Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование неопиоидной рецепции β-эндорфина в доимплантационном развитии эмбриона мыши
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Исследование неопиоидной рецепции β-эндорфина в доимплантационном развитии эмбриона мыши"
На правах рукописи
45563
Чернов Александр Сергеевич
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕОПИОИДНОЙ РЕЦЕПЦИИ Р-ЭНДОРФИНА В ДОИМПЛАНТАЦИОННОМ РАЗВИТИИ ЭМБРИОНА МЫШИ
03.01.02-Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 2 МАЙ 2011
Пущино-2011
4845563
Работа выполнена в лаборатории роста клеток и тканей Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Научные руководители: кандидат физико-математических наук
Давыдова Галина Анатольевна
доктор медицинских наук, профессор Гаврилюк Борис Карпович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Погорелов Александр Григорьевич
доктор биологических наук Шмуклер Юрий Борисович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук
Институт биофизики клетки РАН
Защита диссертации состоится «Ц» мая 2011 г. в 14 — часов на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат разослан «11» апреля 2011 г.
Ученый секретарь ,/
диссертационного совета -//¿^¿¿н^' Ланина Н.Ф.
кандидат физ.-мат. наук х
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Тесное взаимодействие иммунной и нейроэндокринной систем осуществляется благодаря использованию общих сигнальных молекул и их рецепторов в качестве общего химического языка. p-Эндорфин - опиоидный нейропептид, является одной из таких молекул и способен регулировать основные функции организма, осуществляя тесное взаимодействие нервной, иммунной и эндокринной систем. Установлено, что молекула Р-эндорфина содержит три различных участка, ответственных за специфическое связывание с рецепторами. Концевые участки p-эндорфина отвечают за взаимодействие с ц- и 8- опиоидными рецепторами (Li, 1976), а центральная часть - с неизвестным типом рецепторов Р-эндорфина (нечувствительными к специфическому блокатору опиоидных рецепторов налоксону) - неопиоидными рецепторами (Hazum et al., 1979). В настоящее время показано наличие неопиоидных рецепторов Р-эндорфина в иммунной, нервной и эндокринной системах организма млекопитающих (Hazum et al., 1979; Наволоцкая и др., 2004; Ковалицкая и др., 2010; Nekrasova et al., 2010). Кроме того, известно, что Р-эндорфин способен синтезироваться тканями репродуктивной системы (Lim et al., 1983; Wahlstrom et al., 1985; Czaja et al., 1996; Okrasa et al., 2003). Несмотря на это, до сих пор остается неясным, существуют ли неопиоидные рецепторы Р-эндорфина на ранних стадиях развития эмбрионов млекопитающих и если существуют, то какую роль они играют в доимплантационном развитии.
В репродуктивной системе также был обнаружен иммуноглобулин G (IgG), представляющий собой один из основных белков плазмы крови (Fahev, 1965; Oliphant et al., 1978; Parr et al., 1985). В отличие от других типов иммуноглобулинов (A, M и др.), иммуноглобулины класса G имеют относительно небольшой молекулярный вес (около 150 кДа) и поэтому могут проникать через плаценту от матери к плоду (Yasuhara et al., 2010). Предполагают, что таким образом обеспечивается пассивный иммунитет новорожденного ребенка к некоторым инфекционным заболеваниям (Awdeh et al., 1970; Rasheed et al., 1995; Maidji et al., 2006; Strunk et al., 2011;). Также было показано, что в жидкости яйцевода присутствуют протеазы, под действием которых IgG может расщепляться на короткие пептиды (Tauber et al., 1985; Gandolfi et al., 1995; Mugnier et al., 2009), и был обнаружен пептид, представляющий собой фрагмент 364-377 тяжелой цепи IgG (Julliard et al., 1980). Как оказалось, он имел 50% подобия с центральной частью
молекулы p-эндорфина (рис.1), и в последствии был назван иммунорфином (Zav'yalov et al„ 1996).
1
31
(J-эндорфин GFMTSEK5Q7PiFTL/TCNAI/KNAYKKGE
фрагмент HuIgG(364-377)
364
377
-5L7"CXFKGFYPSD/-
Иммунорфин
SLTCLVKGFY
Пентарфин
FKGFY
Циклопентарфин
VKGFY
Рисунок 1. Аминокислотная последовательность Р-эндорфина, фрагмента тяжелой цепи IgG человека, иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина (жирным курсивом выделены совпадающие аминокислоты).
Значение и функциональная роль этого пептида в репродуктивной системе в настоящее время не выявлены. Однако как было показано, пептид способен взаимодействовать только с неопиоидным рецептором p-эндорфина и для связывания достаточно последовательности VKGFY (рис.1) (Наволоцкая и др., 2004; Ковалицкая, 2010).
Таким образом, изучение с помощью P-эндорфина и коротких фрагментов IgG ф-эндорфинподобных пептидов) роли неопиоидного рецептора P-эндорфина в течении доимплантационного эмбриогенеза млекопитающих представляет научный и практический интерес. Для исследования неопиоидной рецепции на ранних эмбрионах мыши был синтезирован фрагмент 369-373 тяжелой цепи IgG - пентарфин и его циклическая форма -циклопентарфин (рис.1).
Цель работы
Целью настоящей работы является исследование неопиоидной рецепции р-эндорфина и фрагментов иммуноглобулина G в доимплантационном развитии эмбрионов мыши в условиях культивирования in vitro.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи исследования:
1) Изучить влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 2-, 4-, и 8-клеточных эмбрионов мыши в условиях in vitro;
2) Определить пути передачи внутриклеточного сигнала при действии пентарфина и циклопентарфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши;
3) Определить пути передачи внутриклеточного сигнала при действии p-эндорфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши;
4) Исследовать действие циклопентарфина на выживаемость 8-клеточных эмбрионов мыши при криоконсервации (витрификации);
5) Исследовать воздействие предварительной инкубации 8-клеточных эмбрионов мыши с циклопентарфином на их выживаемость при постимплантационном развитии.
Научная новизна работы. Результаты данной работы являются первым экспериментальным доказательством того, что у доимплантационных эмбрионов мыши присутствуют неопиоидные (не чувствительные к налоксону) рецепторы р-эндорфина. Показано, что Р-эндорфин и короткие фрагменты IgG 369-373 (Р-эндорфинподобные пептиды пентарфин и циклопентарфин) являются неспецифическими факторами роста ранних эмбрионов мыши и принимают непосредственное участие в доимплантационном развитии. Установлено, что стимулирующее действие гормона и синтетических пептидов на ранние эмбрионы мыши через неопиоидные рецепторы Р-эндорфина осуществляется при участии аденилатциклазной сигнальной системы. Исследуемые пептиды пентарфин и циклопентарфин имеют высокое сродство к неопиоидному рецептору Р-эндорфина и поэтому любой из этих пептидов может быть использован в качестве специфического маркера для данного рецептора.
Практическая ценность результатов работы. Биологически-активные пептиды привлекают внимание ученых и фармакологов и активно используются в самых разных сферах медицины. Несомненными достоинствами Р-эндорфина и синтетических коротких фрагментов IgG при использовании их на практике являются эндогенное происхождение, отсутствие токсичности, простота расщепления молекул в организме и последующее
использование продуктов деградации - аминокислот в биохимических реакциях. Способность p-эндорфина и синтетических пептидов повышать жизнеспособность эмбрионов, улучшать их морфологическое состояние, снижать процент гибели ранних эмбрионов может найти применение как в экспериментальной эмбриологии (получение и сохранение редких видов животных, создание химер), так и в медицинской практике (технологии экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида). Таким образом, проведенные исследования позволяют рекомендовать использование p-эндорфина и p-эндорфинподобных пептидов в качестве добавки в среды для культивирования ранних эмбрионов, что позволит оптимизировать условия культивирования in vitro и приблизить их к таковым in vivo.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); на XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008); на XI Всероссийской конференции «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008); на международной конференции «Лазерно-информационные технологии в медицине, биологии и геоэкологии - 2009» (Абрау-Дюрсо, 2009); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009); на международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2010» (Москва, 2010); на международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 2010); на XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); на «5th Congress of the world association of reproductive medicine WARM-2010» (Moscow, 2010).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 12 печатных работах, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, 1 - в сборнике и 9 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 127 страницах, иллюстрирован 29 рисунками и II таблицами. Список литературы содержит 173 цитируемых источника, из которых 13 на русском и 160 на иностранном языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все экспериментальные данные, описанные в работе, получены с использованием мышей SHK и С57В1/6, содержащихся в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН.
Синтетические пептиды. Получены в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Пептиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе Vega Coupler, модель С250 (США), очищены до гомогенного состояния препаративной обращенно-фазовой хроматографией (хроматограф Gilson, Франция, колонка Waters SymmetryPrep). Синтезированные соединения охарактеризованы данными аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограф Gilson, Франция, колонка XTerra RP18), аминокислотного анализа (аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Finnigan, США). Использовали ß-эндорфин человека (Sigma, США) и налоксон (ICN, США).
Выделение и культивирование ранних эмбрионов. Эксперименты проводили на 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионах, полученных от 8-10 недельных самок мышей стока SHK, которых забивали цервикапьной дислокацией. 2-клеточные эмбрионы вымывали на 2-ой день беременности из яйцеводов, 4- и 8-клеточные - на 3-ий из яйцеводов и верхней части рогов матки. Эмбрионы культивировали при 37°С в атмосфере 5% С02 в среде MI6 с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки до достижения эмбрионами контрольной группы стадии бластоцисты. Подсчитывали общее количество сформировавшихся бластоцист, в том числе вышедших из оболочки оплодотворения, и количество номально развитых бластоцист (представляющих собой трофобластические пузырьки с аномально крупными клетками внутренней клеточной массы и трофобласта). Наблюдения за состоянием эмбрионов проводили каждые 24 часа с помощью микроскопа (Axiovert 200, Zeiss). Оценивали внешний вид и количество развивающихся эмбрионов в каждой группе. К развивающимся эмбрионам относили эмбрионы, успешно прошедшие деление дробления и перешедшие на следующую стадию развития, характерную для определенного времени культивирования in vitro. В каждом эксперименте для каждой подгруппы использовали от 3 до 10 эмбрионов. Исследовали действие ß-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в концентрациях 1, 0,1 0,01 и 0,001 мкМ. В качестве специфического блокатора опиоидных рецепторов использовали налоксон (1 мкМ).
Флуоресцентная микроскопия. Эксперименты проводили с помощью флуоресцентной станции на базе Axiovert 200М с использованием камеры AxioCam HRm (Carl Zeiss) и наборами светофильтров для регистрации флуоресценции, а также с помощью двухволнового микрофлуориметра «Радикал ДМФ-2» (Карнаухов и др., 2008). В каждом эксперименте использовалось от 3 до 10 эмбрионов. Регистрацию внутриклеточной концентрации ионов Са2+ проводили с помощью флуоресцентного зонда Fluo-ЗАМ. Эмбрионы нагружали 5 рМ эфира Fluo-ЗАМ в среде Хенкса (без фенолового красного, без сыворотки) и ставили на 40 мин в СОг-инкубатор. Получали серии
изображений эмбрионов с интервалом 5 секунд. Обработку изображений проводили с помощью программы ImageJ 1.36b. Для определения роли вне- и внутриклеточных ионов
измерения проводили в стандартной среде Хенкса и в бескальциевой среде Хенкса с замещением СаС12 на 0,5мМ ЭГТА. Использовали нормировку сигнала Fluo-ЗАМ на максимальный сигнал по иономицину (Са2+-ионофор) в концентрации 1мкМ (Sigma). Для определения роли инозитолфосфатной и аденилатциклазной сигнальных систем в передачи сигнала Р-эндорфином, пентарфином и циклопентарфином через неопиоидные рецепторы у ранних эмбрионов использовали специфические блокаторы активности фосфолипазы С (U73122, Sigma) и аденилатциклазы (SQ22,536, Sigma).
Сверхбыстрое замораживание (витрификация) ранних эмбрионов.
Эксперименты по сверхбыстрому замораживанию проводили на 8-клеточных эмбрионах мыши. В качестве компонентов криопротекторной среды использовали стандартную смесь проникающих в клетку (глицерин) и не проникающих (сахароза) веществ (в соотношение 1:3). Эмбрионы первой опытной группы культивировали in vitro с циклопентарфином в концентрации 0,1 мкМ в течение 24 часов в среде М16 до замораживания. Эмбрионы контрольной группы культивировали в среде М16 в течение 24 часов без добавления пептида. Затем эмбрионы помещали в криосоломинку и погружали в жидкий азот. Замороженные эмбрионы переносили в сосуд Дюара с жидким азотом и хранили в течение 3-5 дней. Затем их размораживали при 37°С и продолжали культивирование в стандартных условиях, оценивая качество эмбрионов и процент их гибели. Вторую опытную группу эмбрионов до замораживания культивировали 24 часа в среде М16 без добавления пептида, а после размораживания культивировали в среде, содержащей циклопентарфин 0,1 мкМ, до достижения контрольными эмбрионами стадии бластоцисты.
Трансплантация эмбрионов псевдобеременным самкам-реципиентам. Данный метод состоит из трех последовательных этапов. Первый этап: подготовка вазектомированных самцов. С помощью хирургического вмешательства по стандартному протоколу самцам перерезали семявыносящие канальцы. Второй этап: подготовка псевдобеременных самок. Мышей-реципиентов ссаживали с вазектомированными самцами, происходило скрещивание, по наличию у самок копулятивной пробки судили о наступившей псевдобеременности. Третий этап: трансплантация. 8-клеточные эмбрионы, полученные от самок-доноров, культивировали в течение 48 часов до стадии бластоцисты в присутствии циклопентарфина в концентрации 0,1 мкМ. Трансплантацию эмбрионов проводили согласно стандартной методике. Обработанные эмбрионы вводили в полость матки с помощью микрокапилляра. Спустя 17-18 дней у самок-реципиентов после пересадки эмбрионов регистрировали беременность и роды. По достижению новорожденными мышами месячного возраста оценивали количество и качество помета.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью системы электронных таблиц Microsoft Excel MS 2007 и Origin 7.0. Для определения средних значений использовали данные 5-10 независимых экспериментов. Для каждой исследуемой группы использовалось не менее 35 эмбрионов. Для сравнительной оценки средних величин использовали U-критерий Манна-Уитни (Лакин, 1990).
8
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование влияния p-эндорфпна, пентарфина и циклопентарфина на доимплантаиионное развитие ранних эмбрионов мыши в условиях in vitro
Согласно литературным источникам концентрация Р-эндорфина в репродуктивной системе лежит в диапазоне от 0,001 до 0,1 мкМ (Bernasconi, 1988; Forsberg, 1990; Okrasa, 2003). В связи с этим мы провели сравнительный анализ воздействия Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на образование бластоцист из 2-клеточных эмбрионов мыши в концентрации от 0,001 до 1 мкМ. При концентрации пептидов 0,001 - 0,01 мкМ не было обнаружено отличий в развитии эмбрионов по сравнению с контролем. Добавление Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в концентрации 0,1-1 мкМ приводило к увеличению количества нормально сформировавшихся бластоцист по сравнению с контролем (на 7%, 10% и 17% для Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина соответственно). На основании полученных результатов была выбрана эффективная концентрация Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина, которая составила 0,1 мкМ.
Эффект действия пептидов на развитие 2-клеточных эмбрионов проявляется уже через 24 часа культивирования (рис. 2).
Рисунок 2. Влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на процесс развития 2-клеточных эмбрионов мыши in vitro.
В группе пентарфина и циклопентарфина количество эмбрионов, успешно прошедших деления дробления и перешедших на следующую стадию развития, составило 96 и 100% соответственно, при том, что в контроле их оказалось 84%. Через 72 часа в контроле процент развивающихся эмбрионов составил 56%. В то время как в присутствии
р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина развилось 82, 80 и 88% эмбрионов соответственно.
При культивировании 2-клеточных эмбрионов в присутствии р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в концентрации 0,1 мкМ обнаружено, что все исследуемые пептиды оказывали положительное действие на развитие эмбрионов. Культивирование эмбрионов проводили до достижения ими стадии бластоцисты, последней стадии доимплантационного развития. Подсчитывали количество нормально развитых бластоцист, в том числе выклюнувшихся бластоцист, и бластоцист с аномальным развитием (табл. 1).
Таблица 1. Анализ бластоцист, сформировавшихся в присутствии Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина (в концентрации 0,1 мкМ) при культивировании _ доимплантационных эмбрионов в условиях in vitro._
Общее Бластоцисты, Аномально
Воздействие Общее количество от общего развитые
количество сформировавши количества, бластоцисты от
эмбрионов хся бластоцист выходящие из общего количества
zona pellucida
кол-во % кол-во % кол-во %
2-клсточные эмбрионы
Контроль 29 19 65 4 14 2 7
р-эндорфин 36 28 77 5 14 3 8
Пентарфин 38 31 81* 10 28* 2 4
Циклопентарфин 37 31 85* 10 26* 2 6
4-клеточные эмбрионы
Контроль 31 21 69 4 13 2 6
р-эндорфин 36 29 81* 5 14 2 6
Пентарфин 35 29 83* 8 23* 2 5
Циклопентарфин 35 30 85* 11 31* 1 3
8-клеточные эмбрионы
Контроль 36 27 76 9 27 3 9
р-эндорфин 37 31 84* 14 39 1 3
Пентарфин 36 33 91* 19 53* 0 0*
Циклопентарфин 37 34 93* 23 63* 0 0*
* достоверное различие по отношению к контролю, р<0,01 (11-критерий Манна-Уитни)
Количество сформировавшихся бластоцист на 3-й сутки культивирования 2-клеточных эмбрионов в присутствии пентарфина и циклопентарфина (81 и 85% соответственно) достоверно превышало показатели контрольной группы (65%), в то время как при добавлении Р-эндорфина было всего 77% сформировавшихся бластоцист. В
10
присутствии пентарфина и циклопентарфина были отмечены случаи «выклёвывания» бластоцист - разрыв оболочки оплодотворения и выход зрелой бластоцисты (28 и 26% соответственно). Полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии p-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 2-клеточных эмбрионов мыши. В присутствии тестируемых пептидов развитие эмбрионов до стадии бластоцисты происходит быстрее, чем в контроле, при этом количество аномально развитых бластоцист не увеличивается.
При культивировании 4-клеточных эмбрионов мыши все исследуемые пептиды не оказывали отрицательного воздействия на их развитие при культивировании in vitro. Через 72 часа в контроле процент развивающихся эмбрионов составил 66%. В то время как в присутствии циклопентарфина развилось 88% эмбрионов (рис. 3).
Время культивирования, ч
Рисунок 3. Влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на процесс развития 4-клеточных эмбрионов мыши in vitro.
В присутствии Р-эндорфина и пентарфина наблюдалось достоверное увеличение количества развивающихся эмбрионов по отношению к контролю. Для Р-эндорфина эта величина составила 80%, а для пентарфина - 82%. Эти данные свидетельствуют о том, что Р-эндорфин, пентарфин и циклопентарфин способствуют развитию 4-клеточных эмбрионов мыши т viíro. Анализ сформировавшихся бластоцист показал, что на 3-й сутки культивирования 4-клеточных эмбрионов при добавлении Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина (81%, 83% и 85% соответственно) увеличивалось количество нормально развивающихся бластоцист по сравнению с контролем (табл. 1). Процент аномально развитых бластоцист во всех подопытных группах был на уровне контроля.
Культивирование 8-клеточных эмбрионов с р-эндорфином, пентарфином и циклопентарфином также оказывало стимулирующее действие на их развитие. Через 48 часов количество развивающихся эмбрионов в контрольной группе составило 72%, в то время как в опытных группах р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина показатели были достоверно выше контрольных значений - 79, 85 и 90% соответственно (рис. 4).
Данные анализа бластоцист представлены в табл. 1. Количество сформировавшихся бластоцист на 2-е сутки культивирования 8-клеточных эмбрионов в группах р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина (84, 91 и 93% соответственно) достоверно превышало показатели контрольной группы (76%). В присутствии пентарфина и циклопентарфина наблюдалось полное отсутствие аномально развитых бластоцист, в то время как в контроле их было 9 % (табл. 1).
Время культивирования, ч
Рисунок 4. Влияние р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на процесс развития 8-клеточных эмбрионов мыши in vitro.
Кроме того, в присутствии циклопентарфина в среде культивирования было отмечено самое высокое количество случаев «выклевывания» бластоцист. Это говорит о том, что эмбрионы полностью прошли все стадии доимплантационного развития и готовы к переходу на следующий этап - имплантацию. Можно предположить, что положительное действие Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие эмбрионов происходит за счет их влияния на подготовительные процессы, которые на ранних стадиях дробления определяют последующее формирование бластоцист. Последнее представление основано на данных, показывающих значимость каждой стадии раннего дробления для формирования бластоцисты (Евсиков A.B., 2000).
Таким образом, полученные нами данные показывают, что Р-эндорфин. пентарфин и циклопентарфин могут выступать в роли неспецифических факторов роста, которые обеспечивают нормальное развитие ранних эмбрионов мыши, увеличивают жизнеспособность эмбрионов, стимулируют деление бластомеров. уменьшают количество аномально развитых эмбрионов и способствуют образованию бластоцист.
Известно, что ранние эмбрионы мыши чувствительны к агонистам и антагонистам опиоидных рецепторов (Калюжный, 1987), что позволяет предположить наличие на их поверхности опиоидных рецепторов. Калюжным и соавт. с помощью иммуноцитохимического метода показано, что опиоидные рецепторы локализованы только на самых ранних стадиях (зигота, ранняя 2-клеточная), и на более поздних стадиях (бластоциста и ее выход из оболочки оплодотворения). В период с поздней 2-клеточной стадии и до морулы опиоидные рецепторы отсутствуют (Ка1уиг)шу е1 а!., 1997). Поэтому было изучено влияние р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина (0,1 мкМ) на развитие 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов мыши в присутствии налоксона (1 мкМ) - специфического блокатора опиоидных рецепторов. Параллельно было исследовано действие налоксона на развитие доимплантационных эмбрионов. Чтобы полностью заблокировать все типы опиоидных рецепторов, использовали концентрацию налоксона на порядок выше, чем исследуемых пептидов (МШап е1 а!., 1989).
В присутствии Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина (80, 81 и 84% соответствено) наблюдалось достоверное увеличение количества сформировавшихся бластоцист по сравнению с контролем (60%) (рис.5).
Г] - всего бластоинст
ц - выклюнувшиеся бластоинсты от общего числа
С] - аномальные бластоцисты
Рисунок 5. Влияние пентарфина,
циклопентарфина и Р-эндорфина на
формирование бластоцист из 2-
клеточных эмбрионов в присутствии
налоксона.
* достоверное различие по отношению к контролю, Р<0,01 (и-критерий Манна-Уитни).
+ налоксон
Р-эядорфнв иоклооеитарфия
+ налоксон +яалоксои
Добавление налоксона оказывала угнетающее действие на развитие 2-клеточных эмбрионов, снижало количество нормальных бластоцист до 50% и приводило к увеличению аномально развитых бластоцист (29%) (рис.5). Т.к. для опиатных соединений показано их негативное воздействие на доимплантационное развитие (Калюжный, 1989; Ша1-8ит, 1990), то можно предположить, что отрицательное действие налоксона на развитие 2-клеточых эмбрионов обусловлено его взаимодействием с опиоидными рецепторами.
Культивирование 4-клеточных эмбрионов с [3-эндорфином, пентарфином и циклопентарфином в присутствии налоксона показало, все исследуемые пептиды не оказывали отрицательного воздействия на их развитие. Через 72 часа культивирования в присутствии налоксона количество сформировавшихся бластоцист составило 69% и было схоже с контролем (70%) (рис. 6). Добавление в среду культивирования Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина ссовместно с налоксоном приводило к достоверному увеличению количества образовавшихся бластоцист (81, 83 и 85% соотвественно).
Д - всего бластоцист
ц - выклюнувшиеся бластописты от общего числа
О - аномальные бластоинсты
Рисунок 6. Влияние пентарфина,
циклопентарфина и р-эндорфина на
формирование бластоцист из 4-
клеточных эмбрионов в присутствии
налоксона.
* достоверное различие по отношению к контролю, Р<0,01 (11-критерий Манна-Уитни)
При культивировании 8-клеточных эмбрионов р-эндорфин, пентарфин и циклопентарфин в присутствии налоксона оказывали стимулирующее действие на развитие эмбрионов, также как и в отсутствии налоксона (табл. 1). Данные анализа бластоцист показали, что в присутствии пентарфина и циклопентарфина наблюдалось полное отсутствие аномально развитых бластоцист, в то время как в контроле их количество составляло 9%. Кроме того, в присутствии пентарфина и циклопентарфина в
певтарфин + на.юь:сон
нзлоксов
(1-эвдорфпн + налоксов
шпс-юпентарфов -гналоксон
среде культивирования был отмечен высокий процент случаев «выклевывания» бластоцист (45 и 44% соответственно), тогда как в контроле этот показатель составил только 28% (рис. 7).
I I - всего бластоцист
g - выклюнувшиеся бластоцисты от общего числа
ПИ - аномальные бластоцисты
Рисунок 7. Влияние пентарфина,
циклопентарфина и Р-эндорфина на
формирование бластоцист из 8-клеточных
эмбрионов в присутствии напоксона.
* достоверное различие по отношению к
контролю, Р<0,01 (U-критерий Манна-
Уитни)
Налоксон несколько снижал стимулирующее действие (3-эндорфина на процесс выхода бластоцист из оболочки, но не влиял на действие пентарфина и циклопентарфина ни на одной из стадий развития 8-клеточных эмбрионов. Можно предположить, что такое воздействие налоксона связано с отсутствием опиоидных рецепторов на 8-клеточной стадии (Kalyuzhny et al., 1997).
Мы показали, что Р-эндорфин. пентарфин и циклопентарфин в присутствии налоксона стимулируют развитие 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов in vitro. Кроме того, количество образовавшихся бластоцист превышало контрольные показатели и совпадало с данными, полученными в отсутствии налоксона для этих пептидов. Налоксон оказывал ингибирующее действие на развитие 2-клеточных эмбрионов. На развитие 4- и 8-клеточных эмбрионов налоксон не влиял, что связано с отсутствием опиоидных рецепторов на этих стадиях. Таким образом, мы показали, что стимулирующее действие Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие ранних эмбрионов мыши осуществляется через неопиоидный рецептор Р-эндорфина.
Изучение путей передачи внутриклеточного сигнала при действии Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на ранние эмбрионы мыши
В настоящее время пути передачи внутриклеточного сигнала через неопиоидные рецепторы p-эндорфина не установлены. Однако известно, что одним из путей передачи
пентарфин + налоксон
3-энлорфин ппклопентарфнн
+ налоксон -налоксон
внутриклеточного сигнала при активации опиоидных рецепторов Р-эндорфином является инозитолфосфатный цикл (Cheng, 2002). При связывании лиганда с рецептором происходит активация фосфолипазы С, с последующим образованием инозитолтрифосфата (13Р) и выходом ионов Са2+ из эндоплазматического ретикулума. Кроме того, как было показано Наволоцкой и соавт., Р-эндорфинподобный пептид иммунорфин (фрагмент тяжелой цепи IgG) снижает активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников (Наволоцкая и др., 2004). Можно предположить, что и пентарфин также оказывает свое воздействие на развитие эмбрионов при участии аденилатциклазной сигнальной системы. Используя специфические ингибиторы для фосфолипазы С и аденилатциклазы, можно определить вклад той или иной системы при передаче внутриклеточного сигнала через опиоидные и неопиоидные рецепторы р-эндорфина.
Для обеих сигнальных систем характерно изменение внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Поэтому нами было изучено изменение уровня [Са2+], при действии р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на доимплантационные эмбрионы мыши.
На рис.8 представлен график изменения [Са2+], в 2-клеточных эмбрионах мыши при действии пентарфина и циклопентарфина в концентрации 0,1 мкМ.
Рисунок 8. Влияние пентарфина и
циклопентарфина (0,1 мкМ) на изменение уровня
внутриклеточного [Са2+]; у 2-клеточных эмбрионов мыши (НВБЗ). Каждая кривая -значение сигнала Р1ио-3 в 1 эмбрионе. Сигнал нормирован на максимум по иономицину.
Как видно из графика (рис.8), в контроле уровень внутриклеточного кальция не менялся на протяжении всего времени измерения и соответствовал базовому уровню цитоплазматического [Са2*],. После добавления в среду как пентарфина, так и циклопентарфина (0,1 мкМ) происходило постепенное увеличение [Са21^ в эмбрионах в
течение первых 15-20 мин, после чего наблюдался спад до контрольного значения (рис.8). Причем это изменение было одинаковым для обоих пептидов.
Чтобы установить источник поступления кальция в цитоплазму эмбриона при воздействии пентарфина и циклопентарфина были проведены эксперименты с использованием среды Хенкса, не содержащей ионы Са2+ с добавлением ЭГТА (рис.9). В среде, не содержащей ионы Са2+, под действием пентарфина и циклопентарфина также происходило увеличение [Са2+]| в течение первых 15-30 мин после воздействия пептида (рис.9). Амплитуда этого увеличения была сходной с экспериментами в стандартной среде. Полученные результаты свидетельствуют о том, что медленный выход ионов Са2+ в цитоплазму, при связывании пептидов с рецепторами на мембране 2-клеточного эмбриона, происходит из внутриклеточных депо и это не связано с пространственной формой пептида.
Рисунок 9. Влияние пентарфина и циклопентарфина (0,1 мкМ) на изменение уровня внутриклеточного Са2+ у 2-кл сточных эмбрионов мыши (НВ55 без Са2+). Каждая кривая - значение сигнала Р1ио-3 в 1 эмбрионе. Сигнал нормирован на максимум по иономицину.
Нами было исследовано действие р-эндорфина (0,1 мкМ) на изменение уровня ионов цитозольного кальция. После добавления в среду с эмбрионами p-эндорфина происходило быстрое увеличение [Са2+], в течение первых 60 - 80 сек, после чего наблюдался быстрый спад до базовых значений (рис.10).
Наши результаты согласуются с литературными данными, полученными исследователями опиоидных рецепторов на других объектах. Вероятно, быстрый выброс кальция при действии p-эндорфина на эмбрионы через опиоидные рецепторы происходит при участии фосфатидилинозитидного цикла [Blake et al., 1997; Jordan et al., 1998].
1.0 1
С»~|
О
3 0,8 -
ti-
er
S 1 0.6 -
X
0J
я
<11
о.
о
>> с; 0,2 -
е
0.0 •
контроль бета-эндорфин бета-эндорфин + налоксон
Время, мин
Рисунок 10. Влияние Р-эндорфина(0,1 мкМ) и налоксона (1 мкМ) на изменение уровня ионов внутриклеточного Са2' у 2-клеточных эмбрионов мыши. Каждая кривая - среднее значениесигнала Пио-З в 6-10 эмбрионах. Сигнал нормирован на максимум по иономицину.
При добавлении р-эндорфина одновременно с налоксоном мы наблюдали увеличение уровня [Са2+], у 2-клеточных эмбрионов (рис.10). Однако это изменение происходило плавно, в течение 15-20 мин после добавления р-эндорфина, а затем вновь возвращалось к начальному уровню и было сходным с действием пентарфина (рис. 8), но амплитуда сигнала была несколько ниже. Можно предположить, что эти различия могут быть связаны с различными путями передачи сигнала через опиоидный и неопиоидный рецепторы Р-эндорфина.
После прединкубации эмбрионов в присутствии блокатора активности фосфолипазы С (ЮмкМ) добавление р-эндорфина не вызывало быстрого увеличения ионов кальция (рис. 11).
Рисунок 11. Влияние р-эндорфина (0,1 мкМ) в присутствии блокатора
фосфолипазы С (10 мкМ) на изменение уровня [Са2+], у 2-клеточных эмбрионов мыши. Каждая кривая - среднее значение сигнала Р1ио-3 в 6-8 эмбрионах. Сигнал нормирован на максимум по иономицину.
контроль бета-эндорфин бета-эндорфин + налоксон
Время, мин
Однако, так же, как и в случае с налоксоном, клеточный ответ при действии Р-эндорфина в присутствии блокатора фосфолипазы С сопровождался медленным выбросом ионов кальция и был схож с действием пентарфина.
Таким образом, медленный выброс ионов Са2+ при связывании р-эндорфина и пентарфина с неопиоидным рецептором р-эндорфина происходит при участии одной и той же сигнальной системы и не связан с инозитолфосфатным циклом.
Действие как пентарфина, так и циклопентарфина на 8-клеточные эмбрионы было сходно с их действием на 2-клеточные эмбрионы. Анализируя данные (рис.12) видно, что происходило интенсивное увеличение [Са2+]| в течение первых 15 мин после добавления пептида, а затем наблюдался плавный спад до контрольных значений. У эмбрионов в контрольной группе происходили незначительные колебания уровня ионов внутриклеточного кальция.
Рисунок 12 Влияние пентарфина, циклопентарфина и Р-эндорфина (0,1 мкМ) на изменение уровня внутриклеточного Са2+ „ у 8-клеточных эмбрионов мыши. Каждая кривая - среднее значение сигнала Р1ио-3 в 6-8 эмбрионах. Сигнал нормирован на максимум по иономицину.
Добавление Р-эндорфина к 8-клеточным эмбрионам приводило только к медленному выходу кальция (рис.12). Быстрого выхода, как в случае с 2-клеточными эмбрионами, обнаружено не было. Можно предположить, что воздействие р-эндорфина, так же как и пентарфина на 8-клеточные эмбрионы осуществляется через неопиоидный рецептор Р-эндорфина.
Наволоцкой и др. было показано, что р-эндорфинподобный пептид иммунорфин снижает активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников [Наволоцкая и др., 2004]. Поскольку пентарфин является фрагментом 6-10 иммунорфина и обладает аналогичным воздействием на развитие ранних эмбрионов, мы предположили, что
пентарфин, также как и иммунорфин, может оказывать свое действии при участии аденилатциклазной сигнальной системы. Для этого нами был использован ингибитор активности аденилатциклазы (8022,53б)- Прединкубация эмбрионов с ингибитором 8(^2,536 в концентрации 15 мкМ в течение 30 минут приводила к тому, что после добавления пентарфина (0,1 мкМ) наблюдалось снижение выхода внутриклеточного кальция на 50% (рис. 13). При увеличении концентрации ингибитора аденилатциклазы в 2 раза (30 мкМ) полностью ингибировалась активность аденилатциклазы и уровень [Са2*], оставался на базовом уровне на протяжении всего времени эксперимента.
Исходя из полученных результатов можно предположить, что аденилатциклазная сигнальная система является основной системой в передаче внутриклеточного сигнала пентарфином и р-эндорфином через неопиоидные рецепторы р-эндорфина.
Рисунок 13. Влияние пентарфина (0,1 мкМ) в присутствии блокатора аденилатциклазы (15 и 30 мкМ) на изменение уровня [Са2+]| у 2-клеточных эмбрионов мыши. Каждая кривая - среднее значение сигнала ИШо-З в 6-8эмбрионах. Сигнал нормирован на максимум по иономицину.
Основываясь на том, что главная цепь неопиоидного действия исследуемых пептидов включает активацию аденилатциклазы и мобилизацию [Са2+]„ можно предположить, что неопиоидные рецепторы p-эндорфина представляют собой метаботропные рецепторы, сопряженные с G-белками (Gilman et al., 1989). Мы полагаем, что активация неопиоидных рецепторов может приводить к фосфорилированию про-апоптотических белков и транскрипции генов выживания, что в свою очередь повышает жизнеспособность эмбрионов, стимулирует и улучшает образование и «выклевывание» зрелых бластоцист.
■ контроль I
• пентарфин |
пентарфин + SQ (15 мкМ)! пентарфин + SQ (30 мкМ) [
g-0,2-
Время, мин
Исследование воздействия циклопентарфина на выживаемость допмплантационных эмбрионов при криоконсервации
Мы показали, что исследуемые пептиды в условиях т vitro стимулируют раннее развитие, оказывают положительное действие на пролиферацию и дифференцировку эмбрионов. Поскольку фосфорилирование про-апоптотических белков может приводить к повышению жизнеспособности клеток в условиях стресса, было проведено исследование влияния циклопентарфина на 8-клеточные эмбрионы при холодовом стрессе -криоконсервации. Контрольная группа составила 191 эмбрион, опытная - 189 эмбрионов. Результаты, полученные в ходе экспериментов, представлены в табл.2.
Согласно результатам, представленным в табл.2, инкубация эмбрионов с
циклопентарфином (0,1 мкМ) в течение 24 часов до замораживания приводила к
увеличению количества нормально развившихся бластоцист (82,9%) по сравнению с контрольными эмбрионами (69,1%).
Таблица 2. Влияние циклопентарфина (0,1 мкМ) на формирование бластоцист из эмбрионов, подвергнутых витрификации.
Действующее Общее Нормально Аномально Бластоцисты,
вещество число развитые развитые вышедшие из
эмбрионов бластоцисты бластоцисты оболочки
оплодотворения
% % %
Добавление пептида до заморозки
контроль 112 77 69,1 32 28,8 3 2,1
циклопентарфин 109 90 82,9* 6 5,3 13 11,8*
Добавление пептида после разморозки
контроль 79 56 70,4 21 26,2 2 3,4
циклопентарфин 80 56 70 16 20 8 10
* - достоверное различие по отношению к контролю, р < 0,01 (11-критсрий Манна-Уитни)
Также наблюдалось значительное снижение аномально развитых бластоцист. Добавление циклопентарфина после витрификации не оказывало значительного эффекта на количество нормальных бластоцист, но приводило к снижению аномально развитых бластоцист и увеличению количества бластоцист, вышедших из оболочки оплодотворения.
Таким образом, циклопентарфин, взаимодействуя с неопиоидным рецептором р-эндорфина, способствует сохранению жизнеспособности эмбриона в экстремальных
условиях. Пептид активирует каскад реакций аденилатциклазной системы, который влияет на процессы транскрипции продуктов (Montminy et al., 1997), необходимых для формирования как морул, так и бластоцист, и повышает выживаемость ранних эмбрионов после витрификации.
Исследование действие циклопентарфина на постимплантационное развитие
Способность к имплантации является одной из основных интегральных характеристик оценки качества эмбрионов при трансплантации (Royen, 2001). Одним из важнейших критериев отбора эмбрионов для последующего переноса в полость матки является их способность к формированию бластоцисты (Fisch et al., 2001). Перенос эмбриона на стадии бластоцисты позволяет увеличить частоту наступления беременности до 50—60% (Lundin et al., 2001). Согласно современным представлениям, имплантация эмбриона в полости матки — сложный, многоступенчатый процесс, регуляция которого осуществляется при помощи большого количества гуморальных факторов и разнообразных межмолекулярных и межклеточных взаимодействий (Klentzeris et al., 1997). Эмбрион принимает в процессе имплантации активное участие путем выработки эффекторных соединений, взаимодействующих с сигнальными молекулами эндометрия и иммунокомпетентными клетками матери (Гьюдайс и др., 1999).
Исследуемые нами пептиды увеличивают жизнеспособность ранних эмбрионов, стимулируют деление бластомеров, и самое главное, увеличивают количество бластоцист, вышедших из оболочки оплодотворения, что говорит о полном прохождении эмбрионами доимплантационной стадии развития и их готовности к дальнейшему, постимплантационному, развитию. Потому нами было проведено исследование влияния циклопентарфина на постимплантационное развитие эмбрионов мыши. Результаты, полученные в ходе проведения экспериментов, представлены на рис. 14.
Как видно из рис.14, предварительное культивирование 8-клеточных эмбрионов с циклопентарфином (0,1 мкМ) перед трансплантацией, достоверно увеличивало количество рожденных мышей (64) по сравнению с контролем (44). Полученные в ходе трансплантации животные при внешнем осмотре не имели как-либо отклонений и патологий. Вес животных колебался в пределах 12-14 гр, а в контроле - 11,5-13,5 гр. Анализ полового состава полученного потомства показал, что в контроле соотношение
полов составило 1:1 (22$ и 22<S). В опыте это расщепление составило 1,5:1 (38$ и 26с?).
22
Рисунок 14. Влияние
циклопентарфина (0,1 мкМ) на рождаемость, после трансплантации. На графиках указано количество рожденных мышей.
*- достоверное различие по отношению к контролю, р<0,01 (11-критерий Манна-Уитни)
На основании полученных данных можно заключить, что прединкубация 8-клеточных эмбрионов с циклопентарфином (0,1 мкМ) в течение 48 часов приводит к увеличению числа эмбрионов, имплантировавшихся в стенку матки, и продолжающих постимплантационное развитие. Таким образом, р-эндорфинподобный пептид циклопентарфин способен оказывать непосредственное воздействие на подготовительные процессы в эмбрионе перед имплантацией, улучшая взаимодействие эмбриона и материнского организма.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение неопиодного рецептора Р-эндорфина с помощью синтетических пептидов, фрагментов ^О, позволяет решить фундаментальную задачу, позволяя охарактеризовать неизвестный тип рецепторов Р-эндорфина и функции, которые он осуществляет, взаимодействуя с ним. Выявленная нами способность р-эндорфина и фрагментов иммуноглобулина в стимулировать процессы первичной дифференцировки у ранних эмбрионов мыши, образование зрелых бластоцист и выход их из оболочки оплодотворения дает право считать, что эти вещества играют роль неспецифических факторов роста в регуляции доимплантационного развития мыши. Наиболее активным является циклическая форма пентарфина. В присутствии циклопентарфина в среде культивирования эмбрионы проходят стадии развития в те же сроки, что и в организме матери, т.е. происходит нормализация сроков развития. Оценивая роль Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в раннем эмбриональном развитии, необходимо отметить, что полученные данные прямо указывают на непосредственное участие этих эндогенных
100 80 60 40 20 0
61
44
контроль циклопентарфин
пептидов, а также неопиоидных рецепторов р-эндорфина в стимулировании доимплантационного развития млекопитающих.
Результаты проделанной работы впервые свидетельствуют о том, что на ранних стадиях эмбриогенеза существуют неопиоидные рецепторы р -эндорфина, взаимодействуя с которыми, гормон и фрагменты ^О способствуют успешному развитию эмбрионов до стадии имплантации. Впервые нами был показан не только биологический эффект р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие ранних эмбрионов, но и также установлены основные компоненты сигнальной системы неопиоидного рецептора Р-эндорфина. В работе показано, что передача сигнала исследуемыми пептидами при активации неопиоидных рецепторов р-эндорфина осуществляется через аденилатциклазную сигнальную систему при участии аденилатциклазы и высвобождения ионов Са2+ из внутриклеточных депо.
Результаты настоящей работы могут быть с успехом использованы на практике при культивировании ранних эмбрионов, криоконсервации и трансплантации зародышей для любых целей: сохранения ценных видов животных, сельскохозяйственных пород и главное, для решения проблемы бесплодия человека. С этих позиций проведенные исследования вносят существенный вклад в развитие биофизики и экспериментальной эмбриологии и могут быть использованы на практике.
Изучение неопиодного рецептора р-эндорфина с помощью синтетических пептидов, фрагментов позволяет решить фундаментальную задачу, давая возможность
охарактеризовать неизвестный тип рецепторов Р-эндорфина и функции, которые он осуществляет, взаимодействуя с ним.
выводы
1) Установлено, что на 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионах мыши локализованы неопиоидные рецепторы р-эндорфина;
2) p-эндорфин, пентарфин и циклопентарфин увеличивают жизнеспособность эмбрионов, стимулируют деление бластомеров, способствуют образованию и «выклевыванию» зрелых бластоцист и уменьшают количество аномально развитых бластоцист в условиях in vitro;
3) Воздействие Р-эндорфина на 2-клеточные эмбрионы осуществляется по инозитолфосфатному и аденилатциклазному путям через опиоидные и неопиоидные рецепторы соответственно, а на 8-клеточные эмбрионы - только по аденилатциклазному пути через неопиоидные рецепторы Р-эндорфина;
4) Воздействие пентарфина и циклопентарфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы осуществляется по аденилатциклазному пути через неопиоидные рецепторы Р-эндорфина;
5) Предварительная инкубация 8-клеточных эмбрионов с циклопентарфином (0,1 мкМ) повышает криорезистентность эмбрионов при витрификации;
6) Предварительная инкубация 8-клеточных эмбрионов с циклопентарфином (0,1 мкМ) улучшает прохождение эмбрионами этапа имплантации, тем самым увеличивая количество рожденных мышей у самок-реципиентов после трансплантации.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах
1. Чернов A.C., Ковалицкая Ю.А., Сахарова Н.Ю., Давыдова Г.А. Оптимизация условий культивирования ранних эмбрионов мыши in vitro с помощью бета-эндорфина. // Проблемы репродукции, 2009, Том 15, № 3, С. 60-64.
2. Чернов A.C.. Ковалицкая Ю.А., Сахарова Н.Ю., Чайлахян JI.M. Влияние бета-эндорфина на доимплантационное развитие эмбрионов мыши in vitro. // Доклады Академии Наук, 2009, том 428, № 6, С. 845-848.
Статьи в сборниках
1. Чернов A.C., Сергиевич JI.A., Карнаухова H.A., Ковалицкая Ю.А., Давыдова Г.А.. Бета-эндорфинподобный пептид пентарфин увеличивает внутриклеточный уровень кальция у доимплантационных эмбрионов мыши.Международная конференция " Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 2-4 июня 2009 г. Сборник статей, с. 391-395.
Тезисы докладов
1. Чернов A.C. Влияние бета-эндорфина и бета-эндорфинподобных пептидов на раннее развитие эмбрионов млекопитающих in vitro. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии», Пущино, 2007, стр. 65-66.
2. Чернов A.C. Культивирование ранних эмбрионов млекопитающих in vitro в присутствии бета-эндорфинподобных пептидов, выступающих в роли неспецифических факторов роста. Санкт-Петербург, тезисы докладов и сообщений конференции, Цитология, 2008, т.50, №9, стр. 830.
3. Чернов A.C. Использование бета-эндорфинподобных пептидов как неспецифических факторов роста при культивировании ранних эмбрионов мыши ш vitro. Тезисы докладов XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2008, стр.78.
4. Чернов A.C., Сергиевич Л.А., Карнаухова H.A., Ковалицкая Ю.А., Давыдова Г.А. Флуориметрическое исследование изменения уровня внутриклеточного кальция у ранних эмбрионов мыши in vitro при воздействии бета-эндорфинподобного пептида пентарфина. Труды XVII Международной конференции "Лазерно-информационные технологии в медицине, биологии и геоэкологии - 2009" Новороссийск, 8-12 сентября 2009 г., с. 36-37.
5. Чернов A.C. Опиоидный нейропептид бета-экдорфин увеличивает уровень внутриклеточного Са2+ у ранних эмбрионов мыши. Тезисы докладов XVII международной конференции Ломоносов-2010, Москва, 2010, стр. 292.
6. Чернов A.C., Ковалицкая Ю.А., Сахарова Н.Ю., Давыдова Г.А. Стимулирующее действие бета-эндорфинподобных пептидов на доимплантационное развитие эмбрионов млекопитающих. Материалы V международной конференции, посвященной 50-летию ВНИИФБиП, Боровск, 2010, стр. 280-281.
7. Чернов A.C., Ковалицкая Ю.А., Сахарова Н.Ю., Давыдова Г.А. Влияние опиоидного гормона бета-эндорфина на ранний эмбриогенез млекопитающих. Тезисы докладов XXI съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Калуга, 2010, стр. 673.
8. A.S. Chernov, Yu.A. Kovalitskaya, G.A. Davidova. The optimization of cultural conditions of early mouse embryos in vitro by the help of ß-endorphin. Abstracts of the 5th congress of the world association of reproductive medicine, Reproductive biomedicine online, 20, suppl. 3 (2010), S60.
Подписано в печать: 06.04.2011 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп. 1 (495) 790-47-77; www.reelet.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чернов, Александр Сергеевич
ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Ранний эмбриогенез млекопитающих: стадии и особенности раннего развития.
1.2. Межклеточные взаимодействия и ростовые факторы в раннем развитии млекопитающих.
1.3. Характеристика Р — эндорфина.
1.4. Характеристика иммуноглобулина О.
1.5. Неопиоидное действие р -эндорфина.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Реактивы.
2.2. Среды для работы с культурами клеток.
2.3. Экспериментальные животные.
2.4. Синтетические пептиды.
2.5. Выделение и культивирование ранних эмбрионов мыши.
2.6. Изучение действия Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на раннее развитие эмбрионов мыши.
2.7. Выделение и культивирование первичных эмбриональных фибробластов мыши.
2.8. Оценка метаболической активности и жизнеспособности клеток.
2.9. Методы измерения внутриклеточного Са у 2- и 8-клеточных эмбрионов мыши.
2.9.1. Микроспектральный флуоресцентный анализ.
2.9.2. Ратиометрический анализ.
2.10. Вазэктомия самцов мыши.
2.11. Трансплантация бластоцист псевдобеременным самкам мыши.
2.12. Криоконсервация (витрификация) ранних эмбрионов мыши.
2.13. Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на доимплантационное развитие эмбрионов мыши.
3.1.1. Выбор эффективной концентрации исследуемых веществ.
3.1.2. Развитие 2-клеточных эмбрионов.
3.1.2.1. Влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 2-клеточных эмбрионов мыши.
3.1.2.2. Влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в присутствии налоксона на развитие 2-клеточных эмбрионов мыши.
3.1.3. Развитие 4-клеточных эмбрионов.
3.1.3.1. Влияние р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 4-клеточных эмбрионов мыши.
3.1.3.2. Влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в присутствии налоксона на развитие 4-клеточных эмбрионов мыши
3.1.4. Развитие 8-клеточных эмбрионов.
3.1.4.1. Влияние р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 8-клеточных эмбрионов мыши.
3.1.4.2. Влияние р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в присутствии налоксона на развитие 8-клеточных эмбрионов мыши.
3.2. Влияние Р-эндорфина и пентарфина на пролиферативную и митохондриальную активность первичных эмбриональных фибробластов мыши.
3.3. Роль ионов Са в развитии доимплантационных эмбрионов млекопитающих.
3.3.1. Передача внутриклеточного сигнала при действии пентарфина и циклопентарфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши.
3.3.2. Передача внутриклеточного сигнала при действии Р-эндорфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши.
3.3.3. Ратиометрическое определение [Са2+]; у 2-клеточных эмбрионов
4. Действие циклопентарфина на выживаемость ранних эмбрионов при криоконсервации (витрификации).
5. Исследование действии* циклопентарфина на постам плантационное развитие.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование неопиоидной рецепции β-эндорфина в доимплантационном развитии эмбриона мыши"
Эмбриональное развитие млекопитающих - это сложный и длительный процесс превращений и перестроек, в результате которых из зиготы развивается взрослый организм. Основные стадии раннего развития (2-, 4-и 8-клеточная) являются определяющими и на этих стадиях происходят важные события, которые в последующем влияют на формирование и развитие всего организма. Во время развития эмбриона млекопитающих происходят сложные взаимодействия как между эмбрионом и материнским организмом, так и между клетками самого эмбриона. В настоящее время, изучению фундаментальных основ эмбриогенеза животных и человека, а также исследованною факторов, влияющих на этот процесс, уделяется огромное внимание во всем мире. Детальное изучение факторов, влияющих на раннее развитие эмбриона, его имплантацию, на взаимосвязь бластомеров эмбриона между собой, а также механизмов этого действия очень важно и актуально. На доимплантационное развитие эмбрионов млекопитающих оказывают влияние несколько семейств ростовых факторов различного происхождения, такие как инсулиноподобные (ИФР), эпидермальные (ЭФР), тромбоцит-производные (ТПФР), трансформирующий фактор роста Р (ТФР-р), фактор роста фибробластов (ФРФ), лейкемия-ингибирующий фактор (ЛИФ) [Гилберт, 1993]. Однако, помимо классических факторов роста, могут существовать неспецифические пептидные ростовые факторы, которые также могут оказывать свое влияние на ранний эмбриогенез млекопитающих. Ильинским и соавторами было высказано предположение о том, что в роли неспецифического ростового фактора может выступать Р~ эндорфин [Ильинский и др., 1987]. Р-Эндорфин — опиоидный нейропептид, способен регулировать основные функции организма, осуществляя тесное взаимодействие иммунной и нейроэндокринной систем. Установлено, что молекула Р-эндорфина содержит три различных участка, ответственных за специфическое связывание с рецепторами. Концевые участки р-эндорфина отвечают за взаимодействие с ц- и 8- опиоидными рецепторами [1л е1 а1.,
1976], а центральная часть — с неизвестным типом рецепторов p-эндорфина -неопиоидным (не чувствительным к специфическому блокатору опиоидных рецепторов налоксону) [Hazum et al., 1979]. В настоящее время показано наличие неопиоидных рецепторов p-эндорфина в иммунной, нервной и эндокринной системах организма [Hazum et al., 1979; Наволоцкая и др., 2004; Nekrasova et al., 2010]. Кроме того, известно, что Р-эндорфин локализован в репродуктивной системе [Lim et al., 1983; Wahlstrom et al., 1985; Okrasa et al., 2003]. Однако сих пор остается неясным, существуют ли неопиоидные рецепторы p-эндорфина на ранних стадиях развития эмбриона и если существуют, то какую роль они играют в доимплантационном развитии эмбрионов.
В репродуктивной системе также обнаружен иммуноглобулин G (IgG), представляющий собой один из основных белков плазмы крови [Oliphant et al., 1978]. Под действием протеаз в просвете яйцевода и в плаценте из IgG образуется пептид, представляющий собой фрагмент 364-377 тяжелой цепи IgG, подобный центральной части молекулы P-эндорфина [Julliard et al., 1980; Gandolfï, 1995]. Значение и функциональная роль этого пептида в репродуктивной системе в настоящее время не выявлена. Однако, известно, что пептид способен взаимодействовать только с неопиоидным рецептором p-эндорфина и для связывания достаточно последовательности 369-373 [Ковалицкая и др., 2010].
Таким образом, изучение с помощью коротких фрагментов IgG (Р-эндорфинподобных пептидов) роли неопиоидного рецептора P-эндорфина в течении доимплантационного эмбриогенеза млекопитающих, а также самого P-эндорфина представляет научный и практический интерес. Для исследования неопиоидной рецепции на ранних эмбрионах мыши был синтезирован фрагмент 369-373 тяжелой цепи IgG — пентарфин, и его циклическая форма, циклопентарфин.
Цель настоящей работы — исследование неопиоидной рецепции [3-эндорфина и фрагментов иммуноглобулина G в доимплантационном развитии эмбриона мыши в условиях культивирования in vitro. Основные задачи исследования:
1) Изучить влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 2-, 4-, и 8-клеточных эмбрионов мыши в условиях in vitro',
2) Определить пути передачи внутриклеточного сигнала при действии пентарфина и циклопентарфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши;
3) Определить пути передачи внутриклеточного сигнала при действии (3-эндорфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши;
4) Исследовать действие циклопентарфина на выживаемость ранних эмбрионов при криоконсервации (витрификации);
5) Исследовать воздействие предварительной инкубации 8-клеточных эмбрионов мыши с циклопентарфином на их выживаемость при постимплантационном развитии.
Работа выполнена в лаборатории "Роста клеток и тканей" Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ.
Объектом нашего исследования стали доимплантационные эмбрионы на стадии 2, 4 и 8 бластомеров, полученные от мышей стока SHK из вивария Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Используемые в работе синтетические пептиды пентарфин и циклопентарфин были получены в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург).
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственного экспериментального материала и его обсуждения, выводов и библиографического списка использованной литературы.
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Чернов, Александр Сергеевич
107 ВЫВОДЫ
1) На 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионах мыши локализованы неопиоидные рецепторы р-эндорфина;
2) Р-эндорфин, пентарфин и циклопентарфин увеличивают жизнеспособность эмбрионов, стимулируют деление бластомеров, способствуют образованию и «выклевыванию» зрелых бластоцист и уменьшают количество аномально развитых бластоцист в условиях in vitro;
3) Воздействие p-эндорфина на 2-клеточные эмбрионы осуществляется по инозитолфосфатному и аденилатциклазному путям через опиоидные и неопиоидные рецепторы соответственно, а на 8-клеточные эмбрионы — только по аденилатциклазному пути через неопиоидные рецепторы р-эндорфина;
4) Воздействие пентарфина и циклопентарфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы осуществляется по аденилатциклазному пути через неопиоидные рецепторы р-эндорфина;
5) Предварительная инкубация 8-клеточных эмбрионов с циююпентарфином (ОД мкМ) повышает криорезистентность эмбрионов при витрификации;
6) Предварительная инкубация 8-клеточных эмбрионов с циклопентарфином (0,1 мкМ) позволяет увеличить количество рожденных мышей у самок-реципиентов при трансплантации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Впервые открытая Хазумом в 1979 году способность бета-эндорфина взаимодействовать с неопиоидным рецептором дала сильный толчок к изучению неопиоидного действия опиоидных пептидов. Неопиоидные рецепторы были обнаружены и охарактеризлованы на различных клетках млекопитающих (нервные, иммунокомпетентные и пр.). Нами было обнаружено наличие неопиодных рецепторов бета-эндорфина на доимплантациорнных эмбрионах мыши и установлено, что (3-эндорфин и фрагменты иммуноглобулина G пентарфин и циклопентарфин стимулируют процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши, образование и выклевывание зрелых бластоцист in vitro. Циклопентарфин наиболее активен в качестве неспецифического фактора роста, повышающего жизнеспособность ранних эмбрионов мыши. В присутствии циклопентарфина в среде культивирования эмбрионы проходят стадии развития в те же сроки, что и в организме матери, т.е. происходит нормализация сроков развития. Выявленная нами способность Р-эндорфина и фрагментов иммуноглобулина G стимулировать процессы первичной дифференцировки у ранних эмбрионов мыши, образование зрелых бластоцист и выход их из оболочки оплодотворения дает право считать, что эти вещества играют роль неспецифических факторов роста в регуляции доимплантационного развития мыши. Оценивая роль Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина в раннем эмбриональном развитии, необходимо отметить, что полученные данные прямо указывают на непосредственное участие этих эндогенных пептидов в • стимулировании раннего развития. По нашему мнению, применение циклопентарфина при культивировании доимплантационных эмбрионов позволит увеличить их жизнеспособность и подготовить эмбрионы к более успешной имплантации.
Результаты настоящей работы могут быть с успехом использованы на практике при культивировании ранних эмбрионов, криоконсервации и трансплантации эмбрионов для любых целей: сохранение ценных видов животных, сельскохозяйственных пород и главное, для решения проблемы бесплодия человека. С этих позиций проведенные исследования вносят существенный вклад в развитие биофизики и экспериментальной эмбриологии и мо1уг быть использованы на практике.
Впервые нами было показано не только биологический эффект р~ эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие ранних эмбрионов, но и также установлены основные компоненты сигнальной системы неопиоидного рецептора Р-эндорфина. В работе показано, что передача сигнала исследуемыми пептидами при активации неопиоидных рецепторов Р-эндорфина осуществляется через аденилатциклазную сигнальную систему при участии аденилатциклазы и высвыбождения ионов Са2+ из внутриклеточных депо.
Изучение неопиодного рецептора Р-эндорфина с помощью синтетических пептидов, фрагментов позволяет решить фундаментальную задачу, позволяя охарактеризовать неизвестный тип рецепторов Р-эндорфина и функции, которые он осуществляет, взаимодействуя с ним. Исследуемые пептиды пентарфин и циклопентарфин имеют высокое (примерно одинаковое) сродство к неопиоидному рецептору Р-эндорфина и поэтому любой из этих пептидов может быть использован в качестве специфического маркера для данного рецептора.
В настоящее время остается не ясным, является ли неопиоидный рецептор Р-эндорфина неизвестным до сих пор новым рецептором Р-эндорфина, или это уже известный рецептор, способный наряду с собственным эндогенным лигандом связывать р-эндорфин. Для ответа на этот вопрос необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение неопиоидного рецептора Р-эндорфина, его молекулярной структуры и с последующей возможностью его клонирования.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернов, Александр Сергеевич, Пущино
1. Awdeh Z.L., Williamson A.R., Askonas B.A. One cell-one immunoglobulin. Origin of limited heterogeneity of myeloma proteins // Biochem. J. — 1970. — Y.l 16(2). — P.241-8.
2. Aplin J.D. Adhesion molecules in implantation // Rev.Reprod. —1997, — V.2. P.84-93.
3. Apte R.N., Oppenheim J.J., Durum S.K. Beta-endorphin regulates interleukin 1 production and release by murine bone marrow macrophages // Int. Immunol. 1989. -V.l(5). -P.465-470.
4. Artus J., Panthier J.J., Hadjantonakis A.K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst // Development. 2010. - V.137(20). - P.3361-3372.
5. Bernasconi S., Petraglia F., Iughetti L., Marcellini C., Lamborghini A., Facchinetti F., Genazzani A.R. Impaired beta-endorphin response to human corticotropin-releasing hormone in obese children // Acta. Endocrinology. — 1988.-V.l 19(1).-P.7-10.
6. Berridge M.J., Downes C.P., Hanley M.R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands // Biochem. J. 1982. - V.206(3). -P.587-595.
7. Biswas D., Jung E.M., Jeung E.B., Hyun S.H. Effects of vascular endothelial growth factor on porcine preimplantation embiyos produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer // Theriogenology. 2011. — V.75(2). — P.256-267.
8. Bloor D.J., Metcalfe A.D., Rutherford A. Expression of cell adhesion molecules during human preimplantation embryo development // Mol.Hum.Reprod. 2002. - V.8(3). - P.237-245.
9. Bruce A.W., Zernicka-Goetz aM. Developmental control of the early mammalian embryo: competition mong heterogeneous cells that biases cell fate// Curr. Opin. Genet. Dev. -2010. V.20(5). -P.485-491.
10. Burton A., Torres-Padilla M.E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo // Brief. Funct. Genomics. 2010. - V.9(5-6). - P.444-454.
11. Carr D.J. The role of endogenous opioids and their receptors in the immune system // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1991. - V. 198. -P.710-720.
12. Chandrashekar V. and Bartke A. The influence of beta-endorphin on testicular endocrine function in adult rats // Biology of reproduction. — 1992. — V.47(l). — P. 1-5.
13. Charlwood P.A., Utsumi S. Conformation changes and dissociation of Fc fragments of rabbit immunoglobulin G as a function of pH // Biochem J. — 1969. — V.l 12(3). -P.357-65.
14. Chen H.F., Shew J.Y., Ho H.N., Hsu W.L., Yang Y.S. Expression of leukemia inhibitory factor and its receptor in preimplantation embryos // Fértil Steril. 1999. — V.72(4). - P.713-719.
15. Cheng S.X., Okuda M., Hall A.E., Geibel J.P., Hebert S.C. Expression of calcium-sensing receptor in rat colonic epithelium: evidence for modulationof fluid secretion // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 2002. -283(1). -P.240-250.
16. Chereshnev V.A., Gein S.V. Beta-endorphin as the endogenous regulator of immune processes // Ross. Fiziol. Zh. Im. I.M. Sechenova. 2009. -V.95(12). - P. 1279-1290.
17. Chia C.M., Winston R.M., Handyside A.H. EGF, TGF-alpha and EGFR expression in human preimplantation embryos // Development. — 1995. -V. 121(2). -P.299-307.
18. Chisholm J.C., Johnson M.H., Warren P.D., Fleming T.P., Pickering S.J. Developmental variability within and between mouse expanding blastocysts and their ICMs // J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. - V.86. - P.311-336.
19. Chou K.C. Low-frequency motions in protein molecules. Beta-sheet and betabarrel // Biophys. J. 1985. - V.48(2). - P.289-97.
20. Chun J.T., Santella L. Roles of the actin-binding proteins in intracellular Ca2+ signaling // Acta. Physiol. 2009. - V. 195(1). -P.61-70.
21. Clegg K.B., Piko L. Quantitative aspects of RNA synthesis and polyadenylation in 1-cell and 2-cell mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morphol. 1983. - V.74. -P.169-82.
22. Cuthbertson K.S.,, Whittingham D.G., Cobbold P.H. Free Ca2+ increases in exponential phases during mouse oocyte activation // Nature. 1981. -V.294(5843). - P.754-757.
23. Cuthbertson K.S., Cobbold P.H. Phorbol ester and sperm activate mouse oocytes by inducing sustained oscillations in cell Ca2+ // Nature. — 1985. — V.316(6028). P.541-542.
24. Dale B., Gualtieri R., Talevi R., Tosti E., Santella L., Elder K. Intercellular communication in the early human embryo // Mol. Reprod. Dev. — 1991. — V.29(l). — P.22-28.
25. Dardik A., Schultz R.M. Blastocoel expansion in the preimplantation mouse embryo: stimulatory effect of TGF-alpha and EGF // Development. — 1991. -V.113(3). -P.919-30.
26. Davidson E.H. How embryos work: a comparative view of diverse modes of cell fate specification //Development. 1990. -V. 108(3). -P.365-89.
27. Dell'Aquila M.E., Casavola V., Reshkin S.J., Albrizio M., Guerra L., Maritato F., Minoia P. Effects of beta-endorphin and Naloxone on in vitro maturation of bovine oocytes // Mol. Reprod. Dev. 2002. - V.63. - P.210-22.
28. Dhawan B.N., Cesselin F., Ragnubir R., Reisine T., Bradley P.B., Protoghese P.S., Hamon M. International Union of Pharmacology. XII. Classification of opioid receptors // Pharm. Rev. 1996. - V.48. - P.567-92.
29. Dunglison G.F., Jane S.D., McCaul T.F., Chad J.E., Fleming T.P., Kaye P.L. Stimulation of endocytosis in mouse blastocysts by insulin: a quantitative morphological analysis // J. Reprod. Fertil. 1995. - V.105(l). - P.l 15-23.
30. Dupont G., Heytens E., Leybaert L. Oscillatory Ca2+ dynamics and cell cycle resumption at fertilization in mammals: a modelling approach // Int. J. Dev. Biol. 2010. -V.54(4). - P.655-65.
31. Eckenhoff J.E., Elder J.D., King B.D. N-allyl-normorphine in the treatment of morphine or demerol narcosis // Am. J. Med. Sci. — 1952. — V.223(2). -P.191-7.
32. El-Haggar S., El-Ashmawy S., Attia A., Mostafa T., Roaiah M.M., Fayez A., Ghazi S., Zohdy W., Roshdy N. Beta-endorphin in serum and seminal plasma in infertile men // Asian J. Androl. 2006. - V.8(6). - P.709-12.
33. Fagarasan M.O., Aiello F., Muegge K., Durum S., Axelrod J. Interleukin 1 induces beta-endorphin secretion via Fos and Jun in AtT-20 pituitary cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1990a. V.87(20). - P.7871-4.
34. Faletti A.G., Mohn C., Farina M., Lomniczi A. and Rettri V. Interaction among beta-endorphin, nitric oxide and prostaglandins during ovulation in rats // Reproduction. 2003. - V.125. - P.469-477.
35. Fields S.D., Hansen P.J., Ealy A.D. Fibroblast growth factor requirements for in vitro development of bovine embryos // Theriogenology. — 2011. —V. 74. — P.872-876.
36. Forsberg G., Bednar I., Eneroth P., Sodersten P. Beta-endorphin acts on the reproductive tract of female rats to suppress sexual receptivity // Neurosci. Lett.- 1990.-V.115(l).-P.92-6.
37. Freye E., Schnitzler M., Schenk G. Opioid-induced respiratory depression and analgesia may be mediated by different subreceptors // Pharm. Res. — 1991. -V. 8. — P. 196-9.
38. Furshpan E.J., Potter D.D. Low-resistance junctions between cells in embryos and tissue culture // Curr. Top. Dev. Biol. -1968. -V.3. P.95-127.
39. Gallagher S.K., Witkovsky P., Roux M.J., Low M.J., Otero-Corchon V., Hentges S.T., Vigh J. Beta-endorphin expression in the mouse retina // J. Comp. Neurol. 2010. - V.518(15). - P.3130-48.
40. Galvao T.F., Matos K.C., Brum P.C., Negrao C.E., Luz P.L., Chagas A.C. Cardioprotection conferred by exercise training is blunted by blockade of the opioid system // Clinics. 2011. - V.66(l). - P. 151-7.
41. Gandolfi F. Functions of proteins secreted by oviduct epithelial cells // Microsc. Res. Tech. 1995. - V.32(l). -P.l-12.
42. Gein S.V., Gorshkova K.G., Tendryakova S.P. Regulation of interleukin-lbeta and interleukin-8 production by agonists of mu and delta opiate receptors in vitro // Neurosci. Behav. Physiol. 2009. - V.39(6). - P.591-5.
43. Giedroc D.P., Puett D. Binding of a synthetic beta-endorphin peptide to calmodulin//Mol. Pharmacol. 1985. - V.28(6).-P.588-93.
44. Gilman S.C., Schwartz J.M., Milner R.J., Bloom F.E., Feldman J.D. pendorphin enhances lymphocyte proliferative responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. -P.4226-30.
45. Gilman A.G. The Albert Lasker Medical Awards. G proteins and regulation of adenylat cyclase // JAMA. 1989. - V.262(13). -P.1819-25.
46. Gilman A.G. Transmembrane signaling, G proteins, and adenylat cyclase // Harvey Lect. 1990. - V.85. - P.153-72.
47. Gilmore W., Weiner L.P. The opioid specificity of beta-endorphin enhancement of murine lymphocyte proliferation // Immunopharmacology. — 1989. — V.17. — P.19-30.
48. Giordano A.L., Nock B., Cicero T.J. Antagonist-induced up-regulation of the putative epsilon opioid receptor in rat brain: comparison with kappa, mu and delta opioid receptors // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990. - V.255. - P.536-40.
49. Gonzalez J.P., Brogden R.N. Nalaxone. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in the management of opioid dependence //Drugs. 1988. - V.35(3). - P. 192-213.
50. Gulyas B.J. A reexamination of cleavage patterns in eutherian mammalian eggs: rotation of blastomere pairs during second cleavage in the rabbit // J. Exp. Zool. 1975. — V. 193(2). -P.235-48.
51. Gumbiner B. Cadherins: a family of Ca2+-dependent adhesion molecules // Trends. Biochem. Sci. 1988. - V.13(3). -P.75-6.
52. Hansson U.B. Correlation between amount of aggregates formed on freezing of immunoglobulin G and protein concentration // Acta. Chem. Scand. -1969. V.23(5). - P. 1828-9.
53. Harvey M.B., Leco K.J., Arcellana-Panlilio M.Y., Zhang X., Edwards D.R. and Schultz G.A. Roles of growth factors during periimplantation development // Molecular Human Reproduction. — 1995. — V.10. — P.712-8.
54. Hazum E., Chang K.J., Cuatercasas P. Specific nonopiate receptors for (3-endorphin // Science. 1979. - V.205. - P.1033-35.
55. Heagy W., Shipp M.A., Finberg R.W. Opioid receptor agonists and Ca2+ modulation in human B cell lines // J. Immunol. 1992. - V. 149(12). -P.4074-81.
56. Heijnen C.J., Croiset G., Zijlstra J., Ballieux R.E. Modulation of lymphocyte function by endorphins // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1987. V.496. - P.161-5.
57. Hildebrand A., Schweigerer L., Teschemacher H. Characterization and identification of heparin-induced nonopioid-binding sites for p-endorphin in human plasma // J. Biological. Chem. 1988. - V.263. - P.2436-41.
58. Houck J.C., Kimball C., Chang C. Placental p-endorphin-like peptides // Science. 1980. - V.207. - P.78-9.
59. Jacquet Y.F., Lajtha A. The periaqueductal gray: site of morphine analgesia and tolerance as shown by 2-way cross tolerance between systemic and intracerebral injections // Brain. Res. 1976a. - V.103. — P.501-13.
60. Jacquet Y.F., Carol M., Russell I.S. Morphine-induced rotation in naive, nonlesioned rats // Science. 1976b. - V.192. - P.261-3.
61. Jacquet Y.F., Marks N. The C-fragment of beta-lipotropin: an endogenous neuroleptic or antipsychotogen? // Science. 1976c. - V.194. - P.632-5.
62. Julliard J.H., Shibasaki T., Ling N., Guillemin R. High-molecular-weight immunoreactive beta-endorphin in extracts of human placenta is a fragment of immunoglobulin G // Science. 1980. - V.208. - P.183-5.
63. Johnson R.L., Deutsch H.F. Preparation and studies of myeloma Fab subtractions // Immunochemistiy. 1970. - V.7(2). - P.207-15.
64. Kalyuzhny A.E., Hensleigh H.C., Arvidsson U., Robert E. Immunocytochemical localization of p-opioid receptors in follicular cells and preimplantation mouse embryos // Anatomy and Embryology. 1997. -V. 195(5). -P.451-5.
65. Kane M.T., Morgan P.M., Coonan C. Peptide growth factors and preimplantation development // Hum. Reprod. Update. 1997. — V.3(2). — P.137-57.
66. Harvey M.B., Kaye P.L. Mediation of the actions of insulin and insulin-like growth factor-1 on preimplantation mouse embryos in vitro // Mol. Reprod. Dev. 1992. - V.33(3). - P.270-5.
67. Kelamangalath L., Dravid S.M., George J., Aldrich J.V., Murray T.F. Kappa-opioid receptor inhibition of calcium oscillations in spinal cord neurons // Mol. Pharmacol. 2011. - V.79(4). - P. 768-75.
68. Kelly S.J., Mulnard J.G., Graham C.F. Cell division and cell allocation in -early mouse development // J. Embryol. Exp. Morphol. — 1978. V.48. -P.37-51.
69. Kidder G.M. The genetic program for preimplantation development // Dev. Genet. 1992. — V.13(5). — P.319-25.
70. King A.C. and Cuatrecasas P. Peptide hormone-induced receptor mobility, aggregation, and internalization // New England J Medicine. — 1981. V.305. -P.77-88.
71. Knotts L.K. and Glass J.D. Effects of photoperiod, beta-endorphin, and naloxone on in vitro secretion of testosterone in white-footed mouse (Peromyscus leucopus) testes // Biology of reproduction, 1988. - V.39(l). — P.205-12.
72. Korotkoiychko V.P. Immunoglobulin G peculiar to cancer // Ukr. Biokhim. Zh. -1975. V.47(5). -P.593-603.
73. Krieger D.T. Placenta as a source of 'brain' and 'pituitary' hormones // Biol. Reprod. 1982. — V.26(l). — P.55-71.
74. Kovalitskaia Iu.A., Navolotskaia E.V. Synthetic peptide immunorphin as an instrument for studying nonopioid beta-endorphin receptor // Bioorg. Chem. — 2010. — V.36(l). — P.47-55.
75. Lambert D.G. Methods in molecular biology: Calcium signaling protocols // Humana Press. Totowa, New Jersey. — 2006. — 359 pp.
76. Larson R.C., Ignotz G.G. and Currie W.B. Platelet derived growth factor (PDGF) stimulates development of bovine embryos during the fourth cell cycle // Development. 1992. - V.l 15(3). - P.821-6.
77. Lessey B.A. Adhesion molecules and implantation // J. Reprod. Immunol. — 2002. — V.55(l-2). — P.101-12.
78. Li CH. Beta-endorphin // Cell. 1982. - V.31(3). -P.504-5.
79. Li C.H., Chang D., Doneen B.A. Isolation, characterization and opiate activity of p-endorphin from the human pituitary glands // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976a. -V.72. -P.1542-7.
80. Li C.H., Lemare S., Yamashiro D;, Doneen D.A. The synthesis and opiate activity of p-endorphin // Biochem Biophys Res Commun. 1976b. - V.71. -P. 19-25.
81. Li C.H., Yamashiro D., Tseng L.F., Loh H.H. Beta-endorphin: synthesis and biological activity of shortened peptide chains // Int. J. Pept. Protein Res. — 1978.-Y.il.-P. 54-8.
82. Li Y.M., Zhuang L.X., Zhang D.S., Luo Y.F. Effect of catgut implantation at acupoint on gonadal hormone and beta-endorphin in patients of climacteric syndrome // Zhongguo Zhen. Jiu. 2009. - V.29(l 1). - P.865-7.
83. Lighten A.D., Hardy K., Winston R.M., Moore GJE. Expression of mRNA for the insulin-like growth factors and their receptors in human preimplantation embryos // Mol. Reprod. Dev. 1997. - V.47(2). - P.134-9.
84. Lim A.T., Lolait S., Barlow J.W. et al. Immunoreactive beta-endorphin in sheep ovary //Nature. 1983. - V.303. -P.709-11.
85. Lin S.C., Wani M.A., Whitsett J.A., Wells J.M. Klf5 regulates lineage formation in the pre-implantation mouse embryo // Development. — 2010. -V. 137(23). -P.3953-63.
86. Ling N. And Guillemin R. Morphinomimetic activity of synthetic fragments of p-lipotropin and analogs // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. -P.3308-10.
87. Logan J.E. and William E. Roudebush Platelet-Activating Factor Increases Intracellular Calcium Levels In Preimplantation Stage Embryos // Early Pregnancy. 2000. - V.4(l). - P.30-8.
88. Loh H.H., Tseng L.F., Wie E., Li C.H. p-Endorphin is a potent analgesic agent // Proc. Nat Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. - P.2895-8.
89. Lolait S.J., Lim A.T., Toh B.H., Funder J.W. Immunoreactive beta-endorphin in a subpopulation of mouse spleen macrophages // J. Clin. Invest — 1984. — V.73. — P.277-80.
90. Lord J.A.H., Waterfield A.A., Hughes J., Kosterlitz H.W. Endogenous opioid peptides: Multiple agonists and receptors // Nature. 1977. - V.267. - P.495-9.
91. Lovegren E.S., Ling N., Puett D. Interaction of alfa-N-acetyl-beta-endorphin and calmodulin // J. Protein Chem. 1988. - V.7. - P.35-47.
92. Mallery D.L., McEwan W.A., Bidgood S.R., Towers G.J., Johnson C.M., James L.C. Antibodies mediate intracellular immunity through tripartite motif-containing 21 (TRIM21) // Proc. Natl. Acad. Sei. 2010. - V.10. -P.101-4.
93. Malkova N.V., Krasnova S.B., Navolotskaya E.V., Zargarova T.A., Prasolov V.S. Effect of beta-endorphin and beta-endorphin-like peptide immunorphin on the growth of human leukemic cells in vitro // Russ. J. Immunol. — 2002. -V.3. -P.239-44.
94. Mariani R.K., Mello C.F., Rosa M.M., Ceretta A.P., Camera K., Rubin M.A. Effect of naloxone and morphine on arcaine-induced state-dependent memory in rats // Psychopharmacology. 2011. - V.25 (3). - P. 306-13.
95. Martin W.R., Eades C.G., Thompson J.A., Huppier R.E., Gilbert P.E. The effects of morphine and nalorphine like drugs in the nondependent and morphin depended chronic spinal dog // J. Pharmacol. Exp. Hier. — 1976. -V.197. — P.517-32.
96. McCain H.W., Lamster I.B., Bozzone J.M., Grbic J.T. ß-Endorphin modulates human immune activity via non-opiate receptor mechanisms // Life Sei. 1982. - V.31. -P.1619-24.
97. Millan M.J., Czlonkowski A., Lipkowski A., Herz A. Kappa-opioid receptor-mediated antinociception in the rat. II. Supraspinal in addition to spinal sites of action // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989. - V.251(1). - P.342-50.
98. Misawa H., Ueda H., Satoh M. Kappa-opioid agonist inhibits phospholipase C, possibly via an inhibition of G-protein activity // Neurosci. Lett. 1990. -V.l 12(2-3). -P.324-7.
99. Montminy M. Transcriptional regulation by cyclic AMP I I Annu. Rev. Biochem. 1997. - V.66. - P.807-22.
100. Morita Y., Tsutsumi O., Taketani Y. In vitro treatment of embryos with epidermal growth factor improves viability and increases the implantation rate of blastocysts transferred to recipient mice // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1994. — V.171(2). -P.406-9.
101. Nakanishi S., Inoue A., Kita T., Nakamura M., Chang A.C., Cohen S.N., Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor // Nature. 1979. - Y.278. - P.423-7.
102. Navolotskaya E.V., Zargarova T.A., Malkova N.V., Krasnova S.B., Zav'yalov V.P., Lipkin V.M. Synthetic peptide SLTCLVKGFY competes with Pendorphin for naloxone-insensitive binding sites on rat brain membranes // Peptides. 2002. - V.23. - P.l 115-19.
103. Navolotskaya E.V., Malkova N.V., Zargarova T.A., Lepikhova T.N., Zav'yalov V.P., Lipkin V.M. Synthetic beta-endorphin-like peptide immunorphin binds to non-opioid receptors for p-endorphin on T lymphocytes // Peptides. 2001. - V.22. - P.2009-13.
104. Nekrasova YN, Sadovnikov VB, Zolotarev YA, Navolotskaya EV. Binding of synthetic peptide TPLVTLFK to nonopioid beta-endorphin receptor on rat brain membranes // J. Pept. Sci. 2010. - V.16(6). - P.263-8.
105. Nichols J., Davidson D., Taga T., Yoshida K., Chambers I., Smith A. Complementary tissue-specific expression of LDF and LIF-receptor mRNAs in early mouse embryogenesis // Mech. Dev. — 1996. — V.57(2). P. 123-31.f
106. O'Brien C.P., Testa T., Ternes J., Greenstein R. Conditioning effects of narcotics in humans // NIDA Res. Monogr. 1978. - V.l 8. - P.67-71.
107. Owen D.L., Morley J.S., Ensor D.M., Miles J.B. The C-terminal tetrapeptide of p-endorphin (MPF) enhances lymphocyte proliferative responses // Neuropeptides. 1998. - V.32. -P.131-9.
108. Panerai A.E., Sacerdote P. Beta-endorphin in the immune system: a role at last? // Immunol. Today. 1997. - V.18(7). - P.317-9.
109. Paria B.C., Dey S.K. Preimplantation embryo developmemt in vitro: cooperative interactions among embryos and role of growth factors // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 1990. - V.87(12). -P.4756-69.
110. Periyasamy S., Hoss W. Kappa opioid receptors stimulate phosphoinositide turnover in rat brain // Life Sci. -1990. V.47(3). - P.219-25.
111. Peters J.M., Tsark E.C., Wiley L.M. Radiosensitive target in mouse embryo chimera assay: implications that the target involves autocrine growth factor function// School of Medicine, USA. 1996. - V. 145(6). -P.722-9.
112. Pohl J., Zeitschr H. Oppressing action morphine and heroin on the respiratory center // Ges. Exp. Med. 1915. - V.17. - P.370-8.
113. Porter R.R. Structural studies of immunoglobulins // Science. 1973. -V. 180(87). -P.713-6.
114. Rappolee D.A., Basilico C., Patel Y. Werb Z. Expression and function of FGF-4 in periimplantation development in mouse embryos // Development. — 1994. V. 120(8). - P.2259-69.
115. Ricci V., Russolo M. Production and importance of immunoglobulins G,A,M in lymphoid tissue of the tonsil // Arch. Klein. Exp. Ohren. Nasen. Kehlkopfheilkd. 1970. - V.196(2). -P.97-102.
116. Salonen M.J., Vaheri A., Koskiniemi M. IgM and avidity of IgG antibodies in primary HHV-6 infections // Scand. J. Infect. Dis. 2008. - V.40(5). - P.420-3.
117. Sambury S., Chowdhury P., Saha A. Studies on cryoprecipitation: covalent structure of a human IgG cryoglobulin and its gelation characteristics // Immunochemistry. 1974. - V.l 1(11). - P.711-8.
118. Sawada H., Hoshi M., Someno Т., Suzuki R., Yamazaki K. Inhibition of mouse blastocyst hatching by subsite-specific trypsin inhibitors, peptidyl argininals // Development. Growth & Differentiation. 1992. — V.34 (3). — P.357-62.
119. Schoch P. и Помыткин И. Интерлейкин-1 альфа эпидермальный цитокин, регулятор процессов формирования и функционирования кожи // Эстетическая медицина. — 2010. — V.2. — Р.115-22.
120. Schweigerer L., Bhakdi S., Teschemacher H. Specific non-opiate binding sites for human P-endorphin on the terminal complex of human complement // Nature. 1982. - V.296. - P.572-4.
121. Schweigerer L., Schmidt W., Teschemacher H., Gramsch C. P-endorphin: surface binding and internalization in thymoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82. — P.5751-5.
122. Seung-uon Shin, Friden P., Moran M., Morrison S.L. Functional properties of antibody insulin-like growth factor fusion protein // The Journal of biological chemistry. 1994. - V.269(7). -P.4979-85.
123. Shahabi N.A., Linner K.M., Sharp B.M. Murine splenocytes express a naloxone-insensitive binding site for P-endorphin // Endocrinol. — 1990a. — V.l 26.-P.1442-8.
124. Shahabi N.A., Peterson P.K., Sharp B. р-endorphin binding to naloxone-insensitive sites on a human mononuclear cell line (U937): effects of cations and guanosine triphosphate // Endocrinol. 1990b. -V. 126. - P. 006-15.
125. Shi C.Z., Collins H.W., Buettger C.W., Garside W.T., Matschinsky F.M., Heyner S. Insulin family growth factors have specific effects on protein synthesis in preimplantation mouse embryos // Mol. Reprod. Dev. 1994. — V.37(4). — P.398-406.
126. Shu-Dong T., Phillips D.M., Halmi N., Krieger D. and Bardin C.W. Beta-endorphin is present in the male reproductive tract of five species // Biology of reproduction. 1982. - V.27(3). -P.755-64.
127. Simantov R. and Snyder S.H. Morphine-like peptides in mammalian brain: Isolation, structure elucidation, and interactions with the opiate receptor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. - P.2515-9.
128. Skrzypczak J., Mikolajczyk M., Szymanowski K. Endometrial receptivity: expression of alpha3betal, alpha4betal and alpha5betal endometrial integrins in women with impaired fertility // Reprod. Biol. 2001. - V.l(2). - P.85-94.
129. Smith E.M. and Blalock J.E. Human lymphocyte production of ACTH and endorphin-like substances: association with leukocyte interferon // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. - V.78. -P.7530- 4.
130. Smith L.C., Wilmut I., West J.D. Control of first cleavage in single-cell reconstituted mouse embryos // J. Reprod. Fertil. 1990. - V.88(2). - P.655-63.
131. Smotrich D.B., Stillman R.J., Widra E.A., Gindoff P.R., Kaplan P., Graubert M., Johnson K.E. Immunocytochemical localization of growth factors and their receptors in human pre-embryos and Fallopian tubes // Hum. Reprod. -1996. -V. 11(1). P.184-90.
132. Smyth D.S., Utsumi S. Structure at the hinge region in rabbit immunoglobulin-G // Nature. 1967. - V.216(5113). - P.332-5.
133. Solomon S. POMC-derived peptides and their biological action // Ann. NY Acad. Sci. 1999. - V.885. - P.22-40.
134. Stachecki J.J., Armant D.R. Regulation of blastocoele formation by intracellular calcium release is mediated through a phospholipase Cdependent pathway in mice // Biology of Reproduction. 1996a. — V.55. — P. 1292-8.
135. Taddio A., Shah V., Shah P., Katz J. Beta-endorphin concentration after administration of sucrose in preterm infants // Arch. Pediatr. Adolesc. Med. -2003. — V.157(ll). — P.1071-4.
136. Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator // Science. 1991. - V.251(5000). -P.1451-5.
137. Tamada H., Das S.K., Andrews G.K., Dey S.K. Cell-type-specific expression of transforming growth factor-alpha in the mouse uterus during the periimplantation period // Biol.Reprod. 1991. - V.45(2). - P.365-72.
138. Teruel M., Smith R., Catalano R. Growth factors and embryo development // Biocell. 2000. - V.24. - P.107-22.
139. Tseng L.F., Loh H.H., Li C.H. (3-Endorphin as a potent analgesic by intravenous injection // Nature. 1976b. - V.263. - P.239-40.
140. Tseng L.F., Menon M.K., Loh H.H. Comparative actions of monomethoxyamphetamines on the release and uptake of biogenic amines in brain tissue // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1976c. - V.197. - P.263-71.
141. Tseng L.F., Loh H.H., Li C.H. P-Endorphin: cross tolerance to and cross physical dependence on morphine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976a. -V.73.-P.4187-9.
142. Tseng L.F. Evidence for epsilon-opioid receptor-mediated P-endorphin-induced analgesia // Trends. Pharmacol. Sci. 2001. - V.22. - P.623-30.
143. Tuchmann-Duplessis F. Teratogenic screening methods and their application to contraceptive products // Acta. Endocrinologica. — 1972. — V.77(l). — P.S203-23.
144. Vaccarino A.L., Olson G.A., Olson R.D., Kastin A J. Endogenous opiates // Peptides. 1999. -V.20. - P.1527-74.
145. Van Der Bergh P., Rozing J., Nagelkerken L. Identification of two moieties of P-endorphin with opposing effects on rat T-cell proliferation // Immunol. — 1993.-V. 79.-P. 18-23.
146. Van Der Bergh P., Rozing J., Nagelkerken L. Two opposing modes of action of P-endorphin on lymphocyte function // Immunol. 1991. - V.72. — P.537-43.
147. Velazquez M.A., Hermann D., Kues W.A., Niemann H. Increased apoptosis in bovine blastocysts exposed to high levels of IGF 1 is not associated with downregulation of the IGF1 receptor // Reproduction. 2011. — V. 141(1). -P.91-103.
148. Wahlstrom T., Laatikainen T., Salminen K. Immunoreactive beta-endorphin is demonstrable in the secretory but not in the proliferative endometrium // Life Sci. 1985. - V.36. - P.987-90.
149. Wai-Sum C. The effect of beta-endorphin on rat oocyte maturation in vitro // Mol. cell endocrinology. 1990. - V.68. - P. 181-5.
150. Walker C.G., Meier S., Littlejohn M.D., Lehnert K., Roche J.R., Mitchell M.D. Modulation of the maternal immune system by the pre-implantation embryo // BMC Genomics. 2010. - V. 11. P.474-5.
151. Webb T., Goodman H.C. The structure and function of immunoglobulins // Mod. Trends. Immunol. 1967. - V.2. - P. 151-87.
152. Werb Z. Expression of EGF and TGF-alpha genes in early mammalian development // Mol. Reprod. Dev. 1990. - V.27(l). - P.10-5.
153. Wood S.A., Kaye P.L. Effect of epidermal growth factor on preimplantation mouse embryos // Reprod. Fertil. 1989. - V.85(2). - P.575-82.
154. Woods J.A., Shahabi N.A., Sharp B.M. Characterization of a naloxone-insensitive p-endorphin receptor on murine peritoneal macrophages // Life Sci. 1997. - V.78. - P.573-86.
155. Wrobel M. Acquisition and expression of ethanol-induced conditioned place preference in mice is inhibited by naloxone // Pharmacol. Rep. — 2011. -V.63(l).- P.79-85.
156. Wu C.S., Lee N.M., Loh H.H. Yang J.T. Li C.H. р-Endorphin: formation of alpha-helix in lipid solutions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. -P.3656-9.
157. Yoshida S. Effect of basic fibroblast growth factor on the development of mouse preimplantation embryos // Development 1996. — V.48(3). — P. 1769.
158. Zheng L., Paik W.Y., Cesnjaj M., Balla Т., Tomic M., Catt К J., Stojilkovic S.S. Effects of the phospholipase-C inhibitor, U73122, on signaling and secretion in pituitary gonadotrophs // Endocrinology. 1995. — V.136(3). -P.1079-88.
159. Белоусов JI.В. Основы общей эмбриологии. М.: Высш. шк., 2005. -367с.
160. Гилберт С. Биология развития. М.: «Мир», 1993. - Т.З. - 352с.
161. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. М.: Наука, 1988. - 341 с.
162. Евсиков Е.А. Регуляторные механизмы доимплантационного морфогенеза мыши // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13(2). — С. 9399.
163. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино. «Аналитическая микроскопия». — 2003. — 84с.
164. Ильинский О.Б., Козлова М.Б., Кондракова Е.С. и др. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. — 1985. — Т.21. С.511-5.
165. Калюжный А.Е., Платонов Е.С., Миронова О.В., Сухих Г.Т. Влияние опиоидов на развитие доимплантационных мышиных зародышей // Бюл. эксп. биол. мед. 1989. - Т. 108. - С.622-4.
166. Ковалицкая Ю.А., Наволоцкая Е.В. Синтетический пептид иммунорфин как инструмент исследования неопиоидного рецептора {3-эндорфина // Российский журнал биоорганической химии. - 2010. - Т.36(1). — С.40-48.
167. Наволоцкая Е.В., Ковалицкая Ю.А., Золотарев Ю.А. Выявление и характеристика неопиоидных рецепторов (3-эндорфина коры надпочечников крысы // Биохимия. 2004. - Т.69(8). — С.1071-78.
168. Студеникина Т.М, Слука Б,А. Молекулы клеточной адгезии и их роль в процессе оплодотворения у человека // Медицинский журнал. 2005. -№4. - С.7-10.
169. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций // Соросовский образовательный журнал. 2001. — Т.7(5). — С. 10-5.
170. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.:«Бином». -2003.-268с.
171. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк. - 1990. - 352с.1. БЛАГОДАРНОСТИ
172. Выражаю большую благодарность своим научным руководителям к.ф.-м.н. Давыдовой Г.А. и д.м.н. Гаврилюку Б.К. за их терпение, поддержку, советы и неоценимую помощь в работе над диссертацией.
173. Искренне благодарен Сахаровой Н.Ю. за обучение и обсуждение проблем эмбриологии млекопитающих.
174. Выражаю большую благодарность сотрудникам института биофизики клетки РАН Сергеевич JI.A. и Карнауховой H.A. за помощь в проведении исследований по микрофлуоресцентному анализу внутриклеточного кальция у ранних эмбрионов мыши.
175. Особенно признателен Селезневой И.И., Акатову B.C., Шишовой Н.В., Гаховой Э.Н. за поддержку, участие и содействие при выполнении данной работы.
176. Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам НЛП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН Овсепяну A.A. и Телегину Г.Б. за обучение и помощь в проведении криоконсервации и трансплантации ранних эмбрионов мыши.
177. Выражаю искреннюю благодарность моим родным и близким за поддержку, советы и помощь во время выполнения работы и написания диссертации.1
-
Чернов, Александр Сергеевич
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2011
-
ВАК 03.01.02
- Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина
- Развитие доимплантационных эмбрионов млекопитающих после экспериментальных воздействий
- Развитие доимплатационных эмбрионов млекопитающих после экспериментальных воздействий
- Изучение рецептор-опосредуемого трансгенеза в клетки эмбрионов млекопитающих доимплантационных стадий развития и анализ ДНК трансгенных животных
- β-Эндорфинподобный пептид иммунорфин: свойства и механизм действия
