Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние эндоморфина-2, сойморфина и N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей белых крыс
ВАК РФ 03.03.01, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Влияние эндоморфина-2, сойморфина и N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей белых крыс"
005533763
На правах рукописи
ЧЕСНОКОВА Екатерина Алексеевна
Влияние эндоморфина-2, сойморфина и 1Ч-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей белых крыс
03.03.01 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
26 СЕН 2013
Москва-2013
005533763
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой - доктор биологических наук, профессор A.A. Каменский).
Научный руководитель кандидат биологических наук, старший научный
сотрудник кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Сарычева Наталия Юрьевна
Официальные оппоненты доктор биологических наук, ведущий научный
сотрудник кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Полетаева Инга Игоревна
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН Константинопольский Марк Александрович
Ведущая организация ФГБУ ННЦ наркологии МЗ РФ
Защита состоится 7 октября 2013 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.ВЛомоносова.
Автореферат разослан 7 сентября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время в организме человека и животных обнаружены сотни эндогенных олигопептндов. Короткие пептиды действуют на всех уровнях межклеточной сигнализации - от ауто- и пара-кршшого до гормонального. В нервных клетках пептиды могут служить ней-ромедиаторами или модуляторами действия медиаторов иной химической природы (Ашмарнн, 1996). Некоторые пептиды, обладающие биологической активностью, не являются эндогенными, а всасываются в кровь через слизистую кишечника после неполного расщепления белков пиши (Hartmann, Mei-sel, 2007). Доля пептидов среди продуктов ферментативного расщепления белков особенно велика в кишечнике грудных детей в связи с возрастными особенностями пищеварения (Зуфаров, 1998).
Одной из наиболее активно изучаемых групп регуляторных пептидов является семейство опиоидов. Эндогенные опиоидные пептиды играют важную роль в контроле болевой чувствительности, врожденных поведенческих реакций, обучения и других функций центральной и периферической нервной системы. Опиоидные пептиды, попадающие в организм с пищей, объединяются под общим названием «экзорфины». У ряда опноидных пептидов обнаружены не только эффекты, проявляющиеся сразу после введения, но и отставленное действие, регистрируемое через несколько недель и даже месяцев после получения пептида. Отставленные эффекты особенно выражены при хроническом введении пептида в раннем возрасте (Малиновская, 2001; Беляева, 2005,2007).
Все опиоидные пептиды обладают рядом общих свойств, но отличаются друг от друга по первичной структуре и по сродству к разным типам опноидных рецепторов, а следовательно, и по спектру физиологического действия. При изучении влияния пептидов на центральную нервную систему обычно используют интрацеребровентрнкулярный (i.c.v.) способ введения, гарантирующий попадание рассматриваемого вещества в мозг в нужной дозе. Однако i.c.v. введение плохо подходит для изучения поведения, поскольку эксперимент включает хирургическую операцию по вживлению канюли, вызывающую сильный стресс у подопытных животных. В то же время внутри-брюшинная инъекция является одним из наименее травматичных способов введения веществ и при этом обеспечивает высокую их биодоступность. Данных о действии опноидных пептидов на ЦНС при системном способе введения в литературе в настоящее время мало. При этом многие пептиды с высокой вероятностью являются потенциально пригодными для применения в фармацевтике в качестве препаратов для мягкой коррекции разнообразных нарушений, в том числе заболеваний нервной системы (Левицкая, Каменский, 2003). С другой стороны, при некоторых особенностях диеты избыток экзорфннов, попадающих в организм (особенно детский) с пищей, потенциально может оказывать нежелательные эффекты. Опиоидные фрагменты растительных пищевых белков рассматриваются в качестве факторов, способствующих развитию аутизма и даже синдрома внезапной остановки дыхания (Kidd et al., 2002). Это подтверждает актуальность изучения как немедленного (развивающегося в течение минут-часов после введения), так и отставленного (наблюдаемого через недели и даже месяцы) эффектов, наблюдаемых при системном введении различных опноидных пептидов экспериментальным животным, в особенности - детенышам. Представляется важным, во-первых, подтвердить или опровергнуть наличие влияния пептидов на пове-
дение при выбранном способе инъекции; во-вторых, попытаться оценить баланс положительных и отрицательных (с точки зрения возможного применения в клинике) последствий введения пептидов на разных этапах постнаталь-ного развития.
Цель и задачи исследования. Целью представленной диссертационной работы явился анализ поведенческих эффектов трех олигопептидов опиоидной природы при однократном и хроническом системном (внутри-брюшинном) введении белым крысам на разных этапах постнатального развития. Исследовались пептиды YPFF-NHi (эндогенный эндоморфин-2), YPFVV-NFb (амндированный экзогенный пептид сойморфин) и FGGF-NHi (амидированный N-концевой фрагмент эндогенного пептида иоцицептина). Изучались как немедленные (при остром введении), так и отставленные (при хроническом введении в первые 14 дней постнатального развития) эффекты пептидов. В работе были поставлены следующие задачи:
• изучить влияние острого введения вышеуказанных пептидов на врожденные формы поведения (исследовательскую активность, уровень тревожности, поведенческие проявления депрессивности и болевую чувствительность) детенышей крыс и сравнить полученные результаты с последствиями острого введения этих же пептидов взрослым крысам;
• изучить отставленное действие хронического введения пептидов в первые дни жизни на те же параметры врожденного поведения экспериментальных животных;
• исследовать эффекты острого и хронического введения пептидов в экспериментах с обучением детенышей крыс новым навыкам;
• установить участие опиоидных рецепторов в развитии обнаруженных эффектов пептидов с помощью фармакологических блокаторов этих рецепторов.
Научная новизна. Практически все полученные нами результаты можно классифицировать как новые и не имеющие аналогов в литературе. Работа является продолжением скрининга пептидных лигандов опиоидных рецепторов, начатого в нашей лаборатории еще в 1980-х годах.
Пептид FGGF-NH?, являющийся укороченным аналогом молекулы иоцицептина, исследован впервые. В литературе нет данных о действии этого пептида в экспериментах ш vivo, хотя более длинные фрагменты молекулы ноцицептина активно изучаются. Такая модификация пептида была выбрана нами для работы, потому что малый размер молекулы увеличивает ее потенциальную способность преодолеть гемато-энцефалический барьер, а ампдп-рование повышает устойчивость пептида к пептидазам, содержащимся в крови и тканевых жидкостях. Пептид сойморфнн-5 из группы экзорфпнов был обнаружен в 2007 году, и о его влиянии на организм до сих пор известно очень мало. В опытах на мышах показано анкснолнтическое действие сои-морфина, а также его способность подавлять пищевую мотивацию (Ohinata et al., 2007; Kaneko et al., 2010). В нашей работе использовался амидированный аналог сойморфина-5. Эндогенный амидированный пептид эндоморфин-2 изучен достаточно подробно, но его эффекты при системном введении исследуются впервые. Учитывая литературные данные о действии эндоморфи-на при центральном введении, можно с большой вероятностью предсказать ожидаемые последствия системного введения этого пептида. Поэтому эндоморфин-2 можно рассматривать как вещество сравнения для двух других пептидов.
В представленной работе впервые показано, что все изученные пептиды при остром системном введении оказывают влияние на баланс ориентировочно-исследовательской активности и тревожности. При этом была выявлена общая для всех пептидов тенденция: подавление ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) у крысят в раннем возрасте, сменяющееся усилением ОИР в середине полового созревания (возраст 42 дня), отмечаемым и у взрослых животных. Для всех изученных пептидов при хроническом введении выявлено отставленное действие на способность крыс к обучению, зависимое от пола. Отрицательное влияние на обучение отмечалось чаще, чем положительное. Впервые обнаружено, что все три рассмотренных пептида при системном введении проявляют анальгетическое действие. Впервые показано, что на фоне налоксона поведенческие эффекты от системного введения всех трех изученных пептидов не проявляются, что подтверждает участие опиоидных рецепторов в реализации этих эффектов.
Несмотря на ряд общих закономерностей, большинство полученных результатов указывает на значительные отличия физиологической активности исследованных пептидов в сравнении друг с другом. Причиной этого, очевидно, являются различия их первичной структуры, а следовательно — разная селективность по отношению к потенциальным мишеням: опиоид-ным рецепторам (1-, 5- и к-типов, а также к ноцицептиновому рецептору ОШ] (и разным изоформам каждого типа рецепторов). В большинстве случаев направленность эффектов эндоморфина-2 и сойморфин-5-амида зависела от пола животных. В случае аналога ноцицептина также было отмечено влияние фактора пола животных на выраженность эффектов, но реже отмечалась разная направленность действия пептида на самцов и самок.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли опиоидных пептидов разных групп. Показана способность эмулированных олигопептидов вызывать центральные эффекты при внутрибрю-шинном способе введения. Показано, что опиондные пептиды при попадании в организм детенышей млекопитающих способны оказывать существенное нейротропное (изменяющее поведение) действие. В первую очередь, это относится к уровню исследовательской активности, тревожности, а также способности к обучению. В значительной части случаев это действие имеет отставленный характер, проявляется через несколько недель после окончания введения пептида и сохраняется в течение длительного времени. Большинство обнаруженных эффектов оказались негативными с точки зрения применения в клинике (усиление тревожности, нарушение способности к обучению и др.) При исследовании немедленных последствий введения пептидов показана зависимость эффектов не только от пола, но и от возраста подопытных животных, что увеличивает объем имеющейся информации о возрастных изменениях опиоидной медиаторной системы. Практическая значимость представленной работы связана с выявлением ряда негативных отставленных эффектов от введения опиоидных пептидов в раннем возрасте. Это информация, которую следует учитывать при оценке побочного действия белковых компонентов искусственных смесей для питания новорожденных. Согласно полученным нами результатам, опиоидные пептиды, попадающие в организм в первые дни жизни, являются физиологически значимыми факторами, от присутствия которых зависит реализация многих важнейших поведенческих реакций детеныша. Известно, что даже достаточно длинные пептиды у ново-
рожденных детей всасываются из пищеварительного тракта в кровь в относительно больших количествах (Зуфаров, 1998). С учетом этого факта наши результаты подтверждают необходимость контроля за содержания в заменителях молока белков, содержащих опиоид-подобные последовательности (в частности, широко применяемых в смесях для детского питания соевых белков).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Все изученные в работе пептиды при системном (внутрибрюшинном) введении способны изменять поведение животных. Это косвенно доказывает способность пептидов преодолевать гемато-энцефалический барьер.
2. Действие пептидов осуществляется с участием опиоидных и ORLr рецепторов.
3. Действие пептидов при остром введении может иметь разную направленность в зависимости от пола и возраста животных.
4. При хроническом введении пептидов в первые дни жизни отставленные эффекты зависят от пола животных, но мало изменяются с возрастом, что позволяет предположить программирующее действие пептидов на созревание нервной системы крысят.
Апробация работы. Результаты представленного диссертационного исследования доложены и обсуждены на XIII школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009), на IV, V и VI российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Казань, 2009; Петрозаводск, 2011; Уфа, 2013), XVI и XVII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (Москва, 2010), 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), 23-м международном конгрессе ECNP (Амстердам, 2010), 11-й региональной конференции ECNP (Санкт-Петербург, 2011), 8-м Международном форуме FENS (Барселона, 2012), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 24-й Международной конференции ISN/ASN (Канкун, 2013), а также на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ¿L4Q страницах, содержит 27 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 332- источников, из них ¿g отечественных.
Материалы и методы исследования. Опыты проводились на беспородных белых крысах. Животных содержали в виварии биофака МГУ со свободным доступом к пище и воде, взрослых - по 6-10 в одной клетке, детенышей - по одному выводку в клетке. Взрослые животные были старше 60 дней. Всего использовано 629 детенышей крыс (328 самцов и 301 самка) и 412 взрослых крыс (294 самца и 118 самок). Изучавшиеся пептиды YPFF-NH2 (эндоморфин-2), YPFVV-NH2 (амид сойморфина-5) и Ac-OHH-FGGF-NH2 (ацетилированный амид N-концевой части ноцицептина) были синтезированы на химическом факультете СПбГУ в лаборатории В.Н. Калихевича. Вещества растворяли в смеси дистиллированной воды и медицинского спирта
(3,33%). При остром введении (за 20 минут до теста) использовалась доза 5 мг/кг (в/б), при хроническом (инъекции раз в день в 1-14 дни жизни)- 1 мг/кг (в/б). Контрольным животным вводили растворитель.
Схема проведения тестов при остром введении
Основная серия экспериментов 21, 28,42 день - «открытое поле» со сменой освещенности (9 мин); 35,49 день — приподнятый крестообразный лабиринт (9 мин); 49-52 день - выработка и проверка условной реакции пассивного избегання (УРПИ).
Дополнительная серия экспериментов 35 (50) день - тест Порсолта; 43 (55) день - тест «отдергивание хвоста».
Схема проведения тестов при хроническом введении 21, 28, 35,42 день - «открытое поле» со сменой освещенности (5 мин); 35, 50 день - приподнятый крестообразный лабиринт (3 мин); 43-48 дни - обучение в «сложном лабиринте»; 53 день - тест Порсолта; 56 день - тест «горячая пластина».
Со взрослыми животными проводили эксперименты «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», тест Порсолта, выработку УРПИ, тесты на болевую чувствительность. Интервал между разными тестами составлял от 3 до 7 дней. Действие блокаторов опноидных рецепторов при совместном введении с пептидами изучали только на взрослых самцах. Налок-сон и вещество .1ТС-801 растворяли в дистиллированной воде и вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг (налоксон за 15 минут, ГГС-801 за 30 минут до инъекции пептида).
Параметры установок и протоколы эксериментов Тест «открытое поле» со сменой освещенности. Открытое поле представляет собой круглую арену (диаметр 100 см, высота стенки 42 см) с 13-ю отверстиями («норками»). В сериях с острым введением пептидов эксперимент длился 9 минут: 1-3-я минуты при ярком свете, 4-6-я минуты при красном, 79-я минуты снова при ярком. В серии с хроническим введением - 5 минут: 13-я минуты при ярком свете, 4-я при красном и 5-я при ярком. Регистрировали латентный период выхода из центра; горизонтальную активность; вертикальную активность; перемещения к центру арены; грумннг; заглядывания в «норки»; затаивания; дефекации и уринации.
Гест «приподнятый крестообразный лабиринт». Длина лучей лабиринта 50 см, ширина 15 см, стенки закрытых рукавов высотой 30 см. Открытые рукава освещены яркими лампами. Регистрировали латентный период входа в закрытый рукав; суммарное время в разных участках установки; стойки; гру-минг; выглядывания на свет; выходы на свет; выходы на край открытого рукава; свешнвания с края; переходы через центр «свет-свет» и «темнота-темнота»; затаивания; дефекации и уринации.
Тест «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ). Выработка УРПИ проводилась в светло-темной камере (50x25x40 см), пол которой сделан из металлической сетки и подключен к электростимулятору ЭСЛ-1. В первый день проводили обучение животных. Использовали удар током (50 Гц, 10 мс) амплитудой 80-100 В. Через 72 часа проводили проверку выработки УРПИ. В день обучения (перед ударом тока) и в день проверки в течение трех минут
регистрировали: время на свету, заглядывания в темноту и выглядывания на свет, переходы между отсеками, груминг, стойки и дефекации. Тест «сложный лабиринт с пищевым подкреплением». Лабиринт представляет собой деревянную камеру (размер 60x60x25 см), разделенную пятью прозрачными перегородками с отверстиями. На фоне пищевой депривации в течение 4 дней проводилось обучение: 5 попыток не более 3-х минут ежедневно. Регистрировали латентный период выхода из стартового отсека; латентный период взятия пищи; ошибки; стойки; груминг. После 4 дней обучения все перегородки лабиринта переворачивали зеркальным образом и переучивали крыс в течение 2 дней.
Тест «принудительное плавание». Использовали пластиковый цилиндр высотой 39 см, диаметром 20 см с водой температурой 28°С. Визуально регистрировали число и время эпизодов активного плавания, пассивного плавания и иммобилизации1. Время наблюдения составляло 5 или 10 минут. Тест «отдергивание хвоста». Использовали горячую воду (54°С). Хвост крысы опускали в пробирку и замеряли время отдергивания хвоста. Измеряли фоновый (до введения пептида) уровень болевой чувствительности. Через 20 минут после инъекции проводили 4-6 измерений с интервалом 15 минут. Время одного измерения ограничивали 30 секундами.
Тест «горячая пластина». Использовали анальгезиметр фирмы Ugo Basile. Животное помещали на металлическую поверхность, разогретую до 53°С. Регистрировали латентный период первого облизывания задней лапы. Время одного наблюдения ограничивали 30 секундами. Проводили 4 измерения болевой чувствительности с интервалом между ними 15 минут.
Обработка данных
Полученные результаты обрабатывали на компьютере с помощью программ «Statistica 8» и «Microsoft Excel 2003». Для сравнения данных контрольной и опытной групп использовали параметрические и непараметрнче-скне критерии: тест Стьюдента, ANOVA, критерий %2, критерий Манна-Уитни, а также анализ корреляций.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Действие пептидов на болевую чувствительность животных.
Поскольку исследуемые пептиды являются лигандами опиоидных рецепторов, особый интерес для нас представляло влияние пептидов на уровень болевой чувствительности животных.
Пептид эндоморфин-2 при остром введении обладал анальгетнческим действием. В тесте «tail flick» время отдергивания хвоста у самцов в возрасте 55 дней, получивших пептид, было увеличено в сравнении с контрольным показателем (рис. 1).
Сойморфин-5-амид ни при остром, ни при хроническом введении детенышам не вызвал значимого изменения болевого порога. Однако в опыте «отдергивание хвоста» у взрослых самок было выявлено анальгетическое действие пептида. Среднее значение времени отдергивания хвоста (по 4 измерениям) у крыс, получивших сойморфин (п=8), составило 8,8±1,3 сек по сравнению с 5,9±0,5 сек в контрольной группе (п=8) (р<0,05 по критерию у~).
Аналог ноинцептина проявил анальгетическое действие как при остром, так и при хроническом введении. При остром введении пептида самцам крыс (возрасте 42 дня) через 35 минут после инъекции у половины (3 из 6) крыс опытной группы латентный период отдергивания хвоста был в три или более раз выше фонового значения; в контрольной группе (п=8) ни у одной
крысы не выявлено такого повышения латентного периода, межгрупповое отличие достоверно (р<0,05, критерий Среднее значение измеряемого показателя составило 13,7±4,2 сек в опытной группе и 5,8±1,3 в контрольной. При хроническом введении аналога ноцицептина у самцов опытной группы (возраст 56 дней) в тесте «горячая пластина» при всех 4-х измерениях время облизывания лапы было повышено по сравнению с аналогичным показателем в контроле (рис. 2).
Рис. 1. Влняние острого введения эндоморфина-2 на время отдергивания хвоста у самцов (возраст 55 дней). По оси абсцисс - время после инъекции веществ (минуты). По оси ординат - время отдергивания в % от фонового значения в группе (АМ±5ЕМ). Прерывистая линия - контрольная группа (п=12), сплошная линия - опытная группа (п=12). * - р<0,05.
100% -
50%
0%
10
20
30
40
50
20
15
10 -
Рис. 2. Действие хронического введения аналога ноцицептина на время облизывания лапы в тесте «горячая пластина» у самцов (возраст 56 дней). По оси абсцисс - время эксперимента (минуты). По оси ординат -время облизывания лапы в секундах (АМ±5ЕМ). Прерывистая линия -контрольная группа (п=18), сплошная линия - опытная группа (п=17). * - р<0,05.
0 15 30 45
2. Действие эндо5юрфпна-2 при остром к хроническом введении детенышам крыс на двигательную и ориентировочную активность, тревожность, депрссснвность и способность к обучению 2.1. Эффекты острого введения эндоморфина-2 Статистическая выборка состояла из 46 самцов (24 в контроле, 23 в опытной группе) и 37 самок (18 в контрольной и 19 в опытной группе).
У самцов 21-го дня жизни, получивших инъекцию эндоморфина-2 за 20 минут до тестирования в «открытом поле», зарегистрировано снижение локомоторной активности при красном свете (4-6 минуты теста): пробег в опытной группе составил в среднем 22,5±3,6 сегментов, а в контрольной — 35,5±4,1 сегмента (р<0,05, тест Стьюдента).
При тестировании на 28-й день в опытной группе самцов достоверно был снижен суммарный пробег за все 9 минут опыта: 88,4±5,6 сегментов по сравнению с 100,9±6,0 в контроле (р<0,05 по критерию %2). При этом у самок на 21-й день жизни однократное введение эндоморфина-2 вызвало обратный эффект: пептид повышал локомоторную активность. Самки опытной группы за последние три минуты теста прошли 45,6±5,2 сегмента, а контрольные — 29,2±4,2 сегмента (р<0,05, тест Стьюдента). У самок в возрасте 28 дней, а
также у животных обоего пола в возрасте 42 дней влияния пептида на локомоторную активность обнаружено не было.
Действие эндоморфина-2 на ориентировочно-исследовательскую реакцию (ОИР) крысят зависело не только от пола, но и от возраста (см. табл. 4). При тестировании в возрасте 21 дня у самцов отмечалось снижение ориентировочной активности под действием пептида: число стоек при красном свете (4-6 минуты эксперимента) в опытной и контрольной группах составило 5,9±1,3 и 8,5±1,1 соответственно (р<0,05, критерий уи2). У самок в этом же возрасте пептид, напротив, усиливал ориентировочную активность: количество стоек за 7-9 минуты эксперимента у самок опытной группы составило 4,8±0,8 по сравнению с 2,4±0,7 в контрольной группе (р<0,05, тест Стьюден-та). На 28-й день жизни, как и на 21-й, у самцов отмечалось снижение ОИР, но не такое сильное, как при первом тестировании: в опытной группе было достоверно (р<0,05, тест Стьюдента) уменьшено число норковых реакций на первой минуте (1,0±0,2 по сравнению с 1,7±0,3 в контроле), а также снижен суммарный пробег (см. выше). У самок этого же возраста отмечалось более существенное снижение ОИР, чем у самцов: у самок опытной группы не было зарегистрировано ни одного перехода к центру за 1-3 минуты тестирования (в контроле число переходов составило 0,5±0,3, р<0,05 по критерию '£), а кроме того, у них было меньше норковых реакций за 7-9 минуты (1,8±0,7 по сравнению с 3,6±0,9 в контроле, р<0,05 по критерию х2)-
На 42-й день жизни как у самцов, так и у самок эндоморфин-2 вызывал увеличение ОИР. У самцов это выражалось в повышенном количестве стоек за 1-4 минуты тестирования (8,7±1,6 по сравнению с 4,5±1,0 в контроле; F(l, 45)=5,1, р=0,03, ANOVA), у самок - в увеличении числа норковых реакций за те же 1-4 минуты (7,8±0,9 по сравнению с 5,1±0,7 в контроле, F(l, 35)=5,0, р=0,03, ANO VA). Следует, однако, отметить, что норковая активность у самцов опытной группы оказалась снижена (суммарное число норковых реакций 9,3±1,3 по сравнению с 13,1±1,6 в контроле, р<0,05, критерий х~), но суммарное значение уменьшено только за счет снижения числа норковых реакций на 4-й минуте (1,3±0,3 по сравнению с 2,6±0,4 в контроле, р<0,01 по критерию Стьюдента).
Влияние острого введения эндоморфина-2 на уровень тревожности, оцениваемый в_«приподнятом крестообразном лабиринте», оказалось разнонаправленным у самцов и самок. У самцов (возраст 35 дней) после введения пептида оказался увеличен латентный период входа в темный рукав ПКЛ: в опытной группе этот показатель составил 13,9±3,3 сек, а в контроле — 6,9±1,1 сек (р<0,05, тест Стьюдента). Кроме того, у крыс опытной группы было увеличено число свешиваний с края лабиринта (2,1±0,6 по сравнению с 0,8±0,4 в контроле, р<0,10, тест Стьюдента) и выходов на освещенные рукава лабиринта (0,4±0,1 по сравнению с 0,0±0,0 в контроле, р<0,05, тест Стьюдента). Эти различия говорят о сниженной тревожности у самцов опытной группы. У самок, получавших эндоморфин-2, уровень тревожности на 35-й день жизни оказался выше, чем у контрольных самок. Об этом свидетельствует снижение числа стоек (12,9±1,9 по сравнению с 23,3±3,4 в контроле, р<0,05, критерий х') и свешиваний с края ПКЛ (0,8±0,5 по сравнению с 2,3±0,6 в контроле, р<0,05, критерий у2).
При тестировании животных в возрасте 49 дней у самцов опытной группы не было отмечено значимых отличий от контроля. У самок анксио-генный эффект пептида сохранился, но был менее выражен по сравнению с
возрастом 35 дней. Признаком повышенной тревожности у самок опытной группы на 49-й день жизни стало снижение числа стоек на освещенных участках лабиринта (0,4±0,3 по сравнению с 1,3±0,5 в контроле, р<0,05, критерий х2).
Влияние острого введения эндоморфина-2 на обучение с отрицательным подкреплением было выявлено только у самок. При проверке выработки навыка пассивного избегания (через 72 часа после обучения) и в контрольной, н в опытной группе латентный период входа в темный отсек камеры увеличился. Однако у самок, получивших перед обучением эндоморфин-2, разница между ЛП при проверке и при обучении составила всего 45,3±25,8 секунд, тогда как в контрольной группе этот показатель достиг 105,8±18,7 секунд. Различие статистически значимо (р<0,05 по критерию х2). Таким образом, крысы в опытной группе обучились пассивному избеганию хуже, чем в контрольной.
Действия острого введения пептида на депрессивность не выявлено.
2.2. Отставленные эффекты хронического введении эндоморфина-2
Статистическая выборка состояла из 49 самцов (23 в контроле и 26 в опытной группе) и 23 самок (11 в контрольной группе, 12 в опытной).
Отставленное действие пептида на локомоторную активность крысят зависело от их пола. Наиболее выраженные эффекты пептида отмечались в возрасте 21 день. У самцов, хронически получавших эндоморфин-2 в первые дни жизни, в возрасте 21 дня горизонтальная активность в «открытом поле» оказалась снижена: суммарный пробег составил 29,5±3,5 сегментов арены в опытной группе и 43,6±5,8 сегментов в контроле (р<0,05 по критерию Стью-дента). У самок опытной группы пробег оказался увеличен, особенно в начале эксперимента: пробег за первые три минуты теста у них составил 31,3±7,2 сегмента, а в контрольной группе — 19,1±4,7 сегмента (р=0,06 по критерию Г)-
Направленность отставленного влияния эндоморфина-2 на ориентировочную активность (выявленного только в возрасте 21 день) также зависела от пола. У самцов пептид подавлял ориентировочную активность: у 18 из 26 животных опытной группы не было отмечено ни одной стойки при красном свете. В контрольной группе таких животных было только 6 из 20. (Среднее значение числа стоек при красном свете составило 0,8±0,3 в опытной группе, 1,6±0,4 в контроле, р<0,01 по критерию у^). У самок опытной группы исследовательская активность, напротив, была повышена: число переходов к центру арены у них составило 1,4±0,9 по сравнению с 0,1±0,1 в контроле (р=0,06 по критерию %').
Влияние хронического введения эндоморфина-2 на уровень тревожности также у самцов и у самок было различным. Следует отметить, что в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» ни в возрасте 35 дней, ни в возрасте 50 дней не было выявлено различий между контрольной и опытной группами по времени, проведенному на освещенных участках установки (основной показатель, отражающий уровень тревожности). Под влиянием эндомор-фина-2 отмечались изменения только таких параметров, как число стоек или свешиваний. Это говорит о том, что отставленные изменения уровня тревожности под влиянием пептида невелики.
У самцов в возрасте 35 дней в ПКЛ доля выглядываний, реализованных в выходы на свет, составила 0,2±0,1 в опытной группе и 0,7±0,2 в контроле (р<0,05, критерий Х2). Это говорит о некотором повышении тревожности у
крыс опытной группы. Анксиогеннын эффект пептида сохранился и в возрасте 50 дней: самцы опытной группы в этом эксперименте совершили 0,2±0,1 переходов между светлыми рукавами, а контрольный показатель составил 0,5±0,1 (р=0,06 по критерию Стьюдента).
У самок, напротив, под влиянием эндоморфина-2 отмечалось смещение баланса тревожности и ориентировочно-исследовательской активности в сторону последней. Так, при тестировании в ПКЛ на 35-й день жизни у самок опытной группы было отмечено больше стоек, чем в контроле: 10,9±1,8 по сравнению с 6,6±1,2 (р<0,05 по критерию "£). При проведении эксперимента на 50-й день у самок опытной группы было зарегистрировано повышенное количество свешиваний: 3,3±1,1 по сравнению с 1,2±0,4 в контрольной группе (р<0,05 по критерию у?).
Направленность отставленных эффектов эндоморфина-2 на обучение с положительным подкреплением также зависела от пола. У самок опытной группы в тесте «сложный лабиринт с пищевым подкреплением» отмечалось выраженное улучшение обучения: увеличение доли выполненных реакций за день обучения, уменьшение числа ошибок и времени выполнения задачи. Достоверно (р<0,05 по критерию у') изменено число выполненных реакций в 1-й день обучения (4,9±0,1 в опытной группе, 3,9±0,7 в контрольной), среднее время выполнения реакции на 2-й день (20,6±4,3 сек и 58,4±23,5 сек соответственно), суммарное число ошибок на 3-й день (3,9±1,1 и 7,4±2,2 соответственно). У самцов влияние пептида на обучение было скорее негативным, о чем можно судить по увеличению среднего времени выполнения реакции. На 3-й день среднее время выполнения задачи составило 23,5±9,7 сек в опытной группе и 8,б±0,7 сек в контрольной (р<0,05 по критерию у?). Однако значимого увеличения числа ошибок или снижения числа выполненных реакций в группе самцов, получавших эндоморфин-2, отмечено не было.
Влияние хронического введения эндоморфнна-2 на обучение с отрицательным подкреплением, как и в случае с острым введением, было выявлено только у самок. При проверке выработки УРПИ суммарное время, проведенное на свету, у животных опытной группы было значимо (р<0,05 по критерию Стьюдента) увеличено и составило 119,4±21,0 сек по сравнению с 42,3±13,4 сек в контроле. Разница между временем на свету при проверке и при обучении составила 90,9±9,1 сек в опытной группе и только 9,4±9,1сек в контроле (р<0,05, тест Стьюдента). Следовательно, хроническое постнаталь-ное введение пептида способствует улучшению обучения с отрицательным подкреплением у самок.
Как и в случае с острым введением эндоморфина-2, влияния хронического пептида на депрессивность животных выявлено не было.
Все статистически значимые результаты экспериментов с введением эндоморфина-2 детенышам крыс обобщены в таблице 1. Особенности влияния пептида на уровень ориентировочной активности в тесте «открытое поле» по мере взросления животных представлены в таблице 4.
Таблица 1. Выявленные в различных тестах эффекты острого и хронического введения чндоморфина-2 у крыс разного возраста и пола.
Условные обозначения: Т - повышение, 1 - снижение, || - направленность эффектов меня-
Эффекты энломорфииа-2 острое введение хроническое введение
самцы самки самцы самки
Локомоторная активность 4 т 4 т
Ориентировочная активность И 1Г 4 т
Тревожность 4 т Т 4
Обучение с
положительным нет данных нет данных 4 Т
подкреплением
Обучение с
отрицательным = 4 = Т
подкреплением
Депрессивность = = = =
3. Действие соГшорфнн-З-амида при остром н хроническом введении детенышам крыс на двигательную н ориентировочную активность, тревожность, депрессивность и способность к обучению
3.1. Эффекты острого введения сойморфин-5-амида
Статистическая выборка в экспериментах с острым введением пептида состояла из 39 самцов (20 в контрольной, 19 в опытной группе) и 51 самки (25 в контроле, 26 в опытной группе).
Эффекты острого введения сойморфин-5-амида крысятам разного возраста оказались незначительными. Так, не было отмечено влияния пептида на локомоторную и ориентировочно-исследовательскую активность самцов в тесте «открытое поле». В этом эксперименте эффекты пептида проявились только у самок.
У самок при тестировании в «открытом поле» на 21-й день жизни было отмечено снижение локомоторной активности под действием сойморфин-5-амида. Суммарный пробег у крыс, получивших пептид, составил 92,3±7,8 сегментов, а в контрольной группе - 115,9±11,1 (р<0,05, критерий х2)-
В возрасте 28 дней суммарный пробег в опытной группе самок был равен 98,1±6,3 сегмента, а в контроле - 135,0±11,7 сегментов (р<0,01 по критерию Стьюдента).
Кроме пробега, на 28-й день жизни у самок, получивших сойморфнн-5-ампд, были уменьшены и другие проявления двигательной активности. Суммарное число стоек составило у опытных самок 18,8±2,3 по сравнению с 24,9±2,8 в контроле (р<0,05, критерий Суммарное число переходов к центру в опытной группе равнялось 5,8±1,0, а в контрольной - 10,9±2Д (р<0,05, критерий Стьюдента). Полученный результат позволяет сделать вывод, что сойморфнн-5-амнд в этом возрасте снижает не только двигательную, но еще и ориентировочно-исследовательскую активность самок. В возрасте 42 дней влияние сойморфин-5-амида на самок в тесте «открытое поле» изменилось. Пептид не оказал влияния на пробег животных. Однако наблюдалось достоверное увеличение числа обследованных «норок» у самок опытной группы. Суммарное число «норок» составило 17,0±1,7 в опытной группе и 9,7±1,0 в
контроле (р<0,001 по критерию Стьюдента). Можно заключить, что введение еойморфин-5-амида в этом возрасте усиливает исследовательское поведение самок.
При тестировании в «приподнятом крестообразном лабиринте» было выявлено увеличение уровня тревожности животных под действием соймор-фин-5-амида. На 35-й день жизни у самцов опытной группы оказалось уменьшено число выходов на светлые участки ПКЛ в конце эксперимента. Суммарное число выходов за 4-9 минуты составило 1,0±0.4 в контрольной группе и 0,2±0,1 в опытной группе (р<0,05 по критерию 7"). Кроме того, у животных опытной группы было меньше свешиваний с края в конце эксперимента. Число свешиваний за 7-9 минуты в опытной группе было 0,1±0,07 по сравнению с 0,7±0,3 в контроле (р<0,05 по критерию х). На 49-й день в этом же эксперименте различий в поведении опытной и контрольной групп не обнаружено.'
У самок также отмечалось анксиогенное действие сойморфин-5-амида, но оно было выражено слабее, чем у самцов. В возрасте 35 дней число стоек на открытых рукавах и в центре лабиринта у самок опытной группы составило 0,1±0,08, а в контроле этот показатель был равен 0,4±0,2 (р<0,05 по критерию х2)- При тестировании на 49-й день у самок опытной группы достоверно (р<0,05 по критерию -/2) уменьшились число выходов на свет за первые 3 минуты эксперимента (1,1 ±0,2 по сравнению с 1,8±0,4 в контроле) и число переходов через центр между темными отсеками за первую треть эксперимента (0,2±0,08 по сравнению с 0,7±0,3 в контроле).
Действия пептида на обучение с отрицательным подкреплением выявлено не было.
Влияние острого введения сойморфин-5-амида на депрессивные проявления поведения в тесте Порсолта было выявлено только у самцов (выборка состояла из 17 контрольных и 14 опытных животных). У крыс, получивших сойморфин-5-амид, число эпизодов пассивного плавания было меньше, чем в контроле (9,5±1,0 по сравнению с 12,2±0,9 в контроле; р<0,05 по критерию X2). Также у самцов опытной группы среднее время одного эпизода активного плавания оказалось больше, чем в контроле: 42,7±6,3 и 29,8±2,4 соответственно (р<0,05 по критерию Стьюдента). Это позволяет предположить анти-депрессантное (хотя и слабо выраженное) действие пептида.
3.2 Эффекты хронического введения сойморфин-5-амнда
В экспериментах с хроническим введением пептида статистическая выборка состояла из 38 самцов (18 в контрольной, 20 в опытной группе) и 37 самок (18 в контрольной и 19 в опытной группе).
При тестировании крыс в «открытом поле» не было выявлено существенных отставленных эффектов сойморфин-5-амида на локомоторную активность животных разного возраста.
Существенных изменений ориентировочно-исследовательской активности под влиянием хронического введения сойморфин-5-амида при тестировании в возрасте 21, 28 и 42 дней также не обнаружено. В возрасте 35 дней отмечалось повышение ОИР у самцов опытной группы. У них было достоверно (р<0,05 по критерию Стьюдента) увеличено суммарное число стоек за время эксперимента (11,9±1,1 по сравнению с 8,7±1,0 в контроле). У самок влияние пептида на ориентировочную активность оказалось выражено сильнее, чем у самцов, но имело иную направленность. У самок опытной группы суммарное число стоек при тестировании в «открытом поле» на 35-й
день жизни оказалось значимо ниже, чем в контроле (7,7±1,7 и 11,1±4,5 соответственно, р<0,05 по критерию у").
Отставленное влияние сойморфин-5-амида на тревожность наблюдалось только у самок. В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» в возрасте 50 дней у самок опытной группы было значимо больше выходов на открытые лучи (1,7±0,2 по сравнению с 1,1 ±0,2 в контроле). Кроме того, доля выглядываний, реализованных в выходы на свет, у опытных самок составила 0,7±0,1, а в контроле - 0,4±0,1 (для обоих различий р<0,05 по критерию Стыодента).
Отставленное действие сойморфин-5-амида на обучение с положительным подкреплением у самцов и у самок в эксперименте «сложный лабиринт» оказалось прямо противоположным. Статистическая выборка состояла из 31 самца (15 в контроле, 16 в опытной группе) и 31 самки (15 в контроле, 16 в опытной группе). У самцов крыс, хронически получавших сойморфин-5-амид в постнаталыюм периоде, на 2-й день обучения было больше выполненных реакций (4,9±0,06 по сравнению с 4,3±0,3 в контроле, р<0,05, критерий Стьюдента). Кроме того, у самцов опытной группы оказались уменьшены как число ошибок во время обучения, так и среднее время поиска подкрепления за каждый день обучения. Так, на 2-й и 4-й дни эксперимента число ошибок составляло соответственно 18,9±2,4 и 6,1±1,4 в опытной группе и 26,8±3,0 и 14,9±2,2 в контроле (в обоих случаях р<0,05 по критерию Стьюдента). На 3-й и 4-й дни обучения среднее время реакции составило соответственно 20,4±4,1 и 12,3±2,2 сек в опытной группе и 38,7±7,4 и 28,6±5,8 сек в контроле (р<0,05, ANOVA, F(l, 23)=7,1). При переучивании у животных опытной группы среднее время реакции в 1-й день составило 13,1±1,6 сек в опытной группе и 24,0±4,4 сек в контроле (р<0,05, тест Стьюдента). Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение сойморфин-5-амида в первые дни жизни вызывает отставленное улучшение обучения с положительным подкреплением у самцов. У самок опытной группы число выполненных реакций в 1-й день обучения составило 2,1±0,5 , в контроле - 3,7±0,5 (р<0,05 по критерию Стыодента). Число ошибок при переучивании на 1-й и 2-й день соотвественно составило в опытной группе 19,8±3,4 и 9,3±1,5, в контрольной - 13,4±1,9 и 6,1±1,2 (р<0,05 по критерию х2)- На 2-й день переучивания среднее время выполнения реакции в опытной группе составило 11,8±1,7 сек, а в контроле - 8,1±1,1 сек (р<0,05 по критерию х2)-
Действие пептида на обучение с отрицательным подкреплением выявлено только в группе самок. При проверке выработанного навыка пассивного избегания латентный период входа в темный отсек в опытной группе увеличился (по сравнению с днем обучения) на 9,5±11,3 секунд, в то время как в контрольной группе - на 43,4±15,5 секунд (р=0,08, тест Стыодента). Таким образом, отмечена тенденция к ухудшению в результате постнатального хронического введения пептида.
Влияние сойморфин-5-амида на депрессивность было отмечено только у самок. В тесте «принудительное плавание» на 53-й день жизни у самок, получавших сойморфин-5-амид в раннем возрасте, среднее значение времени иммобилизации составило 36,7±5,1 сек по сравнению с 16,7±9,8 сек в контрольной группе (р<0,05 по критерию х). Таким образом, у этих животных под влиянием пептида оказался повышен уровень депрессивности.
Обобщенные статистически значимые результаты экспериментов с введением сойморфин-5-амида представлены в таблице 2. Особенности
влияния пептида на уровень ориентировочной активности в тесте «открытое поле» по мере взросления животных представлены в таблице 4.
Таблица 2. Выявленные в различных тестах эффекты острого и хронического введения сойморфин-5-амнда у крыс разного возраста и пола.
Условные обозначения: | - повышение, 1 - снижение, || - направленность эффектов меня-
Эффекты сойморфил-5- острое введение хроническое введение
амнда самцы самки самцы самки
Локомоторная _ 1 _
активность
Ориентировочная активность = IÎ Г 1
Тревожность Î Î = 1
Обучение с
положительным нет данных нет данных î
подкреплением
Обучение с
отрицательным = = 1 =
подкреплением
Депрессивность i = = т
4. Действие аналога ноцицептниа при остром и хроническом введении детенышам крыс на двигательную и ориентировочную активность, тревожность, депрессивность и способность к обучению
4.1 Эффекты острого введения аналога поцицептина
Статистическая выборка в экспериментах с острым введением пептида детенышам состояла из 30 самцов (16 в контроле, 14 в опытной группе) и 28 самок (по 14 в контрольной и опытной группах).
Локомоторная активность в результате введения аналога ноцнцептина изменялась на 21-й день жизни только у самок, а на 28-й - только у самцов. У самок опытной группы па 21-й день пробег за 1-5 минуты эксперимента оказался снижен: 46,7±4,6 сегментов арены по сравнению с 63,0±5,5 сегментов в контроле (F(l, 25)=5,2, р=0,03, ANOVA).
У самцов на 28-й день также отмечалось снижение локомоторной активности под влиянием пептида: суммарный пробег в опытной группе составил 52,1±6,1 сегмента, в контрольной - 71,2±4,3 сегмента (р<0,05, тест Стью-дента). На 42-й день изменений двигательной активности под влиянием пептида отмечено не было.
Действие аналога поцицептина на ориентировочную активность оказалось достаточно сложным и зависело от возраста животных (см. табл. 4). На 21-й день как у самцов, так и у самок отмечалось снижение ОИР в результате введения пептида. У самцов это проявлялось уменьшением числа норковых реакций за 4-6 минуты эксперимента (1,3±0,4 по сравнению с 3,2±0,7 в контроле; р<0,05, тест Стьюдента). У самок опытной группы при тестировании на 21-й день было значимо снижено число отходов от стенки за 4-6 минуты теста: 1,2±0,4 по сравнению с 2,0±0,3 в контроле (р<0,05, критерий Уменьшение числа отходов от стенки можно трактовать как признак снижения ОИР, однако этот показатель сильно зависит от горизонтальной активно-
сти, которая в данном случае была снижена (см. выше). На 28-й день существенного изменения ОИР под действием тетрапептида не зарегистрировано.
Наконец, на 42-й день жизни отмечалось небольшое увеличение ОИР под влиянием пептида как у самцов, так и у самок. У самцов опытной группы главным признаком смещения баланса тревожности и исследовательской активности в сторону последней стало уменьшение времени затаивания (суммарное время затаивания составило 30,4±10,4 сек в опытной группе и 65,6±20,2 сек в контрольной; р<0,05, тест Стьюдента). У самок, получивших тетраиептид, было больше отходов от стенки за 1-3 минуты теста: 3,0±0,6 по сравнению с 1,6±0,4 в контроле (р<0,05, тест Стьюдента).
В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» не было отмечено значимого влияния аналога ноцицептнна на уровень тревожности как у самцов, так и у самок, хотя признаки снижения тревожности у самцов были обнаружены в эксперименте «открытое поле» (см. выше).
Также не было отмечено изменения способности к обучению с отрицательным подкреплением под действием пептида.
Антпдепрессантное действие аналога ноцицептнна было выявлено только у взрослых самок. В эксперименте «принудительное плавание» выборка состояла из 14 крыс (по 7 в контрольной и опытной группе). У взрослых самок, получивших пептид, суммарное время иммобилизации (13,7±13,7 сек) было меньше, чем в контроле (48,4±31,3 сек). Время активного плавания у крыс опытной группы было увеличено: 78,6±17,6 сек по сравнению с 47,3±13,0 сек в контроле. Значимость обнаруженных отличий находится на уровне тенденции (р<0,10, тест jf). У самок в возрасте 35 дней, как и у самцов, значимых изменений поведения в тесте «принудительное плавание» под влиянием пептида не обнаружено.
4.2 Эффекты хронического введения аналога ноцицептнна
Локомоторная активность под влиянием хронических инъекций аналога ноцицептнна изменялась только у самцов, причем первые изменения пробега отмечены только в возрасте 35 дней. В этом возрасте у самцов опытной группы отмечалось снижение горизонтальной активности (пробег у них составил 41,6±4,0 сегментов по сравнению с 59,2±5,6 сегментов в контроле, р<0,05 по критерию Стьюдента).
В возрасте 42 дней у самцов, хронически получавших пептид, отмечалось, напротив, увеличение горизонтальной активности. Пробег за 1-3 минуты в опытной группе составил 49,9±3,3 сегмента, в контрольной - 37,8±3,9 сегментов (F(l, 33)=5,5, р=0,03, ANO VA).
Отставленное действие аналога ноцицептнна на уровень ориентировочной активности, как и в случае с острым введением, было разнонаправленным в зависимости от пола и возраста животных (см. табл. 4). При тестировании в «открытом поле» на 21-й день жизни у самцов опытной группы ОИР оказалась повышена: у них было отмечено увеличение числа стоек на 13 минутах эксперимента (8,2±1,2 по сравнению с 5,1 ±1,0 в контроле; р<0,05, критерий х2)- У самок в этом возрасте влияния пептида на ориентировочную активность не зарегистрировано.
При тестировании на 28-й день, напротив, изменения ориентировочной активности отмечались только у самок. Суммарное число стоек у самок опытной группы составило 10,2±1,3, а в контроле - 13,0±1,3 (р<0,05 по критерию х"). Таким образом, ориентировочно-исследовательская активность самок, получавших пептид, в данном случае оказалась подавлена.
В возрасте 35 дней у самцов опытной группы отмечалось снижение ОИР, о чем свидетельствовало уменьшение суммарного числа переходов к центру (0,8±0,4 по сравнению с 2,8±0,9 в контроле; р<0,05 по критерию х2)- У самок опытной группы в этом возрасте также было отмечено снижение ориентировочно-исследовательской активности, проявляющееся в уменьшении числа обследованных «норок». Суммарное число норковых реакций у них составило 1,5±0,4, а в контроле этот показатель был равен 3,1±0,6 (р<0,05, критерий Стьюдента).
На 42-й день жизни у самцов отмечалось повышение исследовательской активности под влиянием пептида: в опытной группе было увеличено число стоек за 1-3 минуты тестирования (12,1±1,4 по сравнению с 8,0±1,2 в контрольной группе; F(l, 33)=4,8, р=0,04, ANO VA); у самок существенных эффектов пептида в этом возрасте отмечено не было.
Изменение уровня тревожности под влиянием хронического введения аналога ноцицептина отмечалось только у самок. На 35-й день жизни у самок опытной группы прн тестировании в «приподнятом крестообразном лабиринте» суммарное число свешнваний с края составило 2,5±0,6, а в контрольной группе - 4,6±1,3 (р<0,05, критерий х")- Это говорит о достаточно слабом (поскольку другие параметры поведения значимо не изменились) анксиоген-ном действии пептида в данном тесте.
В возрасте 50 дней у самок опытной группы суммарное время на свету составило 55,2±6,5 сек, а в контроле - 26,9±3,8 сек. Число выходов на освещенные рукава - 2,5±0,3 в опытной группе, 1,3±0,2 в контроле. Число выходов на край освещенного рукава - 1,9±0,4 в опытной группе, 0,4±0,2 в контроле. Число свешнваний - 6,3±0,7 в опытной группе, 3,6±0,5 в контроле (для всех вышеуказанных различий р<0,05, тест Стьюдента). Эти результаты свидетельствуют о сильном снижении уровня тревожности у самок опытной группы. Таким образом, в онтогенезе самок, получавших аналог ноцицептина в первые две недели жизни, по мере полового созревания анксиогенное действие пептида сменяется анксиолнтическим. Это хорошо согласуется со сменой направленности действия пептида на исследовательскую активность в тесте «открытое поле» по мере взросления, обнаруженной у этих же животных (см. выше).
Отставленное действие аналога ноцицептина на обучение с положительным подкреплением оказалось негативным у животных обоего пола. У самцов, хронически получавших аналог ноцицептина, число ошибок в первый день обучения в «сложном лабиринте» оказалось увеличено по сравнению с показателем контрольной группы (32,2±2,3 и 27,7±1,5 соответственно; р<0,05 по критерию у~). Однако уже на второй день обучения число ошибок в опытной группе сравнялось с контрольным значением. В начале обучения у крыс опытной группы также была отмечена повышенная ориентировочная активность, что проявлялось увеличением числа стоек. Повышенная вертикальная активность коррелировала с увеличением числа ошибок. При анализе корреляции между числом стоек и числом ошибок в первый день обучения в объединенной выборке (контрольные и опытные самцы) для каждой попытки корреляция оказалась статистически значимой (р<0,05); наименьший коэффициент корреляции между этими переменными отмечался при первой попытке (г=0,45), наибольший - при третьей (г=0,88). Таким образом, затрудненное обучение в первый день эксперимента у самцов, хронически получавших аналог ноцицептина, можно считать следствием повышенной ориен-
тировочно-исследовательской активности. При переучивании в «зеркальной» версии лабиринта у самцов опытной группы оказалось значимо увеличено среднее время реакции на второй день (9,2±1,1 по сравнению с 6,8±0,7 в контроле, р<0,05, тест х2). У самок также отмечалось нарушение обучения с пищевым подкреплением под действием тетрапептнда. У них было значимо больше ошибок за второй день обучения: 22,9±5,2 в опытной группе по сравнению с 10,4±2,2 в контроле (р<0,05 по критерию Стьюдента).
Действия хронического введения аналога ноцицептнна на обучение с отрицательным подкреплением и на уровень депрессивности не выявлено.
Все значимые эффекты пептида ГОСт1'-Ш12, обнаруженные при его остром и хроническом введении, представлены в таблице 3. Особенности изменения действия пептида на ориентировочную активность в тесте «открытое поле» в зависимости от возраста животных представлены в таблице 4. Таблица 3. Выявленные в различных тестах эффекты острого и хронического введения аналога ноцицептина у крыс разного возраста и пола.
Условные обозначения: ] - повышение, | - снижение, || - направленность эффектов меняется по мере взросления, = - значимого эффекта при введении пептида не обнаружено.
Эффекты госл-мь острое введение хроническое введение
самцы самки самцы самки
Локомоторная активность 1 1 1Т =
Ориентировочная активность 1Т И 1Т 1
Тревожность = = = ТА
Обучение с положительным подкреплением нет данных нет данных 1 1
Обучение с отрицательным подкреплением = = = =
Депрессивность = = = =
5. Особенности изменения действия пептидов на уровень ориентировочной активности на разных сроках постнаталыюго развития
В таблице 4 обобщены обнаруженные эффекты всех трех пептидов на ориентировочную активность крыс разного возраста в «открытом поле». Практически во всех случаях острое введение пептидов способствовало усилению ОИР в возрасте 42 дней. Кроме того, усиление ОИР в этом эксперименте отмечалось и у взрослых (старше 60 дней) беспородных самцов при введении сонморфнн-5-амида и аналога ноцицептина (см. рис. 4 и 6). При этом в раннем возрасте (21-28 дней) чаще отмечалось подавление ориентировочно-исследовательской активности при введении пептидов. Таким образом, при остром введении всех изученных пептидов подавление ориентировочно-исследовательской активности у крысят в раннем возрасте сменялось усилением ОИР в середине полового созревания (42 дня). Усиление ОИР сохранялось и у взрослых животных. Поскольку взрослых крыс тестировали в «открытом поле» только один раз, можно утверждать, что изменения направленности действия пептидов по мере взросления связаны в большей степени с возрастными изменениями в нервной системе животных, чем с фактором повторного тестирования или возможным кумулятивным действием пептидов при еженедельном введении.
При хроническом введении аналогичное изменение направленности действия пептидов с возрастом тоже прослеживается, но менее четко. В некоторых случаях на 42-й день отмечалось усиление ОИР, но чаще в этом возрасте не наблюдалось действия пептидов на ориентировочную активность, что можно объяснить постепенным «затуханием» отставленных эффектов пептидов, вводимых в раннем возрасте. В случае хронического введения чаще отмечалось разнонаправленное действие пептидов на самцов и самок. Больше всего изменений ориентировочно-исследовательской активности в сериях с хроническим введением пептидов (почти во всех случаях - уменьшение ОИР под действием пептидов) выявлено на 35-й день жизни. Согласно литературным данным, поведение нативных крыс в «открытом поле» резко изменяется в сторону снижения ОИР при достижении возраста 35-40 дней, предположительно, в связи с началом полового созревания и сопутствующим этому изменением гормонального фона (Ьт^еу, и.о^цег, 1970; Вгопь1ет. 1972). Вероятно, введение опиоидных пептидов в раннем постнатальном периоде вызывает некоторое ускорение таких гормональных процессов, в связи с чем ориентировочная активность в опытной группе в этом возрасте оказывается меньше, чем в контрольной.
Таблица 4. Действие пептидов на ориентировочно-исследовательскую активность животных в тесте «открытое поле» в зависимости от способа введения, пола и возраста.
1 Острое введение
Возраст эндомо рфнн-2 еойморфин-5-амид | аналогноцнцептина |
самцы самки самцы самки самцы самки
21 день т = = 1 =
28 день = 1 = =
42 день <___!___ 1 = т т т
! Хроническое введение |
Возраст 1 эндоморфин-2 | сойморфин-5-амид | | аналог ноцицептииа |
самцы самки самцы самки самцы самки 1
21 день = т = = Г
28 день — = = =
35 день = = т 1 1 1
42 день т = Г т ■Э1
6. Влияние блокаторов опиоидных и ОКЬгрецепторов на выраженность действия изученных пептидов при совместном введении
Действие блокаторов изучали на взрослых самцах крыс. Из предварительно проведенной батареи тестов выбирали тот эксперимент, в котором отмечались наиболее выраженные эффекты пептида, и использовали его при совместном введении пептида и блокатора.
6.1 Влияние предварительного введения налоксона на выраженность эффектов эндоморфина-2
В эксперименте «приподнятый крестообразный лабиринт» было использовано 33 самца. У животных в группе «эндоморфин-2» по сравнению с контролем было значимо увеличено число выходов на свет (см. рис. 3) и число выглядываний (6,5±1,2; контрольное значение — 3,1±1,0), что говорит о некотором снижении тревожности под действием пептида. На фоне предварительно введенного налоксона анксиолитический эффект пептида не проявнл-
ся: в группах «налоксон» и «налоксон+эндоморфин-2» число выглядываний составило 4,5±1,0 и 3,7±0,8 соответственно (р>0,5); число выходов на свет изображено на рис. 3. Таким образом, можно сделать вывод, что обнаруженные в «приподнятом крестообразном лабиринте» эффекты пептида опосредованы центральными опиоидными рецепторами (предположительно, преимущественно мю-типа).
1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0,0
6.2 Влияние предварительною введения налоксона на выраженность эффектов сойморфин-5-амида
В эксперименте «открытое поле» участвовало 33 самца. В группе «сойморфин-5-амид» было выявлено увеличение вертикальной активности по сравнению с группой «контроль» (рис. 4). Повышение числа стоек на второй минуте под влиянием сойморфин-амида достоверно (5,1 ±1,0 по сравнению с 2,1±0,5 в контроле, р<0,05, критерий Манна-Уитни), увеличение суммарного числа стоек значимо на уровне тенденции (р<0,1, критерий Манна-Уитни). В группе «сойморфин-5-амид+налоксон» вертикальная активность оказалась даже несколько меньше, чем в контроле (см. рис. 4). Таким образом, эффект от введения сойморфин-5-амида снимается предварительным введением налоксона. Это позволяет предположить, что механизм воздействия сойморфин-5-амида связан с центральными опиоидными рецепторами.
6.3.1 Влияние предварительною введения блока гора ноцицептино-вых рецепторов .1ТС-801 на выраженность эффектов аналога ноцицеп-тина РССР^Н2
В эксперименте «открытое поле» участвовало 40 самцов (линии \Vistar). Было отмечено снижение горизонтальной активности крыс под влиянием пептида. Однако блокатор ОЫ^-рецепторов Л'С-801, во-первых, не подавлял эффекты пептида, а во-вторых, сам обладал схожим действием на локомоторную активность животных (см. рис. 5А). Можно предположить, что влияние пептида на двигательную активность либо вообще не связано с О ИТ. 1 - рецепторами, либо (с учетом схожести эффектов пептида и .ТТС-801) пептид является не агонистом, а антагонистом данного рецептора. Введение РССР-ЫНг также вызвало увеличение числа умываний. Изменение суммар ного числа актов груминга не является значимым (р=0,2), но повышение числа умываний на 3 и 4 минутах теста (соответственно 3,9±0,8 по сравнению с
Р=0'04 р=0,09
Рис. 3. Действие эндоморфина-2 на уровень тревожности взрослых самцов в Г1КЛ на фоне предварительного введения налоксона. По оси ординат - число выходов на освещенные участки лабиринта (АМ±8ЕМ).
25
20 15
1,3±0,5 в контроле и 2,8±0,7 по сравнению с 1,4±0,4 в контроле) достоверно (р<0,05, ANOVA, F(l, 18)=7,0). При этом в группе «JTC-801+FGGF-NH2» число умываний оказалось существенно ниже (см. рис. 5Б). Таким образом, предварительное введение JTC-801 заблокировало действие пептида на гру-минг, но не на горизонтальную активность животных. Можно сделать предположение, что пептид FGGF-NH2 на некоторые изоформы рецептора ORL> действует как агонист, а на другие - как антагонист.
6.3.2 Влияние предварительного введения налоксона на выраженность эффектов FGGF-NH2
В эксперименте «открытое поле» участвовало 40 самцов (беспородных). Наиболее выраженным эффектом аналога ноцицептина в данном тесте стало увеличение числа исследованных «норок». На фоне предварительно введенного налоксона этот эффект не проявился (см. рис. 6). Исходя из полученного результата, можно предположить, что механизм действия пептида на проявления исследовательской активности включает в себя активацию опио-идных рецепторов (преимущественно ц-типа). Однако, согласно литературным данным (Mogil, Pasternak, 2001), прямое связывание пептида FGGF-NH? с этими рецепторами маловероятно: все известные пептидные лиганды классических опиатных рецепторов содержат на N-конце тирозин, и при замене тирозина на другую аминокислоту теряют способность активировать рецептор. Возможно, действие изученного пептида на опиатные рецепторы не прямое, а опосредовано пресинаптическими ORLr рецепторами, находящимися на опиоидергических терминалях в центральной нервной системе (Anton et al., 1996). Можно отметить (рис. 4 и 6), что налоксон обладает собственным действием на поведение животных, причем его эффекты могут иметь такую же направленность, как и эффекты изучаемых опиоидных пептидов. Это связано с тем фактом, что налоксон является не антагонистом, а частичным агонистом опиоидных рецепторов. Тем не менее, в тех экспериментах, где налоксон проявил себя как агонист опиатных рецепторов, при совместном введении пептида и налоксона эффекты этих веществ не суммируются. Вероятно, в данных случаях наблюдается компенсаторная десенсити-зация рецепторов в ответ на повышенную концентрацию лигандов.
□ контроль (п=8)
□ сойморфин-5-амид (п=8) Q налоксон (п=8)
И сойм+налокс (п=9)
Рис. 4. Действие сойморфин-5-амида на вертикальную активность взрослых самцов в «открытом поле» на фоне предварительного введения налоксона. По оси ординат — суммарное число стоек (АМ±5ЕМ).
р=0,08
р=0,04
Рис. 5. Действие FGGF-NH2 на поведение взрослых самцов в «открытом поле» на фоне предварительного введения JTC -801. По оси ординат - суммарное число пройденных сегментов (А) или суммарное число эпизодов груминга (Б) (AM±SEM).
р=0,02
А ЮО
р=0,046
р=0,001
□ контроль (п=10)
□ FGGF-NH2 (п=10) 0 налоксон (п=10)
И FGGF-NH2+Han (п=10)
Рис. б. Действие аналога ноцицептина на исследовательскую активность взрослых самцов в «открытом поле» на фоне предварительного введения налоксона. По оси ординат - суммарное число норковых реакций (АМ±8ЕМ).
□ контроль (п=10)
□ JTC-801 (п=10)
И FGGF-NH2 (п=10) И FGGF+JTC (п=10)
р=0,02
выводы
1. При системном введении эндоморфнн-2, сойморфин-5-амид и аналог но-цнцептнна проявили анальгетическое действие. Действие всех изученных пептидов блокировалось налоксоном. Таким образом, влияние пептидов на нервную систему связано с активацией опиоидных рецепторов, предположительно, р-типа. В случае аналога ноцицептина возможно косвенное действие на р-рецепторы через снятие торможения опиондергических нейронов при связывании непгида с рецепторами (ЖЬ; на этих нейронах.
2. При системном введении (как однократном, так и хроническом) всех изученных пептидов была выявлена зависимость выраженности и направленности эффектов от пола и возраста животных. Половой диморфизм в действии пептидов отмечался уже на 21-й день жизни. У всех трех пептидов при остром и (в меньшей степени) при хроническом способах введения была отмечена общая тенденция к подавлению ориентировочно-исследовательской активности у крысят в раннем возрасте, которое сменяется усилением ОИР в середине полового созревания (42 дня), отмечаемым и у взрослых животных.
3. Хроническое неонатальное введение эндоморфина-2, сойморфин-5-амида и аналога ноцицептина вызывает отставленные эффекты, сохраняющиеся в течение нескольких недель после окончания инъекций. Отставленные эффекты хронического введения пептидов в первые дни жизни меньше зависели от возраста животных по сравнению с последствиями острого введения, что позволяет предположить программирующее действие пептидов на созревание нервной системы в целом.
4. Эндоморфин-2 при остром введении детенышам белых крыс у самцов снижал локомоцню и уровень тревожности. У самок пептид повышал локо-моцию и ухудшал обучение. При хроническом неонатальном введении эндоморфин-2 у самцов подавлял локомоторную активность, усиливал тревожность и ухудшал обучение с положительным подкреплением. У самок эффекты хронического введения пептида были противоположны: он снижал тревожность и усиливал ориентировочно-исследовательскую активность, улучшал обучение (с положительным и с отрицательным подкреплением).
5. Сойморфин-5-амид при остром введении детенышам крыс усиливал тревожность у животных обоего пола. У самцов пептид оказывал антидепрес-сантное действие, у самок снижал локомоторную активность. При хроническом введении сойморфин-5-амид у самцов стимулировал ориентировочную активность, а также улучшал обучение с пищевым подкреплением, но ухудшал обучение с отрицательным подкреплением. У самок, напротив, пептид при хроническом введении подавлял ориентировочно-исследовательскую активность, ухудшал обучение с положительным подкреплением, а также снижал тревожность и усиливал проявления депрессивности.
6. Аналог ноцицептина при остром введении подавлял локомоторную активность детенышей крыс обоего пола. РССР-ИНг подавлял ориентировочную активность самцов в раннем возрасте, но по мере взросления (в промежутке между 28 и 42 днем жизни) наблюдалось обращение эффекта. У самок пептид усиливал ориентировочно-исследовательскую активность. При хроническом введении РООР-ЗЧНз подавлял двигательную и ориентировочную активность животных в раннем возрасте, но у самцов в 42 дня отмечалось обращение эффекта . Пептид ухудшал обучение с положительным подкреплением у крыс обоего пола.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Малышев, А.В. Поведенческие эффекты эндоморфина-2 при однократном и хроническом введении / А.В. Малышев, Н.И. Троянова, Е.А. Иванова (Чеснокова), В.А. Дубынин, НЛО. Сарычева, В.Н. Калихевич, З.А. Ардема-сова, А.А. Каменский // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2011. №4. С.41-45.
2. Иванова (Чеснокова), Е.А. Поведенческие эффекты оригинального тет-рапептнда — аналога N-концевого фрагмента ноцицептина / Е.А. Иванова (Чеснокова), Н.Ю.Сарычева, В.А. Дубынин, А.В. Малышев, В.Н. Калихевич,
3.А. Ардемасова, А.А. Каменский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 153. № 2. С. 141-145.
3. Чеснокова, Е.А. Действие новых аналогов ноцицептина на поведение белых крыс / Е. А. Чеснокова, П. К. Анохин, А. С. Воронкова, H. Ю. Сарычева, В. А. Дубынин, А. А. Каменский, Л. А. Андреева, Н. Ф. Мясоедов // Доклады Академии Наук. 2013. Т. 449. № 5. С. 610-613.
4. Чеснокова, Е.А. Влияние сойморфин-5-амида на поведение белых крыс / Е.А. Чеснокова, Н.Ю. Сарычева, В.А. Дубынин, А.А. Каменский, В.Н. Калихевич, З.А. Ардемасова // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология (в печати).
Публикации в других изданиях
1. Иванова (Чеснокова), Е.А. Влияние N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение лабораторных крыс при однократном введении / Е.А. Иванова (Чеснокова), А.В. Малышев // Материалы XIII школы-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии. Москва, 2009. С. 49.
2. Дубынин, В.А. Влияние тетрапептндов эндоморфнна-2 н N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей крыс / В.А. Дубынин, Е.А. Иванова (Чеснокова), Н И. Троянова, А.В. Малышев, В.Н. Калихевич, А.А. Каменский // Материалы IV российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань, 2009. С. 79.
3. Иванова (Чеснокова), Е.А. Влияние N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей лабораторных крыс при однократном введении / Е.А. Иванова (Чеснокова), А.В. Малышев // Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». Москва, 2009. С. 256.
4. Иванова (Чеснокова), Е.А. Влияние N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение лабораторных крыс разного пола и возраста при однократном введении / Е.А. Иванова (Чеснокова) // Материалы международной конференции студентов, аспирантов н молодых ученых «Ломоносов-2010». Москва, 2010. С. 271-272.
5. Ivanova (Chesnokova), Е.А. Delayed eiïects of nociceptin analogue administration to anxiety and learning in juvenile rats / E.A. Ivanova (Chesnokova), A.V. Malysliev, N.Y. Sarycheva, V.A. Dubynin, V.N. Kalikhevich, Z.A. Ardema-sova, A.A. Kamensky // The Journal of the European College of Neuropsycho-pharmacology. 2010. V. 20 Suppl. 3. P. S249.
6. Сарычева, Н.Ю. Влияние хронического введения эндоморфнна-2 и N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей белых крыс / Н.Ю. Сарычева, Е.А. Иванова (Чеснокова), А.В. Малышев // Материалы
XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Калуга, 2010. С. 544.
7. Иванова (Чеснокова), Е.А. Влияние хронического постнатального введения N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение белых крыс / Е.А. Иванова (Чеснокова), Н.Ю. Сарычева, A.B. Малышев, В.А. Дубынин, В Н. Калнхевнч, З.А. Ардемасова, A.A. Каменский // Материалы 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». Москва, 2010. С. 46.
8. Иванова (Чеснокова), Е.А. Влияние системного введения N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение белых крыс / Е.А. Иванова (Чеснокова), Н.Ю. Сарычева, A.B. Малышев, В.А. Дубынин, В.Н. Калнхевнч, З.А. Ардемасова, A.A. Каменский // Материалы конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов». Москва, 2010. С. 45.
9. Иванова (Чеснокова), Е.А. Влияние системного введения эндоморфина-2 на спонтанное поведение самцов и самок белых крыс / Е.А. Иванова (Чеснокова), A.B. Малышев, Н.Ю. Сарычева, В.А. Дубынин // Материалы 15-й Международной Пущинской школы-конференцни молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущине, 2011. С. 180-181.
10. Ivanova (Chesnokova), Е. Anxiogenic or anxiolytic effects of nociception analogue are dose-dependent and sex-specific / E.A. Ivanova (Chesnokova), N.Y. Sarycheva, V.A. Dubynin, V.N. Kalikhevich, Z.A. Ardemasova, A.A. Kamensky // The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 2011. V. 21 Suppl. 2. P. S145.
11. Иванова (Чеснокова), Е.А. Действие новых аналогов ноцицептина на двигательную активность белых крыс / Е.А. Иванова (Чеснокова), Н.Ю. Сарычева, В.А. Дубынин, A.A. Каменский, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Материалы V российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск, 2011. С. 311.
12. Сарычева, Н.Ю. Отставленное влияние хронического введения сой-морфпн-5-амида на обучение с положительным подкреплением / Н.Ю. Сарычева, Е.А. Иванова (Чеснокова), В.А. Дубынин, A.A. Каменский, В.Н. Калнхевнч, З.А. Ардемасова // Материалы V российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск, 2011. С. 215.
13. Chesnokova, Е.А. Delayed behavioral effects of soymorphin, a novel mua-gonist derived from soy protein, are sex-specific / E.A. Chesnokova, V.A. Dubynin, N.Y. Sarycheva, V.N. Kalikhevich, Z.A. Ardemasova, A.A. Kamensky, A.S. Voronkova // 8th FENS forum of neuroscience (Barcelona, July 2012).
http:// fens.ekonnect.co/FENS_33 l/poster_34199/program.aspx
14. Чеснокова, E.A. Отставленные эффекты N-концевого фрагмента ноцицептина FGGF-NH2 при хроническом интраназальном введении / Е.А. Чеснокова, A.C. Воронкова, Н.Ю. Сарычева, В.А. Дубынин, В.Н. Калихевич, З.А. Ардемасова, A.A. Каменский // Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». Казань, 2012. С. 196.
15. Анохин, П.К. Новый синтетический аналог N-концевого фрагмента ноцицептина Phe-Gly-Gly-Phe-Val-Gly-Pro: регуляция болевой чувствительности при стрессе // П.К. Анохин, H.ÍO. Сарычева, Е.А. Иванова (Чеснокова),
B.А. Дубынин, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Материалы IV Съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». Казань, 2012.
C. 13.
16. Анохин, П.К. Синтетические аналоги ноцицептина в регуляции стресс-вызванной аналгезии у крыс / П.К. Анохин, Е.А. Чеенокова // Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». Москва, 2013. С. 315-316.
17. Chesnokova, Е.А. Opioid peptides endomorphin-2 and soyшoфhin-5-amide are able to cross blood-brain barrier after intraperitoneal administration / E.A. Chesnokova, V.A. Dubynin, N.Y. Sarycheva, V.N. Kalikhevich, Z.A. Ardemaso-va, A.A. Kamensky // Journal ofNeurochemistry. 2013. V. 125, Suppl. 1. P. 229.
18. Чеенокова, Е.А. Развитие поведенческих эффектов эндоморфина-2 во времени / Е.А. Чеенокова, Н.Ю. Сарычева, В.А. Дубинин, А.В. Малышев, В.Н. Калихевич, З.А. Ардемасова, А.А. Каменский // Материалы VI Российского симпозиума «Белки и пептиды». Уфа, 2013. С. 242.
Список сокращений
ОИР - ориентировочно-исследовательская реакция
ЛП — латентный период
ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт
УРПИ - условная реакция пассивного избегания
AM - average mean
ANOVA - ANalysis Of VAriance
i.c.v. - интрацеребровентрикулярно
ORLi - opioid receptor-like receptor 1
SEM - standard error of mean
ООО «Хорошая типография» Подписано в печать 5.09.13, тираж 100 г. Москва, ул. Валовая, д. 14, стр. 8 Тел.: 8(495) 940-70-17 e-mail: 2202758@mail.ru www.niceprint.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чеснокова, Екатерина Алексеевна, Москва
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА
Биологический факультет
На правах рукописи
04201361464
ЧЕСНОКОВА Екатерина Алексеевна
ВЛИЯНИЕ ЭНДОМОРФИНА-2, СОЙМОРФИНА И ]Ч-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА НОЦИЦЕПТИНА НА ПОВЕДЕНИЕ ДЕТЕНЫШЕЙ БЕЛЫХ КРЫС
Специальность 03.03.01 - физиология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель -к.б.н., с.н.с. Н.Ю. Сарычева
МОСКВА-2013
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................10
1. Опиоидная медиаторная система и исследуемые в работе опиоидные пептиды.. 10
Общие свойства опиоидных рецепторов. Типы опиоидных рецепторов...................10
Онтогенез опиоидной и ноцицептиновой систем мозга..............................................23
Пептидные лиганды опиоидных рецепторов. Их проникновение через кишечный и
гемато-энцефалический барьеры...................................................................................28
Эндоморфины и их опиоидные свойства......................................................................31
Сойморфины и их опиоидные свойства........................................................................37
Антиопиоидный пептид ноцицептин - лиганд рецептора ORLj................................39
2. Зависимость поведения лабораторных крыс от пола, возраста, схемы введения препаратов и сроков тестирования. Зависимость эффектов опиоидных пептидов от
этих факторов...................................................................................................................46
Зависимость поведения лабораторных крыс от пола...................................................46
Различия в действии опиоидных лигандов на животных разного пола.....................48
Зависимость поведения лабораторных крыс от возраста............................................50
Эффекты повторного тестирования...............................................................................51
Отставленные эффекты фармакологических препаратов при неонатальном введении............................................................................................................................54
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................57
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................................68
Острое и хроническое введение эндоморфина-2..........................................................68
Острое и хроническое введение сойморфин-5-амида..................................................98
Острое и хроническое введение аналога ноцицептина FGGF-NH2..........................124
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................................150
Влияние острого введения пептидов на поведение детенышей крыс
разного возраста.............................................................................................................150
Влияние хронического неонатального введения пептидов на поведение детенышей
крыс разного возраста...................................................................................................165
ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................174
ВЫВОДЫ..............................................................................................................177
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................179
Список основных сокращений
ГЭБ - гемато-энцефалический барьер ЛП - латентный период
ОИР - ориентировочно-исследовательская реакция ОП - открытое поле
ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт СЛ - сложный лабиринт
УРПИ - условная реакция пассивного избегания
ЦНС - центральная нервная система
ANOVA - ANalysis Of Variance
BDNF - brain-derived neurotrophic factor
DMSO - диметилсульфоксид
i.c.v. - интрацеребровентрикулярно
N/OFQ - nociceptin/orphanin FQ
NTS - nucleus tractus solitarius
ORLi - opioid receptor-like receptor 1
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
В настоящее время в организме человека и животных обнаружены сотни эндогенных олигопептидов. Короткие пептиды действуют на всех уровнях межклеточной сигнализации - от ауто- и паракринного до гормонального. В нервных клетках пептиды могут служить нейромедиаторами или модуляторами действия медиаторов иной химической природы (Ашмарин, 1996). Некоторые пептиды, обладающие биологической активностью, не являются эндогенными, а всасываются в кровь через слизистую кишечника после неполного расщепления белков пищи (Hartmann, Meisel, 2007). Доля пептидов среди продуктов ферментативного расщепления белков особенно велика в кишечнике грудных детей в связи с возрастными особенностями пищеварения (Зуфаров, 1998).
Одной из наиболее активно изучаемых групп регуляторных пептидов является семейство опиоидов. Эндогенные опиоидные пептиды играют важную роль в контроле болевой чувствительности, врожденных поведенческих реакций, обучения и других функций центральной и периферической нервной системы. Опиоидные пептиды, попадающие в организм с пищей, объединяются под общим названием «экзорфины». У ряда опиоидных пептидов обнаружены не только эффекты, проявляющиеся сразу после введения, но и отставленное действие, регистрируемое через несколько недель и даже месяцев после получения пептида. Отставленные эффекты особенно выражены при хроническом введении пептида в раннем возрасте (Малиновская, 2001; Беляева, 2008).
Все опиоидные пептиды обладают рядом общих свойств, но отличаются друг от друга по первичной структуре и по сродству к разным типам опиоидных рецепторов, а следовательно, и по спектру физиологического действия. При изучении влияния пептидов на центральную нервную систему обычно используют интрацеребровентрикулярный (i.c.v.) способ введения, гарантирующий попадание рассматриваемого вещества в мозг в нужной дозе. Однако i.c.v. введение плохо подходит для изучения поведения, поскольку эксперимент включает хирургическую операцию по вживлению канюли, вызывающую сильный стресс у подопытных животных. В то же время внутрибрюшинная инъекция является одним из наименее травматичных способов введения веществ и при этом обеспечивает
высокую их биодоступность. Данных о действии оииоидных пептидов на ЦНС при системном способе введения в литературе в настоящее время мало. При этом многие пептиды с высокой вероятностью являются потенциально пригодными для применения в фармацевтике в качестве препаратов для мягкой коррекции разнообразных нарушений, в том числе заболеваний нервной системы (Левицкая, Каменский, 2003). С другой стороны, при некоторых особенностях диеты избыток экзорфинов, попадающих в организм (особенно детский) с пищей, потенциально может оказывать нежелательные эффекты. Опиоидные фрагменты растительных пищевых белков рассматриваются в качестве факторов, способствующих развитию аутизма и даже синдрома внезапной остановки дыхания (КлсИ е1 а1., 2002). Это подтверждает актуальность изучения как немедленного (развивающегося в течение минут-часов после введения), так и отставленного (наблюдаемого через недели и даже месяцы) эффектов, наблюдаемых при системном введении различных опиоидных пептидов экспериментальным животным, в особенности - детенышам. Представляется важным, во-первых, подтвердить или опровергнуть наличие влияния пептидов на поведение при выбранном способе инъекции; во-вторых, попытаться оценить баланс положительных и отрицательных (с точки зрения возможного применения в клинике) последствий введения пептидов на разных этапах постнатального развития.
Цель и задачи исследования
Целью представленной диссертационной работы явился анализ поведенческих эффектов трех олигопептидов опиоидной природы при однократном и хроническом системном (внутрибрюшинном) введении белым крысам на разных этапах постнатального развития. Исследовались пептиды УРБР-НН2 (эндогенный эндоморфин-2), УРРУУ-МН2 (амидированный экзогенный пептид сойморфин) и РООР-1ЧН2 (амидированный ]Ч-концевой фрагмент эндогенного пептида ноцицептина). Изучались как немедленные (при остром введении), так и отставленные (при хроническом введении в первые 14 дней постнатального развития) эффекты пептидов.
В работе были поставлены следующие задачи:
• изучить влияние острого введения вышеуказанных пептидов на врожденные формы поведения (исследовательскую активность, уровень тревожности, поведенческие проявления депрессивности и болевую чувствительность) детенышей крыс и сравнить полученные результаты с последствиями острого введения этих же пептидов взрослым крысам;
• изучить отставленное действие хронического введения пептидов в первые дни жизни на те же параметры врожденного поведения экспериментальных животных;
• исследовать эффекты острого и хронического введения пептидов в экспериментах с обучением детенышей крыс новым навыкам;
• установить участие опиоидных рецепторов в развитии обнаруженных эффектов пептидов с помощью фармакологических блокаторов этих рецепторов.
Научная новизна
Практически все полученные нами результаты можно классифицировать как новые и не имеющие аналогов в литературе. Работа является продолжением скрининга пептидных лигандов опиоидных рецепторов, начатого в нашей лаборатории еще в 1980-х годах.
Пептид FGGF-NH2, являющийся укороченным аналогом молекулы ноцицептина, исследован впервые. В литературе нет данных о действии этого пептида в экспериментах in vivo, хотя более длинные фрагменты молекулы ноцицептина активно изучаются. Такая модификация пептида была выбрана нами для работы, потому что малый размер молекулы увеличивает ее потенциальную способность преодолеть гемато-энцефалический барьер, а амидирование повышает устойчивость пептида к пептидазам, содержащимся в крови и тканевых жидкостях. Пептид сойморфин-5 из группы экзорфинов был обнаружен в 2007 году, и о его влиянии на организм до сих пор известно очень мало. В опытах на мышах показано анксиолитическое действие сойморфина, а также его способность подавлять пищевую мотивацию (Ohinata et al., 2007; Kaneko et al., 2010). В нашей работе использовался амидированный аналог сойморфина-5. Эндогенный амидированный пептид эндоморфин-2 изучен достаточно подробно, но его эффекты при системном введении исследуются впервые. Учитывая литературные данные о действии
эндоморфина при центральном введении, можно с большой вероятностью предсказать ожидаемые последствия системного введения этого пептида. Поэтому эндоморфин-2 можно рассматривать как вещество сравнения для двух других пептидов.
В представленной работе впервые показано, что все изученные пептиды при остром системном введении оказывают влияние на баланс ориентировочно-исследовательской активности и тревожности. При этом была выявлена общая для всех пептидов тенденция: подавление ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) у крысят в раннем возрасте, сменяющееся усилением ОИР в середине полового созревания (возраст 42 дня), отмечаемым и у взрослых животных. Для всех изученных пептидов при хроническом введении выявлено отставленное действие на способность крыс к обучению, зависимое от пола. Отрицательное влияние на обучение отмечалось чаще, чем положительное. Впервые обнаружено, что все три рассмотренных пептида при системном введении проявляют анальгетическое действие. Впервые показано, что на фоне налоксона поведенческие эффекты от системного введения всех трех изученных пептидов не проявляются, что подтверждает участие опиоидных рецепторов в реализации этих эффектов.
Несмотря на ряд общих закономерностей, большинство полученных результатов указывает на значительные отличия физиологической активности исследованных пептидов в сравнении друг с другом. Причиной этого, очевидно, являются различия их первичной структуры, а следовательно — разная селективность по отношению к потенциальным мишеням: опиоидным рецепторам ц-, 5- и к-типов, а также к ноцицептиновому рецептору СЖЬ! (и разным изоформам каждого типа рецепторов). В большинстве случаев направленность эффектов эндоморфина-2 и сойморфин-5-амида зависела от пола животных. В случае аналога ноцицептина также было отмечено влияние фактора пола животных на выраженность эффектов, но реже отмечалась разная направленность действия пептида на самцов и самок.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли опиоидных пептидов разных групп. Показана способность амидированных олигопептидов вызывать центральные эффекты при внутрибрюшинном способе введения. Показано, что опиоидные пептиды при попадании в организм детенышей млекопитающих способны оказывать существенное нейротропное (изменяющее поведение) действие. В первую очередь, это относится к уровню исследовательской активности, тревожности, а также способности к обучению. В значительной части случаев это действие имеет отставленный характер, проявляется через несколько недель после окончания введения пептида и сохраняется в течение длительного времени. Большинство обнаруженных эффектов оказались негативными с точки зрения применения в клинике (усиление тревожности, нарушение способности к обучению и др.) При исследовании немедленных последствий введения пептидов показана зависимость эффектов не только от пола, но и от возраста подопытных животных, что увеличивает объем имеющейся информации о возрастных изменениях опиоидной медиаторной системы. Практическая значимость представленной работы связана с выявлением ряда негативных отставленных эффектов от введения опиоидных пептидов в раннем возрасте. Это информация, которую следует учитывать при оценке побочного действия белковых компонентов искусственных смесей для питания новорожденных. Согласно полученным нами результатам, опиоидные пептиды, попадающие в организм в первые дни жизни, являются физиологически значимыми факторами, от присутствия которых зависит реализация многих важнейших поведенческих реакций детеныша. Известно, что даже достаточно длинные пептиды у новорожденных детей всасываются из пищеварительного тракта в кровь в относительно больших количествах (Зуфаров, 1998). С учетом этого факта наши результаты подтверждают необходимость контроля за содержания в заменителях молока белков, содержащих опиоид-подобные последовательности (в частности, широко применяемых в смесях для детского питания соевых белков).
Апробация работы
Результаты представленного диссертационного исследования доложены и обсуждены на XIII школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009), на IV, V и VI российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Казань, 2009; Петрозаводск, 2011; Уфа, 2013), XVI и XVII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (Москва, 2010), 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), 23-м международном конгрессе ECNP (Амстердам, 2010), 11-й региональной конференции ECNP (Санкт-Петербург, 2011), 8-м Международном форуме FENS (Барселона, 2012), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 24-й Международной конференции ISN/ASN (Канкун, 2013), а также на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 204 страницах, содержит 28 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 340 источников, из них 27 отечественных.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Опиоидная медиаторная система и исследуемые в работе опиоидные
пептиды
1.1 Общие свойства опиоидных рецепторов. Типы опиоидных
рецепторов.
Опиоидные пептиды в настоящее время считаются наиболее изученной группой сигнальных веществ пептидной природы. Их название происходит от опиума — известного несколько тысяч лет наркотического препарата, получаемого из мака Papaver somniferum. Опиум вызывает обезболивание, успокоение и засыпание, а также эйфорическое состояние. Передозировка может вызвать остановку дыхания. Основной действующий компонент опиума, алкалоид, названный морфином (рис. 1), был выделен в 1804 г. Фридрихом Сертюрнером (Sertürner, 1806). Позднее были синтезированы химические аналоги морфина — опиаты, а также антагонисты морфина, наиболее известным из которых является налоксон (рис. 1). (Линский и др., 2009). В 1970-е годы были найдены специфические мишени морфина в организме — опиоидные (опиатные) рецепторы. На сегодняшний день выделяют 4 основных типа опиоидных рецепторов (см. стр. 17). Эти рецепторы являются потенциальными мишенями не только для болеутоляющих препаратов, но и для антидепрессантов, анксиолитиков и лекарств для снятия наркотической зависимости. Эндогенные лиганды опиатных рецепторов были обнаружены сравнительно недавно (во второй половине XX века). Они являются веществами пептидной природы. В настоящее время известно несколько классов опиоидных пептидов, отличающихся п
-
Чеснокова, Екатерина Алексеевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2013
-
ВАК 03.03.01
- Экспериментальное моделирование нарушений материнского поведения и поиск путей их коррекции
- Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина
- Нейротропные эффекты β-казоморфина-7 при хроническом и остром введении детенышам белых крыс
- Влияние опиоидных пептидов пищевого происхождения на поведение детенышей белых крыс
- Экзогенная регуляция пищевого поведения детенышей млекопитающих в лактотрофный период
