Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-"упаковщиц"

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-"упаковщиц""

На правах рукописи

ВОЛКОВА Людмила Александровна

, ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ КЛЕТОК-«УПАКОВЩИЦ»

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2005

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства РАСХН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шихов Игорь Яковлевич; доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович.

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К И Скрябина (МГАВМиБ).

Защита диссертации состоится «Л. ^ 2005 года, в 10 часов, на заседании

диссертационного совета Д 006 013 01 при учреждении Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ)

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос Дубровицы, ВИЖ, факс 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан чЯ! » ¿¿-^/¿£<^.¿.2005 года

Ученый секретарь диссертационного кандидат биологических наук

В П Губанова

яшг

Аз

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для создания трансгенных животных используют целый ряд методов' микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот, вирусная трансфекция, использование спермиев как переносчиков ДНК, пересадка ядер трансформированных эмбриональных стволовых клеток, липосомальный транспорт генов [Зиновьева, Эрнст, 2004]. Исторически более ранним методом является метод микроинъекции ДНК, с использованием которого были получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные [Hammeret al, 1985; Вгет et al, 1985]. Однако данный метод характеризуется низкой эффективностью трансгенеза- интеграция рекомбинантной ДНК в зависимости от вида животного наблюдается только в 0,5-1% случаев [Брем и др., 1995]. Причем около 40% полученных трансгенных животных в последующем не экспрессируют чужеродный белок ¡Wilmut I. et al., 1991; Hennighausen L etal, 7992]

В этой связи актуальным является разработка альтернативных методов переноса генов, позволяющих повысить эффективность трансгенеза Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Благодаря эволюционно сложившемуся механизму интеграции вирусной РНК в геном клетки-хозяина, ретровирусные векторы позволяют эффективно осуществлять трансформацию клеток-мишеней, как in vivo, так и in vitro Они самостоятельно проникают в клетки-мишени и эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку. Огромным преимуществом данных векторов является возможность их использования для получения так называемых соматических трансгенных животных методом локального (органного) трансгенеза, что позволяет значительно сократить сроки получения трансгенных индивидуумов [Титова В.А, 2001; Волкова НА, 2002; Гзоздь И М, 2002]. Ретровирусные вектора рассматриваются в качестве перспективного метода и в случае получения трансгенных кур [Mizuarai S et al, 2001; Harvey A J etal, 2002; Mozdziak P E et al „ 2003], особенности воспроизводства которых делают использование метода микроинъекции для этих целей малоэффективным

Однако эффективность трансформации клеток-мишеней ретровирусными векторами во многом определяется используемой линией клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус В этой связи, возникает необходимость в оценке различных линий клеток-«упаковщиц» для использования в трансгенезе соматических и эмбриональных клеток животных in vitro и in vivo.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование эффективности генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-«упаковщиц».

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи: 1 Провести трансфекцию первичной культуры клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro с использованием двух типов клеток-«упаковщиц» АМ12 и рд13

2. Изучить динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коров, коз и свиноматок после введения в молочную железу генных конструкций, инт линию

3 Усовершенствовать метод получения трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов

4 Определить эффективность трансформации клеток эмбрионов кур in vivo на уровне ДНК.

5 Выявить факторы, определяющие эффективность трансформации клеток эмбриона кур in vivo.

6. Дать сравнительную оценку использования двух типов клеток-«упаковщиц» для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые проведена оценка двух типов клеток-«упаковщиц» АМ12 и рд13 для переноса экзогенной ДНК в первичные клетки молочной железы млекопитающих и эмбрионы кур in vitro. Впервые осуществлена трансформация клеток молочной железы коров, коз и свиноматок in vivo пакующей линией рд13 и изучена динамика экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных в ходе лактации.

Впервые оценена эффективность использования ретровирусных векторов для трансгенеза эмбрионов кур in vivo, и на основе сравнительного анализа различных способов введения генных конструкций в эмбрионы кур отработан метод получения трансгенных кур Получены трансгенный петух, несущий структурный ген эритропоэтина человека в клетках крови, кишечнике, печени, сердце и курица с интеграцией рекомбинантной ДНК (ген гормона роста человека) в сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке. Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур.

Практическая значимость работы. Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, имеют практическую значимость. Оценена эффективность использования двух типов клеток-«упаковщиц» АМ12 и рд13 для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo. Усовершенствован метод получения трансгенных кур посредством использования ретровирусных векторов Выявлены факторы, определяющие эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo

Основные положения, выносимые на защиту:

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo

• Периодичность синтеза рекомбинантных белков в молоко соматических трансгенных животных

• Влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур т vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, ВИЖ, 2003; на III международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 2004; на международной научно-

« U i«

практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы, ВИЖ, 2004; на III международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Экспоцентр, 2005; на конференциях отдела биотехнологии ВИЖ, 2002-2005 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на страницах,

содержит // таблиц, J. 6 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает //О источников

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа была выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных отдела биотехнологии ВИЖ, ОПХ «Дубровицы», э/х «Кленово-Чегодаево» в период с 2002 по 2005 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы отдела биотехнологии ВИЖ.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

В работе были использованы три генные конструкции pLN-a, pLN-G-CSF и рХ-RSVhgh, каждая из которых была помещена в одну из пакующих линий клеток рд13 или АМ12. Генные конструкции pLN-a и pLN-G-CSF (предоставлены д.б.н., профессором Рябых В.П., ВНИИФБиП, г. Боровск и к.б.н. Фоминым И.К., БелНИИ переливания крови, г. Минск) были получены на основе вектора pLNS путем встраивания в прямой ориентации в сайт Xho I под контролем промотора asi-казеина крупного рогатого скота генов эритропоэтина человека (ЭПО) в первом случае, и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) - во втором (рис. 2).

Для получения генной конструкции pX-RSVhgh (предоставлена к.б.н. Фоминым И.К., БелНИИ переливания крови, г. Минск) в полилинкер pLXSN по сайтам рестрикции EcoRI и BamHI были встроены два фрагмента: хромосомальный фрагмент BamHI-Smal (1.53 kb) и фрагмент EcoRI-Sacl (0.41 kb) из плазмиды pLP2 (Invitrogen). Первый фрагмент содержал ген гормона роста человека, второй - промотор RSV (вирус саркомы Рауса) (рис.3).

Используемые для упаковки генных конструкций в вирусные частицы линии клеток АМ12 (предоставлена И К Фоминым, Белорусский НИИ переливания крови, г Минск) и рд13 (предоставлена А.Б. Судариковым, Гематологический центр, г. Москва) были получены на основе эмбриональных фибробластов мыши NIH3T3, в которые последовательно были встроены вирус-кодирующие последовательности gag, pol и env. Линия АМ12 содержала белок env амфотропного вируса лейкемии мышей Молони (MLV), который способен взаимодействовать с рецепторами, присутствующими на клетках многих видов - от птиц до человека Линия рд13 экспрессировала белок env вируса лейкемии гиббона (GaLV), который также проявляет тропизм к широкому спектру клеток-хозяев за исключением мыши

Культивирование пакующих линий клеток, продуцирующих рекомбинантный ретровирус, осуществляли в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 2мМ L-глутамина и антибиотика (гентамицина) в конечной концентрации 50 мкг/мл.

Рисунок 1. Схема исследований.

Xhol

pLNS

пп

H4

ЕР рА

NEO

600

900

800........

1 ^

1400

420

pLNa

pLN-G-CSF

asi-казеин/эритропоэтин

asi-казеин/Г-КСФ

Рисунок 2. Схема строения вектора pLNS LTR - длинный концевой повтор, Ф+ -сигнал упаковки, Н4 - промотор гистона человека, NEO - ген устойчивости к неомицину, ЕР - делеция в области промотора-энхансера, рА - сигнал полизденилирования

éOObp 900 410 1530 360 800 600

LTR RSV hgh SV neo LTR

Г S III 1 Е ES S 1 S

Рисунок 3. Схема строения генной конструкции pX-RSVhgh RSV - промотор вируса саркомы Рауса; SV - промотор ранних генов вируса SV40, neo - ген неомицинфосфотрансферазы из транспозонз Тп5, В - BamHI, Е - EcoRI, S - Sacl, SI - Sail, X - Xhol.

Для культивирования первичной культуры клеток молочной железы коровы, свиньи, козы и эмбрионов кур использовали ростовую среду следующего состава: 45% F-12,45% DMEM, 10% сыворотки плода коровы (СПК), 2мМ L-глутамин, гентамицин (50 мкг/мл). В случае культивирования первичных клеток молочной железы в ростовую среду добавляли инсулин в конечной концентрации 3,5 мкг/мл. Снятие клеток с субстрата проводили с помощью 0,25% раствора трипсина, рН=7,6. Криоконсервирование клеток осуществляли с использованием следующей криозащитной среды: 10% ДМСО, 40% СПК, 50% DMEM.

Первичную культуру клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур получали путем механической и ферментативной обработки ткани. В последнем случае использовали растворы 0,25% трипсина и коллагеназы.

Трансформацию клеток-мишеней in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-«упаковщицами» и инфицирования вирусным препаратом, представляющим собой культуральную жидкость, содержащую рекомбинантный ретровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток

Введение генных конструкций in vivo осуществляли в молочную железу сельскохозяйственных животных (коров, коз, свиноматок) и эмбрионы кур Клетки молочной железы трансформировали путем множественной инъекции суспензии клеток-«упаковщиц» непосредственно в паренхиму вымени взрослых животных. В опыте было использовано 4 коровы, 6 коз и 4 свиноматки. Раствор генных конструкций (клетки-«упаковщицы» и культуральную жидкость) в клетки эмбрионов кур вводили до начала инкубации яиц непосредственно в зародышевый диск и на более поздних стадиях развития эмбриона на первый, второй дни инкубации в эмбрион и на третий день - в дорсальную аорту.

Наличие генной конструкции в тканях и органах опытных животных определяли методом ПЦР по стандартной методике Выделение ДНК из крови, спермы и ткани осуществляли с использованием солевого и перхлоратного методов [Зиновьева и др, Í998]. Праймеры, используемые для анализа, имели следующую последовательность-neo - cct-tct-tga-cga-gtt-ctt-ctg-a, mlv - tag-cct-gcc-aaa-cct-aca-ggt.

Экспрессию рекомбинантных белков в молоке и тканях опытных животных определяли методами иммуноферментиого анализа и иммуногистохимии.

Для проведения иммуногистохимических исследований образцы молочной железы, полученные прижизненно (биопсия) или после убоя животного, фиксировали в 10% формалине. Гистологические препараты готовили по общепринятой методике (Ромейс, 1953). Локализацию рекомбинантного белка в клетках молочной железы выявляли с помощью набора «Novostatin Super ABC Kit» (Novocastra) Для детекции продукта иммуногистохимической реакции использовали 3,3-диаминобензидина тетрахлорат (ДАБ) или З-амино-9-этилкарбозол (АЕС) фирмы «Sigma»

Получение и приготовление препаратов митотических хромосом кур осуществляли по модифицированной нами методике [Волкова Л.А и др, 2004] Для цитогенетического анализа полученных препаратов хромосом использовали цифровую видеокамеру КС-583С (Тайвань) и программу Image Scope 1 (фирма СМА, Россия) в комплексе с программой Photoshop 5.5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных

животных

Трансформацию клеток молочной железы сельскохозяйственных животных осуществляли с использованием двух ретровирусных векторов pLN-a и pLN-G-CSF, каждый из которых был помещен в одну из пакующих линий клеток АМ12 или рд13 В данном направлении была проведена серия экспериментов по введению экзогенной ДНК в клетки-мишени in vivo и in vitro

3.1.1. Трансфекция клеток молочной железы сельскохозяйственных

животных in vitro

Эксперименты по трансфекции первичной культуры клеток молочной железы коровы, свиньи и козы ретровирусными векторами выявили различия в способности используемых пакующих линий АМ12 и рд13 инфицировать клетки-мишени (таблица 1)

Таблица 1. Результаты трансфекции клеток молочной железы in vitro

Вид Линия клеток-«упаковщиц»

животно АМ12 Pfl13

го pLN-a PLN-G-CSF pLN-a PLN-G-CSF

частота П частота п частота П частота П

генетич. Ц генетич. ц генетич. Ц генетич. Ц

трансформ.' р трансформ. р трансформ. Р трансформ. Р

коза 8-Ю-4 + 3-1СИ» + 6-1СИ» + 2-1(Н +

свинья 2-Ю-3 + 3-1(Н + 9*10"4 + 1-1(И +

крс 1,5-Ю-з + 6-1(Н + МО-з + 5-Ю-4 +

Примечание: Частота генетической трансформации - отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Наиболее эффективной в переносе экзогенной ДНК оказалась линия АМ12. Так, при трансформации клеток молочной железы свиньи рекомбинантным вектором pLN-a, упакованным в данную линию, из 10000 инфицированных клеток было получено 20 трансформированных клонов (2-103), в то время как при использовании пакующей линии рд13 данный показатель составил только 9 клонов (9-10-4) Во всех остальных опытах по переносу экзогенной ДНК 8 клетки-мишени также отмечались различия по частоте генетической трансформации в пользу линии АМ12, однако эта разница была менее значительной.

Частота генетической трансформации варьировала и в зависимости от используемой генной конструкции. Максимальное число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании с клетками-«упаковщицами», содержащими рекомбинантный ретровирусный вектор pLN-a. В случае использования генной конструкции pLN-G-CSF эффективность трансформации клеток-мишеней была в 2-9 раз ниже.

Таким образом, эффективность трансформации клеток молочной железы in vitro определялась генной конструкцией и пакующей линией клеток. Наиболее высокая частота генетической трансформации клеток-мишеней была установлена при использовании генной конструкции pLN-a и пакующей линии АМ12

3.1.2. Введение экзогенной ДНК в клетки молочной железы

сельскохозяйственных животных in vivo

Следующим этапом работы было введение экзогенной ДНК в клетки-мишени in vivo. В опытах была использована пакующая линия рд13.

Введение генных конструкций в молочную железу коз. Введение клеток-«упаковщиц» осуществляли на третьем, четвертом и 4,5 месяцах сукозности Каждому животному было введено 20 млн. клеток (по 10 млн на одну долю вымени) Четырем опытным козам (№16, №22, №7, №15) была введена генная конструкция pLN-a, двум (№20 и №19) - генная конструкция pLN-G-CSF

Проведенные исследования показали, что наиболее высокая экспрессия рекомбинантного белка с молоком опытных животных наблюдалась при использовании генной конструкции pLN-a В данном случае содержание рекомбинантного ЭПО в молоке коз достигало 350 нг/мл (козы N27 и №15) При введении генной конструкции pLN-G-CSF

концентрация рекомбинантного Г-КСФ не превышала значений 95-100 нг/мл Средний уровень экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе коз также был выше по сравнению с экспрессией рекомбинантного Г-КСФ Если в первом случае содержание рекомбинантного продукта в молоке опытных животных достигало в среднем от 45+14,2 нг/мл (коза №16) до 92±28,0 нг/мл (коза №15), то в последнем данный показатель был ниже в 1,7-3,4 раза и составил всего лишь 27±7,79 нг/мл.

Следует отметить значительную разницу между максимальным и средним уровнями экспрессии рекомбинантных белков, что связано с периодичностью синтеза данных белков в молочной железе опытных коз в течение лактации У всех опытных животных независимо от используемой генной конструкции наблюдались периоды подъема и спада секреции рекомбинантного продукта в молоко (рис. 4).

—

№16

■№7

■№15

1 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Дни лактации

Рисунок 4. Динамика экспрессии рекомбинантного ЭПО в молоко коз в течение лактации.

Введение генных конструкций в молочную железу коров. Введение клеток-«упаковщиц» осуществляли на 7-7,5 месяцах стельности в концентрации 60 млн. клеток на животное (по 30 млн на долю вымени). В молочную железу трех коров №3600, №55 и N23168 была введена генная конструкция р/_Л/-а, одной корове №3522 - конструкция

Как и у коз, наиболее эффективным оказалось введение в молочную железу генной конструкции р1А/-сг При использовании данной конструкции максимальное содержание рекомбинантного ЭПО в молоке опытных коров достигало 400 нг/мл (коровы №55, №3168) и даже 1000 нг/мл - у первотелки №3600 По сравнению с секрецией секреторными клетками вымени ЭПО, рекомбинантный Г-КСФ экспрессировался в молоко в меньших количествах и достигал максимального значения 150 нг/мл (корова №3522) Тенденция зависимости уровня экспрессии рекомбинантного продукта от используемой генной конструкции сохранялась и в отношении средних показателей

экспрессии Средний уровень экспрессии рекомбинантного продукта с молоком опытных коров, также как и максимальный, был выше при использовании генной конструкции рШ-а - от 88±36,9 до 198+79,4 нг/мл Средняя концентрация рекомбинантного Г-КСФ в молоке была на 72-87% ниже уровня экспрессии рекомбинантного ЭПО и составила 25+8,5 нг/мл. Однако следует отметить, что в отличие от коз, экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе коров наблюдалась только первые три-четыре месяца лактации, в последующие дни ИФА не выявил наличия рекомбинантных белков молоке (рис 5).

лактации.

Введение генных конструкций в молочную железу свиноматок. Наряду с коровами и козами генные конструкции ЭПО и Г-КСФ человека были введены в молочную железу 4 свиноматок Каждому животному было введено 60 млн. клеток (по 10 млн. клеток на долю вымени).

Как и в предыдущих опытах, содержание рекомбинантного ЭПО в молоке опытных животных было значительно выше, чем рекомбинантного Г-КСФ. Если в первом случае концентрация рекомбинантного продукта в молоке достигала 350-400 нг/мл, то во втором данный показатель составил всего лишь 45-65 нг/мл.

Оценивая динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком свиноматок, следует отметить, что их содержание в молоке в различные периоды лактации варьировало Практически у всех опытных животных независимо от введенной генной конструкции максимальная активность синтеза белка наблюдалась первые 2 недели лактации {рис. 6).

Дни лактации

Рисунок 6. Экспрессия рекомбинантного ЭПО в молоко свиноматок

Данные об уровне экспрессии рекомбинантных белков (ЭПО и Г-КСФ) в молочной железе опытных животных суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Экспрессия рекомбинантных белков с молоком опытных животных

№ Рекомбинант- Стадия введения Кол-во Уровень экспрессии,

живот ный белок (месяц введенных нг/мл

нога беременности) клеток, млн. М+т Макс

Козы

16 ЭПО 3 20 45±14,2 200

22 ЭПО 3 20 56±14,3 200

7 ЭПО 4 20 88±41,1 350

15 ЭПО 4,5 20 92+28,0 350

19 Г-КСФ 4 20 29±6,5 100

20 Г-КСФ 4 20 24±6,1 95

Коровы

3600 ЭПО 7 60 198+79,4 1000

55 ЭПО 7,5 60 102+37,9 400

3168 ЭПО 7 60 88±36,9 400

3522 Г-КСФ 7 60 25±8,5 150

Свиноматки

3567 ЭПО 3 60 137±32,4 350

641 ЭПО 3 60 123±32,8 400

6169 Г-КСФ 3 60 18±4,5 "" 45 """

3566 Г-КСФ 3 60 20±4,9 65

3.1.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе опытных животных

С целью определения локализации рекомбинантного продукта в клетках молочной железы были выполнены иммуногистохимические исследования ткани вымени пяти опытных коз на втором и четвертом месяцах лактации.

В отдельных срезах были выявлены небольшие участки трансформированных секреторных клеток, причем включения ЭПО встречались как в просвете альвеол, так и внутри эпителиального слоя.

Секреторные клетки, имеющие после иммуногистохимического окрашивания характерную красную окраску, были выявлены у всех исследованных коз, как на втором, так и на четвертом месяцах лактации Однако частота их встречаемости была низкой и варьировала у разных животных, хотя четкой прямой зависимости от стадии введения генных конструкций и уровня экспрессии ЭПО, установленного методом ИФА, выявлено не было.

3.1.4. Факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток молочной железы /л vivo.

Анализ экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных показал, что на уровень их синтеза оказывал влияние ряд факторов, таких как 1) генная конструкция; 2)период лактации; 3) вид животного

Генная конструкция У всех опытных животных независимо от стадии введения генных конструкций концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке была значительно выше уровня экспрессии Г-КСФ. Средняя концентрация рекомбинантного Г-КСФ составляла всего 15-43% от уровня экспрессии ЭПО При этом максимальное содержание ЭПО в молоке достигало от 350 до 1000 нг/мл, в то время как рекомбинантный Г-КСФ экспрессировался в количестве 65-150 нг/мл

Период лактации. В ходе лактации экспрессия рекомбинантных белков с молоком опытных животных была непостоянна и характеризовалась периодичностью: периоды активного синтеза рекомбинантного продукта чередовались с периодами спада его секреции Наибольшее число пиков активного синтеза белка наблюдалось в первую треть лактации (табл. 3).

Таблица 3. Средние показатели уровня экспрессии рекомбинантных белков в молоко опытных животных в течение лактации, нг/мл (М±т)__

Вид животного Рекомбин. белок Период лактации

1 треть 2 треть 3 треть

Коровы ЭПО 129±27 0 0

Г-КСФ 25+8,5 0 0

Свиньи ЭПО Г-КСФ 183+48,3 150+12,5 31±9,5

30±6,8 15±3,8 6+0,9

Козы ЭПО 97+19,3 68±18,2 12±3,7

Г-КСФ 41+4,3 26±3,1 6±2,1

Средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке в первую треть лактации была выше уровня экспрессии данного белка во вторую и последнюю треть лактации соответственно в 1,2-1,4 и 5,9-8 раз Данная тенденция сохранялась и при введении генной конструкции р1А/-6-С8Р Среднее содержание рекомбинантного Г-КСФ в молоке опытных животных в первую треть лактации достигало 25-41 нг/мл, что было на 37-86% выше уровня экспрессии рекомбинантного продукта во вторую и последнюю треть лактации.

Вид животного Уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком также варьировал в зависимости от вида животного. Исследования, проведенные на трех видах животных - коровах, козах и свиньях - показали, что наиболее результативным оказалось введение ретровирусных векторов в молочную железу свиноматок. Средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке данных животных (за лактацию) достигала 130±25,3 нг/мл, в то время как у коз и коров этот показатель составил, соответственно, 62+14,1 нг/мл и 43±9 нг/мл. Однако максимальная экспрессия ЭПО была выявлена у коров -1000 нг/мл.

При введении в молочную железу опытных животных генной конструкции А/-6-СБР максимальный показатель среднего содержания рекомбинантного Г-КСФ в молоке был установлен у коз - 27+7,79 нг/мл, что было в 1,4 раза выше уровня экспрессии данного белка с молоком свиноматок и более чем в 3 раза с молоком коров. Максимальная экспрессия Г-КСФ, как и в случае ЭПО, была выявлена у коров - 150 нг/мл {рисунок 7).

, ЭПО Г-КСФ

Рисунок 7. Уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоко в зависимости от вида животных.

3.2 Трансформация клеток эмбрионов кур

Трансформацию эмбриональных клеток кур осуществляли с использованием следующих векторных систем' AM12/pLN-a, AM12/pX-RSVhgh и pg13/pLN-a Эксперименты проводились в двух направлениях - введение генных конструкций в эмбриональные клетки кур в культуре (in vitro) и трансформация эмбрионов кур на разных стадиях развития in vivo.

3.2.1. Трансфекция эмбриональных клеток кур in vitro

Результаты трансфекции эмбриональных клеток кур in vitro представлены в таблице 4

Таблица 4. Результаты трансфекции эмбриональных клеток кур in vitro

Конструкция Совместное культивирование

клетки-«упаковщицы» культуральная жид кость

частота генетич. [ ПЦР трансформации ! частота генетич трансформации ПЦР

AM12/pLN-oc 3-Ю-3 ¡ + 8-10^ +

pg13/pLN-a 2-Ю-3 , + 8-1 (И +

AM12/pX-RSVhgh 5-Ю-3 ¡ + МО-3 +

Примечание: частота генетической трансформации - отношение числа полученных генетически трансформированных клонов к общему числу инфицированных клеток.

Наиболее эффективной в переносе экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур оказалась векторная система AM12/pX-RSVhgh, как при использовании клеток-«упаковщиц», так и культуральной жидкости, содержащей рекомбинантный ретровирус (соответственно 5-1Q-3 и МО-3). Трансформация клеток-мишеней векторными системами AM12/pLN-a и pg13/pLN-a оказалась менее результативной С использованием данных систем из 10000 инфицированных клеток было получено от 8 (8-Ю4) до 20-30 генетически трансформированных клонов (2-10 3 и 3-10-3).

Частота генетической трансформации варьировала также в зависимости от пакующей линии клеток и метода трансфекции Наибольшее число генетически трансформированных клонов было получено при использовании линии клеток-«упаковщиц» АМ12 В данном случае частота генетической трансформации была на 33% выше, чем при использовании пакующей линии рд13 Наиболее высокая эффективность трансформации клеток-мишеней отмечалась и в случае их совместного культивирования с клетками-«упаковщицами».

Таким образом, эффективность трансформации первичных клеток эмбриона курицы in vitro определялась используемой векторной системой, пакующей линией клеток и методом трансфекции Более результативным оказалось введение в клетки-мишени ретровирусных векторов, помещенных в пакующую линию АМ12, причем большее число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-«упаковщицами»

3.2.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур /л vivo

Введение генных конструкций осуществляли на разных стадиях развития эмбриона кур В качестве источника генных конструкций использовали клетки-«упаковщицы» и культуральную жидкость, содержащую рекомбинантный ретровирус.

3.2.2.1 Трансформация клеток эмбрионов кур культуральной жидкостью

Культуральную жидкость вводили в зародышевый диск и эмбрионы кур в количестве 1-100 мкл. Были проведены следующие опыты.

Опыт №1. Введение культуральной жидкости осуществляли до начала инкубации яиц в количестве 100 мкл с помощью инсулинового шприца путем прокола скорлупы в тупом конце яйца. В опыте были использованы три ретровирусные векторные системы AM12/pLN-a, pg13/pLN-a и AM12/pX-RSVhgh.

Проведенные исследования показали, что наименьшее влияние на эмбриональное развитие кур оказала генная конструкция pg13/pLN-a. В данном случае из 50 проинъецированных яиц вылупилось 8 цыплят, при этом развитие эмбрионов наблюдалось в 72% случаев. При введении векторных систем AM12/pLN-a и АМ12/рХ-RSVhgh процент выпупа и процент развившихся эмбрионов составил соответственно 4%, 54% и 10%, 40%. Однако, если в первом случае частота интеграции рекомбинантной ДНК составила только 7,4%, то в последнем —18,8%.

Необходимо отметить, что наличие чужеродной ДНК отмечалось в основном у погибших в процессе инкубации эмбрионов. Среди вылупившихся цыплят рекомбинантная вставка была выявлена только в одном случае - у петуха №3976 (вводили векторную конструкцию AM12/pLN-a). У данной птицы наличие рекомбинантной ДНК было установлено в клетках крови, печени, сердце и кишечнике.

Наряду с ПЦР-анализом были выполнены цитогенетические исследования клеток крови данного петуха. Учитывая то, что в кариотипе кур идентификация большинства микрохромосом в силу их малых размеров и вариабельности числа невозможна, изучение влияние экзогенных конструкций на состояние генома проводили на уровне макрохромосом и половых хромосом Проведенный цитогенетический анализ не выявил структурных нарушений в системе исследованных макрохромосом.

Опыт №2. Введение культуральной жидкости осуществляли на разных стадиях развития куриного эмбриона: до начала инкубации в зародышевый диск, на первый и второй дни инкубации в эмбрион и на третий день - в кровь. В каждом случае было проинъецировано по 21 яйцу. Вирусный препарат в количестве 1 мкл вводили в эмбрионы кур через окно, вырезанное в экваториальной области (при введении генной конструкции до начала инкубации) или в тупом конце яйца. В опыте была использованная конструкция pX-RSVhgh.

Как и в опыте №1, процент вылупа в опытных группах был значительно ниже, чем в контрольной и варьировал в зависимости от стадии введения генной конструкции Наибольшее число цыплят было получено при введении культуральной жидкости на второй день инкубации. В данном случае из 21 проинъецированного яйца вылупилось 4 цыпленка. При введении генной конструкции на первый и третий дни инкубации было получено всего по 2 цыпленка.

ПЦР-анализ погибших в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал, что более эффективным с точки зрения трансформации клеток-мишеней

оказалось введение вирусного препарата на первый и третий (в кровь) дни инкубации Положительные сигналы были выявлены у двух эмбрионов из шести развившихся в первом случае и из пяти - во втором.

Вылупившихся цыплят и взрослую птицу исследовали прижизненно путем анализа ДНК, выделенной из ткани гребешка, крови и спермы При этом из восьми исследованных кур рекомбинантная ДНК не была выявлена ни в одном случае

Данные о введении культуральной жидкости в эмбрионы кур in vivo суммированы в таблице 5.

3.2.2.2 Трансформация клеток эмбрионов кур суспензией клеток-«упаковщиц»

Клетки-«упаковщицы» вводили в зародышевый диск и эмбрионы кур в концентрации 10 тыс клеток В экспериментах была использована векторная система AM12/pX-RSVhgh.

Опыт №1 Суспензию клеток-«упаковщиц» вводили до начала инкубации с помощью инсулинового шприца путем прокола скорлупы с тупого конца яйца. Конечный объем суспензии 50 мкл.

Из 40 проинъецированных яиц было получено 5 цыплят, что составило 15% от вывода молодняка в контрольной группе. По сравнению с контрольной группой в опыте также отмечалась высокая эмбриональная смертность Если в контрольной группе развитие эмбрионов наблюдалось в 93% случаев, то в опыте данный показатель составил только 40%.

Анализ на трансгенность погибших в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал наличие рекомбинантной ДНК только в одном случае. Положительные сигналы были выявлены у эмбриона, погибшего на 17 день инкубации, в кишечнике и сердце.

Опыт №2. Введение клеток-«упаковщиц» осуществляли в зародышевый диск и эмбрионы кур на разных стадиях развития- до инкубации, на первый, второй и третий (в кровь) дни инкубации. В каждом случае было проинъецировано по 21 яйцу. Раствор генных конструкций вводили через окно в скорлупе, вырезанное в экваториальной области или в тупом конце яйца. Конечный объем суспензии 1 мкл

Вылуп цыплят наблюдался при введении генной конструкции на первый, второй и третий дни инкубации, при этом выводимость составила соответственно 19%, 29% и 24% ПЦР-анализ погибших в процессе инкубации эмбрионов и вылупившихся цыплят показал наличие генной конструкции у пяти из 40 исследованных эмбрионов Наибольший процент трансгенных эмбрионов наблюдался при введении генной конструкции на первый и третий дни инкубации

Вылупившихся цыплят и взрослую птицу исследовали прижизненно путем анализа ДНК, выделенной из ткани гребешка, крови и спермы. При этом из 15 исследованных кур рекомбинантная ДНК была выявлена в одном случае - у курицы №4208 Наличие генной конструкции было установлено в крови и диагностировалось в течение одного месяца ПЦР-анализ внутренних органов показал наличие рекомбинантной вставки в сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке

Данные о введении клеток-«упаковщиц» в эмбрионы кур суммированы в табл 6

Показатель Опыт №1 Опыт №2

I гр. Игр III гр Контр Irp. Игр III гр. IV гр Контр

Пакующая линия клеток/ генная конструкция АМ12/ pLN-a рд13/ pLN-a АМ12/рХ-RSVhgh - AM12/pX-RSV-hgh -

Заложено яиц, шт 50 50 40 40 21 21 21 21 21

Введено вирусного препарата: объем, мкл / титр, КОЕ/мл 100/105 100Л05 100/105 - 1/107 1/107 1/107 1/107 -

Стадия введения генной конструкции до инкубации - ДО инкуб на 1 д.и на 2 д.и наЗди (в кровь) -

Число развившихся эмбрионов, шт всего/в т ч трансгенных 27/2 36/1 16/3 37 4/0 6/2 3/1 5/2 19

Процент развившихся эмбрионов, % 54 72 40 94 19 29 62 24 90

Вылупилось цыплят, шт всего/ в т ч трансгенных 2/1 8/0 4/0 32/- 0/0 2/0 4/0 2/0 16/-

Процент вылупа, % 4 16 10 80 0 10 19 10 78

Частота интеграции*, % 7,4 2,8 18,8 - 0 33,0 7,6 40,0 -

Общая эффективность трансгенеза", % 4,0 2,0 7,5 0 9,5 4,8 9,5

Эффективность получения трансгенных кур***, % 2,0 0 0 0 0 0 0

Примечание: д.и - день инкубации, * - отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %, ** - отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу проинъецированных яиц, выраженное в %, *** - отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу проинъецированных яиц, выраженное в %

Таблица б. Введение клеток-«упаковщиц» в эмбрионы кур in vivo

Показатель Опыт №1 Опыт №2

Опыт Контр Irp.. II ф. III ф IV гр. Контр

Пакующая линия клеток/ генная конструкция АМ12/рХ-RSVhgh АМ12 / pX-RSVhgh .

Заложено яиц шт 40 40 21 21 21 21 21

Введено вирусного препарата объем, мкл / титр, КОЕ/мл 10/50 _ 10/1 10/1 0/1 10/1 _

Стадия введения генной конструкции до инкубации - ДО инкубации на 1 д и на2ди наЗди (в кровь) -

Число развившихся эмбрионов, шт всего/в тч трансгенных 13/1 37/- 4/0 8/1 18/1 10/3 18

Процент развившихся эмбрионов, % 40 93 0 38 86 48 90

Вылупилось цыплят, шт всего/втч трансгенных 5/0 32/- 0/0 4/0 6/0 5/1 16

Процент вылупа, % 12 81 0 19 29 24 76

Частота интеграции*, % 7,6 - 0 12,5 6,2 30 -

Общая эффективность трансгенеза", % 2,5 0 4,8 4,8 14,3 _

Эффективность получения трансгенных кур"*, % 0 - 0 0 0 4,8 -

Примечание д и - день инкубации; * - отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в % ** - отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу проинъецированных яиц, выраженное в % *** - отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу проинъецированных яиц, выраженное в %

3.2.3. Влияние различных факторов на эффективность трансформации клеток эмбрионов кур

Анализ полученных данных выявил влияние ряда факторов на эффективность трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами, таких как используемые генная конструкция и пакующая линия клеток, стадия и метод введения генной конструкции.

Генная конструкция и пакующая линия клеток.

Эксперименты по трансформации клеток эмбрионов кур тремя векторными системами показали, что более эффективными в переносе экзогенной ДНК в клетки-мишени оказались генные конструкции, помещенные в пакующую линию АМ12. В данном случае частота интеграции составила 7,4% при введении генной конструкции pLN-a и 18,8% - при введении pX-RSVhgh. Наличие рекомбинантной ДНК при использовании линии рд/З было установлено только в 2,8% случаев.

Если сравнивать эффективность трансформации клеток-мишеней двумя генными конструкциями pLN-a и pX-RSVhgh, помещенными в одну и ту же пакующую линию АМ12, то следует отметить, что в последнем случае эффективность была выше, как в культуре in vitro при инфицировании первичной культуры клеток эмбриона курицы, так при введении генных конструкций in vivo.

Стадия введения Наиболее высокая эффективность трансформации клеток-мишеней была установлена при введении генных конструкций на третий день инкубации. В данном случае частота интеграции рекомбинантной ДНК составила 3040% в зависимости от используемого типа вирусного препарата (клеток-«упаковщиц» или культуральной жидкости). При введении ретровирусных векторов на второй день инкубации этот показатель был ниже в 1,3-2,5 раза и более чем в 5 раз - при введении на второй день. Именно при введении генных конструкций в кровь на третий день инкубации была получена курица №4208, несущая рекомбинантную ДНК в клетках крови, сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке.

Метод введения генных конструкций. Как отмечалось выше, в своих исследованиях мы использовали 2 метода введения генных конструкций в эмбриональные клетки кур: с помощью инсулинового шприца путем прокола скорлупы в предполагаемое место расположения зародышевого диска и через окно d=10 мм, вырезанное в скорлупе, непосредственно в зародышевый диск, эмбрион или кровь. Сравнительный анализ полученных данных показал, что в последнем случае общая эффективность трансгенеза была в ряде случаев выше и составила 4,8-14,3% в зависимости от используемого типа препарата При введении генных конструкций до инкубации путем прокола скорлупы рекомбинантная ДНК была выявлена в 2-7,5% случаев.

Таким образом, максимальная эффективность трансформации эмбриональных клеток кур была достигнута при использовании генных конструкций, упакованных линией АМ12, в частности, pX-RSVhgh. При этом более эффективным с точки зрения трансформации клеток-мишеней оказалось введение генных конструкций в кровь на третий день инкубации

3.3 Сравнительный анализ эффективности использования пакующих линий клеток АМ12 и рд13 для трансформации клеток-мишеней in vitro и in vivo

Анализ эффективности трансформации клеток молочной железы животных и эмбрионов кур двумя разными пакующими линиями клеток АМ12 и рд13, выявил существенные различия в способности данных пакующих линий инфицировать клетки-мишени, как in vitro, так и in vivo

Эффективность трансформации клеток-мишеней in vitro независимо от их видового происхождения (первичные клетки молочной железы коровы, козы, свиноматки и первичная культура эмбриона курицы) и используемой генной конструкции была выше при использовании пакующей линии АМ12 В данном случае частота генетической трансформации составила от 8*1(Н до 5-Ю-3, что было в 1,5-2,2 раза выше, чем при использовании линии рд13. Следует отметить, что эффективность трансформации первичной культуры клеток эмбриона курицы по сравнению с другими клетками-мишенями была в 2-10 раз выше. Это, по всей видимости, связано с тем, что эмбриональные клетки по сравнению с соматическими характеризуются более высокой пролиферативной активностью.

Эффективность трансформации клеток-мишеней in vivo также была выше при использовании пакующей линии АМ12. В частности, при введении в эмбрионы кур генных конструкций, помещенных в данную пакующую линию, общая эффективность трансгенеза составила от 4,0 до 14,3%, в то время как при использовании линии рд13 данный показатель составил 2%. Данная тенденция отмечалась и при введении генных конструкций в молочную железу коров, коз и свиноматок

Таким образом, суммируя все вышеизложенное, можно заключить, что наиболее высокая эффективность трансформации клеток-мишеней ретровирусными векторами, как in vitro, так и in vivo наблюдалась при использовании пакующей линии АМ12

4. ВЫВОДЫ

1 Посредством использования ретровирусных векторов осуществлена трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro с частотой интеграции рекомбинантной ДНК от 8-10"4 до 5*103. Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации клеток-мишеней.

2. С использованием линии рд13, упаковывающей ретровирусные векторы, получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки с максимальной экспрессией в молочной железе рекомбинантного ЭПО 350-1000 нг/мл и Г-КСФ - 65-150 нг/мл. Выявлены периодичность синтеза рекомбинантного продукта в молоко в течение лактации и зависимость уровня его экспрессии от периода лактации, используемой генной конструкции и вида животного. Экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе коз и свиноматок установлена в течение всей лактации, у коров - только первые три месяца лактации

3 Отработан метод получения трансгенных кур посредством введения генных конструкций в зародышевый диск до начала инкубации и в дорсальную аорту эмбрионов на третий день развития С использованием данного метода получены трансгенные петух №3976 и курица №4208

4 При введении ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo рекомбинантная ДНК интегрировалась в клетки-мишени с частотой от 2,8 до 40%

5. Выявлено влияние пакующей линией клеток, типа вирусного препарата, метода и стадии введения генных конструкций на эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo. Наиболее высокая эффективность трансгенеза установлена при введении ретровирусных векторов, упакованных в пакующую линию АМ12, в виде суспензии клеток-«упаковщиц» на третий день инкубации в кровь - 14,3%.

6. При сравнительном анализе двух типов клеток-«упаковщиц» АМ12 и рд13 в переносе экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo более высокая эффективность трансформации клеток-мишеней установлена в случае использования линии АМ12.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для получения соматических трансгенных животных и трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов рекомендуем в качестве пакующей линии клеток использовать линию АМ12

Для получения трансгенных кур с использованием ретровирусных векторов рекомендуем осуществлять введение генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на третий день инкубации

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Волкова Н А, Волкова Л А Локальная инфекция молочной железы как альтернатива получения сельскохозяйственных животных - продуцентов рекомбинантных белков II Достижения науки и техники АПК, №10,2003, с 11-14

2 Волкова Л А Оценка двух типов клеток-упаковщиц АМ12 и рд13 в переносе экзогенной ДНК в первичные клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vitro II Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, Дуброеицы, 2003, с 90-92

3 Кленовицкий П М, Волкова Л А, Волкова Н А. Получение хромосомных препаратов домашней курицы II Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, Дуброеицы, 2003, с 47-52

4 Волкова Л А, Волкова Н А, Зиновьева Н А, Эрнст Л К Успехи соматического переноса генов в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vitro и in vivo II Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», ВИЖ, Дуброеицы, 2004, с.215-220.

5. Волкова Л А, Ларионова П В, Кленовицкий П М, Волкова Н.А, Зиновьева Н А Методические вопросы цитогенетики птицы Дубровицы, 2004, 21с

6 Волкова Н А, Зиновьева Н А, Волкова Л А, Эрнст Л К Методические рекомендации по использованию ретровирусных векторов для доставки ДНК в клетки сельскохозяйственных животных in vitro и in vivo Дубровицы, 2004,52с.

7 Волкова Н А, Волкова Л.А, Зиновьева Н А, Эрнст Л.К Некоторые аспекты генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo II Материалы третьей международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 2004,

8 Волкова Н А, Волкова Л А, Эрнст Л К, Зиновьева Н А Опосредованный ретровирусами перенос генов как перспективный метод создания трансгенных кур II Материалы третьего московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 2005, с 238.

9 Волкова Н А, Волкова Л А, Эрнст Л К, Зиновьева Н А Перспективные технологии создания трансгенных сельскохозяйственных животных II Материалы третьего московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 2005, с 247

с 124-127

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132 Московская обл , Подольский р-н, п Дубровицы Тел (8-27)65-14-24,(8 - 27)65-14-07

Стано в набор 18 04 2005 Подписано в печать 18 04 2005 Закат № 9 Печ л 1,1 Тираж 100 экч

75 IS

РНБ Русский фонд

2006-4 5025

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волкова, Людмила Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса чужеродных генов в клетки эукариот.

1.1.1. Биологические особенности ретровирусов.

1.1.2. Создание ретровирусных векторов.

1.1.3. Пакующие линии клеток.

1.1.4. Свойства ретровирусных векторных систем и их использование для переноса чужеродной ДНК.

1.2. Трансгенные животные биореакторы.

1.2.1. Преимущества использование трансгенных животных для производства рекомбинантных белков.

1.2.2 Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных.

Ф 1.2.3. Использование ретровирусных векторов для получения трансгенных животных биореакторов.

1.3. Получение трансгенной сельскохозяйственной птицы.

1.3.1. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной ДНК в эмбриональные клетки птицы.

1.3.2. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы.

1.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток.

1.3.4. Использование примордиальных зародышевых клеток. щ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и оборудование.

2.2. Используемые генные конструкции и пакующие линии клеток.

2.3. Культивирование клеток.

2.4. Получение первичной культуры клеток-мишеней.

2.4.1. Получение первичной культуры клеток молочной железы. 45 2.4.2 Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы.

2.5 Трансформация клеток-мишеней in vitro.

2.5.1. Совместное культивирование с клетками-«упаковщицами».

2.5.2. Инфицирование культуральной жидкостью, содержащей рекомбинантный ретровирус.

2.6. Введение генных конструкций в клетки-мишени in vivo.

2.6.1. Введение генных конструкций в молочную железу сельскохозяйственных животных.

2.6.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур.

2.7. Анализ на наличие генной конструкции (ПЦР).

2.8 Анализ экспрессии рекомбинантных белков.

2.8.1. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.8.2. Иммуногистохимия.

2.9. Получение и приготовление препаратов митотических хромосом кур.

Ф 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных.

3.1.1. Трансфекция клеток молочной железы сельскохозяйственных животных in vitro.

3.1.2. Введение экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vivo.

3.1.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе опытных животных.

3.1.4. Факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток молочной железы in vivo.

3.2. Трансформация клеток эмбрионов кур.

3.2.1. Трансфекция эмбриональных клеток кур in vitro.

3.2.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур in vivo.

3.2.2.1 Трансформация клеток эмбрионов кур культуральной жидкостью.

3.2.2.2 Трансформация клеток эмбрионов кур суспензией клеток-«упаковщиц».

3.2.3. Влияние различных факторов на эффективность трансформации клеток эмбрионов кур.

3.3. Сравнительный анализ эффективности использования пакующих линий клеток AMI2 и pgl3 для трансформации *■ клеток-мишеней in vitro и in vivo.

4 ОБСУЖДЕНИЕ.

5 ВЫВОДЫ.

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-"упаковщиц""

Актуальность темы.

Для создания трансгенных животных используют целый ряд методов: микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот, вирусная трансфекция, использование спермиев как переносчиков ДНК, пересадка ядер трансформированных эмбриональных стволовых клеток, липосомальный транспорт генов [Зиновьева, Эрнст, 2004]. Исторически более ранним методом является метод микроинъекции ДНК, с использованием которого были получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. Однако данный метод характеризуется низкой эффективностью трансгенеза: интеграция рекомбинантной ДНК в зависимости от вида животного наблюдается только в 0,5-1% случаев [Ерем и др., 1995]. Причем около 40% полученных трансгенных животных в последующем не экспрессируют чужеродный белок [Wilmut I. et al., 1991; Hemmighausen L. étal., 1992].

В этой связи актуальным является разработка альтернативных методов переноса генов, позволяющих повысить эффективность трансгенеза. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Благодаря эволюционно сложившемуся механизму интеграции вирусной РНК в геном клетки-хозяина, ретровирусные векторы позволяют эффективно осуществлять трансформацию клеток-мишеней, как in vivo, так и in vitro. Они самостоятельно проникают в клетки-мишени и эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку. Огромным преимуществом данных векторов является возможность их использования для получения так называемых соматических трансгенных животных методом локального (органного) трансгенеза, что позволяет значительно сократить сроки получения трансгенных индивидуумов [Титова В.А., 2001; Волкова H.A., 2002; Гвоздь ИМ., 2002]. Ретровирусные вектора рассматриваются в качестве перспективного метода и в случае получения трансгенных кур [Mizuarai S. et al., 2001; Harvey A.J. et al., 2002; Mozdziak P.E. et al„ 2003], особенности воспроизводства которых делают использование метода микроинъекции для этих целей малоэффективным.

Однако эффективность трансформации клеток-мишеней ретровирусными векторами во многом определяется используемой линией клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус. В этой связи, возникает необходимость в оценке различных линий клеток-«упаковщиц» для использования в трансгенезе соматических и эмбриональных клеток животных in vitro и in vivo.

Цель и задачи исследования.

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование эффективности генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-«упаковщиц».

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести трансфекцию первичной культуры клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro с использованием двух типов клеток-«упаковщиц» AMI2 и pgl3.

2. Изучить динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коров, коз и свиноматок после введения в молочную железу генных конструкций, интегрированных в пакующую линию pgl3.

3. Усовершенствовать метод получения трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов.

4.Определить эффективность трансформации клеток эмбрионов кур in vivo на уровне ДНК.

5. Выявить факторы, определяющие эффективность трансформации клеток эмбриона кур in vivo.

6. Дать сравнительную оценку использования двух типов клеток-«упаковщиц» для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы впервые проведена оценка двух типов клеток-«упаковщиц» AM 12 и pg!3 для переноса экзогенной ДНК в первичные клетки молочной железы млекопитающих и эмбрионы кур in vitro. Впервые осуществлена трансформация клеток молочной железы коров, коз и свиноматок in vivo пакующей линией pgl3 и изучена динамика экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных в ходе лактации.

Впервые оценена эффективность использования ретровирусных векторов для трансгенеза эмбрионов кур in vivo, и на основе сравнительного анализа различных способов введения генных конструкций в эмбрионы кур отработан метод получения трансгенных кур. Получены трансгенный петух, несущий структурный ген эритропоэтина человека в клетках крови, кишечнике, печени, сердце и курица с интеграцией рекомбинантной ДНК (ген гормона роста человека) в сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке. Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур.

Практическая значимость работы.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, имеют практическую значимость. Оценена эффективность использования двух типов клеток-«упаковщиц» AM 12 и pg!3 для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo. Усовершенствован метод получения трансгенных кур посредством использования ретровирусных векторов. Выявлены факторы, определяющие эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo.

• Периодичность синтеза рекомбинантных белков в молоко соматических трансгенных животных.

• Влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены и обсуждены: на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, ВИЖ, 2003; на III международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 2004; на международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы, ВИЖ, 2004; на III международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Экспоцентр, 2005; на конференциях отдела биотехнологии ВИЖ, 2002-2005 гг.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 11 таблиц, 26 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 110 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Волкова, Людмила Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Посредством использования ретровирусных векторов осуществлена трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro с частотой интеграции рекомбинантной ДНК от 8*10"4 до 5*10"3. Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации клеток-мишеней.

2. С использованием линии pg!3, упаковывающей ретровирусные векторы, получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки с максимальной экспрессией в молочной железе рекомбинантного ЭПО 3501000 нг/мл и Г-КСФ - 65-150 нг/мл. Выявлены периодичность синтеза рекомбинантного продукта в молоко в течение лактации и зависимость уровня его экспрессии от периода лактации, используемой генной конструкции и вида животного. Экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе коз и свиноматок установлена в течение всей лактации, у коров - только первые три месяца лактации.

3. Отработан метод получения трансгенных кур посредством введения генных конструкций в зародышевый диск до начала инкубации и в дорсальную аорту эмбрионов на третий день развития. С использованием данного метода получены трансгенные петух №3976 и курица №4208.

4. При введении ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo рекомбинантная ДНК интегрировалась в клетки-мишени с частотой от 2,8 до 40%.

5. Выявлено влияние пакующей линией клеток, типа вирусного препарата, метода и стадии введения генных конструкций на эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo. Наиболее высокая эффективность трансгенеза установлена при введении ретровирусных векторов, упакованных в пакующую линию АМ12, в виде суспензии клеток-«упаковщиц» на третий день инкубации в кровь - 14,3%.

6. При сравнительном анализе двух типов клеток-«упаковщиц» AM 12 и pgl3 в переносе экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo более высокая эффективность трансформации клеток-мишеней установлена в случае использования линии AMI2.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для получения соматических трансгенных животных и трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов рекомендуем в качестве пакующей линии клеток использовать линию АМ12.

Для получения трансгенных кур с использованием ретровирусных векторов рекомендуем осуществлять введение генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на третий день инкубации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Людмила Александровна, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Абдурахманов И.К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих: автореф. дисс. канд. биол. наук. / И.К.Абдурахманов - Дубровицы, 2001. - 22 с.

2. Брем Г. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными /Г. Брем, H.A. Зиновьева, JI.K. Эрнст // Сельскохозяйственная биология.- 1993.- № 6.- С. 3-27.

3. Брем Г. Экспериментальная генетика в животноводстве / Г. Брем, X. Кройслих, Г. Штранцингер -М: РАСХН, 1995. 326 с.

4. Волкова JI.A. Методические вопросы цитогенетики птицы / J1.A. Волкова, П.В. Ларионова, П.М. Кленовицкий, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева -Дубровицы: ВИЖ, 2004. 22с.

5. Волкова H.A. Интеграция и экспрессия экзогенов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов: автореф. дисс. канд. биол. наук. / H.A. Волкова -Дубровицы, 2002. 22 с.

6. Горбунова В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / В.Н. Горбунова, B.C. Баранов -СПб.: Специальная литература, 1997. 287 с.

7. Гвоздь И.М. Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных: автореф. дисс. канд. биол. наук. / И.М. Гвоздь -Дубровицы, 2003. 22 с.

8. Зиновьева Н. А. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / H.A. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С. Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г.Брем Дубровицы: ВИЖ, 1998.- 47 с.

9. Зиновьева H.A. Трансгенные кролики как продуценты химозина крупного рогатого скота с молоком / H.A. Зиновьева, У. Безенфельдер, М. Мюллер, J1.K. Мюллер, JI.K. Эрнст, Г. Брем // Биотехнология. 1998.- С.17-31.

10. Зиновьева H.A. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве / H.A. Зиновьева, J1.K. Эрнст, Г. Брем Дубровицы: ВИЖ, 2001.-128 с.

11. Зиновьева H.A. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных / H.A. Зиновьева, JI.K. Эрнст. Дубровицы: ВИЖ, 2004.-316с.

12. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1989. - 368 с.

13. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих / В.С.Прасолов // Молекулярная биология. - 1989. - Т.23, вып.2. - С.8-12.

14. Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг М.: Мир, 1998. -Т.2.- 362 с.

15. Спиер P.E. Биотехнология клеток животных / P.E. Спиер, Г.Д.Адаме, Дж.Б. Гриффите М.: Агромпромиздат, 1989. - 520 с.

16. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин -М.:ВНИТИБП, 1998.-С.363-460.

17. Титова В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трасгенеза в животноводстве: автореф. дисс. канд. биол. наук. / В.А. Титова. Дубровицы, 2001. - 22 с.

18. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 4.2. / С.Н. Щелкунов -Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1997. 400с.

19. Эрнст J1.K. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro / JI.K. Эрнст, H.A. Зиновьева, H.A. Волкова, B.A. Титова M.: РАСХН, 2003.-84 с.

20. Эрнст J1.K. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве / J1.K. Эрнст, Н.А. Зиновьева, Г.Брем М.: РАСХН, 2002.-341с.

21. Эрнст J1.K. Биотехнология сельскохозяйственных животных / Л.К.Эрнст, М.И. Прокофьев-М.: Колос, 1995.-192с.

22. Aaronson S.A. Endogenous type-C RNA viruses of mammalian cells / S.A. Aaronson, J.R. Stephenson // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - 458, 323354.

23. Blake J. Beta geo, a combined selection and reporter gene for retroviral and transgenic studies / J. Blake, P.S. Salinas, S.M. Hughes // Biotechnigues. 1997. - 23(4), 690-695.

24. Borwornpinyo S. Germ-line transmission of a lacZ gene in chickens using an avian Spleen Necrosis Virus-based vector / S. Borwornpinyo, D.W.McCoy, P.E. Mozdziak, J.N. Petitte // J. Anim. Sci. 1998. - 79 (1), 174.

25. Bosselman R.A. Germline transmission of exogenous genes in the chicken / R.A. Bosselman, R.Y. Hsu, T. Boggs, S. Hu, J. Bruszewski, S. Ou,

26. Kozar, F. Martin, C. Green, F. Jacobsen // Science.- 1989. 243 (4890), 533535.

27. Brazolot C.L. Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo / C.L. Brazolot, I.N.Petitte, R.I. Etches, A.M. Verrinder Gibbins // Mol. Reprod. Dev.- 1991.- 30, 304-312.

28. Brem G. Produktion of transgenic mice, rabbits and pigs by mikroinjektion into pronuclei / G. Brem, B. Brenig, H.M. Goodman, R.S. Selden, F.Graf, B. Kruff// Zuchthygiene.- 1985.-20, 251-252.

29. Brinster R.L. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs / R.L. Brinster, H.Y. Chen, M.E. Trumbauer // Proc. Natl Acad. Sci. USA.- 1985. 82, 4438^442

30. Carsience R.S. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos / R.S. Carsience, M.E.Clark, R.I. Etches, A.M. Verrinder Gibbins // Development.- 1993.- 117, 669-675.

31. Carver A.S. Transgenic liverstock as bioreactors: stable expression of human alfa-l-antitripsin by a flock of sheep / A.S. Carver // Biotechnology. 1993. - 11, 1263-1270.

32. Chang I.K.Germ line chimera produced by transfer of cultured chick primordial germ cells / I.K. Chang, A. Yoshiki, M. Kusakabe, A. Tajima, T.Chikamune, M. Naito, T. Ohno // Cell Biol Int.- 1995.- 19 (7), 569-576.

33. Chong H. Replication-competent retrovirus produced by a 'split-function' third generation amphotropic packaging cell line / H. Chong, R.G. Vile // Gene Ther. 1996. - 3, 624-629.

34. Clark A.J. Expression of human antihemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep / A.J. Clark, P. Simons, I. Wilmut // Biotechnology 1989. - 7, 487-492.

35. Coffin J.M. Structure and classification of retroviruses. In 'The

36. Retroviridae' (ed. L.A. Levy ) / J.M Coffin // Plenum Press, NY, 1992. 19-49.

37. Cone R.D. High-efficiency gene transfer into mammalian cells: generation of helper-free recombinant retrovirus with broad mammalian host range / R.D. Cone, R.C. Mulligan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- 81, 6349-6353.

38. Cosset F.L. A new avian leukosis virus-based packaging cell line that uses two separate transcomplementing helper genomes // F.L. Cosset // J. Virol.t 1990.- 64, 1070-1078.

39. Cosset F.L. Packaging cells for avian leukosis virus-based vectors with various host ranges./ F.L. Cosset // J. Virol.- 1992.- 66, 5671-5676.

40. Das R.C. Production of therapeutic proteins from transgenic animals / R.C. Das // Bio Business.- 2001, 60-62.

41. Donahue R.E. Helper virus induced T-cell lymphomas in non-human promates after retroviral mediated gene transfer / R.E. Donahue, S.W. Kessler,

42. D.Bodine, K.Mc Donagh, C. Dunbar, S. Goodman, B. Agricola, E. Byrne, M.Raffeld, R. Moen, J. Bacher, K.M. Zsebo, A.W. Nienhuis // J. Exp. Med.- 1992.176, 1125-1135.

43. Emery D. W. Development of a condensed locus control region cassette and testing in retrovirus vectors for a gamma-globin / D.W. Emery // Blood Cells Mol Dis. 1998. -24,322-339.

44. Eyal-Giladi H. Avian primordial germ cells are of epiblastic origin / H.Eyal-Giladi, M. Ginsburg, A. Farbarov // J Embryol Exp Morphol.- 1981.- 65, 139-147.

45. Fraser R.A. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chicken embryos / R.A. Fraser, R.S. Carsiense, M.E. Clark, R.I.Etches // Int. J. Dev. Biol.- 1993.- 37, 381-385.

46. Gilbert A.B. Egg albumen and its formation / A.B.Gilbert // Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl, Academic Press, 1984.- 1291-1329.

47. Gray D.A. Insertional mutagenesis: neoplasia arising from retroviral integration / D.A. Gray // Cancer Invest.- 1991.- 9, 295-304.

48. Grosovsky AJ. Insertional inactivation of the tk-locus in a human B lymphoblastoid cell line by a retroviral shuttle vector / A.J. Grosovsky, A.Skandalis, L. Hasegawa, B.N Walter // Mutat. Res.- 1993.- 289, 297-308.

49. Hammer R.E. Brinster Produktion of transgenic rabbits, sheer and pigs by microinjection / RE. Hammer, V.G. Pursel, C.E. Rexroad, R.I. Wall, D.I. Bolt, I.M. Ebert, RD. Palmiter, R.L. Brinster // Nature.- 1985.- 315, 680-683.

50. Harvey A.J. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures / A.J. Harvey, G. Speksnijder, L.R. Baugh, J.A. Morris, R. Ivarie // Poult Sci.-2002.- 81 (2), 202-212.

51. Harvey A.J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens / A.J. Harvey // Nat. Biotechnol.- 2002.- 20, 396-399

52. Henighausen L. // J. Cell. Biochem. 1992. - 49, 325-332.

53. Hu S. Generation of competent virus in the REV helper cell line C3. / S.Hu, J. Bruszewski, M. Nicolson, J. Tseng, R.Y. Hsu, R. Bosselman // Virology.-1987.- 159,446-449.

54. Ko J.H. Production of biologically active human granocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat / J.H. Ko // Transgenic Reseach. -2000.-9,215-222.

55. Korhonen V.P. Expression of bovine beta-lactoglobulin human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits / V.P.Korhonen, M. Tolvanen, J.M. Hyttinen // Eur. J. Biochem. 1997. - 15, 482489.

56. Krimpenfort P. Ceneration of transgenic dairy cattle using in vitro embryo production / P. Krimpenfort, A. Rademakers, W. Eyestone // Gamete Res. -1983.-8, 29-47.

57. Lampe D.J. Factors affecting transposition of the Himarl mariner transposon in vitro / D.J. Lampe// Genetics.- 1998.- 149,179-187

58. Larsson E. Human endogenous proviruses / E. Larsson, N. Kato, M.Cohen // Curr. Top. Microbiol, Immunol. 1989. - 148, 115-132.

59. Levy J.A. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS / J.A. Levy, A.D. Hoffmann, S.M. Kramer, J.A.Landis, J.M. Shimabukuro, L.S. Oshiro // Science.- 1984.- 225, 840-842.

60. Li Y. Ballistic transfection of avian primordial germ cell in ovo / Y. Li, J. Behnam, K. Simkiss // Transgenic Res.- 1995.- 4 (1), 26-29.

61. Linial M. Transfer of defective avian tumor virus genomes by a Rous sarcoma virus RNA packaging mutant / M. Linial // J. Virol.- 1981.- 38, 380-382.

62. Linial M. An avian oncovirus mutant (SE21Qlb) deficient in genomic RNA: biological and biochemical characterization. / M. Linial, E. Medeiros, W.S.Hayward // Cell.- 1978.- 15,1371-1381.

63. Love J. Transgenic birds by DNA microinjection / J. Love, C. Gribbin, C. Mather, H. Sang // Biotechnology. 1994. - 12, 60-63.

64. Lower R. Identification of human endogenous retroviruses with complex mRNA expression and particle formation / R. Lower, K. Boiler, B.Hasenmaier, C. Korbmacher, N. Muller-Lantsch, J. Lower, R. Kurth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - 90, 4480-4484.

65. Mann R. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus / R. Mann, R.C. Mulligan, D. Baltimore // Cell. 1983.- 33, 153-159.

66. Massoud M. The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits / M.Massoud, J. Attal, D. Thepot // Reprod. Nutr. Dev. 1996. - 36, 555-563.

67. Miller A.D Retroviral packaging cells / A.D. Miller // Hum. Gene Ther. 1990.- 1,5-14.

68. Miller A.D. Redesign of retroviral packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production / A.D. Miller, C. Buttimore // Mol. and Cell. Biol. 1986. - 6, 2895-2902.

69. Miller A.D. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene / A.D. Miller, M.F. Law, I.M. Verma// Mol. Cell. Biol. 1985.-5, 431-437.

70. Miller D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only en cells that are actively replicating an the time of investion / D. Miller, M. Adam, V. Miller // Mol. Cel. Biol. 1990. - 10, 4239-4242.

71. Mozdziak P.E. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, J.N. Petitte // Dev Dyn. 2003. - 226 (3), 439-445.

72. Naito M. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells / M. Naito, A. Tajima, Y. Yasuda, T. Kuwana // Mol Reprod Dev. -1994.- 39 (2), 153-161.

73. Naldini L. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector /

74. Naldini, U. Blomer, F.H. Gage, D. Trono, I.M. Verma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - 93, 11382-11388.

75. Naldini L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector / L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay, D. Ory, R. Mulligan, F.H. Gaga, I.M. Verma, D. Trono // Science. 1996. - 272, 263-267.

76. Nilson B.H.K. Targeting of retroviral vectors through protease-substrate interactions / B.H.K. Nilson //Gene Ther. 1996. - 3, 280-286.

77. Ory D.S. A stable human-derived packaging cell line for production of high retrovirus / vesicular stomatitis virus G pseudotypes / D.S. Ory, B.A.Neugeboren, R.C. Mulligan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - 93, 11400 -11406.

78. Pain B. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. / B. Pain, M.E.Clark, M. Shen, H. Narazawa, M. Sakurai, R.I. Etches // Development. 1996. - 122, 2339-2348

79. Petitte J.N. The origin of the avian germ line and transgenesis in birds / J.N. Petitte, L. Karagenc, M. Ginsburg // Poult. Sci. 1997. - 76 (8), 1084-1092.

80. Petitte J.N. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells / J.N. Petitte, M.E. Clark, G. Liu,

81. A.M.Verrinder Gibbins, R.I. Etches // Development. 1990. - 108, 185-189.

82. Poiesz B.J. Detection and isolation of type-C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma /

83. B.J.Poiesz, A.F. Ruscetti, P.A. Gazdar, P.A. Bunn, J.D. Minna, R.C. Gallo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - 77, 7415-7419.

84. Rigg R.J. A novel human amphotropic packaging cell line: High titer, complement resistance, and improved safety / R.J. Rigg, J. Che n, J.S. Dando, S.P.Forestell, I. Plavec, E. Bohnlein // Virology. 1996. - 218, 290-295.

85. Roe T. Integration of murine leukemia virus DNA depengs on mitosis / T. Roe, T. Reynolds, P.O. Brovn // EMBO J. 1993. - 12, 2099-2108.

86. Russell S.J. Gene therapy: Science, medicine and the future / S J.Russell // Br. Med. J. 1997.-315, 803-815.

87. Salter D.W. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line / D.W. Salter, E.J. Smith, S.H. Hughes, S.E. Wright, L.B.Crittenden // Virology. 1987.- 157(1), 236-240.

88. Salter D.W. Gene insertion into the chicken germ line by retroviruses / D.W. Salter, E.J. S mith, S.H. Hughe s, S.E. Wright, A.M. Fadly, R.L. Witter, L.B.Crittenden //Poult Sci. 1986. - 65(8), 1445-1458.

89. Salter D.W. Insertion of a disease resistance gene into the chicken germline / D.W. Salter, L.B. Crittenden // Biotechnology. 1991.- 16, 125-131.

90. Sang H. Transgenic chicken Metods and potential applications / H.Sang // Trends Biotechnol. - 1994. - 12, 451-420.

91. Seamon J.A. Inserting a nuclear targeting signal into a replication-competent Moloney murine leukemia virus affects viral export and is not sufficient for cell cycle-independent infection / J.A. Seamon // J. Virol. 2002. - 76(16), 8475-8484.

92. Shank P. Avian oncovirus mutant (SE21Qlb) deficient in genomic RNA: characterization of a deletion in the provirus / P. Shank, M. Linial // J. Virol.-1980.- 36, 450-456.

93. Sherman A. Transposition of the Drosophila element mariner into the chicken germ line / A. Sherman // Nat. Biotechnol. 1998. - 16, 1050-1053.

94. Temin H.M. Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors / H.M. Temin // Hum. Gene Ther.- 1990. 1,111123.

95. Uckert W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy / W.Uckert, W. Walther // Pharmac. Ther. 1996. - 63, 323-347.

96. Urven L.E. Distribution of extracellular matrix in the migratory pathway of avian primordial germ cells / L.E. Urven, U.K. Abbott, C.A. Erickson// Anat Rec. 1989. - 224(1), 14-21.

97. Velande W.H. Expression of human protein C in trancgenic swine / W.H. Velande // Harnessing biotechnology for the 21st century: Proc. 9th International Biotechnology Symposium and Exposition Virginia, August 16-21. -1997.-34-37.

98. Vick L. Transgenic birds from transformed primordial germ cells / L.Vick, Y. Li, K. Simkiss // Proc. R. Soc. Lond. 1993. - 251, 179-182.

99. Waddington D. Chronology of events in the first cell cycle of the polyspermic egg of the domestic fowl (Gallus domesticus ) / D. Waddington // Int. J. Dev. Biol. 1998.- 42, 625-628.

100. Watanabe S. Construction of a helper cell line for avian retikuloendotheliosis virus cloning vectors / S. Watanabe, H.M. Temin // Mol. Ceii. Biol. 1983. - 3, 2241-2249.

101. Way J.C. Transposition of plasmid-borne TnlO elements does not exhibit simple length-dependence / J.C. Way, N. Kleckner // Genetics. 1985.- Ill, 705-713.

102. Wall R.J. High level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine / R.J. Wall // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. -88, 1696-1700.

103. Weiss R. RNA tumor viruses / R. Weiss, N. Teich, H. Varmus, J.M.Coffin // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

104. Wentworth B.C. Manipulation of avian primordial germ cells and gonadal differentiation / B.C. Wentworth, H. Tsai, J.H. Hallett, D.S. Gonzales // Poultry Sci. 1989. - 68, 999-1010.

105. Wentworth B.C. Primordial germ cell for genetic modification of poultry / B.C. Wentworth, H. Tsai, A. Wentworth, E. Wong, J. Proudman, M.Halawani // In: Beltsville Symposia in Agricultural Research: Biotechnology's

106. Role in Genetic Improvements of Farm Animals American Society of Animal Science, Savoy, Illinois, 1996. 202-227.

107. Wilmut I., Archibald A., McClenaghan M. // Experientia. 1991. -47, 905-912.

108. Wright G. High level expression of active human a-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep / G. Wright, A. Carver, D. Cottom // Biotechnology. -1991.-8, 830-834.

109. Yasuda Y. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells / Y. Yasuda, A. Tajima, T. Fujimoto, T. Kuwana // J. Reprod Fertil. 1992. - 96(2), 521-528.