дорсальнее ротового отверстия, вне области будущей закладки ганглиев. Реакция с антителами ктирозингыдроксилазе, ключевому ферменту цепи синтеза катехоламинов, позволила точнее установить форму этих клеток

и проследить ход их отростков. Ранние катххоламинергические клетки являются биполярнымми. Короткий отросток заканчивается о наружном . эпителиальном слое, а длинные отростки образуют широкую сеть в апикальном отделе зародыша, непосредсвенно под ресничным эпителием апикальной

пластинки.

Следует отметить, что аналогичные клетки не были обнаружены у эмбрионов планорбид. Апикальная пластинка у них также не обнаруживается, хотя все другие ресничные образования на поверхности тела близки по расположению к сходным ресничным образованиям лимнеид. Других отличий в распределении катехопаминергических клеток у моллюсков этих двух семейств обнаружено не было.

После вылупления пара ранних катехоламинергичвсхмх клеток перестает выявляться, хотя мелкие биполярные клетки и отростки центральных нейронов продолжают выявляться в этой области тела. На основании этого мы считаем, что эта пара клеток экспрвссирует медиатор только на определенном участке эмбриогенеза и называем их транзиторными катехсламинергическими клетками.

Период, когда у эмбрионов обнаруживается только пара транзиторных катехопаминергических клеток продолжается в течение всей стадии оелигера и прохождения метаморфоза (Е30-Е65). После прохождения метаморфоза катехоламинергические клетки обнаруживаются на периферии, а ноге и головных щупальцах. Они также биполярны, имеют короткий отросток в наружном эпителии, а длинные отростки собираются в тяжи, входящие соответственно в педальные и церебральные ганглии. Клетки в ганглиях появляются за 1-1.5 дня до вылупления.

Схема распределения катехопаминергических нейронов в эмбриональном развитии лимнеид представлена на Рис. 1.

В постэмбриональном развитии число катехоламинергичесхих нейронов возрастает. Следует отметить, что их популяция неоднородна. Так, не все клетки, проявляющие зеленую люминесценцию при реакций с глиоксиловой кислотой, являются тирозингмдрокснлазиммунопозитивными.

п

Глав« 5. ФОРМИРОВАНИЕ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ВОДНЫХ ЛЕГОЧНЫХ МОЛЛЮСКОВ.

Впервые серотонин-иммунопозитивные клетки в эмбриогенезе лимнеид выявляются на стадии среднего еелигера (Е35) в паре клеток (С4) в антеродорсальном квадрате зародыша (место закладки церебральных ганглиев) и в паре клеток (ЕРе1) в средней части ноги (будущие педальные ганглии).

К стадии Е45 становятся различимы отростки клеток С4, направляющиеся к контралатеральному ганглию. В районе каждого педального ганглия четко выделяются три пары клеток (ЕРе1, ЕРе2, ЕРеЗ) и их отростки, иннервирующие ресничные образования на поверхности ноги.

.В процессе эмбриогенеза число иммунопозитивных клеток продолжает увеличиваться и при достижении Е80 в ЦГ общая картина такова: в передней части ганглия расположена клетка С1 (соответствующая гигантскому метацеребральному нейрону С1 взрослых моллюсков), легко определяемая по

Рис. 1. Схема распределения нейрональных катехоламинов на разных стадиях эмбриогенеза пресноводных легочных моллюсков (ЕЗО, Е60, Е75, Е95). Транзиторные катехоламинергические клетки (ТС1), обозначенные на схеме, отсутствуют у планорбид. CG - церебральный ганглий, PeG - педальный ганглий, RPeG - правый педальный ганглий, BG - букхальный ганглий, eye -глаз, foot - нога, mouth - рот, shell - раковина, tentacle - головное щупальце.

ее аксональным проекциям в буккальный ганглий; в каудальной части расположена группа нейронов С4-С6; несколько антеромедиальнее этой группы находится нейрон С2, посылающий отростки в направлении щупалец, каждом ПеГ насчитывается 11-13 5НТ-ИП клеток, часть из которых сгруппирована в медиальной области каждого ганглия (РеА кластер). Окончания отростков серотонинергических клеток можно видеть оканчивающимися непосредственно под ресничным эпителием подошвы, в мышцах ноги и колонны, под эпителием стенки тела.

Было обнаружено существенное отличие в формировании серотонинергической системы планорбид. Так, у эмбрионов ммоллюсков этого семейства первые серотониниммунопозитивные нейроны появляются значительно раньше, на стадии раннего ввлигера (ЕЗО). Они расположены дорсо-латеральнее ротового отверстия, вне области будущей закладки ганглиев, биполярны. Короткий отросток идет в переднюю область головы и заканчивается на поверхности эпителия пучком ресничек. Другой, более длинный, отросток проходит в ногу, в толще которой разветвляется и иннервирует реснички ноги. Отметим, что ранние серотонинергические клетки и у лимнеид, и у планорбид иннервируют аналогичные ресничные образования на поверхности ноги, с помощью биения ресничек которых зародыш вращается в капсулярной жидкости. На более поздних стадиях развития длинный отросток на своем пути к ноге последовательно проходит через церебральный и педальный ганглии. В течение всего эмбриогенеза местоположение тел этой пары клеток не меняется. Незадолго до вылупления (Е90) эти клетки и их отростки перестают выявляться, поэтому мы считаем их транзиторными серотонинергическими клетками.

На стадии ЕЗО выявляется пара клеток в ЦГ и ПеГ, соответствующие по своей морфологии, локализации и местам иннервации клеткам С4 и ЕРе1 зародышей лимнеид. На последующих стадиях развития появление и локализация серотониниммунопозитивных клеток в нервной системе планорбид не отличается от ранее описанного для лимнеид.

Суммарная схема возникновения серотонинергических клеток в эмбриогенезе лимнеид и планорбид представлена на Рис. 2.

u

PLAN0R8IDAE

LYMNAEIDAE

E60

E45

Рис. 2. Суммарная схема появления серотонин-иммунопозитивных клеток в эмбриогенезе прудовика (Lymnaeidae) и катушки (Planorbidae). Показаны стадии Е40, Е45 и Е60, на которых происходили значительные изменения в количестве и локализации иммунопозитивных клеток. Транзиторные серотонинергические клетки (TS1), появляющиеся первыми в развитии планорбид, у лимнеид отсутствуют. С4 - первая пара серотонинергических клеток лимнеид. CG - церебральный ганглий, PeG - педальный ганглий, eye -глаз, foot - нога, mouth - рот.

ГЛАВА 6. ФОРМИРОВАНИЕ РМЯРамид-ЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ВОДНЫХ ЛЕГОЧНЫХ МОЛЛЮСКОВ.

Впервые клетки, экспрессирующие один из широко известных нейромедиаторов - пептид семейства ИРамидов - появляется у зародышей пульмонагг на стадии перехода оттрохофоры с раннему велигеру (Е25-Е30). На этой ранней стадии еще даже не началась пролиферация клеток в зонах эктодермы, из которых впоследствии будут образовываться центральные ганглии. Первая выявляемая антителами к РМЯРамиду клетка возникает в каудальной части зародыша. Она биполярна, расположена строго по центру вентральнее только начавшей формироваться раковины. Два ее отростка направляются в передний отдел зародыша. Приблизительно в середине по ходу следования этих отростков обнаруживаются две симметричные клетки характерной звездчатой формы соответственно на правой и левой сторонах

стенки тела. Они мультиполярны, посылают один из свои* длинных отростков навстречу друг другу по вентральной стороне тела эмбриона, а другой длинный отросток следует по ходу отростка биполярной клетки в передний отдел зародыша. В момент, когда отростки первых РМЯРамид-ергичесхих клеток достигают области, непосредственно лежащей под цефалической пластинкой (зона эктодермы, из которой образуются церебральные ганглии), можно наблюдать, как в этой зоне начинается инвагинация эктодермы. Проводимая одновременно иммунореакция с антителами к тубулину, выявляющими волокна всех нервных клеток, независимо от их эргнчности, показала, что на стадии Е25-Е30 не выявляется никаких иных отростков в каких-либо областях тела зародыша, кроме отростков описанных выше трех РМРРамид-вргмчесхнх клеток.

На следующей стадии - среднего велигера (Е40) отростки ранних РМЯРамид-ергических клеток прорастают дальше, поворачивают в головном отделе и достигают зоны будущих педальных ганглиев. Отметим, что по времени этот момент совпадает с началом пролиферации клеток эктодермы в зонах закладки педальных ганглиев. Ход следования отростхов ранних РМЯРамид-ергических клеток напоминает ход следования коннеюив и комиссур на последующих стадиях развития.

У улиток после вылупления мы не смогли найти ничего, соответствующего ранним РМЯРамид-ергическим клеткам в местах их характерной локализации, хотя богатая иннервация этих зон отростхами других РМЯРамид-ергичесхих клеток продолжала выявляться. На основании этого факта мы считаем, что ранние РМЯРамид-иммунопозитивные клеШси экспрессируют медиатор только на определенном отрезке развития, и называем их транзиторными РМЯРамид-ергическими нейронами.

В дальнейшем развитии РМЯРамид-ергическме нейроны выявляются в ганглиях формирующейся ЦНС, их число увеличивается в течение всего эмбрио- и постэмбриогенеза. Следует отметить, что общее увеличение числа нейронов идет за счет начала экспрессии медиатора клетками дополнительно возникающих групп клеток, а не за счет увеличения числа таких нейронов внутри уже сформированных групп.

Рис. 3. Выполненные с помощью рисовального аппарата рисунки РМЯРамид-иммунореаетивности на тотальных препаратов зародышей прудовика стадий Е35 (А) и Е65 (Б). Стрелками указаны транзиторныв нейроны, локализованные вне области закладки ганглиев. После метаморфоза (Е65) выявляются йммунопозитивные клетки в ганглиях формирующейся ЦНС. ЕЮ - буккальный ганглий, Св - церебральный ганглий, Рев - педальный ганглий, ИРав - правый париетальный ганглий, Ув - висцеральный ганглий. Калибровка 0.1 мм.

При изучении распределения РМЯРамид-иммунопозитивных нейронов в ЦНС развивающихся моллюсков нами были обнаружены несколько групп ранее неизвестных клеток, выявляющихся только на стадиях Е65-Р5, и перестающих обнаруживаться на стадии Р6, т.е. при наступлении полового созревания. Одна

из таких грулп расположена в медио-вентральной области каждого церебрального ганглия, рядом с церебральной комиссурой. В каждом ганглии эта группа представлена 3-мя клетками на стадиях Е65-РЗ и 1-2 на стадиях Р4-Р5. Другая аналогичная группа нейронов находится на мадио-дорсальной поверхности каждого педального ганглия. Она состоит из 5 клеток на стадиях Е65-Р1, 7-8 клеток на стадиях Р2-РЗ и 2-3 на стадии Р5. В течение всего времени развития группы этих нейронов легко опознаются благодаря их характерному расположению и большому размеру нейронов. На препаратах взрослых животных (п=7) все другие группы РМИРаммид-ергических клеток продолжают выявляться, распределение иммунопозитивных отростков в глубоких слоях ганглия сохраняется, однако мы не смогли найти описанных нами групп у половозрелых улиток. На основании этого, мы считаем их также экспрессирующими пептид временно, и называем их транзиторными.

Глава 7. ВЛИЯНИЕ ГАЛОПЕРИДОЛА И МЕТИЛЭРГОМЕТРИНА НА ЭМБРИОНАЛЬНУЮ МОТОРИКУ И РАЗВИТИЕ БОЛЬШОГО ПРУДОВИКА.

Во всех сериях экспериментов инкубация моллюсков стадии ЕЮ в галоперидоле была летальной. Эмбрионы достигали стадии развития Е25-Е30, после чего развитие останавливалось, и через 2-3 дня зародыши погибали. При инкубации в метилэргометрине такого эффекта не наблюдалось.

На зародышей более поздних стадий развития (Е20, ЕЗО, Е65) галоперидол и метилэргометрик, блокирующие даа взаимно антагонистических эффекта дофаммина, оказали противоположное действие на моторное поведение развивающегося моллюска. Галоперидол резхо снижал локомоторную активность и нарушал респираторное поведение. Вызванная глиоксилатом люмминесценция нейрональных катехоламинов была значительно менее яркой, а в некоторых случаях (Е20) не проявлялась совсем. Метилэргометрин, напротив, вызывал заметное повышение локомоторной активности и не влиял на респираторное поведение. Все влияния были более выражены при начале инкубации на более ранних стадиях развития.

Проверка на ткани зрелого мозга показала, что при долговременной (хронической) инкубации (более 7 дней) наблюдается существенное снижение уровня нейрональных моноаминов..Существенно, что свечение перестает

наблюдаться только в части популяции катехоламинергических нейронов ЦНС, и не обнаруживается в клетках, которые являются негативными при иммунореакции с антителами к тирозингидроксилазе.

Как видно из представленных результатов, ГТ1 и МЭМ (фармакологические агенты, блокирующие два взаимно антагонистических эффекта ДА) оказали противоположное действие на моторное поведение развивающегося моллюска. ГП резко снижал активность локомоторного аппарата и нарушал респираторное поведение. МЭМ, напротив, вызывал заметное повышение локомоторной активности и не влиял на респираторное поведение. Эти эффекты находятся в хорошем соответствии с теми знаниями о поведенческих функциях дофамина, которые получены на взрослых моллюсках.

ГЛАВА 8. ВЛИЯНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ДОФАМИНА И СЕРОТОНИНА (б-ГИДРОКСИДОФАМИНА И 5,6-ДИГИДРОКСИТРИПТАМИНА) НА РАЗВИТИЕ И ЭМБРИОНАЛЬНУЮ МОТОРИКУ.

Применяли инъекцию внуть яйца токсических аналогов ДА и СЕР - 6-гидроксидофамина (6-ОНДА) и 5,6-дигидрокситриптамина (5,6-ДГТ), из расчета конечной концентрации в яйце 10 мкМ на стадиях ЕЮ, Е35, Е60, Е95.

Инъекция 6-ОНДА моллюскам стадии ЕЮ была летальной. Эмбрионы развивались еще некоторое время, но не проходили метаморфоз и через некоторое время погибали. Во всех других группах смертность была сравнима с контрольной.

Непосредственные (не отставленные) эффекты инъекции токсических аналогов на зародышей всех других групп были выражены слабо или даже не выражены совсем. Во всех инъецированных группах вылупление занимало 1-3 суток и, в общем, имело динамику, характерную для контроля.

Каяедый из токсических аналогов оказал, однако, характерное влияние на моторное поведение в период вылупления. У улиток, обработанных 6-ОНДА, движения тела наблюдались чаще, чем в других группах, тогда как почти не наблюдалось регулярных сокращений буккальной мускулатуры.

В первые двое суток после вылупления улитки, подвергнутые действию токсически?? аналогов, кажутся не отличающимися от контрольных. Отличия, и

весьма резкие, наступают на третьи сутки. У улиток, обработанных 5,6-ДГТ, резко нарушается локомоторное поведение. Моллюсхи теряют способность прикрепляться подошвой к субстрату и по этой причине лежат на боку, совершая движения телом. При помещении таких моллюсков в раствор серотонина (до 1 мМ) способность прикрепляться к субстрату и передвигаться по нему не восстанавливается. Одновременно с нарушениями локомоторного поведения наблюдается уменьшение частоты сердечных биений до около 50 в минуту (у неинъецированного контроля она около 80 биений). Циклы жевательных движений наблюдаются реже, чем в других группах, - только у примерно трети животных. Способность захватывать дыхальцем воздух в легочную полость не нарушена.

Поведение улиток, обработанных 6-ОНДА. представляет в этом возрасте во многом противоположную картину. Улитки быстро прикрепляются к субстрату, проявляют хорошо выраженную способность к локомоции как мышечного, так и ресничного типа. Внешне улитки отличаются укороченной подошвой и обилием вращательных или качательных движений передней половины тела. Ритмическая активность буккальной мусхулатуры наблюдается практически у всех улиток этой группы. Высокой моторной активностью отличается у этих улиток и пищеварительный тракт, который как правило полон зеленым кормом. Несмотря на интенсивное питание, улитки этой группы остают по росту от всех других. Различия меяеду группами по размерам тела сохранялись в течение всего периода наблюдений (две недели).

Глава 9. ИНЪЕКЦИИ РМЯРямида И АНТИТЕЛ К НЕМУ НА РАННИХ СТАДИЯХ ЭМБРИОГЕНЕЗА ПРУДОВИКА.

Ни инъекция антител к РМЯРамиду, ни самого пептида не вызывала видимых изменений в развитии зародышей. Не было отмечено отклонений в возникновении клеток разной медиаторной эргичности (ТГ-ИП, 5НТ-ИП, РМЯР-ИП) или в ходе следования их отростков.

В случае инъекции антител было возможно определить, где находится проинъецированная субстанция через 1-2 суток после инъекции (проведение стандартной иммуноцитохимической процедуры, .но без первичных антител). На таких препаратах помеченными оказались клетки так называемой

зародышевой печени, в норме адсорбирующие и перерабатывающие питательные вещества, содержащиеся в капсулярной жидкости.

Отсутствие выраженного эффекта действия медиатора и антитела к нему не кажется нам странным. Вероятнее всего, при одноразовой инъекции, веществ было просто недостаточно для оказания какого-либо воздействия, т.к. большая их часть захватывалась и перерабатывалась клетками зародышевой печени. Нельзя исключать и того, что в данном случае для процесса развития данный трансмиттер как таковой не является важным. Можно предположить другие механизмы, не связанные с конкретным трансмиттером первых нейронов. Так, могут быть существенны, например, молекулярные свойства поверхности мембраны отростков, как это показано для пионерных нейронов насекомых.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В работе было проведено детальное исследование формирования катехоламинергической, серотонинергической и РМЯРамид-ергической медиаторных систем у ряда представителей пресноводных легочных моллюсков. Динамика увеличения числа нервных клеток всех исследованных медиаторных систем в течение эмбрио- и постэмбриогенеза пресноводных моллюсков представлена на фафиках на Рис. 4.

Обнаружены сходства и отличия в возникновении ранних нервных клеток у представителей лимнеид и планорбид (Рис. 1, 2). И у прудовика, и у катушки самыми первыми в эмбриогенезе обнаруживаются РМИРамид-ергические клетки. Три нейрона расположены.в висцеральном отделе зародыша и посылают свои отростки в ростральном направлении. К моменту развития, когда отростки достигают областей формирования церебрального и педального ганглиев, в соответствующих зонах эктодермы начинается дифференцировка будущих нервных клеток. Морфология отростков ранних РМЯРамид-ергических клеток соответствует расположению образующихся коннектив и комиссур (Рис. 3.). На основании этих наблюдений мы предполагаем, что первые РМЯРамид-ергические клетки и их отростки являются пионерными и маркируют путь последующего развития нервной системы моллюска. Описанные клетки перестают выявлятся после выхода

зародыша из яйца. Поэтому мы считаем экспрессию в них пептида временной, и называем клетки транзиторными.

На стадии раннего велигера у зародышей прудовика выявляется пара катехоламинергических клеток дорсальное и латеральное ротового отверстия, вне области образования центральных ганглиев. Их отростки следуют в теменную область и иннервируют апикальную пластинку - ресничный сенсорный орган зародыша. У всех исследованных представителей катушек подобные клетки отсутствуют. Не обнаруживается также и апикальная пластинка, хотя все другие ресничные образования на поверхности аналогичны ресничным образованиям прудовика. После вылупления, у прудовика, эта пара клеток перестает экспрессировать медиатор, поэтому мы называем их транзиторными катехоламинергмческими клетками.

На стадии перехода от трокофоры к волигеру у зародышей катушки выявляются серотонинергические клетки, локализованные вне области будущих ганглиев, дорсо-латеральнее ротового отверстия. Их отростки проходят в ногу и иннервируют ресничные образования на подошве зародыша, биение которых обеспечивает вращение эмбриона в капсулярной жидкости. После вылупления эта пара клеток также перестает экспрессировать медиатор, поэтому мы называем их транзиторными серотонинергичаскимк клетками.

В процессе эмбрионального развития происходит постепенная замена ресничного вращения в капсулярной жидкости на скользящую ресничную локомоцию по стенке капсулы. Модуляция скорости вращения и способность к другому типу локомоции формируются параллельно с возникновением и развитием системы серотонинергических нейронов. Первые ритмические движения радулы, лежащие в основе пищедобывательного поведения, формируются у зародыша параллельно с появлением катехоламинов а клетках и нейропиле букхальных ганглияхев.

Мы попытались выяснить роль изученных трансмиттерных систем в формировании поведения, применяя специфические для каждого медиатора фармакологические воздействия. Так, лалолеридол и 6-гидроксидофамин (блокатор возбуждающих рецепторов и токсический аналог дофамина) прекращали развитие и оказывали летальное действие при применении на

ранних стадиях эмбриогенеза прудовика, до возникновения первых катехоламинергических клеток. На более продвинутых стадиях развития галоперидол тормозил локомоторную активность зародышей, замедлял развитие. 6-гидроксидофамин вызывал уменьшение размеров зародышей, но не влиял на темпы развития. Хроническое (свыше 7 дней) применение галоперидола приводило к существенному снижению уровня нейрональных аминов в части популяции катехоламинергических клеток зрелого мозга прудовика. Обнаружено, что в отличие от галоперидол-устойчивых, галоперидол-чувствйтельные катехоламинергические клетки не проявляют положительной реакции с антителами к тирозингидроксилазе. Блокатор тормозных рецепторов дофамина - метилэргометрин - не влиял на темпы" эмбрионального развития и уровень нейрональных моноаминов, оказывал стимулирующее действие на локомоцию зародышей прудовика. Токсический аналог серотонина - 5,6-дигидрокситриптамин - не оказывал непосредственных эффектов на эмбриогенез, но вызывал потерю способности прикрепляться к субстрату у на третьи сутки после вылупления. Одноразовые инъекции антител к РМЯРамиду или высоких концентраций самого РМЯРамида на ранних стадиях развития прудовика не приводили к видимым изменениям в развитии катехоламин-, серотонин- и РМЯРамид-ергических нервных клеток или их отростков.

Таким образом, были выявлены корреляции между возникновением в развитии нейрональных систем определенной эргичносги и формированием поведенческих актов, контролируемых у взрослых особей этими нейрональными системами.

Последующее образование клеток трех медиаторных систем в пределах формирующихся ганглиев сходно для всех исследованных нами представителей пульмонат. С той лишь разницей, что ЦНС прудовика и катушек являются зеркальным отражением друг друга. Число нейронов в -ганглиях возрастает в процессе всего эмбрио- и постэмбриогенеза (Рис. 4). Для моноаминергйческих систем характерно увеличение числа групп нейронов в _а05Г?Мбриосене.зе, в то время как для изученной пептидергической системы , -^МЛР^гидц^двойственно прибавление клеток в пределах уже существующих

групп. У ювенильных прудовиков выявлены два группы РМР^амид-ергических транэиторных нейронов в церебральны* и педальных ганглиях, перестающие экслрессировать пептид ко времени полового созревания моллюсков. Возможно, что эти группы каким-то образом включены в процесс формирования попового поведения или половых органов.

Представленные данные свидетельствуют о том. что пресноводные легочные моллюски являются удобной моделью для решения фундаментальных задач нейробиопогии развития. Результаты, полученные на этих модельных беспозвоночных, позволяют обсудить основные принципы возникновения систем нейронов разной медиаторной специфичности и их связь с формирующимся поведением.

Nи.МВЕК ОР *.'£иК<Ж5 Л')

3 -

Е35 ЕЗО

£95 Р1 Р2 РЗ У* Рй Рв

Рис. 4. Динамика увеличения числа нейронов трех медиаторных систем в процессе развития пресноводных легочных моллюсков (на примера большого прудовика). По оси абсцисс - стадии развития, по оси ординат - общее число нейронов во всех ганглиях, N (представлено в виде 1д И). .

ВЫВОДЫ.

1. Для трех медиаторных систем - катехоламинергмческой, серотонинергичесхой и РМЯРамид-ергичесхой - характерно наличие транзиторных нейронов. Все встречающиеся в эмбриогенезе транзиторные нейроны выявляются вне области будущей закладки ганглиев и перестают экслрессировать свойственный им трансмиттер после выхода зародыша из яйца.

2. Первыми в эмбриональном развитии пресноводных легочных моллюсков появляются транзиторные РМИРамид-ергические нейроны. На стадии перехода оттрохофоры к велигеру три таких клетки локализованы в висцеральном отделе зародыша. Имеющиеся наблюдения позволяют предположить, что отростки первых РМ[?Рамид-ергических клеток маркируют

путь последующего развития нервной системы. В ЦНС ювенильных прудовиков • " *

также обнаружены транзиторные РМЯРамид-ергические нейроны, перестающие экспрессировать пептид ко времени полового созревания.

3. Пара катехоламинергических транзиторных нейронов появляется у эмбрионов прудовика на стадии раннего велигера и сохраняется до вылупления. Их отростки иннервируют апикальную пластинку - ресничный орган зародыша. У катушки, не имеющей апикального органа, такие нейроны отсутствуют.

4. Серотонинергические транзиторные нейроны обнаружены у эмбрионов катушки на стадии раннего велигера дорсо-латеральнее ротового отверстия. Их отростки иннервируют временные ресничные образования на поверхности ноги, обеспечивающие вращение эмбриона внутри капсулярной жидкости.

5. Число нейронов всех описанных медиаторных систем возрастает в процессе всего эмбрио- й постэмбриогенеза. Для моноаминергических систем характерно увеличение числа групп нейронов в постэмбриогенезе, в то время как для РКЯНРамид-ергоческой системы свойственно прибавление клеток в пределах уже существующих групп.

в. В процессе эмбрионального развития ресничное вращение в капсулярной жидкости постепенно сменяется скользящей ресничной покомоцией по стенке капсулы. Модуляция скорости ресничного вращения и формирование другого типа локомоции происходит параллельно с в^нэдновением и развитием системы серотонинергических нейронов.

& Ритмические движения радулы, лежащие в основе пищедобывательного поведения, формируются у зародыша параллельно с появлением'катехо'ламинов в клетках и нейропиле буккальных ганглияхев.

8. Применение фармакологических агентов, действующих на дофамин- и серотонинергические системы, подтвердило важность медиаторных

моноэминов для развития моллюсков. В ходе нейрофзрмакологического исследования обнаружен ранее не известный способ действия хронического галоперидола - снижение уровня нейрональных биогенных аминов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1. Воронежская Е.Е. 1990. Нейрональные катехоламины в эмбриогенезе прудовика Lymnaea stagnalis Онтогенез 21. 2: 593-597.

2. Воронежская Е.Е., Павлова Г.А., Сахаров Д.А. 1992. Возможное влияние нейрональных катехоламинов на эмбриогенез моллюска. Онтогенез 23. 3: 295.

3. Воронежская Е.Е., Павлова Г.А., Сахаров Д.А. 1993. Развитие эмбриональной моторики у зародышей прудовика Lymnaea stagnalis. Онтогенез 24. 6: 33-39.

4. Воронежская Е.Е., Павлова Г.А., Сахаров Д.А. 1993. Влияние галоперидола и метилэргометрина на эмбриональную моторику и развитие моллюска Lymnaea stagnalis. Онтогенез 24. 6: 40-47.

5. Voronezhskaya Е.Е., Kabotyansky Е.А. 1991. A comparative study of dopaminergic activation of feeding movements in model gastropods. In: Signal Molecules and Behaviour (ed. by W.Winlovv, O.S.Vinogradova, D.A.Sakharov). Manchester University Press. Manchester: 141-145.

6. Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 1994. Chronic haloperidol: Neural correlates of motor disorders in an invertebrate model. NeuroReport 5. 6: 667-670.

7. Voronezhskaya E.E., Elekes K. 1994. Distribution of serotonin-like immununoreactive neurons in the embryonic nervous systsm of lymnaeid and planorbid snails. Neurobiology (Budapest). 1: 371-383.

8. Voronezhskaya E.E., Elekes K. 1995. Transient and sustained expression of FMRFamide-like immunoreactivity in the developing nervous system of Lymnaea stagnalis (Mollusca, Pulmonata). Cell. Mol. Neurobiol. (in press)

9. Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P., Baker M.W., Elekes K., Croll R.P. 1995. Tyrosine hydroxylase-negative dopaminergic neurons are targets for transmitter-depleting action of haloperido! in the snail brain. Brain Res. (in press).

Тезисы докладов:

1. Voronezhskaya Е.Е., Kabotyansky Е.А. 1989. A comparative study of dopaminergic activation of feeding movements in model gastropods. In: Signal Molecules and Mechanisms of Animal Behaviour (Puschino), p.68.

2. Воронежская E.E. 1990. Параллельное формирование поведенческих актов и контролирующих нейрональных систем в эмбриогенезе большого прудовика Lymnaea stagnafis. Материалы X Всесоюзного совещания по эволюционной физиологии поев. Л.А.Орбели (Ленинград), р. 103.

3. Voronezhskaya Е.Е., Pavlova G.A., Sakharov D.A. 1991. Behavioural consequences of exposure of pond snail embryos to toxic analogs of transmitter monoamines. In: Simpler Nervous Systems (Minsk), p.104.

4. Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 1994. Invertebrate models for studying mechanisms underlying effects of antipsychotic drugs. In: Simple nervous systems (Puschino), p. 40.

5. Voronezhskaya E.E, Elekes K. 1994. Aminergic neurons in the developing nervous system of-gastropods. In: Simple Nervous Systems (Puschino), p. 49.

6. Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P. 1994. A'novel approach to examining background mechanisms of action of antipsychotics. Abstracts of the IVth Symposium on Molluscan Neurobiology (Amsterdam), p. 146.

7. Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E., Nezlin L.P., Elekes K„ Baker M.W., Croll R.P. 1994. Haloperidol-induced monoamine depletion: tyrosine hydroxylase-negative subsets of dopamine neurons are affected in gastropod CNS. Abstracts of 24th Annual Meeting OF Society for Neurosdence (Miami), v 20, p 1772.