Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций"

На правах рукописи

005055641

БЕЛОГЛАЗОВА Елена Викторовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕТУХОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

03.02.07-Генетика 03.03.01 - Физиология

2 2 НОЯ 2012

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская обл. 2012

005055641

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна;

доктор биологических наук Волкова Наталья Александровна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Коршунова Людмила Георгиевна ГНУ В НИТИ птицеводства, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии;

доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич - пенсионер.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится «■ 'И » декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ.

Автореферат разослан « ноября 2012 года

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Использование клеток гонад рассматривается как один из перспективных методов получения трансгенных животных, в том числе птицы [Коржикова C.B., 2002; Новгородова И.П. и др., 2008; Эрнст JI.K. и др., 2008; Волкова Н.А. и др., 2011; Лоцманова Н.С., 2011]. Несмотря на наличие целого ряда методов доставки рекомбинатной ДНК в эмбриональные клетки птиц [Sang H., 2004. Petitte J. et al., 2004; Kamihira M. et al., 2005; Kawabe Y. et al., 2006; Сураева H.M. и др., 2009; Эрнст JI.K. и др., 2009], интерес к использованию клеток семенников сохраняется вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в раде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.

Среди всех типов клеток сперматогенного эпителия интерес исследователей сосредоточен на использовании стволовых клеток сперматогоний. Популяция данного типа клеток постоянно обновляется, что открывает широкие возможности реализации их потенциала при получении трансгенной птицы: репликация сперматогоний инициирует комплексный процесс их дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев.

Вместе с тем, не смотря на ряд преимуществ использования половых клеток в качестве объекта для адресной доставки ДНК, на сегодняшний день нет однозначных данных о молекулярных механизмах транспорта генов в данные клетки-мишени и эффективных способах их трансформации. Решение данной проблемы позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных петухов.

2. Дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от возраста петухов.

3. Выявить оптимальный возраст петухов для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогеного эпителия.

4. Определить эффективность генетической трансформации клеток семенников петухов in vitro с использованием ретровирусных векторов.

5. Изучить результативность генетической трансформации сперматогенных клеток петухов in vivo.

Научная новизна. Впервые подробно изучены гистологические особенности семенников петухов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда семенников in vivo.

Практическая значимость. Определен возраст петухов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество сперматогоний -перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных манипуляций. Отработан метод введения генных конструкций в семенники петухов in vivo. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в данный орган-мишень. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке: наличие рекомбинантной ДНК установлено в спермиях по достижении половой зрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

• Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах семенников петухов изменяется в зависимости от возраста.

• В сперматогенном эпителии семенных канальцев петухов постоянно присутствуют стволовые клетки сперматогонии, число которых изменяется в процессе онтогенеза.

• Клетки сперматогенного эпителия петухов могут быть трансформированы in vivo с использованием ретровирусных векторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: научной конференции «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра», С.-Петербург, 2009, 2010 г., «Высокие технологии, исследования, промышленность», С.-Петербург, 2010 г., научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 3.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 9 таблиц, 28 рисунков. Список литературы включает 150 источников, в том числе 112 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных и физиологическом дворе ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Примечание: ПЦР - полимеразная цепная реакция, ИГХ -иммуногистохимия

Рис. 1. Схема исследований

Объектом исследований служили петухи кросса «Птичное». Образцы семенников отбирался при убое птицы. Гистологические исследования семенников петухов (п=95) проводились в 19 возрастных категориях (от 1 недели до 12 месяцев). В каждой группе было исследовано по 5 голов.

Для фиксации ткани семенников использовался раствор Буэна. Дегидратацию исследуемых образцов ткани и их запивку в парафин проводили по общепринятой методике [Ромейс Б., 1953]. Срезы семенников

готовили на ротационном микротоме и окрашивали растворами гематоксилина и эозина. Анализ полученных гистопрепаратов осуществляли на микроскопе «Opton» (Германия), объективы х40, х16, с использованием программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»). При анализе учитывались только семенные канальцы, имеющие округлую форму. От каждого опытного петуха было проанализировано не менее 30 семенных канальцев. Клетки сперматогенного эпителия идентифицировали по их морфологии. Содержание ДНК в сперматогенных клетках определяли при окраске гистопрепаратов по Фельгину [Микроскопическая техника: Руководство, 1996].

Для трансформации клеток сперматогенного эпителия петухов использовали ретровирусные генные конструкции pLgfpSN и pBMN-lacZ, содержащие, соответственно, репортерные гены GFP (зеленый флюоресцирующий белок) и lacZ. Трансформацию клеток сперматогенного эпителия in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавления вирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа генетически трансформированных клеток к общему числу клеток.

Введение генных конструкций (суспензия клеток-упаковщиц и вирусный препарат) в семенники петухов in vivo осуществляли в возрасте 22,5 месяцев. Для получения инъекционного раствора клеток-упаковщиц их ресуспензировали в среде DMEM, содержащей полибрен (8 мкг/мл).

Выделение ДНК из эмбрионов кур осуществляли солевым методом [Зиновьева H.A. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК в эмбрионах кур определяли методом ПЦР. Экспрессию рекомбинантных белков в клетках сперматогенного эпителия семенников петухов изучали методом иммуногистохимии с использованием первых антител, специфичных к GFP.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием стандартной компьютерной программы Microsoft Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Особенности сперматогенеза петухов в различные возрастные

периоды

Гистоструктура семенных канальцев петуха характеризовалась наличием соединительно-тканной оболочки, внутренний слой которой был образован сперматогенным эпителием. Данный слой был представлен двумя популяциями клеток: поддерживающими клетками (клетки Сертоли) и

сперматогенными клетками на разных стадиях дифференцировки (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, спермии).

С возрастом число семенных канальцев на единицу площади ткани семенника изменялось (табл. 1).

Табл. 1. Морфологическая характеристика гистоструктуры семенника петуха__

Возраст Среднее число Среднее число Диаметр Площадь

семенных сперматогенных семенных семенных

канальцев на 1 клеток в семенном канальцев канальцев

мм2 канальце, п

1 нед 201±22 25±0,3 50,5±1,2 1871±82

2 нед 188±9 30±0,3 61,4±1,1 2715±93

3 нед 170±7 30±0,2 60,8±0,9 2638±74

4 нед 145±9 31±0,3 62,1±0,5 2771±40

5 нед 136±8 30±0,3 62,1±0,6 2795±59

6 нед 127±б 40±0,4 67,0±0,8 3207±71

7 нед 129±11 38±0,4 66,7±0,6 3203±55

8 нед 131±9 44±0,4 65,0±0,8 3036±76

9 нед 122±10 50±0,8 68,0±0,9 3331±97

10 нед 116±9 58±0,5 69,1±1,0 3368±90

11 нед 117±8 54±0,5 73,0±1,5 3862±153

12 нед 108±12 62±0,4 86,2±0,9 5348±116

3,5 мес 88±3 70±0,6 97,2±2,3 6963±306

4 мес 74±7 226±1,7 111,7±1,1 8962±172

4,5 мес 62±6 291±1,8 169,0±10,8 17787±282

5 мес 17±2 711±5,6 191,9±2,0 27092±564

5,5 мес 15±2 913±6,0 195,0±2,6 27877±525

6 мес 18±2 1154±7,6 186,8±2,0 23760±491

12 мес 15±3 1148±10,6 216,2±6,3 36254±2297

В период с 7-дневного до 3,5-месячного возраста наблюдалось постепенное снижение числа семенных канальцев на 1 мм2 среза при равномерном увеличении клеток сперматогенного эпителия - в 2,3 и 2,8 раза, соответственно. В последующий период с 3,5 до 5 месяцев данные изменения были более выраженными. За счет значительного увеличения размеров канальцев наблюдалось снижение их числа на единицу площади среза в 5,2 раза по сравнению с предыдущим периодом. Это было связано, прежде всего, с увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в семенных канальцах более чем в 10 раз по сравнению с 3,5-месячным возрастом. В период с 5 до 12 месяцев размеры канальцев и число клеток в них изменялись незначительно: различия по данным показателям не превышали 38%.

Вариабельность возрастных изменений в гистоструктуре ткани семенника петуха была обусловлена особенностями развития клеток сперматогенного эпителия. В возрасте 7 дней в семенных канальцах петуха встречались 2 типа клеток: клетки Сертоли и ранние половые клетки -сперматогонии, число которых в одном семенном канальце достигало, соответственно, 16±0,3 и 9±0,2. Клетки Сертоли располагались на периферии семенного канальца и имели ядро пирамидальной или овальной форм, расположенное перпендикулярно базальной мембране. Сперматогонии характеризовались наличием хорошо оформленного крупного ядра со светлой цитоплазмой и встречались как на периферии, так и внутри семенного канальца. На данной стадии развития просвет семенного канальца отсутствовал.

В возрасте 14 дней наблюдалась концентрация сперматогоний по периферии семенного канальца. Между петлями извитых канальцев, в рыхлой неоформленной соединительной ткани встречались хорошо различимые интерстициальные клетки. Число клеток Сертоли в семенном канальце увеличивалось до 23±0,2. Количество сперматогоний при этом не изменялось —7±0,1.

В возрасте 3-х недель в отдельных семенных канальцах появлялся просвет. При этом число половых клеток значительно не менялось.

На срезах семенников петухов 4-х недельного возраста число клеток Сертоли в семенном канальце снижалось до 20±0,2. При этом количество сперматогоний незначительно увеличивалось до 11±0,1.

В пяти недельном возрасте практически во всех семенных канальцах отчетливо выявлялся просвет. Клетки сперматогенного ряда располагались по базальной мембране. Наблюдалась физиологическая гибель части клеток Сертоли. Количество данного типа клеток в семенном канальце снижалось до 14±0,3. Число сперматогоний, напротив, увеличивалось до 16±0,2. При этом отмечались делящиеся формы сперматогоний в стадиях профазы и метафазы

- промежуточные клетки.

В возрасте 6-7 недель наблюдалось дальнейшее увеличение размеров семенных канальцев, внутри них четко выявлялся просвет. Между клетками Сертоли почти сплошным слоем располагались сперматогонии. Число клеток Сертоли значительно не менялось - 13±0,2. Количество сперматогоний увеличивалось до 24±0,2. Выявлялся новый тип клеток сперматогенного ряда

- сперматоциты первого порядка. Данные клетки располагались во втором ряду от мембраны и имели округлую форму, большое ядро и светлую цитоплазму. Число их составляло 3±0,2.

В 8-12 недельном возрасте наблюдалось незначительное увеличение числа клеток сперматогенного эпителия (рис. 2). Клетки Сертоли

располагались на стенке канальцев в один ряд. Между ними почти сплошным слоем залегали сперматогонии, количество которых практически не изменялось и варьировало от 26±0,1 до 29±0,2. Отмечалось значительное увеличение числа сперматоцитов первого порядка - до 24±0,2.

В семенных канальцах видны сперматогонии и

сперматоциты первого

порядка на разных стадиях мейоза.

1 - сперматогония,

2 - сперматоцит 1 порядка,

3 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: об. х40, ок. х15.

Рис. 2. Гистоструктура семенника петуха в возрасте 12 недель

В возрасте 3,5 месяцев в отдельных семенных канальцах семенников петухов выявлялся новый тип клеток - сперматоциты второго порядка. Их количество в одном канальце не превышало 3±0,1.

Семенные канальцы 4-месячных петухов характеризовались наличием всех клеток сперматогенного эпителия, за исключением спермиев. Сперматогонии располагались на базальной мембране сплошным слоем, между ними были видны клетки Сертоли, имеющие типичную пирамидальную форму. Над сперматогониями в 2-3 ряда располагались сперматоциты и ранние сперматиды. Число клеток Сертоли составляло 7±0,1, сперматогоний - 31±0,7, первичных - 25±0,4 и вторичных сперматоцитов -15±0,4 на разных стадиях мейоза и молодых круглых сперматид - 148±2,7.

В возрасте 4,5-5 месяцев сперматогенные клетки достигали уровня развития поздних грушевидных сперматид и зрелых спермиев (рис. 3). В семенных канальцах были видны все сперматогенные клетки, характерные для активного сперматогенеза, значительная часть семенных канальцев содержала зрелые спермии. Число клеток сперматогенного эпителия в этом возрасте колебалось в следующих пределах: сперматогонии - 36±2,0; сперматоциты первого порядка - 209±4,7 и второго - 146±1,8, сперматиды -151±1,9, спермии - 162±2,1 и клетки Сертоли - 7±0,1.

В возрасте 6-ти и 12-ти месяцев число клеток сперматогенного эпителия значительно не изменялось и варьировало в следующих пределах: сперматогонии - 40+2,5 и 38±1,4, сперматоциты первого порядка - 350±1,4 и 321 ±7,4, второго - 263±5,8 и 262±3,8, сперматиды - 216±4,2 и 242±3,8, спермии - 279±1,6 и 277±3,6 и клетки Сертоли - 6+0,2 и 7±0,3, соответственно.

•'Ц 1 ч - > 1' N. ; 4 • •

• V V/ »" * | < # 1" »V

- -

' * * •ч

<ч V» • , • - ' » . * . 5 N

'' д • *

В семенных канальцах представлены сперматогонии, сперматоциты первого и второго порядка, сперматиды и спермин. 1 - сперматогоння, 2 -сперматоцит 1-го порядка, 3 -сперматоцит 2-го порядка, 4 -сперматида, 5 - спермии. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: об. х40, ок. х15.

Рис. 3. Гистоструктура семенника петуха в возрасте 5 месяцев

Динамика изменения морфологического состава клеток сперматогенного эпителия семенников петухов в зависимости от возраста представлена на рисунке 4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3.5 4 4,5 5 5,5 6 12 нед нед нед нед нед нед нед нед нед нед нед кед мес мес мес мес гиес мес мес

Рис. 4. Морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенников петухов в динамике

3.2. Пролиферативная активность клеток сперматогенного эпителия

петухов

Ввиду того, что для генетической трансформации клеток семенников петухов планировалось использование генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов, были проведены дополнительные

исследования по оценке содержания ДНК в ядрах сперматогоний разновозрастных петухов, т.к. этот показатель является критерием пролиферативной активности клеток.

Высокое содержание ДНК в ядрах сперматогоний было установлено в возрасте от 2 недель до 3 месяцев - до 47,4±1,1 отн. ед. (табл. 2). Исходя из этого, с учетом процентной доли сперматогоний в семенных канальцах в качестве оптимального возрастного периода для введения генных конструкций в семенники петухов in vivo был выбран возраст от 1,5 до 3 месяцев.

Табл. 2. Морфофункциональная характеристика сперматогониев петухов

в различные возрастные периоды, M±m (Cv,%)

Возраст Количество сперматогониев в одном Содержание ДНК,

семенном канальце отн. ед.

п %

2 нед 7±0,1 (16) 23,3 37,6±0,9 (22)

1 мес 11±0,1 (21) 35,5 44,0±1,1 (23)

1,5 мес 24±0,2 (13) 60,0 47,4±1,1 (22)

2 мес 28±0,4(11) 63,6 40,7±1,2 (27)

2,5 мес 29±0,3(10) 50,0 38,8±0,9 (21)

3 мес 29±0,2(11) 46,8 3 8,0± 1,0(24)

4 мес 31 ±0,7 (9) 13,7 36,3±0,7(19)

5 мес 32±0,5 (13) 4,5 30,9±0,9(28)

6 мес 40±2,5 (11) 3,5 26,1±0,8(29)

12 мес 38±1,4 (9) 3,3 29,9±0,8(26)

3.3. Эффективность траисфекции клеток семенников петуха ретровирусными векторами в культуре in vitro

На первом этапе с целью оценки тропности используемых ретровирусных генных конструкций был проведен ряд экспериментов по переносу экзогенной ДНК в клетки семенника петуха в культуре in vitro.

Проведенные исследования показали эффективность использования данных векторов для трансформации клеток семенника петуха. При этом частота генетической трансформации данных клеток-мишеней варьировала в зависимости от типа используемого ретровирусного препарата. Так, при использовании ретровирусного вектора pBMN-IacZ наибольшее число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-упаковшицами. В данном случае из 1000 инфицированных клеток было получено 4 трансформированных клона, в которых наблюдалась экспрессия репортерного гена lacZ. При инфицировании эмбриональных клеток кур вирусным препаратом, представляющим собой среду культивирования

клеток-упаковщиц, эффективность трансформации клеток-мишеней была в 2,8 раз ниже и составила 1,4*10"3.

Аналогичные данные были получены и при использовании ретровирусного вектора pLgfpSN. В данном случае эффективность генетической трансформации первичной культуры клеток семенника петуха была несколько выше по сравнению с использованием ретровирусного вектора pBMN-lacZ и составила при использовании клеток-упаковщиц 5,5* 10'3, а при инфицировании вирусным препаратом 3,2* 10'3.

Результаты исследований, полученные в опытах in vitro, послужили основой для проведения дальнейших исследований по переносу рекомбинантной ДНК в семенники петухов in vivo.

3.2. Введение ретровирусных генных конструкций в клетки семенников петухов in vivo

Введение генной конструкции pLgfpSN в семенники петухов осуществляли по схеме, представленной в таблице 3.

Табл. 3. Схема эксперимента по введению генной конструкции pLgfpSN _в семенники петухов in vivo _

Показатели Группа

I 2 3 4

Способ подготовки генной ВП КК КК КК

конструкции для инъекции

Объем суспензии, мл/сем 1 1 1 1

Концентрация вирусного препарата, КОЕ/мл 4,2 х 105 - - -

Концентрация клеток- 0,5 1 О

упаковщиц, млн. клеток

Возраст животных, мес. 2 2 2 2

Количество животных, п 3 3 3 3

Примечание: КК — суспензия клеток-упаковщиц, ВП - вирусный препарат.

Интеграция и экспрессия гена йГР в клетках сперматогенного ряда была установлена как при введении вирусного препарата, так и после инъекции суспензии клеток-упаковщиц (рис. 5). Число трансформированных сперматогенных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 26 независимо от используемого источника генной конструкции.

При введении в семенники самцов петухов вирусного препарата из 60 проанализированных срезов только в 51 из них было выявлено наличие семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками: доля таких канальцев на одном срезе достигала 15,7±2,1% (табл. 4).

Примечание: 1-е возрасте 3 месяцев, 2-е возрасте 6 месяцев/ а -опыт, б - контроль. Трансформированные клетки выделены рамкой. Увеличение: хЮО (2а, 26), х400 (1а, 16).

Рис. 5. Иммуногистохимическое окрашивание семенников петухов на экспрессию репортерного гена GFP

Процент трансформированных клеток в семенных канальцах варьировал от 1,8 до 32,2% и составил в среднем по группе 1,5±0,3%. Общая эффективность трансформации семенных канальцев и клеток сперматогенного слоя (отношение числа трансформированных семенных канальцев и клеток к общему их числу во всех исследованных срезах, выраженное в процентах) составила, соответственно, 13,3±2,3 и 1,3±0,3%.

С целью повышения эффективности трансгенеза был проведен ряд экспериментов по оптимизации дозы вводимой генной конструкции в семенники самцов in vivo. В качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковшиц в концентрации от 0,5 до 2 млн. клеток. Предполагалось, что увеличение концентрации вводимых клеток-упаковщиц позволит повысить эффективность трансгенеза сперматогенных клеток семенников петухов. Однако с увеличением дозы введения клеток-упаковщиц наблюдалась обратная тенденция (табл. 4).

Табл. 4. Эффективность генетической трансформации семенных канальцев и клеток сперматогенного эпителия семенников петухов in _ vivo генной конструкцией pLgfpSN_

Показатель Группа

1 2 3 4

Концентрация вирусного препарата, КОЕ/мл 4,2x105

Количество клеток-упаковщиц, млн/семенник 0,5 1 2

Исследовано от каждого петуха срезов, п 20 20 20 20

Доля срезов с трансформированными семенными канальцами, % 85 85 50 35

Доля трансформированных семенных канальцев на срезе, %: - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе 1.7 31,0 15,7±2,1 5,9 47,1 18,1±2,6 1,7 31,3 10,7±2,2 2,5 13,2 5,8±0,9

Общая эффективность трансформации семенных канальцев, % 13,3±2,3 9,1±2,7 8,6±2,2 2,3±0,9

Доля трансформированных сперматогенных клеток в семенных канальцах, %: - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе 1,8 32,2 1,5±0,3 1,3 47,2 1,0±0,3 0,1 21,1 0,6±0,2 0,7 11,1 0,3±0,05

Общая эффективность трансформации клеток в семенных канальцах, % 1,3±0,3 0,5±0,2 0,3±0,2 0,1±0,04

Примечание: Общая эффективность трансформации семенных канальцев - отношение числа трансформированных семенных канальцев к общему числу исследованных семенных канальцев, выраженное в процентах. Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток -отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к общему числу исследованных клеток, выраженное в процентах.

Результативность переноса рекомбинантной ДНК в семенные канальцы и клетки сперматогенного слоя семенников петухов была ниже по сравнению с использованием вирусного препарата. Так, при инъекции в семенники самцов петухов суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 0,5 млн. клеток общая эффективность трансформации семенных канальцев составила

12

9,1±2,7%, сперматогенных клеток - 0,5±0,2%, что было в 1,5-2,6 раз ниже аналогичных показателей, полученных при введении вирусного препарата. При введении клеток-упаковщиц в концентрации 2 млн. клеток на семенник различия по данным показателям были больше: эффективность трансформации семенных канальцев не превышала 2,3±0,9%, клеток сперматогенного слоя - 0,1±0,04%. Снижение эффективности трансформации сперматогенных клеток семенников при увеличении концентрации вводимых клеток-упаковщиц, возможно, связано с иммунной реакцией организма в ответ на введение чужеродных для него клеток.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать условия введение генных конструкций в семенники петухов in vivo. Максимальная эффективность трансформации клеток сперматогенного слоя семенников установлена при использовании в качестве источника генной конструкции вирусного препарата. Исходя из этого, данный способ подготовки генных конструкций был использован нами в дальнейших исследованиях.

С целью изучения результативности передачи трансгена потомству была выполнена генетическая модификация семенников петухов in vivo (n=6) с использованием в качестве источника генных конструкций вирусного препарата.

Введение генной конструкции семенники петухов осуществляли в возрасте 2,5 месяцев. С целью объективной оценки эффективности передачи трансгена потомству исследования проводили на уровне эмбрионов. От каждого подопытного петуха было получено и проанализировано на наличие трансгена не менее 100 эмбрионов. Наличие рекомбинантной ДНК в эмбрионах кур определяли методом ПЦР.

Возможность передачи трансгена потомству была подтверждена у всех подопытных петухов. Однако количество полученных трансгенных эмбрионов варьировало от 1 до 7 и составило в среднем 4,2%.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов для генетической трансформации клеток семенников петухов in vivo, что позволяет рассматривать перенос генов, опосредованный ретровирусными векторами, как альтернативный метод получения трансгенной птицы, характеризующийся невысокими временными и материальными затратами.

выводы

1. Установлены возрастные периоды в онтогенезе петухов, характеризующие основные изменения гистоструктуры семенников. Показано, что в период с 7-дневного до 3,5-месячного возраста наблюдается постепенное снижение числа семенных канальцев на единицу площади ткани семенника (от 201±22 до 88±3 на 1 мм2) при относительно равномерном увеличении среднего числа клеток в них с 25±0,3 до 70±0,6. Изменение данных показателей при возрастном интервале в 1-2 недели варьируют от 5 до 10%. Интенсивные изменения в гистоструктуре семенника отмечаются в возрасте от 3,5 до 5 месяцев. Площадь семенных канальцев и число клеток в них увеличиваются по сравнению с предыдущим периодом в 5,2 и 10,2 раза, соответственно. Максимальное развитие сперматогенного эпителия петухов наблюдается в возрасте 6 месяцев: число семенных канальцев на 1 мм2 ткани семенника снижается до 18±2 при увеличении клеток в них до 1154±7,6.

2. Изучен морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенников у разновозрастных петухов. Установлено, что основным типом сперматогенных клеток семенных канальцев в возрасте 1-6 недель являются сперматогонии. С 7-недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5-4 месяцев -сперматоциты второго порядка и сперматиды. В возрасте 5 месяцев в семенных канальцах впервые выявляются спермин, число которых увеличивается к достижению возраста 6 месяцев и остается практически неизменным в возрасте 12 месяцев.

3. Установлен оптимальный период для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогенного эпителия семенников петухов. Максимальный процент сперматогоний в семенных канальцах и высокая пролиферативная активность данного типа клеток наблюдается в возрасте от 1,5 до 3 месяцев. В данный период доля сперматогоний от общего числа клеток сперматогенного эпителия достигает 63,6% при максимальном содержании ДНК в них - до 47,4 отн. ед.

4. Установлена компетентность сперматогенных клеток семенников петуха in vitro к рекомбинантным ретровирусам. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 1,4*10"3 до 5,5* 10"3 в зависимости генной конструкции и метода трансфекции.

5. Показана результативность введения ретровирусных векторов в семенники петухов in vivo с общей эффективностью трансформации семенных канальцев и клеток сперматогенного эпителия до 13,3±2,3 и 1,3±0,3%, соответственно. Выявлена возможность передачи трансгена потомству с эффективностью 4,2%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных и птицы, рекомендуем:

1. Для генетической трансформации половых клеток петухов использовать генные конструкции, полученные на основе рекомбинантных ретровирусов.

2. Для эффективной трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников in vivo осуществлять введение ретровирусных векторов в виде вирусного препарата в возрасте от 1,5 до 3 месяцев.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, рекомендованных ВАК

1. Эрнст, JI.K. Некоторые аспекты соматического переноса генов в половые клетки самцов сельскохозяйственных животных / Л.К. Эрнст, Е.В. Белоглазова, Е.К. Томгорова, H.A. Волкова, В.А. Багиров, H.A. Зиновьева, Л.А.Волкова // Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 10. - С. 71-72.

2. Волкова, H.A. Генетическая трансформация сперматогониев петухов in vivo / H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.А. Волкова, Е.В. Белоглазова, Т.О. Котова, Л.К. Эрнст // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук,-2011.-№ 1.-С. 45-47.

3. Белоглазова, Е.В. Возрастная динамика сперматогенеза у петухов в связи с оптимизацией сроков проведения биоинженерных манипуляций / Е.В. Белоглазова, Т.О. Котова, H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - №6. - С. 60-64.

В других изданиях

4. Белоглазова, Е.В. Влияние различных факторов на эффективность соматического переноса генов в половые клетки петухов / Е.В. Белоглазова, Т.О. Котова, H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева // Сборник трудов «Высокие технологии, исследования, промышленность». - 2010. - т. 4. - С. 95-96.

5.Тулякова, А.О. Эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза кур / А.О. Тулякова, Е.В. Белоглазова, Д.В. Белоглазов, H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Сборник материалов научной конференции «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра». - 9-11 июня 2010 г. - С. 217-220.

6. Волкова, H.A. Некоторые аспекты генетической трансформации сперматогониев петухов in vitro и in vivo / H.A. Волкова, E.B. Белоглазова, E.K. Томгорова, H.A. Зиновьева // Материалы VIII международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». - 2009. - С. 120-121.

15

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (4967)65-13-18 (4967)65-15-97

Сдано в набор 07.11.2012. Подписано в печать 08.11.2012. _Заказ № 55. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии 16

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белоглазова, Елена Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Сперматогенез у многоклеточных животных размножающихся половым путем

1.2 Морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенников самцов.

1.3 Пролиферация и дифференцировка половых клеток самцов.

1.4 Развитие семенников и оплодотворяемость.

1.5 Использование половых клеток самцов в качестве векторов для переноса рекомбинантной ДНК.

1.5.1 Использования спермиев для переноса рекомбинантной ДНК в клетки-мишени.

1.5.2 Использование сперматогоний в качестве мишеней для введения рекомбинантной ДНК.

1.6 Методы получения трансгенной птицы.

1.6.1 Использование вирусных векторов для переноса экзогенной

ДНК в клетки и органы птицы.

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы и оборудование.

2.1.2 Животные.

2.2 Гистологические исследования.

2.2.1 Получение гистологических препаратов.

2.2.2 Определение числа клеток сперматогенного эпителия и относительного количества ДНК ядер клеток семенников.

2.3 Работа с культурой клеток.

2.3.1 Культивирование клеток.

2.3.2 Получение первичной культуры клеток семенника петуха.

2.4 Эксперименты по переносу рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия петухов.

2.4.1 Генные конструкции.

2.4.2 Трансформация культуры клеток семенника петуха in vitro.

2.4.3 Введение ретровирусных векторов в семенники петухов in vivo

2.5 Анализ на наличие генной конструкции.

2.6 Анализ экспрессии рекомбинантных белков.

2.6.1 Иммуногистохимия.

2.6.2 Оценка экспрессии экзогенной Р-галактозидазы.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Особенности сперматогенеза петухов в различные возрастные периоды.

3.2 Пролиферативная активность клеток сперматогенного эпителия петухов.

3.3 Эффективность трансфекции клеток семенников петуха ретровирусными векторами в культуре in vitro.

3.4 Введение ретровирусных генных конструкций в клетки семенников петуха in vivo.

4 ОБСУЖДЕНИЕ.

5 ВЫВОДЫ.

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций"

Актуальность темы.

Использование клеток гонад рассматривается как один из перспективных методов получения трансгенных животных, в том числе птицы [Коржикова C.B., 2002; Савченкова И.ГТ. и др., 2006; Новгородова И.П. и др., 2008;Эрнст J1.K. и др., 2008;Волкова H.A. и др., 2011]. Несмотря на наличие целого ряда методов доставки рекомбинатной ДНК в эмбриональные клетки птиц [SangH., 2004; PetitteJ. etal., 2004; Kamihira M. etal., 2005; KawabeY. etal., 2006; Эрнст JT.K. и др., 2009;Сураева и др., 2009], интерес к использованию клеток семенников сохраняется вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.

Среди всех типов клеток сперматогенного эпителия интерес исследователей сосредоточен на использовании стволовых клеток сперматогоний. Популяция данного типа клеток постоянно обновляется, что открывает широкие возможности реализации их потенциала при получении трансгенной птицы: репликация сперматогонийинициирует комплексный процесс их дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев.

Вместе с тем, не смотря на ряд преимуществ использования половых клеток в качестве объекта для адресной доставки ДНК, на сегодняшний день нет однозначных данных о молекулярных механизмах транспорта генов в данные клетки-мишени и эффективных способах их трансформации. Решение данной проблемы позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Цель и задачи.

Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных петухов.

2. Дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от возраста петухов.

3. Выявить оптимальный возраст петухов для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогеного эпителия.

4. Определить эффективность генетической трансформации клеток семенников петухов in vitro с использованием ретровирусных векторов.

5. Изучить результативность генетической трансформации сперматогенных клеток петухов in vivo.

Научная новизна.

Впервые подробно изучены гистологические особенности семенников петухов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда семенников in vivo.

Практическая значимость.

Определен возраст петухов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных манипуляций. Отработан метод введения генных конструкций в семенники петухов invivo. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в данный орган-мишень. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке: наличие рекомбинантной ДНК установлено в спермиях по достижении половой зрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

• Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах семенников петухов изменяется в зависимости от возраста.

• В сперматогенном эпителии семенных канальцев петухов постоянно присутствуют стволовые клетки сперматогонии, число которых изменяется в процессе онтогенеза.

• Клетки сперматогенного эпителия петухов могут быть трансформированы invivo с использованием ретровирусных векторов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: научной конференции «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра», С.-Петербург, 2010 г., «Высокие технологии, исследования, промышленность», С.-Петербург, 2009, 2010 г., научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 3.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 9 таблиц, 28 рисунков. Список литературы содержит 150 источников, в том числе 112 на иностранных языках.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Белоглазова, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Установленывозрастные периоды в онтогенезе петухов, характеризующие основные изменения гистоструктуры семенников. Показано, что в период с 7-дневного до 3,5-месячного возраста наблюдается постепенное снижение числа семенных канальцев на единицу площади ткани семенника (от 201±22 до 88±3на 1 мм") при относительно равномерном увеличении среднего числа клеток в них с 25±0,3до 70±0,6. Изменение данных показателей при возрастном интервале в 1-2 недели варьируют от 5 до 10%. Интенсивные изменения в гистоструктуре семенника отмечаются в возрасте от 3,5 до 5 месяцев. Площадь семенных канальцев и число клеток в них увеличиваются по сравнению с предыдущим периодом в 5,2 и 10,2 раза, соответственно. Максимальное развитие сперматогенного эпителия петухов наблюдается в возрасте 6 месяцев: число семенных канальцев на 1 мм2 ткани семенника снижается до 18±2при увеличении клеток в них до 1154±7,6.

2. Изучен морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенников у разновозрастных петухов.Установлено, что основным типом сперматогенныхклеток семенных канальцев ввозрасте 1-6 недель являются сперматогонии. С 7-неделыюго возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5-4 месяцев -сперматоциты второго порядка и сперматиды. В возрасте 5 месяцев в семенных канальцах впервые выявляются спермии, число которых увеличивается к достижению возраста 6 месяцев и остается практически неизменным в возрасте 12 месяцев.

3. Установлен оптимальный период для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогенного эпителия семенников петухов. Максимальныйпроцент сперматогоний в семенных канальцах и высокая пролиферативная активность данного типа клеток наблюдается в возрасте от 1,5 до 3 месяцев. В данный период доля сперматогоний от общего числа клеток сперматогенного эпителия достигает 66,4% при максимальном содержании ДНК в них - до 47 отн. ед.

4. Установлена компетентность сперматогенных клеток семенников петуха 1п\Ыго к рекомбинантным ретровирусам. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 1,4*10" до 5,5*10" в зависимости генной конструкции и метода трансфекции.

5. Показана результативность введения ретровирусных векторов в семенники петухов\nvivo с общей эффективностью трансформации семенных канальцев и клеток сперматогенного эпителия до 18,1 ±2,6 и 1,3±0,30%, соответственно. Выявлена возможность передачи трансгена потомству с эффективностью 4,2%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных и птицы, рекомендуем:

1. Для генетической трансформации половых клеток петухов использовать генные конструкции, полученные на основе рекомбинантных ретровирусов.

2. Для эффективной трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников in vivo осуществлять введение ретровирусных векторов в виде вирусного препарата в возрасте от 1,5 до 3 месяцев.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоглазова, Елена Викторовна, п. Дубровицы Московской обл.

1. Абдрахманов, И. К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих/ И. К. Абдрахманов // автореф. диссер. канд. биол. наук.- Дубровицы. 2001. 22 с.

2. Баранов, B.C. Включение макромолекул в половые клетки самцов мышей при помощи электропорации и диметилсульфоксида/ B.C. Баранов, И. Гапала, П. Грияч // Цитология и генетика. 1990. - Т. 24. - №3. -С.3-7.

3. Волкова, Л.А. Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных клеток «упаковщиц»/ Л.А. Волкова // Афтореф. дисс. канд. биол. наук. - Дубровицы. - 2005. - 20 с.

4. Вракин, В.Ф. Морфология сельскохозяйственных животных. Анатомия и гистология с основами цитологии и эмбриологии / В. Ф. Вракин, М. В.Сидорова, В. П. Панов // М.:Гринлайт. 2008 С. 510-516.

5. Галат, В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомогательной репродукции и изучения биологии оплодотворения/ В.В. Галат//Онтогенез. 2000.- Т.31. -№1. - С.5-13.

6. Гистология / Под ред. Ю.И. Афанасьева, H.A. Юрина// М.: Медицина, 2002. 695с.

7. Гистология: атлас, учебное пособие / Л.К. Жункейра, Ж. Карнейро; пер. с анг. под ред. В.Л. Быкова. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2009. -576с.

8. Данилова, JI.B. Сперматогонии, сперматоциты, сперматиды// JI.B. Данилова / В кн.: Современные проблемы сперматогенеза// М.: Наука. -1982. С.25-72.

9. Захидов, С.Т. Современные достижения в исследованиях проблемы сперматогенеза. Проблемы репродуктивной биологии/ С.Т.Захидов // М. 1998. - С.233-259.

10. Зиновьева, Н. А. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н. А.Зиновьева, А. Н.Попов, Л. К.Эрнст, Н. С. Марзанов // Дубровицы: ВИЖ. 1998. - 47 с.

11. Зиновьева, H.A. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных / Н. А.Зиновьева, Л.К.Эрнст // Дубровицы: ВИЖ.-2004. -316 с.

12. Зиновьева, H.A. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве / Н.А.Зиновьева, Л.К.Эрнст, Г.Брем // Дубровицы: ВИЖ, 2001.-128 с.

13. Коржикова, C.B. Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка/ С.В.Коржикова // Афтореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы. - 2002. - 19 с.

14. Костерева, Н.В. Культура сперматогенных клеток свиней/ Н.В.Костерева, С.В.Коржикова, И.П.Савченкова // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». -ВИЖ. п. Дубровицы. - 2002. - В.1. - С.67-71.

15. Кузнецов, A.B. Исследования переноса чужеродных генов сперматозоидами в яйцеклетки мидии MytilusGalloprovincialisLam./ А.В.Кузнецов, А.В.Пиркова, Г.А. Дворянчиков и др. //Онтогенез. 2001. -Т.32. - №4. - С.309-318.

16. Меркурьева, Е.А. Генетика / Е.А. Меркурьева //М.: Агропромиздат. 1991. - 247с.

17. Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова// М.: Медицина, 1996. 544 с.

18. Новгородова, И.П. Генетическая трансформация сперматогониев кроликов in vivo / И.П. Новгородова, А.Н. Мормышев, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, JI.K. Эрнст // Биотехнология. 2008. - № 1. - С. 24-28.

19. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера// М.: Мир, 1989. 368с.

20. Прасолов, B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих/ B.C. Прасолов // Молекулярная биология. - 1989. - Т.23, вып.2. - С.8-12.

21. Райцина, С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих// С.С. Райцина /Успехи современной биологии. 1967. - Т.63. - С.135-153.

22. Райцина, С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции/ С.С. Райцина // М.: Наука. 1985. - 207 с.

23. Реунов, A.A. Сперматогенез многоклеточных животных / A.A. Реунов // М.: Наука. 2005. - 123 с.

24. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. Пер. с нем. В.Я. Александрова, З.И. Кроковой // М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953. 718 с.

25. Рузен-Ранге, Э. Сперматогенез у животных / Э. Рузен-Ранге // М.: Мир. 1980.- 255 с.

26. Столярова, В.Н. Получение и использование сперматогоний в качестве кариопластов при реконструировании яйцеклеток/ В.Н.Столярова,

27. B.П.Рябых, С.А. Лисицына и др.// Современные проблемы биотехнологии и биологии продуктивных животных. Сб. науч. тр. - Боровск. - 1999. - Т.28.1. C.13-22.

28. Сураева, Н. М. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы / Н. М.Сураева, А. В. Самойлов // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. -2009. Т. 20. - №4. - С. 19-23.

29. Сюрин, В. Н., Вирусные болезни животных./ В. Н.Сюрин // М.: ВНИТИБП. 1998. -С.363-460.

30. Титова, В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трасгенеза в животноводстве / В.А.Титова// Автореф. дисс. канд. биол. наук. Дубровицы, 2001. - 22 с.

31. Хесин, Р.Б. Непостоянство генома / Р.Б. Хесин // М.: Наука.1984.-471 с.

32. Хэм, А. Гистология / А.Хэм, Д. Кормак Пер. с англ.// М.: Мир. -1983.-Т.5.-296 с.

33. Цветной атлас гистологии / Л.П. Гартнер, Дж. Л. Хайатт; пер. с анг. под ред. В.П. Сапрыгина// М.: Логосфера, 2008. 480 с.

34. Шихов, И.Я. Методические рекомендации по количественному определению нуклеиновых кислот в клетках и тканях сельскохозяйственных животных / И.Я.Шихов, М.П.Хамицеева, А.С. Лепнов и др. // Дубровицы.1985.-28с.

35. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия. 4.2. / С.Н. Щелкунов// Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та. 1997. - 400 с.

36. Щит, И.Ю. Прикладные аспекты применения сперматозоидов в качестве переносчика чужеродной ДНК/ И.Ю. Щит //Автореф. дисс. канд. биол. наук. Дубровицы. -1997. - 20 с.

37. Эрнст, Л. К. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК шу1уо и шу^го/ Л. К.Эрнст, Н. А.Зиновьева, Н. А.Волкова, В. А. Титова // М.: РАСХН. 2003. - 84 с.

38. Эрнст, Л. К. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве/ Л. К. Эрнст, Н. А.Зиновьева, Г.Брем // М.: РАСХН. 2002. - 341 с.

39. Arezzo, F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information/ F. Arezzo //Cell Biol. Int. Rep. 1989. - V.13(4). - P.391-404.

40. Aritomi, S. Production of chicken chimeras by fusing blastodermal cells with electroporation/ S.Aritomi, N.Fujinara // Asian J. Androl. 2000. -V.2.-P. 271-275.

41. Bachiller, D.Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells/ Bachiller D., Schellander K., Peli J. et al. //Mol. Reprod. Dev. 1991. - V.30(3). -P. 194-200.

42. Behr, J.P. Cene transfer with synthetic cationic amphiphiles: Prospects for gene therapy/ J.P. Behr //Bioconjugate Chemistry. 1994. - V.5. - P.382-389.

43. Bellve, A.R. Spermatogenic cells of the prepubertal mouse: isolation and morphological characterization/ A.R.Bellve, J.C.Cavicchia, O.'Millette, D.A.Brien, Y.M.Bhatnager, M.Dym //J. of Cell Biology. 1977. - V.74. - P.68-85.

44. Berardino, M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male genn cells/M. Berardino, M. Hoffher //J. ofExper. Zoology. 1976. - V.176( 1). - P.61-72.

45. Bosselman, R.A. Germline transmission of exogenous genes in the chicken/ R.A. Bosselman, R.Y. Hsu, T. Boggs, S. Hu, J. Bruszweski & S. Ou // Science 1989. - V.243. - P. 533-535.

46. Boulo, V. Transient expression of luciferarase reporter gene after lipofection of oyster (Crassostrea gigas) primary cell cultures/ V. Boulo, J.P. Cadoret, Le Marrec F. et al. //Mol. Marine Biol. Biotech. 1996. - V.5(3). - P. 167174.

47. Braskett, B.G. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization/ B.G. Braskett, W. Baranska, W. Sawicki et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1971. - V.68. - P.353-357.

48. Brazolot, C.L. Efficient transfection of chicken cells by lipofection and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo/ C.L.Brazolot, J.N.Petitte, R.J.Etches, A.M. VerrinderGibbins // Mol. Reprod. Dev. 1991. -V.30.-P. 304-312.

49. Brinster, R.L. Spermatogonial stem cell transplantation, cryopreservation and culture/ R.L. Brinster, M. Nagano //Semin. Cell. Dev. Biol. -1998. V.9(4). - P.401-409.

50. Brinster, R.L. No simple solution for making transgenic mice/ R.L. Brinster, E.P. Sandgren, R.R. Behringer, A.F. Palmiter // 1989. - V.59. - P.239-241.

51. Brinster, R.L. Germ line transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. / R.L. Brinster, M.R. Avarbock // PNAS 1994. -V.91.-P. 11303-11307.

52. Brinster, R.L. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation / R.L.Brinster, J.W.Zimmermann // ProcNatlAcadSci. 1994. -V.91.-P. 11298-11302.

53. Buchberger, B. DOSPER liposomal transfection reagent: a reagent with unique transfection properties. / B.Buchberger, E.Fernhol, E.Bantle, M.Weigert, E.Borowski // Biochemica. 1996. V.2. - P. 7-10.

54. Burgos, M.H. Studies on the fine structure of the mammalian testis/ M.H.Burgos, and D.W. Fawcett. // J. Biophys. Biochem. Cytol., 1955. - V. 1. -P. 287-300.

55. Cadoret, J.P. Microinjection of bivalve eggs: application in genetics/ J.P. Cadoret, S. Gendreau, J.M. Delecheneau et al. //Mol. Marine Biol. Biotech. -1997b. -V.6(l).-P.72-77.

56. Capecchi R.L. Science. 1989. - V.244. - P.1288-1292.

57. Castrillon, D.Ii. The human VASA gene is specifically expressed in the germ cell lineage / D.H. Castrillon, B.J. Quade, T.Y. Wang, C. Quigley, C.P. Crum //Proceedings National Academy of Sciences. 2000. - V.97. - P.9585-9590.

58. Castro, F.O. Introduction of foreign DNA into the spermatozoa offarm animals/ Castro F.O. //Theriogenology. 1990. - V.34. - P. 1099-1110.

59. Chiang, M.Y. Transfection optimization. / M.Y.Chiang, H.Chan, M.A.Zounes, S.M.Freier, W.F.Lima, C.F. Bennett // J. Biol. Chem. 1991. -V.266. -P. 181-186.

60. Clouthier, D.E. Rat spermatogenesis in mouse testis/ D.E. Clouthier, M.R. Avarbock, S.D. Maika, R.L. Hammer//Nature. 1996. - V.381. - P.418-421.

61. Coffin, J.M. Structure and classification of retroviruses. In 'The Retroviridae' (ed. L.A. Levy ) / J.M Coffin // Plenum Press, NY. 1992.- P. 19-49.

62. Cosset F.L. Packaging cells for avian leukosis virus-based vectors with various host ranges./ F.L. Cosset // J. Virol. 1992,- V.66. P. 5671-5676.

63. De la Fuente, J. Sperm mediated foreign DNA transfer experiments in different species/ J. De la Fuente, F.O. Castro, O. Hernandez et al. //Presented at Biotech. USA, Ramada Renaissance Tech. Wored. Washington, DC. - November 27-29. - 1990. -P.247-262.

64. De Miguel, M.P. Dissection of the c-kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer/ M.P. De Miguel, L. Cheng, E.C. Holland, M.J. Federspiel, P.J. Donovan //PNAS. 2002. - V.99. -P.10458-10463.

65. De Miguel, M.P. Leukemia inhibitory factor and ciliary neurotropic factor promote the survival of Sertoli cells and gonocytes in a coculture system/ M.P. De Miguel, M. de Boer-Brouwer, R. Paniagua, et al. //Endocrinology. -1996. V.137. - P.1885-1893.

66. De Miguel, M.P.Determinants of Retroviral-Mediated Gene Delivery to Mouse Spermatogonia/ M.P. De Miguel, P.J. Donovan //Biol, of Reprod. 2003. - V.68. - P.860-866.

67. De Rooij, D.G. regulation of proliferation and differentiation of stem cells in the male germ line/ D.G. De Rooij, F.M.P. van Dissel-Emiliani //Stem Cells. 1997.-P.283-313.

68. De Rooji, D.G. Spermatogonial stem cells/ D.G. De Rooji, J.A. Grootegoed //Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.10. - P.694-701.

69. Dirami, G. Isolation and culture of immature rat type A spermatogonial stem cells in signal transduction in testicular cells/ G. Dirami, N. Ravindranath, M.C. Jia, M. Dym //In Basic and Clinical Aspects. 1996. - P. 141165.

70. Dolci, S. Combined action of stem cell factor, leukemia inhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells/ S. Dolci, M. Pesce, M. de Felici //Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.35 - P. - 134-139.

71. Dym, M. Expression of c-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia/ M. Dym, M.-C. Jia, G. Dirami, J.M. Price //Biology of reproduction. 1995 - V.52. - P.8-19.

72. Dym, M. Further observation on the numbers of spermatogonia, spermatocytes and spermatids connected by intercellular bridges in the mammalian testis / M. Dym and D.W. Fawcett // Biol. Reprod. 1971. V.4. - P. 195-215.

73. Forster W. Gene transfer by electroporation//In: Electroporation and electrofüsion in cell biology/ W.Forster, E. Neumann //Press. New York and London. 1989. - P.299-318.

74. Franca, L.R. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat/ L.R.Franca, T.Ogawa, M.R. Avarbock, R.L.Brinster, L.D. Russell //Biol. Reprod. 1998. - V.59(6). - P. 1371-1377.

75. Gahne, M.B. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes/ M.B. Gahne, F. Pothier, M.A. Sirard //Mol. Reprod. Dev. 1991. - Y.29. -P.6-15.

76. Gandolfi, F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals/ F. Gandolfi //Trasgenic Research. 1998. - V.7. - P. 147-155.

77. Gendreau, S. Transient expression of a luciferase reporter gene after ballistic introduction into Artemia franciscana (Crustacea) embrios/ S. Gendreau, V. Lardans, J.P. Cadoret, E. Mialhe //Aquaculture. 1995. - V.133. - P. 199-205.

78. Gruendbaum, J. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens/ J. Gruendbaum, E. Revel, S. Yarus, A. Fainsod //J. Cell Biochem. -1991. Suppl.15. - P. 194.

79. Haneji, T. Adenosine-cyclic monophosphate regulates differentiation of type A spermatogonia with vitamin A in adult mouse cryptorchid testis in vitro/ T. Haneji, S.S Koide., Y. Nishimune, Y.Oota Dibutyryl //Endocrinology. 1986. -V.119. - P.2490-2496.

80. Haneji, T. Effects of epidermal growth factor on the differentiation of type A spermatogonia in adult mouse cryptorchid testes in vitro/ Haneji T., Koide S.S., Tajima Y., Nishimune Y. Differentia //J. Endocrinol. 1991. - V.128. -P.383-388.

81. Harvey, A.J. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures / A.J.Harvey, G.Speksnijder, L.R.Baugh, J.A.Morris, R.Ivarie // Poult Sci. 2002. -V. 81 (2).-P. 202-212.

82. Harvey, A.J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens / A.J. Harvey // Nat. Biotechnol. 2002.- V.20. P. 396-399.

83. Hochi S., Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs spermatozoa/ S.Hochi, T.Ninomiya, A.Mizuno, M.Honma, A.Yuki //Anim. Biotech. 1990.-V.1.-P.21-31.

84. Huguet, E. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa/ E. Huguet, P. Esponda //Mol. Reprod. Dev. 1998. -V.51(l). - P.42-52.

85. Izadyar, F. Proliferation and Differentiation of Bovine Type A Spermatogonia During Long-Term Culture/ F.Izadyar, K. den Ouden, L.B.Creemers, G.Posthuma, M.Parvinen, Dirk G. de Rooij. //Biol, of Reprod. -2003.-V.68.-P.272-281.

86. Izadyar, F. Proliferation and Differentiation of Bovine Type A Spermatogonia During Long-Term Culture/ F.Izadyar, K. den Ouden, L.B.Creemers, G. Posthuma, M.Parvinen, Dirk G. de Rooij. //Biol, of Reprod. -2003.-V.68.-P.272-281.

87. Izadyar, F. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis/ F. Izadyar, G.T.Spierenberg, L.B.Creemers, K.den Ouden, D.G. de Rooij //Reproduction. 2002. - V.124. - P.85-94.

88. Jiang, F.X. Behaviour of spermatogonia following recovery from busulfan treatment in the rat/ Jiang F.X. //Anat. Embryol. 1998. - V.198(l). -P.53-61.

89. Jung, J. G. Identification, Culture, and Characterization of Germline Stem Cell-Like Cells in Chicken Testes / J. G.Jung, Y.M.Lee, T.S. Park, S.H.Park, J.M.Lim, and J.Y.Han // Biology of Reproduction. 2007. - V. 76. - P. 173-182.

90. Kamihira, Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells / Kamihira, S.Pain, M.Leibo, M. Cochran // Poult. Sci. 2005. 76, 753-760.

91. Kawabe, Postnatal development of a demyelinating disease in avian spinal cord chimeras / Kawabe, M.Coltey, N. Le Douarin // Cell. 2006. 45, 307314.

92. Kim, J.Il. Development of a positive method for male stem cellmediated gene transfer in mouse and pig/ J.H.Kim, H.S.Jung-Ha, H.T.Lee //Mol. Reprod. Dev. 1997. - V.46. - P.515-526.

93. Lamb, B.T. Introduction and expression of the 400 kilobase precursor amyloid protein gene in transgenic mice / B.T.Lamb, S.S.Sisodia, A.M.Lawler, H.H. Slunt, C.A.Kitt, W.G.Kearns, P.L.Pearson, D.L.Price, J.D. Gearhart // Nat. Genet. 1993.-V. 5.-P. 22.

94. Lauria, A. Recent advances in sperm cell mediated gene transfer/ A.Lauria, F. Gandolfi //Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.36. - P.255-257.

95. Lavitrano, M. Sperm cells as vectors for introducing foreign Dna into eggs: genetic transformation of mice/ M.Lavitrano, A.Camaioni, V.M. Fasio //Cell. 1989. - V.57. -P.717-723.

96. Lavitrano, M. The interaction of sperm cells with exogenous DNA a role of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules/ M.Lavitrano, B.Maione, E.Forte, M.Francolini, S.Sperandio //Exp. Cell Res. -1997. - V.233. - P.56-62.

97. Leblond, Spermiogenesis of the rat, mouse, hamster, and guinea pig as revealed by the "periodic acid-fuchsin sulfurous acid technique" / Leblond and Clermont //Am J Anat. 1952.-V. 90.-P. 167-216.

98. Li, C. Production of duck-chicken chimeras by transferring early biastodermal cells / C. Li, Y. Song, J. Sha, N. Wang // Poult Sci. 1995. 81, 13601364.

99. Maione, B. Sperm-mediated gene transfer in mice/ B.Maione, M.Lavitrano, C.Spadafora //Mol. Reprod. Dev. 1998. - V.50(4). - P.406-409.

100. Marret, C. Culture of porcine spermatogonia: effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication / C.Marret, P.Durand //Reprod. Nutr. Dev. 2000. - V.40(3). -P.305-319.

101. McGrew, M.J. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors / M.J. McGrew, A. Sherman, F.M. Ellard, S.G. Lillico, H.J. Gilhooley, A.J. Kingsman, K.A. Mitrophanous & H Sang //EMBO Reports. 2004. -V.5.-P. 728-733.

102. Meachem, S.J. Spermatogonia: stem cells with a great perspective/ S.J.Meachem, V.Schonfeldt, S.Schlatt//Reprod. 2001. - V. 121(6). - P.825-834.

103. Miller, A.D. Retroviral packaging cells / A.D. Miller // Hum. Gene Ther. -1990,- V.l.-P. 5-14.

104. Mizuarai, S. Production of transgenic quails with high frequency of germ-line transmission using VSV-G pseudotyped retroviral vector / S.Mizuarai, K.Ono, K.Yamaguchi, M. Nishijima // Biochem Biophys Res Commun. 2001. 286, 456-463.

105. Morena, A.R. Isolation of highly purified type A spermatogonia from prepubertal rat testis/ A.R. Morena, C.Boitani, M.Pesce, M. de Felici, M. Stefanini //J. Androl. 1996. - V.l 7. - P.708-717.

106. Mozdziak, P.Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase / P.Mozdziak, B S.orwornpinyo, D.W. McCoy, J. Petitte // Dev Dyn. 2003. 226, 439-445.

107. Muller, F. Introducing foreign genes into fish eggs with electroporated sperm as a carrier/ F.Muller, Z.Ivics, F.Eedelyi, T.Papp, L.Varadi, L.Horvath, N.Macleans //Mol. Marine Biol. Biotech. 1992. - V.l. - P.276-281.

108. Muramatsu, T. Transfection methods for foreign gene into the embryos. / T.Muramatsu, Y.Mizutani, Y.Ohmori, J.Okumura //Biochem.Biophys. Res. Commun. 1997.-V.l3.-P. 376.

109. Nagano, M. Retrovirus mediated gene delivery into male genn line stem cells/ M. Nagano, T. Shinohara, M.R. Avarbock & R.L. Brinster // FEBS Letters. - 2000. - V. 475. - P. 7-10.

110. Nagano, M. Transgenic mouse produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells / M. Nagano, C.J. Brinster, K.E. Orwig, B.E. Ryu, M.R.Avarbock& R.L. Brinster // PNAS. -2001. V. 99.-P. 13090-13095.

111. Nakanishi, A. Gene transfer in the chicken by sper-mediated methods/ A.Nakanishi, A. Iritani //Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.36. - P.258-261.

112. Nilson, B.H.K. Targeting of retroviral vectors through protease-substrate interactions / B.H.K. Nilson //Gene Ther. 1996. - V.3. - P.280-286.

113. O' Hare, M.J. Electropremeabilization and electrosensitivity of different types of mammalien cells/ M.J.O' Hare, M.G.Ormerod, P.R. Imrie //In: Electroporation & electrofusion in cell biology. 1989. - P.319-330.

114. Oakberg, E.F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium Am. / E.F. Oakberg // J Anat. 1956.- V.99. -P.507-516.

115. Ogawa, T. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules / T. Ogawa, J.M. Arechaga, M.R. Avarbock, R.L. Brinster // Int J DevBiol. 1997. - V.41. - P.l 11-122.

116. Ostresh, M. No barriers to entry, transfection tools get biomolecules in the door /M.Ostresh // Scientist. 1999. -V. 13.-P. 21.

117. Pain, B. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities / B.Pain, M. Clark, M.Shen, H. Nakazawa // Development. 1996. 122, 2339-2348.

118. Parreira, C.G. Development of germ cell transplants in mice/ C.G.Parreira, T.Ogawa, M.R.Avarbock, L.R.Franca, L.R.Brinster, L.D.Russel //Biology of Reproduction. 1998. - V.59. - P.1360-1370.

119. Passoni, L. Sperm cells mediated gene transfer: presence of foreign DNAinto bovine blastocyst obtained from in vitro fertilization/ L.Passoni,

120. Mauri, A.Luciano, P.Pocar, Ajmone-Marsan. et al. //A preliminary report. -1995. P.427-428.

121. Perry, A.C. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection/ A.C.Perry, T.Wakayama, H.Kishikawa et al. //Science. 1999. - V.284 (5417).-P.l 180-1183.

122. Petitte, J. Avian pluripotent stem cells / J.Petitte, G.Liu, Z. Yang// Mechanisms of Development. 2004. 121, 1159-1168.

123. Potter, 11. Molecular genetic applications of electroporation / H.Potter //In: Electroporation & electro fusion in cell biology. 1989. - P.331-341.

124. Regaud, C. Etude sur la structure des tubes seminiferes et sur la spermatogenese chez les Mammiferes / C. Regaud //Arch. anat. microsc. et morphol. exp. 1901. - V.4. - P.231-280.

125. Reis, M.JV1. Xenogeneic transplantation of human spermatogonia / M.M.Reis, M.C.Tsai, P.N.Schlegel, M.Feliciano, R.Raffaelo, Z.Rosenwaks, D.Palermo //Zygote. 2000. - V.8. - P.97-105.

126. Rossi, P. Follicle-stimulating hormone induction of steel factor (SLF) mRNA in mouse Sertoli cells and stimulation of DNA synthesis in spermatogonia by soluble SLF/ P.Rossi, S.Dolci, C.Albanesi, R.Ricca, R.Geremia //Dev. Biol. -1993.-V.155. -P.68-74.

127. Rottman, O. Liposomemediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells / O.Rottman, R.Antes P. Hofer, G.Maierhofer //J. Anim. Breed. Genet. 1991. - V. 109. - P.64-70.

128. Russell, L.D. Ultrastructural observations of spermatogenesis in mice resulting from transplantation of mouse spermatogonia / L.D. Russell, L.R. Franca, R.L.Brinster // J Androl. 1996. - V.17.-P.603-614.

129. Ruysschaert, J.-M. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells/ J.-M.Ruysschaert, A.Ouahabi, V.Willeaume //Biochem. and Bioph. Res. Comm. 1994. - V.203(3). - P.1622-1628.

130. Salter, D.W. Gene insertion into the chicken germ line by retroviruses / D.W.Salter, E.J.Smith, S.H.Hughes, S.E.Wright, A.M.Fadly, R.L.Witter, L.B. Crittenden // Poult Sci. 1986. - V. 65 (8). - P. 1445-1458.

131. Salter, D.W. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line / D.W.Salter, E.J.Smith, S.H.Hughes, S.E.Wright, L.B.Crittenden // Virology. 1987. - V.157 (1). - P. 236-240.

132. Sato, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediated gene transfer / M.Sato, R.lwase, K.Kasai, N.Tada //Animal Biotechnology. 1994. - V.5(l). - P. 19-31.

133. Schrans-Stassen, B.H. Differential expression of c-kit in mouse undifferentiated and differentiating type A spermatogonia / B.H.Schrans-Stassen, HJ.van de Kant, D.G.de Rooij, A.M. van Pelt //Endocrinology. 1999. - V.140. -P.5894-5900.

134. Shinohara, T. Enrichment and transplantation of spermatogonial stem cells /T.Shinohara, R.L. Brinster //Int. J. Androl. 2000. - V.23. - P.89-91.

135. Sperandio, S. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species / S.Sperandio, V.Lulli, M.Bacci, M.Forni, B.Maioni et al. //Anim. Biotech. 1996. - V.7. - P.59-77.

136. Thoraval., P. Inoculation of foreign DNA into testes of young cocks of domestic poultry (Gallus domesticus) / P.Thoraval, P.Trefil, G.Dambrine // Czech J. Anim. Sci. 2000. - V. 45. - P. 289-292.

137. Tsai, H.J. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta) / H.J.Tsai, C.H.Lai, H.S. Yang //Transgenic Res. 1997. - V.6(l). - P.85-95.

138. Uckert, W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy / W.Uckert, W.Walther // Pharmac. Ther. 1994. - V.63. - P.323-347.

139. Vander Wee, K. lmmunomagnetic isolation and long term culture of mouse type A spermatogonia / K.Van der Wee, E.W.Johnson, G.Dirami, M.Dym, M.C. Hofmann //J. of Andrology. 2001. - V.22. - P.697-704.

140. Von Schonfeldt, V. Magnetic cell sorting as a fast and afficient method of enriching viable spermatogonia from rodent and primate testes / V.Von Schonfeldt, H.Krishnamurthy, L.Foppiani, S.Schlatt //Biology of Reproduction. -1999. V.61. - P.582-589.

141. Weiss, R. RNA tumor viruses / R.Weiss, N.Teich, H.Varmus, J.M. Coffin // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. -1985.

142. Zhu, L. Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens / Zhu L., van de Lavoir M., Albanese J., Beenhouwer P. // Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23. - P. 115-119.