Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина

Ковалицкая, Юлия Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

КОВАЛИЦКАЯ ЮЛИЯ АНДРЕЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ - АГОНИСТОВ НЕОПИОИДНОГО РЕЦЕПТОРА р-ЭНДОРФИНА

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАИ.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

доктор биологических наук Е.В. Наволоцкая

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор В.И. Цетлин академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор A.A. Яршгап

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится "_" __ 2006 г. в_часов

на заседании Специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «_

2006 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук, профессор

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Открытие Виктором Найяром в 1970 г эндогенного тетрапептида тафтсина (ТКРЯ, фрагмент 289-292 Сш- домена тяжелой (Н) цепи иммуноглобулина в человека (1§С)), обладающего одновременно иммуностимулирующей и нейротропной активностями, явилось стимулом для поиска новых биологически активных пептидов в ряду фрагментов и аналогов иммуноглобулинов. Через десять лет Джек Джуллиард обнаружил в составе тяжелой цепи ^О человека р-эндорфинподобную последовательность (ЗЬТСЬУКСРУРЗО!, фрагмент 364-377 Снз-домена Н-цепи ^О человека 1-4 подклассов). В нашей лаборатории был синтезирован дскапептид ЗЬТСЬУКОРУ (авторское название - иммунорфин) и показано, что он является селективным агонистом неопиоидного (не чувствительного к опиоидному антагонисту налоксону) рецептора р-эндорфина. Рецепторный аппарат живой клетки - это сложно организованная система, построенная из специализированных рецепторов, которые получают и переводят на язык молекул непрерывный поток информации из внешней и внутренней среды, обеспечивая координацию работы нейроэндокринной, иммунной, сердечно-сосудистой и других систем организма. Понятно, что чем больше мы будем знать о структуре и функции каждого отдельного рецептора, тем более полным и детальным будет наше представление о механизмах функционирования клетки, органа, системы органов и организма в целом. Поэтому открытие и изучение новых неизвестных ранее клеточных рецепторов является актуальным направлением раззития современной биохимии. Изучение свойств и механизма действия синтетического пептида иммунорфина и его активных аналогов позволит исследовать распределение и функции неопиоидного рецептора Р-эндорфина в организме человека и млекопитающих.

В настоящее время на основе производных природных пептидных гормонов уже создано и успешно применяется в клинике несколько десятков эффективных и безопасных лекарственных препаратов. Ценными качествами пептидов как потенциальных лекарственных средств нового поколения являются высокая активность, быстрая реакция организма на их введение в сочетании с практически полным отсутствием токсичности, иммуногенности и аллергенпости. Получение и изучение новых пептидов с простой структурой (состоящих из нескольких аминокислотных остатков), высокой устойчивостью к действию протеаз (долгоживущих) и обладающих ценными фармакологическими свойствами - важнейшая задача современной биохимии. В этой связи, изучение спектра биологической активности и механизма действия иммунорфина и его активных производных является актуальным исследованием, результаты которого могут быть использованы на практике при создании новых лекарственных препаратов.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение свойств и механизма действия синтетического ß-эндорфинподобного пептида иммунорфина и его активных фрагментов и аналогов. Основные задачи исследования:

1. Изучение влияния иммунорфина, пентарфина (фрагмента иммунорфина 6-10) и циклопентарфина на активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro.

2. Исследование влияния иммунорфина на активность клеток коры надпочечников крысы in vitro и in vivo.

3. Изучение влияния пентарфина, циклопентарфина [cyclo(VKGFY)] и циклодипентарфина [cyclo(VKGFYVKGFY)] на доимплантационное развитие зародышей мыши in vitro.

4. Получение [3Н]иммунорфина и 1231-меченного пентарфина и исследование их связывания с перитонеальными макрофагами мыши и мембранными фракциями, выделенными из различных органов крысы.

Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством того, что ß-эндорфинподобный пептид иммунорфин, соответствующий аминокислотной последовательности 364-373 тяжелой цепи IgG человека, является селективным агонистом неопиоидного (не чувствительного к налоксону) рецептора ß-эндорфина. Впервые охарактеризовано распределение данного рецептора в организме крысы, и установлена его функция в клетках коры надпочечников.

Приоритетными являются данные о стимулирующем действии иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на фагоцитоз перитонеальными макрофагами мыши вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro.

Впервые показано, что пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин стимулируют деление бластомеров и ускоряют развитие доимплантационных зародышей мыши in vitro.

Практическая ценность результатов работы. Ученые и клиницисты во всем мире рассматривают биологически активные пептиды как потенциальные лекарственные средства нового поколения. С этих позиций ценной может оказаться способность иммунорфина и его фрагментов стимулировать бактерицидную активность макрофагов: вполне вероятно, что использование данных пептидов или их производных совместно с антибиотиками позволит снизить терапевтические дозы, а значит и многочисленные негативные последствия применения последних.

Благодаря ярко выраженному положительному влиянию на доимплантационное развитие зародышей пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин могут найти

применение в экспериментальной эмбриологии в качестве средств повышения жизнеспособности рапних эмбрионов.

Поскольку иммунорфин и его фрагменты являются селективными агонистами неопиоидного рецептора p-эндорфина, они могут быть успешно использованы в качестве инструмента выявления и исследования данного типа рецептора на различных типах клеток.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международном конгрессе "Цитокины и интерфероны" ("Joint Meeting of the International Society for Interferon and Cytokine Research", Турин, Италия, 2002); на Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); на V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); на XV зимней Международной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003); на Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2003, 2004, 2005); на II Московском Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003); на Международной конференции "Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина" (Пущино, 2004); на Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005); на И Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005): на I Международном междисциплинарном конгрессе "Достижения нейронауки для современной медицины и психологии" (Крым, Украина, 2005); на Международной конференции по изучению аминокислот и белков ("The Forum for Amino Acid and Protein Research", Вена, Австрия, 2005); на 29-ом Европейском симпозиуме но пептидам (29th European Peptide Symposium, Гданьск, Польша, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 17 таблиц. Библиографический указатель содержит 172 источника литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние иммунорфина, пентарфина и цнклопснтарфина на функциональную активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro

Р-Эндорфинподобный пептитид иммунорфин представляет собой фрагмент 364-373 тяжелой цепи IgG (рис. 1), поэтому в первую очередь, мы изучили влияние иммунорфина и его фрагментов на клетки иммунной системы. В исследованиях были использованы наиболее активные фрагменты и аналоги иммунорфина - пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин.

1 ю 20 30

Р-Эндорфин YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNVHKKGQ

364 377

Ни IgG (364-377) -SLTCLVKGFYPS DI-

1 ю

Иммунорфин SLTCLVKGFY

1 5

Пентарфин VKGFY

Рис. 1. Аминокислотные последовательности (3-эндорфина, фрагмента 364-377 тяжелой цепи IgG, иммунорфина и пентарфина. Совпадающие аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.

Нами было изучено влияние иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на функциональную активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro. Мы изучили влияние иммунорфина и p-эндорфина на спонтанную миграцию клеток мышиной макрофагподобной линии WEHi-З из капли агарозы in vitro. Было установлено, что р-эндорфин проявляет хемотаксические свойства в диапазоне концентраций 10"" - 10"' М: в присутствии пептида количество клеток, вышедших из капли агарозы, было на 50-60% больше, чем в контрольных экспериментах (р < 0,05) (рис. 2). При увеличении концентрации Р-эндорфин не оказывал влияния на спонтанную миграцию клеток из капли агарозы. Иммунорфин в диапазоне концентраций 10"'° — 10~6 М увеличивал выход макрофагов из капли агарозы, и это действие было дозозависимым (р < 0,01). Максимальная миграция клеток наблюдалась при концентрациях пептида 10"8 - 10"6 М и составила 170-180% по отношению к контролю (рис. 2).

Результаты, представленные на рис. 3, показывают, что инкубация перитонеальных макрофагов мыши с пентарфином и циклопентарфином в концентрации 1 нМ приводит к увеличению способности макрофагов прилипать к пластику (на 30 и 20%, соответственно).

2,51 2,0 1,5 1,0 0,5

0,0'

10"" 10'" 1x10"'° 1x10"* 1x10"* 1x10"' 1x10"" 1x10"'

[Пептид], М

Рис 2. Влияние иммунорфина (1) и р-эндорфина (2) на спонтанную миграцию клеток мышиной макрофагподобной линии WEHi-З из капли агарозы in vitro. Приведены данные 5 независимых экспериментов среднее значение ± стандартное отклонение.

1,6 л 1.4

1 1,24

2 1,о t

i 0,8

1 0,6

п £

I °'4 0,2

0,0

Контроль

: .ч-к:

iiiiii . f.

Пентарфин

Цикло-пвнтарф ин

1 • * -I 1 .2 1 .0 0,8 0,6 0,4 -0.2 -0,0

Контроль

-К*«!

¡¡¿.Г

П еитарф ин

пентарф ин

Рис. 3. Влияние пентарфина и циклопентарфина в концентрации ] нМ на адгезию (а) и распластывание (б) перитонеальных макрофагов in vitro. Приведены данные 3 независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

Кроме того, при культивировании клеток с пентарфином количество распластанных макрофагов, имеющих звездчатую форму, возрастало на 25%, а в случае циклопентарфина -на 20% (рис. 3).

На следующем этапе работы нами было изучено влияние пентарфина и циклопентарфина на бактерицидную активность перитонеальных макрофагов мыши. Была использована модельная система фагоцитоза перитонеальными макрофагами мыши бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurivm 415 in vitro. Положительным контролем служил тафтсин, который стимулирует бактерицидную функцию макрофагов при фагоцитозе различных бактерий. В экспериментах были использованы пентарфин и циклопентарфин в концентрации 0,1, 1 и 10 нМ, и тафтсин в концентрации 10 и 100 нМ. В табл 1. представлены значения основных показателей (фагоцитарная активность - ФА, цитопатическое действие бактерий - ЦПД> и фагоцитарное число - ФЧ), характеризующие фагоцитоз сальмонелл макрофагами без пептидов (контроль), в присутствии пентарфина (1 нМ) и циклопентарфина (1 нМ), и тафтсина (100 нМ). При этих концентрациях пептидов получены наиболее интересные результаты. Видно, что в контроле макрофаги активно фагоцитировали бактерии этого штамма: через 2 часа в фагоцитозе участвовало более 2/3 общего числа макрофагов (ФА 72,7 ±1,1 %); при этом каждый фагоцит содержал в среднем 10 микроорганизмов (ФЧ 10,2 ± 0,2). Однако переваривания поглощенных микробов не происходило. Более того, сальмонеллы продолжали активно размножаться внутри фагоцитов, о чем свидетельствует увеличение ФЧ с 10,2 ± ОД до 15,5 ± 0,3 между 2 и 7 часами фагоцитоза. Заражение монослоя продолжалось 2 часа, затем среду заражения заменяли средой культивирования, поэтому, начиная с этого момента, увеличение ФЧ могло происходить, в основном,'за счет размножения ранее поглощенных микробов. Массовая гибель фагоцитов наблюдалась уже к 7 часу фагоцитоза (ЦПД 66,7 ± 0,6%), к 12 часу весь монослой макрофагов был разрушен (ЦПД 100%). Таким образом, в контроле взаимодействие сальмонелл и макрофагов заканчивалось гибелью последних.

В присутствии пентарфина или циклопентарфина в концентрации 1 нМ характер взаимодействия сальмонелл и макрофагов коренным образом изменялся: переваривающая способность макрофагов возрастала настолько, что к 7-му часу фагоцитоза ЦПД составляло 10,2 ± 1,2 и 2,2 ±1,3 для пентарфина и циклопентарфина соответственно, а к 12 часу макрофаги переваривали все поглощенные микробы (ЦПД 2,4 ± 1,2% и ~0 % в присутствии пентарфина и циклопентарфина, соответственно) (табл.1).

Таблица 1. Влияние пентарфина и циклопентарфина на фагоцитоз бактерий вирулентного штамма S. typhimurium 415 перитонеальными макрофагами мыши in vitro

Пептид Время фагоцитоза, ч ФА*, % ЦПД*, % ФЧ*

Контроль 1 2 4 7 12 65,3 ± 1,1 72,7 ± 1,1 62,3 ± 1,3 29,0 ± 0,9 0 1,3 ±0,7 13,7 ±0,7 35,7 ±1,4 66,7 ± 0,6 100 3,9 ± 0,1 10,2 ±0,2 11,2 ± 1,0 15,5 ±0,3

Пентарфин (1 нМ) 1 2 4 7 12 84.1 ±2,1 89.2 ± 1,8 66,8 ±1,1 23.3 ± 0,8 3,7 ±0,6 1,1 ±0,7 1,6 ±0,7 9.3 ± 1,3 10,2 ± 1,2 2.4 ± 1,2 7,1 ± 0,2 9,3 ± 0,7 6,0 ± 0,6 1,0 ± 0,2 0,7 ±0,1

Циклопентарфин (1 нМ) 1 2 4 7 12 87,8 ±3,1 91.3 ±2,2 57.4 ± 2,0 1,7 ±0,4 0,8 ± 0,4 1,3 ±0,6 1.1 + 0,5 2,1 ± 0,6 2.2 ± 1,3 0 7,8 ± 0,4 8,8 ± 0,3 5,3 ± 0,5 0,3 ± 0,2

Тафтсин (100 нМ) 1 2 4 7 12 66,1 ±1,8 74,1 ±1,4 62,0 ±1,2 38,5 ± 0,2 9,3 ± 0,3 1,4 ±0,3 8,1 ± 1,0 29,3 ± 0,8 31,5 ±1,2 7,6 ± 1,4 5,8 ± 0,3 7,3 ± 0,3 6,3 ± 0,5 3.3 ± 0,6 1.4 ±0,9

* среднее значение ± стандартное отклонение

Сравнение показателей фагоцитоза для пентарфина и циклопентарфина показывает, что активность последнего была существенно выше.

Протестированный параллельно тафтсин также увеличивал переваривающую способность макрофагов, но при концентрации в 100 раз большей, чем концентрации пентарфина и циклопентарфина (табл.1). В присутствии тафтсина в концентрации 100 нМ количество фагоцитов, разрушенных внутриклеточными сальмонеллами к 7 часу фагоцитоза, было вдвое меньше, чем в контроле (соответствующие значения ЦПД 31,5 ± 1,2 и 66,7 ± 0,6%). К 12 часу фагоцитоза ЦПД составляло 7,6 ± 1,4%, при этом около 10% фагоцитов содержало в среднем по 1,4 ± 0,9%, не переваренных микроорганизмов. Таким образом, пентарфин и циклопентарфин были, по крайней мере, в 100 раз активнее таф геина.

На основании полученных данных можно заключить, что иммунорфин, пентарфин и циклопентарфин стимулируют способность макрофагов к адгезии, распластыванию, миграции и увеличивают их бактерицидность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415.

Чтобы ответить на вопрос, о механизме стимулирующего действия исследуемых пептидов на макрофаги, нами были получены [3Н]иммунорфин и 1251-меченный пентарфин и

изучено взаимодействие этих соединений с перитонеальными макрофагами мыши. Оказалось, что [}Н]иммунорфин и 1251-меченный пентарфин связываются на поверхности макрофагов с одним типом рецептора, т.к. график Скэтчарда в обоих случаях имеет вид прямой линии, Ю= 3,6 ± 0,3 и К<|= 2,4 + 0,1 для 1251-меченного пентарфина и [эН]иммунорфина соответственно (рис.4).

В №

0,25 0,20 0,15 0,10 0,05

0,00

0,0

0,1

К » 2,4 + 0,1 нМ

0,2

0,3

0,4

—I—

0,5

В, НМ

Рис. 4. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания 1-меченного пентарфина (а) и [3Н]иммунорфина (6) с перитонеальными макрофагами мыши. В и И -молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно.

При расчетах плотности рецепторов в обеих тест-системах получены практически одинаковые значения, 27780 ± 560 и 28000 ± 300 рецепторов на клетку (для [3Н]иммунорфина и ш1-меченного пентарфина соответственно), что свидетельствует о достоверности

полученных результатов. Было показано, что на взаимодействие [3Н]иммунорфина и 1251-меченного пентарфина с макрофагами не влияли немеченые налоксон и [МеГ]энксфалин, в то же время немеченые р-эндорфин, циклопентарфин и [Рго3]пентарфин ингибировали связывание на 100% (табл. 2, 3). Следовательно, действие пентарфина и циклопентарфина на макрофаги опосредовано через общие не чувствительные к налоксону рецепторы, которые с высоким сродством связывают также иммунорфин и р-эндорфин.

Таблица 2. Ингибирование связывания [3Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши немечеными пептидами и налоксоном

Лиганд Ьм, нМ* К;, НМ*

['Н]иммунорфин 2,4 ± 0,1 -

Р-эндорфин - 2,9 ± 0,2

Пентарфин - 2,7 ± 0,2

Циклопентарфин - 2,6 ± 0,2

[Рго^пентарфин - 3,0 ± 0,2

Налоксон - > 105

[Ме13]энкефалин - > 10*

* среднее значение ± стандартное отклонение

Таблица 3. Ингибирование связывания 1251-меченного пентарфина с перитонеальными макрофагами мыши немечеными лигандами и налоксоном

Лиганд К„ (нМ)* К| (нМ)*

1251-меченый пентарфин 3,6 ± 0,3 -

Циклопентарфин - 2,6 ± 0,3

Иммунорфин - 3,2 ± 0,3

Р-эндорфин - 2.8 ± 0,2

Налоксон - > 10'

[МеГ^энкефалин - > ¡О5

* среднее значение ± стандартное отклонение

2. Действие иммунорфина на рост Т-лимфобластной клеточной линии человека Лигка1

Известно, что Р-эндорфин стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов периферической

крови доноров. Нами было показано, что р-эндорфин и иммунорфип в диапазоне

концентрации 10"8 - 10"6 М стимулируют рост клеток человеческой Т-лимфобластной линии

.Тигкг! на 50-70%, и их действие не зависит от присутствия налоксона (рис. 5).

s В з

70000 60000-

50000-

30000'

Д 20000-

10000'

2 m

ю"м ю*м

б«та-эндорфин

тЩ

я щ

Шф.

10"7М 10"* Nt Налокосон Контроль бата*эндорфин + (10* М)

налоксон {10* М)

I 60000

* 70000 «

I 60000 f

| 50000 „5? 40000

30000 '20000

10000

10 'М 10*м Иммунорфин

10 М ЮМ Иммунорфин + налоксон (10* М)

Налоксон Контроль (10* М)

Рис. 5. Влияние Р-эндорфина (а) и иммунорфина (б) на рост клеток линии Jurkat in vitro в присутствии и в отсутствие налоксона. Темно-серый столбик — включение [метил-3Н]тимидина в контрольные клетки, штриховка сеточкой - включение [метил-3Н]тимидина в клетки в присутствии налоксона (Ю-4 М). Белые столбики — уровень включения [метил-3Н]тимидина в присутствии р-эндорфина (а) и иммунорфина (б) (10 s и 10"7 М); штриховка диагональ — то же в присутствии налоксона (10"6 М). Приведены средние значения ± стандартное отклонение одного из 3 независимых экспериментов.

На поверхности клеток 1игка1 обнаружены высокоаффинные участки связывания для иммунорфина (Кл =1,3 нМ; п = 5,2 х Ю5). График Скэтчарда имеет вид прямой линии, что свидетельствует о наличии одного типа рецепторов для иммунорфина на поверхности клеток. р-Эндорфин полностью вытеснял иммунорфин из лиганд-рецепторного комплекса. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии на поверхпости клеток Т-

яимфобластной линии Дигкаг неопиоиднош рецептора, общего для иммунорфина и р-эндорфина.

3. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы

Основная функция коры надпочечников состоит в продукции кортикостероидов (минералкортикоидов и глюкокортикоидов). Глюкокортикоиды участвуют в освобождении катехоламинов, активации ферментов глкжонеогенеза, усилении липолиза, подавлении белкового синтеза, увеличении секреции глюкагона, снижении секреции инсулина. Основным стимулятором синтеза и секреции глюкокортикоидов клетками пучковой и сетчатой зон коры надпочечников является адренокортикотропный гормон (АКТГ), Чувствительность клеток коры к АКТГ зависит от экспрессии и функции рецептора, принадлежащего к подсемейству меланокортиновых рецепторов. Связывание гормона с этим рецептором приводит к активации аденилатциклазы и, как следствие, к увеличению внутриклеточной концентрации циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). В результате возрастает синтез и секреция глюкокортикоидов. Р-Эндорфин также принимает участие в регуляции функций коры надпочечников. Поскольку аминокислотная последовательность иммунорфина подобна аминокислотной последовательности центральной части молекулы Р-эндорфина, нами было изучено влияние пептида на активность аденилатциклазы коры надпочечников крысы. Результаты, представленные в табл. 4, показывают, что при концентрациях 1 - 1000 нМ иммунорфин снижает аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крысы. Максимальный эффект (47% ингибирования активности фермента) наблюдался при концентрации пептида 10 нМ. Увеличение концентрации иммунорфина (100 и 1000 нМ) не приводило к возрастанию его ингибирующей способности.

Таблица 4. Влияние иммунорфина на активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы

Концентрация иммунорфина, нМ Аденилатциклазная активность, нмоль цАМФ на 1 мг мембранного белка за 10 мип ± стандартное отклонение

0 1,57 ±0.16

0,1 1,55 ±0,17

1 1,12 ± 0,14

10 0.83 ± 0,09

100 0,86 ± 0,08

1000 0,89 ±0,11

Было изучено влияние иммунорфина в дозах 10 и 100 мкг/кг на продукцию 11-оксикортйкостероидов (КС) в надпочечниках крыс. Результаты, приведенные в табл. 5,

показывают, что через 1 час после внутримышечной инъекции иммунорфина в дозе 10 мкг/кг содержание КС в надпочечниках увеличивалось, а в плазме снижалось примерно на 30 %. Введение иммунорфина в дозе 100 мкг/кг приводило к аналогичному, но более выраженному эффекту: уровнь КС в надпочечниках возрастал, а в плазме снижался примерно на 50 %. Как видно из табл. 5, через 24 часа после введения иммунорфина в дозах 10 и 100 мкг/кг происходило снижение уровня КС в плазме на 41 и 49 %, соответственно. В то же время содержание КС в надпочечниках крыс в обоих случаях возрастало приблизительно на 10 %. Такой результат свидетельствует в пользу того, что пептид оказывает ингибирующее действие на секрецию КС.

Таблица 5. Влияние иммунорфина (ИМН) на уровень КС в надпочечниках и плазме крови крыс через 1, 6 и 24 часа после внутримышечной инъекции

Доза ИМН мкг/кг Уровень КС, опыт/контроль, среднее значение ± стандартное отклонение

1 час 6 часов 24 часа

Надпочечник Плазма Надпочечник Плазма Надпочечник Плазма

10 1,32 ±0,08* 0,67 ±0,14* 1,29 ±0,09* 0,65 ±0,10* 1,07 ±0,08* 0,59 ±0,12*

100 1,49±0,06** 0,56 ±0,11* 1,52 ±0,09* 0,49 ±0,08* 1,09 ± 0,09* 0,51 ±0,09*

*р < 0,02, **р< 0,001 Содержание КС в плазме и надпочечниках контрольных животных составляло в среднем 0,3 мкг/мл и 35 мкг/г ткани соответственно.

Анализ специфического связывания [3Н]иммунорфина с мембранами коры надпочечников в координатах Скэтчарда (рис. 6) показал наличие двух типов участков связывания (рецепторов), различающихся аффинностью (К<п = 40,0 ± 0,2 нМ, К<12 = 0,25 ± 0,01 мкМ) и плотностью (Втах1 = 40,7 ± 2,3 пмоль/мг белка, Втах2 = 187,8 ± 9,4 пмоль/мг белка).

Таким образом, связываясь с неопиоидными рецепторами, иммунорфин снижает концентрацию аденилатциклазы в коре надпочечников крысы, тем самым, препятствуя секреции КС в плазму крови крысы. Действие иммунорфина прямо противоположно действию АКТГ.

Для характеристики специфичности выявленных рецепторов в качестве потенциальных конкурентов [3Н]иммунорфина были протестированы немеченые налоксон, [Ме15]энкефалин, а-, (3-, и у-эндорфины, АКТГ (1-24) и соматостатин (табл.6). Видно, что только р-эндорфин ингибировал специфическое связывание [3Н]иммунорфина, К| - 70,0 ± 9,2 нМ.

В, нМ

Рис. 6. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3Н]иммунорфина с мембранами коры надпочечников крысы.

Таблица б. Ингибирование немечеными пептидами и налоксоном специфического связывания [''Н]иммунорфина с мембранами коры надпочечников крысы

Лиганд И» К,

Среднее значение, нМ ± стандартное отклонение

¡3-эндорфин 105,0 ± 12,3 70,0 ± 9,2*

Налоксон > 10" > 10"

("Ме15]энкефалин > 10" > 106

а-эндорфин > 10ъ > 10°

у-эндорфин > 10" > 10й

АКТГ(1-24) > 10" > 101

Соматостатин > 10" > 10"

* Значение К, вычислено с использованием Кц комплекса [ Н]иммунорфин - рецептор

Таким образом, выявленные на мембранах коры надпочечников с помощью [3Н]иммунорфина рецепторы связывают р-эндорфин, но не взаимодействуют с налоксоном, [Ме15]энкефалином, а- и у-эндорфинами.

4. Связывание [3Н]иммунорфина с мембранами, выделенными из различных органов

крысы

Было изучено связывание [3Н]иммунорфина с мембранными фракциями, полученными из печени, почек, легкого, миокарда, селезенки, надпочечников, кишечника и головного мозга крысы. На мембранах печени, легких, почек и кишечника крысы специфического связывания [3Н]иммунорфина не выявлено. Специфические участки

связывания [3Н]иммунорфина были обнаружены на мембранах, выделенных из надпочечников, селезенки, миокарда и головного мозга крысы (табл. 7). Данные этой таблицы показывают, что величина специфического связывания 8,4 нМ [3Н]иммунорфина с мембранами (фмоль в расчете на 1 мг мембранного белка) убывала в ряду надпочечники > селезенка > миокард > головной мозг.

Результаты экспериментов по ингибированию специфического связывания [3Н]иммунорфина с мембранами перечисленных выше органов немечеными налоксоном и немечеными пептидами приведены в табл. 8. Пептиды (Р-эндорфин, пентарфин, [Рго3]пентарфин, циклопентарфин, циклодипентарфин) практически полностью ингибировали связывание [3Н]иммунорфина.

- «Таблица 7. Специфическое связывание 8,4 нМ [3Н]иммунорфина с мембранными фракциями из различных органов крысы

Орган Специфическое связывание [3Н]иммунорфина, фмоль/мг белка*

Надпочечники 1146,0 ±44,7

Селезенка 698,6 ±28,1

Миокард 279,1 ± 15,4

Головной мозг 172,2 ± 1,8

"среднее значение ± стандартное отклонение

Таблица 8. Ингибирование различными немечеными лигандами специфического связывания 8,4 нМ [3Н]иммунорфина с мембранами из надпочечников, селезенки, миокарда и головного мозга крысы

Лиганд Ингибирование, % *

Надпочечники Селезенка Миокард Головной мозг

Налоксон (1мкМ) 0 0 0 0

Р-эндорфин (0,1 мМ) 93,2±5,3 93,7±5,0 99,5±2,3 100,0±6,4

Рс-фрагмент (1,5 нМ) 80.3±7,3 98,6±9,9 67,5±3,9 98,6±8,6

Пентарфин (0,1 мМ) 97,2±4,4 100,0±3.0 100,0±4,8 100,0+8,4

Циклопентарфин (0,1 мМ) 89,2±5,3 98,8+9,9 93,3±4,8 100.0+7,1

Циклодипентарфин (0,1 мМ) 72,0±4,2 100,0±7,9 79,9+1,9 100,0±11,6

[Рго3]пентарфин 93,0±8,8 100,0±7,4 100,0+5,3 100,0±6,3

♦среднее значение ± стандартное отклонение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что на мембранах надпочечников, селезенки, миокарда и головного мозга крысы имеются рецепторы, общие для р-эпдорфина,

пентарфина, циклопентарфина, циклодипентарфина и [Рго3]пентарфина и не чувствительные к налоксону.

5. Влияние пептидов на развитие доимплантационных зародышей мыши

Анализ широкого спектра функций исследуемых пептидов, опосредованных взаимодействием с неопиоидным рецептором р-эндорфина, и распространение в организме взрослых животных этого рецептора, позволили сделать вывод, что до сих пор не известно, существуют ли неопиоидные рецепторы гормона на ранних стадиях развития, или же они появляются на более поздних этапах онтогенеза. Нами было изучено действие пептидов пентарфина, циклопентарфина в концентрации и циклодипентарфина (10"6М) на

.развитие доимплантационных зародышей мыши in vitro. Чтобы показать специфическое действие исследуемых пептидов, было изучено также влияние "коктейля" аминокислот (Val, Lys, Gly, Phe и Туг, 10"7М), из которых состоят пептиды.

При культивировании 2-х клеточных зародышей мыши в присутствии пептидов было отмечено, что все протестированные пептиды стимулировали их развитие (рис. 7). Количество жизнеспособных эмбрионов через 72 часа культивирования в опытных группах пентарфина, циклопентарфина и циклодипентарфина (50, 58 и 48% соответственно) достоверно превышало показатели контрольной группы (28%) и группы коктейля аминокислот (33%). Наиболее выраженной активностью для 2-х клеточных зародышей обладал циклопентарфин. Также наблюдалось ускорение развития при культивировании зародышей с циклопентарфином и циклодипептарфином, что позволило развиться большему количеству зародышей в этих группах до стадии бластоцисты, конечной стадии доимплантациЬнного развития.

Было изучено влияние пентарфина и циклопентарфина в концентрации

Ю-7 M на

развитие 4-х клеточных зародышей мыши in vitro (табл. 9). В присугствии циклопентарфина наблюдалось ускорение развития зародышей: они быстрее проходили все стадии доимплантационного развития, при этом у них не наблюдалось признаков атипичной морфологии. Через 72 часа культивирования в контроле и в группе пентарфина показатели жизнеспособности зародышей были почти равны (32 и 37 % соответственно). В то время как в присутствии циклопентарфина развилось 88% зародышей (табл. 9), что свидетельствует о стимулирующем действии пептида на развитие 4-х клеточных зародышей мыши in vitro.

ШШ контроль I 1пентарфин ivvvj циклопентарфин мши циклодилентарфин

коктейль аминокислот

Время культивирования,ч

Рис. 7. Влияние пентарфина (10"7 М), циклопентарфина (10"7 М), циклодипентарфина (10"6 М) и коктейля аминокислот (10"7 М) на развитие 2-х клеточных эмбрионов мыши in vitro.

Наиболее ярко положительное действие пептидов проявилось при культивировании 8-ми клеточных зародышей (табл. 9). Через 24 часа культивирования во всех группах, за исключением контрольной, все эмбрионы были жизнеспособны. Через 48 часов количество жизнеспособных эмбрионов контрольной группы составило 78%, группы "коктейля" аминокислот — 87%, в то время как в опытных группах циклопентарфина и циклодипентарфина показатели были достоверно выше контрольных значений — 98 и 93%. Наиболее выраженное стимулирующее действие на развитие 8-ми клеточных зародышей оказывал циклопентарфин.

Таблица 9. Влияние пептидов пентарфина, циклопентарфина (10"7 М), циклодипентарфина (10"6 М) и "коктейля" аминокислот (10"7 М) на жизнеспособность 4-х и 8-ми клеточных зародышей мыши через 24,48 и 72 часа культивирования

Воздействие Общее количество зародышей 24 часа 48 часов 72 часа

%, жизнеспособных зародышей %, жизнеспособных зародышей жизнеспособных зародышей

4-х клеточные зародыши

Контроль 37 89 62 32

Пентарфин 43 91 67 37

Циклопентарфин 25 100 96" 88*

8-ми клеточные зародыши

Контроль 81 91 78 -

Пентрафин 37 97 92 -

Циклопентарфин 47 100 98* -

Циклодипентарфин 41 100 93* -

Коктейль аминокислот 15 100 87 -

* достоверное значение по отношению к контролю, р<0,05

Особое внимание во время экспериментов уделяли анализу сформировавшихся бластопист. Подсчитывали количество нормально развитых бластоцист, зародышей, сформировавших трофобластические пузырьки (бластоциста, из которой не разовьется эмбрион) и количество бластоцист, находящихся на стадии "выклевывания" (разрыв оболочки оплодотворения и выход зрелой бластоцисты) (табл.10). Во время развития 2-х клеточных зародышей мыши наибольшее количество аномалий наблюдалось в группе "коктейля" аминокислот — 3 8%, в контроле сформировалось 31 % аномальных бластоцист, в присутствии пептидов - в два раза меньше контрольного показателя. Меньше всего аномальных бластоцист развилось в присутствии циклопентарфина в среде культивирования -11%.

При культивировании 8-ми клеточных зародышей самый большой процент аномалий был зафиксирован в группе "коктейля" аминокислот — в 4 раза выше контрольных показателей. В этой же группе наблюдалось 40% "выклевываний" бластоцист (табл. 10). Однако в присутствии циклопентарфина в среде культивирования было отмечено всего 2% аномалий и зафиксировано 39% случаев выхода бластоцист из оболочек оплодотворения, что свидетельствует о полном прохождении зародышем всех стадий доимплантационного развития и переходе на следующий этап - стадию имплантации.

Таблица 10. Анализ бластоцист, сформировавшихся в присутствии пентарфина (10"7 М), циклопентарфина (10"7 М), циклодипентарфина (10"6 М) и "коктейля" аминокислот (10"7 М) при культивировании in vitro

Воздействие Общее количество бластоцист Бластоцисты, выходящие из оболочки оплодотворения Аномально развитые бластоцисты

кол-во | % кол-во %

2-х клеточные зародыши

Контроль 32 1 3 10 31

Пентарфин 22 - - 4 18

Циклопентарфин 27 4 15 3 11

Циклодипектарфин 12 - - 2 17

Коктейль аминокислот 8 3 38 3 38

4-х клеточпые зародыши

Контроль 17 1 б 5 29

Пентарфин 29 4 14 5 17

Циклопентарфин 24 5 20 - -

8-ми клеточные зародыши

Контроль 63 6 9 3 5

Пентарфин 32 6 19 2 6

Циклопентарфин 46 18 39 1 2

Циклодипентарфин 40 5 13 - -

Коктейль аминокислот 13 6 40 2 15

В присутствии пентарфина и циклодипентарфина показатели "выклевывания" бластоцист превышали количество аномалий в несколько раз. Таким образом, пептиды улучшали жизнеспособность, а также стимулировали деление бластомеров и образование нормальных бластоцист из доимплантационных зародышей мыши in vitro. Циклопентарфин в концентрации 10"7 М наиболее полно проявляет свои свойства как кеспецифический фактор роста, повышающий жизнеспособность ранних зародышей мышей.

Заключение

Нами было установлено, что иммунорфин, пентарфин и циклопентарфин при концентрации порядка 1 нМ значительно увеличивают адгезию и распластывание мышиных перитонеальных макрофагов и их бактерицидную активность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro, (активность пептидов более чем в 100 раз превышала активность тафтсина - запатентованного стимулятора фагоцитоза). Установлено, что в физиологическом диапазоне концентраций эти пептиды не иммуногенны и не токсичны (LD5a > 2500 мг на 1 кг массы тела при внугрибрюшинном введении мышам), продуктами их деградации являются аминокислоты. По нашему мнению, их применение в сочетании с уже известными и широко применяемыми антибиотиками позволит значительно уменьшить терапевтические дозы, а значит, и негативные последствия применения последних.

Кроме того, было показано, что ß-эндорфинподобные пептиды пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин могут выступать в роли ростовых факторов, стимулирующих процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши, образование и "выклевывание" зрелых бластоцист in vitro. Циклопентарфин наиболее активен в качестве неспецифического фактора роста, повышающего жизнеспособность ранних зародышей мышей. В присутствии циклопентарфина в среде культивирования зародыши проходят стадии развития в те же сроки, что и в организме матери. По нашему мнению, культивирование доимплантационных эмбрионов в среде, содержащей циклопентарфин, позволит увеличить их жизнеспособность и подготовить зародыши к более успешной имплантации.

20 Выводы

1. Показано, что синтетические ß-эндорфинподобные пептиды иммунорфин (SLTCLVKGFY), пентарфин (VKGFY) и циклопентарфин [cyclo(VKGFY)] активируют перитонеальные макрофаги мыши in vitro: стимулируют способность макрофагов к адгезии, распластыванию, миграции и увеличивают их бактерицидность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415.

2. Установлено, что иммунорфин ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь.

3. Показано, что пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин [cyclo(VKGFYVKGFY)] стимулируют процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши, образование и "выклевывание" зрелых бластоцист in vitro.

4. С помощью [3Н]иммунорфина и 1251-меченного пентарфина обнаружено, что на перитонеальных макрофагах мыши, клетках человеческой Т-лимфобластной лейкемической линии Jurkat, а также на мембранах коры надпочечников, миокарда, селезенки и головного мозга крысы имеются неопиоидные (не чувствительные к опиоидному антагонисту налоксону) рецепторы, с высоким сродством и специфичностью связывающие ß-эпдорфин и ß-эндорфинподобные пептиды (иммунорфин, пентарфин, циклопентарфин, циклодипентарфин).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Наволоцкая Е.В., Колобов А.А., Кампе-Немм Е.А., Заргарова Т.А., Малкова Н.В., Краснова С.Б., Ковалицкая Ю.А., Завьялов В.П., Липкин В.М. Синтетический пептид VKGFY и его циклический аналог стимулируют бактерицидную активность макрофагов через неопиоидные рецепторы p-эндорфина. Биохимия, 2003, Т. 6S (1), С. 42-51.-' ...... ............................

2. Krasnova S.B., Malkova N.V., Kovalitskaya Yu.A., Zololarev Yu.A., Zargarova T.A., Kolobov A.A., Kampe-Nemm E.A., Navolotskaya E.V., Lipkin V.M. The stimulation effect of P-endorphin-like peptide immunorphin oil the human T-lymphoblastoid cell line Jurkat is mediated by a non-opioid receptor of р-endorphin. Russian Journal of Immunology, 2003, V. 8(1), P. 31-36.

3. Navolotskaya E.V., Kovalitskaya Yu.A., Zolotarev Yu.A., Kudryashova N.Yu., Goncharenko E.N., Kolobov A.A., Kaxnpe-Nemm E.A., Malkova N.V., Yurovsky V.V., Lipkin V.M. р-Endorphin-like peptide SLTCLVKGFY reduces the production of 11-oxycorticosteroids by rat adrenal cortex through nonopioid P-endorphin receptors. Peptides, 2003, V. 24, P. 1941-46.

4. Наволоцкая E.B., Ковалицкая Ю.А., Золотарев Ю.А., Колобов А.А., Кампе-Немм Е.А., Малкова Н.В., Юровский В.В., Липкин В.М. Характеристика неопиоидного рецептора p-эндорфина. Биохимия, 2004, Т. 69 (4), С. 488-96.

5. Наволоцкая Е.В., Ковалицкая Ю.А., Золотарев Ю.А., Кудряшова Н.Ю., Гончаренко Е.Н., Колобов А.А., Кампе-Немм Е.А., Малкова Н.В., Юровский В.В., Липкин В.М. Выявление и характеристика неопиоидных рецепторов Р-эндорфина коры надпочечников крысы. Биохимия, 2004, Т. 69 (8), С. 1071-78.

6. Ковалицкая Ю.А., Смирнов А.А., Сахарова Н.Ю., Наволоцкая Е.В., Чайлахян Л.М. Стимулирующее действие Р-эндорфинподобных пептидов на жизнеспособность ранних эмбрионов мыши, культивируемых in vitro. Доклады Академии Наук, 2005, Т. 405 (1), С. 137-141.

к исполнению 30/06/2006 Исполнено 04/07/2006

Заказ № 502 Тираж: 70 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autorcferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалицкая, Юлия Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Неопиоидное действие р-эндорфина.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 1. Материалы и методы.

1. Реактивы.

2. Экспериментальные животные.

3. Штамм бактерий.

4. Клеточные линии.

5. Среды для работы с культурами клеток. t 6. Синтетические пептиды.

7. Методы выделения и оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

7.1. Получение макрофагов брюшной полости мыши.

7.2. Определение способности макрофагов к адгезии.

7.3. Определение способности макрофагов к распластыванию.

7.4. Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов in vitro.

7.5. Культивирование лейкемических линий человека in vitro.

7.6. Оценка ростовой активности лейкемических клеток по включению [метил-3Н]тимидина в клетки.

7.7. Изучение спонтанной миграции мышиной макрофагподобной линии WEHi-З из капли агарозы.

8. Получение поликлональных антител к молекуле иммунорфина.

8.1. Получение поликлональной сыворотки. 8.2. Тестирование сывороток мышей на наличие антител к иммунорфину в иммуноферментном анализ.

9. Методы культивирования доимплантационных зародышей мыши in vitro

10. Определение кинетических характеристик взаимодействия изучаемых пептидов с рецепторами методом радиолигандного анализа.

10.1. Получение мембранных фракций из различных органов крысы.

10.2. Иодирование пептида пентарфина.

10.3. Получение [3Н]иммунорфина.

10.4. Изучение связывания 1251-меченного пентарфина и [3Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши, лейкимическими клетками Jurkat и мембранными фракциями из различных органов крысы.

10.5. Анализ ингибирования связывания I-меченного пентарфина и [ Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши, клетками линии Jurkat и мембранными фракциями из органов крысы немечеными пептидами и налоксоном.

11. Изучение функциональной активности надпочечников крысы.

11.1. Изучение влияния иммунорфина на активность аденилатциклазы в мембранах коры надпочечников крысы.

11.2. Исследование влияния иммунорфина на уровень 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме крови крыс.

12. Статистическая обработка результатов.

Глава 2. Результаты исследований.

1. Характеристика пептидов.

2. Влияние пептидов на функциональную активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro.

2.1. Действие пептидов на спонтанную миграцию клеток мышиной макрофагподобной линии WEHi-З из капли агарозы in vitro.

2.2. Влияние пентарфина и циклопентарфина на адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов мыши in vitro.

2.3. Влияние пентарфина и циклопентарфина на бактерицидную активность перитонеальных макрофагов.

3. Влияние пептидов на рост лейкемических клеточных линий человека in vitro.

3.1. Действие иммунорфина на рост Т-лимфобластной клеточной линии человека Jurkat.

3.2. Влияние циклопентарфина на рост клеток острой промиелоцитарной лейкемии человека HL-60.

4. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы.

4.1. Влияние иммунорфина на аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крысы.

4.2. Влияние иммунорфина на уровень 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме крови крысы.

5. Влияние пептидов на развитие доимплантационных зародышей мыши

6. Изучение рецепции пептидов.

6.1. Связывания [3Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши.

6.2. Связывания [3Н]иммунорфина с клетками Т-лимфобластной линии Jurkat.

6.3. Связывание [3Н]иммунорфина с мембранами выделенными из различных органов крысы.

6.4. Связывания [ Н]иммунорфина с мембранами коры надпочечников крысы.

6.5. Изучение связывания 12э1- меченного пентарфина с перитонеальными макрофагами мыши.

7. Получение поликлональных мышиных антител к молекуле иммунорфина

Глава 3. Обсуждение результатов.

3.1. Влияние иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на функциональную активность клеток иммунной системы.

3.2. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы

3.3. Влияние пентарфина, циклопентарфина и циклодипентарфина на развитие доимплантационных зародышей мыши.

3.4. Исследование неопиоидного рецептора Р-эндорфина с помощью Рэндорфинподобных пептидов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина"

Актуальность проблемы. Открытие Виктором Найяром в 1970 г эндогенного тетрапептида тафтсина (TKPR, фрагмент 289-292 СН2-домена тяжелой (Н) цепи иммуноглобулина G человека (IgG)), обладающего одновременно иммуностимулирующей и нейротропной активностями, явилось стимулом для поиска новых биологически активных пептидов в ряду фрагментов и аналогов иммуноглобулинов. Через десять лет Джек Джуллиард обнаружил в составе тяжелой цепи IgG человека (3-эндорфинподобную последовательность (SLTCLVKGFYPSDI, фрагмент 364377 Снз-домена Н-цепи IgG человека 1-4 подклассов). В нашей лаборатории был синтезирован декапептид SLTCLVKGFY (авторское название -иммунорфин) и показано, что он является селективным агонистом неопиоидного (не чувствительного к опиоидному антагонисту налоксону) рецептора (3-эндорфина. Рецепторный аппарат живой клетки - это сложно организованная система, построенная из специализированных рецепторов, которые получают и переводят на язык молекул непрерывный поток информации из внешней и внутренней среды, обеспечивая координацию работы нейроэндокринной, иммунной, сердечно-сосудистой и других систем организма. Понятно, что чем больше мы будем знать о структуре и функции каждого отдельного рецептора, тем более полным и детальным будет наше представление о механизмах функционирования клетки, органа, системы органов и организма в целом. Поэтому открытие и изучение новых неизвестных ранее клеточных рецепторов является актуальным направлением развития современной биохимии. Изучение свойств и механизма действия синтетического пептида иммунорфина и его активных аналогов позволит исследовать распределение и функции неопиоидного рецептора |3-эндорфина в организме человека и млекопитающих.

В настоящее время на основе производных природных пептидных гормонов уже создано и успешно применяется в клинике несколько десятков эффективных и безопасных лекарственных препаратов. Ценными качествами пептидов как потенциальных лекарственных средств нового поколения являются высокая активность, быстрая реакция организма на их введение в сочетании с практически полным отсутствием токсичности, иммуногенности и аллергенности. Получение и изучение новых пептидов с простой структурой (состоящих из нескольких аминокислотных остатков), высокой устойчивостью к действию протеаз (долгоживущих) и обладающих ценными фармакологическими свойствами - важнейшая задача современной биохимии. В этой связи, изучение спектра биологической активности и механизма действия иммунорфина и его активных производных является актуальным исследованием, результаты которого могут быть использованы на практике при создании новых лекарственных препаратов. Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение свойств и механизма действия синтетического Р-эндорфинподобного пептида иммунорфина и его активных фрагментов и аналогов.

Основные задачи исследования:

1. Изучение влияния иммунорфина, пентарфина (фрагмента иммунорфина 610) и циклопентарфина на активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro.

2. Исследование влияния иммунорфина на активность клеток коры надпочечников крысы in vitro и in vivo.

3. Изучение влияния пентарфина, циклопентарфина и циклодипентарфина на доимплантационное развитие зародышей мыши in vitro.

4. Получение [ Н]иммунорфина и I-меченного пентарфина и исследование их связывания с перитонеальными макрофагами мыши и мембранными фракциями, выделенными из различных органов крысы.

Работа выполнена в лаборатории "Пептидных биорегуляторов" Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ.

Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым эксперментальным доказательством того, что р-эндорфинподобный пептид иммунорфин, соответствующий аминокислотной последовательности 364-373 тяжелой цепи IgG человека, является селективным агонистом неопиоидного (не чувствительного к налоксону) рецептора Р-эндорфина. Впервые охарактеризовано распределение данного рецептора в организме крысы, и установлена его функция в клетках коры надпочечников.

Благодаря ярко выраженному положительному влиянию на доимплантационное развитие зародышей фрагменты иммунорфина -пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин могут найти применение в экспериментальной эмбриологии в качестве средств повышения жизнеспособности ранних эмбрионов.

Поскольку иммунорфин и его фрагменты являются селективными агонистами неопиоидного рецептора Р-эндорфина, они могут быть успешно использованы в качестве инструмента выявления и исследования данного типа рецептора на различных типах клеток.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Синтетические |3-эндорфинподобные пептиды иммунорфин (SLTCLVKGFY), пентарфин (VKGFY) и циклопентарфин [cyclo(VKGFY)] активируют перитонеальные макрофаги мыши in vitro: стимулируют способность макрофагов к адгезии, распластыванию, миграции и увеличивают их бактерицидность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415.

2. Иммунорфин ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию 11-оксикортикостероидов из надпочечников в кровь.

3. Пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин [cyclo(VKGFYVKGFY)] увеличивают жизнеспособность, а также стимулируют деление бластомеров и образование нормальных бластоцист из доимплантационных зародышей мыши in vitro.

4. [ Н]иммунорфин и I-меченный пентарфин с высоким сродством и специфичностью связываются с неопиоидным (не чувствительным к опиоидному антагонисту налоксону) рецептором (3-эндорфина на перитонеальных макрофагах мыши, клетках человеческой Т-лимфобластной линии Jurkat, а также на мембранах коры надпочечников, миокарда, селезенки и головного мозга крысы.

Часть I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Неопиоидное действие р-эндорфина

Р-Эндорфин принадлежит к группе опиоидных пептидов, т.е. пептидов, связывающихся с морфиновыми (опиоидными) рецепторами. Впервые о существовании в мозге эндогенных соединений, являющихся агонистами опиоидных рецепторов стало известно в 1974 г из работ Терениуса и Хьюгса [61, 144, 145]. В 1975 г Симантов, Снайдер и Хьюгс установили структуру этих веществ и назвали их [Met5]- и [Ьеи5]энкефалинами (рис.1) [62, 125]. Это событие послужило толчком для исследований в данном направлении. Своим открытием Р-эндорфин обязан исследователям Р-липотропина. р-Липотропин принадлежит к группе белковых гормонов, стимулирующих липолиз в жировой ткани. Этот гормон, состоящий из 91 аминокислотного остатка, впервые был выделен из гипофиза овцы в 1964 г [75], затем из гипофиза свиньи [47], и, наконец, из гипофиза человека [26]. Продолжая работу, первооткрыватели Р-липотропина Ли и Чанг в 1976 г хотели выделить исследуемый белок из гипофиза экзотического животного - верблюда, но из-за протеолиза выделить его тогда не удалось, однако, в ходе работы был обнаружен пептид, состоящий из 31 аминокислотного остатка [76]. Анализ аминокислотной последовательности пептида показал, что он полностью идентичен фрагменту 61-91 С-концевой части молекулы Р-липотропина овцы, а от аналогичных фрагментов Р-липотропинов свиньи и человека отличается на один аминокислотный остаток в 83 положении и на два аминокислотных остатка 87 и 91 положениях соответственно. Выделенный пептид практически не обладал липотропной активностью, но было показано, что он обладает значительной опиоидной активностью. Обнаруженный пептид получил свое название немного позже, когда Линг и Джиллемин в июне 1976 г выделили из нейрогипофиза и гипоталамуса свиньи фрагменты Р-липотропина 61-76, 61-91 и 61-77 и назвали их а-, Р- и у-эндорфинами (рис. 1) [49, 82]. В 1976 г Р-эндорфин был выделен из гипофиза человека, установлена его аминокислотная последовательность, и показано, что человеческий p-эндорфин также является С-концевым фрагментом (3липотропина человека (рис.1) [77].

1 5

МеГ^энкефалин YGGFM

1 5

Ьеи5]энкефалин YGGFL

1 10 а-Эндорфин YGGFMTSEKSQTPLVT

1 10 20 30

Р-Эндорфин YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNVHKKGQ

1 ю

Y-Эндорфин YGGFMTSEKSQTPLVTL

Рис.1. Аминокислотные последовательности а-, Р- и у-эндорфинов и [Met5]- и [Ьеи5]энкефалинов человека.

Вторичная структура молекулы (3-эндорфина была установлена By с помощью спектров кругового дихроизма молекулы гормона в воде [166]. Было показано, что полипептидная цепь гормона формирует а-спираль, Р-лист и p-поворот, разделенные нерегулярными участками (рис. 2). N Antibody ^ ^ \ ttrxfmg site

Рис. 2. Вторичная структура молекулы р-эндорфина [80].

В организме |3-эндорфин образуется из проопиомеланокортина (ПОМК), синтезируемого в передней доле гипофиза [103]. ПОМК также служит источником ос, Р- и у-меланоцитстимулирующих гормонов, АКТГ, а-и р-липотропинов [55]. При процессинге расщепление происходит почти исключительно по остаткам основных аминокислот (Lys, Arg) и осуществляется трипсиноподобными ферментами (рис. 3). Образование (3-эндорфина регулируется кортикотропин-релизинг гормоном (corticotrophin-releasing hormone, CRH) гипоталамуса. Активация действия CRH происходит в результате любого стресса, как эмоционального, так и физического. Установлено, что индуцированные а-интерфероном лимфоциты человека, а также макрофаги в очаге воспаления, секретируют |3-эндорфин [20, 85, 128].

ПОМК

АКТГ(1-39) р-ЛПГ(44-134) у-ЛПГ Р-эндорфин

44-101) (104-134)

Рис. 3. Процессинг ПОМК в передней и промежуточной доле гипофиза головного мозга крысы [55].

В 1976 г было показано, что (3-эндорфин человека является селективным агонистом опиоидных рецепторов [77]. В этом же году (3-эндорфин человека был синтезирован [78]. Синтезированный пептид был использован в экспериментах по изучению ингибирования связывания [3Н]морфина с мембранными фракциями головного мозга немечеными природным и синтезированным p-эндорфином. Было установлено, что сродство к рецептору природного и синтетического пептида одинаково [78]. Было показано, что p-эндорфин при внутримозговом введении мышам оказывает выраженное и длительное анальгетическое действие [84]. Гормон был активнее морфина в 18-33 раза (в зависимости от используемой тест-системы). Действие пептида блокировалось специфическим опиоидным антагонистом - налоксоном [84]. Было обнаружено, что при внутривенном введении p-эндорфина мышам в концентрациях 8,2, 14,5 и 20,1 мкг/кг, животные не реагировали на болевые стимулы. Действие пептида в этом случае также было дозозависимым, предварительное введение мышам налоксона (1 мкг/кг) приводило к исчезновению анальгетического эффекта Р-эндорфина [147-149]. Позже было установлено, что при внутривенном введении кошкам в дозах 25 и 50 мкг/животное (3-эндорфин вызывает анальгезию и изменение поведения у кошек, причем появление характерного состояния (настороженность, фиксация взгляда, резкие повороты головы) авторы связывали с возникновением у животных зрительных галлюцинаций. Действие пептида было дозозависимым и блокировалось налоксоном [95]. Кроме того, было показано, что внутримозговое введение р-эндорфина крысам, вызывало ярко выраженное седативное действие и каталепсию [6668].

Для того, чтобы установить участок молекулы Р-эндорфина, ответственный за анальгетическое действие пептида, были синтезированы фрагменты {3-эндорфина (1-5)-(28-31), (6-31), (1-5)-( 16-31). Синтезированные пептиды, [Met5]-, [Ьеи5]энкефалины, а-, Р-, и у-эндорфины вводили в мозг крысам и оценивали их анальгетическое действие. Эксперименты показали, что полное длительное обезболивание обеспечивалось только внутримозговым введением целой молекулы Р-эндорфина [79]. Однако, недостатком этой работы может быть достаточно небольшое количество тестируемых фрагментов гормона.

Известно, что p-эндорфин взаимодействует с двумя классами опиоидных рецепторов: ц-, открытых Мартином в 1976 г, и 5-, обнаруженных Лордом в 1977 г [12, 86, 91]. Некоторые исследователи полагают, что существует е- тип опиоидных рецепторов, и одной из характеристик этого типа рецепторов является большая селективность к (3-эндорфину, чем к какому-либо другому эндогенному опиоидному пептиду [46, 79, 150]. s-Опиоидные рецепторы обнаружены в семявыносящем протоке крыс, в головном мозге и других тканях. Показано, что связывание f3-эндорфина с 8-опиоидными рецепторами гипофиза вызывает высвобождение [Ме^энкефалина, который, в свою очередь, воздействует на 82 рецепторы в спинном мозге, обеспечивая анальгезию [46, 150]. Молекулу Р-эндорфина можно условно разделить на три участка: N-концевая часть молекулы отвечает за связывание с 8-рецепторами, центральная часть молекулы является антигенной детерминантой, С-концевая часть молекулы взаимодействует с ju-рецепторами (рис. 2) [80]. Все типы опиоидных рецепторов относятся к семейству рецепторов, связывающих G-белки. Связываясь с 8- и ц-опиоидными рецепторами, (3-эндорфин оказывает обезболивающее действие, участвует в процессах регуляции дыхания, тонуса сердечно-сосудистой системы, пищевого поведения [32]. Через 8-рецепторы опосредовано действие пептида на двигательную активность, обоняние, распознавательные функции, регуляцию настроения и эмоций [32, 39]. Взаимодействуя с ц-опиоидными рецепторами (3-эндорфин регулирует процессы терморегуляции, обучения и памяти [32,153].

В процессе большого числа исследований было обнаружено, что многие пептидные гормоны проявляют активность одновременно в нервной, эндокринной и иммунной системах, осуществляя их взаимосвязь. Механизмы взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем стали одной из актуальных и перспективных проблем, волнующих ученых всего мира. Казалось, что столь хорошо изученный гормон, как (3-эндорфин, уже не хранит в себе тайн и загадок. Однако, в ходе целого ряда исследований, выяснилось, что (3-эндорфин обладает иммуномодулирующей активностью, механизмы которой не известны.

Первые данные о неопиоидном рецепторе p-эндорфина были опубликованы в 1979 году. Американский ученый Хазум обнаружил, что

125 2 специфическое связывание I-меченного P-[D-Ala ]эндорфина с трансформированными Т-лимфоцитами человека ингибируется (3-эндорфином и p-[D-Ala ]эндорфином, в то же время на связывание не влияют аналоги энефалина, p-липотропин, инсулин, глюкагон, АКТГ, а-меланоцитстимулирующий гормон, опиоидные агонисты и антагонисты [53]. Это открытие дало основание предположить наличие на лимфоцитах человека неизвестных специфических участков связывания Р-эндорфина неопиоидной природы. Было показано, что для связывания с этим рецептором необходим С-концевой участок молекулы Р-эндорфина, т.к. связывания а-эндорфина с данным рецептором не было обнаружено. Открытие специфических рецепторов p-эндорфина неопиоидной природы позволило предположить, что некоторые центральные и периферические физиологические функции гормона, могут осуществляться при помощи отличных от классических, связанных с опиоидными рецепторами, механизмов [53]. Таким образом, рецепторные исследования доказали существование рецепторов Р-эндорфина неопиоидной природы на Т-лимфоцитах человека, что позволяет объяснить иммуномодулирующее действие гормона. Последующие исследования Гилмана и соавторов подтвердили результаты Хазума. Гилман впервые установил, что Р-эндорфин влияет на функциональную активность клеток иммунной системы [43]. В присутствии Р-эндорфина увеличивалась продукция митогенов Т-лимфоцитами человека. Гормон также способствовал пролиферации Т-клеток in vitro. Поскольку а-эндорфин не влиял на активность Т-лимфоцитов человека, был сделан вывод, что действие гормона осуществляется через рецептор, специфичный к С-концевой части молекулы Р-эндорфина [43]. Таким образом, в этой работе авторы отметили неизвестное ранее действие пептидного гормона, а также высказали предположение, что это действие вызвано связыванием пептида с неизвестным рецептором. В этой же работе было установлено, что Р-эндорфин, связываясь с рецептором, нечувствительным к налоксону, увеличивает пролиферацию спленоцитов крысы, индуцированную Кон А. В тоже время, МакКейн в 1982 г, опубликовал данные о том, что гормон снижает пролиферацию Т-лимфоцитов периферической крови человека in vitro, что противоречит данным Гилмана [94]. Однако, в обеих работах выдвигается предположение, что действие p-эндорфина опосредовано связыванием с рецептором неопиоидной природы. Исследования Хейджнена и соавторов внесли некоторую ясность в изучение этой проблемы. Оказалось, что Р-эндорфин оказывает модулирующее действие на Т-лимфоциты. При изучении воздействия гормона на индуцированные Кон А Т-лимфоциты двух доноров оказалось, что действие пептида было прямо противоположным: в одном и том же диапазоне концентраций (10'14 - 10"9 М) гормон увеличивал пролиферацию Т-лимфоцитов одного донора, а на пролиферацию лимфоцитов другого донора оказывал ингибирующее действие. Было изучено влияние различных фрагментов p-эндорфина на пролиферацию активированных Кон А Т-лимфоцитов этих доноров. По данным Хейжнена и соавт. фрагменты р-эндорфина 10-16 и 2-31 обладали такой же активностью, как и целая молекула [54]. Полученные данные позволили предположить, что модулирующее действие Р-эндорфина на Т-лимфоциты человека связано с уровнем экспрессии рецептора неопиоидной природы на поверхности клеток.

В дальнейшем было показано, что пролиферацию индуцированных Кон А лимфоцитов человека стимулировал не только p-эндорфин, но и N-Ac-p-эндорфин, фрагменты р-эндорфина 6-31 и 18-31, в то время как фрагмент р-эндорфина 1-27, [Ме^энкефалин, а- и у-эндорфины были не активны [45]. Эти данные свидетельствуют о том, что для связывания с предполагаемым рецептором неопиоидной природы, необходима С-концевая область молекулы гормона.

Для выяснения причины существования столь противоречивых данных о действии p-эндорфина на пролиферацию Т-лимфоцитов Ван Ден Бергом и соавт. было изучено влияние пяти опиоидных пептидов (а-, Р-, у-эндорфинов, [Met5]- и [Ьеи5]энкефалинов) на индуцированную Кон А пролиферацию Т-клеток селезенки крыс [155]. Оказалось, что постоянное присутствие любого из этих пептидов в среде культивирования спленоцитов не влияет на пролиферативный ответ этих клеток. В то же время 30-минутная преинкубация Т-клеток с Р-эндорфином (но не с другими пептидами) приводила к дозозависимому увеличению уровня пролиферации на 50-100%. Присутствие налоксона не влияло на стимулирующее действие Р-эндорфина. Из этого следовало, что действие Р-эндорфина на пролиферацию Т-клеток опосредовано не через опиоидные рецепторы. Одновременно было показано, что постоянное присутствие p-эндорфина (или а-эндорфина) в культуре Т-клеток, которые были преинкубированы с Р-эндорфином, полностью отменяло стимулирующий эффект последнего. Авторы работы предположили, что в отсутствие опиоидных пептидов на поверхности Т-лимфоцитов селезенки крысы доступны для связывания только неопиоидные рецепторы p-эндорфина. Введение в среду p-эндорфина приводило к опосредованному через эти рецепторы увеличению пролиферативного ответа. В условиях постоянного присутствия p-эндорфина (или другого опиоидного пептида) в среде культивирования Т-клеток на их поверхности появляются опиоидные рецепторы, связываясь с которыми Р-эндорфин ингибирует собственный стимулирующий эффект [155].

Для доказательства гипотезы о том, что молекула р-эндорфина содержит два различных участка, один из которых служит для связывания с опиоидными, а другой с неопиоидными рецепторами, Ван Ден Бергом и соавт. было изучено влияние на пролиферацию Т-лимфоцитов синтетических фрагментов Р-эндорфина - 6-31, 18-31, 24-31, 28-31 и 1-27 (пептиды вносили в среду культивирования до стимуляции их митогеном) [156]. В результате проведенных исследований было установлено, что фрагменты р-эндорфина 6-31 и 18-31 увеличивали пролиферацию Т-клеток, причем первый был значительно активнее второго. В то же время фрагменты Р-эндорфина 1-27, 24-31 и 28-31 оказались неактивными. На основании полученных результатов авторы предположили, что для реализации действия Р-эндорфина на Тлимфоциты, а значит и для взаимодействия с налоксон-нечувствительными рецепторами, важен участок молекулы Р-эндорфина (6-23). При этом, ключевую роль в связывании, по мнению авторов работы, играет фрагмент (3-эндорфина 18-23. Одновременно эти же авторы показали, что р-эндорфин (18-23) увеличивает продукцию IL-2 и IL-4 CD4+ Т-клетками [156].

Исследование свойств тетрапептида Lys-Lys-Gly-Gln, представляющего собой С-концевой фрагмент Р-эндорфина 28-31, показало, что он стимулирует пролиферацию индуцированных Кон А Т-лимфоцитов человека в 1,2 - 7,5 раз в диапазоне концентраций пептида 10"п - 10"4 М [108]. Максимальная активность пептида проявлялась при концентрации ~ 1 нМ. Протестированные параллельно опиоидные пептиды - [Met5]-, [Ьеи5]энкефалины, p-эндорфин и более короткие фрагменты исследуемого пептида были менее активны. Авторы также выдвинули предположение, что действие тетрапептида осуществляется через неопиоидные рецепторы Р-эндорфина. Однако, в этой работе не хватает рецепторных исследований, чтобы подтвердить данное предположение.

Было установлено наличие неопиоидных участков связывания на двух комплексах системы комплемента человека: на цитолитическом мембранном комплексе C5b-9(m), и на цитолитически неактивном сывороточном комплексе SC5b-9 [115]. На взаимодействие I-меченого Р-эндорфина с рецептором на C5b-9(m) не влияли АКТГ, инсулин, релизинг фактор лютеинизирующего гормона, динорфин (1-13), р-казоморфин.

Следующим этапом исследований было получение кинетических характеристик неопиоидного рецептора Р-эндорфина. В 1985 г Шейгерер обнаружил неопиоидные рецепторы Р-эндорфина на нескольких клеточных линиях мышиной тимомы [116]. На клетках линии EL4 показано, что

125 связывание I-меченного Р-эндорфина с неопиоидным рецептором ингибировалось немеченым Р-эндорфином, оно зависело от температуры (в дальнейшем все эксперименты проводили при 4°С) и рН, характеризовалось насыщаемостью и обратимостью. Связывание I-меченного p-эндорфина не ингибировалось [Leu5]- и [Ме15]энкефалинами, а также N-концевыми фрагментами Р-эндорфина - Р-эндорфином (1-16) (а-эндорфин) и |3-эндорфином (1-27) [116]. Эти исследования еще раз подтверждают предположение о том, что за связывание с неопиоидным рецептором ответственна С-концевая часть молекулы (3-эндорфина. Установлено, что после связывания I-меченного Р-эндорфина с неопиоидным рецептором на поверхности клеток EL4 при 37°С наблюдалась интернализация лиганд-рецепторного комплекса в клетку посредством эндоцитоза [116]. Большинство пептидных гормонов и ростовых факторов попадает в клетки-мишени именно таким путем, но их дальнейшая судьба внутри клетки не известна. Шейгерер и соавт., опираясь на результаты Кинга [73] по исследованию интернализации эпидермального ростового фактора, предположили, что Р-эндорфин способен модулировать клеточные функции, такие как пролиферация Т-лимфоцитов, взаимодействуя с специфическими внутриклеточными участками связывания. Вскоре было показано, что гормон способен связываться с внутриклеточным белком кальмодулином и влиять на активность фосфодиэстеразы, причем связывание наблюдалась как в случае N-Ac-p-эндорфина, так и фрагмента Р-эндорфина 14-31 [42, 87]. Однако, пока для утверждения о внутриклеточных участках связывания гормона недостаточно аргументов.

Неопиоидные рецепторы p-эндорфина были обнаружены также у компонентов плазмы и сыворотки крови человека в присутствии гепарина [58]. При этом взаимодействие гормона с неопиоидными рецепторами зависело от температуры и не наблюдалось в присутствии других пг антикоагулянтов. Связывание I-меченного Р-эндорфина характеризовалось насыщаемостью и обратимостью и не ингибировалось налоксоном, морфином и рядом других опиоидных пептидов, являющихся фрагментами N-концевой части молекулы Р-эндорфина. Связывание ингибировалось С-концевым фрагментом Р-эндорфина, что подтверждает неопиоидную природу этих рецепторов.

Шахаби и соавт. обнаружили существование неопиоидного рецептора Р-эндорфина на интактных спленоцитах мыши, культивируемых in vitro [118]. Было, установлено, что связывание 1-меченного p-эндорфина со спленоцитами насыщаемо, график Скэтчарда имел вид прямой линии, что говорило о наличии одного типа рецепторов на поверхности клеток, К^ = 4,1

125 нМ. Кроме того, связывание 1-меченного p-эндорфина со спленоцитами в равной степени ингибировалось N-Ac-p-эндорфином и Р-эндорфином, в то время как фрагменты Р-эндорфина 6-31 и 28-31 были менее активны, чем Р-эндорфин в 10 и 1000 раз соответственно. Налоксон и фрагмент Р-эндорфина 1-27 были не активны. Таким образом, характеристики неопиоидного рецептора p-эндорфина на спленоцитах мыши совпадали с ранее полученными для других клеток-мишеней.

Этой же группой ученых было изучено связывание 1-меченного Р-эндорфина с клетками моноцитарной клеточной линии человека U-937 [119]. Результаты экспериментов показали, что связывание гормона с рецептором было насыщаемым и характеризовалось высокой аффинностью (Kd= (1,2 ± 0,5) х Ю'° М). Связывание '"I

-меченного Р-эндорфина с клетками моноцитарной клеточной линии человека U-937 ингибировалось Р-эндорфином и N-Ac-P-эндорфином, а налоксон, морфин, и другие селективные опиоидные агонисты были не активны. Впервые было изучено влияние ионов

Na+, К+, Са+2, Mg+2, Мп+2) и гуанозинтрифосфата на рг связывание 1-меченного Р-эндорфина с мембранами клеток U-937.

Оказалось, что увеличение концентрации перечисленных ионов приводило к уменьшению связывания. Присутствие гуанозинтрифосфата (10"4 М) также уменьшало связывание на 25 %.

Шахаби и соавт. [118, 119] предприняли первую попытку изучить данный рецептор на молекулярном уровне. Из мембран спленоцитов был

125т о выделен комплекс - рецептор, химически сшитыи с 1-меченным р-эндорфином, и определена молекулярная масса белков этого комплекса методом электрофореза в SDS полиакриламидном геле. Оказалось, что гормон связывался с белками с молекулярной массой 66 и 57 кДа. Подобные исследования были проведены и с моноцитарной клеточной линией U-937, получены следующие значения: I-меченный Р-эндорфин связывался с белками массой 66 и 44 кДа [119]. В обоих случаях связывание характеризовалось высокой специфичностью и нечувствительностью к налоксону. Другая группа авторов, [116], изучая связывание Р-эндорфина с налоксон-нечувствительным рецептором клеток мышиной тимомы EL4, показала, что гормон в присутствии налоксона взаимодействует с двумя участками связывания, различающихся по аффинности и молекулярной массе белков рецепторного комплекса. Молекулярная масса белков высокоаффинного рецепторного комплекса равна 72 кДа, низкоаффинного -40 кДа. Дальнейшие исследования показали, что игибируют связывание I-меченного p-эндорфина с высокоаффинным участком связывания на клетках EL4 p-эндорфин и его С-концевые фрагменты, что подтверждает неопиоидную природу рецептора. Некоторе несоответствие молекулярной массы белков рецепторного комплекса, скорее всего, может быть связано с применением различных методов анализа рецепторного комплекса при проведении эксперимента.

На перитонеальных макрофагах мыши неопиоидные рецепторы Р

125 эндорфина были охарактеризованы в 1997 году [165]. Анализ связывания I-меченного Р-эндорфина с перитонеальными макрофагами мыши в координатах Скэтчарда показал, что график Скэтчарда имеел вид прямой линии, что говорило о наличии одного типа рецепторов на поверхности клеток. Были определены Kd= 9,75 + 2,6 нМ и количество сайтов связывания

19 ^ в расчете на одну клетку (8218 + 2360). Связывание I-меченного Р-эндорфина с перитонеальными макрофагами мыши ингибировалось немеченым p-эндорфином, а опиоидные лиганды и налоксон были не активны.

Для дальнейшего исследования неопиоидного рецептора Р-эндорфина необходимы были лиганды, взаимодействующие только с данным типом рецептора. Возможность работы с такими соединениями была получена после того как, американский ученый Джулиард обнаружил в экстракте плаценты человека пептид SLTCLVKGFYPSDI, представляющий собой фрагмент 364-379 тяжелой цепи IgG, гомологичный центральной части молекулы Р-эндорфина SQTPLVTLFKNAII на 60% [70]. Хоук синтезировал этот пептид и показал, что он связывается с рецепторами Р-эндорфина на мембранах головного мозга крысы [60]. В дальнейшем было показано, что эти рецепторы являются неопиоидными.

Для дальнейших исследований Завьяловым и соавт. был синтезирован Р-эндорфинподобный пептид SLTCLVKGFY - иммунорфин, соответствующий последовательности 364-373 тяжелой цепи IgG. Проведены сравнительные исследования связывания p-эндорфина и иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши. Оказалось, что на макрофагах существует два типа рецепторов для Р-эндорфина (Kdi = 6,1 ± 0,6 нМ и Kd2 = 0,31 ± 0,02 нМ), и иммунорфин конкурирует с Р-эндорфином за связывание с высокоаффинным рецептором (Kj = 2,5 ± 0,9 нМ). Этот тип рецепторов не блокируется налоксоном и не взаимодействует с [Leu5]- и [Ме^энкефалинами [171]. Данные, полученные годом позже Вудсом и соавтрами сообщали о наличии только одного типа рецепторов (неопиоидного) для Р-эндорфина на поверхности макрофагов, хотя Kd также лежит в области наномолярных концентраций: Kd = 9,75 ± 2,6 нМ по данным Вудса [165] и Kd = 6,1 ±0,6 нМ [171].

Солидный вклад в изучение данной проблемы внесли исследования, проведенные в Филиале Института биоорганической химии им. академиков Шемякина М.М и Овчинникова Ю.А. в лаборатории пептидных биорегуляторов, заведующая лабораторией Наволоцкая Е.В. С помощью иммунорфина были обнаружены и охарактеризованы налоксон-нечувствительные рецепторы Р-эндорфина на Т-лимфоцитах человека и синаптических мембранах головного мозга крысы [104, 105]. На Т-лимфоцитах человека было показано наличие одного типа рецепторов к рэндорфину и отсутствие ингибирования налоксоном связывания гормона с этим рецептором. Установлено, что константа диссоциации лиганд -рецепторного комплекса находится в области наномолярных концентраций (Kd = 0,25 ± 0,03 нМ), что совпадает с литературными данными. В аналогичных экспериментах с иммунорфином на Т-лимфоцитах человека Kd равнялось 7,0 ± 0,3 нМ [104]. На мембранах головного мозга крысы также было показано наличие одного типа рецепторов для Р-эндорфина и иммунорфина, связывание пептидов не блокировалось налоксоном, Kd для р-эндорфина было равно 1,87 ± 0,13 нМ, для иммунорфина - 2,93 ± 0,27 нМ [105]. Было проведено исследование по изучению связывания фрагментов иммунорфина с мембранами головного мозга крысы и Т-лимфоцитами человека. Установлено, что самым коротким активным фрагментом иммунорфина является пептид VKGFY - фрагмент иммунорфина 6-10. Пептид с высоким сродством связывался с нечувствительным к налоксону рецептором Р-эндорфина: Kd в исследованных тест-системах равнялось 3,17 ± 0,29 нМ и 36,3 ± 0,5 нМ на мембранах головного мозга крысы и Т-лимфоцитах человека соответственно. Это открытие позволило использовать фрагмент иммунорфина 6-10 в дальнейших исследованиях [104, 105].

Было изучено влияние Р-эндорфина и иммунорфина на рост различных клеточных линий человека, чтобы установить наличие неопиоидных рецепторов гормона на их поверхности. Оказалось, что исследуемые пептиды стимулировали рост клеток Т-лимфобластных линий Jurkat (на 50-70%) и МТ-4 (на 30%), причем действие пептидов на рост клеточной линии Jurkat не блокировалось налоксоном. Р-эндорфин и иммунорфин в диапазоне физиологических концентраций не оказывали влияния на рост В-лимфобластной линии человека RPMI-1788, острой промиелоцитарной лейкемии HL-60 и хронической миелоидной лейкемии К-562. Было

8 6 обнаружено, что иммунорфин в концентрации 10"° - 10"° М увеличивал скорость деления клеток диффузной гистиоцитарной лимфомы U-937 на 30%. В тоже время Р-эндорфин в дозе 10"8- 10"7М вызывал 40% увеличение роста данной клеточной линии. Таким образом, в ходе этих исследований была разработана удобная модель для изучения неопиоидного рецептора с помощью пептида иммунорфина [89].

Поскольку синтетические p-эндорфинподобные пептиды с высоким сродством связываются с нечувствительным к налоксону рецептором, их можно использовать в качестве селективнных агонистов для изучения данного типа рецептора. По сравнению с p-эндорфином пептиды имеют преимущества, т.к. связываются только с неопиоидным рецептором, тогда как P-эндорфин помимо нечувствительного к налоксону рецептора связывается с ц-, б- и s-опиоидными рецепторами.

Таким образом, опиоидный пептид P-эндорфин оказывает неопиоидное действие. Гормон влияет на активность клеток иммунной системы. Неопиоидное действие p-эндорфина осуществляется через рецептор нечувствительный к налоксону, блокатору опиоидных рецепторов. Проанализировав литературные данные, можно сделать вывод, что участок молекулы гормона, ответственный за связывание с неопиоидным рецептором, находится в пределах фрагмента (6-23) молекулы р-эндорфина. На данном этапе исследований недостаточно информации о структуре неопиоидного рецептора Р-эндорфина.

В настоящее время не ясно, является ли неопиоидный рецептор Р-эндорфина новым рецептором Р-эндорфина или это уже известный рецептор, способный наряду с собственным эндогенным лигандом связывать Р-эндорфин. Волеманн и Бенухе [164] высказали предположение о том, что неопиоидное действие Р-эндорфина может быть объяснено образованием рецепторных гетеродимеров. В последние годы были опубликованы данные о способности опиоидных рецепторов взаимодействовать друг с другом и образовывать новые функциональные структуры, самой простой из которых является димер. Более того, описана гетеродимеризация двух функционально активных опиоидных рецепторов, к- и 8-, что привело к образованию нового рецептора с функциональными свойствами несколько отличными от исходных рецепторов [69]. В качестве критерия активности гетеродимера оценивалось специфическое связывание селективных агонистов и антагонистов с гетеродимером к-8 и отдельно с каждым исходным типом опиоидного рецептора на мембранах клеток, экспрессирующих либо к-, либо 8-, или оба типа этих рецепторов. Показано, что с высоким сродством (Kd ~ 1 нМ) происходило связывание гетеродимера как с отдельными агонистами исходных рецепторов, так и с комбинацией двух селективных агонистов или двух селективных антагонистов. Связывания агониста в присутствии антагониста не наблюдалось. Однако, у гетеродимера к-5 не наблюдалось высокого сродства к некоторым агонистам и антагонистам исходных рецепторов [69]. Вероятно, гетеродимеризация приводила к образованию нового участка связывания, способного избирательно связываться с селективными лигандами. Однако, идея того что этот гетеродимер является неопиоидным рецептором Р-эндорфина сомнительна. В статье Джордана и Деви (1999) отмечено, что ц- и 8-классы опиоидных рецепторов не образовывали гетеродимера, в тоже время было показано, что р-эндофин может связываться только с ц- и S-опиоидными рецепторами [12]. Отличительной особенностью связывания Р-эндорфина с неопиоидным рецептором является взаимодействие с рецептором в присутствии антагониста опиоидных рецепторов налоксона [53]. Показано, что данный, нечувствительный к налоксону, рецептор с высоким сродством связывается с Р-эндорфином, С-концевыми фрагментами Р-эндорфина (С-конец молекулы, ответственный за связывание с ц-опиоидными рецепторами), с N-Ac-p-эндорфином и Р-эндорфинподобным пептидом иммунорфином, а с другим опиоидными пептидами он не взаимодействует [104, 118, 119, 165]. В статье Джордана и Деви приведен широкий спектр агонистов и антагонистов 8- и к-рецепторов, связывающихся с высоким сродством с гетеродимером, однако, в присутствии антагониста связывания опиоидного пептида с гетеродимером не наблюдалось.

Группа исследователей под руководством Уалдхоера (2005) [158], с помощью опиоидного агониста б'-гуанидиноналтриндола (6'-GNTI), обладающего уникальным свойством селективно активировать только гетеродимеры опиоидных рецепторов, показала, что функционально активные гетеродимеры опиоидных рецепторов действительно существуют in vivo. Оказалось, что существуют гетеродимеры, образованные рецепторами, сопряженными с G-белками, но их образование ткане-специфично. Наблюдалась анальгезия, вызванная действием б'-GNTI при введении в спинной мозг крысы, но при введении в головной мозг анальгезия не наблюдалась. Эти данные свидетельствуют о том, что гетеродимеры не образуются в головном мозге, а существование неопиоидного рецептора р-эндорфина доказано на мембранах головного мозга крысы [53].

Подводя итог, можно сделать вывод, что четко показано существование рецептора нечувствительного к налоксону, с высоким сродством связывающего p-эндорфин, С-концевые фрагменты р-эндорфина, N-Ac-P-эндорфин и p-эндорфинподобный пептид иммунорфин. Этот рецептор обнаружен на мембранах головного мозга крысы, перитонеальных макрофагах мыши, на Т-лимфоцитах человека, спленоцитах мыши, трансформированных клеточных линиях человека и мыши. IQ данного рецептора лежит в области наномолярных концентраций; неопиоидный рецептор имеет белковую природу и, вероятно, состоит из двух субъединиц. Связываясь с этим рецептором, Р-эндорфин стимулирует пролиферацию индуцированных Кон А Т-лимфоцитов человека.

Согласно литературным данным последних лет, не только Р-эндорфин, но и целый ряд опиоидных пептидов обладает неопиоидной активностью. Пептиды взаимодействуют с рецепторами, отличными от опиоидных, и связывание с этими рецептрами не блокируется налоксоном. Аминокислотные последовательности некоторых из этих пептидов приведены на рис. 4. Наибольшее количество публикаций посвящено неопиоидному действию эндогенного опиоидного пептида динорфина А.

Динорфин А, взаимодействуя с к-опиоидными рецепторами, оказывает аналитическое действие, питьевую и пищевую мотивацию, взаимодействие нервной и эндокринной систем. Было установлено, что для связывания динорфина с опиоидными рецепторами необходима последовательность Туг-Gly-Gly-Phe, так называемый адресный фрагмент, поэтому для исследования неопиоидного действия пептида использовали его фрагменты без N-концевого Туг [117]. Установлено, что в большинстве случаев неопиоидное действие динорфина А и его производных связано с взаимодействием с подтипом глутаматных рецепторов N-метил-О-аспартат, представляющих собой рецепторные каналы (NMDA рецепторы). Было установлено, что, связываясь с NMDA рецепторами, динорфин ослабляет развитие привыкания к обезболивающему действию морфина. Динорфин А и фрагмент динорфина А 2-17 подавляют абстинентный синдром, вызванный налоксоном, и ингибируют развитие привыкания у морфин-зависимых мышей, а также дозозависимо увеличивают внутриклеточный уровень глутамата и аспартата в гиппокампе крыс [34,137, 146].

Динорфин A YGGFLRRIRPKLKWDNQ

Ме^]энкефалин YGGFM

MERF YGGFMRF

ВАМ22 YGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYG

VV-геморфин 7 VVYPWTQRF

Ноцицептин FGGFTGARKSARKLANQ

Эндоморфин-1 YPWF- NH2

Эндоморфин-2 YPFF-NH2

Рис. 4. Аминокислотные последовательности динорфина А, [Ме1:5]энкефалина, MERF, ВАМ22, геморфина, ноцицептина и эндоморфинов-1 и -2. рс

Было показано, что I-меченный фрагмент динорфина А 2-17 с высоким сродством связывается с NMDA рецепторами на мембранах коры головного мозга крысы (Kd = 9,4 ± 1,6 нМ), в субъединице NR1 NMDA рецептора определена аминокислотная последовательность, с которой взаимодействуют динорфин А и фрагмент динорфина А 2-17 [123, 138].

Однако, имеются данные о неопиоидном действии динорфина А, не связанном с NMDA рецепторами. Было установлено, что введение динорфина А и его фрагментов в спинной мозг крысы приводило к увеличению частоты сердечных сокращений и артериального давления, что говорит о неопиоидном действии пептидов на вегетативную нервную систему [112].

Было обнаружено, что [3Н]динорфин А связывается с неопиоидными рецепторами на клетках гипофизарной клеточной линии мыши AtT 20, не экспрессирующих опиоидные рецепторы. [168]. Кроме того, по данным Танга, возбуждающее действие динорфина А в спинном мозге, связанное с увеличением притока ионов кальция через потенциалзависимые кальциевые каналы, может быть опосредовано не только взаимодействием с NMDA рецепторами, но и взаимодействием с неустановленным типом неопиоидных рецепторов [139].

Интересно отметить, что динорфин А может проникать как в нейрональную клетку, так и в клетки других тканей. Динорфин А с помощью не установленных механизмов быстро проходит через плазматическую мембрану. Установлено, что прохождение пептида через плазматическую мембрану не связано с аппаратом Гольджи или с традиционным эндоцитозом [90]. С помощью иммунофлуоресценции показана низкая концентрация динорфина в ядре и на плазматической мембране. Возможность проникновения динорфина в клетку может быть связана с его неопиоидным действием [90].

Таким образом, неопиоидное действие динорфина А и его фрагментов может быть опосредовано связыванием с NMDA-рецепторами, а также взаимодействием с неизвестными неопиоидными рецепторами.

Хорошо изученным опиоидным пептидом, обладающим неопиоидной активностью, является [Ме1:5]энкефалин. Известно, что пептид взаимодействует с ц- и 5-опиоидными рецепторами. Однако, было показано, что [Ме^энкефалин также взаимодействует с еще одним типом рецепторов, названных ^-рецепторами (другое название - opioid grow factor (OGF) -рецепторы) [169]. Связываясь с OGF - рецепторами, пептид выступает в качестве опиоидного ростового фактора клеток [52, 59]. Затем было осуществлено клонирование и определена нуклеотидная последовательность кодирующей ДНК OGF-рецептора крысы и человека [170]. Как оказалось, структуры этих и классических опиоидных рецепторов не гомологичны.

До сих пор не установлено существование неопиоидного рецептора для с А 7 эндогенного опиоидного пептида [МеПэнкефалин-Arg-Phe' (MERF) производного проэнкефалина А. Фрагмент MERF 4-7, пептид Phe-Met-Arg-Phe (FMRF), оказывает возбуждающее действие на нейроны продолговатого мозга, причем, налоксон не влиял на эту активность [40]. Изучение связывания меченного тритием MERF с мембранами головного мозга крысы, лягушки и свиньи дало противоречивые характеристики рецептора. По сведениям одних авторов, рецептор частично устойчив к действию налоксона или подобен рецептору а2 [15, 160, 161]. Данные других авторов свидетельствуют о наличии неопиоидного компонента в участке связывания [15, 16]. Воллеманн и Бенухе полагают, что это опиоидный рецептор частично устойчивый к действию налоксона [163]. Причин для сомнения множество, для их разрешения необходимы дальнейшие исследования в данном направлении.

Опиоидный пептид ВАМ22 (рис. 4), образующийся из проэнкефалина А путем посттрансляционного ферментативного расщепления, активирует семейство сенсорных нейрон-специфичных рецепторов, сопряженных с Gбелками (SNSR) [74, 126]. В пептиде присутствует аминокислотная последовательность [Ме^энкефалина, поэтому он также взаимодействует с классическими опиоидными рецепторами. Известно, что за связывание с SNSR отвечает фрагмент 8-22 пептида ВАМ22. SNSR-рецепторы расположены на поверхности малых спинных корешков и на сенсорных нейронах тройничного нерва у человека и крысы, они нечувствительны к налоксону и слабо активируются опиоидными лигандами. Физиологическая роль связывания ВАМ22 с этими рецепторами пока остается неизвестной, однако, неопиоидная природа рецепторов несомненна [33, 50].

Геморфины - не типичные опиоидные пептиды, образующиеся из структурных белков. Показано, что ЬУУ-геморфин-4 в диапазоне наномолярных концентраций влияет на активность фосфатазы в лимфоцитах человека, причем действие пептида связано с взаимодействием с кальмодулином, и ключевым ферментом, лежащим в основе молекулярных механизмов действия пептида, является кальцинейрин [14]. Геморфины оказывают опиоидное и неопиоидное действие на LC нейроны [167]. Однако, изучение связывания меченых тритием геморфинов с мембранами головного мозга крысы показало лишь слабое сродство к опиоидным рецепторам [19, 99, 135]. Эти данные позволяют предположить, что для этого семейства пептидов должны существовать другие рецепторы, отличные от опиоидных.

Эндоморфин-1 и -2 являются селективными агонистами ц-опиоидных рецепторов и обладают характерным для |1-агонистов действием, исключая анальгезию. Было показано, что [ Н]эндоморфин-1 и -2 специфично связываются не только с высокоаффинными ц-опиоидными рецепторами, но и взаимодействует с налоксон-нечувствительными участками связывания на мембранах головного мозга крысы. Неопиоидные рецепторы эндоморфина-1 отличаются более низкой аффинностью, за связывание с ними конкурируют различные эндогенные агонисты опиоидных рецепторов [18, 37].

И наконец, ноцицептин, или орфанин FQ, пептид, обладающий наибольшей гомологией с опиоидным пептидом динорфином А, относится к классу опиоидных пептидов. Его фармакологическое действие весьма разнообразно: стимулирует активность нейронов, обеспечивает анальгезию в спинном мозге, регулирует высвобождение гормонов гипофиза в покое и при стрессе [98]. Пептид является природным лигандом нечувствительных к налоксону orphan-рецепторов, сопряженных с G-белками, этот тип рецепторов имеет высокую степень гомологии с к-опиоидными рецепторами [97, 100, 101]. Другие опиоидные лиганды не способны активировать orphan-рецепторы, не считая нескольких исключений - это динорфин А, налоксон-бензоилгидразон и лофентанил.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что многие опиоидные пептиды, взаимодействующие с классическими опиоидными рецепторами, связываются также с рецепторами неопиоидной природы. На данном этапе исследований, достоверно установлено, что у опиоидных пептидов [Ме^энкефалина, ВАМ22, ноцицептина, эндоморфинов-1 и -2 существуют собственные неопиоидные рецепторы.

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 1. Материалы и методы 1. Реактивы

В работе использовали 1,3,4,6-тетрахлор-За,6а-дифенилгликоурил (Иодоген), [Ме^энкефалин и а-, у-, Р-эндорфины, сахарозу, БСА, фенилметилсульфонилфторид, трис, коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США); стекловолокнистые фильтры GF/C (Whatman, Великобритания), налоксон, гентамицин, кортикостерон (ICN, США); краситель Гимза, акридиновый оранжевый, трипановый синий (ПанЭко, Россия); ЛПС Salmonella typhi (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия); жидкий сцинтиллятор "Ready Gel" (Beckman, США). Все остальные использованные в работе реактивы были отечественного производства марки х.ч. или о.с.ч.

Меченые соединения: [метил- Щтимидин (удельная активность 76 Ки/ммоль), Na I (удельная активность 2x10 Ки/моль) (Санкт-Петербургское отделение Российского объединения "Изотоп"), [3Н] иммунорфин (удельная активность 24 Ки/ммоль) (Институт молекулярной генетики РАН).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковалицкая, Юлия Андреевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что синтетические (З-эндорфинподобные пептиды иммунорфин (SLTCLVKGFY), пентарфин (VKGFY) и циклопентарфин [cyclo(VKGFY)] активируют перитонеальные макрофаги мыши in vitro: стимулируют способность макрофагов к адгезии, распластыванию, миграции и увеличивают их бактерицидность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415.

3. Показано, что пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин [cyclo(VKGFYVKGFY)] стимулируют процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши, образование и «выклевывание» зрелых бластоцист in vitro.

4. С помощью [ Н]иммунорфина и 1-меченного пентарфина обнаружено, что на перитонеальных макрофагах мыши, клетках человеческой Т-лимфобластной лейкемической линии Jurkat, а также на мембранах коры надпочечников, миокарда, селезенки и головного мозга крысы имеются неопиоидные (не чувствительные к опиоидному антагонисту налоксону) рецепторы, с высоким сродством и специфичностью связывающие Р-эндорфин и p-эндорфинподобные пептиды (иммунорфин, пентарфин, циклопентарфин, циклодипентарфин).

106

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалицкая, Юлия Андреевна, Пущино

1. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования доимплантационных мышиных зародышей // Онтогенез. - 1986. - Т. 17. - С. 553-5.

2. Вальдман А.В., Бондаренко Н.А., Козловская М.М., Русаков Д.Ю., Каликхевич В.Н. Сравнительное исследование психотропной активности тафтсина и его аналогов // Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1982а. -Т. 93.-С. 49-52.

3. Вальдман А.В., Бондаренко Н.А., Камышева В.А., Козловская М.М., Каликхевич В.Н. Анализ нейрохимических механизмов психотропного действия тафтсина и его аналогов // Бюл. Эксп. Биол. Мед. 19826. - Т. 93. - С. 57-60.

4. Ильинский О.Б., Козлова М.В., Кондрикова Е.С. Действие опиоидных пептидов на процессы роста и регенерации нервной ткани крысы // ЖЭБФ. 1985. - Т. 21. -С. 511-515.

5. Калюжный А. Е., Платонов Е. С., Миронова О. В., Сухих Г. Т. Действие опиоидов на развитие доимплантационных мышиных зародышей // Бюл. эксп. биол. мед. 1989. - Т. 108. - С. 622-624.

6. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

7. Сахарова Н.Ю., Лепихова Т.Н., Лепихов К.А., Малкова Н.В., Наволоцкая Е.В., Чайлахян Л.М. Влияние иммуномодулирующих пептидов на доимплантационное развитие мышиных зародышей. // Доклады Акад. Наук. 2002. - Т. 385. - С. 258-261.

8. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М.: Медицина, 1978. - 200 с.

9. Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов. М: Медицина, 1984. - 272 с.

10. Ahmed M.S., Cemerikic B. and Agbas A. Properties and functions of human placental opioid systems // Life Sci. 1991. - V. 50. - P. 83-97.

11. Akil H., Hewlett W.A., Barchas J.D., Li C.H. Binding of 3H.-beta-endorphin to rat brain membranes: characterization of opiate properties and interaction with ACTH // Eur J Pharmacol. 1980. - V. 64. - P. 1-8.

12. Antoni F.A. Hypothalamic control of adrenocorticotropin secretion:advances since the discovery of 41-residue corticotropin-releasing factor //

13. Endocr Rev.- 1986. V. 7.-P. 351-78.

14. Barkhudaryan N., Gambarov S., Gyulbayazyan Т., Nahapetyan K. LVV-hemorphin-4 modulates Ca2+/calmodulin-dependent pathways in the immune system by the same mechanism as in the brain // J Mol Neurosci. -2002. -V. 18.-P. 203-10.

15. Benyhe S., Farkas J., Toth G., Wollemann M. Met5-enkephalin-Arg6-Phe , an endogenous neuropeptide, binds to multiple opioid and nonopioid sites in rat brain // J Neurosci Res. 1997. - V. 48. - P. 249-58.

16. Benyhe S., Monory K., Farkas J., Toth G., Guerrini R., Salvadori S., Orosz G., Wollemann M. Nociceptin binding sites in frog (Rana esculenta) brain membranes // Biochem Biophys Res Commun. 1999. - V. 260. - P. 592-6.

17. Beuschlein F., Fassnacht M., Klink A., Allolio В., Reincke M. ACTH-receptor expression, regulation and role in adrenocortial tumor formation//Eur J Endocrinol.-2001.-V. 144.-P. 199-206.

18. Brantl V., Gramsch C., Lottspeich F., Mertz R., Jaeger K.H., Herz A. Novel opioid peptides derived from hemoglobin: hemorphins // Eur. J. Pharmacol. 1986. - V. 125. - P. 309-10.

19. Carr D.J.J. The role of endogenous opioids and their receptors in the immune system // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1991. - V. 198. - P. 71020.

20. Charmandari E., Tsigos C., and Chrousos G. Endocrinology of the stress response // Ann Rev Physiol. 2005. - V. 67. - P. 259-84.

21. Cheng Y.C., Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Kl) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (150) of an enzymatic reaction // Biochem. Pharmacol. 1973. -V. 22.-P. 3099-108.

22. Clark A.J., Baig A.H., Noon L., Swords F.M., Hunyady L., King P. Expression, desensitization, and internalization of the ACTH receptor (MC2R) // Ann N Y Acad Sci. 2003. - V. 994. - P. 111-7.

23. Coventry T.L., Jessop D.S., Finn D.P., Crabb M.D., Kinoshita H., Harbuz M.S. Endomorphins and activation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis//J Endocrinol.-2001. V. 169.-P. 185-93.

24. Cseh G., Barat E., Patthy A., Graf L. Studies on the primary structure of human beta-lipotropic hormone. // FEBS Lett. 1972. - V. 21. - P. 344

25. Daigo Nutritive Chem. K.K. Tetrapeptide promoting phagocytosis activity of leukocyte. Pat. 064500 (Jap.), 1973 // CPI 56264w/34.

26. Dallman M.F., Akana S.F., Jacobson L., Levin N., Cascio C.S. Shinsako J. Characterization of corticosterone feedback regulation of ACTH secretion // Ann N Y Acad Sci. 1987a. - V. 512. - P. 402-14.

27. Dallman M.F., Akana S.F., Cascio C.S. Darlington D.N., Jacobson L., Levin N. Regulation of ACTH secretion: variations on a theme of В // Recent Prog Horm Res. 1987b. - V. 43. - P. 113-73.

28. Dell'Aquila M.E., Casavola V., Reshkin S.J., Albrizio M., Guerra L., Maritato F., Minoia P. Effects of beta-endorphin and Naloxone on in vitro maturation of bovine oocytes // Mol Reprod Dev. 2002. - V. 63. - P. 210-22.

29. Dhawan B.N., Cesselin F., Ragnubir R., Reisine Т., Bradley P.B., Protoghese P.S., Hamon M. International Union of Pharmacology. XII. Classification of opioid receptors // Pharm Rev. 1996. - V. 48. - P. 56792.

30. Dong X, Han S., Zylka M.J., Simon M.I., Anderson D.J. A diverse family of GPCRs expressed in specific subsets of nociceptive sensory neurons // Cell. 2001. - V. 106. - P. 619-32.

31. Faden A.I. Dynorphin increases extracellular levels of excitatory amino acids in the brain through a non-opioid mechanism // J Neurosci. -1992.-V. 12.-P. 425-9.

32. Fahlbusch В., Dornberger G. Studies of assay conditions for macrophage migration from an agarose droplet // Acta Biol. Med. Ger. -1979.-V. 38.-P. 1453-60.

33. Faletti A.G., Mohn C., Farina M., Lomniczi A., Rettori V. Interaction among beta-endorphin, nitric oxide and prostaglandins during ovulation in rats // Reproduction. 2003. - V. 125. - P. 469-77.

34. Fischer A. and Undern B.J. Naloxone blocks endomorphin-1 but not endomorphin-2 induced inhibition of tachykinergic contractions of guinea-pig isolated bronchus // British J Pharmacol. 1999. - V. 127. - P. 605-8.

35. Fitzer-Attas C.J., Lowry M., Crowley M.T., Finn A.J., Meng F., DeFranco A.L., Lowell C.A. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn // J Exp Med. 2000. - V. 191. - P. 669-82.

36. Freye E., Schnitzler M., Schenk G. Opioid-induced respiratory depression and analgesia may be mediated by different subreceptors // PharmRes.- 1991.-V. 8.-P. 196-9.

37. Gayton R.J. Mammalian neuronal actions of FMRFamide and the1. Z nstructurally related opioid Met-enkephalin-Arg -Phe // Nature. 1982. -V. 298.-P. 275-6.

38. Gessner J.E., Heiken H., Tamm A., Schmidt R.E. The IgG Fc receptor family // Ann Hematol. 1998. - V. 76. - P. 231-48.

39. Giedroc D.P., Puett D. Binding of a synthetic beta-endorphin peptide to calmodulin // Mol. Pharmacol. 1985. - V. 28. - P. 588-93.

40. Gilman S.C., Schwartz J.M., Milner R.J., Bloom F.E., Feldman J.D. P-endorphin enhances lymphocyte proliferative responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 4226-4230.

41. Gilmore W. and Weiner L.P. P-endorphin enhances interleukin-2 (IL-2) production in murine lymphocytes // J. Neuroimmunol. 1988. - V. 18. -P. 125-138.

42. Gilmore W., Weiner L.P. The opioid specificity of beta-endorphin enhancement of murine lymphocyte proliferation // Immunopharmacology. 1989. -V. 17.-P. 19-30.

43. Giordano A.L., Nock В., Cicero T.J. Antagonist-induced up-regulation of the putative epsilon opioid receptor in rat brain: comparison with kappa, mu and delta opioid receptors // J Pharmacol Exp Ther. -1990. V. 255.-P. 536-40.

44. Graf L., Barat E., Cseh G., Sajgo M. Revised amide location for porcine and human adrenocorticotropic hormone // Biochem. Biophys. Acta. 1971.-V. 229.-P. 276-8.

45. Grahme-Smith D.G., Butcher R.W., Ney R.L., Sutherland E.W. Adenosine 3',5'-monophosphate as the intracellular mediator of the action of adrenocorticotropic hormone on the adrenal cortex // J Biol Chem. -1967.-V. 242.-P. 5535-41.

46. Guillemin R., Ling N., Burgus R. Endorphins, hypothalamic and neurohypophysial peptides with morphinomimetic activity: isolation and molecular structure of alpha-endorphin // CR Hebd Seances Acad Sci. -1976.-V. 282.-P. 783-5.

47. Harvey M.B., Leco К .J., Arcellana-Panlilio M. Y., Zhang X., Edwards D.R., Schultz G.A. Roles of growth factors during peri-implantation development // Human reproduction, Oxford. 1995. - V. 10. - P. 712-18.

48. Hauser K.F. and Mangoura D. Diversity of the endogenous opioid system in development // Perspectives in Developmental Neurobiology. -1998.-V. 5.-P. 437-9.

49. Hazum E., Chang K.-J., Cuatercasas P. Specific nonopiate receptors for p-endorphin // Science. 1979. - V. 205. - P. 1033-35.

50. Heijnen C.J., Croiset G., Zijlstra J., Ballieux R.E. Modulation of lymphocyte function by endorphins // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1987. V. 496.-P. 161-5.

51. Herbert E. Discovery of pro-opiomelanocortin cellular polyprotein // TIBS.- 1981.-Jul.-P. 184-8.

52. Herman Z.S., Stachura Z., Opielka L., Siemon I.Z., Nawrocka E. Tuftsin and D-Arg3-tuftsin possess analgesic action // Experientia. 1981. -V.37.P. 76-7.

53. Herman S.Z., Stachura Z., Krzeminski Т., Plech A., Siemion I.Z., Nawrocka E. Central effects of tuftsin // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1983. - V. 419.-P. 156-63.

54. Hildebrand A., Schweigerer L., Teschemacher H. Characterization and identification of heparin-induced nonopioid-binding sites for p-endorphin in human plasma // J Biological Chem. 1988. - V. 263. - P. 2436-41.

55. Houck J.C., Kimball C., Chang C. Placental P-endorphin-like peptides // Science. 1980. - V. 207. - P. 78-79.

56. Hughes J. Isolation of an endogenous compound from the brain with pharmacological properties similar to morphine. // Brain Res. 1975a. -V. 88. - P. 295-308

57. Hughes J., Smith T.W., Kosterlitz H.W., Fothergill L.A., Morgan B.A., Morris H.R. Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity // Nature. 1975b. - V. 258. - P. 577-9.

58. Hulett M.D., Witort E., Brinkworth R.I., McKenzie I.E., Hogarth P.M. Multiple regions of human Fc gamma RII (CD32) contribute to the binding of IgG // J Biol Chem. 1995. - V. 270. - P. 21188-94.

59. Ichinose M., Asai M., Sawada M. |3-endorphin enhances phagocytosis of latex particles in mouse peritoneal macrophages // Scand. J. Immunol. -1995.-V. 42.-P. 311-6.

60. Ishibashi Y., Arai T. Spesific inhibition of fagosome-Iysosome fusion in murine macrophages mediated by Salmonella typhimnrium infection // FEMS Microbiol. Immunol. 1990. - V. 2. - P. 35-43.

61. Jacquet Y.F., Lajtha A. The periaqueductal gray: site of morphine analgesia and tolerance as shown by 2-way cross tolerance between systemic and intracerebral injections // Brain Res. 1976a. - V. 103. - P. 501-13.

62. Jacquet Y.F., Carol M., Russell I.S. Morphine-induced rotation in naive, nonlesioned rats // Science. 1976b. - V. 192. - P. 261-3.

63. Jacquet Y.F., Marks N. The C-fragment of beta-lipotropin: an endogenous neuroleptic or antipsychotogen? // Science. 1976c. - V. 194. -P. 632-5.

64. Jordan B.A., Devi L.A. G-protein-coupled receptor heterodimerization modulates receptor function // Nature. 1999. - V. 399. - P. 697-700.

65. Julliard J.H., Shibasaki Т., Ling N., Guillemin R. High-molecular-weight immunoreactive beta-endorphin in extracts of human placenta is a fragment of immunoglobulin G // Science. 1980. -V. 208. - P. 183-5.

66. Kapas S., Pubrick A., Hinson J.P. Action of opioid peptides on the rat adrenal cortex: stimulation of steroid secretion through a specific mu opioid receptor//J Endocrinol.- 1995.-V. 144.-P. 503-10.

67. Kearney R. and Johnstone S. Serum IgM/A, IgA and functionally distinct IgM anti-type III pneumococcal polysaccharide (SIII) antibodies in BALB/c and athymic (nude) mice // Aust J Exp Biol Med Sci. 1984. - V. 62.-P. 701-9.

68. King A.C. and Cuatrecasas P. Peptide hormone-induced receptor mobility, aggregation, and internalization // New England J Medicine. -1981.-V. 305.-P. 77-88.

69. Lembo P.M.C., Grazzini E, Groblewski Т., Roy M.O., Zhang J., Labarre M. Proenkephalin A gene products activate a new family of sensory neuron-specific GPCR // Nature Neurosc. 2002. - V. 5. - P. 2019.

70. Li C.H., Barnafi L., Chretien M., Chang D. Isolation and amino-acid sequence of beta-LPH from sheep pituitary glands // Nature. 1965. - V. 208.-P. 1093-94.

71. Li C.H. and Chang D. Isolation and structure of an untriakontapeptide with opiate activity from camel pituitary glands // Proc Nat Acad Sci USA. 1976. - V. 73.-P. 1145-8

72. Li C.H., Chang D., Doneen B.A. Isolation, characterization and opiate activity of ^-endorphin from the human pituitary glands // Biochem Biophys Res Commun. 1976a. -V. 72. - P. 1542-7.

73. Li C.H., Lemare S., Yamashiro D., Doneen D.A. The synthesis and opiate activity of P-endorphin // Biochem Biophys Res Commun. 1976b. -V.71.-P. 19-25.

74. Li C.H., Yamashiro D., Tseng L.F., Loh H.H. Beta-endorphin: synthesis and biological activity of shortened peptide chains // Int J Pept Protein Res. 1978. - V. 11. - P. 154-8

75. Li C.H. P-Endorphin // Cell. 1982. - V. 31. - P. 504-505.

76. Lim A.T., Lolait S., Barlow J.W., О W.S., Zois I., Toh B.H., Funder J.W. Immunoreactive beta-endorphin in sheep ovary // Nature. 1983. - V. 303.-P. 709-711.

77. Ling N. And Guillemin R. Morphinomimetic activity of synthetic fragments of P-lipotropin and analogs // Proc Nat Acad Sci USA. 1976. -V. 73. P. 3308-10

78. Liotta A.S., Houghten R., Krieger D.T. Identification of a beta-endorphin-like peptide in cultured human placental cells // Nature. 1982. - V. 295.-P. 593-595.

79. Loh H.H., Tseng L.F., Wie E., Li C.H. р-Endorphin is a potent analgesic agent // Proc Nat Acad Sci USA. 1976. - V. 73. - P. 28952898.

80. Lolait S.J., Lim A.T., Toh B.H., Funder J.W. Immunoreactive beta-endorphin in a subpopulation of mouse spleen macrophages // J Clin Invest. 1984. - V. 73. - P 277-80.

81. Lord J.A.H., Waterfield A.A., Hughes J., Kosterlitz H.W. Endogenous opioid peptides: Multiple agonists and receptors // Nature. 1977. - V. 267. - P. 495-499.

82. Lovegren E.S., Ling N., Puett D. Interaction of alfa-N-acetyl-beta-endorphin and calmodulin // J. Protein Chem. 1988. - V. 7. - P. 35-47.

83. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr O.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 265-73.

84. Malkova N.V., Krasnova S.B., Navolotskaya E.V., Zargarova T.A., Prasolov V.S. Effect of beta-endorphin and beta-endorphin-like peptide immunorphin on the growth of human leukemic cells in vitro // Russ J Immunol. 2002. - V. 3. - P. 239-44.

85. Marinova Z., Vukojevic V., Surcheva S., Yakovleva Т., Cebers G., Pasikova N., Usynin I., Hugonin L., Fang W., Terenius L., Bakalkin G. Translocation of dynorphin neuropeptides across the plasma membrane // J Biol chem. 2005. - V. 280. - P. 26360-70.

86. Martin W.R., Eades C.G., Thompson J.A., Huppler R.E., Gilbert P.E. The effects of morphine and nalorphine like drugs in the nondependent and morphin depended chronic spinal dog // J Pharmacol Exp Ther. 1976. -V. 197.-P. 517-532

87. Martinez J., Winternitz F. Bactericidal activity of tuftsin // J. Molecular Cellular Biochem. 1981.- V. 41.-P. 123-36.

88. Maxwell K.F., Powell M.S., Huliett M.D., Barton P.A., McKenzie I.F., Garrett T.P., Hogarth P.M. Crystal structure of the human leukocyte Fc receptor, Fc gammaRIIa // Nat Struct Biol. 1999. - V. 6. - P. 437-42.

89. McCain H.W., Lamster I.B., Bozzone J.M., Grbic J.T. (3-Endorphin modulates human immune activity via non-opiate receptor mechanisms // Life Sci. 1982. - V. 31. - P. 1619-1624.

90. Meglio M., Hosobuchi Y., Loh H.H., Adams J.E., Li C.H. p-Endorphin: Behavioral and analgesic activity in cats // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. - V. 74. - P. 774-6.

91. Melzig M.F., Nylander I., Vlaskovska M., Terenius L. P-endorphin stimulates proliferation of small cell lung carcinoma cells in vitro via nonopioid binding sites // Exp. Cell Res. 1995. V. 219. - P. 471-476.

92. Meunier J.-C., Mollereau C., Toll L., Suaudeau C., Moisand C., Alvinerie P., Butour J.-L., Costentin J. Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor // Nature. -1995.-V. 377.-P. 532-5.

93. Meunier J.-C. Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor-like ORL1 receptor // Eur J Pharmacol. 1997. - V. 430. - P. 1-5.

94. Moeller I., Lew R.A., Mendelsohn F.A., Smith A.I., Brennan M.E., Tetaz T.J., Chai S.Y. The globin fragment LVV-hemorphin-7 is an endogenous ligand for the AT4 receptor in the brain // J. Neurochem. -1997.-V. 68.-P. 2530-7.

95. Mollereau C., Simons M.J., Soularue P., Liners F., Vassart G., Meunier J.-C., Parmentier M. Structure, tissue distribution, and chromosomal localization of the prepronoociceptin gene // Pro Nat Acad Sci USA. 1996. - V. 93. - P. 8666-70.

96. Najjar V.A., Nishioka K. "Tuftsin": a natural phagocytosis stimulating peptide // Nature. 1970. - V. 228. - P. 672-3.

97. Nakanishi S., Inoue A., Kita Т., Nakamura M., Chang A.C., Cohen S.N., Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor // Nature. 1979. - V. 278. - P. 423-7.

98. Navolotskaya E.V., Malkova N.V., Zargarova T.A., Lepikhova T.N., Zav'yalov V.P., Lipkin V.M. Synthetic beta-endorphin-like peptide immunorphin binds to non-opioid receptors for P-endorphin on T lymphocytes // Peptides. 2001. - V. 22. - P. 2009-13.

99. Navolotskaya E.V., Zargarova T.A., Malkova N.V., Krasnova S.B., Zav'yalov V.P., Lipkin V.M. Synthetic peptide SLTCLVKGFY competes with р-endorphin for naloxone-insensitive binding sites on rat brain membranes//Peptides.-2002.- V. 23.-P. 1115-19.

100. Oh Y., Alpuche-Aranda C., Berthiaume E., Jinks Т., Miller S.I., Swanson J.A. Rapid and complete fusion of macrophage lysosomes with phagosomes containing Salmonella typhimurium II Infection and Immunity. 1996. - V. 64. - P. 3877-83.

101. Ortega E., Forner M.A., Barriga C. Effect of P-endorphin on adherence, chemotaxis and phagocytosis of Candida albicans by peritoneal macrophages // Сотр. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1996. - V. 19. - P. 267-74.

102. Owen D.L., Morley J.S., Ensor D.M., Miles J.B. The C-terminal tetrapeptide of P-endorphin (MPF) enhances lymphocyte proliferative responses//Neuropeptides. 1998.-V. 32.-P. 131-9.

103. Riad M., Mogos M., Thangathurai D., Lumb P.D. Steroids // Curr Opin Crit Care. 2002. - V. 4. - P. 281-4.

104. Rochford J., Godin C., Henry J.L. Intrathecal administration of dynorphin A and its fragments increase heart rate and arterial pressure in the urethane anesthetized rat: mediation by nonopioid mechanism // Brain Res. 1991. - V. 565. - P. - 67-77.

105. Saltarelli D., Fischer S., Gacon G. Modulation of adenylate cyclase by guanine nucleotides and Kirsten sarcoma virus mediated transformation // BiochemBiophys Res Commun. 1985. - V. 127.-P. 318-25.

106. Schweigerer L., Bhakdi S., Teschemacher H. Specific non-opiate binding sites for human P-endorphin on the terminal complex of human complement // Nature. 1982. - V. 296. - P. 572-4.

107. Schweigerer L., Schmidt W., Teschemacher H., Gramsch С. P-endorphin: surface binding and internalization in thymoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82. - P. 5751-5.

108. Schwyzer R. Molecular mechanism of opioid receptor selection // Biochem. 1986. - V. 25. - P. 6335-42.

109. Shahabi N.A., Linner K.M., Sharp B.M. Murine splenocytes express a naloxone-insensitive binding site for P-endorphin // Endocrinol. 1990a. -V. 126.-P. 1442-8.

110. Shahabi N.A., Peterson P.K., Sharp B. P-endorphin binding to naloxone-insensitive sites on a human mononuclear cell line (U937): effects of cations and guanosine triphosphate // Endocrinol. 1990b. - V. 126.-P. 3006-15.

111. Shaker M. Shahabi N.A., Sharp B.M. Expression of naloxone-resistant (3-endorphin binding sites on A20 cells: effect of concanavalin A and dexamethasone // Immunopharmacol. 1994. - V. 28. - P. 183-92.

112. Shane R., Lazar D.A., Rossi G.C., Pasternak G.W., Bodnar R.J. Analgesia elicited by OFQ/nociceptin and its fragments from the amygdala in rats // Brain Res. 2001. - V. 907. - P. 109-16.

113. Siemion I.Z., Kluczyk A. Tuftsin: On the 30-year anniversary of Victor Najjar's discovery // Peptides 1999. - V. 20. - P. 645-74.

114. Simantov R. and Snyder S.H. Morphine-like peptides in mammalian brain: Isolation, structure elucidation, and interactions with the opiate receptor // Proc Nat Acad Sci USA. 1976. - V. 73. - P. 2515-19

115. Simonin F. and Kieffer B.L. Two faces for an opioid peptide- and more receptors for pain research // Nature Neurosci. 2002. - V. 5. - P. 185-6.

116. Simpkins C.O., Dickey C.A., Fink M.P. Human neutrophil migration is enhanced by p-endorphin // Life Sci. 1984. - V. 34. - P. 2251 -5.

117. Smith E.M. and Blalock J.E. Human lymphocyte production of ACTH and endorphin-like substances: association with leukocyte interferon // Proc Nat Acad Sci USA. 1981. - V. 78. - P. 7530- 4.

118. Sondermann P., Jacob U. Kutscher C., Frey J. Characterization and crystallization of soluble human Fc gamma receptor II (CD32) isoforms produced in insect cells // Biochemistry. 1999. - V. 38. - P. 8469-77.

119. Sondermann P., Huber R., Oosthuizen V., Jacob U. The 3.2-A crystal structure of the human IgGl Fc fragment-Fc gammaRIII complex // Nature. 2000. - V. 406. - P. 267-73.

120. Spiess J., Rivier J., Rivier C., Vale W. Primary structure of corticotropin-releasing factor from ovine hypothalamus // Proc Natl Acad Sci U S A. 1981. - V. 78. - P. 6517-21.

121. Stabinsky Y., Gottlieb P., Hiller Y., Beretz A., Hazum E., Tzehoval E., Feldman M., Segal S., Zakuth V., Spirer Z. Tuftsin receptors // Ann N Y Acad Sci. 1983. - V. 419. - P. 93-106.

122. Szalay K.S. Effects of pro-opiomelanocortin peptides. on adrenocortical steroidogenesis // J Steroid Biochem Mol Biol. 1993. - V. 45.-P. 141-6.

123. Szeto H.H. Dynorphin and the hypothalamo-pituitary-adrenal axis during fetal development // Life Sci. 2003. - V. 27. - P. 749-58.

124. Szikra J., Benyhe S., Orosz G., Darula Z., Piot J.M., Fruitier I., Monory K., Hanoune J., Borsodi A. Radioligand binding properties of VV-hemorphin 7, an atypical opioid peptide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 281. - P. 670-7.

125. Takarada Т., Balcar V.J., Baba K., Takamoto A., Acosta G.B.,л

126. Takano K., Yoneda Y. Uptake of JH.L -serine in rat brain synaptosomal fractions // Brain Res. 2003. - V. 983. - P. 36-47.

127. Takemori A.E., Loh H.H., Lee N.M. Suppression by dynorphin A and DES-Tyr'.Dynorphin A peptides of the expression of opiate withdrawal and tolerance in morphine-dependent mice // J Pharm Exp Therap. 1993. -V. 266.-P. 121-4.

128. Tang Q., Gandhoke R., Burrit A., Hruby V.J., Porreca F., Lai J. High affinity interaction of des-tyrosyl.dynorphin A (2-17) with NMDA receptor // J Pharm Exp Therap. 1999. - V. 291. - P. 760-5.

129. Tang Q., Lynch R.M., Porreca F., Lai J. Dynorphin A elicits an increase in intracellular calcium in cultured neurons via a non-opioid, non-NMDA mechanism // J Neurophys. 2000. - V. 83. - P. 2610-2615.

130. Taylor C.C., Wu D., Soong Y., Yee J.S., Szeto H.H. Dynorphin Аиз stimulates ovine fetal pituitary-adrenal function through a novel nonopioid mechanism // J Pharmacol Exp Ther. 1997a. - V. 280. - P. 416-21.

131. Taylor C.C., Wu D., Soong Y., Yee J.S., Szeto H.H. Opioid modulation of the fetal hypothalamic-pituitary-adrenal axis: the role of receptor subtypes and route of administration // J Pharmacol Exp Ther. -1997b.-V. 281.-P. 129-35.

132. Taylor P.R., Martinez-Pomares L., Stacey M., Lin H.H., Brown G.D., Gordon S. Macrophage receptors and immune recognition // Annu Rev Immunol. 2005. - V. 23. - P. 901-44.

133. Terenius L. Letter: A rapid assay of affinity for the narcotic receptor in rat brain: application to methadone analogues // Acta Pharmacol Toxicol (Copenh). 1974. - V. 34. - P. 88-91.

134. Terenius L. and Wahlstrom A. Search for an endogenous ligand for the opiate receptor // Acta Physiol Scand. 1975. - V. 94. - P. 74-81.

135. Trujillo K.A. and Akil H. Inhibition of morphine tolerance and dependence by the NMDA antagonist MK-801 // Science. 1991. - V. 251.-P.-85-87.

136. Tseng L.F., Loh H.H., Li C.H. P-Endorphin: cross tolerance to and cross physical dependence on morphine // Proc Natl Acad Sci U S A. -1976a.-V. 73.-P. 4187-9.

137. Tseng L.F., Loh H.H., Li C.H. P-Endorphin as a potent analgesic by intravenous injection // Nature. 1976b. - V. 263. - P. 239-40.

138. Tseng L.F., Menon M.K., Loh H.H. Comparative actions of monomethoxyamphetamines on the release and uptake of biogenic amines in brain tissue // J Pharmacol Exp Ther. 1976c. - V. 197. - P. 263-71.

139. Tseng L.F. Evidence for epsilon-opioid receptor-mediated P-endorphin-induced analgesia // Trends Pharmacol sci. 2001. - V. 22. - P. 623-30.

140. Tsigos C. and Chrousos G.P. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress // J Psychosomatic Res. 2002. - V. 53. -P. 865-71.

141. Udenfriend S., Zaltzman P. Fluorescence characteristics of purines, pyrimidines, and their derivatives: measurement of guanine in nucleic acid hydrolyzates // Anal Biochem. 1962. - V. 3. - P. 49-59.

142. Vaccarino A.L., Olson G.A., Olson R.D., Kastin A.J. Endogenous opiates // Peptides. 1999. - V. 20. - P. 1527-74.

143. Vale W., Spiess J., Rivier C., Rivier J. Characterization of a 41-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-endorphin // Science. 1981. - V. 213. - P. 1394-7.

144. Van Der Bergh P., Rozing J., Nagelkerken L. Two opposing modes of action of P-endorphin on lymphocyte function // Immunol. 1991. - V. 72.-P. 537-43.

145. Van Der Bergh P., Rozing J., Nagelkerken L. Identification of two moieties of P-endorphin with opposing effects on rat T-cell proliferation // Immunol. 1993. - V. 79. - P. 18-23.

146. Wahlstrom Т., Laatikainen Т., Salminen K., Leppaluoto J. Immunoreactive beta-endorphin is demonstrable in the secretory but not in the proliferative endometrium // Life Sci. 1985. - V. 36. - P. 987-990.

147. Wollemann M., Benyhe S., Simon J. The kappa opioid receptor: evidence for the different sybtypes //Life sci. 1993. V. 52. - P. 599-611.

148. Wollemann M., Farkas J., Toth G., Benyhe S. Characterization of 3H.Met-enkephalin-Arg6-Phe7 binding to opioid receptors in frog brain membrane preparations // J Neurochem. 1994. -.V. 63. - P. 1460-5.

149. Wollemann M., Farkas J., Toth G., Benyhe S. Comparison of the endogenous heptapeptide Met-enkephalin-Arg6-Phe7 binding in amphibian and mammalian brain // Acta Biol Hung. 1999. - V. 50. - P. 297-307.

150. Wollemann M. and Benyhe S. Presence of 3H.Met-enkephalin-Arg-Phe binding sites on Chinese hamster ovary cells transfected with к-opioidreceptors // In: Proceedings of 3rd European Opioid Conference, Guilford, Great Britain. 2000. - P. Ml8.

151. Wollemann M. and Benyhe S. Non-opioid actions of opioid peptides //Life sci. 2004. - V. 75. - P. 257-270.

152. Woods J.A., Shahabi N.A., Sharp B.M. Characterization of a naloxone-insensitive P-endorphin receptor on murine peritoneal macrophages // Life Sci. V. 1997. - P. 573-86.

153. Wu C.S., Lee N.M., Loh H.H. Yang J.T. Li C.H. P-Endorphin: formation of alpha-helix in lipid solutions // Proc Natl Acad Sci U S A. -1979.-V. 76.-P. 3656-9.

154. Yang Y.R., Chiu Т.Н. Opioid and antiopioid actions of Tyr-MIF-1, Tyr-W-MIF-1 and emorphin-4 on rat locus coeruleus neurons: intracellular recording in vitro // Chin. J. Physiol. 1997. - V. 40. - P. 131-5.

155. Yarigin K.N., Zhang X.H., Lee N.M. Non-opioid dynorphin binding site on secretory vesicles of a pituitary-derived cell line // Brain Res. -1998.-V. 79.-P. 99-107.

156. Zagon I. S. and McLaughlin P.J. Identification of opioid peptides regulating proliferation of neurons and glia in the developing nervous system//Brain Res. 1991. - V. 542. - P. 318-23.

157. Zagon I.S., Verderame M.F., Allen S.S., Mclaughlin P.J. Cloning, sequencing, chromosomal location, and function of cDNAs encoding an opioid growth factor (OGFr) in humans // Brain Res. 2000. - V. 856. - P. 147-54.

158. Zenker N., Bernstein D.E. The estimation of small amounts of corticosterone in rat plasma // J Biol Chem. 1958. - V. 231. - P. 695701.1271. БЛАГОДАРНОСТИ

159. Выражаю большую благодарность своему научному руководителю д.б.н. Наволоцкой Е.В. за ее терпение, поддержку, советы, неоценимую помощь в работе над диссертацией.

160. Искренне благодарна Сахаровой НЛО. за обучение, обсуждение проблем эмбриологии млекопитающих, руководство при проведении экспериментов по изучению влияния (3-эндорфинподобных пептидов на раннее развитие эмбрионов мыши.

161. Особенно признательна Ваниной В.И., Ваниной Л.С., Мурановой Т.А. и Липкину В.М. за поддержку, участие и содействие при выполнении данной работы.

162. Выражаю большую благодарность Шаровой Н.И. и сотрудникам института иммунологии РАМН за помощь в проведении исследований по иммуногенности исследуемого пептида иммунорфина.

163. Выражаю искреннюю благодарность моим родным и близким за поддержку, советы и помощь во время выполнения работы и написания диссертации.

Информация о работе

Ковалицкая, Юлия Андреевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалицкая, Юлия Андреевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковалицкая, Юлия Андреевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалицкая, Юлия Андреевна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия