Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика трансгенных мышей с генами гемопоэтических факторов человека (Г-КСФ и ГМ-КСФ) под контролем 5`-регуляторной области гена α-S1-казеина козы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика трансгенных мышей с генами гемопоэтических факторов человека (Г-КСФ и ГМ-КСФ) под контролем 5`-регуляторной области гена α-S1-казеина козы"

На правах рукописи

БУРКОВ ИВАН АНДРЕЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ С ГЕНАМИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ЧЕЛОВЕКА (Г-КСФ И ГМ-КСФ) ПОД КОНТРОЛЕМ 5'-РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА а-81-КАЗЕИНА КОЗЫ

Специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ 005007060

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯНВ 2012

Новосибирск 2011

005007060

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения РАН Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: Кандидат биологических наук

Ирина Александровна Серова Институт Цитологии и Генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

Елена Викторовна Дейнеко Институт Цитологии и Генетики СО РАН, г. Новосибирск

Доктор биологических наук, профессор,

Людмила Фёдоровна Гуляева Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики РАН,

г. Москва.

Защита диссертации состоится « 2012 г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в конференц-зале Института цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, 90, пр. акад. Лаврентьева, 10, тел. (383)363-49-06, факс: (383)333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «19

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Возможность искусственно включать в геном практически любой интересующий исследователей ген позволила создать огромное количество трансгенных животных, используемых для решения самых различных задач современной биологии, медицины и сельского хозяйства. Одно из новейших направлений биотехнологии, заключается в создании так называемых биореакторов, - трансгенных сельскохозяйственных молочных животных, способных с молоком продуцировать ценные белки человека. Данная методика получения рекомбинантных белков является альтернативным подходом ныне существующим, основанным на бактериальных продуцентах или на использовании трансформированных клеток млекопитающих. Стратегия создания животных-биореакторов основана на введении в их геном конструкции, содержащей последовательность ДНК, кодирующую необходимый белок, и управляемую регуляторными элементами одного из «генов молока» -asi-, aS2-, ß- и к-казеинов, ß-лакгоглобулина, кислого белка молока или ß-лактальбумина (Maga et al., 1995; Wall et al., 1996; Wall et al., 1997; Гольдман и др., 2002; Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann, 2011). Полученные таким способом трансгенные животные способны на высоком уровне синтезировать целевой рекомбинантный белок в молочной железе и секретировать его в молоко, которое, в свою очередь, становится источником дая выделения белка. В настоящее время имеются примеры успешного применения этой технологии и созданы трансгенные козы, коровы, овцы, свиньи и кролики - продуценты человеческих белков: а-антигрипсина, сывороточного реактивного белка С, анти-тромбина, факторов VIII и IX свертывания крови, лактоферрина, кальцитонина и других (Wall et al. ,1997; Wall et al., 1997; Rudolph, 1999; Гольдман и др., 2002; Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann 2011).

Считается, что для корректной экспрессии трансгена в его составе должен присутствовать промотор, энханесеры, инсуляторы, интроны, а так же терминатор транскрипции (Houdebine 2006). Некоторые исследователи полагают, что для обеспечения экономической выгоды, концентрация рекомбинантных белков в молоке животных-биореакторов должна составлять около 1-2 мг/мл (Wall et al., 1997; Houdebine 2009). Действительно, такие высокие концентрации желательны, но только в том случае, если рекомбинантный белок не обладает биологической активностью и может находиться в трансгенном организме в высоких концентрациях (например, альбумин или фибриноген). Если же речь идет о белках, имеющих высокую биологическую активность (ростовые факторы, цитокины и др.), такие уровни продукции непригодны, ввиду того, что рекомбинантные белки могут нанести вред самому трансгенному животному при всасывании из молочной железы (Houdebine 2009). В свете этого не удивительно, что список белков человека, созданных к настоящему времени с помощью животных-биореакторов, не включает ростовых факторов или цигокинов (Lubon, 1998; Rudolph 1999; Goldman et al., 2002; Houdebine 2006; Niemann and Kues 2007, Niemann 2011). Рекомбинантные белки могут оказывать вредное влияние на организм трансгенного сельскохозяйственного животного как в случае эктопической экспрессии трансгена, так и в случае их адсорбции из молока в кровяное русло

(при высоком уровне секреции в молочной железе). Таким образом, стратегия получения трансгенных животных, продуцирующих биологически активные белки человека, должна быть пересмотрена, с целью обеспечить умеренную секрецию рекомбинантного белка в молоко. Для реализации этой цели необходимо создавать и тестировать такие генетические конструкции, которые смогли бы обеспечить умеренную, а самое главное тканеспецифичную экспрессию биологически активных рекомбинантных белков.

Учитывая длительный репродуктивный период большинства крупных животных - потенциальных продуцентов белков человека - трансгенные мыши являются незаменимой модельной системой в тестировании генетических конструкций, созданных для получения трансгенных животных-биореакторов. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось детальное исследование параметров экспрессии 2-х генно-инженерных конструкций, имеющих идентичные 5'- и 3' -регуляторные последовательности гена a-Sl-казеина козы, «слитые» с полноразмерными генами гранулоцит-колониестимулирующего (Г-КСФ, конструкция pGoatcasGCSF) или гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего (ГМ-КСФ, конструкция pGoatcasGMCSF) факторов человека у трансгенных мышей. Отдельным фрагментом работы являлось изучение экспрессии гена ГМ-КСФ человека у трансгенных мышей, несущих модифицированную конструкцию pGoatGMCSF, с добавленным в ее состав потенциальным инсулятором - MAR-элементом дрозофилы (pMARGoatcasGMCSF). Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Создать 3 группы линий трансгенных животных, несущих генно-инженерные конструкции pGoatcasGCSF, pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF, изучить наследование и копийность трансгенов.

2. Оценить экспрессию генов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в различных тканях и органах лактирующих и нелактирующих трансгенных животных с помощью ОТ-ПЦР.

3. Провести иммунофлуоресцентный анализ экспрессии гемопоэтических факторов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молочной железе в различных физиологических состояниях; и в тканях основных внутренних органов трансгенных мышей.

4. Используя количественный иммуноферментный метод (ELISA) определить уровень секреции белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей.

5. Посредством иммуноблотгинга определить наличие посттрансляционных модификаций белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека, синтезируемых в молоке трансгенных мышей.

6. С использованием теста на образование колоний из кроветворных клеток-предшественников пуповинной крови человека оценить биологическую активность бежов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека, синтезируемых в молоке трансгенных мышей.

Научная новизна

1. Проведена функциональная характеристика генно-инженерных конструкций pGoatcasGCSF, pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF,

способных обеспечивать экспрессию генов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молочной железе трансгенных мышей.

2. Впервые для создания вектора экспрессии использована 5'-фланговая область гена а-81-казеина козы, включающая в себя 1944 п.н. 5'-регуляторный район и 1443 п.н. последовательность, содержащую экзон 1, интрон 1 и 8 п.н. экзона 2.

3. Впервые показано, что данная нуклеотидная последовательность обеспечивает корректную и умеренную тканепецифичную экспрессию генов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молочной железе трансгенных мышей, не нарушая гематологические показатели у трансгенных животных.

4. В результате изучения функциональных характеристик вектора рМАКОоа1са5СМС8Р получены данные, свидетельствующие о негативном влиянии МАИ-элемента дрозофилы на экспрессию трансгена у мышей в случае включения его в 5'-область генно-инженерной конструкции рОоаказОМСЗР.

5. В работе проведена оценка влияния гомозиготного состояния трансгена на его экспрессию. Показано, что в большинстве случаев данный подход позволяет увеличить продукцию рекомбинантного белка. Положения, выносимые на защиту

• 5'-фланговая область гена а-81-казеина козы длиной 3387 п.н., включающая в себя регуляторный район длиной 1944 п.н., способна обеспечивать умеренную, стабильную и тканеспецифичную экспрессию трансгенов с гемопоэтическими гранулоцит-колониестимулирующим и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующим факторами человека в клетках молочных желез лактирующих трансгенных мышей.

• Экспрессия трансгенов с гемопоэтическими факторами человека не зависит от места их интеграции в реципиентный геном и количества копий в случае тандемного характера встройки.

• Рекомбинантные белки гемопоэтических факторов человека секретируются в молоко трансгенных мышей, имеют нормальный профиль гликозилирования, обладают полноценной колониестимулирующей активностью и не нарушают собственный гемопоэз трансгенных животных.

• Инсуляторная активность МАЯ-элемента дрозофилы в составе трансгена с гранулоцит-макрофаг колониестимулирующим фактором человека не подтвердилась.

Практическая значимость. Исходя из результатов, полученных в данной работе, мы можем рекомендовать использование генно-инженерных конструкций pGoatca.sGC.SF и р0оа1са50МСЯ1" для создания трансгенных коз-биореакторов. К настоящему времени генно-инженерная конструкция рОоаКаБССЗР уже использована сотрудниками Факультета репродукции мелкого рогатого скота университета штата Сеара (Бразилия) для создания трансгенных коз. Получены первые животные, секретирующие белок Г-КСФ человека в молоко.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на отчетной конференции по программе президиума РАН "Биоразнообразие и Динамика генофондов" (Москва, 2008), XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), IV международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (2010, Москва), Международной научной студенческой конференции (2011, Новосибирск) и 10 Transgenic Technology Meeting (Флорида, США, 2011).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы:

- генно-инженерные конструкции pGoatcasGCSF, pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF, созданные доктором Г.А. Дворянчиковым (Университет Майами, США) и доктором И.В. Бабкиным (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск).

- Коммерческие препараты "Granulen" и "Filgrastim" -рекомбинантные белки Г-КСФ, полученные в бактериальной системе E.coli.

Рекомбинантный негликозилированный ГМ-КСФ, полученный в бактериальной системе E.coli, любезно предоставлен доктором И.П. Гилевой (НПО «Вектор», Новосибирск).

Для выделения суммарной РНК использовался Trizol reagent (Life Technology, USA), согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription System (Pronega, USA).

Иммунофлуоресцентный анализ криостатных срезов органов и тканей трансгенных мышей проводили с использованием моноклональных антител против Г-КСФ и ГМ-КСФ человека (Santa Cruz, USA).

Для определения копийности трансгенных вставок использовали количественный ПЦР-анализ с использованием набора реактивов Синтол (Москва, Россия).

Иммуноблотгинг белка Г-КСФ в образцах молока трансгенных мышей проводили с использованием поликлональных антител против Г-КСФ и ГМ-КСФ человека (Santa Cruz).

Количественное определение содержания белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного анализа ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), используя наборы реактивов компании "Quantikine": "Human G-CSF", "Human GM-CSF" (R&D Systems) USA.

Подсчет форменных элементов крови частично производился с использованием гемоцитометра Hemolux 19 (Mindray, Shenzhen, China).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение трансгенных мышей, несущих конструкцию

pGoatcasGCSF Создание тпансгенпых мышей

! Генетическая конструкция, использованная в работе для получения

трансгенных мышей, была получена доктором Г.А. Дворянчиковым (Университет Майами, США). 5'-регуля_горная область гена asi-казеина козы, размером 3387 п.н. была синтезирована с помощью амплификации геномной ДНК козы. Этот фрагмент включает все известные регуляторные сайты, охарактеризованные к настоящему времени (Ramunno et al., 2004). 3'-нетранслируемая область гена ¡-казеина коровы включала в себя 1518 п.н. вместе с экзонами 18 и 19. Общая длина вектора, получившего название pGoatcasGCSF, составила 6409 п.н. (рис. 1).

I 3

РгС. гРгО РГ&*. .Рг В

SphI BsIEIl

t ____E1SN»

jGoat CSN1S1 S'-regulatory regionj.j Goal CSN1S1 infron 1 ЩЩ hG-CSF ^■/temtmGgMISlL^ '/.) ^ША mlronts ('../' 1 1

, 3387 bp U ATG tt 1504 bp ± 3'-UTR « 1518 bp ,

Рис. 1. Схематическое изображение вектора pGoalca.sCiC.SF. использованного I для создания трансгенных мышей.

Очищенная ДНК была инъецирована в мужской пронуклеус зигот мыши ) (7-10 нг/мкл). Инъецированные одноклеточные эмбрионы были перенесены реципиентам. Среди родившихся животных были идентифицированные четыре трансгенные мыши: две самки - #57 и #78, и два самца - #60 и #83 (рис.2).

К- К+ 1.100 83 80 79 78 60 59 58 57 К- К+ 1.100 83 80 79 78 60 59 58 5;

Рис. 2. Идентификация трансгенных мышей методом ПЦР с использованием праймеров РгА-РгВ (1) и РгС-РгО (2). #58, #60, #78 и #83 - трансгенные фаундерные животные. К+ - положительный контроль, К- - отрицательный контроль, Ь100 - маркер.

Все первичные трансгенные мыши оказались фертильными и посредством скрещивания с нетрансгенными животными линии С57В1/6 основали четыре индивидуальные линии. Чтобы выяснить, влияет ли гомозиготность трансгена на экспрессию гена Г-КСФ человека, с помощью анализирующего скрещивания были получены гомозиготные по трансгену рОоа1са5СгСЯР мыши линий #78 и #83.

Определение количества копий трансгена рСаа/сшОСЯГ Для определения копийности трансгенных встроек был использован метод qPCR. Референсиым геном был выбран ЬЛ, представленный в геноме в единственном экземпляре. Было установлено, что генетическая конструкция рОсШсжССХГ' присутствует в геноме гомозиготных мышей линий #78 в

количестве двух копий, а в геноме гомозиготных мышей линии #83 - в количестве пяти копий. Количество копий приведено в расчете на гаплоидный геном.

Экспрессия гена Г-КСФ человека в различных органах и тканях трансгенных

В молочных железах трансгенных самок линий #58, #60, #78 и #83 обнаружено присутствие транскрипта гена Г-КСФ человека (рис. 3).

58 60 78 83 К К- L100 58 60 78 83 К К- L100

Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Г-КСФ человека (1) и бета-акгина мыши (2) в молочных железах трансгенных гетерозиготных лактирующих самок #58-5, #60-6, #78-8, and #83-19. (К) - кДНК, полученная из молочной железы нетрансгенной лактирующей самки. (К-) - отрицательный контроль, реакционная смесь без добавления кДНК.

Более того, у самок и самцов линий #78 и #83, гомозигонтых по трансгену pGoatcasGCSF, ожидаемый транскрипт был обнаружен только в образцах РНК, выделенных из молочной железы, и отсутствовал в образцах РНК, выделенных из легкого, тимуса, печени, почки, селезенки, слюнной железы, яичника или семенников. Полученные данные свидетельствуют о высокой тканеспецифичности экспрессии трансгена pGoatcasGCSF, ограниченной только тканями молочной железы трансгенных лактирующих самок.

Количественное определение содержания Г-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей с помощью илшуноферментного

анализа ELISA

Результаты данного анализа демонстрируют, что вектор pGoatcasGCSF обеспечивал тканеспецифичную секрецию белка Г-КСФ человека в молоко трансгенных мышей в концентрации от 18,9 мкг/мл (у линии #60) до 38,8 мкг/мл (у линии #58). Мы не наблюдали значительной вариабельности в экспрессии этого трансгена у разных линий, несмотря на случайный характер интеграции трансгенной конструкции в геном животных-основателей. Дополнительно показано, что лактирующие гомозиготные самки линий #78 и #83 имели статистически значимо (р>0,05) более высокий уровень концентрации белка Г-КСФ человека в молоке — 68,2 и 38,8 мкг/мл соответственно. Также, нами получены данные о значениях концентрации Г-КСФ человека в сыворотке крови трансгенных мышей, из которых следует, что рекомбинантный белок не обнаруживается в крови самок всех линий вне лактации, однако его следовые количества были обнаружены у лактирующих самок линии #58 (1.1 нг/мл) и #78 (0.8 нг/мл). У трансгенных гетерозиготных самцов всех линий рекомбинантный белок в крови не обнаружен. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии эктопической экспрессии трансгена pGoatcasGCSF.

Иммунофлуоресиентный анализ экспрессии Г-КСФ человека в молочной железе и других органах трансгенных мышей

Локализация экспрессии белка Г-КСФ человека в тканях и органах трансгенных мышей была проведена с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител против Г-КСФ человека

1 ."«г-., -

1 ■\ -л4- .. • ' • • . " - 2

1 1 3 ^ 1оо ут ^ ' с*-... ' ' "■.»Л • 4

5 » • " - . 4; А.. 6

7 >- . - . 8

Рис. 4. - Иммунофлуоресцентный анализ секреции белка Г-КСФ человека в молочных железах трансгенных лактирующих самок. 1 - виргильная самка #83-31; 2 - беременная самка #58-12 на 16-й день беременности; 3 - беременная самка #78-2 на 19-й день беременности; 4, 5, 6 - самки #58-11, #78-8, #83-10 на десятый день лактации, соответственно; 7 - самка #60-24 на 8-ю неделю после лактации; 8 - контрольная нетрансгенная лактирующая самка.

Было показано, что в молочной железе девственных трансгепных самок отсутствуют клетки, экспрессирующие Г-КСФ человека. Единичные позитивные клетки появляются на поздних стадиях беременности, а на десятый день лактации большинство (если не все) эпителиальных клеток долек молочной железы трансгенных самок экспрессируют Г-КСФ человека. Топографически,

позитивные клетки выстилают лактирующие дольки, то есть это именно те эпителиальные клетки, которые секретируют «зрелое» молоко в просвет долыш. Мы обнаружили, что клеточный мозаицизм у исследованных линий слабо выражен. Отмечено, что молочные железы трансгенных самок в лактационной паузе (8 недель после последней лактации) содержат единичные клетки, экспрессирующие Г-КСФ человека. В иммунофлуоресцентном анализе образцов тканей трансгенных животных (печень, легкое, селезенка, тимус, лимфатический узел, почка, яичник и кожа) не было обнаружено клеток, позитивных по экспрессии Г-КСФ

Имм\ноблоттинг белка Г-КСФ человека в образцах молока трансгенных

мышей

Известно, что нативный белок Г-КСФ человека гликозилирован в положении ТЬг133 (КиЬЛа е1 а1., 1990; РгашрЮп й а1., 1994) и имеет молекулярную массу 20 кДа, тогда как рекомбинантный бактериальный Г-КСФ человека негликозилирован и имеет молекулярную массу около 18 кДа. Было показано, что белок Г-КСФ человека в молоке трансгенных мышей всех четырех линий представлен обеими формами в равных пропорциях. Опенка биологической активности белка Г-КСФ человека в образцах молока

трансгенных мышей Нами показано, что гемопоэтическая активность Г-КСФ человека, секретируемого в молоке трансгенных мышей, достаточно высока и сравнима, а в некоторых случаях и превосходит активность рекомбинантного коммерческого препарата Г-КСФ, и достоверно отличается от отрицательного контроля. Морфологический анализ колоний, полученных в колониеобразующем тесте, показал, что они представлены клетками гранулоцитарного ряда на различных стадиях дифференцировки. Полученные данные говорят о высокой биологической активности белка Г-КСФ человека, синтезируемого в молочной железе трансгенных мышей (рис. 5)

щ ") •1 ■ i. V ШР

3. ' * V^-fOOjim-.- - ' • 100 ут >

CN CP L58 L60 L78 L83

Рис. 5. Результаты колониеобразующего теста, проведенного на клетках пуповинной крови человека, а - графическое представление результатов колониеобразующего теста: CN - отрицательный контроль (молоко нетрансгенной мыши); CP - положительный контроль (коммерческий рекомбинантный Г-КСФ человека. Filgrastim); L58, L60, L78 и L83 - молоко соответствующих трансгенных линий. Ось ординат представляет количество образовавшихся колоний. * - Р<0.05; ** - Р<0.01. b - 1, 2, 3, 4 - фотографии

колоний, полученные с помощью световой микроскопии, образовавшихся при добавлении в культуру клеток пуповинной крови человека молока трансгенных мышей линий #58, #60, #78 и #83, соответственно. Морфология колоний указывает на принадлежность их клеток к нейтрофильно-гранулоцитарному ряду.

Гематологический анализ лейкоцитов крови трансгенных мышей

Гематологический анализ был проведен с помощью подсчета форменных элементов периферической крови трансгенных мышей. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии разницы в гемопоэзе трансгенных и нетрансгенных мышей. Мы также не наблюдали какой-либо разницы в количестве форменных элементов крови между трансгенным лактирующими и трансгенными нелактирующими самками.

2. Изучение трансгенных мышей, несущих генетические конструкции рСоа^аэСМСвГ и рМАКСоа^аэСМСвР Создание трансгенных мышей

Генетические конструкции рСоаК;азОМС8Р и рМАЯОоагсазОМСЗР, использованные для получения трансгенных мышей, были получены доктором Г.А. Дворянчиковым (Университет г. Майами, США) и доктором И.В. Бабкиным (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск).

j^^MAR ~ |GoatCSmsiS,-n»3"iati»Yra9k>nj:} GoatCSN1S1 faibwi 1 f' 1 PoVA 1 , 13041» «_ШШ__2028 bp » 1518 bp

Рис. 6. Схематическое изображение векторов pGoatcasGMCSF (А) и pMARGoatcasGMCSF (В), использованных для создания трансгенных мышей.

Для создания конструкции pGoatcasGMCSF клонированный полноразмерный ген ГМ-КСФ человека был переклонирован в ранее полученную плазмиду pGoatcasGCSF. Общая длина вектора pGoatcasGMCSF составила 6933 п.н. (рис. 6, А). Для создания конструкции pMARGoatcasGMCSF (рис. 6, В), предположительно способной избавить трансген от влияния эффекта положения, в плазмиду pGoatcasGMCSF была встроена последовательность инсулятора - MAR-элемента (matrix-attachment region) дрозофилы. Для данной цели использовали плазмиду, содержащую вставку MAR-элемента в векторе pUC19. Плазмида была любезно предоставлена профессором С.В. Разиным (Институт биологии гена РАН, Москва). Общая длина вектора pMARGoatcasGMCSF составила 8237 п.н. Очищенная ДНК с каждой из двух конструкций была инъецирована в мужской пронуклеус зигот мышей, после чего одноклеточные эмбрионы были перенесены реципиентам. Из родившихся животных четыре несли конструкцию pGoatcasGMCSF (самки #3, #9, #11 и #20),

а восемь - конструкцию рМАКОоа1сазОМС8Р (четыре самки - #18, #26, #28, #43 и четыре самца - #19 #20, #24 и #29) (рис. 7).

GM3 GM9 GM11 GM20 К- К* L100

18 19 20 24 26 28 29 43 К+ К- L

Рис. 7. Идентификация трансгенных мышей методом ПЦР с использованием праймеров Gm3F-Gm3R. GM3, GM9, GM11, GM20 - трансгенные фаундерные животные с конструкцией pGoatcasGMCSF; 18, 19, 20, 24, 26, 28, 29, 43 -трансгенные фаундерные животные с конструкцией pMARGoatcasGMCSF. К+ -положительный контроль, К- - отрицательный контроль, L100 - маркер.

Все трансгенные основатели оказались фертильными и при скрещивании с мышами С57В1/6 дали начало соответствующим линиям трансгенных животных: GM3, GM9, GM11 и GM20 - с конструкцией pGoatcasGMCSF, и MAR18, MAR 19 , MAR20, MAR24 MAR26, MAR28, MAR29 и MAR43 - с конструкцией pMARGoatcasGMCSF. Чтобы выяснить, как гомозиготное состояние трансгена влияет на экспрессию гена ГМ-КСФ человека, с помощью анализирующего скрещивания были получены и выделены гомозиготные по трансгену pGoatcasGMCSF мыши линий GM3, GM9, GM11 и GM20.

Определение количества копий трансгенов pGoatcasGMCSF и рМА RGoatcasGMCSF

С помощью метода qPCR было установлено, что у большинства изученных линий мышей трансгенная вставка содержит по 1 -3 копии трансгена Исключение составляют мыши линии GM3 и основатель линии MAR18, у которых встройки содержат 199 и 48 копий трансгена, соответственно. Кроме того, для линии MAR 18 было показано расщепление по копийности трансгена в первом поколении (F1), в результате чего различные потомки основателя имели от 16 до 48 копий трансгена. Это свидетельствует о том, что трансгенная конструкция одновременно интегрировалась в несколько независимых геномных локусов.

ОТ-ПЦР анализ экспрессии трансгенов pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF в различных органах трансгенных мышей

В тканях молочных желез трансгенных самок линий GM3, GM9, GM11 и GM20 был обнаружен транскрипт гена ГМ-КСФ человека. Среди других изученных органов трансгенных лактирующих самок с конструкцией pGoatcasGMCSF, транскрипт гена ГМ-КСФ был обнаружен в легком самки GM20 (рис. 8).

Рис. 8. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена ГМ-КСФ человека в различных органах лактирующих трансгенных самок с конструкцией pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF.: 1- молочная железа; 2 - печень; 3 -легкое; 4 - селезенка; 5 - почка, 6 - тимус, 7 - слюнная железа, 8 - яичник.

Полученные данные свидетельствуют о высокой тканеспецифичности экспрессии трансгеиа pGoatcasGMCSF, за исключением единичного случая обнаружения транскрипта гена ГМ-КСФ человека в легком лактирующей самки линии GM20 (рис. 8). I Исследование экспрессии трансгена pMARGoatcasGMCSF проводилось на

мышах шести линий. Результаты ОТ-ПЦР анализа показали слабую тканеспецифическую экспрессию трансгена в молочных железах лактирующих самок всех изученных линий (рис. 8). Эктопическая экспрессия трансгена pMARGoatcasGMCSF была выявлена в лёгких и слюнной железе линии MAR 18, а также в слюнной железе линии MAR 19 (рис. 8 ).

Количественное определение содержания ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей с помощью иммуноферментного

анализа (ELISA)

В результате данного анализа было показано, что концентрация рекомбинантного белка в молоке трансгенных мышей, несущих конструкцию pGoatcasGMCSF, была в среднем ниже, чем у мышей с конструкцией 1 pGoatcasGCSF и составляла от 2 до 14 мкг/мл у разных линий, хотя по-прежнему не наблюдалось значительной вариабельности в экспрессии трансгена. В целом, как и в случае с конструкцией pGoatcasGCSF, уровень экспрессии рекомбинантного белка в молочной железе трансгенных лактирующих самок носит стабильный характер. Данные о концентрации рекомбинантного белка в I молоке мышей, гомозиготных по данной конструкции, носят противоречивый характер. Так, у гомозиготных трансгенных самок линий GM 11 и GM20, концентрация белка ГМ-КСФ человека в молоке имеет достоверно более высокий уровень по сравнению с гетерозиготными мышами этих же линий. Тем 1 не менее, в сравнении с гетерозиготами, гомозиготные мыши линий GM3 и GM9 не демонстрируют каких-либо статистически значимых изменений I концентрации ГМ-КСФ человека.

У трансгенных самок с конструкцией pMARGoatcasGMCSF уровень секреции ГМ-КСФ человека в молоко оказался в 10-100 раз ниже, чем у мышей с конструкцией pGoatcasGMCSF, и составил от 0 до 700 нг/мл.

Нами так же были получены данные о концентрации белка ГМ-КСФ человека в сыворотке крови трансгенных лактирующих мышей. Этот важный параметр свидетельствует о наличии или отсутствии эктопической экспрессии трансгена. Так, у линий, несущих конструкцию pGoatcasGMCSF, следовые количества рекомбинантного белка обнаружены только в сыворотке крови мышей линии GM20: 0,1 нг/мл у самцов, 0,2 нг/мл у самок вне лактации и 0,2 нг/мл у лактирующих самок. Можно констатировать, что у мышей линии GM20 присутствует эктопическая экспрессия трансгена (что подтверждается результатами ОТ-ПЦР анализа в лёгких).

У трансгенных мышей с конструкцией pMARGoatcasGMCSF белок выявлен в сыворотке крови трех линий: MAR18 - 0,4 нг/мл, MAR19 - 0,7 нг/мл и MAR20 - 0,8нг/мл. Полученные данные согласуются с результатами иммунофлуоресцентного и ОТ-ПЦР анализов и свидетельствуют о том, что добавление в конструкцию MAR-элемента ухудшило её характеристики практически по всем изученным параметрам, и, в частности, обусловило частую эктопическую экспрессию трансгена.

Иммунофлуоресиентный анализ тканей и органов трансгенных мышей Локализация экспрессии белка ГМ-КСФ человека в тканях и органах трансгенных мышей была проведена с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител против ГМ-КСФ человека.

По сравнению с конструкцией pGoatcasGCSF, степень клеточного мозаицизма в молочных железах животных с конструкцией pGoatcasGMCSF носила более выраженный характер. Тем не менее, аналогично первой конструкции, трансген подчинялся физиологическим сигналам беременности и лактации. Так, первые позитивные клетки, экспрессирующие ГМ-КСФ, обнаруживались уже в молочных железах беременных самок. Впоследствии их количество заметно нарастало и достигало максимума на пике лактации, после чего опять уменьшалось и в лактационной паузе мы наблюдали лишь единичные позитивные клетки.

Иммунофлуоресцентный анализ органов трансгенных мышей, несущих конструкцию pGoatcasGMCSF, не выявил клеток, экспрессирующих ГМ-КСФ человека, в том числе и в лёгком мышей линии GM 20 - единственной линии, обнаружившей эктопическую экспрессию в лёгком в анализе ОТ-ПЦР.

Клетки, экспрессирующие ГМ-КСФ человека, были выявлены в молочных железах всех изученных трансгенных самок с конструкцией pMARGoatcasGMCSF, однако встречались они достаточно редко. Располагаются такие клетки, как правило, не в зрелом эпителии молочной железы (как у первых двух конструкций), а в междольковых пространствах, протоках или в неразвитых «молодых» дольках, ещё не включившихся в лактацию. Таким образом, ожидаемой картины присутствия позитивного сигнала в эпителиальных клетках, выстилающих лактирующую дольку, мы не наблюдали. У самок линии MAR 18 количество позитивных клеток было выше, чем у остальных исследованных линий, что соответствует более высокой продукции белка,

однако топографически позитивные клетки также локализованы не внутри лактирующих долек, а в междольковом прстранстве. Складывается впечатление, что рекомбинантный белок продуцируют более молодые клетки- молочной железы..

Иммунофлуоресцентное исследование тканей внутренних органов трансгенных мышей, несущих конструкцию pMARGoatcasGMCSF показало полное соответствие с результатами проведённого ОТ-ПЦР анализа -эктопическая экспрессия была выявлена в лёгком и слюнной железе у мышей лиши MAR 18 и в слюнной железе у линии MAR 19. У остальных изученных линий трансгенных мышей позитивных клеток в исследованных органах обнаружено не было.

Иммуноблоттинг белка ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей, несущих конструкцию pGoatcasGMCSF Иммуноблотгинг образцов молока трансгенных самок с конструкцией pGoatcasGMCSF был выполнен с использованием антител против белка ГМ-КСФ человека. Было показано, что ГМ-КСФ содержится в образцах молока всех четырех трансгенных линий, где он представлен несколькими формами с молекулярной массой от 14,5 до 25 кДа. Данные фракции представляют собой молекулы белка ГМ-КСФ человека с различной степенью гликозилирования (нативный ГМ-КСФ человека имеет два сайта потенциального N-гликозилирования и два сайта потенциального О-гликозилирования (Hamilton, Anderson, 2004)). Контрольный рекомбинантный негликозилированный ГМ-КСФ был представлен лишь одной фракцией с молекулярным весом около 14,5 кДа.

Оценка биологической активности белка Г-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей с конструкциями pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF Для того чтобы определить биологическую активность белка ГМ-КСФ человека, секретируемого в молоке трансгенных мышей, мы исследовали его влияние на кроветворные клетки-предшественники пуповинной крови человека в колониеобразующем тесте (табл. 1). Полученные результаты демонстрируют, что биологическая активность белка ГМ-КСФ человека, секретируемого в молоке трансгенных мышей линий GM3, GM9, GM И и GM20, значительно (и достоверно) выше активности контрольного рекомбинантного бактериального ГМ-КСФ, а активность ГМ-КСФ из молока линии MAR 18 сравнима с ней. Кроме того, биологическая активность ГМ-КСФ человека, секретируемого в молоке всех изученных линий (GM3, GM9, GM11, GM20, MAR18, MAR20 и MAR26) достоверно отличается от отрицательного контроля.

Таблица 1. Результаты колониестимулирующего теста образцов молока трансгенных линий с конструкциями рОоа^ОМСБГ, рМАЯОоа^аяОМСЗР, а также молока нетрансгенных мышей._

Экспериментальная группа Количество опытов Количество образовавшихся колоний

Молоко линии GM3 5 387,4±53,5**

Молоко линии GM9 5 254±29,4**

Молоко линии GM11 5 343,6±31,3**

Молоко линии GM20 5 245.6± 110,8**

Молоко линии MAR 18 4 73,75±10,46**

Молоко линии MAR20 4 27,5±15,02*

Молоко линии MAR26 4 12,5±6,75*

Положительный контроль, рекомбинантный GM-CSF (Е. coli) 4 93,25±31,4*

Молоко нетрансгенных мышей 4 1±2

Гематологический анализ периферической крови трансгенных мышей Гематологический анализ был проведен с помощью подсчета форменных элементов крови трансгенных мышей, несущих конструкцию рСоа1са5СМС81;\ Полученные данные, сходные с таковыми для конструкции рСоа^авССБР, свидетельствуют об отсутствии нарушений гемопоэза трансгенных мышей. Более того, мы также не наблюдали какой-либо разницы в количестве форменных элементов крови между траснгенным лактирующими и нелактирующими самками.

выводы

1. Генно-инженерные конструкции рвоаказОСЗГ и рСоаижОМСЗР, содержащие 3387 п.н. фрагмент 5'-фланговой последовательности гена а-81-казеина козы, включающей регуляторный район, экзон 1, интрон 1 и часть экзона 2, способны обеспечивать умеренную, стабильную и тканеспецифичную экспрессию генов гемопоэтических факторов (Г-КСФ и ГМ-КСФ) человека в клетках молочных желез "лактирующих трансгенных мышей.

2. Концентрация Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке трансгенных мышей с конструкциями рСоаижОСБР и рС1оа1сакСМС8Р варьировала в диапазоне от 2 до 40 мкг/мл. Такой уровень является приемлемым для создания трансгенных животных-биореакторов. Показано, что у гомозиготных по трансгену мышей в большинстве случаев возрастает продукция рекомбинантного белка в молоке.

3. Копийность и место интеграции трансгенов в реципиентном геноме'не оказывают существенного влияния на экспрессию исследованных генно-инженерных конструкций.

4. Гемопоэтическая активность белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека, продуцируемых с молоком трансгенных мышей, сопоставима или превышает активность коммерческих препаратов соответствующих рекомбинантных белков, полученных в бактериальных системах. В сочетании с результатами иммуноблотгинга, показавшими наличие гликозилированных форм этих белков в молоке трансгенных мышей, полученные данные свидетельствуют о важной роли посттрансляционных модификаций в обеспечении полноценной функциональной активности рекомбинантного белка.

5. Анализ гематологических показателей периферической крови не выявил негативного влияния рекомбинантных белков на гемопоэз изученных трансгенных животных.

6. Введение в 5'-область конструкции рСоа^аэСМСЗР потенциального инсулятора - МА11-элемента дрозофилы, существенно снижает ее транскрипционную активность, вызывает эктопическую экспрессию трансгена и значительно уменьшает уровень продукции рекомбинантного белка в молоке. Конструкция рМА1Шоаи:а50МС8Р не соответствует критериям, позволяющим использовать ее в биотехнологических целях.

7. На основании полученных результатов генно-инженерные конструкции р(]оа!са50С8Р и рОоа^аэОМСЗР могут быть рекомендованы для получения трансгенных животных с высокой молочной продуктивностью, с целью дальнейшего их использования в качестве биореакторов, продуцирующих гемопоэтические белки человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) JI.E. Андреева, И.А. Серова, Н.В. Хайдарова, Н.А. Барионова, Бапулин Н.Р., Бурков И.А. Изучение влияния регуляторных последовательностей a-Sl гена казеина коровы и козы на уровень экспрессии репортерных генов у трансгенных мышей. Отчетная конференция по программе президиума РАН "Биоразнообразие и Динамика генофонда", подпрограмма II "Динамика генофондов". Москва, 16 декабря, 2008 г. Стр. 215.

2) И.А. Бурков. А.Ю. Слободской, И.А. Серова, JI.E. Андреева, Г.А. Дворянчиков, L.P.B. Dias, Серов О.Л.Экспрессия генов гранулоцит-колониестимулирующего (Г-КСФ) и гранулоцит-макрофаг-колониестимулирукяцего (ГМ-КСФ) факторов человека под контролем 5'-регуляторной области гена a-Sl -казеина козы у трансгенных мышей. Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров., Москва, 21-28 июня, 2009. Часть 1, стр. 117

3) Бурков И.А.. Серова И.А., Андреева JI.E., Дворянчиков Г.А., Багинская Н.В., Серов O.JI. Клеточный мозаицизм в молочной железе мышей с геном гранулоцит колоние-стимулирующего фактора человека под контролем 5'-регуляторного района гена альфа-Si-казеина козы. XV Школа «Актуальные проблемы биологии развития», Звенигород, 19-24 октября 2008 г., стр 93-94.

4) Бурков И.А., Андреева JI.E., Бабкин И.В., Бапулин Н.Р., Серова И.А. Сравнительный анализ экспрессии рекомбинантных конструкций с геном гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора человека, несущих и не несущих ограничивающий МАЯ-элеменгДУ международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», 29 ноября-Здекабря 2010 г., Москва.

5) I.A.Serova, L.E. Andreeva, N.V.Khaidarova, L.P.B Dias, G.A.Dvoiyanchikov, I.A.Burkov. and N.V.Baginskaya. Mosaic Expression of LacZ Reporter Gene Controlled by 5'- Regulatory Sequences of alpha-Si -Casein Gene in Transgenic Mice. Cell and Tissue Biology, 2009, Vol. 3, No. 5, pp. 409-416

6) Irina A. Serova, Gennady A. Dvoryanchikov, Ludmila E. Andreeva, Ivan A. Burkov. Luciene P. B. Dias, Nariman R. Battulin, Alexander V. Smirnov and Oleg L. Serov. A 3,387 bp 5'-flanking sequence of the goat alpha-S,-casein gene provides correct tissue-specific expression of human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) in the mammary gland of transgenic mice. Transgenic Research, 2011, DOT 10.1007/sl 1248-011-9547-1.

7) Ivan Burkov. Irina Serova, Gennady Dvoryanchikov, Lyudmila Andreeva, Nariman Battulin, Alexandr Smirnov, Oleg Serov. 5'-regulatory region of the goat a-sl-casein gene drives tissue-specific expression of highly active human G-CSF and GM-CSF proteins in the mammary gland

of transgenic mice. Program and Abstracts of the 10th Transgenic Technology Meeting (TT2011), St Pete Beach, Florida, USA, October 24-26, 2011. Transgenic Research (2011), Vol. 20, No. 5, p.1153

Подписано к печати 23.12.2011 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ № 86

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бурков, Иван Андреевич, Новосибирск

61 12-3/470

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

БУРКОВ ИВАН АНДРЕЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕИ С ГЕНАМИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ЧЕЛОВЕКА (Г-КСФ И ГМ-КСФ) ПОД КОНТРОЛЕМ 5' -РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА

а-81-КАЗЕИНА КОЗЫ

Генетика - 03.02.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с., Серова Ирина Александровна

Новосибирск 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................................12

1.1. Достижения трансгенеза в биологии, медицине и сельском хозяйстве.................................................12

1.1.1. Создание животных, моделирующих различные наследственные заболевания человека..............12

1.1.2. Улучшение пород существующих сельскохозяйственных животных...................................................13

1.1.3. Создание трансгенных животных, служащих источником органов для пересадки человеку.............13

1.1.4. Использование трансгенных животных в продукции ценных белков человека для нужд медицины и биологии................................................................................................................................................................14

1.2. Методы получения трансгенных животных.....................................................................................................20

1.3. Молочная железа и гены, кодирующие белки молока....................................................................................28

1.4. Использование казеиновых генов молока в трансгенезе................................................................................29

1.5. Структура и функциональная значимость 5'-фланкирующих областей генов белков молока...................34

1.6. Факторы, влияющие на экспрессию трансгена у животных...........................................................................35

1.6.1. Эффект положения и влияние генетического окружения.......................................................................36

1.6.2. Тип ткани-мишени, экспрессирующий трансген.....................................................................................37

1.6.3. Количество копий трансгена......................................................................................................................37

1.6.4. Эпигенетические модификации трансгена...............................................................................................38

1.6.5. Эффекты присутствия гомологичных элементов в геноме.....................................................................39

1.6.6. Структура трансгена и наличие в ней 5'-цис-действующих регуляторных элементов........................39

1.6.7. Клеточный мозаицизм в экспрессии у трансгенных животных.............................................................41

1.6.8. Влияние возраста трансгенного животного и факторов окружающей среды.......................................42

1.6.9. Характеристики MAR/SAR элементов и их использование в создании трансгенных конструкций ..43

1.7. Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ)..................................................................................45

1.7.1. Структура гена Г-КСФ...............................................................................................................................46

1.7.2. Регуляция экспрессии Г-КСФ....................................................................................................................47

1.7.3. Биологические свойства Г-КСФ................................................................................................................48

1.7.4. Рецептор Г-КСФ..........................................................................................................................................49

1.7.5. Клиническое применение Г-КСФ..............................................................................................................52

1.8. Гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ).............................................................53

1.8.1. Структура гена ГМ-КСФ............................................................................................................................55

1.8.2. Регуляция экспрессии ГМ-КСФ................................................................................................................55

1.8.3. Рецептор ГМ-КСФ......................................................................................................................................57

1.8.4. Механизм связи лиганда с рецептором ГМ-КСФ....................................................................................58

1.8.5. Физиологические функции ГМ-КСФ........................................................................................................59

1.8.6. Клиническое применение ГМ-КСФ..........................................................................................................61

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................................................................62

2.1. Получение трансгенных мышей........................................................................................................................64

2.1.1. Подготовка рекомбинантной ДНК для микроинъекций.........................................................................64

2.1.2. Микроинъекция и трансплантация эмбрионов........................................................................................64

2.1.3. Анализ интеграции трансгенных конструкций и выявление трансгенных фаундеров........................65

2.2. Анализ транскрипции генов Г-КСФ и ГМ-КСФ в органах трансгенных мышей с помощью ОТ-ПЦР.....65

2.2.1. ОТ-ПЦР........................................................................................................................................................65

2.2.2. Выделение РНК...........................................................................................................................................66

2.2.3. Синтез кДНК..............................................................................................................................................66

2.2.4. Контроль качества полученой кДНК........................................................................................................67

2.3. Определение копийности трансгена.................................................................................................................67

2.4. Электрофоретический анализ ПЦР продукта..................................................................................................70

2.5. Количественное определение белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей..................................................................................................................................................70

2.5.1. Получения образцов молока и сыворотки крови.....................................................................................70

2.5.2 Иммуноферментный анализ........................................................................................................................70

2.6. Иммуноблоттинг белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке трансгенных мышей................................71

2.6.1. Получение поликлональных кроличьих антител к ГМ-КСФ человека.................................................71

2.6.2. Western Blot.................................................................................................................................................71

2.7. Иммунофлуоресцентный анализ присутствия белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в органах и тканях трансгенных мышей..................................................................................................................................................72

2.8. Оценка биологической активности белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей.........................................................................................................................................................................73

2.9. Подсчет форменных элементов периферической крови.................................................................................74

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................................................................75

3.1. Изучение трансгенных мышей, с конструкцией pGoatcasGCSF....................................................................75

3.1.1. Создание трансгенных мышей...................................................................................................................75

3.1.2. Определение количества копий трансгена pGoatcasGCSF......................................................................77

3.1.3. Экспрессия гена Г-КСФ человека в различных органах и тканях трансгенных мышей......................77

3.1.4. Количественное определение содержания Г-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей с помощью иммуноферментного анализа ELISA...........................................................78

3.1.5. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии Г-КСФ человека в молочной железе и других органах трансгенных мышей.............................................................................................................................................80

3.1.6. Иммуноблоттинг белка Г-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей.............................81

3.1.7. Оценка биологической активности белка Г-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей83

3.1.8. Гематологический анализ лейкоцитов периферической крови трансгенных мышей.........................84

3.2. Изучение трансгенных мышей, несущих генетические конструкции pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF................................................................................................................................................85

3.2.1. Создание трансгенных мышей...................................................................................................................85

3.2.2. Определение количества копий трансгенов pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF.......................88

3.2.3. ОТ-ПЦР анализ экспрессии трансгенов pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF в различных органах трансгенных мышей...............................................................................................................................89

3.2.4. Количественное определение содержания белка ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей с помощью иммуноферментного анализа (ELISA)........................................................94

3.2.5. Иммунофлуоресцентный анализ тканей и органов трансгенных мышей..............................................96

3.2.6. Иммуноблоттинг белка ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей, несущих конструкцию pGoatcasGMCSF..........................................................................................................................103

3.2.7. Оценка биологической активности белка ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей с конструкциями pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF...........................................................................104

3.2.8. Гематологический анализ лейкоцитов крови трансгенных мышей.....................................................106

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................................................................108

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТКМ - аутологичная трансплантация костного мозга Г-КСФ - гранулоцит-колониестимулирующий фактор ГМ-КСФ - гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИГФ-1 - белок, инсулиноподобный фактор роста 1 ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота М-КСФ - колониестимулирующий фактор макрофагов

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскрипции

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

чДДТАП - белок, длительно действующий тканевой активатор плазминогена человека

чЛ - лактоферрин человека

ЭПСК - эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки

AML - острый миелоидный лейкоз (Acute Myeloid Leukemia)

CSNlSl-a-Sl-казеин

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол

EDTA - этилендиаминтетраацетат

ELISA - иммуноферментный твердофазный анализ (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay)

LCR - локус-контролирующий район (Locus Control Region)

MAR/SAR - участок прикрепления ДНК к ядерному матриксу (Matrix/Scaffold

attachment region)

PBS - натрий-фосфатный буфер

qPCR - количественная ПЦР в реальном времени

SCNT - технология переноса ядра соматической клетки в энуклеированный ооцит (Somatic Cell Nuclear Transfer)

TNF - белок, фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor)

ВВЕДЕНИЕ

Большинство существующих в мире сортов культурных растений и пород животных созданы с помощью методов селекции. Тем не менее, основой селекции всегда служил геном вида, используемого в селекционной работе, в результате чего ее возможности были ограничены. В 70-е года двадцатого века был предложен революционный способ, позволяющий придавать животным свойства и признаки, которыми они не обладали ранее, путём искусственного введения генов. Такой способ получил название трансгенез, а животные, имеющие модифицированный геном - трансгенные животные. Европейская федерация изучения лабораторных животных (The Federation of European Laboratory Animal Associations) определяет термин «трансгенное животное» как животное, имеющее преднамеренно измененный геном, - генетическую детерминанту, ответственную за проявление наследуемых признаков. В ранних работах трансгенными называли только тех животных, которые несли в своем геноме чужеродный ген и были получены путем микроинъекции чужеродной ДНК в зиготу. Поскольку за последнее время появились и другие методы трасгенеза животных, на настоящий момент к этой категории относят всех животных, полученных в результате генноинженерных манипуляций, в том числе с использованием трансформированных эмбриональных плюрипотентных стволовых клеток, ретровирусных конструкций, трансформированных сперматозоидов и других методик переноса чужеродной ДНК. Иногда к трансгенным животным относят и тех, которые были подвергнуты соматической трансфекции, то есть которым чужеродный ген введен был непосредственно в определенный орган или ткань взрослого организма.

В наши дни трансгенные организмы перестают быть редкостью и значение их для современной биологии и медицины трудно переоценить. Возможность искусственно включать в геном практически любой интересующий исследователей ген позволила создать огромное количество трансгенных животных, используемых для решения самых различных задач современной биологии, медицины и сельского хозяйства. Так, в биологии трансгенные животные используются для изучения функций и регуляции экспрессии различных генов, а в биомедицине - для создания широкого спектра моделей заболеваний человека, включающих такие, как атеросклероз, СПИД, болезнь Альцгеймера, ретинобластому, диабет, гипертонию,

рак и многие другие (Niemann and Kues, 2011). Модельные трансгенные животные (как правило, мыши) позволяют изучать молекулярные и клеточные механизмы развития заболеваний человека и разрабатывать способы их лечения. Другой сферой использования трансгенеза является сельское хозяйство, для нужд которого создаются породы животных, имеющие повышенную устойчивость к различным заболеваниям, способность давать больше мяса, молока, шерсти и т.д. Трансгенез также применяется в экспериментах по созданию животных, чьи органы в перспективе могут быть использованы для ксенотрансплантации человеку. Наконец, трансгенез служит основой новому направлению биотехнологии, которое заключается в создании так называемых животных-биоректоров, -сельскохозяйственных молочных животных, способных с молоком продуцировать ценные белки человека. Данная методика получения рекомбинантных белков является альтернативным подходом ныне существующим, основанным на бактериальных продуцентах или на использовании трансформированных клеток млекопитающих. Стратегия создания сельскохозяйственных молочных животных-биореакторов основана на введении в геном животных конструкции, содержащей последовательность ДНК, кодирующую необходимый белок, и управляемую регуляторными элементами одного из «генов молока» - asr, aS2-, ß- и к-казеинов, ß-лактоглобулина, кислого белка молока или ß-лактальбумина (Maga et al., 1995; Wall et al.,1996; Wall et al.,1997; Гольдман и др., 2002; Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann, 2011). Согласно этой стратегии, полученные трансгенные животные способны на высоком уровне синтезировать целевой рекомбинантный белок в молочной железе и секретировать его в молоко, которое, в свою очередь, становится источником для выделения белка. В настоящее время имеются примеры успешного применения этой технологии и созданы трансгенные козы, коровы, овцы, свиньи и кролики - продуценты человеческих белков: а-антитрипсина, сывороточного С- реактивного белка, анти-тромбина, факторов VIII и IX свертывания крови, лактоферрина, кальцитонина и многих других (Wall et al., 1997; Rudolph, 1999; Гольдман и др., 2002; Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann 2011). Фармакологический рынок рекомбинантных белков, полученных из молока трансгенных сельскохозяйственных животных, к 2007 году оценивался в 1 млрд $,

а к 2013 году прогнозируется его увеличение до 18,6 млрд. $ (Niemann and Kues, 2007).

Считается, что для корректной экспрессии трансгена в его составе должен присутствовать промотор, энханесеры, инсуляторы, интроны, а так же терминатор транскрипции (Houdebine, 2006). Кроме того, показано, что использование в генетической конструкции длинного регуляторного района, содержащего целевой промотор, обеспечивает более высокий уровень экспрессии трансгена (Bischoff et al., 1992; Rival-Gervier et al., 2002). Некоторые исследователи полагают, что для обеспечения экономической выгоды, концентрация рекомбинантных белков в молоке животных-биореакторов должна составлять не менее 1-2 мг/мл (Wall et al., 1997; Houdebine, 2009). Действительно, такие высокие концентрации желательны, но только в том случае, если рекомбинантный белок не обладает биологической активностью и может находиться в организме в высоких концентрациях (например, альбумин или лактоферрин). Если же речь идет о белках, имеющих высокую биологическую активность (ростовые факторы, цитокины, гормоны и др.), такие уровни продукции непригодны, ввиду того, что рекомбинантные белки могут нанести вред самому трансгенному животному (Houdebine, 2009). В свете этого не удивительно, что список белков человека, созданных к настоящему времени с помощью животных-биореакторов, не включает ростовых факторов или цитокинов (Lubon, 1998; Rudolph, 1999; Goldman et al., 2002; Houdebine, 2006; Niemann and Kues, 2007; Niemann, 2011). Рекомбинантные белки могут оказывать вредное влияние на организм трансгенного сельскохозяйственного животного как в случае эктопической экспрессии трансгена, так и в случае их адсорбции из молока в кровяное русло (при высоком уровне секреции в молочной железе). Таким образом, стратегия получения трансгенных животных, продуцирующих биологически активные белки человека, дол