Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая трансформация половых клеток кроликов и хряков с использованием ретровирусных векторов

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация половых клеток кроликов и хряков с использованием ретровирусных векторов"

г

ЛОЦМАНОВА Наталья Сергеевна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК КРОЛИКОВ И ХРЯКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

03.02.07-Генетика 03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ИЮН 2011

Дубровицы - 2011

4851047

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна;

доктор биологических наук Волкова Наталья Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич;

кандидат биологических наук, Пархоменко Елена Григорьевна

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится « ?» июля 2011 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ. Автореферат разослан « ^ » июня 2011 года.

Ученый секретарь Совета Д006.013.03

КВ. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка методов генетической модификации животных, основанных на использовании половых клеток в качестве векторов для переноса генов, рассматривается как альтернатива традиционному методу получения трансгенных животных - микроинъекции ДНК в пронуклеус зигот [Коржикова С.В., 2002; Савченкова И.П. и др., 2006; Новгородова И.П. и др., 2008; Эрнст JI.K. и др., 2008; Волкова H.A. и др., 2011]. Интерес к данному направлению связан, прежде всего, с природной способностью клеток сперматогенного эпителия самцов поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения [Gandolfi F., 1998]. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.

Несмотря на то, что для трансформации половых клеток (спермиев) используют ряд методов (липофекцию, электропорацию и вирусную трансдукцию), сегодня не разработаны системы, позволяющие эффективно доставлять рекомбинантную ДНК в данные клетки-мишени. Разработка эффективного метода генетической модификации половых клеток позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Одним из возможных путей решения данной проблемы является трансформация половых клеток на ранних стадиях их дифференцировки с использованием генных конструкций, полученных на основе рекомбинантных ретровирусов.

Цель и задачи. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток хряков и самцов кроликов.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить компетентность клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков к ретровирусным векторам in vitro.

2. Осуществить трансформацию клеток сперматогенного ряда прямым введением генных конструкций в семенники кроликов и хряков in vivo.

3. Определить факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков in vivo (кратность введения, концентрация и тип используемого препарата).

4. Изучить результативность генетической трансформации сперматогенных клеток кроликов и свиней in vivo генным и конструкциями, содержащими кДНК инсулина человека.

5. Исследовать характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков.

Научная новизна. Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия кроликов и хряков посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (GFP, инсулин) в половых клетках самцов кроликов и хряков.

Практическая значимость. Отработан метод введения генных конструкций в семенники самцов кроликов и хряков in vivo, позволяющий трансформировать клетки сперматогенного ряда с эффективностью до 0,48±0,12 и 0,57±0,10%, соответственно. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в органы-мишени: отработан способ подготовки генных конструкций для инъекций и определена концентрация генных конструкций, эффективная для интеграции рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в спермиях опытных животных по достижении ими половой зрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как способ генетической трансформации клеток сперматогенного ряда in vitro и in vivo.

• Способ подготовки, концентрация, кратность введения ретровирусных векторов в семенники кроликов и хряков in vivo как факторы, влияющие на результативность трансгенеза.

• Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия кроликов и хряков.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции: «ЕС-Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи»», Уфа, 2010 г.; на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК (Достижения науки и техники АПК, Сельскохозяйственная биология)-2.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы» практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 11 таблиц и 16 рисунков. Библиографический список включает 160 источников, в том числе 120 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2005 по 2010 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных и на физиологическом дворе ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, а также экспериментальном хозяйстве «Кленово-Чегодаево» согласно схеме (рис. 1).

Рис.1 Схема исследований.

Объектом исследований служили кролики породы шиншилла и хряки крупно-белой породы. Для трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников использовали три генные конструкции рЬ№ОРР, рЬЫт и рХ-1пз, полученные на основе ретровирусного вектора рЬХБЫ. Первая генная конструкция содержала репортерный ген вРР, вторая и третья - кДНК

инсулина человека. Для упаковки рекомбинантных ретровирусов была использована линия клеток-упаковщиц GP+envAml2.

Трансформацию клеток сперматогенного эпителия кролика и хряка in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавления вирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу клеток, взятых для трансфекции.

Введение генных конструкций в семенники кроликов и хряков in vivo осуществляли в возрасте 5-ти и 3-х недель, соответственно. Для инъекций использовали суспензию клеток-упаковщиц и вирусный препарат. Для получения инъекционного раствора клеток-упаковщиц, последние ресуспензировали в среде DMEM, содержащей полибрен (8мкг/мл). Вирусный препарат также вводили с добавлением полибрена (8 мкг/мл).

Выделение ДНК из культуры клеток семенника и спермы осуществляли с использованием солевого и перхлоратного методов [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Экспрессию рекомбинантных белков в клетках сперматогенного эпителия семенников подопытных животных изучали методом иммуногистохимии. Гистологические препараты готовили по общепринятой методике [Ромейс Б., 1953]. Для анализа использовали не менее 20 гистологических срезов толщиной 4-5 мкм с интервалом 50 мкм. Микроскопирование гистопрепаратов осуществляли с использованием компьютерной программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Эффективность трансфекции клеток семенников кролика и хряка ретровирусными векторами в культуре in vitro

На первом этапе с целью оценки тропности используемых ретровирусных генных конструкций был проведен ряд экспериментов по переносу экзогенной ДНК в клетки семенников кролика и хряка в культуре in vitro. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала в зависимости от метода трансфекции и используемой генной конструкции. Наибольшая доля генетически трансформированных клонов была получена при совместном культивировании с клетками-упаковщицами: при использовании генных конструкций, содержащих кДНК инсулина человека (pX-Ins, pLNins) частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 1,7х10"3 до 4,1х10'3 в зависимости от вида животного. При трансфекции клеток сперматогенного ряда семенника вирусным препаратом данный показатель был в 2,1-3,5 раза ниже и не превышал для культуры клеток семенника хряка 1,1х10'г, кролика - 0,8x10"3.

Аналогичные данные были получены и при использовании генной конструкции pLN-GFP. В данном случае эффективность генетической трансформации первичной культуры клеток семенника была несколько выше по сравнению с использованием генных конструкций pX-Ins, pLNins. При совместном культивировании с клетками-упаковщицами данный показатель достигал в культуре клеток хряка 4,9х10"3, кролика - З,2х10"3, при трансфекции вирусным препаратом - 2,1х10'3 и 1,2х10'3, соответственно.

Результаты исследований, полученные в опытах in vitro, послужили основой для проведения дальнейших исследований по переносу рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия кроликов и хряков in vivo.

3.2. Трансформация клеток семенников кролика in vivo посредством прямого введения ретровирусных генных конструкций

Для трансформации сперматогенных клеток использовали генные конструкции pLN-GFP, pX-Ins и pLNins. На первом этапе была оптимизирована доза вводимых генных конструкций, на втором - оценена эффективность генетической трансформации клеток сперматогенного эпителия кроликов.

3.2.1. Введение в семенники кроликов генной конструкции pLN-GFP

Введение генной конструкции pLN-GFP в семенники кроликов осуществляли однократно и двукратно с интервалом в 14 дней. В качестве источника генной конструкции использовали вирусный препарат и клетки-упаковщицы в концентрации 1 млн., 2 млн. и Змлн. клеток на семенник.

Интеграция и экспрессия репортерного гена GFP в клетках сперматогенного эпителия была установлена как при введении вирусного препарата, так и после инъекции суспензии клеток-упаковщиц. Число трансформированных сперматогенных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 6 независимо от используемого источника генной конструкции. Вместе с тем, способ подготовки генной конструкции для инъекции и кратность ее введения в семенник опытных животных влияли на эффективность трансформации семенных канальцев.

При введении в семенники самцов кроликов вирусного препарата из 60 проанализированных срезов только в 17 из них было выявлено наличие семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками: доля таких канальцев на одном срезе достигала 21,8±2,7% (табл. 1). Процент трансформированных клеток в семенных канальцах варьировал от 2,4 до 14,6% и составил в среднем по группе 4,65+0,59% (табл. 2). При этом общая эффективность трансформации семенных канальцев и сперматогенных клеток (отношение числа трансформированных семенных канальцев и клеток к общему их числу во всех исследованных срезах, выраженное в процентах) не превышала 5,8±1,5 и 0,27±0,07%, соответственно.

При использовании в качестве источника генной конструкции суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток на семенник эффективность

трансформации семенных канальцев была незначительно ниже по сравнению с применением вирусного препарата - 5,1±2,2%. Наличие канальцев с трансформированными клетками было установлено в 15 из 60 исследованных срезов.

Таблица 1

Эффективность генетической трансформации семенных канальцев семенников кроликов in vivo в зависимости от кратности введения _ генной конструкцией pLN-GFP_

Показатель Группа

I II III IV

Способ подготовки генных конструкций для инъекции ВП КК вп+вп вп+кк

Концентрация: -ВП, КОЕ/мл - КК, млн.клеток/семенник 1х105 1 1x105 1х105 1

Доля срезов с трансформированными семенными канальцами, % 28,3±1,7 25,0±5,0 30,0±2,8 26,7±3,3

Доля трансформированных семенных канальцев на срезе, %: - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе 3,0 38,6 21,8+2,7 5,7 39,8 20,3±2,0 3,3 46,9 22,5±3,0 4,3 40,5 21,1±2,4

Общая эффективность трансформации семенных канальцев, % 5,8±1,5 5,1±2,2 6,4±2,8 5,6±2,4

Примечание: КК — суспензия клеток-упаковщиц, ВП - вирусный препарат, Общая эффективность трансформации семенных канальцев - отношение числа трансформированных семенных канальцев к общему числу исследованных семенных канальцев, выраженное в процентах.

Однако результативность введения рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного слоя была выше. Доля трансформированных клеток в семенных канальцах достигала 9,42±0,92% при общей эффективности трансформации сперматогенных клеток 0,48±0,12%, что было в 1,8-2,0 раза выше аналогичных показателей, полученных при введении в семенники самцов кроликов вирусного препарата.

Введение генной конструкции в семенники кроликов путем двукратного введения с интервалом в 14 дней позволило повысить результативность трансформации семенных канальцев по сравнению с однократной инъекцией как вирусного препарата, так и суспензии клеток-упаковщиц. Наличие семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками было выявлено в 16-18 срезах из 60 проанализированных в зависимости от

используемого источника генной конструкции. При двукратном введении вирусного препарата общая эффективность трансформации семенных канальцев достигала 6,4±2,8%, при последовательном введении вирусного препарата и суспензии клеток-упаковщиц - 5,6±2,4%.

Таблица 2

Эффективность генетической трансформации сперматогенных клеток семенников кроликов ¡n vivo в зависимости от кратности введения

генной конструкцией pLN-GFP

Показатель Группа

I II Ш IV

Способ подготовки генных конструкций для инъекции ВП КК вп+вп вп+кк

Исследовано от каждого животного: - срезов, п; - клеток сперматогенного ряда,п 20 66488± 1006 20 69276± 718 20 65873± 1576 20 69153± 362

Доля трансформированных сперматогенных клеток в семенных канальцах, % - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе 2,4 14,6 4,65±0,30 2,4 19,5 9,42±0,92 2,4 12,2 5,45±0,67 2,0 14,6 7,20±0,77

Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток, % 0,27±0,07 0,48±0,12 0,35±0,09 0,40±0,10

Примечание: КК - суспензии клеток-упаковщиц, ВП - вирусный препарат, Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток - отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к общему числу исследованных клеток, выраженное в процентах.

Вместе с тем, результативность генетической модификации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов была ниже по сравнению с однократным введением генной конструкции в виде суспензии клеток-упаковщиц. Если при двукратном введении генной конструкции общая эффективность трансформации сперматогенных клеток варьировала от 0,35±0,09 до 0,40±0,10%, то при однократном введении суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток данный показатель достигал 0,48±0,12%. Учитывая полученные результаты, в дальнейших исследованиях в качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц.

С целью повышения эффективности трансгенеза был проведен ряд экспериментов по оптимизации дозы вводимой генной конструкции в

семенники самцов in vivo. В качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц в концентрации огс 2 до 3 млн. клеток. Предполагалось, что увеличение концентрации вводимых клеток-упаковщиц позволит повысить эффективность трансгенеза сперматогенных клеток семенников кроликов. Однако с увеличением дозы введения клеток-упаковщиц наблюдалась обратная тенденция. Результативность переноса рекомбинантной ДНК в семенные канальцы и клетки спермато генного эпителия семенников кроликов была ниже по сравнению с использованием клеток-упаковщиц в меньшей концентрации. Так, при инъекции в семенники самцов кроликов суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 2 млн. клеток общая эффективность трансформации семенных канальцев составила 0,84±0,33%, сперматогенных клеток - 0,06±0,02%, что было в 6,7-8,0 раз ниже аналогичных показателей, полученных при ведении клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток на семенник. При введении клеток-упаковщиц в концентрации 3 млн. клеток на семенник различия по данным показателям были больше: эффективность трансформации семенных канальцев не превышала 0,46±0,19%, клеток сперматогенного слоя - 0,03±0,01%.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать условия введение генных конструкций в семенники самцов кроликов in vivo. Максимальная эффективность трансформации сперматогенных клеток семенников была установлена при использовании в качестве источника генной конструкции суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток на семенник. Исходя их чего, данная концентрация была выбрана нами в качестве оптимальной и была использована в дальнейших исследованиях.

3.2.2. Введение в семенники кроликов генных конструкций, содержащих кДНК инсулина человека

Введение генных конструкций pX-Ins и pLNins в семенники самцов кроликов осуществляли в возрасте 5 недель. В качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток на семенник.

Наличие и экспрессия рекомбинантной вставки, содержащей кДНК, в сперматогенных клетках семенников была выявлена у всех подопытных кроликов. Результативность генетической трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников варьировала в зависимости от используемой генной конструкции.

Максимальная эффективность трансформации клеток-мишеней была установлена при использовании генной конструкции pLNins. Доля трансформированных семенных канальцев на срезе варьировала от 2,4 до 14,6% и составила в среднем 20,3±2,0%. Количество трансформированных клеток при этом в одном семенном канальце достигало 5. Общая эффективность трансформации семенных канальцев составила 5,08±1,27%, клеток сперматогенного слоя семенников - 0,47±0,11% (табл.3).

Таблица 3

Эффективность генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo генными конструкциями, содержащими кДНК _инсулина человека_

Показатель Группа

I II

Генная конструкция pX-ins pLNins

Количество животных, п 3 3

Концентрация клеток-упаковщиц, клеток 1 млн. 1 млн.

Доля срезов с трансформированными семенными канальцами, % 26,7±4,4 35,0±2,9

Доля трансформированных семенных канальцев на срезе, % 20,2±1,3 20,3±2,0

Доля трансформированных сперматогенных клеток в семенных канальцах, % 7,8±2,5 9,1±0,84

Общая эффективность трансформации семенных канальцев, % 4,04±1,10 5,08±1,27

Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток, % 0,36±0,09 0,47±0,11

Примечание: Общая эффективность трансформации семенных канальцев (сперматогенных клеток) - отношение числа трансформированных семенных канальцев

(сперматогенных клеток) к общему числу исследованных семенных канальцев (сперматогенных клеток), выраженное в процентах.

При введении в семенники самцов кроликов генной конструкции pX-Ins результативность переноса рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного слоя была ниже. Общая эффективность трансформации семенных канальцев не превышала 4,04±1,10%, сперматогенных клеток - 0,36±0,09%.

С целью оценки эффективности интеграции генной конструкции по достижению половой зрелости от подопытных кроликов была получена сперма для анализа на трансгенность. Наличие рекомбинантной вставки в спермиях было установлено у 1 из 4 исследованных кроликов, что свидетельствуют о перспективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток самцов кроликов с целью получения трансгенного потомства.

3.3. Введение генных конструкций в клетки сперматогенного эпителия семенников хряков in vivo

Для трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников хряков использовали генные конструкции pLN-GFP и pX-ins, содержащие соответственно, репортерный ген GFP и кДНК инсулина человека. На первом этапе были оптимизированы условия введения генной конструкции в

семенники хряков in vivo, на втором - изучена эффективность введения генной конструкции, содержащей целевой ген человека (кДНК инсулина). 3.3.1. Введение в семенники хряков генной конструкции pLN-GFP Введение генной конструкции pLN-GFP в семенники хряков in vivo осуществляли виде вирусного препарата и суспензии клеток-упаковщиц. Клетки-упаковщицы вводили в концентрации 3 млн., 5 млн. и 7 млн. клеток на семенник. Учитывая результаты трансформации сперматогенных клеток семенников кроликов (раздел 3.2.), введение генной конструкции в семенники подопытных хрячков in vivo проводили однократно.

Наличие и экспрессия репортерного гена GFP в клетках сперматогенного эпителия семенников хряков была установлена как при введении вирусного препарата, так и при использовании клеток-упаковщиц (табл. 4,5).

Таблица 4

Эффективность генетической трансформации семенных канальцев

семенников хряков in vivo генной конструкцией pLN-GFP

Показатель Группа

I II III IV

Способ подготовки генных

конструкций для инъекции ВП КК КК КК

Концентрация: - ВП, КОЕ/мл 1 х105 .

- КК, млн. клеток - 3 5 7

Исследовано от каждого

животного:

- срезов, п; - семенных канальцев, п; 20 2177±113 20 2016±60 20 2229±79 20 2302±88

Доля срезов с трансформированными семенными канальцами, % 28,3±6,6 21,6±6,6 26,7±6,0 16,6±4,4

Доля трансформированных

семенных канальцев на срезе,%:

- минимальная; 2,7 5,5 6,1 4,3

- максимальная; 40,0 23,4 44,6 40,5

- в среднем по группе 22,2+3,0 15,1±1,4 20,7±3,0 15,6±1,0

Общая эффективность трансформации семенных 6,3±1,6 3,3±0,9 6,0±1,6 2,3±0,8

канальцев, %

Примечание: КК - суспензия клеток-упаковщиц, ВП - вирусный препарат, Общая эффективность трансформации семенных канальцев - отношение числа трансформированных семенных канальцев к общему числу исследованных семенных канальцев, выраженное в процентах.

Таблица 5

Эффективность генетической трансформации клеток сперматогенного слоя семенников хрячков in vivo генной конструкцией pLN-GFP

Показатель Группа

I II III IV

Способ подготовки генных конструкций для инъекции ВП КК КК КК

Исследовано от каждого животного: - срезов, п; - клеток сперматогенного слоя, п 20 97950± 5107 20 90735± 2700 20 100290± 1871 20 103620± 3978

Доля трансформированных сперматогенных клеток в семенных канальцах, % - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе 2,2 ИД 4,91+0,20 2,2 6,7 3,87±0,20 2,2 15,6 12,1±0,50 2,2 8,9 4,99±0,23

Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток, % 0,29±0,08 0,13±0,04 0,57±0,10 0,09±0,02

Примечание: КК - суспензия клеток-упаковщиц, ВП - вирусный

препарат, Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток - отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к общему числу клеток во всех исследованных семенных канальцах, выраженное в процентах.

Наличие и экспрессия репортерного гена ОБР в клетках сперматогенного эпителия семенников хряков была установлена как при введении вирусного препарата, так и при использовании клеток-упаковщиц.

При введении в семенники хрячков вирусного препарата эффективность трансформации семенных канальцев была максимальной: процент семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками на исследованных срезах достигал 40,0% и составил в среднем 22,2±3,0% на срезах с трансформированными канальцами и 6,3±1,6% в расчете на общее количество исследованных срезов (общая эффективность трансформации). Доля трансформированных клеток в семенных канальцах при этом не превышала 4,91±0,20% при общей эффективности их трансформации 0,29±0,08%.

При использовании в качестве источника генной конструкции клеток-упаковщиц результативность трансформации семенных канальцев была ниже. Так, введение клеток-упаковщиц в концентрации 3 млн. клеток на семенник обуславливало трансформацию семенных канальцев на уровне

3,3±0,9%, в концентрации 5 млн. клеток - 6,0±1,6%, в концентрации 7 млн. клеток - 2,3±0,8%, что было меньше аналогичных показателей, полученных при использовании вирусного препарата в 1,9,1,1 и 2,7 раз, соответственно.

Вместе с тем, эффективность трансформации клеток сперматогенного слоя семенника варьировала в зависимости от используемой концентрации клеток-упаковщиц. Введение клеток-упаковщиц в концентрации 5 млн. клеток оказалось более эффективным по сравнению с использованием вирусного препарата: общая эффективность трансформации сперматогенных клеток в данном случае была выше в 2,0 раза - 0,57±0,10%. В тоже время, при инъекции в семенники хрячков клеток-упаковщиц в концентрации 3 млн. и 7 млн. клеток на семенник процент трансформированных сперматогенных клеток от общего числа исследованных был в 2,2-3,2 раза ниже и составил 0,13±0,04 и 0,09±0,02%, соответственно.

Учитывая полученные результаты, в дальнейших исследованиях в качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц в концентрации 5 млн. клеток на семенник.

3.2.2. Введение в семенники хряков генной конструкции рХ-1т

Интеграция и экспрессия генной конструкции рХ-1т в клетках сперматогенного слоя семенников были установлены у всех подопытных хрячков.

Наличие семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками наблюдалось в 26,6% исследованных срезов. Процент семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками на одном срезе достигал 40,1%, а доля трансформированных клеток в данных семенных канальцах - 14,2%. Общая эффективность трансформации семенных канальцев при этом составила 5,0±1,2%, клеток сперматогенного слоя - 0,49±0,18%.

С целью оценки эффективности трансформации половых клеток семенников был проведен ПЦР-анализ спермы, полученной от подопытных хряков по достижению половой зрелости. Наличие генной конструкции в половых клетках было установлено у 2 из 3 исследованных хряков.

3.4. Анализ факторов, влияющих на эффективность генетической

трансформации сперматогенных клеток семенников животных

В ходе проведенных исследований было выявлено влияние на эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков таких факторов как (1) используемая генная конструкция, (2) вид животного, (3) концентрация вводимых конструкций и способ их подготовки для инъекции.

Генная конструкция. Анализ эффективности трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников хряков и самцов кроликов тремя разными конструкциями рШ-СРР, рЬЖпя и рХ-гю, выявил различия в результативности переноса рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного ряда при использовании данных генных конструкций.

В экспериментах как in vitro, так и in vivo максимальная эффективность трансформации сперматогенных клеток была установлена при использовании генной конструкции pLN-GFP независимо от видового происхождения (клетки семенников кролика и хряка) и метода трансфекции. В данном случае результативность трансформации клеток-мишеней по сравнению с использованием генных конструкций pX-Ins и pLNins была выше на 9,5-41,7% (рис.2).

0.006 0.005 0.004 0,003 0,002 0,001 0

IN VITRO ,NVIV0

рШ- рХ- pLN- рШ- рХ- pLN- рШ- рХ- pLN- уЦЧ- рХ-

115 j"®, GHP Ins Ins^ «EP bis bis, OKP bis

у---у- "v--V--

кролики хряки кролики хряки

Швирусный препарат а клетки-упаковщицы

Рис. 2. Эффективность генетической трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков in vitro и in vivo

Вид животного. Перенос рекомбинантной ДНК в половые клетки хряков оказался более результативным по сравнению с введением рекомбинантных генов в клетки сперматогенного эпителия семенников кроликов (рис. 2). Эффективность генетической трансформации сперматогенных клеток хряка в культуре in vitro была выше аналогичных показателей, полученных при трансформации клеток семенника кролика, на 34,7-58,5% в зависимости от используемой генной конструкции и метода трансфекции. В экспериментах in vivo данные различия составили 15,8-22,3%.

Концентрация генной конструкции и способ подготовки генной конструкции. Максимальная эффективность трансформации клеток сперматогенного ряда семенников отмечалась при использовании в качестве источника генной конструкции суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток на семенник у кроликов и 5 млн. клеток у хряков (рис. 3). При введении в семенники подопытных животных вирусного препарата и клеток-упаковщиц в большей концентрации результативность трансформации клеток-мишеней снижалась до 6,3 раз. Объяснением этого может служить тот факт, что в вирусном препарате содержится ограниченное число ретровирусных частиц, в то время как клетки-упаковщицы, находясь даже ограниченный период времени в семенных канальцах, постоянно

продуцируют новые рекомбинантные вирусные частицы, способные интегрироваться в клетки-мишени. Снижение же эффективности трансформации сперматогенных клеток семенников при увеличении концентрации вводимых клеток-упаковщиц, возможно, связано с иммунной реакцией организма в ответ на введение чужеродных для него клеток. Введение генных конструкций в меньшей концентрации (до 1 млн. клеток у кроликов и до 5 млн. клеток у хряков) вызывало менее выраженную ответную реакцию организма на введение чужеродного материала.

кролики хряки

—

Г ¡Sis ipi п m

> - JLE i _JSSSL-C»a«_ Al п

ВП+ВП ВП+КК ВП 1млн. 2 млн. Змлн ВП Змлн. 5 млн. 7 млн.

КК КК

Примечание: BIÍ вирусный препарат, КК- клетки-упаковщицы Рис. 3. Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток семенников кроликов и хряков генной конструкцией pLN-GFP.

Таким образом, проведенные исследования показали возможность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток кроликов и хряков и позволили оптимизировать условия введения конструкций в семенники данных животных in vivo (табл. 6).

Таблица 6

Условия, определяющие эффективность генетической трансформации сперматогенных клеток кроликов и хряков ретровирусными векторами

Показатель Кролики Хряки

Метод введения генной однократное однократное

конструкции введение введение

Источник генной конструкции клетки-упаковщицы клетки-упаковщицы

Концентрация, клеток/семенник 1 млн. 5 млн.

Стадия введения (возраст), нед. 2-9 2-11

ВЫВОДЫ

1. Установлена компетентность сперматогенных клеток семенников кролика и хряка in vitro к рекомбинантным ретровирусам. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 0,9*10"5 до

4,9*10"3 в зависимости генной конструкции, метода трансфекции и видовой принадлежности клеток.

2. Показана результативность введения ретровирусных векторов в семенники хряков и самцов кроликов in vivo с общей эффективностью трансформации клеток сперматогенного ряда от 0,09±0,02 до 0,57±0,10% в зависимости от вида животного.

3. Выявлены факторы, влияющие на результативность переноса рекомбинантной ДНК в половые клетки хряков и самцов кроликов in vivo при использовании ретровирусных векторов. Максимальная эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников установлена при однократном введении генной конструкции в виде суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн. клеток на семенник у кроликов и 5 млн. клеток на семенник - у хряков.

4. Показана результативность использования генных конструкций, содержащих кДНК инсулина человека, для генетической трансформации сперматогенных клеток семенников хряков и самцов кроликов in vivo с эффективностью до 0,49±0,18 и 0,47±0,11%, соответственно. Наличие рекомбинантной ДНК в половых клетках подопытных животных установлено как на ранних стадиях их дифференцировки - в сперматогониях, так и на более поздних - в спермиях.

5. Установлена мозаичность интеграции генной конструкции в клетки сперматогенного эпителия семенников хряков и самцов кроликов при введении ретровирусных векторов in vivo. В зависимости от вида животного и используемой генной конструкции наличие семенных канальцев с трансформированными клетками выявлено в 16,6-35,0% исследованных срезов. При этом доля трансформированных семенных канальцев на одном срезе варьировала от 2,4 до 44,6% при эффективности трансформации сперматогенных клеток в данных семенных канальцах до 19,5%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных, рекомендуем:

1. Для генетической трансформации половых клеток хряков и самцов кроликов использовать генные конструкции, полученные на основе ретровирусного вектора pLXSN;

2. Для эффективной трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников осуществлять введение ретровирусных генных конструкций в виде суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 1 млн.клеток на семенник для кроликов и 5 млн. клеток — для хряков.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, рекомендованных ВАК

1) Лоцманова, Н.С. Эффективность использования ретровирусных векторов для трансформации I Н.С. Лоцманова, H.A. Волкова, В.А. Багиров,

Н.А.Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст // Достижения науки и техники АПК. - 2010 - № 10. - С. 39-40.

2) Волкова, Н.А. Изучение факторов, влияющих на эффективность переноса генов в половые клетки самцов сельскохозяйственных животных / Н. А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л. А. Волкова, Н.С. Лоцманова, Л Ж. Эрнст II Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология животных. - 2010. - № 6. -С. 16-19.

В других изданиях

3) Томгорова, Е.К. Генетическая трансформация половых клеток самцов сельскохозяйственных животных / Е.К. Томгорова, Н.С. Лоцманова, Н.А. Волкова // Материалы международной конференции «ЕС-Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», г. Уфа, БашГАУ, 29 сент.-5 окт. 2010. - С.303-304.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967) 65-13-18 (8-4967) 65-15-97

Сдано в набор 02.06.2011. Подписано в печать 03.06.2011. _Заказ № 32. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лоцманова, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Процесс формирования мужских половых клеток.

1.2. Стадии сперматогенеза у млекопитающих. ^

1.3. Типы клеток сперматогенного эпителия. ^

1.4. Использование половых клеток для получения трансгенных животных.

1.4.1. Использования спермиев для переноса рекомбинантной ДНК в клетки-мишени.

1.4.2. Трансплантация сперматогоний.

1.4.3. Использования ретровирусных векторов для генетической ^ трансформации половых клеток животных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы и оборудование.

2.2. Генные конструкции.

2.3 Работа с культурой клеток.

2.3.1 Культивирование клеток.

2.3.2 Получение первичной культуры клеток семенника кроликов и хряков.

2.4. Трансформация клеток-мишеней ретровирусными векторами ^ 2.4.1. Трансформация культуры клеток семенников кроликов и хряков in vitro.

2.4.2 Введение ретровирусных векторов в семенники кроликов и хряков in vivo.

2.5. Анализ на наличие генной конструкции.

2.6 Анализ экспрессии рекомбинантных белков.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Эффективность трансфекции клеток семенников кролика и хряка ретровирусными векторами в культуре in vitro. ^

3.2. Трансформация клеток семенников кролика in vivo посредством прямого введения ретровирусных генных конструкции.

3.2.1. Введение в семенники кроликов генной конструкции pLN

3.2.2. Введение в семенники кроликов генных конструкций, содержащих кДНК инсулина человека.

3.3. Введение генных конструкций в клетки сперматогенного эпителия семенников хряков 1П vivo.

3.3.1. Введение в семенники хряков генной конструкции pLN-GFP

3.3.2. Введение в семенники хряков генной конструкции pX-Ins

3.4. Анализ факторов, влияющих на эффективность генетической трансформации сперматогенных клеток семенников животных.

3.4.1. Влияние генной конструкции на эффективность трансформации клеток-мишеней.

3.4.2. Влияние вида животного на эффективность интеграции рекомбинантной ДНК в сперматогенные клетки.

3.4.3. Влияние дозы введения генной конструкции и способа подготовки генной конструкции на эффективность переноса рекомбинантной ДНК в клетки-мишени.

4 ВЫВОДЫ.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая трансформация половых клеток кроликов и хряков с использованием ретровирусных векторов"

Актуальность темы.

Разработка методов генетической модификации животных, основанных на использовании половых клеток в качестве векторов для переноса генов, рассматривается как альтернатива традиционному методу получения трансгенных животных - микроинъекции ДНК в пронуклеус зигот [Коржикова C.B., 2002; Савченкова И.П. и др., 2006; Новгородова И.П. и др., 2008; Эрнст JI.K. и др., 2008; Волкова H.A. и др., 2011]. Интерес к данному направлению связан, прежде всего, с природной способностью клеток сперматогенного эпителия самцов поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения [Gandolfi F., 1998]. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на:взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.

Несмотря на то, что для трансформации половых клеток (спермиев) используют ряд методов (липофекцию, электропорацию и вирусную трансдукцию), сегодня не разработаны системы, позволяющие эффективно доставлять рекомбинантную ДНК в данные клетки-мишени. Разработка эффективного метода генетической модификации половых клеток позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Одним из возможных путей решения данной проблемы является трансформация половых клеток на ранних стадиях их дифференцировки с использованием генных конструкций, полученных на основе рекомбинантных ретровирусов.

Цель и задачи.

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток хряков и самцов кроликов.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить компетентность клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков к ретровирусным векторам in vitro.

2. Осуществить трансформацию клеток сперматогенного ряда прямым введением генных конструкций в семенники кроликов и хряков in vivo.

3. Определить факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков in vivo (кратность введения, концентрация и тип используемого препарата).

4. Изучить результативность генетической трансформации сперматогенных клеток кроликов и свиней in vivo генными конструкциями, содержащими кДНК инсулина человека.

5. Исследовать характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков.

Научная новизна.

Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия кроликов и хряков посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (GFP, инсулин) в половых клетках самцов кроликов и хряков.

Практическая значимость.

Отработан метод введения генных конструкций в семенники самцов кроликов и хряков in vivo, позволяющий трансформировать клетки сперматогенного ряда с эффективностью до 0,48±0,12 и 0,57±0,10%, соответственно. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в органы-мишени: отработан способ подготовки генных конструкций для инъекций и определена концентрация генных конструкций, эффективная для интеграции рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в спермиях опытных животных по достижении ими половой зрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как способ генетической трансформации клеток сперматогенного ряда in vitro и in vivo.

• Способ подготовки, концентрация, кратность введения ретровирусных векторов в семенники кроликов и хряков in vivo как факторы, влияющие на результативность трансгенеза.

• Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия кроликов и хряков.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции: «ЕС-Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи»», Уфа, 2010 г.; на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК (Достижения науки и техники АПК, Сельскохозяйственная биология) - 2.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 102 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 11 таблиц и 16 рисунков. Библиографический список включает 161 источников, в том числе 121 на иностранных языках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лоцманова, Наталья Сергеевна, Дубровицы

1. Абдрахманов, И. К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих / Абдрахманов И. К. // Автореф. диссер. канд. биол. наук.- Дубровицы. 2001. С. 22.

2. Алиев, A.A. Экспериментальная хирургия / Алиев A.A.// М.: НИЦ Инженер. 1998. -445с.

3. Баранов, B.C. Включение макромолекул в половые клетки самцов мышей при помощи электропорации и диметилсульфоксида / Баранов B.C., Гапала И., Грияч П. // Цитология и генетика. 1990. - Т.24. - №3. - С.3-7.

4. Брем, Г. Экспериментальная генетика в животноводстве / Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. // М.:РАСХН. 1995. С.326.

5. Волкова, JT.A. Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток — упаковщиц / Волкова JI.A. // Автореф. дисс. канд. биол. наук.- Дубровицы. 2005. С. 25.

6. Волкова, H.A. Генетическая трансформация сперматогоний петухов in vitro и in vivo / Н.А.Волкова, H.A. Зиновьева, JI.A. Волкова, Т.О. Котова, Л.К. Эрнст // Доклады РАСХН,- 2011. -№1.-С. 39-41

7. Галат, В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомогательной репродукции и изучения биологии оплодотворения / Галат В.В. //Онтогенез. 2000.- Т.31. - №1. - С.5-13.

8. Гвоздь, И.М. Изучение закономерностей и оптимизация экспрессии рекомбинантных белков в молоке соматических и генеративныхтрансгенных сельскохозяйственных животных / Гвоздь И.М. // Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2004. - 21с.

9. Грезина, Н.М. Гистологические и цитологические особенности молочной железы кроликов как объекта генно-инженерных манипуляций / ГрезинаН.М. //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2004. - 21 с.

10. Данилова, Л.В. Сперматогонии, сперматоциты, сперматиды//В кн.: Современные проблемы сперматогенеза. / Данилова Л.В. // М: Наука. -1982. С.25-72.

11. Зиновьева, Н. А. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н. А.Зиновьева, А. Н.Попов, Л. К. Эрнст, Н.С.Марзанов, В.В.Бочкарев, Н.И.Стрекозов, Г.Брем // Дубровицы, 1998.- 47 с.

12. Зиновьева, Н. А. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза вживотноводстве / Зиновьева H. А., Эрнст JI. К., Брем Г. // Дубровицы: ВИЖ. 2001.С. 128.

13. Коржикова, C.B. Выделение, характеристика и транплантация сперматогоний типа А хряка / Коржикова C.B. //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2002. - 19с.

14. Кузнецов, А. В. Исследования переноса чужеродных генов сперматозоидами в яйцеклетки мидии Mytilus Galloprovincialis Lam. / Кузнецов А. В., Пиркова A.B., Дворянчиков Г.А. //Онтогенез. 2001. - Т.32. -№4. - С.309-318.

15. Меркурьева, Е.А. Генетика / Меркурьева Е.А. //М.: Агропромиздат. 1991. -247с.

16. Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М.: Медицина, 1996. - 544 с.

17. Новгородова, И.П. Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований / Новгородова И.П. // Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2004. - 21с.

18. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1989. - 368с.

19. Прасолов, B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих / Прасолов B.C. // Молекулярная биология. 1989. Т. 23, вып. 2. С. 8-12.

20. Райцина, С.С. Регенерация семенников у млекопитающих//Бюл. эксперим. биологии и медицины / Райцина С.С. // 1956. №9. - С.51-55.

21. Райцина, С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции / Райцина С.С. // М.: Наука. 1985. - 207с.

22. Райцина, С.С. Травма семенника и аутоиммунитет / Райцина С.С. // М.: Медицина. 1970. - 182с.

23. Райцина, С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих//Успехи современной биологии./ Райцина C.C.II 1967. Т.63. - С.135-153.

24. Реунов, A.A. Сперматогенез многоклеточных животных/ Реунов A.A. // М.: Наука. 2005. - 123с.

25. Реунов, A.A. Ультраструктурные аспекты сперматогенеза многоклеточных животных/ Реунов A.A. //Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Владивосток. -1998. 42с.

26. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. Пер. с нем. В .Я. Александрова, З.И. Кроковой / Ромейс, Б // М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953.- 718с.

27. Рузен-Ранге, Э. Сперматогенез у животных / Рузен-Ранге Э //М.: Мир. 1980. -255с.

28. Сурикова, К.К. К вопросу о цитологических и гистохимических изменениях при сперматогенезе//Вестник ЛГУ / Сурикова K.K.// Т.15. 1957.- С.53-71.

29. Титова, В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трасгенеза в животноводстве /В.А.Титова // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Дубровицы, 2001. - 22 с.

30. Фалин, JI.И. Развитие половых желез и происхождение половых клеток в эмбриогенезе человека//Архив анатомии, гистологии, эмбриологии/ Фалин Л.И.// 1968. Т.54. - №2,- С.3-27.

31. Филатов, Ф.П. Рекомбинантный поверхностный белок вируса гепатита В, экспонирующий иммунодоминанту мембранного белка вируса ВИЧ1/ Филатов Ф.П., Тугизов Ш.М., Савченкова И.П // ДАН. 1992. -Т.327(1). - С.172-175.

32. Хесин, Р.Б. Непостоянство генома / Хесин Р.Б// М.: Наука. 1984.-471с.

33. Хэм, А. Гистология: Пер. с англ./ Хэм А., Кормак Д// М.: Мир. -1983. -Т.5.- 296с.

34. Эрнст, Л. К. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro / Эрнст Л. К., Зиновьева Н. А., Волкова Н. А., Титова В. А // М.: РАСХН. 2003. 84 с.

35. Amann, R.P. Sperm production rates / Amann R.P //In: Johnson A.D., Gomes W.R., VanDemark N.L. The Testis. Academic Press, New York. 1970. -V.l. -P.433-482.

36. Archibald, A.L. Molekular Biological Approaches and their Possible Aplications / Archibald, A.L// in J.W. Owen and R.F.E. Axford (eds), Breeding for Disease Resistance in Farm Animals, C.A.B. International, UK. 1991. -P.100-122.

37. Arezzo, F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information / Arezzo F//Cell Biol. Int. Rep. 1989. - V.13(4). - P.391-404.

38. Bachiller, D. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells/ Bachiller D., Schellander K„ Peli J/ZMol. Reprod. Dev. 1991. - V.30(3). - P. 194-200.

39. Behr, J.P. Cene transfer with synthetic cationic amphiphiles: Prospects for gene therapy /Behr J.P//Bioconjugate Chemistry. 1994. - V.5. - P.382-389.

40. Berardino, M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male germ cells / Berardino M., Hoffher M//J. of Exper. Zoology. 1976. - V.176( 1). - P.61-72.

41. Boulo, V. Transient expression of luciferarase reporter gene after lipofection of oyster (Crassostrea gigas) primary cell cultures/ Boulo V., Cadoret J.P., Le Marrec F//Mol. Marine Biol. Biotech. 1996. - V.5(3). - P. 167-174.

42. Braskett, B.G. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization / Braskett B.G., Baranska W., Sawicki W //Proc. Natl. Acad. Sci. 1971. - V.68. - P.353-357.

43. Brinster, R.L. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation / Brinster R.L., Avarbock M.R//Proc. Natl. Acad. Sci. 1994a. -V.91. -P.l 1303-11307.

44. Brinster, R.L. Spermatogonial stem cell transplantation, cryopreservation and culture / Brinster R.L., Nagano M//Semin. Cell. Dev. Biol. -1998. V.9(4). - P.401-409.

45. Brinster, R.L. No simple solution for making transgenic mice/ Brinster R.L., Sandgren E.P., Behringer R.R., Palmiter A.F//- 1989. V.59. - P.239-241.

46. Brinster, R.L. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation / Brinster R.L., Zimmerman W//Developmental biology. 1994b. -V.91.-P.l 1298-11302.

47. Cadoret, J.P. Microinjection of bivalve eggs: application in genetics / Cadoret J.P., Gendreau S., Delecheneau J.M //Mol. Marine Biol. Biotech. 1997b. - V.6(l).-P.72-77.

48. Capecchi, M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells/ Capecchi M.R //Cell. -1980. V.22(27). - P.9139-9143.

49. Capecchi, R.L. Science / Capecchi R.L// 1989. V.244. - P. 1288-1292.

50. Capel, B. The battle of the sexes/ Capel B //Mechanisms of Development. 2000. - V.92. - P.89-103.

51. Castrillon, D.H. The human VASA gene is specifically expressed in the germ cell lineage/ Castrillon D.H., Quade B.J., Wang T.Y., Quigley C., Crum C.P//Proceedings National Academy of Sciences. 2000. - V.97. - P.9585-9590.

52. Castro, F.O. Introduction of foreign DNA into the spermatozoa of farm animals/ Castro F.O //Theriogenology. 1990. - V.34. - P. 1099-1110.

53. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: Seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal/ Clermont Y //Physiol. Rev. 1972. -V.52. - P.198-236.

54. Clermont, Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man/ Clermont Y. //Am. J. Anat. 1963. - V.l 12. - P.35-51.

55. Clermont, Y. Two classes of spermatogonial stem cells in thr monkey (Cercopithecus aethiops)/ Clermont Y//Am. J. Anat. 1969. - V.l26. - P.57-72.

56. Clermont, Y., Bustos-Obregon E. Re-examination of spermatogonial renewal in the rat by means of seminiferous tubules mounted «in toto»/ Clermont Y //American J. of Anatomy. 1968. - V.122. - P.237-247.

57. Clermont ,Y. Spermatogonial stem cells and their behavior in the seminiferous epithelium of rats and monkeys//In: Stem cells of renewing cell populanions/ Clermont Y., Hermo L. //Acad. Press. 1976a. - P.273-287.

58. Clermont, Y. Effect of a spermatogonial chalone on the growing rat testis/ Clermont Y., Mauger A //Cell and Tissue Kinetics. 1976b. - V.9. - P.99-104.

59. Clouthier, D.E. Rat spermatogenesis in mouse testis/ Clouthier D.E., Avarbock M.R., Maika S.D., Hammer R.L //Nature. 1996. - V.381. - P.418-421.

60. De la Fuente, J.Sperm mediated foreign DNA transfer experiments in different species/ De la Fuente J., Castro F.O., Hernandez 0//Presented at Biotech. USA, Ramada Renaissance Tech. Wored. Washington, DC. - November 27-29. -1990. -P.247-262.

61. De Rooij, D.G. Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells/ De Rooij D.G//Reproduction. 2001. - V.121. - P.347-354.

62. De Rooij, D.G. All yor wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask/ De Rooij D.G., Russel L.D //J. of Andrology. 2000. - V.21. - P.776-798.

63. De Rooij, D.G. Regulation of proliferation and differentiation of stem cells in the male germ line/De Rooij D.G., van Dissel-Emiliani F.M.P//Stem Cells. 1997. -P.283-313.

64. De Rooji, D.G. Spermatogonial stem cells/ De Rooji D.G., Grootegoed J.A//Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.10. - P.694-701.

65. Dobrinski, I. Germ cell transplantation from large domestic animals into mouse testes/ Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L //Molecular Reproduction and Development. 2000. - V.57(3). - P.270-279.

66. Dobrinski, I. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes/ Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L //Biol. Reprod. 1999a. -V.61. - P.1331-1339.

67. Dolci, S. Combined action of stem cell factor, leukemia inhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells/ Dolci S., Pesce M., Felici M. de/Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.35 - P. - 134-139.

68. Dym, M. Effects of x-rays on type A spermatogonia in the rat/ Dym M., Clermont Y//Anat. Rec. 1967. - V. 157 - P.238.

69. Dym, M. Role of the spermatogonia in the repair of the seminiferous epithelium following X-irradiation of the rat testis/ Dym M., Clermont Y//Amer. J. Anat. 1970. - V.128. - P.265-282.

70. Dym, M. Expression of c-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia/ Dym M., Jia M.-C., Dirami G., Price J.M//Biology of reproduction. 1995 - Y.52. - P.8-19.

71. Ewing, L.L. Int. Rev. Physiol / Ewing L.L., Davis J.C., Zirkin B.R // 1980.-V.22.-P.41-115.

72. Forster, W. Gene transfer by electroporation/ Forster W., Neumann E//In: Electroporation and electrofiision in cell biology/Press. New York and London. 1989. - P.299-318.

73. Franca, L.R. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat/ Franca L.R., Ogawa T., Avarbock M.R., Brinster R.L., Russell L.D//Biol. Reprod. 1998. - V.59(6). - P. 1371-1377.

74. Fransolini, M. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells/ Fransolini M //Mol. Reprod. and Dev. 1993. - V.34. - P.133-139.

75. Gähne, M.B. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes/ Gähne M.B., Pothier F., Sirard M.A //Mol. Reprod. Dev. 1991. -V.29.-P.6-15.

76. Gandolfi, F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals/ Gandolfi F//Trasgenic Research. 1998. - V.7. - P.147-155.

77. Gendreau, S. Transient expression of a luciferase reporter gene after ballistic introduction into Artemia franciscana (Crustacea) embrios/ Gendreau S., Lardans V, Cadoret J.P., Mialhe E //Aquaculture. 1995. - V.133. - P.199-205.

78. Gruendbaum, J. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens / Gruendbaum J., Revel E., Yarns S., Fainsod A //J. Cell Biochem. -1991. Suppl.15. - P.194.

79. Hannah-Alava, A. Premeiotice studies of spermatogenesis/ HannahAlava A//Adv. Genet. 1965. - P.157-226.

80. Heller, C.G. Kinetics of the germinal epithelium in man/ Heller C.G., Clermont Y//Recent Progr. Hormone Res. 1964. - V.20. - P.545-571.

81. Hericson, B. Translocation heterozygoty in a boar/ Hericson B., Backstrom L//Herditas. 1964. - V.52. - P. 166-170.

82. Higashi, T. Hamster cell line suitable for transfection assay of transforming genes/ Higashi T., Sasai H., Suzuki F//Proc. Natl. Sci. 1990. - V.87.- P.2409-2413.

83. Hochi, S. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs spermatozoa/ Hochi S., Ninomiya T., Mizuno A., Honma M., Yulci A //Anim. Biotech. 1990. - V.l. - P.21-31.

84. Holstein, A.F. Organisation und Regulation der Gametenreifung /Holstein A.F //HVBG. 1999. - V.4. - P. 15-30.

85. Huguet, E. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa/ Huguet E., Esponda P//Mol. Reprod. Dev. 1998. -V.51(l). - P.42-52.

86. Izadyar, F. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis/ Izadyar F., Spierenberg G.T., Creemers L.B., den Ouden K., Dirk de Rooij D.G//Reproduction. 2002. - V.l24. - P.85-94.

87. Izadyar, F. Spermatogonia! stem cell transplantations/Molecular and Cellular Endocrinology/ Izadyar F., van Dissel-Emiliani F., van Pelt A., de Rooij D.G. // 2000. V.l69. - P.21-26.

88. Oakberg, E.F. Spermatogonial stem cell reneval in the mouse/ Oakberg E.F//Anat. Rec. 1971. - V. 169. - P.515-532.

89. Ogawa, T. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules/ Ogawa T., Arechaga J.M., Avarbock M.R., Brinster R.L//International Journal of Developmental Biology. 1997. - V.41. - P. 111-122.

90. Ogawa, T. Leuorolide, a gonadotropin-releasing hormone agonist, enhances colonization after spermatogonial transplantation into mouse testes/ Ogawa T., Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L//Tissue Cell. 1998. -V.30(5). - P.583-588.

91. Ogawa, T. Transplantation of male germ line stem cells restores fertility in infertile mice/ Ogawa T., Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L//Nature Medicine. 2000. - V.6. - P.29-34.

92. Ogawa, T. Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes/ Ogawa T., Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L //Biol. Reprod. 1999a. - V.60. - P.515-521.

93. Ogawa, T. Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat/ Ogawa T., Dobrinski I., Brinster R.L. //Tissue Cell. -1999b. V.31.-P.461-472.

94. Orsi, A.M. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium of the opossum/ Orsi A.M., Ferreira A.L//Acta anat. 1978. - V.100. -P.153-160.

95. Ortavante, R. Action de la duree d' eclairment sur les processus spermatogenetuques chez le Bolier/ Ortavante R//C. r. Soc. Boil. 1956. - V.150.P.471-474.

96. Ortavante, R. Spermatogenesis and morphology of spermatozoon/ Ortavante R//In: Reproduction in domestic animals. 1959. - V.7. - P. 1-51.

97. Parreira, C.G. Development of germ cell transplants in mice/ Parreira C.G., Ogawa T., Avarbock M.R., Franca L.R., Brinster L.R., Russel L.D//Biology of Reproduction. 1998. - V.59. - P.1360-1370.

98. Passoni, L. Sperm cells mediated gene transfer: presence of foreign DNAinto bovine blastocyst obtained from in vitro fertilization/ Passoni L., Mauri L., Luciano A., Pocar P., Ajmone-Marsan//A preliminary report. 1995. - P.427-428.

99. Pittoggi, C. Complete culture system for the chick embryo / Pittoggi C., Beraldi R//Nature. 2006. Vol. 331. P. 70-72.

100. Reis, M.M. Xenogeneic transplantation of human spermatogonia/ Reis M.M., Tsai M.C., Schlegel P.N., Feliciano M., Raffaelo R., Rosenwaks Z., Palermo D//Zygote. 2000. - V.8. - P.97-105.

101. Rex, A. Hess. Spermatogenesis/ Rex A. Hess //Biol. Reprod. 1999. -V.4. - P.539-545.

102. Robertson, E.J. Using embryonic stem cell to introduce mutations into the mouse germ line/ Robertson E.J//Biol. Reprod. 1991. - V.44. - P.238-245.

103. Rodriguez, A. Exogenous cloned DNA can penetrate living sperm cells/ Rodriguez A., Castro F. O., Guillen J. et al. //Advances in Gene Technology: Feeding the World in the 21st Century. 1991. - P.53.

104. Roosen-Runge, E.C. The process of spermatogenesis in Animals/ Roosen-Runge E.C //Cembridge Univ. Press. 1977. - P.326-335.

105. Roosen-Runge, E.C. The process of spermatogenesis in mammals/ Roosen-Runge E.C//Biol. Rev. 1962. - V.37. - P.343.

106. Rose, J.K. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells/ Rose J.K., Buonocore L. and Whitt M.A. //Biotechniques. 1991. - V. 10. - P.520-525.

107. Rossi, P. A novel c-kit transcript, potentially encoding a truncated receptor, originates within a kit gene intron in mouse spermatids/ Rossi P., Marziali G., Albanesi C//Dev. Biol. 1992. - V.152. - P.203-207.

108. Roth, E. Untersuchungen zur Keimdrusenentwicklung bei mannlichen Veredelten Landschweinen/ Roth E., Smidt D//Zuchtungs kunde. 1970. - B.2. -S. 144-160.

109. Rottman, O. Liposomemediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells/ Rottman O., Antes R., Hofer P., Maierhofer G //J. Anim. Breed. Genet. 1991. - V. 109. - P.64-70.

110. Rottman, O. A method for transferring organic and inorganic substances to egg cells and somatic cells of animals and composition for use therein/ Rottman O., Hoffer P//World patent WO 87/05325. 11.09.1987. P.227-236.

111. Ruysschaert, J.-M. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells/ Ruysschaert J.-M., Ouahabi A., Willeaume V//Biochem. and Bioph. Res. Comm. 1994. - V.203(3). - P. 1622-1628.

112. Sato, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediated gene transfer/ Sato M., Iwase R., Kasai K., Tada N//Animal Biotechnology. 1994. - V.5(l). - P.19-31.

113. Spadafora, C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation. Bioassays/ Spadafora C// 1998. P.302-324.

114. Sperandio, S. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species/ Sperandio S., Lulli V., Bacci M., Forni M., Maioni B//Anim. Biotech. -1996. -V.7. -P.59-77.

115. Stewart, C.L. Stem cells from primordial genu cells can reenter the germ line/ Stewart C.L//Dev. Biol. 1994. - V.161. - P.626-628.

116. Swierstra, E.E. Cytology and kinetics of spermatogenesis in the rabbit/ Swierstra E.E., Foote R.H//J. Reprod. Fertil. 1963. - V.5. - P.309-322.

117. Tan, J.C. The dominant W42 spoting phenotype results from a missence mutation in the c-kit receptor kinase/ Tan J.C., Nocka K., Ray P., Traktman P., BesmerP //Science. 1990. - V.247. - P.209-212.

118. Tsai, H.J. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta/ Tsai H.J., Lai C.H., Yang H.S //Transgenic Res. 1997. - V.6(l). - P.85-95.

119. Uckert, W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy/ Uckert W., Walther W//Pharmac. Ther. 1994. - V.63. - P.323-247.

120. Van der Kooy, D. Why stem cells?/ Van der Kooy D., Weiss S//Science. 2000. - V.287. - P.1439-1441.

121. Watt, F.M. Out of Eden: stem cells and their niches/ Watt F.M., Hogan B.L//Science. 2000. - V.287. - P. 1427-1430.

122. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review/ Wheeler M.B//Reprod. Fertil. Dev. 1994. - V.6. - P.563-568.

123. Yamazaki, Y. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminerous tubules and subsequent electroporation/ Yamazaki Y., Fujimoto H., Ando H//Biol. Reprod. 1998. - V.59. - P.1439-1444.

124. Yamazaki, Y. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker/ Yamazaki Y., Yagi T., Ozaki T., Imoto K//J. Exp. Zool. 2000. - V.286(2). - P.212-218.

125. Yu, Z. Gene expression profiles in different stages of mouse spermatogenic cells during spermatogenesis/ Yu Z., Guo R., Ge Y //Biol. Reprod. -2003.-V.69(l).-P.37-47.