Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение рецептор-опосредуемого трансгенеза в клетки эмбрионов млекопитающих доимплантационных стадий развития и анализ ДНК трансгенных животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Маргарита Михайловна, Москва

/

■/sJ :

iJLs sJ

РОССИЙСКАЯ/АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии на правах рукописи

ИВАНОВА Маргарита Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДУЕМОГО ТРАНСГЕНЕЗА

V» .

В КЛЕТКИ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДОИМПЛАНТАЦИОНЫХ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ И АНАЛИЗ ДНК ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ.

(специальность 03. 00. 03 - молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научные руководители: доктор биологических наук, профессор Б.С. Народицкий доктор биологических наук, профессор A.C. Соболев Москва 1998 г.

Оглавление с.

Принятые сокращения 6

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................7

Глава I Обзор литературы.......................................................11

1.1 Краткое описание основных этапов эмбриогенеза

млекопитающих................................................................11

1.1.1. Доимплантационные стадии развития..................11

. . 1.1.2. Постимплантационные стадии развития............. 12

1.1.3. Происхождение различных тканей....................... 13

1.1.4. Активация генома зародыша................................ 13

1.2. Трансгенные животные..................................................15

1.2.1. Использование трансгенных животных................15

1.2.2. Эффективность получения трансгенных животных.................................................................16

1.2.3. Методы получения трансгенных животных........ 17

1.2.3.1. Метод инфирования эмбрионов ретровирусами...........................................17

1.2.3.2. Метод введения чужеродного гена в эмбрионы посредством микроинъекций.. 20

1.2.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток....................................... 23

1.2.3.4. Использование липосом

для получения трансгенных животных.....25

1.2.3.5. Метод высокоскоростной механической инъекции..................................................... 25

1.2.3.6. Сперматозоиды-как вектор для получения трансгенных животных.............................. 26

1.3. Транспорт ДНК в клетку с помощью

рецептор-опосредуемого эндоцитоза...............27

1.3.1. Рецептор-опосредуемый эндоцитоз.........27

1.3.2. Введение ДНК в клетки с помощью рецептор-опосредуемого эндоцитоза.......28

1.3.3.Транспорт чужеродной ДНК методом рецептор-опосредуемого трансгенеза in vivo.........................................................35

Глава 2 Материалы и методы..................................................37

2.1. Материалы............................................................37

2.1.1. Лабораторные животные.......................... 37

2.1.2. Вирусы и бактериальные штаммы............37

2.1.3.Плазмидные вектора.................................. 37

2.1.4.Ферменты и другие реактивы.................... 37

2.2. Методы................................................................. 38

2.2.1. Синтез конструкций................................... 38

2.2.2. Получение животных с датированным сроком беременности............................... 40

2.2.3. Извлечение эмбрионов...............................40

2.2.4. Видео-интенсификационная микроскопия 41

2.2.5. Проведение трансфекции in vitro..............41

2.2.6. Культивирование эмбрионов.................... 42

2.2.7. Трансфекция эмбрионов кролика и овцы. 42

2.2.8. Введение конструкций с помощью внутриматочного зонда............................. 43

2.2.9. Введение конструкций с использованием полостной операции.................................. 43

2.2.10. Выделение ДНК из эмбрионов доимплантационных стадий развития.... 45

2.2.11. Выделение ДНК из эмбрионов постимплантационных стадий развития..45

2.2.12. Синтез и последовательность праймеров для ПЦР................................ 46

з

2.2.13. Анализ ДНК методом ПЦР..................... 46

2.2.14. Гибридизация синтезированных ПЦР продуктов................................................. 48

2.2.15. Блот-гибридизационный анализ.............48

Глава 3. Результаты исследований.................. .................51

3.1. Изучение транспорта конструкций в эмбрионы млекопитающих на доимплантационных стадиях развития.............................................................51

3.1.1. Анализ транспорта конструкций в эмбрионы методом видео-интенсификационной микроскопии..........................................................51

3.1.2. Выживаемость эмбрионов доимплантационных стадий развития после культивирования с конструкцией.........................54

3.1.3. Анализ транспорта конструкции в процессе развития эмбрионов доимлантационных стадий.54

3.1.3.1. Подбор оптимальных условий для анализа эмбрионов методом ПЦР...........54

3.1.3.2. Анализ включения аденовируса в состав конструкций....................................56

3.1.3.3. Транспорта конструкции при

введении ДНК большого размера.............57

3.1.3.4. Зависимость эффективности трансгенеза конструкции от

стадии развития.......................................60

3.1.3.5. Введение чужеродного генетического материала в составе конструкции

в эмбрионы овцы......................................63

3.2. Рецептор-опосредуемый транспорт р01_2С\/ в эмбрионы до имплантационных стадий развития

in vivo.................................................................................63

3.2.1.Введение конструкции рС1_2С\/-(инсулин-р1_)-(стрептавидин-р1_)- Ad5neo........................................63

3.2.2.Введение конструкции р01_2С\/(5нМ)-(инсулин-р1_)-(стрептавидин-р1_)-СЕЮ...........................................64

3.2.3.Введение конструкции pGL2CV(0,4HM)-(HHcynnH-pL)-(стрептавидин-рЦ-СЕЮ..........................................65

3.3. Рецептор-опосредуемый транспорт pCMVLaLuc in vivo.... 75

3.3.1.Введение конструкции рСМ\/1_а1_ис(2нМ)-(инсулин-р1-)-(стрептавидин-р1_)-СЕ1_0......................75

3.3.2. Введение конструкции рСМ\/1_а1_ис(0,66нМ)-(инсулин-р|_)-(стрептавидин-р|_)-СЕ1_0....................Z9

3.3.3. Введение конструкции рСМ\/1_а1_ис--(инсулин-р1_)-(стрептавидин-р1_)-Е0376.........................................80

3.4. Введение конструкции с линейной формой плазмиды..88

3.5. Влияние введения конструкции in vivo на течение беременности.....................................................................89

Глава 4. Обсуждение результатов.............................................. 94

ВЫВОДЫ.......................................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................107

Принятые сокращения. Ас1- аденовирус

ВИМ - видео-интенсификационная микроскопия

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК- матричная РНК

н.- нуклеотид

р-плазмида

р1_ - полилизин

п.н.- пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

трис - трис-гидроксиметиламинометан

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ЭДТА - эти ленд иаминтетраацетат

Айбпео - дефектный аденовирус 5, содержащий ген

неомицинтрансферазы СЕЮ - аденовирус птиц РА\/ 1

Е08-76-утиный аденовирус (синдром снижения яйценоскости)

ВВЕДЕНИЕ.

I. Актуальность проблемы.

Создание трансгенных животных привело к интенсивному развитию в течении последних 15 лет нового направления в биотехнологии - эмбриоинженерии, базирующегося на достижениях молекулярной биологии, генной инженерии, эмбриологии. В настоящее время созданы линии трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных, которые используются как продуценты некоторых биологически активных веществ в фармакологии, в качестве моделей для изучения различных заболеваний и в других областях биотехнологии.

Для получения трансгенных животных сейчас наиболее широко применяют такие технологии, как микроинъекция в пронуклеус зиготы, использование рекомбинантных ретровирусных векторов, липосомы, эмбриональные стволовые клетки. Но несмотря на значительные успехи данных методов в получении трансгенных животных, проблема низкой выживаемости эмбрионов, составляющей 10-20%, низкой эффективности переноса и интеграции чужеродного генетического материала, составляющей 0,2-5%, при высокой трудоемкости методов не решена и сегодня. Особенно актуален вопрос об эффективности существующих технологий переноса чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки при получении трансгенных сельскохозяйственных животных, так как эмбрионы коров, овец, свиней не обладают прозрачной цитоплазмой и для определения локализации пронукпеусов перед микроинъекцией необходимы специальные предварительные манипуляции с зиготами. Кроме того, следует учитывать

большие материальные затраты при получении трансгенного животного: например, стоимость трансгенного теленка достигает 500.000 $.

Поэтому одна из задач современной генной эмбриоинженерии - создание метода, позволяющего снизить трудоемкость процесса введения чужеродной ДНК в эмбриональные клетки млекопитающих доимплантационных стадий развития.

2. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлась разработка и изучение нового метода переноса чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки, основанного на использовании механизма рецептор-опосредуемого эндоцитоза, позволяющего снизить трудоемкость способа доставки чужеродной ДНК, а также в изучении возможности вводить различный генетический материал в составе ДНК-переносящей конструкции на основе применения одних и тех же компонентов.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

' 1. Разработать способ позволяющий использовать рецептор-опосредуемый эндоцитоз для введения чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки млекопитающих in vitro.

2. Определить эффективность трансгенеза с помощью ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы млекопитающих доимплантационных стадий развития in vitro.

3. Разработать способы доставки ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей доимплантационнных стадий развития, не извлекая их из организма беременной самки.

4. Проанализировать состояние введенного чужеродного генетического материала в геноме эмбрионов на разных стадиях эмбриогенеза и у новорожденных.

Научная новизна и практическая значимость.

Методом рецептор-опосредуемого трансгенеза было получено 24 эмбриона мыши постимплантационных стадий развития и один новорожденный с перенесенной чужеродной ДНК.

Впервые было показано, что рецептор-опосредуемый транспорт чужеродного генетического материала может быть применен не только для трансгенеза соматических клеток и тканей, но и для эмбрионов млекопитающих первых дней жизни.

Показана высокая эффективность транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей, кроликов на стадиях зиготы, 2-бластомеров, морулы и бластоцисты, и в эмбрионы овец на стадии морулы.

Установлено, что ДНК-переносящая конструкция не является токсичной для эмбрионов и выживаемость составляет 70%-90%, как и у контрольных животных, при культивировании in vitro.

Показано, что включение в состав ДНК-переносящей конструкции аденовирусов, способствующих выходу ДНК из эндосом, значительно облегчает процесс доставки генетического материала к ядру эмбрионов доимплантационных стадий развития .

Проведенные эксперименты показали возможность получения трансгенных животных непосредственно при введении ДНК-переносящей конструкции в организм беременной самки за счет транспорта чужеродного

генетического материала в эмбрионы в полости организма, что, соответственно, повышает выживаемость эмбрионов.

Работа представляет не только научный, но также имеет практический интерес, так как разработанный метод доставки чужеродного генетического материала в эмбрионы, использующий механизм рецептор-опосредуемого эндоцитоза, может быть в дальнейшем использован для введения рекомбинантого гена в эмбрионы сельскохозяйственных животных.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткое описание основных этапов эмбриогенеза млекопитающих.

1.1.1 Доимплантационные стадии развития.

Одноклеточная стадия, зигота. После оплодотворения яйцеклетки (зиготы) в отличии от неоплодотворенных имеют хорошо заметное направительное (второе полярное) тельце. Последовательность событий во время первого цикла запускается оплодотворением и не зависит от времени овуляции (Howlett S.K. et al., 1985). Ядро ооцита завершает второе мейотическое деление, мужской пронуклеус увеличивается в размерах. Затем, в течении 12 часов, оба пронуклеуса перемещаются навстречу друг другу, реплицируя ДНК в процессе миграции. Когда пронуклеусы приходят в контакт, их ядерные оболочки разрушаются и происходит конденсация хроматина с образованием хромосом. Таким образом, истинно диплоидное ядро впервые появляется не у зиготы, а у двухклеточного зародыша. Цитокинез и начало дробления протекают за 18,5-22 часа после оплодотворения.

Формируется 2-клеточный эмбрион (стадия 2-х бластомеров). Второй клеточный цикл, как и первый, является , относительно продолжительным (около 20 часов), в то же время третий и последующие циклы приближаются к 12 часовому циклу, как и в соматических клетках. Однако эта точность весьма относительна, если учитывать межзародышевые и внутризародышевые вариации темпов развития. Возрастная гетерогенность эмбрионов объясняется асинхронностью оплодотворения, а вариации стадий клеточного цикла, по-видимому связаны с внутренними

генетическими различиями между бластомерами (Гилберт С.

и

1993). Развитие от 2-клеточной стадии до поздней 8-клеточной - ранней 16-клеточной стадии происходит в яйцеводе.

8-клеточная стадия соответствует четвертому клеточному циклу. На данной стадии наблюдается компактизация клеток эмбрионов, бластомеры сближаются и образуют компактный клеточный шар. Клетки компактизированного зародыша продолжают делиться и образуют 16-клеточный зародыш, а затем 32-клеточный зародыш. Компактные агрегаты бластомеров получили общей термин - морула.

У эмбрионов, входящих в матку, кавитация (секреция в морулу жидкости) бластоцеля начинается с 32-клеточной стадии и заканчивается когда эмбрион состоит примерно из 128 клеток. Данная стадия развития получила название -бластоциста (ранняя бластоциста). Эмбрион на стадии бластоцисты состоит из клеток трофэктодермы и клеток внутренней клеточной массы (ВКМ). В процессе развития в формировании собственно эмбриона у мышей участвуют 3 клетки (не больше) (Л/ПгПг В, 1970). Когда бластоциста полностью сформируется, блестящая оболочка утоныиается и бластоциста "вылупляется" (поздняя бластоциста), прикрепляясь к стенки матки и имплантируется, что соответствует 5 дню беременности.

1.1.2. Постимплантационные стадии развития.

6 день беременности. ВКМ врастает в бластоцель, а над ней сосредотачивается внезародышевая эктодерма, в результате эмбрион приобретает цилиндрическую форму с четкой границей между зародышевыми и внезародышевыми областями. Формируется амниотическая полость. Размер эмбриона 0,1x0,1 мм.

Гаструляция (процесс миграции клеток и тканей) начинается на 7 день беременности с появлением первичной полоски. Первичная полоска располагается по средней линии зародыша. На данной стадии формируется третий зародышевый слой - рыхло лежащие клетки мезодермы. Размер эмбриона 0,2x0,2 мм.

8 день беременности характеризуется формированием амниона, головного отростка, образованием головных складок, виден зачаток сердца. Эмбрион в оболочке Рейхерта. Размер эмбриона 0.5x0,4мм.

На более поздних стадиях развития начинается органогенез (ПраттХ. 1990).

1.1.3 . Происхождение различных тканей.

При анализе трансгенных животных необходимо учитывать процессы миграции и дифференцировки клеток, так как часто чужеродный генетический материал может проникть и/или интегрироваться не во все клетки эмбрионов, что приводит к мозаицизму (van der Putten et а!., 1985, Khillan J.S. and Bao Y. 1997, Notarianni E. et al., 1997). Ниже дана схема, иллюстрирующая происхождение различных тканей (рис. 1).

1.1.4. Активация генома зародыша. Для мышей, как для других видов млекопитающих, характерен определённый период, когда используются материнские мРНК, за которыми следует период, когда материнские мРНК заменяются на ядерные транскрипты. Материнские мРНК существуют около двух суток после оплодотворения (примерно такое же время они существуют у представителей других эволюционных групп), и затем, в течение вторых суток,

|фОБпаст —--»-Цитотрофо&ласт-------------------Синцитиальный трофОБлас;

Зародышевая эктодерма

Зародышевая " мезодерма

стоциста

Эпивласт

Зародышевый "эпивласт

т

Мезодерма

(

I

V, Внутренняя

клеточная масса

Первичная полоска

Головной отросток

Внезародышевая ' мезодерма

■ Гипоблэст

Амниотическая ' эктодерма

Внезародышевая_ ' энтодерма

зародышевая энтодерма

Энтодерма 'желточного мешка

V

Рисунок1. Схема, иллюстрирующая происхождение различных тканей у зародышей млекопитающих.

материнские мРНК быстро разрушаются (Clegg K.V. and Pico L. 1983). Когда продукты, кодируемые материнскими мРНК, распадаются, они заменяются новыми белками, синтезированными на мРНК, новообразованной в ядре. В большинстве случаев хромосомы, полученные от спермия, активируются, вероятно, одновременно с хромосомами полученными от яйцеклетки. Время регистрации первых транскриптов у млекопитающих - поздняя фаза одноклеточной стадии (11-17 часов после оплодотворения), время основной волны синтеза новых транскриптов в ядрах это ранняя морула (от 8 до 16 клеток) (трое суток).

1.2.Трансгенные животные.

1.2.1. Использование трансгенных животных.

Животные, в геном которых интегрирована рекомбинантная ДНК, получили название трансгенных. Впервые трансгенные животные (мыши) были получены с помощью инфицирования предимплантационных эмбрионов р^тровирусами (Jaenish R. et al 1976), что явилось причиной создания нового направления в биотехнологии-эмбриоинженерии.

Например, с получением трансгенных животных стало возможным более детальное изучение молекулярных основ интеграции ДНК и ген�