Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕМЕННИКОВ КРОЛИКОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕМЕННИКОВ КРОЛИКОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ"

На гщхгвах рукописи

НОВГОРОДОМ ИННА ПЕТРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕМЕННИКОВ КРОЛИКОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЕН ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ 03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

двссертщв ва сояссште ученой стеоеяи пвонввпбиологнчеокшсявук

Дуброанцы-2004

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители: доктор сельско хозяйствеиных наук,

академик РАСХН Лев Константинович Эрнст;

доктор биологических наук,

профессор Наталия Анатольевна Зиновьева

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, профессор Лев Петрович Дьяконов; доктор биологических наук, профессор Юрий Дмитриевич Клннскнй Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства км. В. А. Афанасьева

«7»

Защита диссертации состоится 10.00 часов, на заседании диссертационного совета Д.006 . Всероссийском государственном научно-исследовательском животноводства.

Адрес института:

142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы ^ . тел. (27)651163

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ^ животноводства.

Автореферат разослан « » Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических а

2004 года.

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы. Изучение процессов созревания и дифференцировки половых клеток семенников животных представляет огромный интерес для сравнительной эмбриологии, биологии развития, медицины и биотехнологии [М.М. Иванова и др., 2000]. Использование клеток гонад животных в биотехнологии рассматривается в качестве перспективного приема получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Несмотря на наличие целого ряда методов доставки генетической информации в эмбриональные линии животных [Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, 2002], интерес к использованию клеток семенников сохраняется, вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения /F. Gandolfí, 1998].

Среди популяции клеток спермато генного эпителия интерес исследователей в настоящее время сфокусирован на использовании стволовых клеток слерматогоний (СКС), Именно уникальное свойство многократного самообновления СКС открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток при получении трансгенных животных [R. Brínster et ai, 1998}.

Популяция диплоидных СКС постоянно обновляется, в результате инициируется комплексный процесс дифференцировки этих клеток. Все это приводит к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев. Одна СКС способна сформировать -4096 сперматид [A. Morena et а!., 1996; i. Dobrinski et а!., 2000; С. Marret et al., 2000/. Понимание молекулярных механизмов, сопутствующих транспорту экзогенной ДНК спермиями в яйцеклетки, способствует прогрессу исследований в данной области и послужит основой для массового переноса генов у различных видов животных.

Стволовые клетки сперматогонии млекопитающих, представляющие большой интерес для таких наук, как биотехнология, клеточная и генная инженерия, являются на сегодняшний день удобной моделью при проведении различных геномных манипуляций у млекопитающих.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных самцов кроликов;

- дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от стадии развития;

- выявить наиболее оптимальные стадии для пидаппиил—СКС и проведения с ними генно-инженерных исследований; МСХА |

г

- определить эффективность генетической трансформации клеток семенников кролика /п vifro с использованием ретровирусных векторов;

- изучить эффективность трансформации клеток семенников кроликов in

vivo.

1.3. Научная новизна работы. В ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно изучены гистологические особенности семенников самцов кроликов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток слерматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Показана возможность генетической трансформации клеток слерматогенного эпителия кроликов in vivo с использованием ретровирусных векторных систем.

1.4. Практическая ценность работы. Практическая значимость диссертации заключается в определении возраста самцов кроликов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество стволовых клеток сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных исследований. Изучена эффективность генетической трансформации сперматогоний кролика in vivo ретровирусными генными конструкциями, содержащими гены инсулина и гормона роста человека.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

• Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах самцов кроликов изменяется в зависимости от возраста животных;

• 6 сперматогекном эпителии семенных канальцев самцов кроликов постоянно присутствуют стволовые клетки слерматогонии, число которых изменяется в процессе онтогенеза;

• Слерматогонии семенных канальцев самцов кроликов могут быть трансформированы in vivo с использованием ретровирусных векторов;

• Эффективность генетической трансформации сперматогоний /л vivo зависит от генной конструкции и типа ретровирусного препарата.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены:

• на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых, ВГНИИЖ, п. Дубровицы, июнь 2003п

• на международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п, Быково, июль 2003г.

• на 3-й международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВГНИИЖ, п. Дубровицы, ноябрь 2003т;

• в научном отчете ВГНИИЖ, 2003 г;

• на научной конференции отдела биотехнологии ВГНИИЖ, август 2004 г;

• на международной научной конференции, посвященной 75-летию ВГНИИЖ, сентябрь, 2004 г.

1.7. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 141 странице, содержит 12 таблиц, 35 рисунков (в т.ч. 25 фотографий), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы. Список литературы включает 267 библиографических источников, а том числе 234 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Экспериментальные исследования проводили в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики сельскохозяйственных животных отдела биотехнологии ВГНИИ животноводства в 2001-2004гт,

В качестве объекта исследований были взяты разновозрастные самцы-кролики помеси пород шиншилла и белый великан, содержащиеся на экспериментальном физиологическом дворе ВИЖ в количестве 72 голов.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

Материал тканей семенников отбирали в зависимости от возраста: при полостной внутрибрюшинной операции или односторонней кастрации кроликов. Отбор тканей семенников проводили, начиная сЮ-дневного до 12-не дельного возраста с интервалом 7 дней и с 3-х до 6 месяцев - с интервалом 14 дней. Гистологические препараты семенников кроликов готовили по общепринятой гистологической методике Б. Ромейса [1953].

Микроскопию гистологических препаратов проводили с помощью микроскопа «ОрЬэп» (Германия), объектив х40, окуляр х15 с использованием системы цифровой визуализации изображений (ООО «Система для микроскопии и анализа»).

Для трансформации клеток семенников кроликов использовали ретровирусные генные конструкции, включающие ген инсулина человека под контролем промотора цитомегаловируса, и ген гормона роста человека под контролем промотора вируса саркомы Рауса (предоставлены к.б.н. И К Фоминым, Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск), 8 качестве клеток-упаковщиц использовали линию АШ2. Схема используемых генных конструкций представлена на рисунке 2.

Перед введением в семенники кроликов клетки-упаковщицы предварительно оценивались на наличие рекомбинантной вставки методом ПЦР. Трансфекцию клеток-мишеней семенников кроликов т Мго проводили путем совместного их культивирования с клетками-упаковщицами или посредством добавления к культуре клеток семенников культуральной жидкости, содержащих ретровирусный вектор рХ-!п$.

л

Характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для генно-инженерных исследований

1

Отбор проб тканей семенников от разновозрастных самцов (п=57)

а:

Я

£

п

i X II i i ? X

(О N со о» о

i X 3 X Я г É £ о Ф 3 й ÍÉ 3 S I

т- СЧ LS «о ■А и> ю ю* <о

Приготовление гистологических препаратов семенников_

3=

Трансфекция m vitro

_ín=3)_

Получение КК семенников (п=3) 1

Морфологическая оценка клеток

Окраска гематотоксилин-эозином

Окраска по Фельгину

Выявление оптимального возраста для проведения бмоинже-нерных манипуляций

I

Изучение морфологии сперматогенеза кроликов

X

Определение возраста с тах количеством сперматогоний

Определение отн. количества ДНК клеток сперматогенного _эпителия_

i

Введение рек. век. в семенники кроликов in vivo (n=12)

I

Отбор проб тканей семенников через 7-14 дней

Анализ трансформации клеток семенников

I

Иммуногистохимические исследования

Анализ интеграции чДНК в клетках сперматогониях _кроликов_

Статистическая обработка данных

Рис.1. Схема исследований.

pX-RSVhgh

бООЬо w LTR

410

1530

T E F.S

360

sv"

800 neo

600

f LTR I

pX-ins

бООЬо 900 LTR j

S

500 360

ins

p

(SVX)

800 neo

600 LTR Г s

Рис. 2. Схема используемых генных конструкций. RSV - промотор вируса саркомы Рауса; SV - промотор ранних гонов вируса SV40; neo - ген неомицинфосфотрансферазы из транспозона Тп5.

В - ВатН/. Е - EcoRt, S • Sact, SI - Sail, X - Xhol.

Трансформацию клеток семенников кроликов in vivo проводили генной конструкцией, включающей ген гормона роста человека, на самцах в возрасте 9 недель (п=6) и генной конструкцией, содержащей ген инсулина человека, - на животных в возрасте 8 недель {п=6).

Ретро вирусные векторы вводили в паренхиму семенников кроликов (множественное введение 5-8 инъекций на семенник). В качестве источника конструкций использовали взвесь клеток-упаковщиц в среде DMENI, с предварительно заблокированным митозом митомицином С, и супернатант, полученный при культивировании линии клеток, продуцирующих рекомбинантные ретровирусы, освобожденный от флотирующих клеток и их остатков высокоскоростным центрифугированием, дополненные полибреном из расчета 8 мкг/мл, в количестве, соответственно, 1 млн и 0,5 мл (105) на семенник. В зависимости от используемого вирусного препарата для каждой из генных конструкций были сформированы две опытные группы: 1 - введение клеток-упаковщиц (п=3), 2 - введение культуральной жидкости (п=3).

Экспрессию рекомбинантных генов в клетках семенников кроликов определяли иммуногистохимическим методом при помощи набора Novocastra (Sigma, США). Клетки, синтезирующие рекомбинантный вирус, окрашиваются в красно-коричневый цвет.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Гистологические исследования семенников кроликов.

3.1.1. Изучение морфологии сперматогенеза кроликов и выявление возраста с максимальным числом сперматогоний.

Гистологические исследования семенников кроликов проводили в 19 возрастных категориях (от 10 дней до 12 месяцев) на самцах в количестве 56 голов.

Исследования срезов семенников кроликов в возрасте 10-ти дней указывают на то. что основную массу клеток в семенных канальцах составляют мелкие с небольшим темным ядром клетки Сертоли, число которых составляет 16,7±0,44. Кроме того, в канальцах обнаруживаются крупные первичные половые клетки (гоноциты) -11,6+0,52 (фото 1).

В возрасте 14-30 дней (фото 2) выявлены сперматогонии типа А со светлой крупной цитоплазмой, заметны делящиеся формы сперматогоний в стадиях профазы и метафазы, число которых изменяется от 7,0±0,41 до 13,1 ±0,55, число клеток Сертоли изменяется незначительно - от 23,1+0,61 до 23,2+0,75,

На срезах семенников самцов 5-недельного возраста начинают отмечаться некоторые изменения, наблюдается размножение сперматогоний. Семенные канальцы представлены двумя типами сперматогоний: тип А и промежуточный. Число сперматогоний типа А достигает 12,6±0,36, промежуточных дифференцирующихся сперматогоний - 7,3+0,42. Число клеток Сертоли уменьшается до 20,2+0,58 (фото 3).

Канальцы кроликов 7-недельного возраста представлены тремя типами сперматогоний: тип А (10,7±0,32), промежуточный (8,7±0,52) и В (6,6±0,36). Происходит дальнейшая физиологическая гибель (апоптоз) некоторого числа клеток Сертоли (13,6*0,45) (фото 4).

С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка (11,2±0г47) (фото 5), а с 3,5 месяцев -сперматоциты второго порядка (13,9±0,70) и сперматиды (22,4±0,89) (фото 6).

В канальцах кроликов 5,5-месячного возраста сперматогенные клетки достигают уровня развития поздних грушевидных сперматид и зрелых спермиев (фото 7). Число клеток сперматогенного эпителия в этом возрасте колеблется в следующих пределах: сперматогонии типа А - 5,2±0,41, промежуточные -4,6±0,28. тип В - 4,4±0,28; сперматоциты первого порядка - 65,8±0,Э4 и второго -18,9±0,37, сперматиды - 72,4±0,52, спермин - 51,5±0,61 и клетки Сертоли -7,2±0,58.

В возрасте 6-ти и 12-ти месяцев (фото 8) число клеток слерматогенного эпителия значительно не изменяется, и, соответственно, составляет: сперматогонии типа А - 4,7±0,39 и 4,8±0,38, промежуточные - 4,4±0,31 и 5,0±0,38, тип В - 3,9±0,65 и 3,7±0,32, сперматоциты первого порядка - 65,8±0,72 и 65,9+0,80, второго - 19,2±0,44 и 18,8+0,44, сперматиды - 76,1±0,89 и 74,5*0,61, спермин-Э1,1±0,71 и 91,4±0,59 и клетки Сертоли - 6,7±0,27 и6,4±0,45.

Данные о распределении клеток слерматогенного эпителия семенников кроликов в динамике представлены на рисунке 3,

Рис. 3. Морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев кроликов в динамике. 1 - сперматогонии, 2 -сперматоциты 1-го порядка, 3 - сперматоциты 2-го порядка, 4 - сперматиды, 5 - спермии, 6 - клетки Сертоли.

Как проиллюстрировано на рисунке 3, в возрасте 6-11 недель сперматогонии являются основным типом клеток семенных канальцев самцов кроликов. Максимальное их число выявляется в семенниках кроликов в возрасте 9 недель. С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев - сперматоциты второго порядка и сперматиды. В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые выявляются спермии, число которых увеличивается к достижению животными возраста 6-и месяцев и остается практически неизменным в возрасте 12-и месяцев.

Морфологическая характеристика тканей семенников у разновозрастных кроликов представлена в таблице 1. Из данных таблицы 1, следует, что в период с 10-и дневного до 12-и недельного возраста наблюдается относительно постоянное число семенных канальцев на единице площади ткани семенника при постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе канальца с 23,3 до 56,9. В последующий интервал с 3,5 до 6 месяцев, соответствующий периоду полового созревания, отмечается уменьшение числа семенных канальцев с 142,9 до 30,6 на 1 ммг.

Табл. 1. Морфологическая характеристика тканей семенников.

Возраст кроликов Среднее число семенных канальцев на 1 мм2, л Среднее число клеток сперматогенного эпителия в семенном канальце, п Доля сперматогенной ткани в семенном канальце, %

Ю дн 208,2±0,34 28,3+0,59 61,3±0,088

14 дн 179.6±0,44 30,1 ±0,93 61,7±0,088

21 дн 165,3±0,33 ЗЭ,2±0,91 61,0±0,089

30 ДН 159,2±0,44 36,3±1.05 61,0±0,089

5нед 159,2±0,38 40,1 ±1,04 65,8±0,086

бнед 173,5±0,36 37,8±0,51 68,0±0,085

7 нед 169,4±0,44 39,6±0,77 63,3±0,088

8нед 179,6*0,41 40,7±1,35 61,3±0,068

9нед 183,7±0,35 40,1 ±1,02 62,5±0,088

Ю нед 165,3±0,40 51,8±1,42 63,7±0,087

11 нед 161,2±0,29 56,5±1,33 60,2±0,089

12 нед 167,3+0,34 56,9±1,26 5б,8±0,090

3,5 мес 142,9±0,38 101,7±1,35 58,8±0,089

4 мес 104,1 ±0,40 116,2+1,83 56,8±0,090

4,5 мес 95,9+0,32 163,1 ±1,5 56,5+0,090

5 мес 87.7+0,39 163,9±1,62 56.1 ±0,090

5,5 мес 65,3±0,26 230,0± 1,76 58,8±0,089

6 мес 30,6±0,17 271,910,98 53,0*0,091

12 мес 28,6±0,17 270,5±1,26 55,540,090

Эти изменения вызваны увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в канальцах, и, как следствие, увеличением объема канальцев. Доля сперматогенной ткани у исследуемых возрастных групп кроликов значительно не изменяется.

Существенное внимание в наших исследованиях было уделено СКС, относящимся к дифференцирующимся сперматогониям типа А. Как показано на рисунке 4, с 10-ти дневного до 4-х недельного возраста сперматогонии типа А являются единственным типом сперматогонии, имеющихся в семенных канальцах кроликов.

Г иСп.тапаА о Сл. про»еж. тага пСа топа В |

1М% Г Ь..........—■ ------—---------

90% -^ 80% М 70% -§ 60% ■ I 50% ° 40% • У 30% --* 20%-10% ■■

0% 4- . . ............. . ,

сч ^ ^ о" т «я

аоэраст

Рис. 4. Распределение сперматогоний разных типов на поперечных срезах семенных канальцев разновозрастных «роликов.

Их число в зависимости от возраста варьирует и достигает максимального значения в возрасте 4-х недель (в среднем 13,1 клеток), С 5-недельного возраста происходит уменьшение числа сперматогоний типа А (12,6) и к 6-ти месяцам уменьшается в 2,7 раза по сравнению с 4-х недельным возрастом, Сперматогонии промежуточного типа и типа В идентифицируются в семенниках кроликов, начиная с 5-и и 7-и недель, соответственно.

3.1.2. Определение относительного количества ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия.

Одной из задач проведенных исследований было определение относительного количества ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия у разновозрастных самцов-кроликов. Этот показатель является критерием пролифератмвной активности клеток. Ядра клеток семенников характеризовались различными величинами относительного количества ДНК.

В результате экспериментов было установлено (рисунок 5), что относительное количество ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия самцов в возрасте от 10 дней до 9 недель заметно увеличивается: у сперматогоний типа А в 1,5 раз (от 589 до 884) и с 5 недель у промежуточного типа -1,9 раз {от 326 до 634).

Дпя этих типов клеток в 9-недельном возрасте содержание ДНК является максимальными, что говорит о высокой пролиферативной активности клеток. Относительная плотность сперматогоний типа В от 7 до 9-недельного возраста изменяется незначительно (от 292 до 328), а в 3,5 месяца достигает максимальной величины (547,8+0,4).

Содержание ДНК в клетках Сертоли с 10-дневного до 8-недельного возраста снижается от 422,8±0,3 до 272,3±0,6, а к 9-неделям увеличивается в 1,6 раз, по сравнению с предшествующим периодом.

При анализе рисунка 5 выявлено, что в 4-месячном возрасте наибольшей пролиферативной активности достигают показатели сперматоцитов первого порядка и клеток Сертоли, соответственно, 499,4±0,5 и 708,3±0,4.

адоо

^ А, \ / РЧ

500 400 ВГ1 ш-м 1 к-Ь- . ,¥ ж V

/ !

1

200 100 / Г 0 0 ' """

/ / / .

У *

10 14 21 4 !> 6 дней див* день нед. нвд. мед. 7 в 9 10 11 Нвд. Н«Д. Нвд, 12 3,5 4 4Ц5 £ С 12 над, Мее. «вс. м«с, нее. иес, мае,

"■>"Слермат- типа А I "Х-" Сперматоциты 1 порядка [ Спермин ' Спермаг промеж, типа ' " Спермат. тилз В 0= * Спер»*атоциты 2 порядка "♦"Слерматидь* ^ Кяетчи Сертоли

Рис. 5. Показатели относительного количества ДНК ядер клеток сперматогвнного эпителия у разновозрастных самцов-к рол и ко е.

С 5,5-месячного возраста а семенных канальцах представлены ее» типы клеток сперматогенного эпителия, В этом возрасте отмечена наибольшая пролиферативная активность сперматоцитов второго порядка (432,1±0,4). В 6 и 12 месяцев показатели относительного количества ДНК ядер сперматид (43,9±0,9 и40,5±0,7) и спермиев (58,9±0.8 и 59,4±0,5) являются наименьшими.

Фото 1. Семенные канальцы 10-дневного кролика. 1 - первичные половые клетки (гоноциты), 2 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 2. Семенные канальцы 30-дневного кролика. 1 - сперматогония, 2 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска; гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 3. Семенные канальцы 5-недельного кролика. 1 - сперматогония типа А, 2 - сперматогония промежуточного типа, 3 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окулярх15.

Фото 4. Семенные канальцы 7-недельного кролика. 1 - сперматогония типа А, 2- сперматогония промежуточного типа, 3 - сперматогония типа В, 4 - клетка Сертопи. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 5. Семенные канальцы 1 (/--недельного кролика. 1

сперматогония типа А, 2 - сперматогония промежуточного типа, 3 -сперматогония типа В, 4 - сперматоцит 1 порядка, 5 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 6. Семенные канальцы 3,5-месячно« о кролика. 1

сперматогония, 2 • с перматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 -сперматида, 5 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 7. Семенные канальцы 5,5-месячного кролика.

1 - сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 -сперматида, б - спермин, 6 - клетка Сертопи. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска:гематоксилин-эозин. Увеличение:объективх40, окулярх15.

£ * г

Фото 8. Семенные канальцы 12-месячного кролика, 1 -

сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 -сперматида, 5 - спермии, 6 - клетка Сертопи. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 9. Срезы семенников кроликов при иммуногистохимических исследованиях (контроль). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х10.

Фото 10. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце 2 трансформированных слерматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х10.

Фото 11. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце 3 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр хЮ.

Фото 12. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В центре семенной каналец с 3-я трансформированными сперматогониями. В левом верхнем углу 4-и трансформированные клетки и нижнем - 1 (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.

Фото 13. Срезы семенников кроликов при иммуногистохимических исследованиях (контроль). Окраска гематоксипин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр хЮ.

Фото 14. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце один трансформированный слерматогоний (клетки указны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр хЮ.

Фото 15. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 14 день). В семенном канальце 2 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). О краска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр хЮ.

Фото 16. Срезы семенников кроликов с трансформированными клетками (опыт, 14 день), В семенном канальце 3 трансформированных сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение; объектив х40, окуляр хЮ.

3.2. Получение и характеристика культуры клеток тканей семенников кроликов.

Экспериментальными данными было установлено, что возраст от 10-и дней до 9-и недель является оптимальным для проведения различных биоинженерных манипуляций у кроликов, так как в этот период генеративные клетки семенных канальцев представлены только сперматогониями и наблюдается их наиболее высокая лролиферативная активность. Именно, поэтому, в результате проведенных исследований была изучена культура клеток семенников, полученная от самцов в возрасте 8 недель в трех последовательных пассажах.

При анализе клеточной популяции были выявлены пять типов клеток, отличающиеся по морфологии: половые клетки - сперматогонии округлой формы с крупным сферическим ядром и достаточно узкой цитоплазмой, клетки Сертоли неправильной формы с крупным ядром и размытой формой цитоплазмы, клетки Лейдига неправильной формы, а также фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму и маленькие сферические миоидные клетки.

В зависимости от пассажа процентное отношение клеток в культуре тканей семенников изменялось (рисунок 6). Наиболее многочисленной группой клеток культуры семенников в трех пассажах были клетки Сертоли. В третьем пассаже по сравнению с первым, значительно увеличилось число фибробластоподобных клеток - в 3 раза. Клетки Лейдига и миоидные клетки в третьем пассаже отсутствовали.

Рис. 6. Число клеток культуры семенников в зависимости от пассажа, %. КС - клетки Сертоли, КЛ - клетки Лейдига.

Было установлено, что в процессе культивирования происходила постепенная утеря сперматогоний. Так, если в первом пассаже на их долю приходилось 29%, то в третьем пассаже их число уменьшилось в 6 раз. По всей видимости, для поддержания сперматогоний в культуре требуется введение в среда дополнительных ростовых факторов.

З.Х Трансфекция клеток семенников кроликов ретровирусными векторными системами in vivo.

Следующим этапом в работе явилось изучение эффективное™ генетической трансформации половых клеток семенников кроликов in vivo. С этой целью были сформированы группы животных в зависимости от используемой генной конструкции и типа ретровирусного препарата (культуральная жидкость или клетки-упаковщицы) (таблица 2).

Табл. 2. Инъецирование ретровирусных векторных систем в семенники кроликов in vivo.

Генная конструкция pX-RSVhGH pX-Ins

Группа 1 2 1 2

Препарат кк КЖ кк КЖ

Количество животных 3 3 3 3

Возраст 9-10 нед 9-10 нед 8 нед 8 нед

Линия клеток-упаковщиц АМ12 АМ12 АМ12 АМ12

Объем суспензии, мл 0,5 0,5 0,5 0,5

Концентрация клеток 1 млн 10a КОЕ/мл 1 млн 10* КОЕ/мл

Анализ наличия трансформированных клеток проводили через 7 и 14 дней после инъекции с использованием иммуногистохимических исследований,

3.3.1. Изучение эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX'RSVhGH.

При анализе интеграции рекомбинантной генной конструкции, содержащей гормон роста человека (hGH), in vivo положительные сигналы наблюдались в пробах тканей семенников, отобранных от самцов через 7 дней. В гистологических срезах семенников, отобранных от кроликов, которым вводили супернатант и у животных на 14 день после инъекции, клеток с характерным красно-коричневым окрашиванием выявлено не было.

В образцах срезов семенников, взятых от животных первой группы (7-ой день после инъекции): положительные сигналы были обнаружены в 12 из 20

проанализированных срезах. Число трансформированных клеток в одном семенном канальце колебалось от 1 до 4 (фото 9-12}. Число окрашенных сперматогоний, встречающихся на одном срезе, достигало 11.

При иммуногистохимических исследованиях гмстосрезов семенников кроликов трансформированными были только сперматогонии. Ни в одном из семенных канальцев не было выявлено трансформированных клеток Сертоли. По всей видимости, это связано с активной пролиферацией сперматогоний в этот период и, наоборот, с низкой пролиферативной активностью клеток Сертоли.

Анализ полученных результатов показал, что минимальное число трансформированных канальцев составило от 0,33±0,03 до 1,85±0,08. Среднее значение трансформированных канальцев составило 1,17+0,16, в то время как среднее значение для всех канальцев - 0,70±0,16.

При инфицировании клеток семенников in vivo клетками-упаковщицами, продуцирующими рекомбинантаый ретро вирус pX-RSVhGH, максимальная величина частоты генетической трансформации сперматогоний составила 5,8%, минимальная -1,9%.

Согласно результатам, представленным в таблице 3, показатель эффективности генетической трансформации при использовании ретровирусного вектора pX-RSVhGH достигал 2,7*10"3.

Табл. 3. Эффективность генетической трансформации клеток семенников кроликов ín vivo генной конструкцией pX-RSVhGH.

Показатели 1 группа 2 группа

кк КЖ

Число трансформированных сперматогоний 80 -

Среднее число клеток в семенном канальце 48,S -

Число семенных канальцев на срезе 605,0 -

Общее число клеток на срезе 29,4* 103 -

Эффективность трансформации клеток 2,7*10* -

Полученные нами результаты свидетельствуют о возможности успешной трансформации клеток семенников кролика in vivo с использованием ретровирусной генной конструкции pX-RSVhGH, содержащей ген инсулина человека.

3.3.2. Изучение эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов /л vivo генной конструкцией pX-lns,

И ммуногистохим ическое исследование семенников кроликов через 7 и 14 дней после введения генной конструкции инсулина выявило наличие рекомбинантной ДИК у опытных животных, как при использовании клеток-упаковщиц, так и культуральной жидкости.

Через 7 дней после инъекции клеток-упаковщиц число трансформированных канальцев колебалось от 0,38 до 1,32%, а при инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом - от 0,21 до 0,64%. Результаты, полученные на 14 день составили, соответственно, от 0,50 до 2,59% и от 0,38 до 0,93%.

У самцов на 7 день после инъекции клеток-упаковщиц соответствующее окрашивание клеток наблюдалось в 9-и из 20-и проанализированных срезах. Число трансформированных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 3 (фото 13-16). В одном из срезов были выявлены 7 окрашенных слерматогоний в разных канальцах. При инъецировании сулернатанта очаги окрашивания наблюдались в 4-х срезах, при этом число трансформированных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 2.

Анализ, проведенный через 14 дней после инъекции, показал наличие трансформированных слерматогоний при введении клеток-упаковщиц в 9-и срезах из 20. При этом в одном из срезов было обнаружено 14 трансформированных клеток. При введении культуральной жидкости наибольшее число окрашенных клеток на одном срезе составляло 5.

Максимальная частота интеграции слерматогоний в трансформированных семенных канальцах через 7 дней после инъекции клеток-упаковщиц достигала 4,1±0,1%, минимальная - 3,2±0,1%. Показатели частоты интеграции при использовании супернагганта варьировали от 3,4±0,1 до4,0±0,1%. В результате данных, полученных через 14 дней, были выявлены колебания частоты интеграции слерматогоний при генетической трансформации клетками-упаковщицами от 3,3±0,1 до 4,0±0,1%. При инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом максимальная величина составила 3,5±0,1%, минимальная -3,3+0,1%.

Сравнительный анализ эффективности трансформации клеток семенников кроликов irt vivo при использовании вектора, содержащего ген инсулина, выявил различия в способности клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус, инфицировать клетки-мишени в зависимости от используемого вирусного препарата.

Как следует из данных таблицы 4, инъекция клеток, упаковывающих ретровирусные векторы, в семенники кроликов обуславливала более высокую

частоту генетической трансформации по сравнению с использованием культурапьной жидкости.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что число трансформированных сперматогоний при практически одинаковом среднем числе клеток в семенных канальцах при инъецировании клеток-упаковщиц, как на 7 (33 клетки), так и на 14 день (67 клеток) после инъекции было в 3 раза выше, чем при использовании супернатзнта (соответственно, 11 и 23 клетки).

Табл. 4. Показатели частоты генетической трансформации клеток-миикней генной конструкцией рХ-1п$.

Параметры через 7 дней через 14 дней

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

КК КЖ КК КЖ

Число трансформированных сперматогоний 33 11 67 23

Среднее число клеток в семенных канальцах 29,4 28,3 29,3 29,2

Среднее число семенных канальцев на срезе 497,9 535,4 559,1 517,7

Общее число клеток на срезе 14,6*10* 15,2*1 О^1 16,4*103 15.П03

Эффективность трансформации 2,26*10"3 0,72-10"^ 4,1*10^ 1,5*10'3

Так, при использовании клеток-упаковщиц на 7 день эффективность трансформации клеток семенников кроликов первой группы составила 2,26*10"3 и, была в 3,1 раза выше, по сравнению с показателем, полученным при инъекции культуральной жидкости (0,72*10"3).

На 14 день после инъекции, частота генетической трансформации при использовании клеток-упаковщиц составила 4,1'Ю"3, что было в 2,7 раз выше по сравнению с использованием супернатанта (1,5'Ю"3).

Анализ полученных данных в зависимости от времени после инъекции показал, что частота генетической трансформации была неодинаковой и увеличивалась к 14 дню в 1,8 раз при использовании клеток-упаковщиц и 2,0 раза при введении культуральной жидкости. Эффективность трансформации сперматогоний происходила за счет увеличения их числа, что еще раз доказывает наиболее высокую пролиферативную активность этого типа клеток и способность инфицирования именно стволовых клеток сперматогоний.

Таким образом, полученные данные позволяют считать наиболее эффективным введение экзогенной ДНК в виде клеток-упаковщиц, так как при его использовании получен лучший результат.

3.3.3. Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов /л vivo при использовании генных конструкций pX'RSVhGH и pX-Ins.

Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кроликов в зависимости от генной конструкции показал, что вектор, несущий ген инсулина человека, оказался наиболее способным при переносе ДНК в половые клетки кроликов, по сравнению с вектором, несущим ген гормона роста человека (таблица 5).

Так, на 14 день после инъекции клеток-упаковщиц pX-RSVhGH, трансформации сперматогоний не наблюдалось ни в одном из семенных канальцев. Напротив, при использовании линии клеток-упаковщиц рУ-íns, интеграция генных конструкций в клетках семенников была выявлена, как на 7, так и на 14 день после введения. При инъекции в семенники культуральной жидкости pX-RSVhGH трансформации клеток вообще не наблюдалось.

Хотя частота интеграции генной конструкции pX-RSVhGH в сперматогонии кроликов in vivo была ниже по сравнению с pX-Ins (3,0% и 3,5%), но частота генетической трансформации, наоборот, была выше на 17,3%, что обуславливалось увеличением числа трансформированных канальцев, как на трансформированных, так и на всех срезах, соответственно, в 2,2 и в 1,6 раза.

Табл. 5. Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации клеток семенников кролика in vivo генными конструкциями pX-RSVhGH и pX-Ins.

Показатели Конструкция Группы животных

KK КЖ

7дн. 14 дн. 7 ДН. 14 дн.

Частота интеграции*, % pX-RSVhGH 3,0 - -

pX-Ins 3,5 3,5 3,6 3,4

Число трансформиров. канальцев от числа канальцев во всех срезах, % pX-RSVhGH 0,70 - - -

pX-lfis 0,32 0,63 0,08 0,22

Число трансформиров. канальцев от числа канальцев pX-RSVhGH 1.16 - - -

в трансформ, срезах, % pX-Ins 0,71 1,36 0,41 0,62

Общая эффективность (частота генетической трансформации) pX-RSVhGH 2,7*1 О*3 - - -

pX-Ins 2,3*10"3 4,1*10"3 0,7*10"3 1,5*10"3 .....

* число трансформированных клеток от числа клеток а трансформ, канальцах, выраженное в %.

Сопоставляя данные об общей эффективности генной конструкции рХ-1пэ на 7-ой и 14-ый дни после инъекции, следует отметить увеличение частоты генетической трансформации на 14-ый день после инъекции & 1,8-2,1 раза, что при практически равной частоте интеграции было обусловлено увеличением доли трансформированных канальцев на срезах.

Таким образом, полученные нами данные показывают, что эффективность генетической трансформации клеток семенников кроликов зависит от генной конструкции, типа используемого препарата и времени после инъекции в семенники.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что в период с 14-и дневного до 12-и недельного возраста наблюдается относительно постоянное число семенных канальцев на единице площади ткани семенника (от 159,2±0,38 до 183,7±0,35 на 1 мм1) при постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе канальца с 28,3±0,59 до 56,9±1,26. В возрасте от 3.5 до 6 мес. происходит уменьшение числа семенных канальцев с 142,9±0,38 до 30,6±0,17 на 1 мм2. Эти изменения вызваны увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в канальцах от 101,7±1,35 до 271,910,98. Доля сперматогенной ткани у исследуемых возрастных групп кроликов значительно не изменяется.

2. Показано, что в возрасте от 10 дней до 4-х недель в семенных канальцах кроликов наряду с клетками Сертоли присутствует единственный тип генеративных клеток - сперматогонии типа А, В зависимости от возраста их число варьирует и достигает максимального значения в возрасте 4-х недель (в среднем 13,1+0,55 клеток в 1 канальце). Наибольшее число сперматогоний промежуточного типа отмечается в возрасте 6-и недель (9.2+0,47), а типа В - в 11 недель (11,4±0,59), С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев -сперматоциты второго порядка и сперматиды. Максимальное число сперматоцитов первого порядка наблюдается в возрасте 5,5-6 месяцев (65,8*0,94). Число сперматоцитов второго порядка и слерматид достигает максимальных значений в 6-и месячном возрасте (соответственно, 19,2±0,44, 76,1±0,89). В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые выявляются слермии, число которых увеличивается к 6-и месячному возрасту (91,1+0,71) и остается практически неизменным в возрасте 12 месяцев (91,4+0,59).

3. Выявлено, что оптимальным периодом для проведения генно-инженерных исследований является возраст от 10 дней до 9 недель, когда сперматогонии являются единственным типом генеративных клеток в семенных

канальцах самцов кроликов. Максимальное число слерматогоний отмечается в период 8-9 недель, когда на их долю приходится, соответственно, 65,7 и 71,3%. Установлено, что в период от 10 дней до 9 недель сперматогонии характеризуются наибольшей пролиферативной активностью, что является одним из определяющих факторов для успешного переноса генов посредством рекомбинантных ретровирусных векторов.

4, В результате исследований полученной и охарактеризованной нами первичной культуры клеток семенников кроликов в возрасте 8-и недель, установлено, что в процессе культивирования происходит потеря слерматогоний. Если на их долю в первом пассаже приходится 29,2%, то в третьем пассаже их число снижается в б раз и составляет 1,8%, Показано, что частота генетической трансформации первичной культуры клеток семенников in vito при использовании клеток-упаковщиц была ниже 3,0*10"4.

5. Выполнена трансформация слерматогоний кролика in vivo генными конструкциями pX-íns и pX-RSVhGH, несущими, соответственно, гены инсулина и гормона роста человека. Клетки, трансформированные pX-RSVhGH, выявлялись только на 7-ой день после инъекции клеток-упаковщиц в семенники кроликов с частотой 2,7*10"3. Частота генетической трансформации слерматогоний вектором pX-tns на 7-ой день после введения кпеток-упаковщиц или культуральной жидкости составляла, соответственно, 2,3*10° и 0,7*10"3, Показано увеличение эффективности трансформации слерматогоний кролика на 14-ый день после инъекции в 1,8-2,1 раза, соответственно, до 4,1*'10"3и 1,5*10"3 Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного внедрения генных конструкций в сперматогонии кролика in vivo посредством рекомбинантных ретровирусов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Для получения оптимальных результатов по генетической трансформации слерматогоний кролика при генно-инженерных исследованиях рекомендуем использовать самцов в возрасте от 10-и дней до 9-и недель, когда в семенных канальцах семенников присутствует наибольшее число клеток этого типа и отмечается их наиболее высокая пролиферативная активность.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Ендоеицкая И.П. (Новгородова И.П.), Гистологические исследования сперматогенеза кроликов I! Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», - РАМЖ, п. Быково. - 2003 г. -В.Э. - С.173-174,

2. Ендоеицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение развития сперматогенеза у кроликов // Материалы 52-ой научной конференции молодых ученых и аспирантов: «Молодые ученые - животноводству страны». - ВИЖ, п. Дубровицы. - 2004. - С.62-64.

3. Ендоеицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение сперматогенеза кроликов ОгусКИадиз сип1си1ив // 3-я международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, п, Дубровицы. - 2003 г. - С106-108.

4. Ендоеицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение сперматогенеза кроликов посредством анализа гистологических препаратов срезов семенных канальцев // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», - ВИЖ, п. Дубровицы - 2003 г. - В.2. - С.27-34.

5. Ендоеицкая И.П. (Новгородова И.П.), Л.К. Эрнст. Использование спермиев и сперматогоний в получении трансгенных животных // Достижения науки и техники АПК. - 2003 г. - №10. - С.20-23,

6. Ендоеицкая И.П. (Новгородова И.П.), Зиновьева НА, Эрнст Л.К. Эффективность трансформации сперматогоний у кроликов II Материалы междунар. научно-практической конферен. к 75-летию ВИЖа: «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки / Труды ВИЖа. - В.62, - Т.З. -Дубровицы, - 2004. - С, 180-185.

Издательство РУЦЭ6ТЖ 142132, Московская обл.. Подольский р-н. п. Дуброеицы ТвЛ. (8-27) 65-14-07, 65-14-24

Сдано а набор 2.09.2004 Заказ Тираж 100 экз.