Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИИ КЛЕТОК, УПАКОВЫВАЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЕ РЕТРОВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, В ПЕРЕНОСЕ ЭКЗО­ ГЕННОЙ ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИИ КЛЕТОК, УПАКОВЫВАЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЕ РЕТРОВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, В ПЕРЕНОСЕ ЭКЗО­ ГЕННОЙ ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ"

я-зто

На правах рукописи

АБДРАХМАНОВ ИГОРЬ КАМИЛЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ КЛЕТОК, УПАКОВЫВАЮЩИХ РЕКОМ-БИНАНТНЫЕ РЕТРО ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, В ПЕРЕНОСЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.23. - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровины, 2001

Работа выполнена в лаборатории клеточкой инженерии отдела биотехнологии В се росс и й с к ого государство I г п ого научно-иселедоначсльскога института

живогноводстпа

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор биологических наук

ИЛ. Савинкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор Л.П. Дьяконов; кандидат биологических, наук В.А. Багнров

Ведущее учреждение - Московская государствен нал академия ветеринарной

медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится « 2001 года в 10 часов на

заседании диссертационного совета Д 006.013.01. во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

А д р е с и и с т и т у т а: "'.'■■'■' Московская обл., Подольский р-н.

, п. ДуброШЩЫ.

С диссертацией можно ознакомиться в б-; .. '*:;>>•"! V л»

Автореферат разослан «_

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Реконструирование генома сельскохозяйственных животных является биотехнологическим приемом, от разработки которого зависит интенсивность развития животноводства на сопремеином этапе. Работы по реконструированию организма ведутся в различных направлениях, одним из которых служит получение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в геноме [Эрнст Л.К., 1998]. Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и признаков продуктивности домашних животных. Они также представляют коммерческий интерес в качестве источников ценнейших фармакологических (эритропоотни, интерферон, альбумин, факторы свертывания крови н др.) и технических (химозин) белков. Важным является создание животных, у которых а результате проведения геномных манипуляций организм приобретает устойчивость к инфекциям. D этой связи успешным считается применение рекомбинантных конструкций, содержащих антисмысловые РНК вирусных генов.

В настоящее время при создании генетически модифицированных животных большое значение приобретает способ доставки рекомбикактных конструкций в организм. Поэтому во всем мире ведутся интенсивные исследования, направленные на разработку новых, эффективных методов переноса. Особую актуальность на сегодняшний день представляют исследования, проводимые на основе клеточной инженерии, которые предполагают использование линий клеток, упаковывающих рекомбинапшые ретро вирусные векторы.

Применение ретро вирусов в качестве векторных молекул за последние годы обрело статус наиболее перспективного и универсального метода введения и экспрессии клонированных генов в эукарнотических клетках [Markowitz D., Goff S., 1988]. Это обусловлено несколькими причинами, одной из которых является высокая эффективность инфицирования клеток-мишеней. В сочетании с клетками, упаковывающими рекомбинантный ретровирус, можно получить в культуре почти 100%-ное заражение клеток-мишеней [Anthony М.С. Brown, 1989]. Кроме того, ретровирусные векторы позволяют вводить экзогенную ДНК в клетки зародышевого пути посредством предымплантационного инфицирования эмбрионов или с пермато генных клеток тесгикул, что может рассматриваться, как перспективный материал для геномных манипуляций у животных. Однако перед введением в организм животных существует необходимость тестирования ре комби нантного вектора в культуре клеток млекопитающих. Необходимо отметить, что многие вопросы, касающиеся тропности ретровнрусных векторов к клеткам млекопитающих, их интеграции и экспрессии, остаются неисследованными. Решению части ю выше изложенных вопросов посвящена настоящая работа.

Цель н задачи исследований. Целью работы является характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, имеющие различное видовое и тканевое происхождение_____________,.,„. ^

Для реализации указанной й'ели был и поставлены следующие задачи:

5 НАУЧ", ; L-'ui.'VOT'Ei-ii. 1

| ftvi-е.»1 ,

liiiäSiei

• изучить и охарактеризовать морфофизиологические особенности линий клеток, упаковывающих рекомби нантные ретровирусные векторы;

• ввести экзогенную ДНК в геном клеток-мини ней in vitro посредством:

1) инфицирования с помощью вирусных препаратов;

2) инфицирования путем совместного культивирования с клетками-«упаковщицами»;

• изучить потенции линий клеток-«упаковщиц» в переносе экзогенной ДНК в клетки-мишени, имеющие различную видовую и тканевую принадлежность;

• провести сравнительный анализ эффективности использования линий клеток-ч<упаковщиц» рекомбинантных векторов для получения стабильных генетически трансформированных клонов клеток млекопитающих;

• разработать новый метод получения трапегенных животных, основанный на использовании линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретро-вирусные векторы.

Научная новизна. Впервые в культуре клеток сельскохозяйственных животных (свиньи и крупного рогатого скота) протестированы и охарактеризованы 4 рекомбинантных ретровирусных вектора: pLU, pLR, pLNa и pLNCX2, продуцируемые двумя линиями упаковывающих клеток: АМ12 и РТ67.

Впервые продемонстрировано, что сконструированные рекомби нантные гены (эритропоэтин и интерферон человека, антисмысловая РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота), входящие в состав ретровирусных векторов, способны экспрессыроваться в культуре генетически трансформированных клеток сельскохозяйственных животных (свиньи и крупного рогатого скота).

Практическая ценность работы. Показала необходимость тестирования линий клеток, упаковывающих ре комби нантные ретровирусные векторы, в культуре клеток сельскохозяйственных животных перед введением их в организм.

Разработан способ получения «фе ноги гшческих» трансгенных животных, основанный на введении клеток-упаковщиц» рекомбинантных ретровирусных векторов в семенники быков.

Основные положения, выносимые на защиту:

- зависимость эффективности использования рекомбинантных ретровирусных векторов в переносе экзогенной ДНК от видовой и тканевой принадлежности клеток-мишеней;

- зависимость частоты генетической трансформации клеток-мишеней с помощью рекомбинантных ретровирусных векторов от метода трансфекцин;

- влияние способа введения в семенники быков клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, на получение генетически трансформированных сперматозоидов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п. Быково, июнь 2000г.; на 49-ой научно-методической конференции «Достижения молодых ученых в области животноводства», ВНИИЖ, п. Дубровины, июль 2000г.;

на научной конференции «Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных», ВНИИРГЖ, г. Санкт-Петербург, октябрь 2000г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научных работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 10.1 стр., содержит I схему, 11 табл., 15 рис. (в т.ч. 8 фотографий, 2 диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 169 библиографических источников, в т.ч. 123 на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВНИИ животноводства. На рисунке 1 представлена комплексная схема проведения эксперимента.

Для изучения тропности ретровирусных векторов in vitro были использованы 4 перевиваемые линии клеток млекопитающих и первичные клетки семенников свиней: FBT - клетки трахеи эмбриона коровы; СПЭВ - клетки почки эмбриона свиньи; Vero - клетки почки зеленой африканской мартышки; STO -фибробласты эмбрионов мышей; CI1 - первичные клетки семенников свиней.

Линии клеток были взяты из коллекции клеточных культур лаборатории клеточной инженерии ВИЖз.

В настоящей работе были использованы две линии клеток, упаковывающих рекомбинацтные ретровирусные векторы: АМ12 - любезно предоставлена к.б.н. Фоминым И.К. (Белорусский НИИ переливания крови г. Минск); РТ67 -любезно предоставлена к.б.н. Маркеловым МЛ. (НИИ бкоорганической химии, г. Москва). Первая линия АМ12 упаковывает 3 рскомбинантных ретровирусных вектора. Вектор pLU создан на основе ретровируса лейкоза мышей, содержит НП антисмысловой РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) под собственным промотором (LTR). В составе рскомбинантного ретровирусного вектора имеются последовательности бактериального гена то, что позволяет отобрать стабильно трансформированные клоны клеток на селективной среде, содержащей генетицин. Вектор pLR - также создан на основе ретровируса лейкоза мышей, содержит HI1 антисмысловой РНК BLV под собственным промотором (LTR) и последовательности бактериального гена neo, Вектор pLNa -создай на основе рекомбинантного ретровируса, в его состав входят НП гена эритропоотина человека, поставленные под контроль a-казси нового промотора, который способствует тканеспсцифичной экспрессии данного гена в клетках молочной железы. Вторая линия РТ67 упаковывает рскомбинантный ретрови-русный вектор pLNCX2 (фирма «Clontech»), содержащий геномный ген р' интерферона человека, поставленный под контроль тканеспецифичного р- дак-тоглобулинового промотора.

Для исследования морфологических особенностей клеток-«упаковщиц» их выращивали на покровных стеклах, фиксировали и окрашивали по методу Романовского- Ги мза.

Рис. 1. Схема эксперимента

Отбор трансформированных клонов клеток с геном | пео на селективной срсдс 1

т

Генетический а на- В лиз трансформиро- I ванных клеток | Молекулярный анализ наличия рекомбннантной ДНК в трансформированных клетках (ПЦР-аналнз)

Через 10,20,25,30,40,45 суток и 2,2,5,3,3,5,4,5, 6 месяцев

т

т

т

Молекулярный анализ наличия НП рскомби-нантяон ДНК в сперме быков (ПЦР-анализ)

■-■.Ж}-"?.

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного н зарубежного производства. Культивирование клеток-мишеней STO и СП, а также клеток-«упаковщиц» проводили в жидкой среде DMEM (ПанЭко, Россия), дополненной 10% сыворотки плода коровы (FCS) (Serva, Germany), гентамнцнном (конечная концентрация 50 мкг/мл) (ПанЭко) и альфа-глутамином (2 шМ) (Sigma, США). Основной средой для культивирования клеток СПЭВ, FBT и Vero служила жвдкая среда DMEM, дополненная 5% сыворотки крови крупного рогатого скота со всеми указанными выше добавками. Культивирование клеток осуществляли в инкубаторе, обеспечивающем 95%-ную относительную влажность воздуха, температуру +37°С и содержание 5% СОг в воздухе (Sanyo, Япония).

Персеев клеток, определение их концентрации и жизнеспособности, а также криоконсервировацие и хранение проводили по стандартным методикам (Адаме Р., 1983; Дьяконов Л.П., 2000]. Для замораживания клеточных линий в качестве криопротектора использовали глицерин фирмы «Merck» и диметил-судьфоксид (ДМСО) фирмы «Serva».

Селективные среды получали растворением соответствующего количества 100х-ного(40 мг/мл) раствора антибиотика G 418 (Sigma) в ростовой среде.

В опытах по трансфекции использовали 100х-ный раствор полибрена (Sigma) (конечная концентрация 8 мкг/мл). Для подавления митоза клеток-мишеней использовали среду DMEM, дополненную 10% FCS и митомицином С (конечная концентрация 30 мкг/мл) (Sigma).

Получение вирусных препаратов осуществляли простым сбором культу-ральной среды. После формирования монослоя на 80-90% клетки-«упаковщицы» помещали в минимальное количество свежей среды, и инкубировали еще 24 часа, после чего среду собирали. Флотирующие клетки и клеточные обломки удаляли центрифугированием при 3000g в течение 5 минут. Хранение ретровирусных препаратов осуществляли замораживанием при -70°С в среде, содержащей 10%FCS.

При введении экзогенной ДНК в клетки-мищени с помощью ретровирусных векторов использовали два методических подхода. Первый заключался в трансфекции клеток-мишеней с помощью вирусных препаратов. Второй - в трансфекции клеток-мишеней путем совместного их культивирования с клетками, упаковывающими рекомбннантный ретровирус. Трансфекцию осуществляли по стандартной методике [Гловер Д., 1989] с небольшими модификациями.

Для осуществления генетической трансформации клеток млекопитающих было проведено по три серии экспериментов с каждой линией клеток, упаковывающих рекомбннантный регровирусный вектор. По окончании этапа селекции все полученные генетически трансформированные клоны клеток-мишеней были подсчитаны для определения среднего значения частоты генетической трансформации, а затем переданы в лабораторию молекулярного н цитологического анализа отдела биотехнологии ВИЖа для анализа наличия ДНК рекомби-нантных ретровирусов. Частота генетической трансформации определялась от-

ношением числа образовавшихся трансформантов в процессе селекции к общему количеству клеток, взятых для селекции.

Введение ретровирусных векторов в организм животных осуществляли на базе ОПХ «Дубровицы». Все экспериментальные линии, упаковывающие ре комби нантный ретровнрус, вводили в семенники быков в количестве 13 голов. Для этого митоз клеток—((упаковщиц» блокировали митомицииом С (10 мкг/мл) в течение 2-4 часов. Затем готовили суспензию клеток в физиологическом растворе с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) в присутствии полн-брена (8 мкг/мл). Клетки в количестве 3,5-20 млн были инъецированы глубоко в паренхиму семенников быков (5 инъекций на семенник). На 10,20,25,30 и 45-е сутки, а также через 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5 И б месяцев после инъекции были взяты экспериментальные образцы спермы для анализа наличия НП рекомбинант-1юй ДНК на молекулярном уровне (ГЩР).

Результаты экспериментов документированы фотографиями.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика морфофнзн О логических особенностей линий клеток, упаковывающих рекомбннантный ретровнрус.

В ходе проведения экспериментов мы пришли к выводу, что для культивирования клеток-упаковщиц» важны такие параметры, как ростовая среда ОМЕМ с 10%-ным содержанием сыворотки плода коровы, Ь-глутамииом (2 мМ) и гентамицином (конечная концентрация 50 мкг/мл). Кроме того, культивирование клеток требует наличия таких инкубационных факторов, как присутствие 5% СОг в атмосфере инкубатора при 95%-ной относительной влажности воздуха и температуре +37° С.

Кратность пересева для обеих линий упаковывающих клеток бьиа определена экспериментально. С этой целью, клеточную суспензию пересевали в культуральные матрасы в соотношениях 1:3, 1:5, 1:10, 1:20. При этом полного монослоя клетки достигали в различные сроки (табл. 1).

Таблица 1

Зависимость образования монослоя кяеткамн-«ушковщщами» от крат-

иости пересева.

Кратность псрссева Срок образования монослоя, сут.

АМ12 РТ67

1:3 3 1

1:5 5-6 3

1:10 8-10 5-6

1:20 14 8-10

Таким образом, мы установили оптимальную кратность пересева, которая составила 1:5 для линии АМ12 и 1:10 для линии РТ67. При этом полного монослоя клетки достигали на 5-6-е сутки культивирования. Наличие в клетках-«упаковщииах» рекомбинаптных последовательностей структурных генов под-тгерждалось при каждом пассаже (ПЦР).

На основании результатов культивирования и микроскопического анализа клеток было отмечено, что две клеточные линии различались между собой по

морфологии и, вероятно, имеют разное происхождение. Клетки линии AMí2no морфологии очень похожи на перевиваемые фибробласты линни N111 ЗТЗ, т.е. с четко выраженными особенностями фибробластов, в то время как клетки линии РТ67 имели наряду с признаками фибробластов некоторые характеристики эпителиоподобных клеток. Кроме того, следует отметить, что для клеток линни АМ12 была характерна высокая склонность к образованию фокусов.

С целью создания банка клеток с одинаковыми морфофизишгогическими характеристиками, клетки были наращены в большом количестве и заморожены. Сравнительная оценка влияния криопротекторов на жизнеспособность клеток, проведенная с помощью 0,5%-ного раствора трипанового синего, показала, что ДМ СО является наиболее предпочтительным защитным агентом в отличие от глицерина. Жизнеспособность клеток поме оттаивания составляет 90% и 95%, соответственно для линии АМ12 и РТ67.

3.2. Тестирование рекомбннантных ретро вирусных векторов в культуре клеток млекопитающих.

3.2,1, Характеристика линии клеток АМ 12, упаковывающих рекомби-пантный ретроеирусним вектор pLNa, в переносе экзогенной ДНК в клетки-мишени.

Анализ результатов, представленных в таблице 2, показал, что ретрови-русный вектор pLNa оказался наиболее эффективным в переносе экзогенной ДНК в геном клеток-мишеней линии STO и менее эффективным для клеток СПЭВ. Этот факт подтверждают следующие показатели частоты генетической трансформации: при совместном культивировании с клетками-«упаковщицами» максимальная величина составила 4 генетически трансформированных клоча клеток на 1 тыс. использованных в опыте клеток STO, минимальное значение -3 клона на 1 млн использованных в опыте клеток СПЭВ. Для клеток FBT и СП показатели частоты генетической трансформации были одинаковыми и составили 2 клона на 1 тыс. клеток. Среднее значение для клеток Vero составило 8 клонов на 10 тыс. клеток. При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом максимальная величина частоты генетической трансформации составила 1 клон на 1 тыс. клеток для линии FBT, минимальная - 1 клон на 1млн. клеток для линии СПЭВ. Для клеток STO, Vero и СП показатели составили 4, 3 я 8 клонов на 1 млн. использованных клеток, соответственно,

Таблица 2

Показатели частоты генетической трансформации клеток-мишеней линией клеток-чупако&цщ» AM12/pLNa.

Клетки - мишени Частота генетической трансформации

Линия AM12/pLNa (клетки) Линия AM12/pLNa (вирусный препарат)

СПЭВ 0,3-10'7 0,1-10'

FBT 2-10* M0'J

STO 4-10"3 0,4-10"'

Vero g-io"1 0,3-10-'

СП 2-10"' 0,8-10"7

Все генетически трансформированные клоны клеток-мишеней, полученные в результате каждой серии эксперимента, в т.ч. минимальное их количество (2-8 клонов на чашку), были собраны для исследования на присутствие НП рскомбинантной ДНК.

Таблица 3

Молекулярный анализ наличия НП гена эритропоэтша человека в клет-

ках-мишенях

Клетки - Линия AM12/pLNa

мишени Клетки-«уп аковши ц ы» Культуральная среда

СПЭВ - -

FBT + +

STO + -

Vero + -

СП + -

Как свидетельствуют данные таблицы 3, при совместном культивировании с клетками-«упаковщипами» НП гена эритропоэтнна были выявлены во всех линиях клеток-мишеней, кроме линии СПЭВ. На рисунке 2 продемонстрированы результаты ПЦР-анализа клонов клеток-ми шснсй, генетически трансформированных линией AM12/pLNa. Положительный сигнал отмечен на дорожках: 2 (STO с клеткам и-«упаковщицам и»), 5 (Vero с клетками-упаковщицами»), 7 (СП с оетками-«упаковщнцами») и II (контроль - клетки pLNa, Ш-пассаж).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

I CirjU* pLNu (клсхкк-вупахоащнкь!») I. STO+ рШа (метки-«улаювшицы»)

3. СПЭВ+рШа (культуральная жидкость)

4. STCH pl.No (кудьтуральнзд жидкость) Vera + .Na (клеткн-^супаковпощьго) Vcn+ pLNa (купьтуралысая жедкость)

7, СП+ pLNo («яеши-вупакоишщи») СП+ pLNo (кулыуральнш щндаоегь)

П1 пассаж

Рис, 2. Результаты ПЦР-аиализа клеток-мишеней, трансформирован-пых линией AM]2/pLNa

Необходимо отметить, что при использовании для трансформации кле-ток-мншеней вирусного препарата наличие рекомбинантной вставки ПЦР-анализом было выявлено только в клетках FBT.

3.2.2. Характеристика линии клеток AMI 2, упаковывающих рекомби-¡тнтный ретровирусный вектор pLR, <s переносе экзогенной ДНК в клетки-■шшени.

При использовании линии упаковывающих клеток AM12/pLR для генетической трансформации клеток-ми теней результаты были следующими: при совместном культивировании с клетками-«упаковщицами» максимальная величина составила 4 генетически трансформированных клона клеток на 1тыс. использованных в опыте клеток для двух линий STO и СПЭВ. Минимальное значение - 3 клона на 1 млн. использованпых в опыте клеток FBT. Для клеток Vero и СП показатели частоты генетической трансформации не были получены (табл. 4). Таким образом, согласно нашим данным, ретровирусный вектор pLR был наиболее эффективным в переносе рекомбинантной ДНК в клетки STO и СПЭВ и наименее результативным для клеток FBT.

При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом, полученным от линии упаковывающих клеток AM12/pLR, максимальная величина составила 2 клона на 1 тыс. клеток у линии STO, минимальная-2 клона на Ылн. клеток у линии СПЭВ. Для клеток FBT, Vero и СИ показатели частоты генетической трансформации не были определены.

Таблица 4

Показатели частоты генетической трансформации клеток-мишеней

линией клеток-чупакощиц» AMi2/pLR

Клетки - мишени Линия AM12/pLR (клетки) Линия AM12/pLR (вирусный препарат)

СПЭВ 4'KTJ 0,2-10"'

FBT 3-1041 *

STO 4*10"J 2*10"J

Vero * *

СП * *

* - отсутствие данных

В таблице 5 представлены результаты молекулярного анализа на наличие НЛ антисмысловоЙ РНК линии АМ12/рЬЯ в клетках-мишенях. Присутствие рекомбинантной ДНК было выявлено только в геноме клеток ЭТО и СПЭВ при их совместном культивировании с клетками-«упаковщицами» и в случае культивирования 5ТО с вирусным препаратом.

Таблица 5

Молекулярный анализ наличия НП антысмысловой РНК линии А М12/р1Я в

клетках-мишенях

Клетки -мишени Линия AM12/pLR

Клеткн-иупаковщнцы» Культур альная среда

СПЭВ + -

FBT - *

STO + +

Vero * *

- СП * *

* - отсутствие данных

3.2.3. Характерист и ка ли и и и клеток Л М12, упаковы воющих рекомби-нантный ретровирусный вектор pLU, в переносе экзогенной ДНК в клетки-мишени.

Мы установили, что линия клеток АМ12, упаковывающих ретровирусный вектор pLU, максимально эффективна при генетической трансформации клеток-мишеней STO и СП и минимально эффективна при трансформации клеток FBT, так как в случае совместного культивирования частота генетической трансформации составила 2 генетически трансформированных клона клеток на 1 тыс. использованных в опыте клеток линий STO и СП и 5 клонов на 1 млн клеток линии FBT (табл. 6). У клеток Vero н СПЭВ показатели частоты генетической трансформации составили 1 и 10 клонов на 10 тыс. клеток, соответственно. При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом максимальная величина составила 2 клона на 1 тыс. клеток для пинии STO, минимальная - 2 клона на 1млн. клеток для линии FBT. Для клеток Vero и СП показатели частоты генетической трансформации были одинаковыми и составили 5 клонов на 1 млн. клеток. При инфицировании клеток СПЭВ было получено 3 клона на 1 млн. использованных клеток.

Таблица б

Показатели частоты генетической трансформации клеток-мишеней лилией кдеток-цупаковщиц» AM12/pLU

Клетки - мишени Линия AM12/pLU (клетки) Линия AM12/pLU (вирусный препарат)

СПЭВ но-1 З-Ю*

FBT Óf5-10"7 0,2-10'7

STO 2*10"3 2-10J

Vero МО"4 0,5-10''

СП 2-10"J 0,5-10"'

При проведении ПЦР-анализа клеток-мишеней, трансформированных линией АМ12/рШ, рекомбинантиый ген антнсмысловой РНК обнаруживался во всех клетках, кроме линии РВТ, а при использовании культу рал ьной среды — только в клетках ЭТО (табл.7).

Таблица 7

Молекулярный анализ наличия НП антисмысловой РНК линии АМ12/рЬи

в клетках-мишенях

Клетки -мишени Линия AM12/pLU

Клетки-«упаковщи цы » Культур альная среда

СПЭВ + -

FBT -

STO + +

Vero +

СП + -

3.2.4, Характеристика линии клеток РТ67, упаковывающих рекомби-нантный ретроеирусный вектор pLNCX2, в переносе экзогенной ДНК в клетки-мишени.

Согласно результатам показателей частоты генетической трансформации клеток-мишеней вектором pLNCX2 при их инфицировании клеткам и -«упаковщицами» линии FT67, установлено, что данный вектор наиболее эффективен для клеток STG (6 генетически трансформированных клонов на I тыс. использованных в опыте клеток) и наименее эффективен для клеток FBT (2 клона на 1 млн. использованных клеток) (табл. 8). При трансформации клеток СПЭВ было получено 5 клонов из 1 тыс. использованных клеток. При инфицировании линий клеток-мишеней вирусным препаратом РТ67 было подучено 1 и 3 клопа на 1 тыс. клеток для линий STO и СПЭВ, соответственно, а для линии FBT эта величина составила 5 клонов на 1 млн. использованных клеток. Для клеток Vero и СП показатели частоты генетической трансформации не были определены ни при совместном культивировании, ни при использовании вирусного препарата.

Таблица 8

Показатели частоты генетической трансформации кяеток-мишеней линией кпеток-цупакобщuif» РТ67

Клетки - мишени Линия РТ67 (клетки) Линия РТ67 (вирусный препарат)

СПЭВ 5-10J 3-10"5

FBT 0,2*10"7 0,5- i'Ó^

STO 6-101 НО""

Vero * *

СП * *

* - отсутствие данных

Рскомбинантный ген р-интерферона человека линии клеток РТ67 был выявлен ПЦР-анализом только в клетках-мишенях СПЭВ и БТО, как в случае совместного культивирования, так и при использовании вирусных препаратов (табл.9).

Таблица 9

Молекулярный анализ наличия НП гена Д-интерферона человека в клетках-мишенях

Клетки-мишени Линия РТ67

Клетки -«упаковщицы » Культур альная среда

СПЭВ + +

FBT - -

STO + +

Vero * *

СП * *

* - отсутствие данньш

На рисунке 3 представлены результаты ПЦР-аналнза клонов, генетически трансформированных линией упаковывающих клеток, несущих ген р-интерфсрона человека. Положительный сигнал отмечен на дорожках 1-5 и 9, которые соответствуют клеткам СПЭВ и ЭТО, а также двум контрольным дорожкам - клеткам РТ67 УП и I пассажей.

12345 6789

1, РТ67, VU пассаж

Z. СПЭВ + FT67 (шегкн-купщовщтш ») СПЭВ + РТ67 (культуралъная жвдкоегь)

4. STO + PTS7 (х.тгст깫упа1«»цшцы»)

5. STO 4- РТ67 (культуралька* жидкость)

6. FBT + PT67 (Бдетсн-иулакоышоды»)

7. FBT + РТ67 (кушурапьнал жвдкостъ)

8. СПЭВ

9. РТ67,1 пассаж

Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа клеток-мишеней, трансформированных линией РТ67

3.3. Сравнительный анализ потенций линий илеток-^упаковшни» в переносе экзогенной ДНК в клетки-ми шеи и.

Анализ полученных нами данных выявил существенные различия в способности клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, инфицировать клеткн-мишеии, имеющие различное видовое и тканевое происхождение.

Как свидетельствуют данные таблиц 2, 4, 6, 8 частота генетической трансформации в экспериментальных группах значительно варьировала. Так, при трансформации мышиных фибробдэстов (STO), а также клеток ночки эмбриона свиньи (СПЭВ) линией клеток, упаковывающих ген ß-интерфсрока человека (РТ67), было получено 5-6 генетически трансформированных клонов на 1000 использованных в опыте клеток. Тогда как, при трансформации клеток трахеи эмбриона коровы (FBT) линией кпеток-«упаковщиц», несущих ген антисмысловой РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота (AM12/pLU), было получено только 2-5 гаs(лнчески трансформированных клонов на 1 млн использованных в опыте клеток.

Во всех случаях наибольшее количество генетически трансформированных клонов (50%) было выделено при использовании, в качестве мишеней, мышиных фибробластов линии STO. Наименьшую тропноегь (2%) линии клеток-«упаковщиц» проявляли при инфицировании клеток Veto. Хотя мы отмечали несколько более высокий процент эффективности генного переноса в клетки-мишени линий FBT и СП (7% и 10% генетически трансформированных клонов, соответственно), по, как видно из результатов, разница между ними оказалась незначительной.

Установлено, что эффективным в переносе экзогенной ДНК в клетки STO и СПЭВ оказался вектор pLNCX2 линии РТ67. Для инфекции клеток FBT, СП и

1S

Vero более эффективной была линия ЛМ12, упаковывающая рекомбинантный ретровирусный вектор pLNa.

Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что эффективность генетической трансформации зависит, прежде всего, от типа клеточных культур. Считается, что для вирусной трансформации клетки-мишени должны происходить от тех же видов млекопитающих, что и трансформирующий вирус или от тех тканей, которые в естественных условиях являются очагами развития злокачественности. Этим, по нашему мнению, можно объяснить большой выход получения генетически трансформированных клонов мышиных фибробластов лннин STO при трансформации их линиями клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, созданные на основе ретро-вируса лейкоза мышей (AM12/pLU, AMI2/pLR).

Кроме того, можно судить о наличии вирус-индуциров аннон трансформации, особенно в том случае, где РНК вируса, специфичного для мышей, трансформировала клетки других биологических видов - крупного рогатого скота, свиньи, обезьяны. Этот факт свидетельствует об универсальности ретро-вирусных векторов pLNa и pLU для исследованных типов клеток млекопитающих.

3.4. Сравнительный анализ эффективности методов переноса реком-бинантных ретровнрусных векторов для получения стабильных генетически трансформированных клонов клеток млекопитающих.

В наших экспериментах установлено, что использование метода 1ранс-фекции клеток-мишеней путем совместного культивирования с клетками-«упаковщицами» оказалось более эффективным, чем использование метода трансфекции с помощью вирусных препаратов. Так, показатели частоты генетической трансформации при инфицировании клеток-мишеней методом совместного культивирования были выше таковых при методе с использованием вирусных препаратов более чем в 6 раз (в случае STO + РТ67), в 300 раз (в случае СПЭВ + AM12/pLU), в 500 раз (в случае СПЭВ + AM12/pLR) и в 1000 раз больше (в случае STO + AM12/pLNa) (Рис.4). Возможно, это связано с тем, что для инфицирования клеток-мишеней необходимо использование препаратов с достаточно высоким титром вирусных частиц. Добиться этого можно концентрацией сред ультрацентрифугированием при 30000 g в течение 12-16 часов при 4°С. Однако в наших экспериментах, в качестве вирусных препаратов мы использовали среду, собранную после инкубации клеток-«у паковшиц». Можно предположить, что различия методов обусловлены тем, что титр вирусных частиц оказался недостаточным для инфицирования. Хотя мы не исключали также возможность присутствия клеток-купаковщиц» в вирусном препарате. Поэтому с целью получения 100%-ной их гибели мы увеличили срок обработки клеток мнтомицииом С до 4-х часов, концентрацию митомицина С с 10 мкг/мл до 30 мкг/мл, а также удлинили этап селекции до 14-15суток.

Частота генетической трансформации

АМ12/РЬЧа АМШРЫ* АМ12/РШ РТ67 Клстки-купяковшнци»

АМ12/Р1Ла АМ12/Р1.Й АМ12/РШ РТ67 Вирусный препарат

Рис. 4. Трансформация клеток-мншеней с помощью линий упаковывающих клеток н с использованием вирусных препаратов

3.5. Введение экзогенной ДИК в организм животных с помощью линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы.

В отделе биотехнологии ВНИИЖа проводятся эксперименты по созданию новых методов переноса рекомбинантных генных конструкций в организм животных. В связи с этим нами была исследована возможность переноса чужеродной ДНК рекомбинантными ретровирусными векторами: рЬЫа, рьи, рШ и рЬМСХ2 в организм быков.

Был разработан метод введения в семенники животных заблокированных митомицином С клеток, упаковывающих данные рекомбинантные векторы. В результате проведенных в этом направлении экспериментов были получены животные, в сперме которых были выявлены НП экзогенной ДНК. Анализ наличия рекомбинантного провируса в мужских половых клетках осуществляли с помощью ПЦР.

Поскольку работа носила поисковый характер, представляло интерес изучить влияние дозы инъецируемой клеточной суспензии на эффективность трансформации мужских половых клеток. Изначально за норму нами была принята концентрация клеток, применяемая в медицине при фетальной терапии органов, в том числе крупных, таких, например, как печень. В последующих экспериментах дозы клеток постепенно увеличивались и достигли максимума -70 млн клеток на семенник. К сожалению, следует констатировать, что у нас отсутствуют данные по 5 головам, которым были введены клетки в концентрации 20-70 млн. Анализ полученных данных, представленных в таблицах 10 и 11, позволяет предположить, что увеличение начальной дозы клеток в 5 раз дает положительный результат. Так, при инъекции в семенники 4-х быков клеток в концентрации 3,5 - 4 млн не было получено ни одного животного с положительным сигналом по рекомбинантной вставке. Увеличение дозы в 2 раза также не привело к эффекту. Однако при использовании 15 млн на семенник у 2-х быков были выявлены НП рекомбинантной ДНК в сперматозоидах. Таким образом, можно предположить, что увеличение концентрации клеток до 15 млн приводит к положительному эффекту у быков (табл. 11).

После введения экзогенной ДНК в семенники быков на 10,20,25,30 и 45-е сутки, а также через 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5 и 6 месяцев после инъекции были взяты экспериментальные образцы спермы для анализа наличия НП рекомбинантной ДНК на молекулярном уровне (ПЦР-анализ). Общий результат представлен в таблице 12.

Таблица 10

Сравнительный анализ эффективности ретровирусных векторов трансформировать мужские половые

клетки быков.

Количество животных, гол. 1 1 1 2 2 1 1

Линия клеток-«утаковгциц» АМ12/рЬ№ АМ12/рЬИа АМ12/рЬКа АМШрШ АШ2/р1Л АМ12/рЬК РТ67

Рекомбинаит-ный ген эритропоэтин эритропоэтин эритропоэтин антисмыслов ая РНК ВЛК антисмысяов ая РНК ВЛК антисмыслов ая РНК ВЛК интерферон

Объем суспензии 5 мл/семенник 5 мл/семенник 5 мл/семенник 5 мл/семеинмк 5 мл/семенник 5 мл/семенник 5 мл/семенник

Концентрация клеток 3 млн/мл 3 млн/мл вирусный препарат 4 млн/ семенник 3,5-4 млн/ семенник 20 млн/семенник 5-6 мл я/семе! шик

Всего клеток 30 млн ЗОмлн - 16 млн 16 млн 40 млн 12 млн

Результат ПЦР-анализа + + - - - не тест. -

Таблица 11

Влияние вводимой дозы клеток, упаковывающих рекомбинантный ретро-вирус, на получение животных с генетически трансформированными сперматозоидами

Количество клеток, введенных в семенник (млн) 3,5-4 5-6 15 20

Количество обработанных животных, гол. 4 1 2 1

Из иих протестировано на наличие рекомбинантной ДНК (ПЦР), гол. 4 1 2 0

Из них выявлено положительных (ПЦР), гол. 0 0 2 -

Таблица 12

Получение животных, в сперме которых выявлены НП рекомбинантной

ДНК

Использовано всего в эксперименте животных, гол. 9

Подвергнуто анализу на выявление рекомбинант-ных ДНК, гол. 8

Из них количество животных с положительным сигналом (ПЦР) 2

Эффективность ретровирусного вектора (%) 25

Как видно из таблицы 12, из восьми быков, подвергнутых ПЦР-анализу, в сперме двух животных, были выявлены НП рекомбинантной ДНК. Следовательно, можно заключить, что в нашем эксперименте эффективность ретрови-русных векторов трансформировать мужские половые клетки составила 25%.

Согласно полученным данным (табл. 10), сравнительный анализ эффективности ретровирускых векторов трансформировать мужские половые клетки быков, показал, что рекомбнкантный вектор, несущий ген эритропоотипа человека (линия АМ12/рЬЫа) оказался способным встраиваться в геном двух экспериментальных животных, от которых были получены образцы трансгенной спермы. В образцах спермы, взятой от остальных животных, интеграция трансгенов линий клеток, несущих гены антисмысловой РНК и р-интерферона человека (линии АМ12/рШ, АМ12/рЬЯ и РТ67) не была выявл&члицатсльный результат был установлен при использовании для получения трансгенной спермы вирусного препарата от линии АШ2/рЬКГа.

Из анализа наших результатов можно сделать вывод, что данные, полученные при тестировании рекомбинантных векторов в культуре клеток, подтвердились данными in vivo. Как было продемонстрировано выше, наиболее эффективным в инфицировании клеток крупного рогатого скота, культивируемых in vitro, оказался вектор, содержащий НП гена эритропоэтнна человека (pLNa). Этот же вектор оказался способным инфицировать и мужские половые клетки быков.

Кроме того, для нас представляло интерес изучить динамику наличия провируса с рекомбинантным геном эритропоэтнна в мужских половых клетках. Различия во времени выявления провируса в сперме быков после обработки, объяснить сложно. Можно предположить, что это связано с инфицированием рекомбинантным ретровирусом различных популяций мужских половых клеток семенника.

Анализ результатов, представленных в таблице 13, показал, что наличие провируса обнаруживалось в различные сроки после одновременной обработки. У первого быка НП гена эритропоэтнна человека обнаруживалась в образцах спермы через 14 сут после введения клеточной суспензии, в то время как у второго быка, она выявлялась только через 3 месяца после инъекции.

Необходимо отметить, что полученные нами данные in vivo требуют дальнейшего изучения на большем поголовье животных, а для подтверждения интеграции трансгенов у быков необходимо, на наш взгляд, проведение молекулярного анализа, помимо ПЦР, также другими методами (например, блоттипг по Саузерну).

Таблица 13

Динамика регистрации рекомбинантного провируса в сперме быков

Сроки взятия проб бык I бык 2

10 дней _ -

14 дней +

20 дней + -

1 мес + _

1,5 мес + -

2 мес + -

2,5 мес +■ -

3 мес _ +

3,5 мес +

4 мес _ +

5 мес - +

6 мес - +

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что клетки-«упаковщицы», продуцирующие рекомбинантные рстровирусные векторы, позволяют получить генетически трансформированные клетки сельскохозяйственных животных с максимальной частотой генетической трансформации от 2 -10"5 до 5 -10"1,

2. Впервые в культуре клеток сельскохозяйственных животных протестированы и охарактеризованы 4 рскомбинантных ретровирусных вектора:

1) вектор рЬЫа - наиболее эффективен генетически трансформировать клетки крупного рогатого скота с частотой трансформации 2 -10";

2) векторы рШ, рЬК и рШСХ2 - способны генетически трансформировать клетки свиньи с частотой трансформации 2 -Ю*3,4 -Ш'3 н 5 10"', соответственно.

3. Сравнительный анализ эффективности методов переноса (метод трансфск-ции с помощью вирусного препарата и метод совместного культивирования с клетками, упаковывающими рекомбинантный ретровирусный вектор) выявил преимущество метода совместного культивирования клеток-мишеней с упаковывающими клетками в 300-1000 раз.

4. Показано, что из изученных в культуре клеток рекомбинантяых ретровнрус-ных векторов, вектор рШа оказался эффективным (25%) в переносе экзогенной ДНК я организм животных (быков).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Необходимо проводить предварительное тестирование линий клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирусный вектор, в культуре клеток сельскохозяйственных животных перед введением их в организм.

2. Рекомендуем использовать протестированные в культуре клеток сельскохозяйственных животных рекомбннантные ретровирусные векторы: pLU, pLR, pLNa и pLNCX2 в составе клеток-«упаковщкц» для создания генетически модифицированных животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Абд рахманов И.К., Савченкова И.П., ПриданцеваТ.А., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Трансфекция соматических клеток млекопитающих in vitro с использованием линий клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус // Материалы научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». -РАМЖ. - п. Быково, Московская область. - 2000. - С. 129-130.

2. Абдрахманов И,К., Савченкова И.П., Приданцева Т.А., Зиновьева НА., Эрнст Л.К. Использование линий клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус, для переноса экзогенной ДНК в соматические клетки млекопитающих // Тезисы докладов научной конференции, посвященной 60-летию ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных, «Селекционно-

22

генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». -ВНИИРГЖ. - Санкт-Петербург. - 2000. -С. 62-63.

3. И.К. Абдрахманов, И.П. Савченкова, ТА. Приданцева, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст. Сравнительный анализ эффективности ретровирусных векторов в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, культивируемые w vitro Н Доклады РАСХН. - Москва. -2001.-№ 5.- С. 30-31.

Издательство 1'УЦ ЭБТЖ 142132, Московская oía., Подольский р-н, и. Дубровины Тел. (8-27) 65-14-24, (S - 27) 65-14-07

Лицензия ЛРЛг021243 от 2112.97

Сдано в набор 31.10,2001. Подписано ь печать 1.11.2001 _Заказ .Na 25. Печ.л. 1,1- Тираж 100 экз._