Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРОЛИКОВ КАК ОБЪЕКТА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРОЛИКОВ КАК ОБЪЕКТА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ"

я-3 3 №

На правах рукописи

ГРЕЗННА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРОЛИКОВ КАК ОБЪЕКТА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

03.00.23 - биотехнология 03.00 Л 3 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2004

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты; доктор биологических наук, профессор

Дьяконов Лев Петрович; доктор биологических наук Воробьева Светлана Владимировна

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт пушного

звероводства и кролиководства им. В.А, Афанасьева

Зашита диссертации состоится 22 июня 2004 года, в 10.00 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы.

Сдиссерт - Г - ^ ВИЖа.

Авторе^ - • !

Ученый секретарь диссертационного советь, кандидат биологических на«

В.П. Губанова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Одним из основных условий для проведения фундаментальных я прикладных исследований в области экспериментальной морфологии, биологии развития, биотехнологии молочной железы животных является знание особенностей ее строения и развития. Молочная железа представляет собой уникальную модель для изучения роста и дифференцировки клеток в динамике, так как ее становление близко к процессам, протекающим при органогенезе эмбрионов животных.

С точки зрения биоинженерии, научный интерес к маммогеиезу кроликов обусловлен тем, что на сегодня это практически единственный вид сельскохозяйственных животных, на котором многочисленные попытки клонирования с использованием соматических клеток оказываются неудачными. Вполне вероятно, что именно клетки молочной железы найдут применение в качестве доноров кариопласта.

Актуальной в настоящее время является проблема получения так называемых соматических трансгенных животных. Так как молочная железа обладает огромным потенциалом синтеза протеинов, а секрет железы, содержащий белки, может быть легко извлечен традиционными технологиями, перспективным является ее использование в качестве продуцирующего органа рекомбинантных белков. Широкое распространение в работах по локальной трансформации молочной железы получили ретровирусные векторные системы [Эрнст Л.К. и др„ 2003]. Одной из особенностей ретровирусов является возможность их репликации и интеграции лишь в интенсивно делящиеся клетки. Поэтому с целью достижения оптимальных результатов необходимо четко представлять динамику развития исследуемого органа.

Если маммогенез мышей и большинства сельскохозяйственных животных охарактеризован достаточно полно, то о развитии молочной железы кроликов в литературных источниках имеется лишь незначительная информация.

!.2. Цель м задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение гистологических и цитологических особенностей развития молочной железы кроликов как объекта для генно-инженерных манипуляций,

Для достижениялшщбьш1Л0£та.мш>Ц'4!Шены следующие задачи:

1 ЦНБ МСХА

| фонд научной пите

- получить гистологические препараты молочной железы кроликов на разных физиологических стадиях (до полового созревания, во время беременности, лактации, в лослеотьемный период);

- определить сроки активной пролиферации маммоцитов;

- выделить и охарактеризовать первичную культуру клеток маточной железы кроликов на разных физиологических стадиях;

- определить эффективность трансформации клеток молочной железы крольчих ретровирусньми генными конструкциями in vitro;

- изучить возможность трансформации секреторного эпителия молочной железы крольчих ретровнрусными конструкциями in viro.

U. Научная новизна работы, В ходе выполнения диссертационной работы впервые детально изучено развитие молочной железы крольчих в динамике. Изучен морфологический состав клеток молочной железы wt vitro. Впервые дана количественная оценка наличия в популяции клеток молочной железы крольчих, культивируемых in vitro, клеток, обладающих свойствами стволовых. Исследована эффективность трансформации маммоцитов кролика hi vitro и in vivo с использованием ретровирусной конструкции pLN-a. Показана возможность переноса чужеродных генов в клетки молочной железы посредством рекомбинантных аденовирусов.

1.4. Практическая значимость. Установлены сроки наибольшей пролиферативной активности клеток молочной железы крольчих. Показано наличие в молочной железе крольчих популяции стволово-подобных клеток,

Í.5. Основные положения, выносимые на защиту:

• Пролифераггивная активность клеток молочной железы зависит от физиологического состояния крольчих.

• В молочной железе крольчих присутствует популяция клеток с характерными признаками стволовых элементов.

• Малодифференцнрованные клетки сохраняются в первично-перевиваемой культуре маммоцнтов.

• С помощью ретровирусной векторной системы pLN-a возможна трансформация клеток молочной железы кролика in vitro,

1.6. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровины, 2003 год; на научно-практической конференции «Повышение

конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», п. Быково, 2003; на научном отчете отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровнцы. 2003; на конференции отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2004 год,

1.7. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертация написана на 114 страницах, состоит из следующих разделов? введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 1S7 источников, в том числе 80 на иностранных языках. Работа содержит 6 таблиц и 32 рисунка.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных в 2001-2004 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы отдела биотехнологии ВИЖ.

Работа выполнялась согласно схеме (рис. ]).

Исследования проводили на разновозрастных помесных (шиншилла х белый великан) крольчихах, содержащихся на экспериментальном физиологическом дворе Всероссийского ГНИИ животноводства, находящихся на разных физиологических стадиях. Материал отбирали непосредственно после забоя животных или хирургическим путем (биопсия).

Гистологические препараты и необходимые растворы готовили по классической методике [Ромейс, 1953]. Анализ гистопрепаратов проводили с использованием компьютерной программы image Scope.

В работе были использованы ретро вирусные векторные системы, состоящие из двух компонентов: генной конструкции и линии клеток-упаковщиц», и аденовирусный вектор.

Рекомбинантнни ретровирусиый вектор pLN-a. В его состав входит рекомбинантный ген эритропотгина человека, поставленный под контроль промотора а-5/-казеина крупного рогатого скота (представлена ВНИИФБиП). Для упаковки данного вектора была использована линия клеток AM-¡2 (предоставлена Фоминым И.К., Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск).

Рис. 1. Схема опыта.

Рекомбинантный ретровирусный вектор рВМШасЯ. В его состав входит ген /?-гш1актозщдаы под контролем вирусного промотора цитомегаловируса человека (СМУ). Для упаковки были использованы клетки-«упаковщицы» линии pg¡3 (предоставлены Судзриковым А.Б., Гематологический центр, г, Москва).

Аденовирусный вектор Ай 5 БЕ АР был получен на основе человеческого вируса А<#, ген белка Е1 которого заменен на рекомбинантный ген плацентарной щелочной фосфатазы (предоставлен профессором Народишнм Б,С,, Всероссийский НИИ экспериментальной медицины, г. Москва),

Линии клеток-«упаковщпц» выращивали в среде ОМЕМ с 10% РС8 и гентамипином (конечная концентрация 50 мкг/мл).

В качестве клеток-мишеней использовали клетки молочной железы кролика, ростовой средой которых являлась среда ОМЕМЛМ2 1:1 с добавлением 10% РС5, 2тМ а-глутамина, 10 нг/мл ЕвР, 5 мг/мл инсулина и гентамицина (конечная концентрация 50 мкг/мл).

Анализ интеграции и экспрессии трансгена проводили гистохимическим, цитологическим и гематологическим методами.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Становление молочной железы у кроликов.

3.1.1. Гистологическая структура молочной железы крольчих.

В ходе проведения исследований разных гру пп животных (табл. /) было установлено, что молочная железа крольчих в период полового созревания была представлена в основном жировой тканью, в которой происходило формирование протоковой системы.

Таблица, 1. Группы животных.

Неполовозрелые, мес 3,4,5

Половозрелые, мес. 6

Беременность, дней 5, 10, 15,20,25,30

Лактация, дней 2, 7, 14,21,28

Отъем, дней 2,7

Наибольшее становление молочной железы отмечалось во время беременности. К 10 дню сукрольности у разновозрастных самок на концах молочных протоков располагались альвеолоподобные образования с двухслойным кубическим эпителием, В 20 дней беременности они уже имели узкий просвет и были выстланы двух-, трехслойным эпителием, при этом отмечалось значительное количество молочных долек, разделенных толстыми слоями соединительной ткани.

С 20 по 25 дни сукрольности наблюдали интенсивное разрастание секреторной ткани в латеральном направлении. На разрезе в это время выделялось незначительное количество секрета. На гистологических препаратах было видно, что молочные дольки сложены в сплошной пласт паренхимы железы с хорошо выраженными пограничными зонами из рыхлой соединительной пеан и. Эта стадия характеризовалась наличием альвеол, выстланных однослойным кубическим эпителием с уплощенными клетками.

В подсосный период молочная железа у кроликов была распластана по грудобрюшной стенке, при пальпации ощущалось незначительное утолщение; на разрезе обильно выделялся секрет. Между молочными дольками на гистологических препаратах визуализировались тонкие прослойки соединительной ткан я. Альвеолы были хорошо сформированы, плотно прилегали друг к другу. В одном поле зрения можно было видеть как растянутые накопившимся секретом, так и спавшиеся альвеолы, с сильно сплющенными, в первом случае, и кубическими эпителиальными клетками, во втором. Нередко встречались двуядерные клетки. На протяжении всей лактации гистологическая картина молочной железы практически не изменялась.

После отъема кроликов на 7-ой день железа все еще была представлена сплошным пластом, однако, при разрезе выделялся густой липкий секрет. На гистологических препаратах бьшо видно, что альвеолы уменьшались в размере, имели неопределенную форму, паренхима заменялась соединительнотканной стромой, структура и упорядоченность клеток нарушалась, что свидетельствовало о происходящих процессах инволюции.

Даля паренхиматозной ткани в молочной железе крольчих на разных физиологических стадиях.

Суммируя данные по количеству секреторной ткани (рис. 2), можно сделать вывод, что у самок в период полового созревания отмечалось незначительное количество паренхимы. С наступлением беременности этот

показатель возрастал, и наибольшее увеличение количества секреторной ткани было отмечено с 20 ло 25 дни сукрольности.

После отъема крольчат к 7 дню доля секреторной ткани снижалась {рис. 2). Однако полной инволюции секреторного отдела не происходило, в связи с чем, у холостых ранее кропившихся самок отмечались значительные различия в структуре молочной железы, и превосходство в количестве паренхиматозной ткани по сравнению с половозрелыми молодыми самками.

Рис, 2. Зависимость дот железистой ткани молочной железы от физиологического состояния.

Примечание: х) половозрелые холостые самки.

3.1.2. Изменение ядра маммоцитое.

Одним из показателей пролиферативной активности клеток является плотность и размер их ядер.

Ядра клеток молочной железы неполовозрелых крольчих обладали относительно высокой плотностью (рис, 5) и были незначительных размеров (рис, 4). Как видно из рисунка 3, по мере полового созревания ядра клеток уплотнялись, с наступлением беременности этот показатель резко увеличивался, и одновременно уменьшался размер ядер (рис. 4). В 10 дней беременности при относительно больших размерах ядер отмечалась слабая плотность, что свидетельствует о деконденсации хроматина и наличии в этот период, в основном, диплоидных клеток.

Усиление процесса пролиферации секреторных клеток отмечалось во вторую декаду сукрольности, в связи с чем ядра становились крупными, с четко видимыми ядрышками, причем их плотность до конца беременности колебалась в незначительных пределах и оставалась на достаточно высоком уровне (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость плотности ядра клеток молочной железы от физиологического состояния.

Примечание: х) половозрелые холостые самки.

Рис. 4. Зависимость размера ядра клеток молочной железы от физиологического состояния самки.

возрЭСмес *6ереиейюсть!дн ^акгацйя, дн отъбм! да

Примечание: 6) половозрелые холостые самки.

Размер ядер с начала беременности увеличивался и в начале третьей декады достигал максимума, затем перед родами этот показатель снижался, а во время лактации снова возрастал (рис. 4).

Ядра лакгоцитов имели четкие контуры, хорошо красились, их плотность уменьшалась с первых дней и до 21-ого дня лактации (рис. 3).

При биометрической обработке данных была установлена незначительная обратная связь между долей паренхиматозной ткани и плотностью ядра клеток молочной железы молодых и ранее кролившихся самок (г=-0,397 и -0,338, соответственно). Более выраженная обратная зависимость прослеживалась между площадью и плотностью ядер маммоцитов у ранее кролнвшихся животных (г=-0,587) и прямая зависимость - между долей паренхимы и площадью ядер клеток молочной железы (г=0,<556).

3.1,3. Определение относительного количества ДНК в ядрах клеток молочной железы.

Определение относительного количества ДНК в ядрах маммоцитов показало, что в молочной железе крольчих в период полового созревания содержались преимущественно диплоидные клетки, при этом происходило незначительное накоплении ДНК в ядрах клеток, по-видимому, до триплоидного состояния.

На начальных стадиях беременности, наблюдалось хорошо выраженное накопление клеток с диплоидным и тетраплоканым содержанием ДНК, что характеризует нормальную митотическую активность ткани развивающейся железы. Однако со второй половины беременности заметно увеличение числа полиплоидных клеток. И если при 15-дневной беременности ядра клеток, в основном, были триплоидными, то к 25 дню превалировала популяция тетраплоидных клеток.

На 2-7 дни лактации наблюдалось накопление, в основном, диплоидных клеток с небольшим дополнением полиплоидных. Новая волна активизации биосинтеза ДНК отмечалась на 14 день лактации, когда выделялось наибольшее количество молока.

3.2. Культивирование клеток молочной железы.

Для изучения морфологического состава клеток молочной железы была получена первично перевиваемая культура от холостых и лактирующих самок.

Было отмечено три типа клеток: крупные и мелкие круглые клетки с большим ядром и узким ободком цитоплазмы, которые интенсивно окрашивались по Гимза, фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму.

Процентное соотношение их менялось в зависимости от количества пассажей, Как видно из графика (рис. 5), культура маммоцитов кролика, независимо от пассажа, представлена, большей частью, фибробласто подобным и клетками. Сильно варьировало количество круглых клеток разных размеров. При каждом пересеве процент круглых клеток снижался, и уже на У-У1 пассажах культура состояла в основном из фибробластоподобиых клеток.

Рис, $. Процентное соотношение разных типов клеток молочной железы кролика в зависимости от пассажа.

1 : з

О мелше круглые Вкругидо круглые

□ фибровласгопсиобные ияпл

Клетки молочной железы в период лактации, культивируемые ш vitro, были больших размеров, после прикрепления к чашке в их цитоплазме обнаруживались капли секрета. Наличие желтого цвета при окраске Суданом (характерная реакция на жир) показало, что в клетках действительно происходил синтез молока. На этой стадии пролиферация клеток in vitro не отмечалась.

3.2.1. Качественная и количественная характеристика клеток молочной железы крольчих, обладающих свойствами стволовых клеток.

Первично трипсинизированная суспензия клеток молочной железы, полученная от животных на разных физиологических стадиях, была обработана флуоресцентным красителем Hoechst 33342, который применяется для обнаружения стволовых клеток в разных органах.

Как видно из рисунка 6, популяция клеток, обладающих свойствами стволовых клеток, присутствовала в молочной железе крольчих всегда, но количество их менялось - до половой зрелости процент малодифференцированных клеток наивысший, а в период лактации он резко снижался, так как клетки к этому времени окончательно специализировались, и основной их задачей становился биосинтез молока.

Рис. 6. Количество малодифференцирова/шых клеток в молочной железе на разных физиологических стадиях.

ЗиаполмозрбЛаг »n-.mjfiajpurti»

(Непременная Сп актируемая сачка

3.2.2. Изучение поддержания в культуре клеток молочной железы крольчих, обладающих свойствами стволовых элементов, в процессе культивирования in vitro.

Согласно нашим исследованиям, малодифференцнрованными элементами молочной железы кролика являются мелкие круглые клетки с большим ядром и узким ободком цитоплазмы, интенсивно окрашивающиеся по Гимза, обладающие повышенной активностью щелочной фосфатазы и светящиеся характерным красным цветом в УФ (длина волны 350 нм) при обработке Hoechst 33342.

Рис. 7. Соотношение количества мелких круглых клеток и клеток, окрашивающихся Hoechst 33342, in vitro в зависимости от пассажа.

30,5%

1 г з

□светящиеся Вмелкие круглые клетки

Установлено, что в процессе культивирования происходит утеря стволово-подобных клеток (12,8% во II пассаже и 5,4% в 111 пассаже) (рис. 7), которая коррелирует с уменьшением количества мелких круглых клеток (г=0,832).

3.3. Использование вирусных векторных систем для трансформации соматических клеток кролика.

3.3.1, Перенос генов в маммоциты in vitro.

Селекция клеточных, популяций.

Рекомбннантные ретровирусные конструкции pBMN-lacZ и pLN-a несут доминантный маркер пео, что обеспечивает возможность селекции клеток-«упаковшиц», интегрировавших данные генные конструкции, на среде с G418. Нами были протестированы клетк и-«улаковщицы» и клетки молочной железы.

Гибель клеток, продуцирующих рекомбинантный ретровирус pBMN-JacZ, и клеток-мишеней в селективной среде отмечалась на 3-5 сутки. При этом, как видно из таблицы 2, полная гибель маммошгтов наблюдалась при концентрации генетнцина 300 мкг/мл, клеток pgl3 - 400 мкг/мл, а клетки-упаковщицы» генно-инженерной конструкции pLN-a выживали и хорошо лролиферировали даже при концентрации генетнцина 900 мкг/мл.

Таблица. 2. Устойчивость клеток к различным концентрациям генетицина в селективной среде.

Тип клеток Титр G 418 (мкг/мл)

100 200 300 400 500 600 700 800 900

Маммоциты + + - - - - - - -

pgl3 pBMN-tacZ + + + - - - - - -

AM- 12 pLNa + + + + + + + + +

Примечание: + наблюдается пролиферация клеток; ± частичная гибель клеток; - гибель всех клеток.

Трансфекция махшощтов геном pBMN-lacZ.

В результате гистохимического исследования в трех повторах культуры клеток молочной железы кролика после сокультивирования с продуцентами модифицированного ретровируса pBMN-lacZ, клеток, синтезирующих />-галактоз ид аз у (характерный сине-зеленый цвет), обнаружено не было.

Анализ экспрессии рекомбинаитного гена ЬЕро в клетках молочной железы in vitro.

В результате сокультивирования маммоцитов и клеток, продуцирующих модифицированный ретровирус, регистрировалась экспрессия рекомбинаитного белка эритропоэтнна.

При микроскопии иммуноцитологических препаратов были выявлены различия в эффективности трансфекции в зависимости от типа клеток (табл. 3).

Таблица. 3. Частота генетической трансформации клеток молочной железы геном hEpo in vitro.

Тип клеток Сокультивнрование

клетки-«упаковщицы» суперчатант К01Щ. суперчатант

общее число 2,45x10J 2,5x10"" 3,7x10"4

круглые мелкие 6,6x10"1 1x10" 3x10 s

круглые крупные 5x10"4 4x10"' 1,6x10"4

ф ибробластоподобн ые 3,6x10"J 2x10"' 1,8x10"4

Частота генетической трансформации клеток молочной железы кролика снижалась при использовании в качестве источника рекомбинаитного гена супернатанта клеток-яупаковщиц».

3.3,2. Микросферы при генетической трансформации клеток молочной железы in vitro.

С целью возможного повышения эффективности генетической трансформации клеток молочной железы кроликов были использованы полимерные гранулы и капсулы, предоставленные Всероссийским НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров. В результате исследований установили, что в процессе культивирования через отверстия данных конструкций во внешнюю среду проникали рекомбинантные ретровирусы, что подтвердилось трансформацией клеток молочной железы, культивируемых в течение суток в очищенной длительным высокоскоростным центрифугированием ростовой среде, где находились гранулы и капсулы. Однако наряду с ретровирусами через отверстия гранул и капсул выходили и продуцирующие их клетки. Освободившиеся клетки прикреплялись к чашке и начинали активно делиться, образуя целые колонии, тем самым, загрязняя культивируемые клетки-мишени.

3.4. Перенос генов посредством аденовирусных векторов in vitro.

Использование аденовирусного вектора Ad5 SEAP, несущего кДНК плацентарной щелочной фосфатазы, делает возможным перенос чужеродных генов в клетки молочной железы кролика. Анализ показал наличие в ростовой среде рекомбинантного белка, причем количество его варьировало (табл. ■/).

Таблица. 4. Количество щелочной фосфатазы в ростовой среде после обработки клеток аденовирусным препаратом Аё$ ЗЕАР, тЕО/мл

Культивирование маммоцктов со сменой ростовой среды

I смена II смена

24 ч 48 ч 24 ч 48 ч

4,9 10,6 5,2 5,3

Примечание: одна mED/мл - это количество фосфатазы, которое гидролизует 1,0 pmol PNPP до min.

3.5. Трансформация клеток молочной железы ¡n vivo.

Инъекции ретровирусных векторов осуществляли в несколько точек второй-третьей пары молочной железы кроликов на 19-23 дни беременности (pBMN-lacZ, pLN-a) и сразу после спаривания (pLN-a) (табл. 5).

Таблица. 5, Введение ретровирусных векторных систем л молочную железу крольчих.

Показатели Конструкция

рВШ-lacZ pLN- а

супернатант клетки супернатант клетки

число животных, гол 5 5 5 3

доза на одну долю 2 мл 1 млн 1 мл 0,5 млн

Образцы молочной железы отбирали на 14 день лактации или после гибели всех крольчат в гнезде, при этом исследования проводили гистологическим и цитологическим методами.

3.5.1. Изучение трансформирующей способности ретровирусной векторной системы pBMN-lacZ.

При микроскопии 18 гистосрезов, полученных из разных мест молочной железы от каждого животного, участков с характерным для клеток, синтезирующих /?-галактозидазу, сине-зеленым цветом обнаружено не было. Микроскопический анализ выделенной и обработанной культуры клеток также не дал положительных результатов.

3.5.2. Оценка интеграции и экспрессии рекомбинантного гена hEpo in

vivo.

В результате микроскопии 16 гистосрезов от каждого животного участков с характерным красно-коричневым окрашиванием для комплекса эритропоэтин-антитела не наблюдалось.

Кроме тканей молочной железы на наличие экспрессии рекомбинантного гена hEpo было исследовано молоко опытных животных методом ИФА. В результате сигнал присутствия рекомбинантного эритропоэтина не поступил, что могло быть связано с его наличием ниже порога детекции метода, т.е. менее 50 нг/мл.

Таблица 6, Показатели гематологических исследований

Показатели л й Супернамант а Клетки Контроль

о. о Ж 384 389 404 358 388 427 437 475 433 336 405 438" 400"

1 2 1 2 1 2

Гемоглобин, г% 10-12,5 о" щ 00 о" •'¿Г; о' Ж м • \а е> Ч. о оГ г-д ее "ПуЙ

Эритроциты, ¿^" 41 Л

млнУмкл 1 VI ■ ЧО й/ г-' ;г= V, л > о\ м «Г <*> Г-." ае ■о 511 VI ОХ Г«'-'" ■г» 1 1 ] Г*1 ЧО о ЧО ЧО •о о ■чг. м о ч-Г Г) ч-" гг •л

Примечание: *1 ретровнрусный вектор введен в день спаривания,

") контроль для животных, ретровнрусный вектор которым был введен вдень спаривания;

1) анализ на 3 день после введения конструкции;

2) анализ на 2 неделю лахташш.

Поскольку уровень экспрессии ретровирусных генных конструкций может быть относительно низким, нами были выполнены исследования косвенной оценки экспрессии эритропоэтина у опытных животных. Для этого провели гематологические исследования крольчих, в молочную железу которым были введены рекомбннантные ретровирусы (табл. 6).

В качестве контроля использовались животные, аналогичные по физиологическому состоянию.

Из табличных данных следует, что в группе животных, которым в день спаривания вводили ретровирусный вектор рЬЫ-а в виде супернатанта клеток-«упаковщнц», количество эритроцитов и гемоглобин на третий день после инъекций увеличивались, соответственно, на 6% и 11,2%. Показатели крови у этих же животных на вторую неделю лактации соответствовали физиологическим нормам.

Таким образом, полученные данные можно рассматривать в качестве косвенного доказательства наличия экспрессии эритропоэтина, обусловленной введением в молочную железу крольчих генно-инженерной конструкции. Однако уровень экспрессии был относительно низким и поэтому не мог быть выявлен ни одним из используемых химических методов детекции.

4. ВЫВОДЫ

1, Молочная железа кроликов меняет свою структуру и размеры в зависимости от физиологического состояния: до половозрелое™ молочная железа в основном представлена жировой тканью, в которой происходит формирование системы выводных каналов; в период сукрсльности наблюдается интенсивное становление паренхиматозной ткани, достигающее максимума в третьей декаде беременности; лактационный период характеризуется наивысшей секреторной деятельностью маммоцитов; в послеотьемный период в молочной железе происходят инволюционные процессы, но альвеолы при этом полностью не исчезают, алишь уменьшаются в размерах и сжимаются,

2. Наибольшая пролнферативная активность клеток молочной железы кроликов отмечается в первые дни беременности с началом деления малодифференцированных элементов и с 20 по 25 дни сукрольности в период максимального увеличения количества секреторных клеток. Независимо от физиологического состояния в молочной железе кроликов всегда присутствуют

малодифференциро ванные клетки, но количество их варьирует от 1,7% в период лактации до 6,8% - в период, предшествующий половому созреванию,

3. Первичная культура клеток молочной железы крольчих in vitro представлена тремя типами клеток: мелкие и крупные круглые, и фибробластоподобные клетки, на долю которых в 1 пассаже приходится, соответственно, 30,5, 19,9 и 49,6%. Среди популяции мелких круглых клеток, которые морфологически подобны стволовым клеткам (большое ядро и узкий ободок цитоплазмы, повышенная активность щелочной фосфатазы), обнаружены малодифференцированные клетки, количество которых в I пассаже составляет 14,4%. Установлено, что в процессе культивирования происходит утеря стволово-подобных элементов (12,8% во II пассаже и 5,4% в III пассаже), что коррелирует с уменьшением количества мелких круглых клеток (i=0,832).

4. Культура клеток молочной железы крольчих может быть трансформирована ретровирусным вектором pLN-a, несущим ген эритропоэтина человека, с частотой генетической трансформации до 2,45хЮ"3. Наиболее компетентными к генно-инженерной конструкции оказались фибробластоподобные клетки (до 3,88xJO*3X в то время как частота трансформации мелких и крупных круглых клеток не превышала, соответственно, 6,76х10"4 и 6,5 x1o"4.

5. Доказана возможность -трансформации молочной железы крольчих ретровирусной генно-инженерной конструкцией m vrvo, однако уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке крольчих был ниже 50 нг/мл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Лабораториям, занимающимся локальным трансгенезом молочной железы кроликов, рекомендуем учитывать период наибольшей пролиферетивной активности маммоцитов - 20-25 дни сукрольности.

2. Рекомендуем продолжить изучение малодифференцированных клеток молочной железы, необходимых при биоинженерных работах на кроликах.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Грезина Я.Л/.. Шихов ИХ, Зиновьева H.A. Приготовление гистологических препаратов маточной железы кроликов I Сб. Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ. - Дубровицы. - 2002. - С. 2532.

2. Грезим ИМ. Определение пролиферативной активности клеток молочной железы крольчих / Сб. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. - ВИЖ. - Дубровицы. -2002.-С. 11S-12Q.

3. Грешна И.М. Становление молочной железы крольчих // Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - Быково. - РАМЖ, вып. 9. - 2003. - С. 175-176.

4. Грезина Я.М. Использование ретровнрусных векторов для трансформации клеток молочной железы кроликов in vitro t Сб. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. - Дубровицы. - 2003. - С. 99-101.

5. Грезина И.М., Зиновьева H.A. Стволовые клетки молочной железы как инструмент биоинженерии сельскохозяйственных животных // Достижения науки и техники АПК. -2003. 10.-С. 14-16.

Ф1*

Издательство РУЦ ЭБГЖ 142132, Московская обл.. Подольский р-н, аДуброшшы Тел, (8-27)65-14-24,(8-27)65-14-07

Сдано в набор 17.05.2004. Подписано а чечвггь 18.05.2004 _Заказ № 17. Печ. а. 1,1 Тираж90эю._