Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомологичные нейроны, координирующие защитное и пищевое поведение у разных гастропод

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Гомологичные нейроны, координирующие защитное и пищевое поведение у разных гастропод"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

РГ6 од

1 ДЕК 1998 На правах рукописи

УДК 591.13:594.35:594.38 612.822:612.616-003.725

АЛАНИЯ Магда Анзоровна

Гомологичные нейроны, координирующие защитное и пищевое поведение у разных гастропод

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва, 1998 г.

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Директор - академик РАН Н.Г. Хрущов)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

академик РАЕН, доктор биологических наук Д.А. Сахаров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор В.Я. Бродский

доктор биологических наук И.С. Захаров

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Кафедра психофизиологии Московского Государственного Университета им. Ломоносова.

Защита состоится "/4 " сж'гл <х1у) й 1998г. в _££час. на заседании Диссертационного совета Д 002.85.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (117334 Москва, ул. Вавилова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан " // " 1998 года.

Ученый секретарь Диссертаци кандидат биологических наук

1.В. Волина

введение

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Представления о гомологии и эволюции поведенческих актов родились на основании зоологических наблюдений и были впервые в общей форме поставлены классиками этологии. Из этологии эти представления перешли в нейроэтологию - современную дисциплину, которая с помощью экспериментальных инструментальных методов исследует механизмы поведения на уровне идентифицируемых нейронов и нервных сетей. Настоящая диссертационная работа относится к этому актуальному направлению современных исследований.

Рождение нейроэтологии четко датируется 1967 годом, когда на заднежаберном моллюске тритонии было продемонстрировано, что сложный поведенческий акт может быть запущен стимуляцией одного идентифицируемого нейрона (A.O.D. Willows, 1967, Science, 157: 570-574). Возможность гомологизировать индивидуальные нейроны отдаленно-родственных животных была вскоре после этого обоснована сравнительным изучением заднежаберных и легочных моллюсков (Д.А. Сахаров, 1970, Журн. общ. биол., 31: 449-457; 1970, Annu. Rev. Pharmacol., 10: 335-352; M.S. Berry and V.W. Pentreath, 1976, J. exp. Biol., 65: 361-380). Разработанные подходы впоследствии применялись на других группах беспозвоночных, в частности на аннелидах (К.Т. Keyser and С.М. Lent, 1977, Comp. Biochem. Phisiol., 58A: 285-297) и низших червях (Б.А. Шишов, 1987. Журн. общ. биол., 48: 124-135; B.I. Joffe, 1991, Hydrobiologia, 227: 201-208).

В теоретической биологии приняты критерии гомологии морфологических структур, обоснованные немецким морфологом Ремане; эти же критерии используют при установлении гомологии нервных клеток. Критерий положения придает значение позиции тела, отростков и секреторных терминалей нейрона относительно других идентифицируемых структур. Критерий специального качества учитывает качественные особенности нейронов; в реальной нейробиологической практике наиболее полезными для гомологизации оказываются свойства, имеющие отношение к секреторной (нейротрансмиттерной или нейрогормональной) специфичности нейрона. При этом сходство должно наблюдаться по нескольким разным качественным признакам. Критерий непрерывности подразумевает возможность проследить в непрерывном ряду сравнимых структур, как развивается и появляется наблюдающееся несоответствие позиций или специального качества.

Использование этих критериев дало возможность во многих случаях проследит! ряды гомологичных нервных клеток - от вида к виду, от семейства к семейству и дальше к разным представителям крупных таксонов.

Достоверность ранних нейрональных гомологизаций получила полное подтверждение в современных результатах микрохимического и молекулярного анализа отдельных идентифицируемых нейронов, благодаря чему такой подход к анализу нейронных популяций стал общепризнанным и нашел широкое применение в нейробиологии (О. Breidbach and W. Kutsch, eds., 1995, The Nervous Systems of Invertebrates: An Evolutionary and Comparative Approach. Basel: Birkhauser) Благодаря этому создалась прочная основа для того, чтобы можно было анализировать гомологичные поведенческие акты в понятиях гомологичных нейронов.

Согласно современным представлениям, в основе той или иной поведенческой программы лежит активность центрального генератора (CPG, central pattern .. generator). Некоторые такие генераторы достаточно хорошо описаны. Однако только в единичных случаях удалось пока показать, что у представителей разных таксонов консервативная форма моторного поведения генерируется или управляется гомологичными нервными клетками. Примерами могут служить генераторы стоматогастрических моторных ритмов у разных ракообразных (P.S. Katz, 1991, Seminars Neurosci., 3: 379-389), генераторы, руководящие воздушным дыханием у пресноводных пульмонат - прудовиков и катушек (К. Луковяк, 1992, Онтогенез, 23: 105-117), а также гигантские серотонинергические нейроны церебральных ганглиев, модулирующие пищевую моторику морских, наземных и пресноводных гастропод.

Основу настоящей работы составляет описание ранее не известной консервативной нейрональной системы и выяснение ее регуляторной функции. В качестве отправной точки послужило краткое сообщение Мёрфи (A.D. Murphy, 1990, Brain Reaserch., 525: 300-303), посвященное симметричной паре плевральных нейронов пресноводного легочного моллюска Helisoma (аквариальная катушка). Свои аксонные проекции каждая клетка направляет в ипсилатеральный буккальный ганглий. При ее возбуждении наблюдалось торможение находящегося буккальных ганглиях нейронального генератора ритмических движений радулы. П предположению Мёрфи, эти парные нейроны "идеально подходят для того, чтобы

прекращать питание при подготовке животного к защитному втягиванию" в раковину.

В реальной эволюции животных, наряду с консервацией, имели место и резкие изменения поведенческих актов: радикально менялись способы локомоции, стратегии защитного поведения, и т. д. В настоящей работе сделана попытка экспериментального подхода к этому слабоизученному явлению. Мы рассматриваем здесь возможность участия гомологичных нейронов в механизме координации движений радулы и тела у разных представителей класса Gastropoda (брюхоногие моллюски).

Эта система привлекательна тем, что известны два варианта координации, соответствующие разным пищевым стратегиям. Для постоянно питающихся растительноядных пульмонат (таких, как широко известные прудовик и катушка) характерно подавление пищевого поведения при активации защитного: ритмические движения радулы останавливаются, едва животное получает тактильный, зрительный, вибрационный либо иной сигнал, вызывающий защитную ретракцию тела или его раздраженной части. Обратная иерархия -подавление защитной реакции при пищевом возбуждении наблюдается у хищных гастропод, в частности у пелагического крылоногого моллюска Clione limacina (клион, или морской ангел). Подавление защитного поведения наблюдалось у морского ангела как при возбуждении запахом жертвы (Y.I. Arshavsky et al, 1989, Exp. Brain Res., 78: 387-397), так и при "самопроизвольном" охотничьем поведении, вызванном активацией серотонинергической системы (Д.А. Сахаров и Е.А. Каботянский, 1986, Журн. общ. биол., 47: 234-245). Что происходит с нейрональной основой при изменении пищевой стратегии? Те же самые координирующие нейроны начинают функционировать и взаимодействовать по-новому? Или система координации, присущая растительноядным моллюскам, элиминируется у хищных, и на ее месте появляется новая? Избранная нами модельная система координации моторных актов позволяет не только исследовать нейрональную основу самой координации, но и определить, на чем основана реверсия доминирования.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью экспериментальной части данной работы было выяснить, консервативна ли нейрональная основа координации, то

есть гомологичны ли координирующие нейроны у моллюсков, проявляющих одинаковую и противоположную иерархию защитного и пищевого поведения.

Конкретно, было необходимо найти координирующие интернейроны у разных гастропод и охарактеризовать их, используя методы нейроморфологии, иммуноцитохимии и нейрофизиологии. Особое внимание было уделено наиболее популярному на сегодня среди нейроэтологов легочному моллюску - большому прудовику. Далее, с меньшими деталями были обследованы другие пресноводные легочные улитки (Ри1шопа1а ВазоттаКфЬога), а затем и наземные легочные (Ри1шопа1а 51у1отта1ор1юга). Наконец, бьшо предпринято, по возможности, обстоятельное изучение заднежаберного хищного моллюска - морского ангела СИопе Итаста (Ор1зШоЬгапсЫа Рсегорос1а/

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована нейрональная основа координации защитного и пищевого поведения на восьми видах легочных моллюсков, для которых характерно подавление пищевого поведения защитным, и на одном хищном заднежаберном моллюске - морском ангеле, проявляющем противоположное доминирование. У всех девяти видов найден парный (плевро-буккальный, ПлБ) нейрон, дающий аксональную проекцию из области генерации защитного в область генерации пищевого поведения. Также на всех исследованных видах показано, что специальным признаком ПлБ нейрона является необычный ход его отростка, который всегда делает петлю, заходя в ипсилатеральный педальный ганглий.

Нижеследующие характеристики ПлБ нейронов определены впервые.

Внутриклеточная инъекция красителя выявила существенное сходство строенш ПлБ нейрона у легочного (прудовик) и заднежаберного моллюска (рис. 1). У обоих видов аксоны правой и левой клеток проникают в буккальную комиссуру, создавав возможность контакта между симметричными нейронами. Особенностью ПлБ нейрона морского ангела является проникновение аксонных ветвей в некоторые церебральные нервы.

Иммуноцитохимически показано, что ПлБ нейроны легочных улиток (прудовик, катушка) и морского ангела окрашиваются антителами, реагирующими с нейропептидами семейства РМКРамида. Результаты применения трех дополнительных антисывороток указывают на то, что у прудовика КРамид-подобная иммунореактивность обеспечивается экспресией второго экзона гена

FMRFaMima, и что вероятным продуктом этой экспресии является тетрапептид FMRFaMHfl.

При нейрофизиологическом исследовании ПлБ нейронов прудовика и морского ангела у обоих видов обнаружены: сильная электрическая связь между левой и правой ПлБ клетками, сильное тормозящее действие ПлБ нейрона на буккальный генератор пищевой моторики, а также возбуждение ПлБ нейрона стимулами или командными нейронами, вызывающими защитное поведение. У морского ангела дополнительно наблюдалось обратное влияние протракторного интернейрона пищевой моторики на ПлБ нейрон, имевшее бифазный характер -кратковременное возбуждение, переходящее в торможение.

Полученные результаты позволили впервые заключить, что у разных гастропод - растительноядных и хищных, легочных и заднежаберных - координация пищевого поведения с защитным осуществляется гомологичными КРамид-ергическими проекционными интернейронами, и что торможение пищевой программы при защитном поведении опосредуется ЯРамид-подобным пептидом (или пептидами) ПлБ клеток.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Исследованная модель координации, включающая обратные влияния мишени на координирующий нейрон, открывает возможность изучать в будущем эти важные механизмы на более глубоком - молекулярном уровне. Это позволит продвинуться в понимании того, как подобные пластичные координации осуществляются в мозге человека и высших животных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации докладывались на 8-ом симпозиуме Международного общества нейробиологии беспозвоночных (ISIN) "Neurobiology of Invertebrates" (Тихань, Венгрия, 1995), на молодежных научных конференциях ИБР им. Н.К. Кольцова (1995, 1997), на 5-ой региональной конференции ISIN "Простые нервные системы" (Москва, 1997) и на семинаре нейробиологического отдела Свободного университета (Берлин, Германия, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и тезисы 3 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материала и методов исследования, главы результатов и их обсуждения (4 раздела), заключения, выводов

и списка литературы. Изложена на/ü страницах машинописного текста, иллюстрирована ¿Î. рисунками. Список литературы содержит /54 источника.

объекты и методы исследования ' Объекты исследования. Объектом исследования служили половозрелые особи следующих видов гастропод: Lymnaea stagnalis, Lymnaea auricularia, Planorbarius corneus (Pulmonata Basommatophora), Helix pomatia, Helix lucorum, Fruticicola fruticum, Umax cinereaniger, Succinea putris (Pulmonata Stylommatophora), Clione limacina (Opisthobranchia Pteropoda). Особей большого прудовика L. stagnalis брали из аквариальной культуры, остальных моллюсков собирали в природе: легочных - в окрестностях Кропотовской биостанции ИБР РАН (Московская обл.), Clione - на морской биостанции ЗИН РАН "Мыс Картещ". Центральную нервную систему (ЦНС) изолировали вместе с буккальными ганглиями и до проведения исследования держали в соответствующем для каждого вида солевом физиологическом растворе.

Плевро-буккальный проекционный нейрон мы обозначаем символом ПлБ (Р1В) (M. Alania, 1995, Acta Biol. Hung., 46: 267-270; M. Alania and D.A. Sakharov, 1996, Soc. Neurosci. Abstr., 22, part 2, 554.2), поскольку обозначение Пл1 (Pli), предложенное Мёрфи (A.D. Murphy, 1990), к тому времени уже принадлежало другому парному плевральному нейрону (D.A. Sakharov and J. Salanki, 1969. Acta physiol. hung., 35: 19-30).

Ретроградное окрашивание. Ретроградное окрашивание никель-лизином. При исследовании легочных моллюсков перерезали правый или левый церебро-буккальный коннектив, его проксимальный участок втягивали с помощью шприца в пластиковую трубку, солевой раствор в этой трубке заменяли на раствор никель-лизина, приготовленный по прописи Фридмана (S.M. Fredman, 1987, J. Neurosci. Methods, 20: 181-194), и оставляли препарат на 24 ч при комнатной температуре. При исследовании Clione limacina краситель вводили в перерезанный конец коннектива, изолированный с помощью вазелинового масла, приложением электрического тока, как в работе Панчина и др. (Y.V. Panchin et al., 1995, J. Neurophysiol., 73: 1912-1923). Затем рубеиновой кислотой делали проявку. После диффузии красителя в нерв препарат проявляли и фиксировали, как в работе Фридмана (1987), и окраску интенсифицировали серебрением по Дэвису (N.T.

Davis, 1982, Stain Tech., 57: 239-244). Это позволяло выявлять те центральные нейроны, которые дают аксонадьные проекции в буккальные ганглии.

Ретроградное окрашивание Люцифером желтым. Флуоресцентный краситель Люцифер желтый вводили через тот же коннектив, применяя такую же пропись, как в работе Панчина и др. (Panchin et al., 1995). Этот метод применялся только на Clione limacina.

Ретроградное окрашивание биоштином. Тот же коннектив засасывали в микропипетку, заполненную следующим раствором: 2% биоцитин, 1% DMSO, ЮшМ NaCl, 5mM HEPES, pH 7.5 - и оставляли препарат на 24 ч при комнатной температуре. Последующую обработку препарата стрептавидином, меченным флуоресцеином, делали так же, как в работе Хорикавы и Армстронга (К. Horikawa and W. Armstrong, 1988, J. Neurosci. Methods, 25: 1-11).

Внутриклеточное окрашивание. При использовании методов этой группы краситель вводили в тело нейрона через внутриклеточный микроэлектрод.

Внутриклеточная окраска Люцифером желтым. Люцифер желтый вводили в клетку электрофоретически пропусканием тока по методике, описанной в работе Стюарта (W.W. Stewart, 1978, Cell, 14: 741-759). Препарат фиксировали через 14-1бч после введения красителя.

Внутриклеточная окраска никель-лизином проводилась на Lymnaea stagnalis по прописи Фридмана (Fredman, 1987).

Внутриклеточная окраска биоиитином также проводилась исключительно на Lymnaea stagnalis по прописи Кавагучи и др. (Y. Kawaguchi et al., 1990, J. Neurosci., 10: 3421-3438).

Иммуноцитохимия. Применяли пропись, адаптированную к тотальным препаратам ЦНС, как в работе Сантамы и др. (N. Santama et al., 1993, European J. Neurosci., 5: 1003-1016.). Этим методом исследовали три вида - Lymnaea stagnalis, Planorbarius comeus и Clione limacina.

Двойное мечение. Для двойного мечения сочетали ретроградное окрашивание с иммуноцитохимией. После введения биоцитина отбирали препараты с успешно окрашенными ПлБ нейронами и на этих препаратах проводили иммуноцитохимическую реакцию, используя одну из четырех антисывороток. Это, во-первых, была коммерческая поликлональная кроличья антисыворотка, полученная иммунизацией FMRFaMimoM (Incstar, Minnesota); она малоспецифична

и реагирует с различными пептидами семейства RFaMima. Во-вторых, это были три поликлональные кроличьи антисыворотки, позволяющие дифференцировать между различными ЯРамид-подобными эндогенными нейроактивными пептидами прудовика (см. N. Santama et al., 1996, European J. Neurosci., 8: 968-977), а именно, антисыворотки 1) против пептвда SEEPLY, состоящего из 22 аминокислот, 2) реагирующая с пентапептидами EFLRI-, pQFYRI- и pQFLRIамидом, и 3) против так называемого "acidic" пептида. Все три антисыворотки, полученные в Sussex Centre for Neuroscience, U.K., нам любезно предоставил проф. P.R. Benjamin.

В иммуноцитохимической прописи мы использовали: стрептавидин, меченый флуоресцеином (Dakopatts, Denmark), вторичные антитела, меченые родамином и флуоресцеином (Dakopatts, Denmark). Для контроля специфичности реакции использовали неиммунную сыворотку и антисыворотку к указанным пептидам, преадсорбированную антигеном.

Препараты просматривали и фотографировали под микроскопом Jenaval, уделяя основное внимание нейронам плевральных ганглиев. При использовании метода двойного окрашивания применяли возбуждающие светофильтры для FITC и TRITC.

Элекгрофизиологические опыты. Электрофизиологические исследования проведены на двух видах моллюсков: на прудовике Lymnaea stagnate и морском ангеле Clione limacina. Для проведения электрофизиологических экспериментов животных анастезировали 0,1 М MgCl2, выделяли ЦНС, обрабатывали раствором проназы (1 мг/мл) в течение 5 мин и удаляли соединительнотканные оболочки.

Препарат ЦНС прудовика укрепляли в камере с физиологическим раствором и выдерживали в холодильнике при температуре 5°С в течение нескольких часов до начала микроэлектродных исследований, которые проводили при комнатной температуре.

ЦНС морского ангела помещали в камеру на слой агар-агара. Ганглии фиксировали каплей застывающего агар-агара, как в работе Аршавский и др. (Y. I. Arshavsky et al., 1985, Exp. Brain Res. 58: 255-272). Все эксперименты проводились при температуре 12°-14°С, в качестве физиологического раствора использовали отфильтрованную морскую воду.

Для регистрации электрической активности нейронов использовали стандартную методику внутриклеточных отведений: усилитель, осциллограф,

самописец, стеклянные микроэлектроды, заполненные ЗМ KCl, с диаметром кончика около 1 цм и сопротивлением 20-40 МОм. Вещества вносили в камеру микропипеткой. В ряде экспериментов сигналы из усилителя записывали непосредственно в компьютер через аналого-цифровой преобразователь (DigiLine, Россия).

В 7 опытах на прудовике использовали также редуцированный полуинтактный препарат, который состоял из ЦНС и участка покровов с щупальцем. При этом нервы, идущие от церебральных и педальных ганглиев к сохраненному участку стенки тела, оставались интактными. На таких препаратах смотрели реакцию ПлБ нейрона на механическое раздражение участка кожи стеклянным капилляром, закрепленным в держателе электродов, и на световое воздействие - включение и выключение света.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Lymnaea stagnalis

Учитывая значение Lymnaea stagnalis как важного модельного объекта нейробиологии, нейроны этого моллюска исследовали особенно детально.

Вначале проводили морфологические исследования, чтобы удовлетворить критерий положения.

1.1. Ретроградное окрашивание. Ретроградное окрашивание инфузией никель-лизина церебро-буккального коннектива в сторону окологлоточного комплекса большого прудовика показало, что в каждом из плевральных ганглиев красится один нейрон с таким же ходом отростка, как клетка ПлБ хелисомы. Нейрон расположен недалеко от выхода плевро-педального коннектива, не всегда в поверхостном слое клеток. Диаметр тела клетки приблизительно 25-30 цм. Тело левой клетки более продолговатое чем правой. Кроме главного отростка, входящего в этот коннектив, клетка имеет множество коротких (дендритных?) отростков, отходящих от сомы и не покидающих пределов плеврального ганглия.

За пределами церебральных ганглиев окраска биоцитином выявляла небольшое число нейронов, помимо описанной выше пары плевральных клеток.

1.2. Внутриклеточное окрашивание. Внутриклеточное окрашивание ПлБ нейронов добавило интересные детали к ранее существующим (рис. 1). На некоторых препаратах левого плеврального ганглия у ПлБ нейрона видны еще два

отростока, один из них направляется в сторону плевро-париетального коннектива, а другой входит в церебро-плевральный коннекгив и истончается в нем. В педальном ганглии от аксона отходят короткие отростки, которые ветвятся в нейропиле. В нейропиле церебрального ганглия ближе к церебро-буккальному коннективу ПлБ аксон образует обширную область арборизации, вытянутую в сторону церебральной комиссуры. В ипсилатеральном буккальном ганглии от ПлБ аксона отходят короткие веточки. Далее он проходит в буккальную комиссуру и входит в контралатеральный буккальный ганглий, где опять ветвится, при этом тонкие ветви видны даже в контралатеральном церебро-буккальном коннективе вблизи буккального ганглия. Нужно отметить, что в других буккальных нервах окрашенные элементы не наблюдались.

1.3. Иммуноцитохимические исследования. Удовлетворив критерий положения, мы обратились к специфическому химизму ПлБ интернейронов.

В связи с данными о том, что FMRFauim вызывает торможение генератора буккального ритма у ряда гастропод, в том числе у прудовика (C.R. McCrochan et al., 1989, J. Moll. Stud., 55: 183-192), можно было предположить, что в управлении генератором может участвовать этот нейропептид или какой-то из родственных эндогенных пептидов семейства FMRFaMma. Поэтому вначале мы проводили иммунореакцию с малоспецифичной антисывороткой против FMRFaMHfla, которая реагирует с широким спектром разнообразных RFaMimoB. Известно, что антитела к FMRFaMKfly кроссреактивны к ряду пептидов, которые являются продуктами экспрессии общего с FMRFaMimoM гена в нейронах L. stagnalis (Santama et al, 1993).

Изучение препаратов ЦНС показало, что иммунореакгивность проявлялась во множестве нервных элементов, при этом в плевральном ганглии выявлялись тела нескольких нейронов. В общем, картина соответствовала той, что была описана ранее (L.P.C. Schot and H.H. Boer, 1982, Cell Tisssue Res., 225: 347-354).

В интересующей нас области плеврального ганглия всегда окрашивалась клетка, которая по позиции, размеру и форме соответствовала нейрону, выявляемому с помощью ретроградной и внутриклеточной окраски. Чтобы удостовериться в этом, было использовано двойное мечение. Для этого после ретроградного окрашивания клеток биоцитином через церебро-буккальный коннекгив проводили иммуноцитохимическое исследование с антисывороткой против FMRFaMima.

ПеГ

ПеГ

Рис. 1. Схематическое изображение ПлБ нейрона в центральной нервной системе большого прудовика (А) и морского ангела (Б). Нейрон показан таким, каким он выявляется при введении красителя через внутриклеточный микроэлектрод. На схеме А педальная коммиссура разрезана, педальные ганглии развернутвы.

Ганглии: БГ-буккальные, ЦГ-церебральные, ПеГ-педальные, ПлГ-плевральные, БПаГ-большой париетальный, МПаГ-малый париетальный, ВГ-висцеральный, АГ-абдоминальные.

Двойное мечение подтвердило наличие ЯРамид-подобной иммунореактивности в ПлБ клетках. Одновременно были проверены на КРамидную иммунореактивность все другие нейроны, дающие проекции в церебро-буккальный коннектив. Просматривая препараты при разных фильтрах, мы удостоверились, что из окрашенных биоцитином клеток иммунореактивны только ПлБ нейроны.

Чтобы уточнить, какие конкретно пептиды семейства FMRFaMHaa экспрессируются в клетках ПлБ прудовика, использовались антисыворотки к SEEPLY, к пентапептидам и "acidic" пептиду. Двойное окрашивание показало, что нейроны ПлБ иммунореактивны к антителам против SEEPLY и пентапептидам. В то же время ПлБ клетки не окрашивались антисывороткой к "acidic" пептиду. Это позволяет предположить, что у прудовика в нейронах ПлБ происходит экспрессия второго экзона гена FMRFaMHua, что косвенно указывает на экспрессию в клетках ПлБ самого тетрапептида FMRFaMUfla (N. Santama et al., 1993; 1995, European J. Neurosci., 7: 234-246), физиологическое действие которого и изучалось ранее.

Наши результаты хорошо согласуются с результатами масс-спектроскопического анализа, обнаружившего в церебро-буккальном коннективе прудовика пептидные продукты второго экзона (Р. R. Benjamin, личное сообщение). Наши данные свидетельствуют, далее, о том, что в ЦНС единственным источником этих пептидов являются нейроны ПлБ, так как другие центральные нейроны такого химического типа, по нашим наблюдениям, не дают проекций в коннектив.

1.4. Электрофизиология. Установив, по крайней мере частично, нейротрансмиттерный состав ПлБ интернейронов, мы провели электрофизиологические исследования, целью которых было продемонстрировать тормозное влияние этих нейронов на генератор пищевой моторики, а также показать, что ПлБ нейроны возбуждаются при активации защитного поведения.

Идентификация ПлБ клетки основывалась на морфологии ее аксона. После каждого опыта клетку красили Люцифером желтым. По мере накопления опыта мы научились узнавать клетку и по электрической активности. Она характеризовалась регулярной импульсной активностью с частотой 1-5 Hz.

Для изучения действия ПлБ нейронов на пищевой генератор одновременно внутриклеточно отводились от ПлБ нейронов и ранее идентифицированного буккального мотонейрона 1, который служил монитором активности пищевого

генератора. Его легко идентифицировать из-за больших размеров тела. Он получает возбуждающий приток от интернейронов N1, что вызывает вспышку спайков во время протракторной фазы пищевого ритма. Каждая ПлБ клетка тормозит протракторный мотонейрон 1 как в ипси-, так и контралатеральном буквальном

ганглии.

Обычно аппликация дофамина на изолированные буккальные ганглии запускает продолжительный пищевой моторный ритм с характерными пачечными вспышками активности в буккальных мотонейронах. В наших экспериментах 510"4М дофамин при одновременной гиперполяризации ПлБ нейронов также вызывал генерацию редкого пищевого ритма, который сразу же тормозился при стимуляции плевро-буккальных нейронов. При этом пачки исчезали и наблюдалась только редкая генерация одиночных потенциалов действия. На этом фоне дальнейшая аппликация дофамина была неспособна вызвать пищевой моторный

ритм.

Стимуляция ПлБ нейрона током в +2пА тормозила гигантскую метацеребральную клетку, что выражалось в прекращении генерации потенциалов

действия и в гиперполяризации.

Для того, чтобы показать связь ПлБ нейронов с защитным поведением, часть опытов была проведена на редуцированных полуинтактных препаратах. Отключение света (что у улиток ассоциируется с тенью и, соответственно, опасностью) или механическое раздражение кожи, что обычно вызывает защитное втягивание всего тела в раковину, в ПлБ клетках вызывало сильное возбуждение.

Также мы нашли, что сильное возбуждение ПлБ нейронов вызывается стимуляцией молчащего нейрона с диаметром тела клетки около 40-45 цм, расположенного в левом педальном ганглии около статоциста. Эта педальныя клетка имеет высокий порог генерации спайков. Возможно, она является элементом защитного поведения - одним из ранее описанных в этой области педального ганглия молчащих мотонейронов колумеллярной или дорзальной продольной мыщц (O.P. Ferguson and P.R. Benjamin, 1991, J. exp. Biol., 158: 63-95). Гиперполяризация этого педального нейрона вызывала слабое торможение спонтанной активности в ПлБ клетках, что указывает на возможную электрическую связь между ними (наличие электрической связи не исключает одновременного существования химического контакта). Сильная внутриклеточная стимуляция ПлБ

нейронов не вызывала в педальных клетках никаких видимых изменений. Это может свидетельствовать о наличии выпрямляющих свойств у электрического контакта, однако следует принять во внимание и тот факт, что педальный нейрон почти в два раза крупнее ПлБ клетки, а, как известно, со стороны крупной клетки эффективность электрического контакта выражена сильнее.

Левая и правая ПлБ клетки связаны электрически. Наличие электрического контакта демонстрировали, пропуская через одну из ПлБ клеток импульсы гиперполяризующего или деполяризующего тока. При этом регистрировали такое же по знаку, но меньшее по величине смещение мембранного потенциала в контралатеральном нейроне. Так как эта связь осуществляется в обоих направлениях практически с одиноковой эффективностью, контакт можно считать невыпрямляющим.

1.5. Обсуждение. Плевро-буккальные интернейроны у большого прудовика должны быть гомологичны нейронам, идентифицированным Мёрфи у НеШота. Выполнен критерий положения. Не только тело клетки и ход аксона, который идет непрямым путем в церебральный ганглий, идентичны, но совпадают даже такие датали, как область ветвления в нейропиле церебрального ганглия, наличие короткого отростка в сторону париетального ганглия, характер ветвления в педальном ганглии. Выполнен и критерий специального качества. У обоих видов эти клетки тормозят пищевой ритм. Гомологизация очевидна.

Нам удалось найти не только сходство ПлБ нейронов большого прудовика с ранее описанными клетками у НеШота, но и детально охарактеризовать их.

В морфологических исследованиях мы показали, что аксон ПлБ интернейрона через буккальную комиссуру проходит в конгралатеральный бухкальный ганглий, где ветвится так, что короткие ветви выходят даже в контралатеральный церебро-буккальный коннектив.

Каждая плевральная клетка тормозит протракторный мотонейрон 1 как в ипси-. так и в контралатеральном буккальном ганглии. Принимая во внимание морфологию аксона и множество электрических контактов как внутри буккальных ганглиев, так и между ПлБ нейронами, этот результат не был неожиданным. Кроме этого, у Ьутпаеа ПлБ клетки тормозят и метацеребральные нейроны.

Нами также показано, что ПлБ нейроны возбуждаются во время защитного поведения. В совокупности, полученные электрофизиологические результаты

говорят о том, что ПлБ клетки являются интернейронами, координирующими пищевое и защитное поведение у большого прудовика.

Данные, полученные нами в ходе иммуноцитохимического исследования, дают возможность утверждать, что ПлБ нейроны свое тормозное влияние на буккальные мотонейроны осуществляют с помощью РМЛРамида. Как аппликация этого пептида в опытах Маккрохан с соавторами (1989), так и электрическая стимуляция ПлБ нейронов (в наших экспериментах) дают похожие тормозные эффекты.

Теневой или тактильный стимул вызывает у Ьутппаеа защитное поведение -втягивание всего тела в раковину. Одновременно происходит быстрое прекращение любой другой активности: пищевого поведения, локомоции, респирации. Идентифицированные электрически связанные нейроны ПлБ обеспечивают такое быстрое торможение пищевого ритма. Как было показано, стимуляция любого из них сильно и надолго тормозит протракторные мотонейроны в обоих буккальных ганглиях.

Таким образом, в данном разделе работы показано, что доминирование защитного поведения над пищевым осуществляется торможением генератора пищевой программы с помощью идентифицированных электрически связанных РМИРамид-ергических ПлБ интернейронов.

2. Р1апогЬаг'№ согпеиз

Следующим шагом нашего исследования было выяснить наличие ПлБ нейронов у другого легочного пресноводного моллюска - роговой катушки Т'ЫпогЬапт согпеш.

2.1. Ретроградное окрашивание. Ретроградное окрашивание раствором никель-лизина церебро-буккального коннектива у Р. сотеш показало, что в каждом из плевральных ганглиев красится один нейрон с таким же ходом отростка, как у ПлБ клетки хелисомы и прудовика. Нейрон расположен недалеко от выхода плевро-педального коннектива, но ближе к центру, чем у прудовика, и не всегда в поверхностном слое клеток. Также, по сравнению с Ьутпаеа stagnalis, тело клетки более крупное. Как и у прудовика, главный отросток входит в плевро-педальный коннектив, заходит в педальный ганглий, где делает поворот в сторону церебро-педального коннектива, и заходит в церебральный ганглий через этот коннектив.

2.2. Иммуноцитохимия. Окрашивание антисывороткой к FMRFaMimy ранее проводили на P. corneus итальянские авторы, согласно которым иммунореактнвность проявляло множество нервных элементов (D. Sonetti et al., 1988, Neurobiology of invertebrates. Symposia Biologica Hungarica 36. Akademiai Kiado, Budapest, 309-327). Картина на наших препаратах в основном совпадала с описанной. В интересующей нас области плеврального ганглия всегда окрашивалась клетка, которая по позиции, размеру и форме соответствует нейрону, выявляемому методом ретроградного окрашивания. Чтобы удостовериться в этом, было использовано двойное мечение.

С помощью двойного мечения проверяли экспрессию FMRFaMiwa в клетках, дающих проекции из подглоточного комплекса в церебро-буккальный коннектив. Просматривая препараты при разных фильтрах, мы удостоверились в том, что, как и на большом прудовике, из этих нейронов только клетки ПлБ иммунореактивны к FMRFaMiia-nofloGHbiM пептидам.

2.3. Обсуждение. Таким образом, мы показали наличие ПлБ нейронов у представителя того же семейства, что и Helisoma. При этом надо отметить, что у Planorbarius corneus ПлБ нейроны, как и у большого прудовика, проявили RFaMna-подобную иммунореактивность. Тело клетки также находится в плевральном ганглии, а отросток в церебральный ганглий идет не прямо, а через педальный ганглий. Значит, выполнены критерии положения и специального качества.

Роговая катушка, подобно Lymnaea и Helisoma, является растительноядным моллюском. В отличие от большого прудовика, она предпочитает сухие или немного подшившиеся листья (F. Lombardo et al., 1991, Сотр. Biochem. Physiol., 99A: 627-632), а один из представителей этого семейства Planorbis cotortus даже питается исключительно бактериями (P. Calow and C.R. Fletcher, 1972, Oecologia. Berl., 9: 155-170). Тем не менее, защитное поведение у катушек, как у прудовиков, обычно сопровождается торможением пищевого.

Ритмические движения радулы контролируется у роговой катушки в основном буккальными ганглиями и частично церебральными. Пищевой генератор хорошо описан в понятиях нейрона и синапса и устроен сходным образом с генератором прудовика. Также довольно детально изучена у роговой катушки нейрофизиологическая основа защитного поведения (Y.I. Arshavsky et al., 1994а, b, с. J. Neurophysiol. 71: 882-890). Как само поведение, так и его нейрональные

корреляты во многих отношениях очень схожи с тем, что известно для Lymnaea stagnalis. На этом основании можно с уверенностью предположить, что идентифицированные нами ПлБ нейроны роговой катушки, гомологичные таковым прудовика, должны выполнять ту же функцию - тормозить пищевой генератор во время защитного поведения.

3. Другие пульмонаты

После роговой катушки были проверены другие доступные нам легочные моллюски - как пресноводные, так и наземные.

3.1. Ретроградное окрашивание. Методом ретроградного окрашивания раствором никель-лизина были исследованы следующие виды: Lymnaea auricularia, Helix pomatia, H. lucorum, Fruticicola fruticum, Limax cinereaniger, Succinea putris. У всех этих видов в каждом плевральном ганглии красится один нейрон с таким же ходом отростка, как у клетки ПлБ хелисомы, прудовика и катушки. Нейрон расположен недалеко от выхода плевро-педального коннектива не всегда в поверхостном слое клеток. Кроме главного отростка, входящего в этот коннектив, клетка имеет множество коротких (дендритных?) отростков, отходящих от сомы. У S. putris, как ранее у Helisoma и Lymnaea stagnalis, на некоторых препаратах можно было видеть, что наиболее длинный из этих отростков направляется в сторону париетального ганглия.

Введение никель-лизина через церебро-буккальный коннектив окрашивало также нейроны, находящиеся в ипси- и (в меньшем числе) контралатеральном церебральных ганглиях. Кроме описанной выше пары плевральных клеток за пределами церебральных ганглиев выявлялось небольшое число нейронов. Отметим крупный парный нейрон, тело которого находится в педальном ганглии, а отросток попадает в церебро-буккальный коннектив, пройдя через ипсилатеральный плевральный ганглий. Мы наблюдали такой нейрон в большинстве препаратов наземных легочных моллюсков.

3.2. Обсуждение. Наши результаты показали, что плевро-буккальные проекционные нейроны представлены у широкого разнообразия гастропод. Мы нашли такие нейроны у всех проверенных видов пресноводных и наземных легочных моллюсков. Имеются достаточные основания установить гомологию этих

клеток ПлБ нейронам ранее рассмотренных видов - выполнены критерии положения и непрерывности.

Все исследованные нами ввды по пищевой стратегии существенно не отличаются от большого прудовика и роговой катушки, несмотря на то, что наземные легочные моллюски (отр. 81у1ошта1орЬога) по образу жизни и таксономически отстоят дальше, а один из них (Ь. cinereaniger) даже проявляет смешанный тип питания и частично плотояден.

На основе полученных и существующих данных мы можем предположить, что у всех легочных моллюсков торможение пищевой программы во время защитного поведения на уровне ЦНС в основном контролируется ПлБ нейронами.

Заслуживает специального внимания обнаруженный нами крупный парный нейрон, дающий проекцию из педального ганглия в церебро-буккальный коннектив. Этот пока не исследованный нейрон может также принимать какое-то участие в согласовании функций буквальной и педальной систем.

4. СИопе Нтаста

Следующей задачей нашей работы было выяснить, существуют ли у моллюсков с противоположной иерархией защитного и пищевого поведения гомологичные ПлБ нейроны и, если они существуют, то каковы их функции?

Обратная иерархия - подавление защитной реакции при пищевом возбуждении - наблюдается, как уже отмечалось ранее, у хищных гастропод, в частности у СИопе Нтаста (морской ангел), возбужденного запахом жертвы (АгеЬаУБку е! а1., 1993). Подавление защитного поведения наблюдалось у морского ангела также при охотничьем поведении, вызванном нейротрансмиггерными веществами -серотонином, его метаболическим предшественником, а также антагонистом дофаминовых рецепторов (Сахаров, Каботянский, 1986).

Несмотря на протовоположную иерархию пищевого и защитного поведения по сравнению с изученными пульмонатами в поиске гомологичных нейронов обнадеживал тот факт, что у СИопе РМИРамид также тормозил компоненты пищевого поведения.

4.1. Ретроградов окрашивание. Как и для предыдущих видов, сначала проводили ретроградное окрашивание через церебро-буккальный коннектив никель-лизином и Люцифером желтым. Мы нашли, что в каждом ипсилатеральном плевральном

ганглии красится только один нейрон. Тела этих парных нейронов были расположены около плевро-педального коннектива не всегда в поверхностом слое клеток. Они билатерально симметричны, но форма тел немного разная. Правая клетка более продолговатая, а левая - круглая. Диаметр тела клетки около 25 цм. Как и в случае ПлБ нейронов пульмонат, было четко видно, что главный отросток покидает плевральный ганглий через плевро-педальный коннекгив.

4.2. Внутриклеточное окрашивание. Внутриклеточная окраска Люцифером желтым позволила выяснить детали маршрута и ветвления аксона (Рис. 1). Подобно ПлБ нейрону пульмонат, он входит в ипсилатеральный церебральный ганглий, пройдя перед этим через ипсилатеральный педальный. При прохождении через церебральный ганглий от основного аксона, идущего в церебро-буккальный коннектив, отходит ветвь в первый головной нерв, где она сильно ветвится в нейропиле. Эта область ветвления похожа по структуре и величине на ту, что нами наблюдалась в нейропиле церебральных ганглиев при окрашивании ПлБ клеток у Lymnaea. Войдя в ипсилатеральный буккальный ганглий, аксон направляется в сторону контралатерального буккального ганглия через буккальную комиссуру.

4.3. Иммуиоцитохимкя. Убедившись в морфологическом сходстве плевро-буккальных нейронов Clione с таковыми легочных моллюсков, мы провели иммуноцитохимическое исследование с антисывороткой к FMRFaMnny.

Иммунореакция выявила множество нервных элементов, соответствущих ранее описанным (Р.Т. Norekian and R.A. Satterlie, 1993, Biol. Bull., 185: 248-262). В интересующей нас области плеврального ганглия выявлялась одна клетка, которая по позиции, размеру и форме соответствует нейрону, выявляемому ретроградным и внутриклеточным окрашиванием.

Полученные результаты позволили назвать эти нейроны ПлБ клетками, как у легочных пульмонат. Данные, полученные с помощью электрофизиологических опытов, потвердили нашу правоту.

4.4. Электрофизиология. Так как в плевральных ганглиях только одна клетка дает проекции в церебро-буккальный коннектив, критерием для идентификации ПлБ нейронов служил ход аксона.

У Clione эти клетки имели нерегулярную электрическую активность. В некоторых препаратах они молчали, в других наблюдались нерегулярные спайки.

Чтобы определить влияние ПлБ клеток на буккальный генератор Clione, одновременно отводились от ПлБ клеток, протракторных или ретракторых мотонейронов и интернейронов буккального генератора, которые служили монитором его активности.

Внутриклеточная стимуляция, которая вызывала в ПлБ клетке вспышку спайковой активности, сопровождалась сильной гиперполяризацией ранее идентифицированных протракторных интернейронов (ПИН) (Y.I. Arshavsky et al., 1939, Exp. Brain Res., 78: 387-397). Одновременно гиперполяризовались и другие клетки, работающие в той же фазе как в ипси-, так и в контралатеральном буккальном ганглии.

Нам удалось зарегистрировать обратную связь ПИН1 с плевральной клеткой. Деполяризация этого буккального нейрона, приводящая к мощному разряду в нем самом и к фиктивному охотничьему поведению в других системах, вызывала в ПлБ нейроне короткую вспышку спайковой активности, переходящую в глубокую гиперполяризацию, то есть в торможение.

У Clione, как уже отмечалось ранее, буккальный генератор состоит из протракторных и ретракторных интернейронов, которые в активном состоянии тормозят друг друга. Внутриклеточная стимуляция ретракторного нейрона тормозит протракторный нейрон. Мы нашли, что ПлБ клетка влияет на ретракторный нейрон не так, как на протракторные клетки. В этом случае влияние является двухфазным. Сначала наблюдается короткий возбуждающий приток, который меняется на более длительную гиперполяризацию.

Спонтанный ритм в буккальных ганглиях не наблюдался. Вызванная эзерином спайковая активность буккальных нейронов тормозилась при стимуляции ПлБ клеток.

Внутриклеточная стимуляция ПлБ нейронов вызывала также сильную гиперполяризацию церебрального щупальцевого мотонейрона.

Синхронная регистрация ПлБ клеток и плавательного мотонейрона показала, что спонтанная вспышка спайковой активности ПлБ нейрона происходила одновременно с учащением генерации потенциалов действия в плавательных мотонейронах, что в реальном поведении соответствует ускорению плавания. При этом в буккальных нейронах наблюдалось сильное торможение, не позволяющее расценивать это ускорение плавания как часть охотничьего возбуждения.

При стимуляции ранее идентифицированных СРА1 нейронов, которые вызывают возбуждение плавательных мотонейронов, в ПлБ клетках наблюдался сильный возбуждающий приток. Эти результаты дают возможность предположить, что ПлБ нейроны активируются при реакции активного избегания.

Нами также было показано, что левый и правый ПлБ нейроны клиона связаны электрически. Наличие такой связи демонстрировали пропусканием через любую из ПлБ клеток импульсов гиперполяризующего тока. При этом регистрировали такое же по знаку, но меньшее по величине смещение мембранного потенциала в парном нейроне. Как правило, наблюдалась синхронная генерация спайков в двух клетках, но, при относительно высокой частоте генерации в правой ПлБ клетке, в левой частично наблюдались абортивные спайки.

4.5. Обсуждение. В плевральных ганглиях хищного моллюска Clione limacina впервые найдена и описана пара симметрично расположенных интернейронов, которые мы считаем гомологичными ПлБ нейронам легочных моллюсков. Гомологизация поддерживается критериями положения и специального качества, причем не одного.

Как и у исследованных легочных, у клиона отросток от тела клетки направляется в сторону церебральных ганглиев не прямо, а через педальный ганглий. Сходство усугубляется и тем, что у клиона эти парные нейроны также проявляют иммуннореактивность к FMRFaMmy.

Существенно, что ПлБ нейроны Clione, как у Helisoma и Lymnaea, оказывают гиперполяризующее действие на нейроны буквального генератора. Но тут надо отметить и различия. У Clione нами наблюдалось тормозящее действие ПлБ интернейронов на как протракторные, так и ретракторные мото- и интернейроны (у последних перед торможением наблюдается короткая возбуждающая фаза). В то же время, у Lymnaea stagnalis мы наблюдали торможение только протракторных мотонейронов, но не видели торможения ретракторного мотонейрона В4 (у Helisoma другие нейроны, кроме протракторного мотонейрона, не проверялись). Эта разница в действии ПлБ клеток, возможно, определяется различием в устройстве буккального генератора. Дело в том, что у Helisoma и Lymnaea ретракторные интернейроны возбуждаются протракторными, а у Clione -тормозятся. Поэтому, если бы ПлБ нейроны вызывали у Clione торможение только протракторов, то это привело бы к возбуждению ретракторных интернейронов.

Связь ПлБ нейронов с нейронами СРА1 представляется очень важной, так как ее наличие косвенно указывает на участие ПлБ интернейронов в активном избегании. В этом контексте следует, по-видимому, рассматривать литературные данные, согласно которым иньекция РМ11Рамида вызывает у интактного животного ретракцию ловчих щупалец, то есть прекращение охотничьего поведения. Нельзя, однако, исключить возможное участие РМЛРамида также и в пассивном избегании.

Обратная возбуждающая связь ПИН1 с ПлБ, пока не проверенная у легочных моллюсков, кажется очень интересным фактом и требует дальнейшего исследования. Возможно, во время охотничьего возбуждения короткие вспышки активности ПлБ клеток препятствуют перевозбуждению буккального генератора.

Как и у Ьутпаеа, ПлБ нейроны СИопе связаны электрически. Но наблюдалось различие в деталях. У ангела происходит синхронизация генерации потенциалов действия, а при высокой частоте генерации спайков электрическая связь работает как высокочастотный фильтр. Но тут надо отметить, что опыты на морском ангеле проводились с неразрезанной церебральной и педальной комиссурами, что сделать на прудовике практически невозможно из-за особенностей строения самих ганглиев.

Наличие у СИопе ПлБ нейронов с мощными тормозными эффектами на буккальный генератор вряд ли является просто атавизмом. Естественнее думать, что эти тормозные влияния реализуются в каких-то, пока не известных поведенческих ситуациях, существование которых можно прогнозировать, исходя из полученных данных о физиологии ПлБ интернейронов. Возможно, что у СИопе торможение пищевой моторной программы со стороны защитной зависит, как некоторые изученные регуляторные системы, от сдвигов нейротрансмиттерного баланса, который в свою очередь зависит от предшествующей поведенческой активности, от внутреннего состояния, обучения и т. д. Эти предположения, конечно, требуют дальнейших экспериментальных подтверждений.

Когда на основании сравнительных данных был сделан вывод о существовании у легочных и заднежаберных моллюсков клеток-гомологов (Д.А. Сахаров, 1974, Генеалогия нейронов. М.: Наука), тогда же обсуждались возможные практические применения выводов такого рода. Один из них - новые прогностические возможности. О том же свидетельствуют наши результаты, которые указывают на

го, что у клиона, возможно, существовуют еще не наблюдавшиеся поведенческие гостояния.

заключение

Результаты предпринятого нами сравнительного исследования позволяют думать, что плевро-буккальные проекционные нейроны представлены у широкого разнообразия гастропод. Мы нашли такие нейроны у всех проверенных видов - как у близких, так и у весьма отдаленных родственников. Ближайшее место по родству с Немота - видом, которому было посвящено единственное краткое сообщение Мёрфи - занимает роговая катушка Р. согпем, относящаяся к тому же семейству Ви1ш<1ае. Оба исследованных вида прудовиков - большой и ушастый -представляют семейство Ьутпае1сЗае, близкое к ВиНш(Зае таксономически и по образу жизни. Наземные легочные моллюски (отр. БгуЬттаЮрЬога) в обоих отношениях отстоят значительно дальше, некоторые из них частично плотоядны (I. cinereaniger). Наконец, у хищного морского ангела, С. Итаста, представляющего подкласс Ор15ЛоЬгалсЫа, мало общего с легочными моллюсками. Тем не менее, и у этого морского крылоногого моллюска найден парный нейрон, гомологичный нейрону ПлБ прудовика, катушки и других легочных моллюсков.

Удовлетворение сразу нескольким критериям гомологии дает нам уверенность в том, что гомологизация надежна. Для выполнения критерия непрерывности мы поначалу двигались от вида к виду небольшими шагами, и лишь успех этого движения позволил сделать крупный последный шаг - перейти в другой подкласс гастропод. Критерий положения также выполнен на всем материале сравнения. Не только позиции клеточных тел проявляют замечательную стабильность, но и своеобразный, уникальный ход клеточного отростка: он направляется из плеврального ганглия в церебральный не прямо, а окольным путем, делая заход в илсилатеральный педальный ганглий.

Выполнен и критерий специального качества. В наших электрофизиологических экспериментах на stagna¡ls и С. Итаста, как и в опытах Мёрфи на НеШота, показано тормозное влияние ПлБ клеток на буккальный генератор пищевой моторики. Также и выборочное иммуноцитохимическое исследование на двух близких формах (I. stagmlis, Р. согпеиз) и одной далекой (С. Итаста) позволило наблюдать сходное специальное качество: во всех трех случаях

у нейрона ПлБ обнаружена КРамид-подобная иммунореакгивность. При углубленном исследовании прудовика нам удалось уточнить, что источником этой иммунореактивности являются продукты экспресии второго экзона гена FMRFaMHfla.

В последнее время все больше потверждений получает представление, согласно которому в пределах того или иного компартмента нервной системы (локальной нервной сети) каждый нейротрансмитгер координированно влияет на отдельные элементы сети, благодаря чему отдельные синаптические эффекты складываются в определенное целое (Д.А. Сахаров, 1990, Жур. звол. биохим. физиол., 26: 733-741). По-видимому, компартментализация не препятствует тому, чтобы нейроны, вырабатывающие один и тот же нейротрансмитгер, были объединены общей регуляторной макрофункцией. Это позволяет рассматривать изохимические нейроны как единую регуляторную систему. Интегративные функции некоторых нейротрансмитгерных систем высших млекопитающих хорошо изучены. Данные сравнительной физиологии свидетельствуют о том, что эти функции - результат длительной эволюции нервной системы, и механизм скоординированного влияния нейротрансмиттеров на нейрональный ансамбль сформировался уже у примитивных организмов.

В нашей лаборатории ранее в поведенческих опытах было показано, что в условиях стресса, вызванного болевой (термической) стимуляцией, наземные улитки Cepaea nemoralis проявляют сложное поведение, в котором исходная болевая реакция - сжатие и втягивание в раковину - сильно подавляется при инъекции улиткам антител против FMRFaMima (V.E. Dyakonova et al., 1995, Gen. Pharmac., 26: 773-777). У виноградных улиток командные нейроны защитного поведения проявляют FMRFaMJvmyio иммунореактивность (К. Elekes and D.R. Nassel, 1990, Cell Tissue Res., 262: 177-190; G.A. Cottrell et al., 1992, Biol. Bull., 183: 113-122). У Helix aspersa ретракция щупалец при раздражении осуществляется РМЯРамидными нейронами (G.A. Cottrell et al., 1983, Nature 304: 638-640). Наши данные о том, что торможение пищевого поведения во время защитной программы у большого прудовика осуществляется FMRFaMniHHMH нейронами, согласуются с этими литературными данными и дополняют их. Можно выдвинуть предположение, что ПлБ нейроны являются частью более обширной системы FMRFaMmi-ергических

нейронов, участвующих в реализации особой, РМЯРамид-зависимой защитной гро граммы у моллюсков.

В электрофизиологических экспериментах на двух видах гастропод с разными пищевыми стратегиями: легочного моллюска большого прудовика и заднежаберного хищника морского ангела нами продемонстрировано, что ПлБ клетки возбуждаются при активации защитного поведения. Это возбуждение можно вызвать как адекватной стимуляцией сенсорной периферии, так и возбуждением одного из интернейронов, управляющих защитным поведением. Существенно, что своим возбуждением ПлБ нейроны тормозят нейрональный генератор пищевого поведения. Надежность выполнения ПлБ нейронами этой важной поведенческой функции очевидно обеспечивается тем, что между двумя нейронами пары существует эффективная электрическая связь. Ее существование обнаружено нами как у растительноядного легочного моллюска, так и у хищного заднежаберного.

Функциональное значение электрических синапсов широко обсуждалось ранее (см. М.Б. Беркинблит и Л.М. Чайлахян, 1979, В кн.: Общая физиология нервной системы. Л.: Наука). Электрическая передача обеспечивает более быструю, по сравнению с химической, связь между клетками. В настоящей работе электрическая связь определяет синхронность функционирования ПлБ нейронов и, как следствие, надежность системы. Такая синхронизация особенно важна, когда жизнь животного в опасности.

Таким образом, в результате проведенной работы в плевральных ганглиях у изученных видов идентифицированы гомологичные интернейроны, которые координируют защитное поведение с пищевым. Заметим, что "странный" путь отростка нейрона ПлБ вполне объясним, если принять во внимание, что нейроны, отвественные за запуск защитного поведения, расположены у гастропод в ганглиях подглоточного комплекса (Ferguson and Benjamin, 1991). Каждая клетка ПлБ не только дает короткие (дендритные?) ветви в сторону висцеральной петли, но и проходит на своем пути к генератору пищевого поведения через педальный и церебральный ганглии. Можно думать, что таким способом клетка собирает максимум информации, имеющей отношение к защитным движениям тела, чтобы быстро и надежно доставить эту информацию к буккальному генератору пищевого поведения.

Полученные результаты дают повод думать, что наши априорные представления об иерархических отношениях между защитным и пищевым поведением у морского ангела, возможно, недостаточны. Эти отношения могут не ограничиваться тем, что защитное поведение обязательно подавляется при охотничьем возбуждении хищника. Скорее, они пластичны, изменчивы. Обнаружена нейрональная основа этой пластичности - бифазное обратное влияние буккального интернейрона на ПлБ нейрон.

В связи с этим возникает вопрос: не может ли быть пластичной координация защитного поведения с пищевым также и у прудовика, у других растительноядных улиток? Априорно кажется, что направление иерархии, то есть подавление пищевой моторики при активации защитного поведения, должно у этих моллюсков характеризоваться постоянством. Но никто не проводил сравнения сытых прудовиков с очень голодными. Не исключено, что при таком сравнении могут обнаружиться (как минимум количественные) различия в функционировании координирующей нейронной системы.

ВЫВОДЫ

1. У девяти видов легочных и заднежаберных моллюсков, исследованных методом ретроградного окрашивания, обнаружен идентичный парный нейрон, дающий ипсилатеральную проекцию из плеврального в буккальный ганглий. В ходе дальнейшего исследования проверяли предположение о том, что этот проекционный нейрон, названный плевро-буккальным (ПлБ), координирует защитное и пищевое поведение.

2. Внутриклеточная инъекция красителя показала, что у представителей легочных и заднежаберных моллюсков - прудовика и морского ангела - отростки правого и левого ПлБ нейронов соприкасаются в буккальной комиссуре, создавая тем самым возможность взаимодействия симметричных нейронов.

3. ПлБ нейроны окрашиваются антисывороткой, реагирующей с нейропептидами семейства РМЯРамида. Результаты применения трех дополнительных антисывороток указывают на то, что ЛРамид-подобная иммунореактивность ПлБ нейронов прудовика обеспечивается экспрессией второго экзона гена РМЯРамида, и вероятным продуктом этой экспресии является тетрапептид РМЯРамид.

4. Микроэлектродным методом у прудовика и морского ангела обнаружены сильная электрическая связь между левым и правым ПлБ нейронами, сильное тормозящее действие ПлБ нейронов на буккальный генератор пищевой моторики, а также возбуждение ПлБ нейронов стимулами или командными нейронами, вызывающими защитное поведение. У морского ангела дополнительно наблюдалось обратное влияние протракторного интернейрона пищевой моторики на ПлБ нейрон, имеющее бифазный характер - кратковременное возбуждение, переходящее в торможение.

5. Полученные результаты позволяют заключить, что ПлБ нейроны являются консервативным клеточным элементом, характерным для растительноядных и хищных, легочных и заднежаберных гастропод. При активации защитного поведения эти РМЯРамидергические проекционные интернейроны подавляют пищевую моторную программу. Мы предполагаем, что наблюдаемая у хищных моллюсков реверсия иерархических отношений между двумя моторными программами может частично обеспечиваться обнаруженным нами обратным влияниям буккальных интернейронов на ПлБ клетки.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 93-04-20110 и 96-04-49181).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Alania М. 1995. Pleuro-buccal projections in pulmonate molluscs. Acta Biol. Hungarica. 46 (2-4): 267-270.

2. Alania M. 1996. Pleuro-buccal projections in pulmonate molluscs. In: Neurobiologj of Invertabrates. (eds. J. Salanki et al.). Budapest, Akademiai Kiado. 267-270. (републикация работы 1).

3. Алания M.A., Сахаров Д.А. 1998. Клеточная основа координации движений консервативна у гастропод с разной пищевой стратегией. Жур. общ. биол. 59(4): 000-000.

Тезисы докладов:

1. Alania, М.А. 1995. Homologous pleuro-buccal projections in diverse pulmonate molluscs. Abstracts of presentations at the 8th ISIN Symposium "Neurobiology of Invertebrates", June 27-July 2, Tihany, Hungary.

2. M. Alania and D.A. Sakharov. 1996. FMRF-amidergic pleuro-buccal projecting neurons common to diverse pulmonate molluscs. Soc. Neurosci. Abstr. 22, part 2, 554.2.

3. MA. Alania, Y.V. Panchin, D.A. Sakharov. 1997. Identification and characterization of pleuro-buccal projecting neurons in the carnovorous mollusc Clione limacina (Opistobranchia: Pteropoda). Abstracts of the 5th East Europian Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, September 9-12, Moscow, Russia, p. 1.

Статьи:

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алания, Магда Анзоровна, Москва



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова

Гомологичные нейроны, координирующие защитное и пищевое поведение

у разных гастропод

03.00.13.- физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата.биологических наук

На правах рукописи

УДК 591.13:594.35:594.38 612.822:612.616-003.725

АЛАНИЯ Магда Анзоровна

Научный руководитель:

академик РАЕН, доктор биологических наук

Дмитрий Антонович Сахаров.

Москва, 1998г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................4

ГЛАВА 1. НЕЙРОНАЛЬНАЯ ОСНОВА ПИЩЕВОГО И ЗАЩИТНОГО ПОВЕДЕНИЯ МОДЕЛЬНЫХ ГАСТРОПОД - БОЛЬШОГО ПРУДОВИКА И МОРСКОГО АНГЕЛА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)...................................................8

1.1. Нейроэтология большого прудовика Ьутпаеа stagnalis...............................8

1.1.1. Пищевое поведение................................................................................8

1.1.2. Нейрональная основа .............................................................................8

1.1.3. Защитное поведение.............................................................................10

1.1.4. Нейрональная основа...........................................................................11

1.2. Нейроэтология морского ангела СИопе Нтаста: Пищевое поведение.... 13

1.2.1. Нейрональная основа...........................................................................14

1.2.2. Интернейроны высшего порядка.........................................................16

1.2.3. Координация захвата жертвы и ускорения плавания........................17

1.2.4. Нейротрансмиттерная основа..............................................................18

1.3. Нейроэтология морского ангела СИопе Нтаста. Защитное поведение... 19

1.3.1. Нейрональная основа активного избегания.......................................20

1.3.2. Нейрональная основа пассивного избегания.....................................21

1.3.3. Взаимосвязь между нейронами избегания и другими системами.....22

1.3.4. Другие нейроны.....................................................................................24

1.4. Поведенческая иерархия..............................................................................24

1.5. Заключение...................................................................................................25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА.............................................................28

2.1. Объекты исследования.................................................................................28

2.2. Ретроградное окрашивание.........................................................................28

2.2.1. Ретроградное окрашивание никель-лизином......................................28

2.2.2. Ретроградное окрашивание Люцифером желтым...............................29

2.2.3. Ретроградное окрашивание биоцитином............................................29

2.3. Внутриклеточное окрашивание...................................................................29

2.3.1. Внутриклеточная окраска Люцифером желтым.................................29

2.3.2. Внутриклеточная окраска никель-лизином........................................29

2.3.2. Внутриклеточная окраска биоцитином...............................................29

2.4. Иммуноцитохимия.......................................................................................29

2.5. Двойное мечение..........................................................................................30

2.6. Электрофизиологические опыты................................................................30

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................32

3.1. Ьутпаеа stagnalis...........................................................................................32

3.1.1. Ретроградное окрашивание..................................................................32

3.1.2. Внутриклеточное окрашивание............................................................32

3.1.3. Иммуноцитохимические исследования...............................................33

3.1.4. Электрофизиология...............................................................................34

3.1.5. Обсуждение............................................................................................37

3.2. Р1апогЪагшБ согпеш.......................................................................................40

3.2.1. Ретроградное окрашивание..................................................................40

3.2.2. Иммуноцитохимия................................................................................40

3.2.3. Обсуждение............................................................................................41

3.3. Другие пульмонаты......................................................................................43

3.3.1. Ретроградное окрашивание..................................................................43

3.3.2. Обсуждение............................................................................................44

3.4. СИопе Итаста...............................................................................................46

3.4.1. Ретроградое окрашивание.....................................................................47

3.4.2. Внутриклеточное окрашивание............................................................47

3.4.3. Иммуноцитохимия................................................................................48

3.4.4. Электрофизиология...............................................................................48

3.4.5. Обсуждение............................................................................................51

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................55

ВЫВОДЫ................................................................................................................60

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................62

ИЛЛЮСТРАЦИИ...................................................................................................76

ВВЕДЕНИЕ

Представления о гомологии и эволюции поведенческих актов родились на основании зоологических наблюдений и были впервые в общей форме поставлены классиками этологии. Из этологии эти представления перешли в нейроэтологию - современную дисциплину, которая с помощью экспериментальных инструментальных методов исследует механизмы поведения на уровне идентифицируемых нейронов и нервных сетей. Настоящая диссертационная работа относится к этому актуальному направлению современных исследований.

Рождение нейроэтологии четко датируется 1967 годом, когда на заднежаберном моллюске тритонии было продемонстрировано, что сложный поведенческий акт может быть запущен стимуляцией одного идентифицируемого нейрона (Willows, 1967). Возможность гомологизировать индивидуальные нейроны отдаленно-родственных животных была вскоре после этого обоснована сравнительным изучением заднежаберных и легочных моллюсков (Сахаров, 1970; Berry and Pentreath, 1976; Croll, 1987; Sakharov, 1970). Разработанные подходы впоследствии применялись на других группах беспозвоночных, в частности на аннелидах (Keyser and Lent, 1977) и низших червях (Иоффе и Котикова, 1988; Шишов, 1987; Joffe, 1991).

В теоретической биологии приняты критерии гомологии морфологических структур, обоснованные немецким морфологом Ремане; эти же критерии используют при установлении гомологии нервных клеток. Критерий положения придает значение позиции тела, отростков и секреторных терминалей нейрона относительно других идентифицируемых структур. Критерий специального качества учитывает качественные особенности нейронов; в реальной нейробиологической практике наиболее полезными для гомологизации оказываются свойства, имеющие отношение к секреторной (нейротрансмиттерной или нейрогормональной) специфичности нейрона. При этом сходство должно наблюдаться по нескольким разным качественным признакам. Критерий непрерывности подразумевает возможность проследить в

непрерывном ряду сравнимых структур, как развивается и появляется наблюдающееся несоответствие позиций или специального качества.

Использование этих критериев дало возможность во многих случаях проследить ряды гомологичных нервных клеток - от вида к виду, от семейства к семейству и дальше к разным представителям крупных таксонов.

Достоверность ранних нейрональных гомологизаций (например, Мороз, 1985; Сахаров, 1974; Sakharov, 1976) получила полное подтверждение в современных результатах микрохимического и молекулярного анализа отдельных идентифицируемых нейронов, благодаря чему такой подход к анализу нейронных популяций стал общепризнанным и нашел широкое применение в нейробиологии (О. Breidbach and W. Kutsch, 1995). Благодаря этому создалась прочная основа для того, чтобы можно было анализировать гомологичные поведенческие акты в понятиях гомологичных нейронов.

Согласно современным представлениям, в основе той или иной поведенческой программы лежит активность центрального генератора (CPG, central pattern generator). Некоторые такие генераторы достаточно хорошо описаны. Однако пока только в единичных случаях удавалось показать, что у представителей разных таксонов консервативная форма моторного поведения генерируется или управляется гомологичными нервными клетками. Примерами могут служить генераторы стоматогастрических моторных ритмов у разных ракообразных (Katz, 1991), генераторы, руководящие воздушным дыханием у пресноводных пульмонат - прудовиков (Lymnaeaidae) и катушек (Bulinidae) (Луковяк, 1992), а также гигантские серотонинергические нейроны церебральных ганглиев, модулирующие пищевую моторику морских, наземных и пресноводных гастропод.

В реальной эволюции животных, наряду с консервацией, имели место и резкие изменения поведенческих актов: радикально менялись способы локомоции, стратегии защитного поведения, и т. д. В настоящей работе сделана попытка экспериментального подхода к этому слабоизученному явлению. Мы рассматриваем здесь возможность участия гомологичных нейронов в механизме координации движений радулы и тела у разных представителей класса Gastropoda (брюхоногие моллюски).

Эта система привлекательна тем, что известны два варианта координации, соответствующие разным пищевым стратегиям. Для постоянно питающихся растительноядных пульмонат (таких, как широко известные прудовик и катушка) характерно подавление пищевого поведения при активации защитного: ритмические движения радулы останавливаются, едва животное получает тактильный, зрительный, вибрационный либо иной сигнал, вызывающий защитную ретракцию тела или его раздраженной части. Обратная иерархия -подавление защитной реакции при пищевом возбуждении наблюдается у хищных гастропод, в частности у пелагического крылоногого моллюска СИопе Итаста (клион, или морской ангел). Подавление защитного поведения наблюдалось у морского ангела как при возбуждении запахом жертвы (АгеИаузку е1 а1., 1989а), так и при "самопроизвольном" охотничьем поведении, вызванном активацией серотонинергической системы (Сахаров и Каботянский, 1986). Что происходит с нейрональной основой при изменении пищевой стратегии? Те же самые координирующие нейроны начинают функционировать и взаимодействовать по-новому? Или система координации, присущая растительноядным моллюскам, элиминируется у хищных и на её месте появляется новая? Избранная нами модельная система координации моторных актов позволяет не только исследовать нейрональную основу самой координации, но и определить, на чем основана реверсия доминирования.

Целью нашей работы было выяснить, консервативна ли в этом случае нейрональная основа координации, то есть гомологичны ли координирующие нейроны у моллюсков, проявляющих одинаковую и противоположную иерархию защитного и пищевого поведения.

Работа выполнена в 1993-1998гг. в лаборатории сравнительной физиологии Института биология развития им. Н.К. Кольцова РАН под руководством д.б.н. Д.А. Сахарова. Часть морфологических исследований выполнена на Кропотовской биостанции института (Каширский р-н Московской области). Часть электрофизиологических экспериментов проводились совместно с сотрудиком Института проблем передачи иформации РАН д.б.н. Ю.В. Панчиным на Беломорской биостанции ЗИН РАН "Мыс Картеш".

Основные материалы диссертации докладывались на 8-ом симпозиуме Международного общества нейробиологии беспозвоночных (ISIN) "Neurobiology of Invertebrates" (Тихань, Венгрия, 1995), на молодежных конференциях ИБР им. Н.К. Кольцова (1995, 1997), на 5-ой Восточно-Европейской конференции ISIN "Простые нервные системы" (Москва, 1997) и на семинаре нейробиологического отдела Свободного университета (Берлин, Германия, 1997).

Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Е.Е. Воронежской за методическую помощь и проф. P.R. Benjamin (Sussex University, England) за предоставленные антитела.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 93-04-20110 и 96-04-49181) и гранта INTAS-93-3504.

ГЛАВА 1. НЕЙРОНАЛЬНАЯ ОСНОВА ПИЩЕВОГО И ЗАЩИТНОГО ПОВЕДЕНИЯ МОДЕЛЬНЫХ ГАСТРОПОД - БОЛЬШОГО ПРУДОВИКА И МОРСКОГО АНГЕЛА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Нейроэтология большого прудовика Lymnaea stagnalis

1.1.1. Пищевое поведение

Большой прудовик, как и многие другие представители легочных моллюсков, добывает пищу, соскребывая её с субстрата, при этом движения, как правило, стереотипны и повторяются ритмически. Сначала происходит протракция "тёрки" (радулы), находящейся в глотке (буккальной массе) на хрящевом одонтофоре, обеспечивая касание пищи. Далее производится ретракция радулы, что обеспечивает соскрёбивание пищи. Завершающая фаза -глотание.

1.1.2. Нейрональная основа

Нервным субстратом, ответственным за возникновение этого моторного ритма, служат парные буккальные ганглии (БГ), лежащие на глотке; каждый из них соеденён с окологолоточным нервным кольцом церебро-буккальным коннективом. От БГ отходят нервы, иннервирующие буккальную массу, слюнные железы и пищевод.

Нейроны БГ образуют так называемый генератор центрального ритма (Central Pattern Generator, CPG), способный функционировать при отсутствии афферентных стимулов. Тем не менее, в живом организме активация, прекращение и многие другие параметры функционирования буккального CPG зависят от поступающих в БГ сигналов.

Мотонейроны, управляющие буккальными мыщцами, - достаточно легко идентифицируемые клетки, лежащие на дорзальной стороне БГ. Большинство из них разряжаются в одну из трех фаз движения глотки и одонтофора:

1. протракция радулы;

2. скребок (ретракция);

3. глотание.

Мотонейроны спонтанно не активны; ими управляют три группы интернейронов, называемые N1, N2 и N3, каждая из которых генерирует пачки

спайков в соответствующую фазу. Эти группы дают возбуждающие синаптические входы на мотонейроны, управляющие мыщцами, активными в соответствующую фазу. Группа N1 активирует группу N2, которая ингибирует деятельность N1 и так далее. Ритм может поддерживаться постоянной деполяризацией клеток N1 (Elliot and Benjamin, 1985а). В буквальных и церебральных ганглиях есть также несколько идентифицированных клеток, деятельность которых тесно связана с генерацией пищевой ритмики (в основном инициирующие ритм).

Особенно детально изучена симметричная пара крупных клеток С1, называемых часто гигантскими церебральными (или метацеребральными) клетками. Эти нейроны, идентифицированные у ряда заднежаберных и легочных моллюсков (Yoshida and Kobayashi, 1994), в свое время явились объектом самых ранних работ по клеточной гомологизации (Сахаров, 1970). Они имеют чрезвычайно обширные проекции в буккальных ганглиях и на периферии - в губах и буккальной мускулатуре.

Во многих первоначальных экспериментах тоническая деполяризация гигантской церебральной клетки приводила к появлению ритмической буккальной активности в исходно неактивном препарате (McCrochan and Audesirk, 1987). Позже, была обнаружена способность нейрона С1 замедлять пищевой ритм вплоть до полной его остановки (McCrochan and Kyriakides, 1992). Подавление в таких случаях было неполным, группы интернейронов N1 и N2 молчали, а нейроны группы N3 были тонически активны.

Гигантская церебральная клетка непосредственно возбуждает интернейроны N3 и слабо тормозит интернейроны N1 и N2 (Benjamin et al., 1981). В свою очередь, интернейроны N3 сильно ингибируют интернейроны N1 и N2 (Elliot and Benjamin, 1985а). В следующих работах было показано его возбуждающее действие на части интернейронов N1 и N2, а также на Медленно Осцириющий интернейрон (Slow Oscillator, SO) (Yeoman et al., 1996). Таким образом, метацеребральная клетка изменяет соотношение различных фаз пищевого ритма. Недавно было показано, что у интактного прудовика во время пищевого поведения гигантская метацеребральная клетка работает с определенной частотой (Yeoman et al., 1994). В изолированной центральной

нервной системе активация С1 с такой же частотой обязательна для запуска пищевого ритма с помощью SO (Yeoman et al., 1994).

Было показано, что нейроны С1 серотонинергичны, но их эффект на буккальный ритм полностью не воспроизводился действием растворов серотонина. По-видимому, неоднозначное действие, оказываемое гигантской церебральной клеткой на буккальный ритм, обьясняется различным участием пептидных ко-трансмиттеров (например, миомодулина (Santama et al., 1994), найденных в этих клетках вместе с серотонином.

Другая инициирущая буккальный ритм клетка - Медленно Осцилирующий Интернейрон (SO), была обнаружена у Lymnaea еще в ранних исследованиях (Rose and Benjamin, 198la,b; Elliot and Benjamin, 1985b). Это одиночная, непарная клетка, обнаруживаемая у различных особей либо в левом, либо в правом буккальном ганглии. Аксон SO пересекает буккальную комиссуру и входит в контралатеральный БГ, где поворачивает и возвращается обратно. От основного аксона ответвляется много тонких отростков, которые заканчиваются в нейропиле буккальных ганглиев. Зона ветвления доходит до середины церебро-

буккального коннектива. Возбуждение SO приводит к возникновению ритма в

а-'

молчащих препартах, но возникающий при этом ритм продолжается недолго: через 1-2 минуты он прекращается (McCrochan et al., 1989). Нужно отметить, что этот ритм по частоте совпадает с тем мышечным ритмом, который наблюдается у интактных животных, в отличие от ритма, который инициируется интернейроном N1.

Основным нейротрансмиттером медленно осцилирующего интернейрона является ацетилхолин (Yeoman et al., 1993). С помощью ацетилхолина SO вызы