Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование некоторых этапов технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование некоторых этапов технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных"

На правах рукописи

АМИРОВ АБДУРАШИД РАМАЗАНОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - биотехнолс

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

и.

. и

БОРОВСК - 1997 V,

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель

Официальные оппоненты -

Ведущее учреждение

кандидат биологических наук, с.н.с. Рябых В.П. доктор биологических наук, профессор Шихов И.Я. кандидат биологических наук Шевченко В.Г.

Биотехцентр по животноводству РАСХН, Москва - Горки Ленинские

. ' > »

Защита диссертации состоится " . >- О ' '/С! 1997 г.

на заседании Диссертационного Совета Д 020.17.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 249010 г.Боровск-3, Калужская область,

ВНИИФБиП с.-х. животных С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан " г~ I " 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук

Г.В.Дворянчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современное животноводство немыслимо без повышения генетического потенциала сельскохозяйственных животных. Однако при использовании для этой цели методов классической селекции требуется не одно десятилетие. В связи с этим возникла необходимость в разработке технологий, позволяющих более быстрыми темпами создавать новые генотипы животных с желаемыми признаками и таким образом ускорять селекционный процесс.

Исследования, проведенные в последние десять лет в области эмбриоинженерии и генетической инженерии, свидетельствуют о принципиальных возможностях изменения генотипа животных как по одному признаку, так и по комплексу признаков, путем прямого переноса дополнительных генов в их геном.

Представления о включении новых генов в геном животных кажутся простыми и привлекательными с точки зрения скорости и точности, с которой могут быть произведены изменения фенотипа. Предложен совершенно новый принцип и механизм введения в популяцию признаков, которые в ней полностью отсутствовали и не могли возникнуть в ходе эволюции. Впервые успешный перенос гена был проведен на мышах в 1980 году (Gordon J.W. et al. 1980). Успехи достигнутые в получении трансгенных мышей побудили исследователей к подобным экспериментам на сельскохозяйственных животных. В 1985 году впервые были получены трансгенные свиньи и кролики (Hammer R.E. et al. 1985; Brem G. et al. 1985). Однако, несмотря на полученные первые результаты, эффективность технологии получения трансгенных животных остается пока еще невысокой, ввиду низкой частоты интеграции чужеродных генов в геном хозяина и несовершенства основных этапов технологии. К настоящему времени принципиально разработан только первый вариант технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных, для осуществления которого требуется большое

число эмбрионов на стадии зиготы, в которые вводят чужеродные гены, и используется большое число животных - доноров и реципиентов, что в значительной степени усложняет и удорожает технологию трансгенеза.

В настоящее время получение трансгенных животных осуществляется, главным образом, путем микроинъекции генноинженерных конструкций в эмбрионы ранних стадий развития. Основным условием, необходимым для передачи трансгена от первичного трансгенного животного его потомкам, является интеграция его в клетки зародышевого пути (гоноциты), из которых в дальнейшем развиваются органы воспроизводительной системы, продуцирующие яйцеклетки или сперматозоиды. Но это условие может быть достигнуто только в том случае, если эмбрионы, предназначенные для введения в них чужеродных генов, будут находиться на стадии зиготы, а именно, на стадии двух пронуклеусов до момента их слияния. В связи с этим возникает необходимость в разработке способов получения от животных-доноров большого количества эмбрионов на стадии зиготы.

Значительное удорожание технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных обусловлено необходимостью содержать большое число животных-реципиентов, которым трансплантируют зиготы, микроинъецированные генноинженерными конструкциями, но с неустановленной интеграцией трансгена. Повысить эффективность технологии и значительно удешевить работы по транс-генезу, особенно на малоплодных животных, возможно в результате разработки способа определения интеграции трансгена еще на стадии эмбриона, что позволит пересаживать животным-реципиентам только зародыши с точно установленной интеграцией трансгена и таким образом существенно сократить число используемых реципиентов и затраты на их содержание.

Цели и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного была поставлена цель - усовершенствовать некоторые этапы тех-

нологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных для повышения ее эффективности.

Для достижения поставленной цели представляется целесообразным решение следующих задач:

1. Усовершенствовать основные этапы технологии трансплантации эмбрионов ранних стадий развития у свиней применительно к условиям получения трансгенных животных.

2. Усовершенствовать способ вызывания суперовуляции у свиней для повышения выхода эмбрионов на стадии зиготы.

3. Оптимизировать способ визуализации пронуклеусов в зиготах свиней с целью уменьшения его отрицательного воздействия на жизнеспособность зародышей.

4. Разработать способ биопсии трофобласта у предимпланта-ционных эмбрионов свиней, позволяющий сохранить жизнеспособность эмбриона и получить достаточное число бластомеров для проведения анализа интеграции чужеродного гена в геном хозяина .

5. Разработать способ определения интеграции введенных чужеродных генов в геном сельскохозяйственных животных на стадии доимплантационных эмбрионов.

6. Выяснить возможность уменьшения числа используемых животных путем трансплантации овцам-донорам, с вызванной суперовуляцией, собственных и чужих зигот, микроинъецированных чужеродным геном.

Научная новизна работы. Впервые на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и микрофракционирования тотальной ДНК бластомеров разработан способ определения интеграции чужеродных генов в геном животных на стадии эмбриона, позволяющий отделить низкомолекулярную ДНК генноинженерной конструкции, неин-тегрированную в хромосомную ДНК, от интегрированной и свести до минимума ложноположительный результат прямого ПЦР - анализа интеграции. Впервые определены стадии развития свиных эмбрио-

нов, наиболее пригодные для биопсии трофобласта, с целью анализа интеграции трансгена и трансплантации их животным-реципиентам. Усовершенствован способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней, позволяющий повысить выход эмбрионов на стадии зиготы. Уточнены условия визуализации пронуклеусов в свиных зиготах. Впервые показана возможность трансплантации овцам-донорам, с вызванной суперовуляцией, собственных и чужих зигот, микроинъецированных генноинженерной конструкцией.

Практическая значимость работы. Разработанные способы: определения интеграции чужеродных генов в геном животных на стадии эмбриона; вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней; использования овец-доноров с вызванной суперовуляцией в качестве реципиентов для трансплантации им собственных зигот, микроинъецированных чужеродными генами и усовершенствованный способ визуализации пронуклеусов в свиных зиготах могут быть использованы (и уже используются) в работах по получению трансгенных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 47-й Научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых (Дубровицы, 1994), международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных" (Пушкин, 1994), 2-й международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995), рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов" (Пущино 1996), научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 1996), а также на заседании отдела биотехнологии ВНИ-ИФБиП.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц, 7 рисунков и 1 фотографию.

Список литературы включает 23 6 работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. На основании использования простагладина Ег^ возможно увеличение выхода эмбрионов на стадии зиготы в 2-3 раза при вызывании суперовуляции у половозрелых свиней-доноров.

2. Биопсия трофобласта (от 5 до 30 бластомеров) у свиных эмбрионов на стадии ранней и средней бластоцисты позволяет определить интеграцию введенного чужеродного гена без существенного нарушения их жизнеспособности.

3. Метод отделения высокомолекулярной хромосомной ДНК от введенной неинтегрированной низкомолекулярной путем микрофракционирования тотальной ДНК, позволяет исключить ложноположи-тельный результат при определении интеграции чужеродного гена у доимллантационных эмбрионов животных.

4 . Овцы-доноры с вызванной суперовуляцией могут быть использованы в качестве реципиентов для пересадки им как собственных, так и чужих эмбрионов, микроинъецированных чужеродной ДНК.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В опытах на овцах использованы взрослые помесные животные (прекос х северокавказская х местная улучшенная порода) с регулярными половыми циклами.

В опытах на свиньях использованы помесные (ландрас х крупная белая) и чистопородные (крупная белая и ландрас) животные с полноценными признаками половой охоты.

В опытах на мышах использовались гибриды {СВАхС57В1).

Суперовуляцию у овцематок вызывали введением гонадотропных препаратов: фоллитропина (ФСГ; Каунский завод эндокринных препаратов) и ГСЖК (Покровский завод биопрепаратов). Для вызывания охоты у овец-доноров и реципиентов использовали препарат простагландина Е2а-эстрофан ("Спофа", Чехословакия). Обработку животных фоллитропином проводили в течении 4-х дней, начиная с 12-го дня эстрального цикла, дважды в день с интервалом 12 ча-

сов (1-й день - по 150 ИЕ. на одну инъекцию, 2-й день - по 100 ИЕ. , 3-й день - по 100 ИЕ., 4-й день - по 50 ИЕ.). Общая доза препарата составляла 550 ИЕ. на голову. Гонадотропином СЖК животных обрабатывали один раз на 12-й день полового цикла в дозе 1200-1500 ИЕ. На третий день от начала введения гонадотро-пинов вводили 250 мкг эстрофана. Животных покрывали через 18 часов от начала охоты. Эмбрионы извлекали спустя 23-25 часов после покрытия бараном.

Суперовуляцию у половозрелых свиней вызывали введением гонадотропных препаратов: СЖК (МП "Гера") и ФСГ-супер (АО "Союзагромед"). Для синхронизации охоты использовали простаг-ландин F2a - эстрофан ("Спофа", Чехословакия). Для вызывания овуляции использовали хорионический гонадотропин человека (ХГ) (Московский эндокринный завод). Животных первой группы обрабатывали по общепринятой схеме (ГСЖК - на 16-й день полового цикла в дозе 1200-1500 ИЕ и ХГ - через 72-80 часов после ГСЖК в дозе 750-1000 ИЕ). Через 24 часа от введения ХГ, свиней осеменяли, второе осеменение проводили через 12 часов после первого. Через 18-24 часа после второго осеменения производили хирургическое извлечение эмбрионов.

Свиньям второй опытной группы в период с 12-го по 14-й день полового цикла (считая первый день предыдущей охоты нулевым днем) в один и тот же день внутримышечно вводили простаг-ландин F2a (эстрофан) дважды с интервалом 8-10 часов (утром и вечером) в дозе 250 мкг на инъекцию. Через 24-36 часов после введения эстрофана свиньям однократно (внутримышечно в области шеи) вводили ГСЖК в дозе 1200-1500 ИЕ на голову, через 72-80 часов от введения гонадотропина СЖК вводили ХГ в дозе 750-1000 ИЕ, через 40-42 часа от введения ХГ осеменяли однократно и через 16-18 часов после осеменения извлекали зиготы. Обработку свиней препаратом ФСГ (III группа) начинали через 24 часа после первого введения эстрофана (простагландин F2a вводили как

указано выше) и вели в течении 4-х дней, утром и вечером с 12 часовым интервалом. ХГ вводили через 72-80 часов от первой инъекции эстрофана в дозе 750-1000 ИЕ на голову. Общая доза ФСГ на голову составляла 25 арм.ед. Осеменение и извлечение эмбрионов у свиней этой группы проводили в те же временные интервалы, что и у животных второй группы.

Эмбрионы на стадии зиготы извлекали у овец и свиней хирургическим способом путем промывания яйцеводов средой Дюльбекко (Юрьевецбиопрепарат, Россия) с добавлением 1% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФС) ("Flow", Англия). Эмбрионы поздних стадий развития получали путем убоя свиней-доноров и промывания рогов матки.

Морфологическую оценку эмбрионов овец и свиней на ранних стадиях развития (зигота, 2-клеточная) проводили в среде Дюльбекко с добавлением 20% ФС под инвертированным микроскопом ("Оптон", Германия). Эмбрионы на стадии одной клетки считали оплодотворенными если у них были видны два пронуклеуса и два направительных тельца. Поздние стадии развития эмбрионов свиней оценивали по общепринятой классификации (Квасницкий, 1959; Хантер, 1984).

Для визуализации пронуклеусов в зиготах и ядер в 2-4-клеточных эмбрионах их центрифугировали при различных скоростях (4500; 7000 и 11000g) и разной продолжительности (t=4; 5; Юмин), при температуре не ниже 20°С. Визуализацию пронуклеусов и ядер проводили с помощью оптики Номарского на инвертированном микроскопе ICM-4 05 ("Оптон", Германия).

Для проведения микроинъекций в пронуклеусы зигот был использован комплект манипуляторов фирмы "Eppendorf" и КМ - 2 (Россия, Пущинское ЭКБ) и микроскоп ICM-405. Микроинъекцию ре-комбинантной ДНК осуществляли в мужской пронуклеус общепринятым способом инъекционной иглой с наружным диаметром 1,5-2 мкм. Точность введения раствора экзогенной ДНК определяли по увеличению размера пронуклеуса. Для микроинъекции использовали

конструкцию, включающую ген человеческого инсулиноподобного фактора роста под МТ-промотором. Обьём вводимой ДНК составлял 2 пкл с концентрацией 1-2 мкг/мл (примерно 600-1000 копий на одну инъекцию).

Биопсию доимплантационных эмбрионов свиней или мышей проводили без использования микроманипулятора, под бинокулярным микроскопом МБС-9 в растворе Дюльбекко с 20% ФС. После биопсии эмбрионы культивировали в каплях среды ДМЕМ с 20 % ФС под слоем парафинового масла в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси при 37°С. Выжившими считали эмбрионы, сформировавшие через 24-28ч морфологически нормальные бластоцисты.

Гистологические суховоздушные препараты для подсчета числа клеток в отсеченных фрагментах готовили по методу Тарковского (Тагкоызк:., 1966) .

Для проведения анализа методом ПЦР клетки лизировали по общепринятой схеме. Конечные концентрации компонентов для лизиса клеток эмбрионов составили: 0,1 мг/мл протеиназы-К, 100£д фрагмента генноинженерной конструкции, 100 пд ДНК фага Л, 0,1 % твин-20, 0,1 % тритон х-100, 10 шМ трисНС1 рН=8,0 суммарный объем лизирующей смеси составлял 10 мкл.

Микрофракционирование тотальной ДНК осуществляли путем электорофореза лизата в агарозном геле (Рис.1) с последующей элюцией с помощью набора ПРЕПАналТМ по инструкции фирмы "Диатом" (Россия).

123456789 10 И 12 123456789 10 11 12

дооооооооооо диииииг.-иууии

1а 16 -

Рис.1. Микрофракционирование тотальной ДНК электрофорезом в 0,8 % агарозном геле.

Рис. 1а. Электрофорезный гель после микрофракционирования. Рис. 16. Электрофорезный гель после удаления среза геля с высокомолекулярной ДНК (ВМД).

Потери высокомолекулярной ДНК, элюированной с помощью данного набора составляла не более 20 %.

Все элюированные образцы ДНК были использованы в PCR как отрицательные контроли {N 2-5) и положительные пробы (N 6-12).

Для постановки ПЦР брали половину элюированного объема (т.е, 1/2 от общего количества высокомолекулярной ДНК), что соответствует приблизительно 5-10 геномам.

Для достижения предельной чувствительности метода определения интеграции трансгена, нами предложен автоматический вариант nested-PCR (automated nested-PCR, AN-PCR), согласно которому внешние (external) праймеры отличаются по температуре отжига на 5-6° С от внутренних (internal) праймеров. Предложенный вариант AN-PCR полностью устраняет проблему контаминации, так как вся процедура амплификации в 1-ом и во 2-ом раундах ПЦР проводится в одной пробирке, а дополнительные компоненты и праймеры для 2-го раунда PCR добавляются путем наслаивания объема сверху на масло.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. йспользозакзга сзоц-дсггероз, с вказашгой супороэуляци-пй, а качество реиротжелотоз дли араиепланя'гщги, гэкероккгаецззро-загжазг вх^о^г.

Способ получения трансгенных млекопитающих путем прямого микроинъецирования чужеродной ДНК в пронуклеусы зигот имеет невысокую эффективность, обусловленную целым рядом факторов, как генноинженерных - несовершенством генных конструкций, случайностью и низкой степенью интеграции введенной ДНК, так и эмбриологических - снижением жизнеспособности зигот при микроманипуляциях in vitro, и приживляемости их после трансплантации реципиентам.

С целью повышения приживляемости эмбрионов и уменьшения числа используемых реципиентов была предпринята попытка транс-

плантировать зиготы, микроинъецированные чужеродным геном, тем же овцам-донорам, от которых эти зиготы были получены. При этом изучали возможность использования суперовулировавших доноров в качестве реципиентов и влияние вида гонадотропина, используемого для вызывания суперовуляции, на количество и качество извлекаемых эмбрионов.

Среднее число овуляций было достоверно выше у животных, обработанных фоллитропином, по сравнению с ГСЖК - 10,4 и 5,6, соответственно (р<0,01). Процент нормальных эмбрионов от общего числа извлеченных зародышей у животных разных групп не отличался, однако среднее число вымытых нормальных эмбрионов на голову было достоверно выше у животных обработанных фоллитропином, по сравнению с ГСЖК-6,9 и 3,5, соответственно (р<0,01).

Основной целью проведенных исследований было выяснение возможности использования доноров с вызванной суперовуляцией в качестве реципиентов для пересадки им как собственных, так и чужих зигот, микроинъецированных генноинженерной конструкцией. Для этого суперовулировавшие овцы, служившие донорами зигот, были разделены на две группы, одной из которых были трансплантированы только собственные эмбрионы, микроинъецированные генной конструкцией. Второй группе овец пересаживали микроинъецированные зиготы, полученные от других доноров. Пересадку осуществляли через 10-15 минут после извлечения зигот, не снимая животных с операционного стола.

В результате исследований установлено (Таблица 1), что при трансплантации овцам-донорам собственных зигот, микроинъецированных чужеродным геном (I гр.), суягность была выше, чем у животных II группы, которым пересаживали зиготы от других доноров и составила 41,2% против 22,2%, однако различия были статистически недостоверны. При этом приживляемость эмбрионов у подопытных животных практически не отличалась (12,2 и 10,9 %, соответственно). В I группе родилось - 8 ягнят и во II - 2 ягненка. Все животные были физиологически полноценными.

Таблица 1.

Трансплантация суперовулированным овцам-донорам собственных и чужих зигот, микроинъецированных рекомбинантной ДНК

Параметры Принадлежность зигот

свои чужие

Количество реципиентов 17 9

Количество пересаженных микро-

инъецированных зигот 90 46

Среднее число пересаженных (на

голову) зигот 5,3 5,1

% суягности 41 ,2 (7/17) 22 ,2 (2/9)

% приживляемости эмбрионов 12, 2 (11/90) 10, 9 (5/46)

Таким образом, проведенные исследования показали, что овцы-доноры с вызванной суперовуляцией могут быть использованы в качестве реципиентов для трансплантации им как собственных, так и чужих зигот, микроинъецированных генноинженерными конструкциями .

2.2. Зкэжзалкп шифеайзярозетой суперезуягасрог

у полозовралзгж сзилпсй.

Основным условием, необходимым для передачи трансгена от первичного трансгенного животного его потомкам, является интеграция его в клетки зародышевого пути (гоноциты), из которых в дальнейшем развиваются органы воспроизводительной системы, продуцирующие яйцеклетки или сперматозоиды. Но это условие может быть достигнуто только в том случае, если эмбрионы, предназначенные для введения в них чужеродных генов, будут находится на стадии двух пронуклеусов до момента их слияния. Только в этом случае при введении генноинженерных конструкций в один из пронуклеусов зиготы наиболее высока вероятность того, что чужеродный ген попадет во все клетки будущего организма

и в том числе в гоноциты. В связи с этим, для получения трансгенных животных требуется большое количество эмбрионов на стадии зиготы.

Общепринятые способы вызывания суперовуляции не позволяют получать достаточное число эмбрионов на стадии зиготы.

С целью повышения выхода зародышей на стадии зиготы предложена новая схема вызывания суперовуляции у свиней. Принципиальное отличие предлагаемого способа вызывания синхронизированной суперовуляции от используемого в настоящее время способа, основанного на принципе введения только гонадотропинов начиная с 16-го дня полового цикла, заключается в том, что за счет предварительного введения простагландина Гга в период с 12-го по 14-й день цикла, вызывается начало регрессии желтого тела и яичники у всех свиней, независимо от продолжительности естественных циклов, приводятся к состоянию, соответствующему началу фолликулярной фазы полового цикла. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Сравнение результатов вновь предложенного и общепринятого способов вызывания суперовуляций у свиней

Показатели | •Опыт | Контроль

1. Число доноров вымытых хирургическим способом 17 12

2. Извлечено всего эмбрионов 337,0 220,0

3. Извлечено зародышей в среднем на

одного донора 19,8±5,7 17,3+6,3

Из них в среднем: 16,8+3,2 8,6+2,1

б) 2-х°клеточные, 3,0±0,В 7,0±6,7

в) 4-х клеточные 1,7±1,3

Из таблицы видно, что выход эмбрионов на стадии зиготы достоверно выше (р<0,01) у свиней опытной группы, по сравнению с контрольной. Увеличение выхода зигот у животных опытной группы происходило за счет снижения выхода 2-х клеточных (15,21 против 40,5%) и 4-х клеточных эмбрионов (0 против 9,8%). Хотя,

извлечено было в среднем на одного донора, приблизительно, одинаковое количество эмбрионов.

Таким образом, предлагаемый способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней позволяет достоверно (р<0,01) увеличить выход эмбрионов на стадии зиготы, по сравнению с известным способом, что способствует увеличению эффективности в целом технологии получения трансгенных животных .

2.3. Зязгялгига гекзерсг^алг^туяпЕргй, зсспод^эуогггзг ярзг сграксгаясза,

Качество визуализации пронуклеусов (или ядер) и микроинъекция экзогенного ДНК точно в пронуклеус имеют существенное значение при получении трансгенных животных. Однако при работе с зиготами свиней визуализации пронуклеусов затруднена из-за наличия в цитоплазме зиготы желточных и пигментных гранул. Поэтому одной из задач нашей работы явилось изучение влияния микроманипуляций, включающих визуализацию пронуклеусов и микроинъекцию чужеродной ДНК, на сохранность в условиях in vitro и способность к развитию in vivo эмбрионов свиней ранних стадий развития.

Наиболее распространенным методом визуализации пронуклеусов является центрифугирование, успех которого может зависеть как от ускорения, так и от времени. С целью выяснения режимов визуализации пронуклеусов была проведена серия экспериментов. Было испытано 3 режима центрифугирования свиных зигот. При I режиме эмбрионы центрифугировали в манипуляционной среде (Вит-тена или Дюльбекко + 20%ФС) в течение 4 мин при 4500 д. При II режиме эмбрионы центрифугировали в течение 5 мин при 11000 д, а при III - в течение 10 мин при 7 000 д и только 2- клеточные эмбрионы были центрифугированы при 11000 д в течение 5 мин. После чего отбирали эмбрионы с хорошо видимыми пронуклеусами. Эмбрионы всех групп были микроинъецированы экзогенной ДНК в пронуклеусы или в оба ядра. Микроинъецированные эмбрионы

после краткосрочного культивирования для выявления разрушений, связанных с манипуляциями, трансплантировали реципиентам, синхронным по половому циклу с животными донорами зародышей. Об успешности микроманипуляций судили по отсутствию видимых признаков нарушения целостности эмбрионов в течение краткосрочного культивирования (от 1 до 4 час). Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Влияние режимов центрифугирования на визуализацию пронук-

леусов и ядер в свинных эмбрионах ранних стадий развития

№N гр. Режим центрифугирования Число эмбри онов %эмбрионов с хорошей визуализацией пронуклеусов и ядер Число мик-роинъециро ванных эмбрионов % морфологически нормальных эмбрионов после микроинъекции и краткосрочного культивирования

I 4500g 4мин 91 50,5 (46/91) 41 89, 1 (41/46)

XI 11000g 5мин 93 87,1 (8Ц93) 81 87,6 (71/81)

III 7000g Юмин 94 91,5 (86/94) 86 77, 9 (67/86)

IV 11000g 5мин 14 92,8 (13/14) 13 92,3 (12/13)

Как видно из таблицы, в I группе эмбрионы с визуализированными пронуклеусами составили только 50,5 %, тогда как в остальных трех группах подобранные режимы центрифугирования дали достоверно более высокие (р<0,01) результаты по сравнению с первой группой, при этом процент выхода морфологически нормальных эмбрионов после микроинъекции и краткосрочного культивирования практически не отличался, хотя в III группе выход неразрушенных эмбрионов по сравнению с остальными группами был несколько ниже (примерно на 10%), различия статистически не достоверны.

Так как режим визуализации эмбрионов II группы дал лучшие результаты, мы в следующих исследованиях, по выяснению влияния микроманипуляций с ранними зародышами на процент их приживляе-мости, использовали эти же параметры центрифугирования. Полученные данные, представленые в таблице 4, показывают, что

процент визуализированных пронуклеусов и ядер у эмбрионов достаточно высок (86,6), при этом зародыши сохраняли нормальную жизнеспособность и 50% реципиентов опоросилось, а приживляе-мость эмбрионов составила 18,1 %, что является достаточно высоким показателем.

Таблица 4.

Приживляемость свиных эмбрионов, микроинъецированных генно-

инженерной конструкцией МТ-ИПФР-1

Показатели Микроинъецировано эмбрионов Всего

Зиготы 2-клеточные

Подвергнуто центрифу-

гированию 98 14 112

Визуализировано про-

нуклеусов и ядер, % 85, 7 (84/98) 92,8 (13/14) со 6 (97/112)

Микроинъецировано эм-

брионов 84 13 97

Пересажено эмбрио-

нов, % 97, 6 (82/84) 92,3 (12/13) 96, 6 (94/97)

Супоросных реципиен-

тов, % 50 ,0 (3/6)

Получено поросят 17

Приживляемость эмбри-

онов, % 18, 1 (17/94)

Таким образом, предлагаемый нами режим центрифугирования эмбрионов позволяет получить оптимальную визуализацию пронуклеусов и ядер зародышей и высокую приживляемость эмбрионов микроинъецированных чужеродной ДНК.

2.4. Равагетзго нокжлкЕгагЕцмогггсмж зародят-шсй сззетой in vitro поело биопсии арофобласта.

Наиболее слабым звеном в технологии получения трансгенных животных является низкий уровень интеграции чужеродных генов в

геном хозяина и этот факт вынуждает использовать большое количество эмбрионов на стадии зиготы для микроинъекции и большое поголовье животных-реципиентов. Поэтому весьма заманчивой представляется идея выявления интеграции трансгена у микрои-нъецированных эмбрионов, что позволит пересаживать реципиентам только зародыши с интегрированными чужеродными генами. Этого можно добиться путем разработки метода биопсии, обеспечивающего достаточное количество материала для анализа и, в то же время, гарантирующего высокую жизнеспособность эмбрионов после микрохирургических манипуляций.

На первом этапе исследований необходимо было определить стадии развития свиных эмбрионов, наиболее подходящие для микрохирургического взятия клеток трофобласта. В ходе экспериментов оказалось, что наиболее удобными для проведения такого рода манипуляций были ранняя и средняя бластоцисты (5-6-ой дни извлечения). Отличительной особенностью этих стадий развития эмбриона является отчетливо выраженная внутренняя клеточная масса (эмбриобласт), что позволяет отсекать только клетки трофобласта и, таким образом, сохранять высокую выживаемость эмбрионов после биопсии.

Выяснив оптимальные для работы стадии доимплантационного развития зародышей необходимо было исследовать выживаемость эмбрионов этих возрастов после биопсии и количество клеток в отсекаемом фрагменте. Для достижения этой цели у 7 6 эмбрионов извлеченных на 5-й или 6-й день после осеменения была проведена биопсия трофобласта. Одну часть кусочков трофобласта фиксировали для определения количества клеток, а другую замораживали в жидком азоте для последующего проведения ПЦР-анализа.

Достоверных различий в развитии in vitro доимплантацион-ных эмбрионов обеих групп выявлено не было (Таблица 5), не смотря на то, что размеры отсеченных фрагментов трофобласта колебались от 5 до 30 клеток и в среднем составляли 21,2 ±3,4 и 19,6 ± 3,6 бластомеров.

Таблица 5.

Влияние биопсии свиных эмбрионов на их способность к дальнейшему развитию in vitro.

Показатели Время извлечения эмбрионов

5-й день 6-й день

1. Число эмбрионов, у которых

проведена биопсия 40 36

2 . Число клеток во взятом фра-

гменте (lim) от 5 до 28 от 7 до 30

3. Среднее количество клеток

во фрагменте 21,2±3,4 19,6±3,6

4 . Число эмбрионов в контроле 11 12

5. Процент развивающихся заро-

дышей после 28-часового

культивирования in vitro:

опыт 85% (34/40) 80% (29/36)

контроль 91% (10/11) 92% (11/12)

Процент нормально развивающихся эмбрионов in vitro в опытной и контрольной группах практически не отличался в зависимости от дня извлечения (5-й или 6-ой). Последующие исследования показали, что даже наименьшего фрагмента (5 клеток) оказалось достаточно для проведения анализа генома методом полимеразной цепной реакции.

Таким образом, определены методы и стадии развития эмбрионов свиней наиболее удобные для проведения биопсии трофоблас-та, с целью определения интеграции трансгена в геном хозяина.

2.5. Опродс^сгзго scscorpausse тракезсела в :•. ir-.vc-f. гсеточчгьзж яв стаяю* змбрюяв моголом ОДР.

Определение интеграции в геном хозяина введенных чужеродных генов на стадии доимплантационных эмбрионов стало возмож-

ным в результате разработки метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) , позволяющем анализировать интеграцию трансгена в количествах ДНК равных 30-50 геномам. Вместе с тем, использование прямого метода ПЦР зачастую дает ложноположительные результаты. Поэтому целью данного раздела работы была модификация прямого метода ПЦР для определения только истинной интеграции чужеродной ДНК в хромосомы.

На первом этапе исследований был отработан автоматический вариант "nested" PCR (AN-PCR), который должен был обеспечить максимальную чувствительность проводимой реакции, т.е. обнаружение интегрированной ДНК в 1-2-х геномах. Для этой цели были подобраны 2 пары праймеров для AN-PCR таким образом, чтобы внешняя пара имела температуру отжига на 4-5°С ниже чем внутренняя. В этом случае, повышение температуры отжига выше указанных диапазонов приводит к нейтрализации внешней пары праймеров, но в это время, уже на обогащенной матрице, начинает работать внутренняя пара праймеров, добавленная во втором раунде ПЦР. Используя данную схему амплификации удалось добиться предельной чувствительности метода (рис. 2.).

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

2а

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Рис. 2. Оптимизация условий амплификации фрагмента MTGRF с помощью праймеров N 132, 133, 134 и 135. Для оптимизации была использована геномная ДНК, выделенная из крови трансгенных родителей, плазмида pMTGRF ранее использованная для получения трансгенных родителей и лизаты эмбрионов от трансгенных родителей .

2а.Серия оптимизации условий ПЦР с выделенной из крови трансгенных животных ДНК и плазмидой pMTGRF: N1 - негативный контроль содержащий все компоненты ПЦР кроме ДНК; N2-13 - позитивные контроли, содержащие хромосомную ВМД из крови

трансгенных родителей; N2,3 - 4 pkg ВМД, 4,5-8 pkg, 6,7-16 pkg, 8,9-40 pkg, 10-80 pkg,

11-400 pkg, 12-800 pkg, 13-1600 pkg N14 - маркер, pBR 322/MspI; N15 - негативный контроль (без ДНК);

N16-25 - позитивные контроли, содержащие ДНК плазмиды pMTGRF;

N15,16 - 10 atg (1 копия),

N17,18 - 1 fg (100 копий),

N19,20 - 100 fg <104 копий),

N21,22 - 10 pkg {10е копий),

N23,24 - 1 ng (108 копий).

26.Серия оптимизации условий ПЦР с лизатами трансгенных эмбрионов :

N1 - маркер pBR 322/MspI;

N2,3 - отрицательные контроли (все компоненты ПЦР, кроме ДНК);

N4,5 - негативные контроли с ДНК-фага X (100 ng) ;

N6,7 - негативные контроли с ДНК нетрансгенных животных(100 ng) ;

N8,9,10 - позитивные контроли с 10 копиями MTGRF(100 ад)

N10-12 - одна копия ДНК из крови трансгенных животных(4 pkg ДНК);

N13,14 - 10 копий ДНК трансгенных животных (40 pkg ДНК);

N15,16 - лизат из одной клетки трансгенного эмбриона N 1

N17,18 - 10 клеток из эмбриона N 1;

N19,20 - 30 клеток из эмбриона N 1;

N21,22 - одна копия генома из эмбриона N 2;

N23,25 - 10 копий генома из эмбриона N 2.

Соблюдение "hot-старта" в данных исследованиях имеет принципиальное значение. Предлагаемая нами схема nested-PCR является универсальной и простой в исполнении (one-tube nested-PCR) , более того, использование его гарантирует достижение предельной чувствительности без необходимости в последующей гибридизации с меченными зондами.

Для отработки микрофракционирования ДНК в агарозном геле (Рис.1), нами был использован несубмариновый вариант электрофореза. Применение такого метода вызвано необходимостью избежать перекрестной контаминации от пробы к пробе ДНК, внесенной в пустую лунку геля, при этом после внесения аликвоты в лунку

её сверху заливали 0,8 % агарозой с низкой температурой застывания. Кроме того, для исключения контаминации в последующей работе, были использованы специальные одноразовые полипропиленовые трубочки с диаметром не превышающим ширину зуба гребенки, предназначенные для взятия минимального среза геля с высокомолекулярной ДНК (ВМД) (Рис.16). Использование обычного субмаринового агарозного электрофореза без запечатывания проб ДНК в лунках геля, неизменно приводило к полной кросс-контаминации (рис. 3).

Дальнейшие исследования проводились с использованием параллельных проб от одного эмбриона. Иначе говоря, взятые кусочки эмбриона еще раз делились на две части: меньшая часть (около 10 клеток) использовалась для проведения прямой ПЦР в лизатах, а большая часть (около 20 бластомеров) была использована для микрофракционирования в агарозном геле и получения ВМД для дальнейшего ПЦР-тестирования (Рис.1). Также, нами была использована серия отрицательных контролей, с помощью которых контролировали весь ход эксперимента от лизиса эмбрионов до постановки ПЦР.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

чмр 'тшт >и1м||»I «шин тШг1ШРь

Рис. 3 Прямой вариант ПЦР с лизатами трансгенных эмбрионов (Ш 1-12) и с ВМД из этих же эмбрионов после проведения микро фракционирования при традиционных условиях электрофореза в агарозном геле и большом избытке копий трансгена в смеси (105 копий на образец) (Ш 14-25):

N 1, 2 - негативные контроли (без ДНК);

N 3 - позитивный контроль (10 копий рМТСКГ);

N 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12 - негативные образцы лизатов эмбрионов;

N 6-8 - позитивные образцы эмбрионов;

N 13 - маркер рВИ322/Мэр1;

N 14-25 - контаминированные образцы, включая негативные контроли.

Результаты экспериментов показали, что при микрофракционировании тотальной ДНК лизатов эмбрионов можно полностью удалить низкомолекулярную, неинтегрированную генетическую конструкцию из общего пула клеточной ДНК и выделить чистую ВМД быстрой элюцией из агарозного геля. Сравнения результатов прямого ПЦР-анализа лизатов эмбрионов с анализом ВМД после микрофракционирования показало полное совпадение количества позитивных проб (рис. 4).

1 2 3 4 5 6 7 8 5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Рис. 4 Прямой ПЦР с лизатами трансгенных эмбрионов (Ш 18) из ВМД из тех же эмбрионов после проведения микрофракционирования при новых условиях электрофореза в агарозном геле и быстрой элюции из агарозного геля при соотношении ВМД к трансгенной генетической конструкции 1:10 ООО копий (Ш 10-21):

N 1 - негативный контроль (без ДНК);

N 2 - позитивный контроль (10 копий рМТСКЕ) ;

N 3-В - позитивные образцы лизатов эмбрионов;

N 9 - маркер рВК 322/МБр1;

NN 10, 11 - негативные контроли с ДНК-носителем;

NN 12-13 - негативные контроли с ДНК-носителем и плазмидой -трансгеном (10 000 копий);

N 14 - позитивный контроль (10 000 копий, плазмиды-трансгена);

NN 15-21 - позитивные образци микрофракционированной ВМД лизатов эмбрионов.

Для подтверждения результатов исследований по установлению интеграции трансгена у эмбрионов свиней, были проведены дополнительные эксперименты на эмбрионах мышей. Для этого 80 мышиных зигот на стадии двух пронуклеусов были микроинъецированы генной конструкцией MT-IGF-1 и прокультивированы в среде Наш F-10 с 5 % БСА до стадии бластоцисты. После культивирования

эмбрионы, развившиеся до стадии бластоцисты, были разделены на две половинки с использованием техники, описанной в методической части работы, помещены в отдельные пробирки и заморожены в жидком азоте. Интактные бластоцисты, предназначенные для проведения контрольных опытов, также были помещены в отдельные пробирки и заморожены в жидком азоте. Две половинки одной бластоцисты являлись контролем по отношению друг к другу, что позволяло исключить возможность ошибки при проведении ПЦР-анализа.

Таблица 6.

Результаты ПЦР-анализа половинок бластоцист, полученных

из зигот, микроинъецированных конструкцией MT-IGF-1.

Результаты ПЦР-анализа

N Группы Число

проб положит. отрицат.

I Полуэмбрионы, анализированные методом прямого ПЦР 18

II Полуэмбрионы,анализированные после микрофракционирования тотальной ДНК

III Интактные бластоцисты,

анализированные прямым ПЦР (контроль на абсорбцию)

IV Интактные бластоцисты, анализированные после микрофракционирования

V Контроль на контаминацию

18

10

10 9

78% (14/18) 22% (4/18)

0% (0/18) 100% (18/18)

100% (10/10) 0% (0/10)

0% (0/10) 100% (10/10)

0% (0/9) 100% (9/9)

Результаты проведенных исследований показали, что при проведении анализа интеграции чужеродного гена прямым методом ПЦР, используемый для микроинъекции чужеродный ген присутствовал в 78% бластоцист, развившихся из микроинъецированных зигот. При

проверке интеграции в геном эмбрионов введенной генной конструкции, с использованием метода микрофракционирования, все параллельные полуэмбрионы дали отрицательный результат. ПЦР-анализ интактных бластоцист, инкубировавшихся в среде с исследованной генной кострукцией показал, что такое пребывание приводит к абсорбции генной конструкции на поверхности зародыша и ведет к получению ложноположительного результата. При использовании же метода микрофракционирования во всех контрольных пробах был получен отрицательный результат. Использование интактных бластоцист для контроля за контаминацией в ходе всей работы дало возможность оценить качество проводимых анализов и исключить ошибку в полученных результатах.

Таким образом, разработанный нами модифицированный метод ПЦР с использованием предварительного микрофракционирования высокомолекулярной ДНК от неинтегрированной низкомолекулярной позволяет выявить истинную интеграцию трансгена у зародышей животных, а высокая чувствительность метода, требующая для анализа до 10 клеток, способствует сохранению высокой степени жизнеспособности эмбрионов.

ВЫВОДЫ

1. Овцы-доноры с вызванной суперовуляцией могут быть использованы в качестве реципиентов для трансплантации им как собственных, так и чужих зигот, микроинъецированных генноинже-нерными конструкциями. При этом суягность при пересадке овцам собственных зигот была в два раза выше, чем при пересадке чужих зигот, а приживляемость эмбрионов составила 12,2 %.

2. Использование простагландина Е2а для синхронизации фолликулярной фазы у свиней с различной продолжительностью половых циклов, позволяет в два раза увеличить выход эмбрионов на стадии зиготы, при вызывании суперовуляции у половозрелых свиней .

3. Центрифугирование свиных зигот в течение 5 минут при 11000 g, с целью визуализации пронуклеусов, и введение в них генноинженерной конструкции микроинъекционным методом позволяет достигать 18% приживляемости трансплантированных эмбрионов при 50% супоросности свиней-реципиентов.

4. Биопсия трофобласта свиных эмбрионов на стадии ранней и средней бластоцисты, позволяющая получить необходимое для анализа количество клеток (10-25 бластомеров), не оказывает существенного отрицательного влияния на их дальнейшее развитие in vitro.

5. Дополнительное использование внутренних праймеров при PCR-анализе интеграции трансгена значительно повышает чувствительность метода и позволяет выявлять трансген в биопсирован-ных фрагментах трофобласта эмбрионов животных, содержащих 1-10 геномов (бластомеров).

6. Предварительное микрофракционирование высокомолекулярной ДНК из биопсированных фрагментов эмбрионов, позволяет отделить низкомолекулярную ДНК неинтегрированных генноинженерных конструкций от ДНК, интегрированной в хромосомы, свести до минимума ложноположительный результат и тем самым выявить истинную интеграцию трансгена в геном эмбриона.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью повышения выхода эмбрионов на стадии зиготы использовать вновь предложенный способ вызывания суперовуляции у половозрелых свиней на основе использования простагландина F2a.

2.С целью определения интеграции чужеродных генов в геном животных на стадии эмбрионов использовать метод предварительного микрофракционирования высокомолекулярной ДНК и метод nested-PCR.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Амиров А. Р. Использование суперовулированных доноров в качестве реципиентов для трансплантации микроинъецированных зигот у овец./4 7-я, Научно-методическая конф. аспирантов и молодых ученых. ВИЖ. 15 июня 1994 г. - Дубровицы, 1994, С.

2. Амиров А.Р., Сапунова Е.Г., Рябых В.П. Трансплантация овцам-донорам собственных зигот, микроинъецированных чужеродным геном./"Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных". Международный симпозиум 2426 мая 1994 г. - Пушкин, 1994, С. 5.

3. 2 марта 1995г. во ВНИИГПЭ в соавторстве была подана заявка N95102960 (005664/20) "Способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней." Получено положительное решение на выдачу патента по вышеуказанному изобретению 8 сентября 1995г.

4. Амиров А.Р., Сапунова Е.Г., Рябых В.П. Получение ягнят после трансплантации микроинъецированных зигот суперовулирова-вшим донорам./"Актуальные проблемы биологии в животноводстве". 2-я Международная конф. 5-8 сентября 1995 г. - Боровск, 1995, С. 170.

5. Амиров А., Кривохарченко A.C., Иванова Л.Б., Рябых В.П. Разработка метода биопсии доимплантационных эмбрионов свиней с целью проведения анализа генома./ "Консервация генетических ресурсов". Материалы рабочего совещания 28-30 мая 1996г. - Пу-щино, 1996, С.73-74.

6. Амиров А.Р., Шайхаев Г.Р., Рябых В.П. Определение интеграции трансгена у эмбриона на основе микрофракционирования ДНК./ Междун.конф. "Актуальные проблемы биотехнологии в расте-ниводстве, животноводстве и ветеринарии", 30-31 октября 1996 г., Москва, 1996, С. 4.