Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторные функции эндогенной опиоидной системы моллюска

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные функции эндогенной опиоидной системы моллюска"

•i i OK* lb' °

i ^ л;

V П

- - ,, . РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах руКопиЫ

ДЬЯКОНОВА Варвара Евгеньевна

Регуляторные функции эндогенной опиоидной системы моллюска

03. 00. 13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ . диссертации на соискание ученой степпш кандидата биологически* туг

Москва - 1996.

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской.академии наук.

Научный руководитель:

академик РАЕН,

доктор биологических наук Д.А. Сахаров

Оффицианьные оппоненты:

доктор биологичеких наук Б.Н.Манухин кандидат биологических наук ГА Павлове

Ведущее учреждение:

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 25 сентября 1996 года в 11 часов на заседании специализированного совета Д 002.85.01 по защите диссертаций при Институте биологин развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова 26

С диссертацией можно ознак шиться в библиотеке Института биологии разаигйя им. Н.К.Кольцова РАН

Автореферш разослан

И

августа 1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета кгцдвдат биологических наук

Б. 0. Волмна

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последнее время вое больше подтп'.ч зданий получает представление о том, что функции нейротрансмиттеров нр исчерпываются передачей сигналов с одного нейрона на другой в синаитической щели, по в пределах локальной нервной сети каждый трансмиттер коорляь нированно влияет на группу нейронов, заставляя их выполнять опрел^рн ную программу (Сахаров, Жур. эвол. бйохим. физиол.. 1990, 26:733-741;.

Нейроны, вырабатывающие один и тот же нейротрансмиттер, как правило, объединены и общей функцией, что гюзнпляет изучать, иг пг сдпнуп неПротрансмиттерную систему, Интегративные функции некоторых нейрот-рансмиттерных систем высших млекопитающих хорошо изучены. Данные сравнительной физиологии свидетельствуют о том, что эти функции - результат длительной эволюции нервной системы, и механизм скоординированного влияния нейротрансмиттеров на нейрональный ансамбль сформировался уже у примитивных организмов. Понять, как сформировался этот механизм, как возникли и развивались интегративные функции нейротрансмиттеров в эволюции - одна из основных задач современной нейрпбиологии. Лля отпета на эти вопросы необходим большой объем сравнительных иеслолпплннй функций нейротрансмиттеров у животных разных систематических групп

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Настоящая работа посвящена иг/чинш функций эндогенной опиоидной системы у беспозвоночных. В качестве но дельного объекта используются брюхоногие моллюски. Целью экспериментов было ответить на два вопроса: (1) Существует ли тоническая активность эндогенной опиоидной системы и если да, то какова ее роль в рргуляпии поведения: (2) Почему в определенных ситуациях требуется иняктирпния или дополнительная активация эндогенной опиоидной системы.'' ' ,

Лля-ответа на эти вопросы изучат на п впденческом и нл^т"^н'.м уровне эффекты:

а) подавления активности эндогенной опиоидной системы, вызванного оло-кадой опиатных рецепторов или введением антител к эндогенным опиоилам;

б) дополнительной активации опиатных рецепторов, вызванной введением опиатных агонистор или <5ол°вой стимуляцией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе предложены новые методы оценки ппрег.пч ческого состояния улиток. С помощью этих методов, а также метпдпп внутриклеточной регистрации электрической активности нейронов и имну -ногистохимии впервые показано, что эндогенная опиоиднэя система исследованных моллюсков тонически активна и оказывает координированное влияние на разные моторные программы. Чем выше активность опиоидной системы, тем сильнее подавляется пассивно-оборонительное- поведение,' что

■ .1' ; • - 2 -

способствует выявлению пищевых, локомоторных и поисковых программ. Установлено,- что эффекты опйоидов сходны с эффектами серотонина и противоположны эффектам дофамина и FMRFabu^a (FMRFa). Иммуногистохимически в некоторых нейронах найдена колокализация энкефалинов друг с другом, а также с серотонином, FMRFa и ГАМК. Колокалйзации энкефалинов с тиро-зингидроксилазой - ферментом синтеза катехоламинов не была выявлена ни в одном нейроне ЦНС улитки. В электрофизиологических экспериментах найдено, что опиоиды могут влиять на пищевое и локомоторное поведение как прямо, так и опосредованно, через генератор защитного поведения, при этом знак прямого и опосредованного действия совпадает. Высказывается предположение, что основной функцией опиоидной системы моллюска является ' регуляция адекватного уровня защитного поведения. Сравнение полученных результатов с литературными данными по другим группам беспозвоночных свидетельствует о том, что эта функция является, по-видимому, и наиболее древней.

/< ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Практическое значение работы состоит е возможности использования разработанных методов оценки поведенческого состояния животных в медицинских и фармакологических экспериментах по тестированию различных препаратов и для определения экологического состояния среды по поведению животных. Кроме того, выявленный синергизм действия опиоидов и серотонина может быть полезен для медицинских исследований в области терапии наркотической зависимости и анестезиологии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основное материалы диссертации докладывались на молодежной конференции ИБР им. Н.К. Кольцова (1993), на Всероссийской конференции•"Исследовательское поведение животных" в Борке (1993), на международной конференции "Простые нервные системы" в Пущино (1994), на восьмом международном симпозиуме "Invertebrate neurosclence" . Ти~ хань. Венгрия (1995), на конференции по межклеточным взаимодействиям ' ИБР РАН (1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертаций опубликовано 6 статей и тезисы 3 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения. обзора литературы, fvmsu с изложением материала и методов иследо-вания, главы результатов и ик обсуждения (. 6 разделов), заключения, выводов и списка литературы:' . Изложена на страницах машинописвдга текста, иллюстрирована ¿¿J.r рисунками. Список литературы содержит IJc/L источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. ' Опыта проводили на моллюсках Lymnaea stagna-lis аквариальной линии, которых содержали в отстоеннОй водопроводной воде при комнатной температуре; в-некоторых экспериментах' использовали также наземных гастропод Сера:а fiemofalls и Hellx pomatla. ' Поведенческие опыты на Lwtnaça stamalis . у, ' '*■ ■ Использовали улиток с длиной раковины около 1 см и вейом около 1г. подбирая для каждой серии экспериментов однооодных по размеру и весу ' особей. В стандартном эксперименте по изучению действия веществ }ia поведение помещали по 5 улиток в, чйшки Петри, наполненные 50 мл раствора исследуемого вещества. Через 3 часа после рассадки животных в растворы начинали тестирование.

Заттное повёдение. Для характеристики защитного поведения оценивали втянутость тела в раковину, сокращенность щупалец, общую активность, число спонтанных оборонительных реакций и ответ на тактильное раздражение щупальца. Использовали 'следующие показатели: (1) длину передней части тела улитки, выдвинутого из раковины, от переднего Края губ до переднего края раковины; (2) длину щупалец; (3) число активных животных в каждой чашке; (4) число спонтанных втягиваний за 5 мин наблюдения в каждой чашке и (5) характер и распределение ответов на тактильное раздражение щупальца. Измерения проводили каждые .10'. минут в течение 2-х часов. . ч' "

Пищевое поведение. Для характеристики пищевого поведения в каждую чашку помещали предварительно взвешенную прямоугольную пластинку, ры-резаннув. из листа салата, размером 5x6 см. • Через 6-10 часов остаУбк пластинки'осушали фильтровальная бумагой, взвешивали и определяли об--щий вес съеденного. Кроме того, подсчитывали число проеденных в листе отверстий и вычисляли убыль веса, приходящуюся на одно отверстие. '. - . ;

Локомоторное поведение. Оценивали два параметра: общую двигатель- ' ную активность и скорость локомоции. Для определения общей- активности • животных, каждые 10 мин в течении 2-х часов отмечали количество Лвига-ющихся особей в каждом контейнере. Для определения скорости локомоций улиток поочередно переносили в плоский сосуд,' стоящий на миллиметровой бумаге и наполненный чистой отстоенной водой на 2 см так, что вода полностью покрывала животное. Через 1 мин после начала локомоции замеряли количество квадратов (1x1см), пересеченных за 1мин.

Реакция на появление незнакомого объекта. Тестируемую улитку пере- •

носили в большой плоский сосуд, наполненный чистой отстоенной водой на 2 см так. что вода полностью покрывала животное. Учитывали время, проведшее с момента пересадки животного до начала выдвижения тела из раковины (латентный период протракции). Через 1_мин после начала локомо-ции проверяли, какой будет поведенческая реакция на объект.. внезапно возникающий перед улиткой. Таким объектом служил камень размером меньше улитки (диаметром около 1см), который падал на дно в 2 см от головы животного.

Ноиииегтывное поведение Cernea nemoralts. Взрослые улити были собраны в окрестностях города Лунд (Швеция), содержались при комнатной температуре с полным обеспечением едой и питьем. Перед опытами улиток Помещали в закрытый влажный контейнер на -15 минут, улитки насыщались влагой и активировались. В опыте улиток помещали на пластинку для гистологических работ, нагретую до 38 С. Тип и длительность поведенческого ответа улитки оценивали визуально и при помощи секундомера. 10 ul растворов исследуемых веществ инъецировали в колонну улитке. Контрольным животным инъецировали физиологический раствор, а также кроличью сыворотку на физиологическом растворе. Каждую экспериментальную и контрольную улитку тестировали один раз до инъекции и пять раз после с первым интервалом 15 и затем 30 минут.

Элекпюофизиологические опыты. Для проведения электрофизиологических экспериментов центральные ганглии выделяли из анестезированных 0.1 М MgC)2 улиток, в течение 5 минут обрабатывали раствором проназы (1мг/мл), .затем удаляли соединительнотканые оболочки, препарат укрепляли в камере с физиологическим раствором и выдерживали в холодильнике при температуре 8 С в течение нескольких часов. Для регистрации электрической активности нейронов использовали стандартную технику для внутриклеточных отведений: усилитель М-707А, осцилограф 1201В (WPI. США), самописец Н338-4П. стеклянные микроэлектроды, заполненные ЗМ KCl. с диаметром около 1 мкм и сопротивлением 20-40 МОм. Вещества подавали в камеру микропипеткой. удалят! протоком через перистальтический lu.coc со скорость 1.2 мл/шн.

¡имтогистохипш. Ганглии вурезали из анестезированных 0,2 М MgCl улиток: фиксировали в 4% Формальдегиде на 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4 (Pitó) в течение 2 HEicoB при 4 С; отмывали 12 часов в PBS при 4 С: ЭШк-рживали 1 час в 20% сахарозе ; заключали в Tlssue-Tek О.С.Т. и за-М0р!шшзли в жидком азозе. Серийные срезы толщиной 20 иМ получали при nt-M'.-qi задарз^шгвдс!« крит-тата Kelchen-Jung Е 2800 и помещали на

покрытые желатином стекла. После 20-минутного отмывания в PBS с 0.25% тритоном (PBS-TX), препараты инкубировали с первичными антителами, разведенными 1:1000 в PBS-TX с добавлением 0.4% бычьей сыворотки {BSA). в течение 12 .часов при комнатной температуре- отмывали три раза по 15 минут в PBS-TX; инкубировали во вторичных антителах с флуоресцентной меткой, разведенных э PBS-BSA 1:40. в течение 3-х часов. Для двойного окрашивания свободные валентности вторичных антител-блокиро- . вали инкубацией в растворе кроличьей сыворотки на PBS-BSA.'t; ^5; -отш-! вали в PBS три раза по 15 минут; инкубировали в биотинилирова'нных первичных антителах, как и в первом цикле, которые затем визуализировали при помощи комплекса .стрептавиданй-флуоресцеина. Срезы заключали в глицерин на PBS, закрывали покровными стеклами и анализировали под флуоресцентным микроскопом Lelt2 . Aristoplari; • Для контроля заменяй! первичные антитела сывороткой от того, же животного, а также использовали первичные антитела, преадсорбированные соответствующими антигенами. Использовали первичные поликлоналънне антитела к Лей- и Мет-знке-фалину, 5-НТ, ГАМК, FMRFaMHBy, полученные от кроликов; моноклональные антитела к тирозингидроксилазе (ТГ). полученные от мыши (все от Inc-star. Minnesota); вторичные антитела конъюгированные с флуоресцеином; родамином от Dakopatts. Denmark и АМСА от Jackson ImmunoReasearch Labs. Pensylvanla.

Растворы. В поведенческих экспериментах на прудовиках стандартными исследуемыми растворами были 0.1 мМ морфин (morphine sulphate, Sigma ) 0.05 и 0,1 мМ налоксон (naloxone hydrochloride, Sigma). .В .каЧестВе контроля были использованы 0.1 мМ метаболического предшественника се- ' ротонина, 5-гидрокситриптофана (5-НТР, L-5-hydroxytryptophane monohyd-rochlorlde. Calblochem) и отстоенная вода. Растворы готовили на отсто-; енной водопроводной воде. ( , . ; ,\„

В электрофизиологических опытах на Lymnaea и rfellx проверяли дейо-твие налоксона. морфина, DAGO (td-Ala2, N-Me-Phe4. GlyS-olI-Enkepha-^ Un, .Sigma) и хлорида кобальта, конечная концентрация которых в камере составляла соответственно: 0,1 мМ; 0.1 мМ. 0,05 мМ и 0.3 мМ.

В опытах на Сераеа проверяли действие Мет- и Лей-энкефалина. серо-тонина (Sigma), антагониста серотонина метисергида малеата (RBI). антител против Лей и Мет-энкефалина и FMRFamifla (Inestar). Фармакологические агенты готовили на Физиологическом растворе.

Объем экспериментального материала. Результаты получены при анализе поведения 840 особей Lymnaea stagnai is (защитное поведение - 100; -

пищевое - 400; локомоторное - 200; поисковое -140) и 168 особей-Сераеа nemoral is.- а таюке в 88 электрофизиологических опытах на нейронах Lym-паеа (клетки:. СеА - 10; ВЗ и В4 - 32; РеА - 20; PeF - 6; PeD - 5) и Helix (клетки: RPa3 - 3; РеА - 12) и имм уногистохимичеоких экспериментов с использованием 25 особей Сераеа nemoraíls.

Обработка результатов. Результаты опытов анализировались статистически при помощи программы Statlstlka с использованием описательной статистики во всех опытах. Т-теста для независимых значений в опытах на Lymnaea и парного Т-теста в опытах на Сераеа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

i. Эндогенная опиоидная система тонически тормозит пассивно-оборонительное поведение прудовика.

1.1. Влияние опиатного антагониста налоксона на поведенческое состояние прудовика In vivo.

' - У улиток, инкубировавшихся в растворе налоксона. наблюдались следующие .отличия от контроля:

(1) •большая етянушосшь тела в раковину . и сокращенностъ щупалец (длина выдвинутой части тела: в контроле - 4.5 + 0.6 мм, в налоксоне (0,05мМ) - 3,5 + 0.5 мм, в налоксоне (0,1мМ) - 1,5 + 0,5 мм; длина щупалец; в контроле - 3.5 + 0,5- мм, в налоксоне (0,05мМ) - 2,2.±.0.5 мм, в налоксоне (0.1мМ) - 1,5 + 0.4 мм).

(2) большая продолжительность втянутого состояния и меньшая активность (процент неподвижных, втянувшихся в раковину улиток: в контроле - 28 + 6. в налоксоне (0,05мМ) -65+7, в налоксоне (0.1мМ) -78.+ 5). '

(3) большее число спонтанных втягиваний (число втягиваний за 5 минут: в контроле - 1 + 0,4. в налоксоне (0,05мМ) - 5 +.0,8. в налоксоне (0.1MM) -7 + 0,8).

1.2. Влияние налоксона и морфина на ответ улитки, вызванный

■ Моторный' ответ улитки относили к одному из следующих типов в порядке усиления его оборонительного характера: (1) поворот головы в сторону стимула. (2) игнорирование стимула. (3) ретракция щупальца. (4) надвигание раковины на передний конец тела и (5) полное прикрытие тела раковиной. Распределение ответов в контроле: (1) - 6% (2) - 22%: (3) - 36%; (4) - 34SE; (5) - 2%. В растворе налоксона увеличивается доля самых сильных защитных реакций (4) и (5): (1) - 2%; (2) - 2%; (3) -

'¿Z%: (i) 46%, (5) - 28а. В растворе морфина доминирует игнприрпрчп«»

стимула (?): (1) - 8%; (2) - 46%; (3) - 36%; (4) - 10%; (5) (У*. 1.3. Нейрональные корреляты защитного поведения. - ,

СеА: PeF. RPa3 ' У прудовика идентифицированы мотонейроны, учагтвувдае в р>зяли «ими пассивно-оборонительных реакций - втягиваний (Ferguson' and ■Benjamin. J. exp. Biol., 1991. 15R: fi3-il6V • Рн.последовала влияние ыж*жм* пИ-r?r;~"i: па аУ.гйвность jmyx групп котгогсйронов: кластера' А -церебральных ганглиев (СеА), -и нейронов из группы F педальных ганглиев (PeF), отве чающих за натягивание раковины во время пассивно-оборонительного itoBe дения. Кроме того, влияние опиатйых лигандов было проверено на одном из интернейронов защитного поведения - .третьем гигантском нейроне левого париетального ганглия Helix pomatla.

СеА. Ferguson and Benjamin описали. 2 типа активности СеА. Для первого характерно практически полное отсутствие спайковой активности редкие одйня»пп:г Р"0П. кап ирчвлло, не достигающие пер-гя По их дли ним з условиях изолированной ЦНС у таком состоянии находятся ннйр"»«* кластера Л практически во всех препаратах. Второй тип актявносч; встречается м»нр», ч»м в 5? препаратов Для него характерны одиночные, сильны» волны деполяризация (до 40 мВ), выливающие 20-40 ПЛ. В повел« нни ?ти разряды сопровождаются сильным и продолжительным сокращением тела. В 6 из 9 препаратов наяокеон вызывал появление второго типа ак тивности у исходно молчащих нейронов OCIA. Первая вспышка активности могла появляться в довольно широком интервале времени аослс введения налоксона - в одних препаратах практически немедленно, ' р Др'тнх -грез ? 5 минуты При длительном действии нялочеона наблюдалась tow wen лунная депочяризапия, так что приходящая волна EÍ1C11 постепенно вызывала все большое число спайков. ■ 1

PeF. В препарате изолированной ЦНС PeF, как правило, имею? тоническую активность. Налоксон вызывал появления' мойных ояиночтп: леноля ризацкоиных волн, сопровождащнхоя учащением снайковой япгивноти

«Рол КГаЗ относится к одному из 9-ти идентифицированных нейронов в нервной системе Не]Ir, удовлетворяющих критериям командных элементов защитного поведения, вызванного болевой стимуляций (Зчупров, Курн.внеш.нерв.деят., 1992. 42: 1156-1169: Balaban, Acta Neurnbl-ol.Exp., 1979. 39:97-107). В препарате изолированной ЦНС RPa3, как правило, находится в состоянии гиперполяризации и не имеет собственной активности. DAGO снижает ответ RPa3 на электрическую стимуляции. На

импульс деполяризующего тока в 1 пА длительностью 30 сек в контроле клетка генерирует. 7-8 спайков, после аппликации DAGO только два, на фоне 0,05 мМ налоксона эффект DAGO ослабляется приблизительно вдвое.

ОБСУЖДЕНИЕ

. Результаты этой серии экспериментов с использованием антагониста опиатных рецепторов налоксона свидетельствуют о том. что эндогенная опиоидная система моллюска находится в состоянии тонической активности и что тоническая активность опиоидной системы препятствует реализации пассивно-оборонительного поведения.

Блокада опиатных рецепторов вызывала у улиток длительное состояние пассивного избегания. Улитки были сильно втянуты в раковину, • другие Виды активности приторможены. Кроме этого, налоксон вызвал увеличение числа спонтанных защитных реакций и усиление защитных ответов на внешние стимулы.; Самопроизвольное высвобождение пассивно-оборонительных программ, под влиянием налоксона подтвердилось на клеточном уровне. В условиях изолированной нервной системы, в отсутствие сенсорного притока, налоксон вызывал появление залпов активности на мотонейронах, ответственных за резкое.натягивание раковины во время пассивно-оборонительного поведения.

Налоксон вызывает также медленную деполяризацию на самих мотонейронах, что приводит к постепенному усилению ответа на залпы ВПСП. Медленное деполяризующее действие налоксона на СеА может быть одним из механизмов^ -обеспечивающих, усиление защитного ответа на тактильный стимул, наблюдаемое в поведенческих экспериментах при блокаде опиатных рецепторов. -

Влияние'опиатных агонистов на ответ улитки, вызванный тактильным раздражением щупальца, свидетельствует о том. что эндогенная опиоидная система не только тормозит пассивно-оборонительное поведение, но и контролирует чувствительность животного к внешним раздражителям. В по- . веденческих экспериментах морфин вызывал подавление как ориентировочных, . так и защитных ответов на тактильный стимул - увеличивал число игнорирований. Сходное действие DAGO - подавление ответа на электрическую стимуляцию - наблюдали на интернейроне ЬРаЗ виноградной улитки, вовлеченного в регуляцию защитного поведения. Кроме того, известно, что морфин налоксон-зависимо уменьшает амплитуду ацетилхолинового тока на этих нейронах, что свидетельствует -о'наличии модуляторных мегабот-ропных опиатных рецепторов на соматической мембране этих клеток (Пивоваров. Кури. высш. иервн. деят.. 1993, 43: 826-836).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать выводы о том, что ЭОС контролирует.чувствительность улиток к внешним стимулам и определяет порог защитного поведения. ;

2. Эндогенная опиодная система опосредованно "влияет на пищевое повздение Lymnaea stagnalls. ,

2.1. Влияние налоксона. морфина и предшественника серотонина на

ришеро'е поведение L.stagnalis m vivo. " , . '..

Налоксон уменьшал на 40 %. а морфин и 5НТР увеличивали (на 30Х и 45/5 соответственно) количество потребляемой пищи по сравнений с; контролем. Под влиянием морфина и 5НТР' уменьшается число отверстий, но они крупнее, чем в контроле. В налоксоне. напротив, размер отверстий уменьшается, а их число ^Увеличивается.' .-.-"-.

2.2. Иейрональные корреляты пищевого поведения. " \

Генератор жевательного ритма Lymnaea stagnalis.хорошо изучен (Benjamin and Rose, J. ехр. В16Г.. 1979, 80: 93-118). Мы исследовали влияние опиатных лигандов на активность буккадьных мотонейронов 3 и 4 (ВЗ.В4). отвечающих за ретракцию радулы во время жевательного цикла.

Влияние налоксона и азокистпое опиашых реиерторов на собственную и вызванную L-DОРА активность ЕЗ и В4 в препарате изолированной ЦИС.

Собственная активность мотонейронов 3 и 4 группу варьировала в разных препаратах. Как правило, наблюдалось чередование Периодов,пачечной- активности с периодами молчания или тонической активностй.' ~ В тех случаях, когда у нейронов буккального генератора не.было исходного жевательного ритма (9 из И препаратов), мы индуцировали ритм инкубацией ЦНС в растворе предшественника дофамина - L-D0PA (0.05 мМ), - слё-дуя ранее разработанному приему (например, МсСгоЬап et: al.. J. Moll.' Stud., 1989. (55): 183-192). Вызванный ритм в отличие от эндогвннЬго, , был более стабильным и■стереотипным, без-.больших перерывов и модулфу-ющих влияний. V J

налоксон вызывал появление длительных перерывов в пачечной активности. исходной или вызванной L-D0PA, так что интервалы между эпизодами пачечной активности становились длиннее, сами эпизоды короче, а число их, соответственно, больше. Кроме того, под действием налоксона менялся характер пачек: увеличивался порог и уменьшалась высота' спай-ков. Подобное влияние налоксона было найдено в 12 из 14 опытов. При длительном действии, до 30 мин. налоксон мог полностью подавить пачечную и даже тоническую активность клетки.

■ На изолированных буккальных ганглиях не было зарегистрировано изменений в ритмической активности под влиянием налоксона в 3-х из 4-х опытов.

DAGO во всех опытах вызывал активирующий эффект. Е трех препаратах. у которых была исходная пачечная активность, DAGO удлинил периоды пачечной активности и увеличил число и частоту спайков в пачках. В одном препарате, не имеющем исходной пачечной активности. DAGO вызвал появление 4-х минутного эпизода пачечной активности. Налоксон полностью снимал эти эффекты. • 1 ОБСУЖДЕНИЕ

На прудовике подтвердился ранее известный факт, • что морфин и налоксон влияют на количество потребляемой пищи. Согласно нашим результатам. количество съеденной пищи при этом определяется длительностью эпизодов пищевой активности. Об этом свидетельствует и характер повреждений листовых пластинок, и характер активности буккальных мотонейронов. • Улитки, инкубировавшиеся в налоксоне, оставляют на листе большее число более мелких проеденных участков по сравнению с контрольными.. Налоксон разбивает периоды пачечной активности буккальных мотонейронов на более короткие, вызывает появление частых перерывов в жевательном ритме. Действие опиатных агонистов прямо противоположно.

В условиях изоляции буккальных ганглиев от других отделов ЦНС опи-атные лиганды не влияли на генерацию жевательного ритма. Это говорит о том, что действие опиоидов на жевательный генератор скорее всего не прямое и опосредуется через другие отделы ЦНС. Результаты предыдущей серии экспериментов свидетельствовали о том, что уровень активности эндогенной опиоидной системы определяет степень "пугливости" животного, т.е. реактивность его защитного поведения. Известно, что при реализации защитных реакций мгновенно прекращаются другие поведенческие программы, в первую очередь пищевые. Таким образом, частота перерывов в жевательном ритме в том числе отражает и частоту защитных реакций. Непрямое влияние опиоидов на число перерывов в буккальном ритме указывает на то, что эти перерывы скорее всего вызваны нейрональными системами защитного поведения.

3. Эндогенная опиоидная система тонически активирует локомоторные мотонейроны Lymnaea stagnaila. 3.1. iHTP да

Налокоон и налтрекссн уменьшили процент подвижных улиток (на » 45 % соответственно, р < 0.001) и скорость локомопии в 1.7 разя (п <■ 0.001) по ".равнению с контролем. В морфине процент активных улиток был по Р« (р< 0.05) выше, чем в контроле, а скорость локомпшс логт'-еори» hi отличалась от контроля. У улиток, инкубированных в морфии«?, наГ-т-дались частые повороты, отрьч ноги от субстрата, понс'ковка движения и

nnwrn.ii>qui*a кЦ" j'U pt.tot.io а n \гоо TTTitioiiTio tit»n по oymipTJirv

них.(на УЯ) и скорости локомоции в 1.3 раза (р < 0,05). Смесь налоксо на и 5НТР не влияла на локомоцию. ' '

3.2.Нейрональные корреляты локомоторного поведения РеА. PeF." PeD,

Все мотонейроны, управляющие локомоциеЯ Lymnaea, расположены в педальных ганглиях улитки. Мотонейронами ресничной локомоции являются серотониновые'клетки группы А.(РеА). Эти нейроны дают проекции в ресничный эпителий ноги и являются последним эфферентным звеном локомоторного генератора. Нейроны группы F птрр.чапт ая г.лкряшрнир ипппуив-г>чу.ной мускулатурн и «атягивани* радивины. а грушь D w. оог.ра'деикя ноги при наземной локомоции iWinlew nntJ Haydon. Сотр. Bloehem. Physiol., ;QR6, оЗА: 13-21;

ГоА нейроны в норме ползают возбуждающий синаптичзскиЯ приток и ТОНИЧЕСКИ активны ( ЗЯ +1 Г> СПЯЯКОВ В минуту). Изоляция педальных гонг • лиев <>т других отделов ЦНС приводила к снижению ишаптического притока и урсжению спайковоП активности ло 25_»5 онайков в минуту. О 3 И СоС1^ вызывал деполяризацию, которая сопровождалась учащением гтйкор; вслол за тем активность переходила на пачечный режим, 'вызванный появлением »lonjioiiii^jv роли мембранного пстгн^ттала* пта П"т.ггт*агттт "!-го

нпдаоь на генерацию платорнх потенциалов.

Налоксон вызывал постепеннее урежение спайковой активности в 14 из: 16 опытов на изолированной нервной системе, в трех из них полностью; подавил активность. В 11 препаратах под влиянием налоксона 'изменялась Форт ПЛ. а икрпио умпньаиллгь спеловпч ! ии^рполя^и.-«'»:^. ЛеГютвио налоксона становилось заметным через 5 мин и прололтию уг иливэться в течение 30-45 мин. Поляризующие эффекты были выражены слабо и не носили однонаправленного характера. На изолированных пелядьчых ганглиях (4 опыта) налоксон оказывал такое дейотвип. т.1?. урежзл актишюсть, при этом эффект развивался быстрее, чем на целой ЦНС. На фоне 0.3 М хлористого кобальта снижение частоты спайковой активности после добавления налоксона наблюдалось только в 2 из 10 опытен, в 8 изменения не было.

■ Морфин или DAGO вызывали учащение спаЯковой активности РеА нейронов. в среднем до 66+10 спайков в минуту в 9 из 14 опытов на изолированной нервной системе . Обычно эффект развивался медленно, достигая , максимума к 15-20 минутам. В 4 случаях эффект носил даухфазный харак-' тер: после активации наблюдались гиперполяризация и урекение. активности ниже исходного уровня. В 3 из 4 опытов на изолированных педальных ганглиях эффекты морфина были сходны с его эффектами в интактной ЦНС: наблюдалось увеличение частоты до 37+9 спайков в минуту при исходном уровне 25 спайков в минуту. В одном эксперименте морфин вызвал подавление тонической активности и запустил ритмичные пачки эндогенной природы. На фоне 0,3 М кобальта увеличение частоты при действии DAGO и ■■ морфина не наблюдалось.

- На гомологичной группе клеток виноградной улитки DAGO вызывало появление периодических, но не ритмичных залпов ВПСП, которые могли сопровождаться и спайковой активностью.. Действие агочиста полностью снималось налоксоном.

" .. . Peö u PeF. Нейроны D и F групп в препарате изолированной ЦНС проявляют тоническую активность и ритмичную пачечную активность, которая наблюдается и в полуинтактном препарате во время наземной локомоции (Wlnlow and Haydon, 1986). Аппликация налоксона на фоне тонической активности меток при длительном действии (до 30 минут) вызывала неболь- . . шое урежение. У нейронов группы F на этом фоне появлялись резкие и длительные залпы учащенной активности. Аппликация налоксона на фоне рпшическор активности вызывала подавление ритма. У нейронов группы D появлялись к-тому же вызванные волны гиперполяризации.

ОБСУЖДЕНИЕ

. Результаты экспериментов снова подтверждают'существование постоянной тонической секреции эндогенных опиоидов и свидетельствуют о том, , что определенная степень занятости опиатных рецепторов эндогенными ' агонистами необходима для нормального локомоторного поведения. В ■ электрофизиологических экспериментах налоксон оказывал тормозящее действие на серотонинэргические локомоторные'(РеА) нейроны не только в изолированной ЦНС. но' и в изолированных педальных ганглиях. Очевидно, что ответственные за регуляцию локомоторного поведения источники тонической секреции опиоидов,. .а также их мишени находятся в самих педальных ганглиях.

Этим выводам не противоречат результаты применения агонистов опиатных рецепторов и предшественника серотонина. Агонисты опиатных ре-

депторов, морфин и DAGO, увеличивали частоту разрядов нейронов РеА, ,а метаболический предшественник серотонина, 5НТР, снимал тормозные эффекты опиатных антагонистов на скорость локомоции и общую двигательную активность улиток.

Мы также нашли,• что опиатные лиганды неэффективны в условиях подавления синаптической передачи кобальтом (8 из 10 экспериментов). По-видимому, их действие на РеА нейроны опосредуется через изменения в синаптическом притоке. Вызыванный характер активности особенно четко наблюдался на гомологичных нейронах виноградной улитки. Однако неисследованной осталась возможность дополнительной прямой стимуляции эндогенными опиоидами ресничных клеток локомоторного эпителия.

4. Налоксон подавляет исследовательское поведение и интерес прудовика к новому объекту

Предыдущие эксперименты показали, что блокада опиатных рецепторов приводит к активации пассивно-оборонительного поведения и скоординированному подавлению пищевого и локомоторного. Эти результаты позволяли предполагать, что эндогенная опиоидная система может прямо или опосредованно влиять практически на все формы поведения, меняя поведенческое состояние моллюска в целом. Нам показалось интересным с этих позиций проанализировать реакцию животного на новый стимул. Если такой стимул сам по себе достаточно нейтрален, то ответы на его предъявление могут быть различны: испуг, интерес, игнорирование, а выбор ответа монет в значительной степени зависеть от поведенческого состояния улитки.

Для этой задачи был разработан метод, который позволял анализировать ответы улитки на неожиданное появление перед ней нейтрального' объекта - небольшого камушка (см Материалы и методы).

. Поведение улиток при переносе в новое место и ответ на внезапное появление нового объекта.

Влияние налоксона, предшественника серотонина и голода

Во время переноса улитки втягиваются в раковину и затем, после помещения их на дно нового контейнера остаются внутри ракивинн в течении некоторого времени, которое было обозначено как латентный период прот-ракции. После этого они начинают вытягиваться из раковины, сначала появляются губы и щупальца, затем i олива и остальная часть ниш. Лагент ный период протракции различался у животных, инкубированных в разных растворах: .

контроль (вода) - 15i6 сек ;

.' 'налоксон - 36+7 сек ' 5НТР - 7+4 сек

Через минуту с момента начала локомоции перед улиткой на растоянии Z см опускался в воду камушек диаметром около 1 см. В поведенческом ответе улитки на падающий перед ней камень естественно различаются две фазы, которые удобно называть непосредственным ответом и отставленным ответом.

Непосредственный ответ, если он проявляется животным, всегда носит защитный характер. Репертуар таких ответов в порядке усиления защитной реакции: (1) игнорирование стимула, (2) ретракция одного или обоих щупалец. (3) надвигание раковины на передний конец тела и (4) полное прикрытие тела раковиной. В контроле непосредственные ответы распределились следующим образом: (1) - 17%; (2) - 14%; (3) - 42%; (4) - 27%. У голодных улиток и улиток, обработанных налоксоном, наблюдалось смещение в сторону сильных защитных реакций по сравнению с контролем: (1)

- 10%; (2) -15%; (3) - 25%; (4) - 50% и (1) - 9%; (2) - 14%; (3) -29%; (4) - 48% соответственно.

• Отставленным ответом мы назвали моторное поведение, которое начинало развиваться по прошествии непосредственного ответа. Репертуар отставленных ответов включал следующие пять вариантов: (1) сохранение остановки локомоции в течение 5 мин наблюдения; (2) разворот улитки более чем на 90"и уход от камня; (3) поворот менее чем на 90*и движение мимо камня; (4) соприкосновения с камнем, не переходящее в напол-зание на него; (5) соприкосновения с камнем, переходящее в наползание на него (рис. 4). Ответ 5 всегда сопровождайся скребущими движениями радулы по камню, что в отсутствие пищи рассматривается как проявление пищепоискового поведения. Таким образом, спектр ответов демонстрирует ■последовательное ослабление защитной компоненты поведения и появление исследовательской.

В контроле отставленные ответы распределились следующим образом: (1) - 2,5%; (2) - 13%; (3) - 11,5%; (4) - 24%; (5) - 49%. Налоксон увеличил долю реакций замирания и ухода qt камня: (1) - 15%; (2) -24%; (3) - 10%; (4) - 15%; (5) - 36%. Голод и 5НТР увеличивают число исследовательских реакций: (1) - 0%; (2) - 5%; (3) - 5%; (4) - 5%; (5)

- 85% и (1) - 0%; (2) - 5%; (3) - 5%; (4) - 5%; (5) - 85% соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты опытов с помещением моллюска в новую среду и внезапным

предъявлением ему нового объекта хорошо согласуются с представлением и том, что активность эндогенной опиоидной системы определяет степень пугливости животного. Под влиянием налоксона у улиток в новой среде значительно увеличивается латентный период активности в новой среде, а спектр ответов на предъявление нового объекта сдвигается, в сторону испуга и избегания.

Влияние предшественника серотонина на отношение к новому объекту ■ также согласуется с его влиянием на поведенческое состояние в целом Рзне? для широкого круга беспозвоночных Сило установлено, чго уровень серотонина повышается у голодных животных, а сам серотонин вызывает подобие feeding arousal, когда животное ведет себя, как при пищевой мотивации (Сахаров, Жур. общ. биол. 1990. 51:437-4-19). Состояние feeding arousal включает поиск пищи. В наших экспериментах у голодных улиток наблюдался повышенный интерес к новому объекту, что можно рассматривать как проявление поискового поведения. Точно так же действовало на сытых улиток повышение синтеза серотонина.

Наши опыты однозначно свидетельствуют с ток, что. усиливая или ои-Jbi'-wji ленотвне определенного медиатора, т е. меняя медиаторный баланс ь ' линий нейрохимической системе, можно направленно влиять на отношс-:!;:. '::нгч :пого к внезапному предъявлению неизвестного объекта В частно. г», повышая уровень тонической фоновой секреции серотонина с по-N••¿1'. сю Метаболического предшественника, ми сдвигали поведенческий 14s -ц. в - 1чрону интереса к новому стимулу, а снижая степень активации ■ ¡..¡а.ния клеточных рецепторов, «4м> стимулировали реакцию избегания.

5. Дополнительная активация эндогенной опиоидной

гистеш необходима для избегания болевой ситуации.

•¡л л п-i'o, чго1ы сIветя!ь на вопрос, какова может быть (..•Л1 ДсПил nrticJibrtuH активации андогеннои опиоидной системы при стрессе, мы изучали поведение улиток с разным уровнем активации опиатных рецепторов

при помещении улитки на нагретую поверхность. Для манипулирования уг-ггем "гпопдог, в UHC г<г:сдп!;и леи- и ме гонке:),лдшш (Лбжс и М.Чнк), и ¡¡.¡и;-.;.! ¡¡р.'.ив ■ г..:,;.,нксфалш<:ое {(ром*- того, было щ.ончргни учаете серотонина и антагонистичного опиоидам пептила - FHRFa.

ibt fi>;,u- {/.'itiKK'' >-. .."iLperu'Dfiiu с||!р,оо1(1Ш Неведение улшья на Harpe •; ,л човерхч'Ч ¡к зги'i!,и; из двух 1:аз. калсдая lu катерах шль'шг сернь последовательных движений. Первая фаза - ретракция (втягивание в раковину), вторая - протракция и поисковое поведение. В контроле1 полная

- le -

ретракция всего тела наблюдалась у 50% улиток, длительность этой фазы составляла 12-15 сек. Поисковое поведение включает поднятие ноги над поверхностью, повороты и ощупывания поверхности щупальцами. Для количественной оценки поискового поведения регистрировалось число поворотов, за 20 секунд с момента начала поисковых движений (3 поворота за 20 сек в контроле).

Влияние ЛЭнк и МЭкк. Введение энкефалинов вызывало депрессию первой фазы поведения - ретракции. ЭнкефалиНы уменьшали число улиток, демонстрирующих полное втягивание в раковину, на ЗОЖ по сравнению с контролем и увеличивали число животных со слабыми (втягиваение щупалец) и Нулевыми ноцицептивными реакциями. Кроме того, они снижали длительность сжатия - время, которое улитки проводят внутри раковины, в 1.7 раза. Эти эффекты достигали максимума через 30-45 минут после инъекций и возвращались к контрольному уровню через 1,5 часа.

Вторая фаза поведения была значительно активирована у улиток, обработанных энкефалинами, по сравнению с контрольной группой, инъецированной физиологическим раствором. Эта фаза начиналась раньше и включала большее число поисковых движений у улиток, обработанных энкефалинами. Максимума эффект достигал через 45 минут (превышение над контрольным уровнем в 1,8 раз).

,. Влияние антсыворотки против ЛЭнк и МЭнх. Введение антител вызвало противоположный энкефалинам эффект, а именно - увеличение числа улиток, демонстрировавших полное втягивание, на 4035, увеличение длительности сжатого состояния в 1,75 раза и уменьшение числа поисковых движений в 2 раза. Таким образом, была активирована первая фаза (ретракции) и подавлена вторая, включающая поисковое поведение.

Влияние антисыворотки против FMRFa на защитное поведение было . ■сходно с эффектами энкефалинов. Инъекция антител против FMRFa вызвала депрессию первой фазы (уменьшение интенсивности и длительности ретракции) и активацию второй (увеличение числа поисковых движений).

• Влияние серотонина на первую фазу поведения - ретракцию было не единообразным: интенсивность ретракции была выше в группе инъецированных серотонином улиток на ЗОЯ. однако длительность сжатого состояния короче (в 1,7 раза), чем в конторольной группе. Вторая фаза - поисковое поведение было активировано серотонином: поисковые движения начинались раньше и иг число за 20 секунд было в 2,2 раза выше, чем в контроле. Эти максимальные эффекты наблюдали через 45-75 минут после инъекции.

Влияние антагонист серотонина, метсервийа было противоположным действию серотонина и знкефалинов на длительность сжатого состояния. Метисергид не вызвал изменений в числе поисковых поворотов, однако в условиях одновременного предъявления с энкефалинами, дозо-зависимо снимал- их активирующее влияние.

ОБСУЖДЕНИЕ ' .

Наши наблюдения показали, что в условиях стресса, вызванного болевой (термической) стимуляцией, улитки проявляют сложное поведение, в котором исходная болевая реакция - сжатие и втягивание в раковину,-', сменяется поисковым поведением, целью которого очевидно является поиск правильного направления для последующего избегания опасной ситуации-Результаты наших опытов свидетельствуйте том. что энкефалины и П>1№а участвуют и действуют как антагонисты в нейрональном контроле ноцицец-' тивного поведения. Конкретно, РМИРа активирует первую фазу поведения, (ноцицептивную реакцию и пассивное избегание) и подавляет вторую - активное избегание: энкефалины, напротив, вызывают депрессию первой фазы и активацию второй. Сходство эффектов знкефалинов и антител против П-ШРа свидетельствует о том, что при этом характер поведения определяется балансом между двумя антагонистичны' I нейропептидами.

Наши опиты впервые показали участие серотонина в регуляции избега-тельного поведения улитки на нагретой поверхности. Эффекты антагониста серотонина, метисергида, свидетельствуют о том, что действие знкефалинов на поисковое поведение и активное избегание в значительной степени зависят от активности серотонинэргической системы и, вероятно, опосредуется через активацию серотонинэргических нейронов.

Возвращаясь к поставленному вопросу о функциональной роли актива-; ции опииьдной системы во время болевого стресса, можно оказать, что активация эндогенной оииоидной системы, по-видимому, необходима 'для перехода от пассивного избегания, вызванного болью, к активному избеганию и поиску. Наши опыты показали, что вторая фаза поведения - активное избегание является огшоид-зависимой. Однако, остается неясным сами ли ипиоиды активируют эту вторую фазу или их участие необходимо только для того, чтобы вызвать аналгезию и подавить болевые реакции, мешающие поисковому поведению. В пользу первой гипотезы свидетельствует ю, что введение опиатных агонистов интактным улиткам само по себе,, в отсутствие болевой ситуации, высвобождает движения, сходные с теми, что наблюдаются на нагретой поверхности, т.е. поднятия нога, повороты, вытягивания и ощупывание поверхности (см. 3,1.). Б пользу этого пред-

положения свидетельствуют и работы, появившиеся за последние два года, на млекопитающих по взаимодействию опиоидной системы и серотонинэрги-ческих нейронов ядер шва в опосредовании гиперкинезий, вызванных болью (Alois!/ Med.Sei.Res.,1992, 20:25-26; Tao and Auerbach. Neurosclence, 1995, 68:553-561).

6. Анатомическая основа взаимодействия энкефалинов с другими нейротрансмиттерамк в нервной системе улитки.

В предыдущих поведенческих и нейрофизиологических экспериментах На моллюсках получены данные, указывающие на возможное совместное участие и взаимодействие энкефалинов с серотонином. дофамином (ДА), и П®Рамидом в регуляции ряда поведенческих программ. Морфологическая основа этих взаимодействий ранее не была изучена. Используя двойную иммуногистохимическую метку, мы изучали взаимное распределение знкефа-лин-иммунореактивных нейронов и нейронов, меченых антителами к FMRFa-миду. серотонину. гамма-аминомасляной кислоте (ГАМК) и тирозингидрок-силазе (ТГ) в нервной системе наземной улитки Cepaeä nemoralis.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показано, что в отдельных нейронах иммет место колокализация Л- и МЭнк друг с другом, а также с FMRFa, серотонином и ГАМК. Колокализации энкефалинов с ТГ выявлено не было.

Л- и МЭнк. В процерубруме среди морфологически сходных нейронов, лежащих вдоль латеральной границы, выявляются три различных иммунохи-мических типа: ЛЭнк-иммунореактивные (доминирующий тип), МЭнк-реактив-ные'и нейроны с двойной меткой к обоим энкефалинам. Отростки всех трех типов нейронов проходят через массу глобулярных клеток и оканчиваются в медиально расположенном нейропиле процеребрума. Колокализация Лэнки •Мэнк обнаружена также в двух нейронах париэтальных гаглиев, среди большой группы МЭнк-иммунореактивных нейронов.

Энк u FURFamd. Колокализация МЭнк и FMRFa обнаружена в обоих церебральных и левом париетальном ганглии. В церебральных ганглиях выявлены две морфологически различные субпопуляции нейронов с двойной меткой: непарный среднего, размера (30 иМ) нейрон, расположенный рядом с нейропилем в верхней части левого церебрального ганглия, и симметрично расположенные группы мелких (15-20 иМ) нейронов в дорзолатеральной части обоих церебральных ганглиев. Последние являются частью более обширной группы FMRFa-иммунореактивных клеток, примыкающих к гигантскому неокрашенному нейрону. В левом париетальном ганглии, колокализация

метки к Юнк и ГЖРа выявлена в мелких и О иМ) нейронах, плотно сгруппированных и примыкающих к большому нейрону в медиальной части ганг

ЛИЯ.

Воспроизводимая и постоянная колокализация ЛЭнк и РМКРа обнаружена только в парной группе мелких нейронов (8-12 иМЬ расположенных на границе с ньиропилем в медиальной часта париетальных ганглиев.

Энк и серотонш. Колокализация МЭнк и серотонина найдена в церебральных. триста льнну я п^иик ганг.";-!:-:; колокажзащш ЛЭнк о ььри-•тиинчм унянлена только в одной группе нейронов правого париетального ганглия. В церебральных ганглиях воспроизводимое двойное окрашивание на МЭнк и серотонин выявляется в четырех нейронах от 10 до 30 иМ в ме-диопостериальной части правого ганглия и в двух нейронах левого ганглия. В правом париетальном ганглии, обширная группа МЭнк-реактивных нейронов располагается в передней (антериальной) части ганглия, серо-тонинэргические нейроны занимают постериальную часть, а в центральной области на пересечении этих субпопуляций лежат нейроны с двойным окра-шипгшш'н к М.тик и серотонину. В леьиы парным/ ном ганглии отростки о «¡н-Ри1-п меткой иплетаъг гигантский неокрашенный нойрон. На вентральной ■:Iгроме педальных ганглиев, так же как и в прапом париетальном, Нейроны С: Д|;'»;шш СКраШИЕЗаНИеМ ныяьлякич я на границе двух оуспопуляций ее ¡и'["нин и Манн эрьических клеток.

практически во всех пшгжях (Оа искличешт плевральных) ибнару гены э.чкеаалинэргическяе нейроны, сплетенные серотонин -имиуньреакгив ними ¡¡тростками

:тк и Т!'. Колокализация Л/МЭ.нк и ХГ не обнаружена ля а одном нейроне центральных ганглиев Сераеа. В церебральных ганглиях некоторые-

.••нг и 11 иммунь'ргШ'Ливныс- к.лепа! непосредственна иримик.чит друг к

Энк и ГАМК. Колокализация энкефалинов и ГАМК найдена только в педальных ганглиях. Двойное окрашивание на МЭнк и ГАМК выявляется в мелких и среднего размера (15-40 иМ) нейронах, симметрично распределенных

а I ■ рхней иасп1 обоих недальних г-Шалаев и .чанимаюиич '.ояа».ть, узко

.•I | .ашпеннуи' И 11-рС-ЛНг- ЗЧДНеМ НаПраКЛеННИ, НО И|...-| Я»«-||НУ1Г< I? Дур "" рРитрПШ-НГ'М Колг.кализйиия Л "ПК И Г.АМК ВИ.ЧЬЛЯе'1 СИ г? Ж'ИрОНаУ, рас педьд.г-щшх (.сЛеч; Ла,^раЛ1Нс И '¡а|>>:е аышмаИЩИХ аОЛаС I ь, ныл л.кенную 11 дирзо-нейтральном направлении, окрашивание на Энк у этих клеток было очень интенсивным, а на ГАМК - сравнительно слабым.

■ ОБСУЖДЕНИЕ <

.'Результаты двойного иммунохимического окрашивания выявили колока-лизацию энкефалинов с пептидом - FMRFa, а также с классическими ней-ронтрансмиттерами - серотонином и ГАМК в нервной системе Сераеа nemoral 1з. Йз числа Проверенных субстанций только ТГ - фермент синтеза ка-техоЛаминов, не был колокализован с энкефалинами ни в одном нейроне.

'В предыдущих опытах мы нашли, что FMRFa и энкефалины регулируют последовательные этапы защитного поведения, вызванного болевой (термической) стимуляцией подошвы улиток: пассивное избегание - уход в раковину (FMRFa) и активное избегание - поисковое поведение - ощупывание поверхности (Энк). Учитывая данные о том, что пептиды с антагонистичными функциями при.колокализации в одном нейроне могут находиться в разных синаптических везикулах, можно предположить что нейроны, содержащие Энк и FMRFa, могли бы обеспечивать быструю смену двух последовательных (и противоположных) этапов защитного поведения при болевой стимуляции.

j Нейроны с колокализацией Энк и серотонина были найдены в цереб-'■ ральных, париетальных, педальных и висцеральном ганглии Сераеа. Кроме того, практически во всех отделах ЦНС выявляется серотонинэргическая ' иннервация Энк-реактивных клеток. Найдены и общие области иннервации серотониновых и энкефалиновых нейронов. Эти морфологические данные указывают на существование тесного физиологического взаимодействия между обеими нейротрансмиттерными системами, что хорошо согласуется с результатами электрофизиологических и поведенческих работ, показавшими синергизм энкефалинов и серотонина в регуляции ряда программ.

' Колокализация энкефалинов о ГАМК была найаена в меньшем числе нейронов и только в одной ограниченной области педальных ганглиев. Физиологическая роль ГАМК-эргических нейронов педальных ганглиев не известна. Литературные данные свидетельствуют о том, что ГАМК, так же как и серотонин, в основном работает как синергист энкефалинов в регуляции ряда поведенческих программ.

В противоположность серотонину и ГАМК (тем классическим нейрот-рансмиттерам. с которыми была найдена .колокализация энкефалинов) ДА выступает как физиологический антагонист энкефалинов на поведенческом уровне. Колокализация энкефалинов с ТН не была выявлена ни в одном нейроне ЦНС Сераеа, хотя часто наблюдались ТН- и Энкреактивные нейроны, примыкающие лруг к другу. На млекопитающих и моллюсках показано, что опиатные агонисты действуют пресинаптически на ДА-эргичёские нейроны, снижая выброс дофамина (Stefano, 1982). Не исключено, что энке-

фалиновые нейроны, примыкающие к ТН-иммунореактивним клеткам, могут выполнять эту модулирующую функцию.

Таким образом, проведенные иммуногистохимические исследования показывают существование анатомической основы для взаимодействий энкефа линов с FMRFa, серотонином, Г'АМК и ДА. Эти данные хорошо согласуются с результатами поведенческих и электрофизиологических работ по взаимодействию энкефалинов с этими трансмиттерами. Хотя физиологический смысл ^локализации до сих пор остается Мало понятным, сравнение изученных результатов с данными фармакологических и поведенческих исследований свидетельствует о том, что колокализация нейротрансмиттеров в одном нейроне может быть связана с синергизмом их функции в регуляции определенных.программ поведения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все проведенные поведенческие и электрофизиологические опыты с" использованием антагониста опиатных рецепторов налоксона свидетельствуют о том, что эндогенная опиоидная система прудовика тонически ак тивна. Налокоон вызывал у улиток длительное состояние пассивного избегания, которое характеризовалось активацией защитных программ и подавлением других видов активности - пищевой, локомоторной, поисковой. В электрофизиологичеоких экспериментах налоксон вызывал появление залпов активности на мотонейронах, участвующих в защитных реакциях, перерывы в жевательном ритме буккальных мотонейронов, подавлял тоническую активность локомоторных нейронов. Специфичность эффектов налоксона как антагониста опиатных рецепторов подтверждается тем, что агонисты в тех же экспериментах вызывали противоположные эффекты.

Теоретически тормозное влияние налоксона на локомоторное и пищите поведение могло быть полностью онииредивани через активацию защитного, поскольку в норме реализация защитных реакций всегда сопровождается подавлением пищевой и локомоторной активности. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что опиоиды могут влияю ¡и локомоцию и пищевое поведение как опосредованно, '¡ак и прямо. 11 числу аффектов, опосредованных нейронами защитного поведения, скорее всего относятся вызванные налоксоном перерывы в оуккалыюм ригме, которые исчезали при отделении буккалыш' ганглиев от других отделов ЦНС. Прямыми „Эдемами налоксона на интери мотонейроны буккального и локомоторного генератора можно счититать те. которые сохранялись при отделении!! буккальных или педальных ганглиев от ЦНС медленное подавление жевак-льниг-о ритма

•(Алания, устное сообщение) и выключение цилиомоторных нейронов РеА.•

' Прямые и опосредованные эффекты налоксона в электрофизиологических экспериментах были однонаправлены и хорошо согласовались с результатами повеДенческих опытов. Это может свидетельствовать о том, что влияние .Опиоидов на разные программы поведения прудовика хорошо скоординированно, и что сами опиоиды могут являться интеграторами поведения не только в пределах ш одного ганглия, но, возможно, всей ЦНС моллюска. Основную функцию тонической активности опиоидной оистемы прудовика точнее всего было бы обозначить как тоническое подавление пассив-но-оборонителных реакций, нарушающих другие программы поведения, и разрешение на нормальную активность центрам пищевого и локомоторного поведения.

Для моллюсков известны две ситуации, вызывающие дополнительную активацию опиоидной системы, это разные виды стрессов и секс. Чтобы ответить на вопрос, для чего нужна дополнительная активация эндогенной ' опиоидной системы при стрессе, мы изменяли содержание опиоидных пепти-' дов в гемолимфе улиток и изучали поведение таких улиток на нагретой поверхности. Помещение улитки на нагретую поверхнось .вызывает типичную " болевую реакцию - сжатие и уход в раковину, однако вслед за этим наступает противоположная фаза поведения - выход из раковины, поисковое ощупывание поверхности и активное избегание. Результаты наших опытов свидетельствуют о том, что активация эндогенной опиоидной системы во время такого поведения и обеспечивает подавление болевых защитных реакций, препятствующих реализации поисковых программ, и стимулирует активное избегание неблагоприятной ситуации.

: Сходные налоксон-обратимые изменения - подавление чувствительности к внешним раздражителям и защитного поведения (Lucowlak et al., 1986) - описаны на другом виде моллюсков (Aplysia callfornlca) во время спаривания.

Оба эти примера свидетельствуют о том, что дополнительная активация эндогенной опиоидной системы может быть нужна в тех случаях, когда защитное поведение мешает реализации .более важных в данный момент программ поведения. Это предположение подтверждается и результатами, полученными в экспериментах на крабе (Tomslc et. al.. Brain Res.Bull., 1991, 26:699-706), показавшими, что подавление защитного ответа на повторяющийся стимул (надвигание тени) снимается налоксоном. В этом случае активация эндогенной опиоидной системы также обеспечивает "нейтрализацию" внешнего стимула, вызывавшего " ненужное" защитное по-

ведение.

Во всех поведенческих экспериментах эффекты опиоидов были оинер-гичны с действием серотонина. Известно, что ДА, напротив, вызывает поведенческие программы, противоположные тем, что запускаются серотони-ном ( Сахаров, Жур: общ. биол., 1990, 51:437-449), и сходные с теми. , что наблюдаются при предъявлении антагониста опиатных рецепторов - на-локсона. Моаио думать, что оииоианая к антиопиоидаая нейропептидные системы функционируют в качестве долгосрочных дублеров соответствующих моноаминов. Это предположение согласуется с обнаруженной нами в некоторых нейронах колокализацией серотонина и энкефалинов, но безусловно нуждается в специальной проверке.

Суммируя, можно заключить, что основная интегративная функция эндогенной опиоидной системы у моллюсков - это регуляция адекватного уровня восприимчивости к внешним сигналам и реактивности защитного поведения. Эта функция является, по-видимому, и наиболее древней в эво люционном отношении, т.к. у всех исследованных представителей беспозвоночных. начиная с одноклеточных, эффекты опиоидов на защитное пове дение одинаковы.

ВЫВОДЫ

1. Эндогенная опиоидная система исследованных беспозвоночных животных (моллюски) тонически активна и оказывает координированное влияние ,на разные моторные программы. Чем выше активность опиоидной системы, '.тем сильнее подавляется пассивно-оборонительные поведение, что способствует выявлению пищевых, локомоторных и поисковых программ.

2. Поведенческие эффекты опиоидов сходны с эффектами серотонина и противоположны эффектам дофамина и П№Гамида.

' . 3. иммуногистохимически в некоторых нейронах моллюска показана колокализация лей- и мет-энкефалинов друг с другом, а также с серото-нином, РНИГа й ГАМК. Колокализации энкефалинов с тирозингидроксилазой - ферментом синтеза катехоламинов не была выявлена ни в одном нейроне ЦНС улитки.

4. Результаты электрофизиологических опытов свидетельствуют о :том,, что опиоиды могут влиять на пищевое и локомоторное поведение как

прямо, так и опосредованно, через генератор защитного поведения. При этом знак прямого'и опосредованного действия совпадает.

5. Высказывается предположение, что основной функцией опиоидной системы моллюска является регуляция уровня защитного поведения, адекватного ситуации. Сравнение полученных результатов с литературными данными по другим группам беспозвоночных свидетельствует о том. что эта функция является, по-видимому, и наиболее древней. Представляется, ■что функции, выполняемые опиоидными нейропептидами у млекопитающих, являются продуктами дивергентной эволюции этой анцестральной функции.

Список статей, опубликованных по теме диссертации :

1. Дьяконова В Е., Дьяконова Т. Л., Сахаров Д. А.'(1992) Эндогенные" опиоиды модельных гастропод: координация моторных программ пищевого и защитного поведения пресноводной улитки,Lymnaea stagnalis. ьиол.мьмц». 10-11: 1874-76. . !

2. Дьяконова В. Е., Сахаров Д.А.(1994а) Участие эндогенной опиоид-ной системы в регуляции пищевого и защитного поведения моллюска Lymna-еа stagnalis. Журн. высш.нервн. деят. им. Павлова, Т. 44, N 2. о. 316-322.

3. Дьяконова В. Е.. Сахаров Д.А. (19946) Нейротрансмиттерная основа псзедения моллюска: управление выбором между ориентировочным и оборонительным ответом на предъявление незнакомого объекта. Журн. высш. нервн. деят. • им. Павлова, Т. 44. МЭ, е.- 526-531. .......

4. Baker M.W., CrollR.P., Dyakonova V., Khabarova М., Sakhaiuv D.A., Voroneztiskaya E. (1995) Mode of action of antipsychotic drugs-Lessons from simpler models. Acta blol. hung.. 46 (2-4); 221-227.

5. Dyakunova V. E., Elofsson R.. Carlberg M.. Sakharov D.A. (lOabaj Complex avoidance behaviour and Its neurochemical regulation In tinland snail cepaea nemoralls. Gen. Pharmac.26: 773-777.

6. Dyakonova V. E , Carlberg M., Sakharov D. A., Elofsson R. (19951/) Anatomical basis for Interactions of enkephalins with other neurot ransmltters'in the CNS of a snail. J. Cc:r.p.!'eurol. 359:2 11. " 7

Тезисы докладов:

, Dyakonova V. , Carlberg M., Sakharov b. г Elofsson R. (1994). Bena vloural choice between active and oasslve avoidance In a land snail: Involvement of two neuropeptide systems. In: Simple Nervous Systems. Abstracts fi-om the regional meeting of ISIil. Fushlnu. Russia, p.8.

Dyakonova V., Elofsson R., Carlberg M. (1995). immediate early gene products can reveal neurons active in benavloural programmes oi molluscs. Abstracts from the 8th symposium on Invertebrate neurobluln gy. Tlhany, Hungary.., p.22. _ . ................ . ....