Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ КЛЕТОК-«УПАКОВЩИЦ»

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ КЛЕТОК-«УПАКОВЩИЦ»"

-3£320 -

На правах рукописи

ВОЛКОВА Людмила Александровна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

СОМАТИЧЕСКИХ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ КЛЕТОК-«УПАКОВЩИЦ»

о

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровины - 2005

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства РАСХН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шихов Игорь Яковлевич;

доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович.

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (МГАВМиБ).

Защита диссертации состоится Ц^ОлА. 2005 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 006.013.01 при учреждении Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (8ИЖ).

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос.Дубровицы, ВИЖ,факс 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь диссертационного сов кандццат биологических наук

Автореферат разослан /

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для создания трансгенных животных используют целый рад методов: микроинъекция ДНК в пронукпеус зигот, вирусная траисфекция, использование спермиев как переносчиков ДНК, пересадка ядер трансформированных эмбриональных стволовых клеток, липосомальный транспорт генов [Зиновьева, Эрнст, 2004). Исторически ботве ранним методом является метод микроинъекции ДНК, с использованием которого были получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные [Hammer et ai, Í985; Brem et aí. 1585]. Однако данный метод характеризуется низкой эффективностью трансгенеэа: интеграция рекомбинантой ДНК в зависимости от вида животного наблюдается топыю в 0,5-1% случаев [Брем и др., Í995). Причем около 40% полученных трансгенных животных в последующем не экспрессируют чужеродный белок [Witotrf I etal.,1991; Hennigbausen L et ai., 1992].

В этой связи актуальным является разработка альтернативных методов переноса генов, позволяющих повысить эффективность трансгенеза. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Благодаря зволюционш сложившемуся механизму интеграции вирусной РНК в геном клетки-хозяина, ретровирусные векторы позволяют эффективно осуществлять трансформацию клеток-мишеней, как in two, так и in vitro. Они самостоятельно проникают в клетки-мишени и эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку. Огромным преимуществом данных векторов является возможность их использования для получения так называемых соматических трансгенных животных методом локального (органного) трансгенеэа, что позволяет значительно сократить сроки получения трзнсгенных индивидуумов [Титова В.А., 2001; Волкова НА, 2002; Гвоздь ИМ, 2002]. Ретровирусные вектора рассматриваются в качестве перспективного метода и е случае получения трансгенных кур [Mizuarai S. ef al., 2001; HawyAJ. etat., 2002; Mozdziak P.E. et at.,, 20031 особенности воспроизводства которых делают использование метода микроинъекции для этих целей малоэффективным.

Однако эффективность трансформации клеток-мишеней ретровирусными векторами во многом определяется используемой линией клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровкрус. В этой связи, возникает необходимость в оценке различных линий клеток-«упаковщиц» для использования в трансгенезе соматических и эмбриональных клеток животных m vitro и in vivo.

Мель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование эффективности генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-л упаковщиц».

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести трансфекцию первичной культуры клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in wtro с использованием двух типов клеток-«упаковщиц» АМ12 и рд13.

2. Изучить динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коров, коз и свиноматок после введения в молочную железу генных конструкций, инте рд(3.

ририцанны* в Псшующую линию

ЦНБ МСХА фонд научной литературы

ыо #-3s3ZO

3. Усовершенствовать метод получения трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов.

4. Определить эффективность трансформации клеток эмбрионов кур in то на уровне ДНК.

5. Выявить факторы, определяющие эффективность трансформации клеток эмбриона кур ш vivo.

6. Дать сравнительную оценку использования двух типов клеток-«упаковщиц» для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые проведена оценка двух типов клеток-купаковщиц» АШ2 и pgí3 для переноса экзогенной ДНК в первичные клетки молсмной железы млекопитающих и эмбрионы кур m vilm. Впервые осуществлена трансформация клеток молочной железы коров, коз и свиноматок in vivo пакующей линией рд13 и изучена динамика экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных в ходе лактации.

Впервые оценена эффективность использования ретровирусных векторов для трансгенеза эмбрионов кур /л то, и на основе сравнительного анализа различных способов введения генных конструкций в эмбрионы кур отработан метод получения трансгенных кур. Получены трансгенный петух, несущий структурный ген эритропоэтина человека в клетках крови, кишечнике, печени, сердце и курица с интеграцией рехомбинактной ДНК (ген гормона роста человека) в сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке. Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур.

Практическая значимость работы. Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, имеют практическую значимость. Оценена эффективность использования двух типов клеток-вулаковщиц» АМ12 и рд13 для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур ¡л vifro и in vivo. Усовершенствован метод получения трансгенных кур посредством использования ретровирусных векторов. Выяалены факторы, определяющие эффективность трансформации эмбрионов кур т vivo.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур ¡n vitro и in viva.

• Периодичность синтеза рекомбинантных белков в молоко соматических трансгенных животных.

• Влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур и wVo.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены: на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы. ВИЖ, 2003; на II! международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 2004; на международной научно-

практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы, ВИЖ, 2004; на Ш международном конгрессе «Биотехнология; состояние и перспективы развития», Москва, Экспоцентр, 2005; на конференциях отдела биотехнологии ВИЖ, 2002-2005 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на страницах,

содержит // таблиц, Jt £ рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Слисок литературы включает //О источников.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа была выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных отдела биотехнологии ВИЖ, ОПХ «Дубровицы», а/х «Кпеново-Чегсдаево» в период с 2002 по 2005 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы отдела биотехнологии ВИЖ.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

В работе были использованы три retwbie конструкции pLN-a, pLN-G-CSF и рХ-RSVhgh, каждая из которых была помещена в одну из пакующих линий клеток рд 13 или АМ12. Генные конструкции pLN-a и рШ-G-CSF (предоставлены д.б.н., профессором Рябых В.П., ВНИИФБиП, г. Боровск и к.б.н. Фоминым ИХ, БелНИИ переливания крови, г. Минск) были получены на основе вектора pLNS путем встраивания в прямой ориентации в сайт Xho I под контролем промотора asi-казеина крупного рогатого скота генов эритропоэтика человека (ЭПО) в первом случае, и гранулоцитарного копониестимулирующею фактора (Г-КСФ) - во втором (рис. 2).

Для получения генной конструкции pX-RSVhgft (предоставлена к.б.н. Фоминым И.К., БелНИИ переливания крови, г. Минск) в полилинкер pLXSN по сайтам рестрикции EcoRI и BamHI были встроены два фрагмента: хромосомапьный фрагмент BamHI-Smal (1.53 kb) и фрагмент EcoRI-Sacl (0.41Kb) из плззмиды plP2 (lnvitrogen). Первый фрагмент «держал ген гормона роста человека, второй - промотор RSV (вирус саркомы Рауса) (рис.3).

Используемые для упаковки генных конструкций в вирусные частицы лини» клеток АШ2 (предоставлена ИХФоминым, Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск) и рд13 (предоставлена А.Б. Судариковым, Гематологический центр, г. Москва) были получены на основе эмбриональных фибробластов мыши NIH3T3, в которые последовательно были встроены вирус-ксдирующие последовательности gag, pol и env. Линия АШ2 содержала белок env амфотропного вируса лейкемии мышей Молони (MLV). который способен взаимодействовать с рецепторами, присутствующими на клетках многих видов - от птиц до человека. Линия рд13 экспрессировала белок env вируса лейкемии гиббона (GaLV), который также проявляет тропизм к широкому спектру клеток-хозяев за исключением мыши.

Культивирование пакующих линий клеток, продуцирующих рекомбинантный ретровирус, осуществляли в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 2мМ 1-глутамина и антибиотика (гентамицина) в конечной концентрации 50 мкг/мл.

Получение вирусных препаратов

_i_

Линии клеток-вупакоешии»

.J-

АМ12

PS«

Т

pLN-a

pX-RSVhgh

д_с

pLN-G-CSF

pLN-a

Л

Купьтуральная жидкость

_L

Клетки-«упаковщицы»

Введение в клетки-мишени

_г

X

ТоансЛосмзиия № vitro

1

ТознсоЬоомэиия in vivo

первичная культура клеток молочной железы коровы, свиньи it козы

X

эмбриональные клетки кур

введение в молочную железу коров, коз и свиноматок

Отбор трансформированных кгтоноа на селективной среда

Отбор проб для исследований

Г

Молоко

X

Г

1

Ткани ПГ~

Анализ на наличие рекомбинаитиой ДНК

ПЦР-анализ

-сг

Анализ экспрессии рекомбинантного белка

| ИФА (

имиуногистохимвд

I—

Анализ эффективности использования линий клеток-купаковщиц» АМ12 и рд13 для твансгенеза in vitro и in vivo

Рисунок 1. Схема исследований.

Xhot ЕР ПА

I i тв I I мл 11 (jen I I t -ta

pLNS

LTR IV* I H4 IT ÑÍO ] | *-Tft [

600 900 ' ----------.------ 1400 4Í0

---------

г' tv

aSi-*a эснк/эрмтроло5тии

pLN-G-GSF I- 11 "' ■ l^-^ .v^l.'.V!-!^...,'.'Л-

Qsi-казеин/Г-КСЛ

Рисунок Z Схема строения вектора pLNS. LTR - длинный концевой повтор. Y+ -сигнал упаковки, Н4 - промотор систона человека, NEO - ген устойчивости к неоиицину, ЕР -деления в области промогора-энхансера, рА - сигнал тгалкадекипироеэния.

бООЬр 900 410 ИЗО 360 «00 боо

LTR RSV ЬФ i SV пео LTR

т S 1 i i Е ES 1 S В 1 S

Рисунок 3. Схема строения генной конструкции рХ-КЗДЬдЬ. ВЗУ - промотор вируса саркомы Рауса; ЗУ - промотор ранних генов вируса 5У40; лео - ген несэдщинфосфотрансферзэы из транспрзона Тгб, В - ВаггИ!, Е - ЕсоГЧ, Б - 5ай, - 5а)1, X - ХЬо1.

Для культивирования первичной культуры клеток молочной железы коровы, свиньи, козы и эмбрионов кур использовали ростоаую среду следующего состава: 45% Р-12,45% ОМЕМ, 10% сыворотки плода коровы (СПК), 2мМ Ь-глутамин, гентамицин (50 мкг/мл). В случае культивирования первичных клеток молочной железы в ростовую среду добавляли инсулин в конечной концентрации 3,5 мкг/мл. Снятие клеток с субстрата проводили с помощью 0,25% раствора трипсина, рН=7,6, Криоконсервирование клеток осуществляли с использованием следующей криозащитной среды: 10% ДМСО, 40% СПК, 50% ОМЕМ.

Первичную культуру клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур получали путем механической и ферментативной обработки ткани, В последнем случае использовали растворы 0,25% трипсина и коллэгеназы.

Трансформацию клеток-мишеней ¡п )/йю осуществляли путем совместного культивирования с клетками-«упаковщицами» и инфицирования вирусным препаратом, представляющим собой культурапьную жидкость, содержащую рекомбинантный ретровирус (Новое е клонировании ДНК, 1989). Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных плеток.

Введение генных конструкций ю vim осуществляли в молочную железу сельскохозяйственных животных (коров, коз, свиноматок) и эмбрионы кур. Клетки молочной железы трансформировали путем множественной инъекции суспензии клеток-«упаковщиц» непосредственно е паренхиму вымени взрослых животных. В опыте было использовано 4 коровы, 6 коз и 4 свиноматки. Раствор генных конструкций (клетки-«упаковщицы» и культуральную жидкость) в клетки эмбрионов кур вводили до начала инкубации яиц непосредственно в зародышевый диск и на более поздних стадиях развития эмбриона: на первый, второй дни инкубации в эмбрион и на третий день - в дорсальную аорту,

Наличие генной конструкции в тканях и органах опытных животных определяли методом ПЦР по стандартной методике. Выделение ДНК из крови, спермы и ткани осуществляли с использованием солевого и перхлоратното методов {Зиновьева и др., J99fl]. Праймеры, используемые для анализа, имели следующую последовательность: neo - cct-tct-tga-oga-gtt-ctt-ctg-a, mtv- tag-cct-gcoaaa-cct-aca-ggt,

Экспрессию рекомбинантных белков в молоке и тканях опытных животных определяли методами ммиуноферментного анализа и иммуногистохимии.

Для проведения иммуногисгохимичееких исследований образцы молочной железы, полученные прижизненно (биопсия) или после убоя животного, фиксировали в 10% формалине. Гистологические препараты готовили по общепринятой методике {Ромейс, 1953). Локализацию рекомбинантого белка а клетках молочной железы выявляли с помощью набора «Novostatin Super ABC Kit» (Novocastra). Для детекции продукта иммуногистохимической реакции использовали 3,3-диаминобензидина тетрзхлорзг (ДАБ) или З-амино-9-этилкарбоэол (АЕС) фирмы «Srgma».

Получение и приготовление препаратов митотических хромосом кур осуществляли по модифицированной нами методике [Волкова Л.А. и др., 2004]. Для цитогенетического анализа полученных препаратов хромосом использовали цифровую видеокамеру КС-5830 (Тайвань) и программу Image Scope 1 (фирма С MA, Россия) в комплексе с программой Photoshop 6.5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных

животных

Трансформацию клеток молочной железы сельскохозяйственных животных осуществляли с использованием двух ретровирусных векторов pLN-a и plN-G-C$F, каждый из которых был помещен в одну из пакующих линий клеток АМ12 или pgI3. В данном направлении была проведена серия экспериментов по введению экзогенной ДНК в клетки-мишени от vivo и in vitro.

3.1.1. Трансфекция клеток молочной железы сельскохозяйственных

животных in vitro

Эксперименты по трансфекции первичной культуры клеток молочной железы коровы, свиньи и козы ретроеирусными векторами выявили различия в способности используемых пакующих пиний AMJ2 и рд13 инфицировать клетки-мишени (таблица 1).

Таблица 1. Результаты трансфекции клеток молочной железы in vitro

Вид животно го Линия клеток-« упаковщиц я

АМ12 PQ13

pLM-a PLN-G-CSF pLN-a PLN-G-CSF

частота П частота п частота п частота Л

генетич. Ц генетт ц генетич. ц генетич. Ц

трансформ.* Р трансформ. р трансформ. р трансформ. Р

коза 8-1 (Н + 3-1 tH + 6-КИ + 2-1 (Н

свинья 2-10-» + 3-1 о-« + 9*1 (И + Ч(М

крс 1,5-103 + м<н + МО* + 5-КМ +

Примечание: Частота генетической трансформации - отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу «нфицирсвзнны* клеток.

Наиболее эффективной в переносе экзогенной ДНК оказалась линия АШ2. Так, при трансформации клеток молодой железы свиньи рекомбинантным вектором pLN-a, упакованный в данную линию, из 10000 инфицированных клеток было получено 20 трансформированных клонов (2-10-3), в то время как при использовании пакующей линии рд13 данный показатель составил только 9 клонов (9-1 СИ). Во всех остальных опытах по переносу экзогенной ДНК в клетхи-мишени также отмечались различия по частоте генетической трансформации в пользу пинии АМ12, однако эта разница была менее значительной.

Частота генетической трансформации варьировала и в зависимости от используемой генной конструкции. Максимальное число генетически трансформированных клонов бьшо получено при совместном культивировании с клеткам и-вупэ ковщицами », содержащими рекомбиканткый ретровирусный вектор рЩ-а. В случае использования генной конструкции pLN-G-CSF эффективность трансформации клеток-мишеней была в 2-9 раз ниже.

Таким образом, эффективность трансформации клеток молочной железы in vitro определялась генной конструкцией и пакующей линией клеток. Наиболее высокая частота генетической трансформации клеток-мишеней была установлена при использовании генной конструкции рШ-a и пакующей линии АШ2.

3.1.2. Введение экзогенной ДНК в клетки молочной железы

сельскохозяйственных животных in v>Vo

Следующим этапом работы было введение экзогенной ДНК в клетки-мишени in vwo. В опытах была использована пакующая пиния pgt 3.

Введение генных конструкций в молочную железу коз. Введение кпеток-«упаковщиц» осуществляли на третьем, четвертом и 4,5 месяцах сукозности. Каждому животному было введено 20 млн. клеток (по 10 млн. на одну долю вымени). Четырем опытным козам {№16, №22, №7, №15} была введена генная конструкция pLN<r, двум (№20 и №19) - генная конструкция piN-G-CSF.

Проведенные исследования показали, что наиболее высокая экспрессия рекомбинантного белка с молоком опытных животных наблюдалась при использовании генной конструкции pLN-a. В данном случае содержание рекомбинанткого ЭПО в молоке коз достигало 350 нг/мл (козы №7 и №15). При введении генной конструкции pLN-G-CSF

концентрация рекомбинантного Г-КСФ не превышала значений 96-100 нг/мл. Средний уровень экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе коз также был выше по сравнению с экспрессией рекомбинантного Г-КСФ. Если в первом случае содержание рекомбинантного продукта в молоке опытных животных достигало в среднем от 45±14,2 нг/мл (коза №16) до 92±28,0 нг/мл (коза №15), то в последнем данный показатель был ниже в 1,7-3,4 раза и составил всего лишь 27±7,79 нг/мл.

Следует отметить значительную разницу мезеду максимальным и средним уровнями экспрессии рекомбинантных белков, что связано с периодичностью синтеза данных белков в молочной железе опытных коз в течение лактации. У всех опытных животных независимо от используемой генной конструкции наблюдались периоды подъема и спада секреции рекомбинантного продукта в молоко (рис. 4).

-©-№22 -О— №16 —№7 -Ф- №15

350 300

5

2S0

X

£ 200

0

1 1«

з 100 i

50 О

1 i 10 20 30 10 50 «О 70 ВО 90 100 110 120 130 НО 150 Дни лакташм

Рисунок 4. Динамика экспрессии рекомбинантного ЭПО в молоко коз в течение пактации.

Введение генных конструкций в молочную железу коров. Введение клеток-«упаковщиц» осуществляли на 7-7,5 месяцах стельности в концентрации 60 млн. клеток на животное (по 30 млн. на долю вымени). В молочную железу трех коров №3600, №55 и №3168 была введена генная конструкция pLN-a, одной корове №3522 - конструкция pLN-G-CSF.

Как и у коз, наиболее эффективным оказалось введение в молочную железу генной конструкции pLN-a. При использовании данной конструкции максимальное содержание рекомбинантного ЭПО в молоке опытных коров достигало 400 нг/мл (коровы №55, №3168) и даже 1000 нг/мл - у первотелки №3600. По сравнению с секрецией секреторными клетками вымени ЭПО, рекомбинантный Г-КСФ экспресс«ровапся в молоко в меньших количествах и достигал максимального значения 150 нг/мл (корова №3522). Тенденция зависимости уровня экспрессии рекомбинантного продукта от используемой генной конструкции сохранялась и в отношении средних показателей

экспрессии. Средний уровень экспрессии рекомбинантного продукта с молоком опытных коров, также как и максимальный, был выше при использовании генной конструкции - от 88±36,9 до 193±79,4 нг/мл. Средняя концентрация рекомбинантного Г-КСФ в молоке была на 72-87% ниже уровня экспрессии рекомбинантного ЭПО и составила 25±3,5 нг/мл. Однако следует отметить, что в отличие от коз, экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе коров наблюдалась только первые три-четыре месяца лактации, в последующее дни ИФА не выявил наличия рекомбинантных белков молоке (рис. 5).

-о- 3600

•55

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Дни лактации

Рисунок 5. Динамика экспрессии рекомбинантного ЭПО в молоко коров в течение лактации.

введение генных конструкций в молочную железу свиноматок. Наряду с коровами и козами генные конструкции ЭПО и Г-КСФ человека были введены в молочную железу 4 свиноматок. Каждому животному было введено 60 млн. клеток (по 10 млн. клеток на долю вымени).

Как и в предыдущих опытах, содержание рекомбинантного ЭПО в мопоке опытных животных было значительно выше, чем рекомбинантного Г-КСФ. Если в первом случае концентрация рекомбинантного продукта в молоке достигала 350-400 нг/мл, то во втором данный показатель составил всего лишь 45-65 нг/мл.

Оценивая динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком свиноматок, следует отметить, что их содержание в молоке в различные периоды лактации варьировало. Практически у всех опытных животных независимо от введенной генной конструкции максимальная активность синтеза белка наблюдалась первые 2 недели лактации (рис. 6).

Данные об уровне экспрессии рекомбинзнтных белков (ЭПО и Г-КСФ) в молочной железе опытных животных суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Экспрессия рекомбинантных белков с молоком опытных животных

№ живот ного Рекомбинант-ный белок Стадия введения {месяц беременности) Кол-во введенных клеток, млн. Уровень экспрессии, нг/мл

М±т Макс

Козы

16 ЗПО [ 3 20 45±14,2 200

22 ЭПО ( 3 20 56±14,3 200

7 ЭПО 1 4 20 88*41,1 350

15 ЭПО 1 4,5 20 92±28,0 350

19 Г-КСФ | 4 20 29±6,5 100

20 Г-КСФ | 4 20 24±6,1 95

Коровы

3600 ЭПО 7 60 198±79,4 1000

55 3168 ЭПО 7,5 60 102±37,9 400

ЭПО 7 60 88±36,9 г 400

3522 Г-КСФ 7 60 25±8,5 150

Свиноматки

3267 ЭПО 3 60 137±32,4 350

641 " 6169" ЭПО 3 60 123±32,8 400 45

Г-КСФ 3 60 18±4,5

3566 Г-КСФ 3 60 20±4,9 65

3.1.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе опытных животных

С целью определения локализации рекомбинантного продукта в клетках молочной железы были выполнены иммуногжтокимические исследования ткани вымени пяти опытных коз на втором и четвертом месяцах лактации.

В отдельных срезах были выявлены небольшие участки трансформированных секреторных клеток, причем включения ЭПО встречались как в просвете альвеол, так и внутри эпителиального слоя.

Секреторные клетки, имеющие после иммуногистохимического о^ашивания характерную красную окраску, были выявлены у всех исследованных коз, как на втором, так и на четвертом месяцах лактации. Однако частота их встречаемости была низкой и варьировала у разных животных, хотя четкой прямой зависимости от стадии введения генных конструкций и уровня экспрессии ЭПО, установленного методом ИФА, выявлено не было.

3.1.4, Факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток молочной железы /л vivo.

Анализ экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных показал, что на уровень их синтеза оказывал влияние ргщ факторов, таких как 1} генная конструкция; 2)лериод лактации; 3) вид животного.

Генная конструкция. У всех опытных животных независимо от стадии введения генных конструкций концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке была значительно выию уровня экспрессии Г-КСФ. Средняя концентрация рекомбинантного Г-КСФ составляла всего 1543% от уровня экспрессии ЭПО. При этом максимальное содержание ЭПО в молоке достигало от 350 до 1000 нг/мл, в то время как рекомбинантный Г-КСФ экспрессировался в количестве 65-150 нг/мл.

Период лактации. В ходе лактации экспрессия рекомбинантных белков с молоком опытных животных была непостоянна и характеризовалась периодичностью: периоды активного синтеза рекомбинантного продукта чередовались с периодами спада его секреции. Наибольшее число ликов активного синтеза белка наблюдалось в первую треть лактации (табл. 3),

Таблица 3. Средние показатели уровня экспрессии рекомбинантных белков в

молоко опытных животных в течение лактации, нг/мл (М±т)

Вид Рекомбин. Период лактации

животного белок 1 треть 2 треть 3 треть

Коровы ЭПО 129±27 0 0

Г-КСФ 25±8,5 0 0

Свиньи ЭПО 183+48.3 150±12,5 31 ±9.5

Г-КСФ 30±6,8 15+3,8 6±0.9

Козы ЭПО 9?±19,3 68±18,2 12*3.7

Г-КСФ 41 ±4,3 26±3,1 6±2,1

Средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке в первую треть лактации была выше уровня экспрессии данного белка во вторую и последнюю треть лактации соответственно в 1,2-1,4 и 5,9-3 раз. Данная тенденция сохранялась и при введении генной конструкции pLN-G-CSF. Среднее содержание рекомбинантного Г-КСФ в молоке опытных животных в первую треть лактации достигало 25-41 нг/мл, что было на 37-86% выше уровня экспрессии рекомбинантного продукта во вторую и последнюю треть лактации.

Вид животного. Уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком такие варьировал в зависимости от вада животного. Исследования, проведенные на трех видах животных - коровах, козах и свиньях - показали, что наиболее результативным оказалось введение ретровирусных векторов в молочную железу свиноматок. Средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке данных животных (за лактацию) достигала 130±25,3 нг/мл, в то время как у коз и коров этот показатель составил, соответственно, 62±14,1 нг/мл и 43±9 нг/мл. Однако максимальная экспрессия ЭПО была выявлена у коров -1000 нг/мл.

При введении в молочную железу опытных животных генной конструкции рШ-6-CSF максимальный показатель среднего содержания рекомбинантного Г-КСФ в молоке был установлен у коз - 27±7,79 нг/мл, что было в 1,4 раза выше уровня экспрессии данного белка с молоком свиноматок и более чем в 3 раза с молоком коров. Максимальная экспрессия Г-КСФ, как и в случае ЭПО, была выявлена у коров - 150 нг/мл (рисунок 7).

I_______________

ЭПО

¿г #

Г-КСФ

Рисунок 7. Уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоко в зависимости от вида животных.

и

3.2 Трансформация клеток эмбрионов кур

Трансформацию эмбриональных клеток кур осуществляли с использованием следующих векторных систем: АМ12/рШ-а, AM12/pX-RSVbgti и pg13/pLN-a. Эксперименты проводились в двух направлениях - введение генных конструкций в эмбриональные клетки кур в культуре (in vitro) и трансформация эмбрионов кур на разных стадиях развития in vivo.

3.2.1. Трансфекция эмбриональных клеток кур/л vitro

Результаты транофекции эмбриональных клеток кур in vtiro представлены в таблице 4.

Конструкция Совместное ю упьтивирование

клетки-«упаковщицы» культуральная жид кость

частота генетич. трансформации ПЦР частота генетич. трансформации ПЦР

AM12/pLN-a З-10-з + 8-10-< +

pg13/pLN-a + 8-1 О* +

AM12/pX-RSVhgh 5-Ю-3 1-10-» +

Примечание: частота генетической трансформации - отношение числа полученных генетически трансформированных кпонов к общему числу инфицированных клеток,

Наиболее эффективной в переносе экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур оказалась векторная система AM12/pX-RSVhghf как при использовании клеток-«упаковщиц», так и культурапьной жидкости, содержащей рекомбинантный ретровирус (соответственно 5-1 СИ и 1-10-'), Трансформация клеток-мишеней векторными системами Atí12/pLN-a и pg13/pLN-a оказалась менее результативной. С использованием данных систем из 10000 инфицированных клеток было получено от 8 (8-10*) до 20-30 генетически трансформированных клонов {2-10-1 и 3-103),

Частота генетической трансформации варьировала также в зависимости от пакующей линии клеток и метода трансфекции. Наибольшее число генетически трансформированных клонов было получено при использовании пинии клеток-«упаковщиц» АШ2. 6 данном случае частота генетической трансформации была на 33% выше, чем при использовании пакующей линии рд13. Наиболее высокая эффективность трансформации клеток-мишеней отмечалась и в случае их совместного культивирования с клетками-вупакоещицами».

Таким образом, эффективность трансформации первичных клеток эмбриона курицы in vitro определялась используемой векторной системой, пакующей линией клеток и методом трансфекции. Более результативным оказалось введение в клетки-мишени ретровирусных векторов, помещенных в пакующую линию АМ12, причем большее число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-«упаковщицами».

3.2.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур /л vivo

Введение генных конструкций осуществляли на разных стадиях развития эмбриона кур. В качестве источника генных конструкций использовали клетки-«упаковщицы» и культуралъную жидкость, содержащую рекомбинантный ретровирус, 3.2.2.1 Трансформация клеток эмбрионов кур кулыпуральной жидкостью

Купьтуральмую жидкость вводили в зародышевый диск и эмбрионы кур в количестве 1-100 мкл. Были проведены следующие опыты.

Опыт №1. Введение культуральной жидкости осуществляли до начала инкубации яиц в количестве 100 мкл с помощью инсулинового шприца путем прокола скорлупы в тупом конце яйца. В опыте были использованы три ретровирусные векторные системы AM12/plM-a, pg13/pLN< и AM12/pX-RSVbgh.

Проведенные исследования показали, что наименьшее влияние на эмбриональное развитие кур оказала генная конструкция pg13/pLN-a. В данном случае из 50 проинъецированных яиц вылупилось 8 цыплят, при этом развитие эмбрионов наблюдалось в 72% случаев. При введении векторных систем AM12/pLN~a и АШ2/рХ-RSVhgh процент выпупа и процент развившихся эмбрионов составил соответственно 4%, 54% и 10%, 40%. Однако, если в первом случае частота интеграции рекомбинантной ДНК отставила только 7.4%, то б последнем -18,6%.

Необходимо отметить, что наличие чужеродной ДНК отмечалось в основном у погибших в процессе инкубации эмбрионов. Среди выпутавшихся цыплят рекомбинантная вставка была выявлена только в одном случае - у петуха №3976 (вводили векторную конструкцию AM12/pLN-a). У данной птицы наличие рекомбинантной ДНК было установлено в клетках крови, печени, сердце и кишечнике.

Наряду с ПЦР-анапизом были выполнены цитогенетические исследования клеток крови данного петуха. Учитывая то, что в кариотипе кур идентификация большинства микрохромосом в силу их малых размеров и вариабельности числа невозможна, изучение влияние экзогенных конструкций на состояние генома проводили на уровне макрохромосом и половых хромосом. Проведенный цитогенетмческий анализ не выявил структурных нарушений в системе исследованных макрохромосом.

Опыт №2. Введение культурапьной жидкости осуществляли на разных стадиях развития куриного эмбриона: до начала инкубации в зародышевый диск, на первый и второй дни инкубации в эмбрион и на третий день - в кровь. В каждом случае было проиньецировано по 21 яйцу. Вирусный препарат в количестве 1 мкл вводили в эмбрионы кур через окно, вырезанное в экваториальной области (при введении генной конструкции до начала инкубации) или в тупом конце яйца. В опыте была использованная конструкция pX-RSVhgh.

Как и s опыте №1, процент еылула в опытных группах был значительно ниже, чем в контрольной и варьировал в зависимости от стадии введения генной конструкции. Наибольшее число цыплят было получено при введении культурапьной жидкости на второй день инкубации. В данном случае из 21 проиньецированного яйца вылупилось 4 цыпленка. При введении генной конструкции на первый и третий дни инкубации было получено всего по 2 цыпленка.

ПЦР-аналиэ погибших в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал, что более эффективным с точки зрения трансформации клеток-мишеней

оказалось введение вирусного препарата на первый и третий (в кровь) дни инкубации. Положительные сит алы были выявлены у двух эмбрионов из шести развившихся в первом случае и из пяш - во втором.

Вылупившихся цыплят и взрослую птицу исследовали прижизненно путем анализа ДНК, выделенной из ткани гребешка, крови и спермы. При этом из восьми исследованных кур рекомбинантная ДНК не была выявлена ни в одном случае.

Данные о введении культурзльной жидкости в эмбрионы кур ю то суммированы в таблице 5.

3.2.2.2 Трансформация клеток эмбрионов кур суспензией клеток-<упаковщиц»

Клетки-вулаковщицы» вводили в зародышевый диск и эмбрионы кур в концентрации 10 тыс. клеток. В экспериментах была использована векторная система

Опыт №1, Суспензию кпеток-«упаковщиц» вводили до начала инкубации с помощью инсулинового шприца путем прокола скорлупы с тупого конца яйца. Конечный объем суспензии 50 мкл.

Из 40 проиньецированных яиц было получено 5 цыплят, что составило 15% от вывода молодняка е контрольной группе. По сравнению с контрольной группой в опыте также отмечалась высокая эмбриональная смертность. Если в контрольной группе развитие эмбрионов наблюдалось в 93% случаев, то в опыте данный показатель составил только 40%.

Анализ на трансгенность погибших в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал наличие рекомбинантной ДНК только в одном случае. Положительные сигналы были выявлены у эмбриона, погибшего на 17 день инкубации, в кишечнике и сердце.

Опыт №2. Введение клеток-«упаковщиц» осуществляли в зародышевый диск и эмбрионы кур на разных стадиях развития: до инкубации, на первый, второй и третий (в кровь) дни инкубации. В каждом случае было проинъецировано по 21 яйцу. Раствор генных конструкций вводили через окно в скорлупе, вырезанное в экваториальной области или в тупом конце яйца. Конечный объем суспензии 1 мкл.

Вылуп цыплят наблюдался при введении генной конструкции на первый, второй и третий дни инкубации, при этом выводимость составила соответственно 19%, 29% и 24%. ПЦР-анализ погибших в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал наличие генной конструкции у пяти из 40 исследованных эмбрионов. Наибольший процент трансгенных эмбрионов наблюдался при введении генной конструкции на первый и третий дни инкубации.

Вылупившихся цыплят и взрослую птицу исследовали прижизненно путем анализа ДНК, выделенной из ткани гребешка, крови и спермы. При этом из 15 исследованных кур рекомбинантная ДНК была выявлена в одном случае - у курицы №4203. Наличие генной конструкции было установлено е крови и диагностиро валось в течение одного месяца. ПЦР-аналиэ внутренних органов показал наличие рекомбинантной вставки в сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке.

Данные о введении клеток-«упаковщиц» в эмбрионы кур суммированы в табл. 6.

Таблица 5. Введение культуральной жидкости в эмбрионы кур ¡п ш>

Показатель Опыт №1 Опыт N(2

1гр. Игр. III гр. Контр 1гр. Игр. III Гр. IV гр. Контр

Пакующая линия клеток/ генная конструкция АМ12/ р^-а Р913/ р1Н-а АМ12/рХ- - АМ12/рХ-(№11д11 -

Заложено яиц, шт 50 50 40 40 21 21 21 21 21

Введено вирусного препарата: объем, мкп / тмтр, КОЕ/мл 100/105 100/10' 100/105 - 1/107 1/10т 1/107 1/107 -

Стадия введения генной конструкции до инкубации - ДО инкуб на 1 д.и, на 2 д.и. нэЗди. (в кровь) -

Число развившихся эмбрионов, шт: всега'в т.ч. транегенкых 27/2 36/1 16/3 37 4/0 6й 3/1 5/2 19

Процент развившихся эмбрионов, % 54 72 40 94 19 29 62 24 90

Вылупилось цыплят, шт: всего/ в т.ч. трансгенных 2П 6«) 4./0 38- £Ш 210 4Ю Ш 1&-

Процент еыпупа, % 4 16 10 © 0 10 19 10 78

Частота интеграции*, % 7,4 2,6 16,6 - 0 33,0 7,6 40,0 -

Общая эффективность трансгенеза" % 4,0 2,0 7,5 0 9,5 4,8 9.5

Эффективность получения трансгенных кур***, % 2,0 0 0 0 0 0 0 •

Примечание: ям. - дань инкубации; * - отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %; ** - отиошеше числа полученных траисгегтш цыплят к эмбрионов, к числу нроинъециррвапных яки, выраженное в %; *** * отношение числа вылупившихся тралегеннш цыплят к числу проиньеиированных яиц, выраженное в %.

Таблица 6. Введение клеток-«упаковщиц» в эмбрионы кур ¡fí vivo

Показатель Опыт №1 Опыт №2

Опыт Контр 1гр„ | Игр.. III гр. (Уф. Контр

Пакующая линия клеток/ генная конструкция АМ12/рХ-RSVhgh _ АМШ pX-RSVhjjh .

Заложено яиц, шт 40 40 21 21 21 21 21

Введено вирусного препарата: объем, мкп 1 титр, КОЕ/мл 10/60 _ 10/1 т оп ЮЛ

Стадия введения генной конструкции до инкубации - ДО инкубации на 1 д.и. на2д.и. на 3 дм. (в кровь) -

Число развившихся эмбрионов, шт; всего/в т.ч. трзнсгенных 13/1 37/- 4/0 8/1 т 10/3 18

Процент развившихся эмбрионов, % 40 93 0 38 96 48 90

Вылупилось цыплят, шт: всего/в т.ч. трансгенных 5/0 32/- 0/0 4/0 6/0 5/1 16

Процент еылупа, % 12 81 0 19 29 24 75

Частота интеграции", % 7,6 - 0 12.5 6,2 30 -

Общая эффективность трансгенеэа", % 2,5 * 0 4,8 4 » 14,3 ,

Эффективность получения трзнсгенных кур***, % 0 • 0 0 0 4.8 -

Примечание: д.и. - день инкубация; * - отношение числа полученных трансгепных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %: ** - отношение числа полученных траясгсннш цыплят И эмбрионов, к числу проииъешрованньн яни, выраженное в %; *** - отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу прошгьеинрованпых яиц, выраженное в%.

3.2.3. Влияние различных факторов на эффективность трансформации клеток эмбрионов кур

Анализ полученных данных выявил влияние ряда факторов на эффективность трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами, таких как используемые генная конструкция и пакующая линия клеток, стадия и метод введения генной конструкции.

Генная конструкция и пакующая пиния клеток.

Эксперименты по трансформации клеток эмбрионов кур тремя векторными системами показали, что более эффективными в переносе экзогенной ДНК в клетки-мишени оказались генные конструкции, помещенные в пакующую пинию АМ12. В данном случае частота интеграции составила 7,4% при введении генной конструкции pLN-a и 18,8% - при введении pX-RSVhgh. Наличие рекомбинантной ДНК при использовании линии рд13 было установлено только в 2,8% случаев.

Если сравнивать эффективность трансформации клеток-мишеней двумя генными конструкциями pLU-a и pX-RSVhgh, помещенными в одну и ту же пакующую линию АМ12, то следует отметить, что в последнем случае эффективность была выше, как в культуре in vitro при инфицировании первичной культуры клеток эмбриона курицы, так при введении генных конструкций in vivo.

Стадия введения. Наиболее высокая эффективность трансформации клеток-мишеней была установлена при введении генных конструкций на третий день инкубации, В данном случае частота интеграции рекомбинантной ДНК составила 3040% в зависимости от используемого типа вирусного препарата (кпеток-«упаковщиц» или купьтуральной жидкосга). При введении ретровирусных векторов на второй день инкубации этот показатепь был ниже в 1,3-2,5 раза и более чем в 5 раз - при введении на второй день. Именно при введении генных конструкций в кровь на третий день инкубации была получена курица №4208, несущая рекомбшантную ДНК в клетках крови, сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке.

Метод введения генных конструкций. Как отмечалось выше, в своих исследованиях мы использовали 2 метода введения генных конструкций в эмбриональные клетки кур: с помощью инсулинового шцрица путем прокола скорлупы в предполагаемое место расположения зародышевого диска и через окно ФИО мм, вырезанное в скорлупе, непосредственно в зародышевый диет, эмбрион или кровь. Сравнительный анализ полученных данных показал, что в последнем случае общая эффективность трансгенеза была в ряде случаев выше и составила 4,8-14,3% в зависимости от используемого типа препарата. При введении генных конструкций до инкубации путем прокола скорлупы рекомбинангтная ДНК была выявлена в 2-7,5% случаев.

Таким образом, максимальная эффективность трансформации эмбриональных клеток кур была достигнута при использовании генных конструкций, упакованных линией АМ12, в частности. pX-RSVhgh. При этом более эффективным с точки зрения трансформации клеток-мишеней оказалось введение генных конструкций в кровь на третий день инкубации.

3.3 Сравнительный анализ эффективности использования пакующих линий клеток АМ12 и рд13 для трансформации клеток-мишеней in viíro и ¡n vivo

Анализ эффективности трансформации клеток молочной железы животных и эмбрионов кур двумя разными пакующими линиями клеток АШ2 и рд13, выявил существенные различия в способности данных пакующих линий инфицировать клетки-мишени, как in vitro, так и in vivo.

Эффективность трансфоризции клеток-мишеней in vitro независимо от их видового происхождения (первичные клетки молочной железы коровы, козы, свиноматки и первичная культура эмбриона курицы) и используемой генной конструкции была выше при использовании пакующей линии АМ12. 6 данном случае частота генетической трансформации составила от 8-104 до ЕИО"5, что было в 1,5-2,2 раза выше, чем при использовании линии pgí3. Следует отметить, что эффективность трансформации первичной культуры клеток эмбриона курицы по сравнению с другими клетками-мишенями была в 2-10 раз выше. Это, по всей видимости, связано с тем, что эмбриональные клетки по сравнению с соматическими характеризуются более высокой пролиферативной активностью.

Эффективность трансформации клеток-мишеней in vivo также была выше при использовании пакующей линии AMÍ2. В частности, при введении в эмбрионы кур генных конструкций, помещенных в данную пакующую линию, общая эффективность трансгенеза составила от 4,0 до 14,3%, в то время как при использовании линии рд13 данный показатель составил 2%. Данная тенденция отмечалась и при введении генных конструкций в молочную железу коров, коз и свиноматок.

Таким обрззом, суммируя все вышеизложенное, можно заключить, что наиболее высокая эффективность трансформации клеток-мишеней ретровирусными векторами, как in vitro, так и ¿o wVo наблюдалась при использовании пакующей линии АМ12,

4. ВЫВОДЫ

1. Посредством использования ретровирусных векторов осуществлена трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro с частотой интеграции рекомбинантной ДНК от JMCH до 5*10Л Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации клеток-мишеней.

2. С использованием линии pgí3, упаковывающей ретровирусные векторы, получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки с максимальной экспрессией в молочной железе рекомбинантного ЗЛО 350-1000 нг/мл и Г-КСФ - 65-150 нг/мл. Выявлены периодичность синтеза рекомбинантного продукта в молоко в течение лактации и зависимость уровня его экспрессии от периода лактации, используемой генной конструкции и вида животного. Экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе коз и свиноматок установлена в течение всей лактации, у коров - только первые три месяца лактации.

3. Отработан метод получения траксгенных кур посредством введения генных конструкций в зародышевый диск до начала инкубации и в дорсальную аорту эмбрионов на третий день развития. С использованием данного метода получены трансгенные петух №3976 и курица №4208,

4. При введении ретроеирусных векторов в эмбрионы кур in то рекомбинантная ДНК интегрировалась в клетки-мишени с частотой от 2,8 до 40%.

5. Выявлено влияние пакующей линией клеток, типа вирусного препарата, метода и стадии введения генных конструкций на эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo. Наиболее высокая эффективность трансгенеза установлена при введении ретроеирусных векторов, упакованных в пакующую линию АМ12, в виде суспензии клеток-супаковщиц» на третий день инкубации в кровь - 14,3%.

6. При сравнительном анализе двух типов клеток-«упаковщиц® АМ12 и pgí3 в переносе экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo более высокая эффективность трансформации клеток-мишеней установлена в случае использования линии АШ2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для получения соматических транстенных животых и трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов рекомендуем в качестве пакующей линии клеток использовать линию AMI2.

Для получения трансгенных кур с использованием ретроеирусных векторов рекомендуем осуществлять введение генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на третий день инкубации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волкова H.A., Волкова RA.. Локальная инфекция молочной железы как альтернатива получения сельскохозяйственных животных - продуцентов рекомбадантных белков II Достижения науки и техники АПК. №10.2003, е.1М4,

Z Волкова Л А. Оценка двух толов клеток-упаковщиц АМ12 и рд13 в переносе экзогенной ДНК в первичные клетки моленной железы сельскохозяйственных животных in vitro II Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», виж, Дубровицы, 200Î, С. 90-92.

3. Кленоеицкий ЛМ, Волкова ЛА, Волкова НА Получение хромосомных препаратов домашней курицы II Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ. Дуброеицы, 2003, C.47-S2.

4. Волкова ЛА, Волкова НА, Змюеьева НА Эрнст П К. Успехи соматического переноса генов в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных ht vitro и in vira И Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее эоотехничесмй науки», ВИЖ, Дубровин, 2004, с.215-220.

5. Волкова ПА., Ларионова П.9., Кпеновицкий ГШ., Волкова НА., Зиновьева НА Методическое вопросы цигогенетики птицы. Дубров щы, 2004,21с.

6. Волкова НА. Зиновьева НА Волкова ЛА, Эрнст Л.К.. Мегорунеские рекомендации по использованию ретроеирусных секторов для доставки ДНК в клетки сельскохозяйственных животных m vitra и in vwo. Дуброеицы, 2004,52с.

7. Волкова НА, Волкова ЛА., Зиновьева НА, Эрнст ПК.. Некоторые аспекты генетической трансформации эмбриомагьных клеток кур in vitro и in viva II Материалы трепней международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВМИИСБ, 2004, с. 124-127.

8. Волкова НА, Волкова ПА., Эрнст Л.К., Зиновьева H.A.. Опосредовать ретроыфусами перенос генов как перспективный метоп создания трансгенных кур И Материалы третьего московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005, с338.

9. Волкова НА, Волкова ПА., Эрнст Л.К., Зиновьева H.A. Перспективные технологии создания транстенных сельскохозяйственных животных П Материалы третьего московского международного конкресса »Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва. 2005, С.2А7.

Издательство руц ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, л. Дубровины Тел. (8 - 27) 65-14-14, (в - 27) 65-14-07

Сдано s набор IS.04.2005. Подписано в печать 18 04.2003 _Захаз № 9. Печ л. 1,1 Тираж 100 зкз.