Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве"



На правах рукописи

ТИТОВА Викторин Андреевна

МОП Е КУЛЯ РНО-ГЕ НЕТИ ЧЕС КИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ТРАНСГЕНЕЗА В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

03.00.23- Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, Московской области 2001

Работа выполнена во Всероссийском Государственном научно-исследовательском институте животноводства (ВИЖ)

Научные руководители; доктор биологических наук Н. А. Зиновьева;

иностранный член РАСХН, д. в. н„ профессор Г. Б рем

Официальные оппоненты:, доктор биологических тук, профессор Н.С. Марзанов;

кандидат биологических наук, В. А. Багиров

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной

октября 2001 года в 10 часов на

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа

медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина (МГАВМБ)

006.013.01 во Всероссийском

Государственном научно-исследовательском институте животноводства (ВИЖ).

Автореферат разослан " сентября 2001 года.

■ Ученый секретарь диссертационного совет) кандидат биологических

В П Губанова

ЬОрЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1,1. Актуальность те^ы.

За последние десятилетня был разработан целый ряд методов, позволяющих уводить интересующие последовательности ДНК в клетки индивидуумов; Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы, использование трансформированных первичных половых и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), ретровнрусных,-аденовррусных и аденоассосинрованиых векторов, трансформированных спермнев и липосом. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы делает возможным введение и интеграцию в геном фрагментов ДНК длиной до 800000 пер нуклеотидов. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного таргетинга (Савченкова И.П. н др., 1996), даёт возможность тестирования интеграции трансгенов в культуре клеток н в ряде случаев проводить оценку их экспрессии (Зиновьева Н.А. и др., 2001). Перенос экзогенных генов посредетиом ретро вирусных векторных систем рассматривают как перспективный метод для использования в следующих направлениях:

1) для получения «фенотипичееких трансгеков», т.е. животных с трансформацией отдельных органов (Брем Г, н др., 1995);

2) для генной терапии болезней человека и животных (Uckert W., et, al.t 1999; Porada С. et. at, 1998; Pitt В et. at, 1995);

3) для синтеза рекомбикантных белков с молоком или придания молоку новых свойств (Gutierrez-Adan A. et а!., 1997; Chan A.W.S, et. el., 1998).

Введение экзогенных генов в молочную железу взрослых особей позволяет получать рекомбинантные белки (интерфероны, эритропоэтин и др.) с молоком лактирующих . самок. Причём, по сравнению с традиционным методом мнкроннъекции ДНК в пронуклеус зиготы затраты времени от начала эксперимента до получения первых результатов об уровне экспрессии сокращаются с 4-5 лет до 4-5 месяцев.

Однако каждый из этих методов имеет ряд недостатков, ограничивающих их использование (Chan A.W.S, et. al., 2000), Негативными факторами являются: недостаточная визуализация пронуклеусов у сельскохозяйственных животных« объединение генов в тандемы в результате гомологичной рекомбинации между молекулами ДНК, не сайт;специфическая интеграция, хромосомные абберацин (Дыбан А.П., 1989). Получение трансгенных животных с помощью первичных половых клеток, эмбриональных стволовых клеток, трансформированы* срермнев и лидосом также связано с определёнными трудностями (Hooper et at, 1996; Kim J.H., 1997). Так, при использовании зародышевые клеток, полученные особи в большинстве случаев являются химерными. Кроме' ШГй; лишь часть животных будут передавать траисген по наследству потомству (Прем Г. и др., 1995). Использование трансформированных спермиев и ляпоссм* не даёт

I | »

цел ГРлЛьНАЛ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. с©ль>:0*02 ачадшии им. и. А. I kt/ирдйвва .

инп

достаточной воспроизводимости эксперимента и желаемого процента положительных результатов.

В этой связи, с целью разработки оптимальной технологии локального трансгенеза, основанной не использовании ретровирусных векторных систем, актуальным является оценка эффективности отдельных методик для доставки ДНК в Отдельные-органы сельскохозяйственных животных, в частности в ■ молочную железу свиней и коров.

Ь2.Цель и эадцчк исследования.

Целью диссертационной работы является исследование способности ретровирусных векторов переносить генетическую информацию в органы И ткани сельскохозяйственных животных с использованием молекулярно-генетическИх методой.

Дп* достижения указанной цели были сформулированы для решения следующие задачи:

• оценить используемые линии клеток-упаковщиц на наличие рекомби-нантной вставки методом ПЦР анализа;

• отработать метод выделения; ДНК из слюны и спермы сельскохозяйствен* пых животных; ...,'}

• изучить эффективность^ Доставки ретровирусиыми векторами ракомбинаИтной ДИК в органы и ткани животных при введении клеток-упаковщиц в молочную железу и ушную вену;

• оценить эффективность > ретровирусных векторов для доставки рекомбинантной геннойконструкции в спермин бычков ¡п

• проследить в динамике экспрессию рекомбииаитного эритропоэтина б молоке опытных животных: !,: ■

• изучить характер распространения ретровирусных векторов в органах и тканях опытных живртаых.

иЛаучная новизна. .

В ходе выполнения диссертационной работы впервые была изучена эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза органов и тканей сельскохозяйственных животных, в частности свиней и коров. Была исследована обусловленная рекомбинактными провируснымй последовательностями экспрессия рекомбинаИтных белков в молоке свинеО н коров в дкиамихе, выявлено влияние места, времени инъекции, а . так же количества инъецированных клеток-упаковщиц на уровень экспрессии. Бцл . выполнен анализ распространения и локализации рекомбинактных . провирусов в органах н тканях животных'при инъекции клеток-упаковщиц ё молочную Железу и >фовь свиней и коров.

(.^Практическая ценность работы.

• Разработана тест-система для выявления рекомбинантных проаирусных последовательностей в органах, тканях и молоке опытных животных;

• Показана возможность обусловленного ретровирусными векторами синтеза а молрке коров и свиней рекомбинантных продуктов экспрессии, в частности эритропоэтииа человека.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту:

• Возможность доставки генной конструкции эритропоэтина в ткани моцочной железы животных как при инъекции ретро аирусных векторов в паренхиму молочной железы, так и при внутривенной инъекции.

9 Синтез рекомбннантиого эритролоэтина в клетках молочной железы животных имеет место как после введения генной конструкции непосредственно в ТкавЧ молочной железы, так и после внутривенной инъекции.

t Распространение рекомбикацтной генной конструкции происходит не только в пределах места инъекции, но наблюдается и в других органах и тканях, Где оно имеет мелкоочаговый характер. '

1.6.Апробация работы.

Материалы диссертационный работы, были представлены на научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства # задачи кадрового обеспечениям, Быково, 2000; конференции аспирантов и црлодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001; научно-практической конференции «(Повышение конкурентоспособности животноводства и . задачи кадрового обеспечения»,. Быково, 2001; научных отчетах ВИЖа 2000-2001; научной конференции отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001.

1.7.Публнкацяя результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

1.8.Структура н обл»5м работы.

Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 10 таблиц, 8 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов ft методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Слисок литературы включает 130 источников, в т.ч. 103 на иностранном языке.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась в. лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики, ОПХ "Дубровицы" и ОПХ "Клёново-Чегодаево" Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

В работе была использована векторная система состоящая из двух компонентов: генной конструкции и линии клеток-упаковщиков.

е

Рис. 1, Общая схема исследований

В линию клеток AM 12 (предоставлена х.б.н. Фоминым И.И., Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск) был встроен рскомби нактный ретровирусный вектор pLNa, содержащий кДКК эритопоэтина человека пвД' контролем промотора aSi-казеина крупного рогатого скота.

Кдетки-упаковщицы и культуральную жидкость, содержащие ретровирусный вектор вводили (внутривенно, в паренхиму молочной» железы, паренхиму семенников) опытным животным: свиноматки—6 голову Heíen*—3 головы, бычки—3 головы.

ДНК выделяли посредством солевой экстракции [Miller S.A., \9Щ) щелочного лизисного буфера, буфера Кавасаки [Li Н. et al., 1988; Зиновьева Н.Уй и» др., 1998] и перхлората натрия с нашим» модификациями. Концентрацию ДНК »' степень ее очистки определяли по описанной методике Н.А, Зиновьевой' о-соавторами [199В].

Полимераэиую цепную реакцию проводили в объёме 20 мкл., применяя следующую инкубационную смесь: xl буфер для ПЦР (1бб,7мМ (NHihSOi; 100мМ Трис-HCt, рН-83; 1,5мМ MgClj; 0,1% Twecn 20); 0,2мМ dNTP, 25 пкмол каждого из праймеров, 1 ЕД Taq полимеразы. ДНК для анализа брали в объёме 1,0 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе Amply 4*L-50 /Шосот/. Реакции проводились в следующем те мпературно-временном режиме: 94"С-1 мин, 60°СМ мин, 72"С-\ мин, 1 цикл; 94°С-1 мин, б0°С-1 мин ,72°С-1мин, 37 циклов. После 38 циклов амплификации брали 10 мкл смеси для анализа продуктов реакиии, которые разделяли в 2% агарозном геле при 120V в буфере ТАБ счмбШммйт' бромистого димндия до конечной концентрации 30 иг/мл.

Определение наличия и количества TpaHcreHHOFo- белка1 осущестВШГН' методом твердофазного конкурентного иммуноферменгдагв-аяюша^НФА^

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ)

3.1.Оценка клеток-упаковщиц иа наличие рекомбииантной вставки.

Используемые для инъекции линии клеток-упаковщиц были предварительно оценены на наличие рекомбинантной вставки. С этой целью нами были разработаны тест-системы на основе метода ПЦР анализа, позволяющие выявлять наличие провирусчой ДНК-формы в клетках.

3.1.1. разработка и оптимизация тест-систем.

Подходящую для проведения анализа локализацию праймеров определяли на основании схемы используемой генной конструкции. Данная генная Конструкция содержит 5' длинный концевой повтор (LTR), с которого происходит транскрипция, область, ответственную за упаковку вирусного генома в вирнои, Ген устойчивости к неомицину (neo) под контролем промотора Н4 гистона человека для селективного введения конструкции в клеточную линию и 3' LTR с делецией в области промотора-энхансера вируса (ЛЕР) (рис.2).

Xhol

pLNS

pLNct

EP pA

1

LTR Н4 NEO 1М

альфа-БЬкаэеин/эритропоэгнн

Рис. 3. Схема строения векторной конструкции pLMS и полученной на ей основе генноА конструкция pLNa: LTR - длинный концевой повтор, - сигнал упаковке, Н4 - промотор гиетояа человека, NEO - гея устойчивости к неомицнну, ЕР - деления в области промотора* энхансера, рА - сигнал полнаденилированМ.

В табл. / суммированы данное о локализации и ориентации праймеров t указанием позиций в соответствуюиЦих генах.

Таблица 1, Характеристика локализации используемых праймеров

: Пра«мер Ген Локализация ротищу Ориентация

Ер 1 Эритропоэтин Ехоп 2 1330-1352 fw

Ер2 Эритропоэтин ЕхорЗ 1668-1691 rw

Epol Эритропоэтин Ехоп 4 2310-2330 fw

Еро 2 Эритропоэтин Ехоп 5 2741-2760 rw

ЕроЗ Эритропоэтин ЕхопЗ . 1638-1658 fw

Еро 4 Эритропоэтин ' Ехоп 5 2619-2637 rw

Еро 5 ЭрИТрОПОГГИН : Ехоп 2 1202-1221 fw

Еро 6 Эритропоэтин Ехоп 3 1670-1690 rw

- Как следует из данных табл. I, для анализа нами были использованы праймеры, локализованные в структурном гене. Последовательности праймеров выбирали, исходя из последовательности генов эритропоэтнна человека (генный баи* № МПЗ 19). Данные о последовательностях используемых праймеров, а тек же длинах амплифнщфуемых в ходе ПЦР фрагментов в зависимости от наличия кДНК нли геномной ДНК представлены в такг. 2.

б

Таблица 2. Последовательности используемых праймеров

Примеры 5'-3' последовательность Длина фрагментов (п.н.)

к-ДНК Геномная ДНК

ctc-cgg-ctc-tta-tap-tgc-cac-tc Нет 362

Ер 2 aaa-^at-acg- sac-clt-ctc-cta-cct

Epol agc-agK-ccE-tag-aag-tc t-gRc 315 451

Epol tgt-cct-gca-ggc-ctc-ccc-tg

ЕроЗ aat-atc-act-gtc-cca-gac-acc 253 1000

Еро4 att- gtt-cgg-agt-gga-gca-gc

Еро5 atg-tcc-tgc-ctg-gct- gtg-яс 231 489

Ероб tcc-act-ctc-ttc-cag-gca-lag

3.1.2. Оценка используемых теток-упаковщ иц на наличие рекомбинвнтной вставки.

ГЩР-аналиэ клеток-упаковщиц на наличие рекомбинантной вставки подтвердил сохранение векторной конструкции в процессе пассирования. Tax, для генной конструкции pLNa наличие вставки было доказано во всех 7-ми исследованных пассажах, для генной конструкции рТ67 - в 7 из впассажей-

ЗЦ. Оп^нмцзацня метода выделения ДНК из слюны н спермы.

Ранее предложенная методика выделения ДНК из спермы (Li Н. et at., 1988) и слюны, где в качестве лнзирующего буфера применяется щелочной лнзнсныЙ буфер (200 мМ КОН; 50 мМ днтиотриэтол), плохо подходит для выделения ДНК из вышеуказанных образцов из-за высокого содержания в них белков. Для получения из слюны и спермы хорошо очищенной, высокомолекулярной ДНК нами была оптимизирована методика выделения ДНК с использованием перхлората натрия.

Х2.1.Рптимищцил гы&пения ДНК ui слюны.

Для выделения ДНК из слюны животных в пробирку объемом 1,5 мп осторожно, по стенке, избеги образования пузырей, наливали 700 мкл слюны, к которой добавляли 800 мкл реагента А (№ мМ Трис-HGI, рН=8,0; 320 ММ сахароза; 5 мМ MgCj; 1% Тритон Х-100), тщательно перемешивали, не допуская вспенивания рмеси, и центрифугировали две минуты при 7S00 об/мин. После удаления надосадочной жидкости процесс очистки клеточного шарика от секретов и слизи повторяли. Для этого, к осадку клеток добавляли 300 мкл реагента Ь (400 мМ Трис-HCl, рН=8,0; 60 мМ ЭДТА, рН=8,0; 150 мМ NaCl; 1% SDS) h 5 мкл протеинаэы К (20 мг/мл) и инкубировали 1-2 часа при температура 80°С. По

истечении процессе инкубирования, пробирки вынимали из водяной бани, центрифугировали в течении нескольких секунд для удаления жидкости со стенок . пробирок и добавляли к клеточному лизату 100 мкл 5М раствора перхлората натрия. Содержимое пробирок тщательно перемешивали в течение 7 минут. Затем добавляли. 1,5 объём (300 мкл) CIA (24 объема хлороформа + I объем и jo амилового спирта), интенсивно смешивали 5 мин и центрифугировали 5 мин при 15000 об/мин. .Верхнюю ДНК-содержащую фазу переносили в чистую пробирку и осаждали ДНК 2 Объемами (600 мкл) 100% этилового спирта. Затем •ДИК инкубировали 5 мин в 0,5-1,0 мл 70% этанола (охлажденного до -20°С). После удаления спирта шарик ДНК высушивали в течение 30 мин При комнатной температуре. Содержимое пробирки ресуспендировалн в 20-50 мкл бндистяллироваиной воды или буфера ТЕ в зависимости от размеров шарика.

3.2.¡.Оптимизация лиделения ДНК из спермы.

Для выделения ДНК в 1,5 мл пробирку помешали 100 мкл спермы. Центрифугировали 5 мин при 3500 об/мин для осаждения осадка (осадок должен быть приблизительно размером со спичечную головку). Центрифугирование и визуальное определение количества осадка производили вследствие того, что предоставляемый в лабораторию длр анализа эякулят часто содержит большое количество примесей мочи и секретов половых желвз и пониженное содержание спермиев. Так же, эякулят разных! видов животных различается по объему и концентрации в нём сперматозоидов. Так, например, у быка объём эякулята составляет 4-8 мл, концентрация в нём сперматозоидов • 1200-1800 млн/мл. У хряка объем эякуляте составляет приблизительно 150-500 мл, а концентрация в нём сперматозоидов - 200-300 млн/мл. В пределах вида они зависят от интенсивности использования производителя (частоты садок), условий кормления и содержания. ¡

После визуализации осадка к нему добавляли' 400 мкл реагента А, перемешивали и центрифугировали 2 мин при 7500 об/мин. Слив надосадочкую жидкость, к осадку приливали 300 мкл реагента В и перемешивали до полного . растворения осадка. Далее к раствору добавляли 5 мкл протеиназы К и 27 мкл * дитмотреитола. Смесь инкубировали при 60°С в течение 60 мин. Затем в пробирки добавляли 100 мкл 5М раствора перхлората натрия. Дальнейшие манипуляции проводили так, как это описано выше при выделении ДНК из проб слюны.

Данный метод выделения позволяет получать высокомолекулярную, хорошо очищенную от различных примесей ДНК, что делит возможным проведение последующего качественного ПЦР-анализа н электрофореза. На рис. 3 представлен ПЦР-аяалиэ ДНК одной и той же пробы спермы, выделенной методом солевой экстракции н методом, где использовался перхлорат натрия.

12 34 56 Т«9 10 II 12 М Р1Ц|!ЧЧ ЦП уимими."-.™ л » г -.и- ;•> „■■■;..»>■■( ;....■(■\

Рис.3, ПЦР-анализ ДНК, выделенной К1 спермы быка: дорожки:I-5-ДНК выделена методом, где использовался перхлорат натри»; дорожки: 1 -й-ДНК выделена метолом солевой экстракции,; 11—отрицательный контроль (бн дистиллированная вода); 12— положительный контроль (ДНК человека).

3.3. Исследование способности ретро и ярусных векторов для локального переноса генов в молочную железу. -

3.3.1.Исследование интеграции генной конструкции при введении ретровирусных векторов в молочную железу.

Оценку эффективности использования ретровирусных векторов для переноса экзогенных генов в молочную железу, мы проводили на пяти свиноматках и трёх нетелях, находящихся в разных физиологических состояниях. Анализ проб ДНК, выделенной из молока опытных животных выявил наличие генной конструкции у всех животных независимо от стадии введения генной конструкции и количества используемых для инъекции клеток-упаковщиц (табл. 3).

Таблица 3, Результаты ПЦР-анализа ДНК, выделенной из молока животных после введения ретровирусных векторов в молочную железу

№ животного Физиологическое состояние Количество введённых клеток (млн.) Взято проб молока ПЦР «+»

п %

СВИНОМАТКИ

2832/2849 супоросность 2,5 месяца 7,5 54 54 100

0115 лактирующая ю 2 2 100

1221 супоросность 2 месяца 24 22 17 77,2

5381 супоросность 2 месяца 20 35 I 2,8

1217/1711 холостая 24 3 1 33,3

НЕТЕЛИ '

3006 стельность 4 месяца 27 4В 19 39,5

3020 стельность 5,5 мес. 27 48 21 43,7

2496 стельность 8 месяцев 10 104 7 6,7

Примечание: п-количество положительных проб молока на наличие рекомбинантной вставки (ПЦР «+»).

Наиболее характерным« а этом отношении являются следующие опыты.

Свиноматке №2832/2949, находящейся на 2,5-месяцев супоросностн вводили в каждую из шести долей правой стороны молочной железы клетки, упаковывающие векторную конструкцию рГ-Ыа. Пробы молока" у~*жТГвотного брались на протяженна всего периода лактации. Проведённый ПЦР-анализ ДНК выявил наличие рекомбинантной генной конструкции в соматических клетках молока из всех долей вдоени как опытной, так и контрольной сторон (рис.4'),

■Рис, 4. ЛЦР-адшш молока свиноматки №2832/2849 на 14-й день лактации; дорожки!- ¡2-ДНК, выделенная из разных долеЯ молочной железы; дорожка 13- отрицательный контроль-бндистнялиро ванная вода; дорожка /-/-отрицательный контроль-ДНК ннтактной свиньи; дорожка Л-пояожительныЛ контроль-ДНК человека

Нетели №2496, находящейся на 7-ом месяце стельности, в переднюю левую четверть вымени было инъецировано 10 млн. клеток-упаковщиц ПЦР-анализом было установлено наличие рекомбинантной генной конструкции на протяжении трёх месяцев после инъекции, 1 2 3 : * Д. 6 '

РисЛ ПЦР анализ ДНК, вцделенной из молока нетели Ш496:&>/>ажжа У—отрицательный ковтроль-бнднетвдлнрованная вода; дорожка ^^-положительный контрол!—ДНК человека; дорожки 3-6— ДНК, выделенная из разных долей полочной железы

3,3.2.Исследсвание интеграции генной конструкции при тутриленном введении клетоц-упаховщиц, содержащихрекомбинантную ДНК.

• Д|Ц анализа интеграции рекомбинантной генной конструкции при внутривенном введении клеток-упаковщиц мы использовали три свиноматки, находящиеся на разных стадиях супоросностн. У двух свиноматок методом ПЦР-анализа были исследованы пробы молока на наличие рекомбинантной ДНК-

Свиноматке №50, находящейся на стадии 2 месяцев супоросностн я ушную ' вену ввелц 20 млн, кдеток, содержащих генную конструкцию рШа. Как ридно и; представленных в табл. 4 данных, максимальное количество положительных по ПЦР-аналязу (фоб наблюдалось в первый и девятнадцатый дни после инъекции.

1а 23-й день не было выявлено нн одного положительного сигнала из семи [сследоаанных проб.

Таблица 4. Результаты ПЦР-аналдаа ДНК, выделенной нз молока свиноматок после внутривенного введения ретровнрусных векторов

№ животного День лактации Взято проб молока Р «+»

п %

№50 \ 9 4 44,4

15 7 1 14,3

19 8 3 37.5

23 7 0 0

29 7 1 14,2

33 7 2 28,6

№ 2847 3 11 • 0

10 12 1 8,3

16 12 * •. 0

Примечание: n-колнчество положительных проб молока на наличие рекомбннантной вставки (ПЦР «+»).

Свиноматке №2847, находящейся на 3-м месяце супоросности была сделана внутривенная инъекция клеток, 'упаковывающих рекомбинантную генную конструкцию, содержащую вставку гена эритропоэтина человека. Взятие проб молока производилось на всём протяжении лактации. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из соматических клеток молока, показал наличие сигнала лишь в одной пробе (табл. 4).

3.3.3.Оценка эффективности испаяьзоеания ретровнрусных teumopot для переноса рекомбннантной генной конструкции t сперм ии ¡n vivo.

В семенники бычков №№ 3155, 3169, 3189 (ОПХ «Дубровицы») вводили клетки-упаковщицы (№ №3155 и 3189) и культуральную жидкость (№ 3169), содержащие генную конструкцию pLNa. Через 25 дней после первой была произведена вторая инъекция культуральной жидкости аналогичной генной конструкции. ' • f

На протяжении шести месяцев пробы спермы были исследованы на наличие ДНК лровнруса. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из сперму трех бычков, выявил наличие провирусау№3155 с 14 по 25 день после инъекции, у №3169- с 14 по 63 день после инъекции и у № 3J 89 -со 109 по 163 день после инъекции.

Таким образом, нами была показана возможность сохранения генной конструкции в сперме в течение двух месяцев после инъекции. Можно

предположить, что происходила интеграция ретровирусного вектора в стволовые клетки семенников, которые давали начало популяции трансформированных сперматозоидов.

3.4 Исследование динамики экспрессии рекомбинантного эритропоэтина * молоке свиноматок

На всём протяжении лактации у животных брали пробы молока для исследования экспрессии рекомбинантного эритропоэтина методом ИФА. Полученные при этом данные представлены в таблице 5.

Как следует из представленных данных инъекция клеток, упаковывающих ретротрусные векторы, в маточную железу и кровь обусловливала определённый уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке животных в каждом конкретном случае. У животных, которым инъекция, клеток-упаковщиц производилась в молочную железу (№2832/2849, 1221, 5381), уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина был выше, чем у животных, которым инъекция была сделана внутривенно (2847, 50). Также было замечено, что на количество рекомбинантного белка в мол окр оказывали влияние сроки супоросности свиноматок, на которых производилось введение ретровирусного вектора. Наибольший уровень экспрессии отмечался тогда, когда ретровирусный вектор был введён в момент усиленной пролиферации клеток молочной железы, примерно, в середине супоросности (2 месяца).

Таблица 5., Результаты исследования экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке свиноматок ;

№ животного Физиологическое состояние животного Количество вводимых клеток ИФА иг/мл Количество «+» Проб 1.0 ПЦР(%)

1 2832/49 супоросность 2,5 месяца 7,5 30 100

2 1221 супоросность 2 месяца 24 150 77,2

3 53в1 супоросность 2 месяца 20 450 2,8

4 2847- супоросность 3 месяца 20 ■ ' 15 ЛЭ ■■

5 30 , супоросность 2 месяца 20 . 24

* Примечание:: п-количество положительных проб молока на наличие р?комбннантиоЙ вставки (ПЦР «+»). 1

I_I-введение в разные доли молочной железы; ¡¿¿Д-внутривенное введение

Из данных табл. 5 видно, что нет чёткой зависимости между количеством положительных по ПЦР проб и уровнем экспрессии рекомбинантного эритропоэтина. Так, у свиноматки №2832/2849 100% проб оказались положительны по ПЦР, но в молоке было обнаружено не более 30 нг/мл эритропоэтина, в то время, как у свиноматки №5381 положительными по ПЦР-анализу оказались лишь 2,8% проб, »о количество трансгенного продукта составило 450 нг/мл,

¿5 Исследование динамики жспрессин рекомбинантного эритропояпина : * молоке крупного рогатого скота.

При введении ретровирусных векторов в правую заднюю четверть вымени нетелей 3006 и 3020 ИФА установлено содержание в молоке рекомбинантного эритропоэтина в пределах 50- 800 нг/мл. ■

В первые четыре дня лактации количество трансгенного белка было в среднем 100 нг/мл. Затем, начиная с 6-го по 62-Й день оно составило, примерно,' 400-800 нг/мл, при этом, максимальное количество эритропоэтина отмечалось у коровы №3006 на 6-ой день лактации, в у коровы №3020 на 22-ой день. К 74 дню в молоке животных было замечено падение уроаня рекомбинантного продукта, что возможно связано с инактивацией генной конструкции (рис. 7).

яг/мл 900 х—

300 100 ■

100

0

800 ■■ 700 -600

900

400

1 4 6 8 11 18 22 36 2» 36 ,62 74

День лактации (дв.)

Рис. 7. Динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке карая

Кроме опытной доли вымени, куда вводились клетки, упаковывающие рекомбннантную генную конструкцию, ИФА показал наличие эрктроцоэтина человека, хотя и в меньших концентрациях, но и в контрольных долях выменй (табл. 6,7).

День лакта--шш , Доли вымени

правая передняя левая передняя левая задняя правая задняя*

ПЦР ИФА, иг/мл ПЦР ИФА, нгУмл ПЦР ИФА. иг/мл ПЦР ИФА, кг'мл

1 + 85 - 75 - 85 + 75

4 125 • 10 85 +■ 85

6 + " 100 ' + 80 + 100 + 90

8 130 - 70 + ■ 105 100

■ 12 0 0 + 75 + 240

18 0 + 50 . - . 210 230

22 50 - 0 . - 0 - 800

26 0 0 - 0 800

29 100 0 - 70 500

36 280 - 80 + 260 + 540

62 0 + 0 - 0 + ■ 500

74 0 - ■ 0 - 0 + 400

'опытная доля вымени

Таблица, 7. Результаты ПЦР и ИФА коровы № 3006.

День лактации ; Доли вымени

правая передняя левая передняя левая задняя правая задняя*

ПЦР ИФА, нг/мл ПЦР ИФА,нг/мл ПЦР ИФА, нг/мл ЛЦР ИФА, нг/мл

1 - 70 - 0 - 0 + 80

4 + 110 115 + 125 - 120

6 - 120 + 120 • 120 • 190

8 + 400 50 - 0 + 800

12* + . 100 + 0 + 50 + 400

18 • 100 . - 50 - 1 0 - 550

22 - 100 • 50 * . + 420 + . 430

26 - ■ 0 - 0 - 100 ■ - 490

29 + 50' • 0 + 0 - 550

36 70 - 0 ■ + . 70 + 500

62 : - ■ 0 ■ + 30 - 0 + 450

74 - 0 . - - - 0 + 80

'опытная доля вымени

Несмотря на то, что ИФА было обнаружено присутствие рекомбНиантного эрнтропоэтина в молоке нетелей, ПЦР-аналцз часто давал отрицательный результат. Однако этот факт вполне объяснимый. На долю альвеолярных клеток молочной железы, которые и являются носителями провируса, в молоке приходится лишь около 2% от общего числа соматических клеток молока, и поэтому отсутствие сигналов при ПЦР амплификации можно объяснить недостаточной чувствительностью метода.

3.5. Исследование распространения провируса в органа! и тши при ннъекинн ретровнрусных векторов в молочную железу, кровь и семенники животных.

3.5.1.Исследо*анце распространения провируса * органах и тканях животных при инъекции ретроаирусных векторов $ молочную жыезу.

В целях исследования распространения ретровирусных векторов в органах и тканях животных при инъекциях в молочную железу мы подвергли ПЦР-анализу ДНК, выделенную из разных органов опытных животных.

Для этого, на 54-й день после опороса свиноматку №2832/2849 забили и взяли внутренние органы для исследования на наличие ДОЖ провируса. На рис.8 представлен ПРЦ анализ ДНК свиньи на наличие провируса в органах.

113 4 3 6 1 Я ) Ю II II13 М ИКР I» И Ш1ХЗ 1*4

fcti*».. «М ¿пи—инт +

рис. & ПЦР анализ органов свиньи № 2832/2849 (54-ый день после опороса): 1-сланной мозг; 2-сепеэенка; 3-дляннейшоя мышца; 4-печень; J-ншгачечиии!; 6-№>КЖ«яудочнм желе»; 7-спюнная «еяеад; 1М4-опытеыв доли «шешг, 15-20-контрольные "доля вымени; 21-отрицательный контроль (ДНК от ннпктноВ сышомоткн); 22-отрнцпелышй . контроль (бкаистшитрсышвя вода); ЗЗ-пояожителькмй контроль { ДНКчеловекв) >

Как видно из ¡fue. 8, наличие провируса было установлено в спинном мозге (дорожка /), надпочечниках (дорожка 5), поджелудочной железе (дорожка 6), слюнной железе {дорожка 7), причем в слюнной железе был выявлен сигнал, по своей силе сопоставимый с сигналами, выявленными в молочной железе {дорожки 8,¡2,13). Все органы, в которых была обнаружена рекомбннантная вставка, за исключением спинного мозга, являлись железами, следовательно, интенсивная интеграция ретровирусного вектора происходит в те Органы, клетки которых усиленно пролнфериругот.

Исходя из результатов анализа ДНК, »наеденной из молока этой же свиноматки, следовало ожидать наличия сигнала в пробах ДНК, выделенной из всех долей вымени как правой, тек и левой сторон. Однако проведенный анализ показал наличие лровируса только в 1-, 5-и 6-й долях вымени правой опытной стороны (рис, 8, соответственно, дорожки 8; 12 и 13) и в 1- и 2-й долях левой контрольно^ стороны вымени (соответственно, дорожки 15 и /б). В качестве положительного контроля была использована ДНК человека (дорожка 23), а в качестве отрицательного - ДНК интактной свиньи и бидистиллироваиная вода (дорожки 21 и 22).

Полученные результаты позволяют сделать вывод об очаговом характере интеграции лровирусов в органах и тканях. Для того, чтобы проверить данное предположение, нами была выделена ДНК из десятц различных участков исследуемых органов. Результаты анализа представлены в табл. 8.

Таблица 8. Результаты ПЦР анализа ДНК свиньи № 2832/2849, выделенной из различных органов

Исследуемый орган Исследовано проб ПЦР «+» %

Слюнная железа 10 3 30

Поджелудочная железа 10 2 20

Надпочечники 10 2 20

Спинной мозг 10 1 20

Печень 10 0 0

Селезенка — .....10 ... _ 0 - 0

1 -ая правая доля вымени (опыт) 10 5 50

2-ая правая доля вымени 10 0 0

3-ая правая доля вымени 10 0 0

4-ая правая доля вымени 10 0 0

5-ая правая доля вымени 10 1 10

6-ая правая доля вымени 10 1 10

1-ая левая доля вымени (контроль) 10 . . 2 20

2-ая левая доля вымени 10 1 10

Э*ая левая доля вымени 10 0 • 0

4-ая левая доля вымени 10 0 0

5-ая левая доля вымени 10 0 0

б-ая левая доля вымени 10 0 • 0

Анализ ДНК, выделенной из тканей свиноматки № 2832/2849, показал присутствие лровируса в слюнной железе (3 из 10 проб), поджелудочной железе (2 из 10 проб), надпочечниках (2 из 10 проб), спинном мозге (1 из 10 проб).Как следует из данных таблицы, максимально 50% проб, выделенной из различных

долей вымени свиньи, содержали рекомбннантный провнрус. Хотя именно молочная железа являлась непосредственным местом введения ретровирусных векторов, в большинстве проб ДНК, выделенной из её долей было обнаружено меньше очагов интеграции рекомбинантной генной конструкции, чем, например, в слюнной железе.

3.5. ¡.Исследование распространения провируса в органах и тканях животных при внутривенном введении ретровнрусных векторов.

Для этого, пробы органов свиноматки №50 были подвергнуты ПЦР-анализу, В результате проведённых исследований было установлено наличие провируса в почках, селезёнке, щитовидной железе, слюнной железе, головном мозге и молочной железе.

3.5.3.Исследование распространения правирусов в органах и тканях при введении ретровирусных векторов в семенники животных

У бычка №3189 сигнал ожидаемой длины был найден в ДНК, выделенной из селезёнки, желудка, спинного мозга, храсного костного мозга н почек. Интересен факт, что в 20 пробах ДНК, выделенной из разных участков ткани семенников не было обнаружено ни одного положительного сигнала,, хотя именно эти органы являлись непосредственным Местом введения клеток, упаковывающих ретровирусный вектор.

Таким образом, сравнивая распространение ретровирусных векторов в органах и тканях животных были замечены различия по месту локализации провируса н количеству положительных проб у особей при различных методах введения клеток-упаковщиц (табп. 9). { ,

Исходя из данных, представленных в табл. 9, у животных, которым инъекция осуществлялась в молочную железу, ПЦР-анализом были обнаружены положительные пробы преимущественно в железах, в то время, как у особей, .которым инъекция осуществлялась в семенники и внутривенно, положительные сигналы были отмечены не только в железах, но и в селезёнке, почках, желудке, красном костном мозге и головном мозге. В процентном отношении, у животных, которым инъекция производилась' внутривенно, наблюдалась большее число положительных пррб в разных органах и тканях, чем у животных, которым клетки-упаковщики вводились в молочную железу.

Следует также отметить, что на количество положительных проб влиял интервал между днвм инъекции и днем вэдткя проб тканей и внутренних органов. Так, у исследованных свиноматок процент положительных проб был выше при большем интервале времени от момента инъекции до дня взятия проб тканей и внутренних органов.

Таблица 9. Количество (%) положительных по ПЦР проб в органах н тканях животных

№квцд животного Свиноматка №2832 Свикомат-каШ217 Свиноматка №50 Свиноматка №1717 Бычок № 3189

Кол-во дней после ннъекцнн 97 45 110 2 . 325

Место инъекцкц молочная железа молочная железа внутривенно внутривенно семенники

Органы и ткани % положительных по П _1Р проб в разных органах и тканях

селезёнка —г ■' 20 10

красный костный мозг т ■■Г* '' 20 ...

желудок . — - ■ . —. 10

почки * ■ ' р*. • — . - 10 ■ — • 10

надпочечники 10 20 ■ — ■ ■ ' я»

щнтовид. железа нь ' 10 — ' . — .

поджелудоч. жел 20 •V ■ " —

слюнная жецеза 30 30 20

молочная железа 60 —• 50 ■ ** ■

головной МОЗГ 40 . -

СПИННОЙ МОЗГ 10 — ■ Я. ■ ■ ■ 30

У свиноматки №50 пробы внутренних органов бьци взяты через ПО дней после инъекциц II ПЦР»анализ показал наличие положительных сигналов в 50°4 ■ исследованных проб ДНК, в то время, как у свиноматки №17)7, которой инъекция была сделан^ за двз дня до взятия проб не было обнаружено ни одной пробы, которая бы показала наличие провируса.

4. ВЫВОДЫ

1,'Применение методики выделения ДНК с помощью перхлората натрия, позволяет получать высокоочищеннук» ДНК из спермы и слюны животных для последующего использования в постановке ПЦР-анализа.

2, Анализ ДНК, выделенной из молока опытных свиней и коров, показал наличие генной конструкция эрщропоэтнна у всех исследованных животных, что доказывает эффективность применения рстровнрусных векторов для' доставки рекомбинантной ДНК в органы-мишени.

3, ПЦР-аналиэ ДНК, выделенной из спермы бычков с генной конструкцией Зритропоэтнна, выявил наличие провируса у всех трёх животных. Показана

2t

возможность сохранения генной конструкции в сперме в течение двух месяцев после инъекции, что демонстрирует возможность интеграции рекомбннактной генной конструкции а половые клетки самцов in vivo.

4. Уровень экспрессии рекомбинантиого эритропоэтнна В молоке свиней при внутривенном введении клеток-упаковщиц достигал 70 иг/мл, а при введении в молочную железу - 450 нг/мл. В Молоке коров эти данные составили 800 иг/мл.

5, Исследование динамики экспрессии эритропозтина в молоке свиней и коров в ходе лактация выявил^ резЛичия в концентрации рекомбинантиого белка. Количество рекомбииаитного эритропоэтнна в молоке Коров было максимально в первый месяц лактации, затем снижалось до 30 кг/мл Kd второму месяцу и до 30 кг/мл К третьему месяцу лактации. После третьего месяца лактации, наличия эритропоэтнна в молоке коров выявлено не было. У свиноматок экспрессия рекомбкнантного бел « наблюдалась на протяжении всего периода лактации.

. б. Исследование внутренних органов опытных животных выявило, что распространение рекомбинантной генной конструкции происходит не только в , пределах места инъекции, нь наблюдается н в других, в основном, сильно ; пролнферирующих органах и тканях. Кроме тканей молочной железк наличие рекомбинантной ДНК было обнаружено В слюнной железе (3 из 10 проб), Поджелудочной железе (2 из 10 проб), надпочечниках (1 tnlQ проб), спинном . мозге (1 из 10 проб). После внутривенной инъекции рекомбннантиая генная конструкция была обнаружена в слюнной железе, ипгтовндной железе, селезенке, ■ головном мозге й почках. . 7.0бнаружено, что локализация генной конструкции в исследованных органах имеет мелкоочаговый характер. . Процент участков, содержащих генную конструкцию составляет в среднем: в молочной железе - 50%, в слюкНой железе -30 %, в поджелудочной железе -20 %, надпочечяикюс-20%, спинном мозге-20%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

При получении соматических трансгеиных животных с генной конструкцией эритропозтина рекомендуем Истгальзовать в качестве продуцентов ', крупный рогатый cictrr из-за болыаего содержания рекомбиНаигного белка в молоке.; ' ' _v ;

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ •

1.Титова В.А.; Зиновьева H.A., Савченкова И.П., Гладырь Е.А., Шатай ло В.Н., Г Эрнст Л.К. Испольэованне ретроаирусиих векторов длапереяоса генов ¡n vivo у

сельскохозяйственных животных Н Сб. науч. трудов ВИЖа,-2001.- Вып. 61. С.

2. Титова В.А,, Зиновьева H.A., Шатайло 8.Н., Чабан И.М-, Сергеев Н.И., Эрнст Л.К. Молекулярно-генетическое исследование эффективности использования ретровирусных векторов для соматического переноса генов в молочную железу свиней. // Материалы научно-практической конференции ' "Повышение конкурентноспособности и задачи кадрового обеспечения " - Быково. - 2000.-С.74.

3. Титова В.А., Зиновьева H.A., Савинкова И.П,, Башкеев Е.Д., Гладырь Е.А., Шатайло В.Н., Эрнст JI.K. Получение рекомбинантного эритропоэтина в молоке соматических трансгенных животных. // Материалы научно-практической конференции "Повышение конкурентноспособности и задачи кадрового обеспечения "-Быково.-2001.-С.113.

4. Титова В.А., Зиновьеве H.A., Эрнст Л.К. Исследование распространения рекомбннантной генной конструкции в организме при введении ретровирусных векторов в молочную железу, кровь и семенники животных. Н Материалы научно-практической конференции "Повышение конкурентноспособности и задачи кадрового обеспечения " -Быково. -200l.-C.43.

225-228.

3«. »У 00 Ttp.XOO «ta. 1,0 У.П.Л. Im. Го* НИИ НПО "Луч" г.Лодоаьм М.О,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Титова, Виктория Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ретровирусы как естественные векторы для переноса 12 экзогенных генов

1.1.1. Строение вириона ретровирусов

1.1.2. Жизненный цикл ретровирусов

1.1.3. Конструирование векторов на основе ретровирусов

1.2. Создание трансгенных животных путём трансформации половых клеток самцов

1.3. Использование молочной железы для синтеза 32 рекомбинантных белков

1.3.1. Получение соматических трансгенных животных с 33 помощью ретровирусных векторов

1.3.2. Производство рекомбинантных белков

1.3.2.1. Производство рекомбинантных белков фармакологического 34 назначения

1.3.2.2. Изменение состава и свойств молока

1.3.3. Животные-продуifенты рекомбинантных белков

1.4. Экспрессия трансгенных белков

1.4.1. Экспрессия продуктов трансгеное в молоко

1.4.2. Экспрессия продуктов трансгенов в кровь

1.5. Исследование способности ретровирусных векторов 48 переносить экзогенные конструкции в органы и ткани животных

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Реактивы и оборудование

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Оборудование

2.2. Используемые векторные системы

2.3. Анализ животных на наличие рекомбинантной вставки

2.3.1. Экстракция ДНК

2.3.2. Определение концентрации ДНК

2.3.3. Использование полимеразной цепной реакции для проведения 58 анализов на траисгенностъ

2.4. Анализ экспрессии трансгенных белков

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Оценка клеток-упаковщиц на наличие рекомбинантной 60 вставки

3.1.1. Разработка и оптимизация тест-систем

3.1.2. Оценка используемых клеток-упаковщиц на наличие 63 рекомбинантной вставки

3.2. Оптимизация метода выделения ДНК из слюны и 63 спермы

3.2.1. Оптимизация выделения ДНК из слюны

3.2.2. Оптимизация выделения ДНК из спермы

3.3, Исследование способности ретровирусных векторов для 66 локального переноса генов в молочную железу, кровь и семенники животных

3 3 J Исследование характера интеграции генной конструкции при введении ретровирусных векторов в молочную железу

3.3.2 Исследование характера интеграции при внутривенном введении клеток-упаковщиц, содержащих рекомбинантную ДНК

3.3.3. Оценка эффективности использования ретровирусных 73 векторов для переноса рекомбинантной генной конструкции в спермии in vivo

3.4. Исследование экспрессии трансгенного белка

3.4.1. Исследование динамики экспрессии рекомбинантного 75 эритропоэтина в молоко свиноматок

3.4.2. Исследование динамики экспрессии рекомбинантного 77 эритропоэтина в молоко крупного рогатого скота

3.5, Исследование распространения провируса в органах и go тканях при инъекции ретровирусных векторов в молочную железу

3.5.1. Исследование распространения провируса в органах и go тканях при инъекции ретровирусных векторов в молочную железу

3.5.2. Исследование распространения провируса в органах и 33 тканях животных при внутривенном введении ретровирусных векторов

3.5.3. Исследование распространения провируса в органах и 33 тканях при инъекции ретровирусных векторов в семенники

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве"

Актуальность темы.

Одним из приоритетных направлений развития науки и техники в области технологий живых систем является создание трансгенных форм животных и растений (Постановление Правительства РФ от 21 июля 1996 года, №2727/п-П8).

Последняя четверть века характеризуется быстрым прогрессом в применении техники генетической инженерии ко всё большей совокупности организмов от бактерий и дрожжей до млекопитающих. В 1985 г. впервые прозвучал доклад по проблеме создания сельскохозяйственных животных. Ранние работы были, в основном, сфокусированны на получении животных, несущих экзогены, отвечающие за рост и развитие, резистентность к заболеваниям, увеличение репродукции, изменение лактации, повышение эффективности переваривания кормов и улучшение иммунного ответа. В настоящее время, трансгенных животных используют в качестве моделей для исследования патогенеза различных наследственных и других заболеваний, для производства биологически активных белков для фармацевтической промышленности.

Несмотря на то, что для создания трансгенных животных, в том числе и сельскохозяйственных, находит применение целый ряд методов (инъекция в пронуклеус, липосомы и спермии как векторы, пересадка ядер), эффективность их получения остаётся на довольно низком уровне. Кроме того, создание трансгенных сельскохозяйственных животных лимитируется высокими материальными и временными затратами.

В этой связи возникает необходимость в поиске и разработке альтернативных подходов, позволяющих эффективно получать генетически модифицированных особей. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Ретровирусные векторы самостоятельно проникают в клетки хозяина, эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку.

Огромным преимуществом ретровирусных векторов является возможность их использования для получения так называемых фенотипических трансгенных животных методами локального (органного) трансгенеза. В отличие от введения трансгена в эмбриональные линии, использование ретровирусных векторов для локального переноса экзогенных генов животным в постнатальный период позволяет синтезировать рекомбинантные продукты в отдельных органах уже через несколько месяцев или даже дней после начала эксперимента. Особенно актуальным это является для экспрессии рекомбинантных белков с молоком сельскохозяйственных животных (свиней и коров), так как по сравнению с методом микроинъекции затраты времени от начала экспериментов и до получения первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются в 10 раз.

За последние десятилетия был разработан целый ряд методов, позволяющих вводить интересующие последовательности ДНК в клетки индивидуумов: микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы, использование трансформированных первичных половых и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), ретровирусных, аденовирусных и аденоассосиированных векторов, трансформированных спермиев и липосом. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы делает возможным введение и интеграцию в геном фрагментов ДНК длиной до 800000 пар нуклеотидов. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного таргетинга (Савченкова И.П. и др., 1996), даёт возможность тестирования интеграции трансгенов в культуре клеток и в ряде случаев проводить оценку их экспрессии (Зиновьева Н.А. и др., 2001). Перенос экзогенных генов посредством ретровирусных векторных систем рассматривают как перспективный метод для использования в следующих направлениях:

1) для получения «фенотипических трансгенов», т.е. животных с трансформацией отдельных органов (Брем Г. и др., 1995);

2) для генной терапии болезней человека и животных (Uckert W., et. al., 1999; Porada С. et. al, 1998; Pitt В et. al, 1995);

3) для синтеза рекомбинантных белков с молоком или придания молоку новых свойств (Gutierrez-Adan A. et. al., 1997; Chan A.W.S. et. al., 1998).

Введение экзогенных генов в молочную железу взрослых особей позволяет получать рекомбинантные белки (интерфероны, эритропоэтин и др.) с молоком лактирующих самок. Причём, по сравнению с традиционным методом микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы затраты времени от начала эксперимента до получения первых результатов об уровне экспрессии сокращаются с 4-5 лет до 4-5 месяцев.

Однако каждый из этих методов имеет ряд недостатков, ограничивающих их использование (Chan A.W.S. et. al., 2000). Негативными факторами являются: недостаточная визуализация пронуклеусов у сельскохозяйственных животных, объединение генов в тандемы в результате гомологичной рекомбинации между молекулами ДНК, не сайт-специфическая интеграция, хромосомные абберации (Дыбан А.П., 1989). Получение трансгенных животных с помощью первичных половых клеток, эмбриональных стволовых клеток, трансформированных спермиев и липосом также связано с определёнными трудностями (Hooper et al.,1996; Kim J.H., 1997). Так, при использовании зародышевых клеток, полученные особи в большинстве случаев являются химерными. Кроме того, лишь часть животных будут передавать трансген по наследству потомству (Брем Г. и др., 1995). Использование трансформированных спермиев и липосом не получило широкого распространения вследствие низкой воспроизводимости эксперимента и высокого процента отрицательных результатов.

В этой связи, с целью разработки оптимальной технологии локального трансгенеза, основанной на использовании ретровирусных векторных систем, актуальным является оценка эффективности отдельных методик для доставки ДНК в отдельные органы сельскохозяйственных животных, в частности в молочную железу свиней и коров.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является исследование способности ретровирусных векторов переносить генетическую информацию в органы и ткани сельскохозяйственных животных с использованием молекулярно-генетических методов.

Для достижения указанной цели были сформулированы для решения следующие задачи:

• оценить используемые линии клеток-упаковщиц на наличие рекомби-нантной вставки методом ПЦР анализа;

• отработать метод выделения ДНК из слюны и спермы сельскохозяйствен-ных животных;

• изучить эффективность доставки ретровирусными векторами рекомбинантной ДНК в органы и ткани животных при введении клеток-упаковщиц в молочную железу и ушную вену;

• оценить эффективность ретровирусных векторов для доставки рекомбинантной генной конструкции в спермии бычков in vivo;

• проследить в динамике экспрессию рекомбинантного эритропоэтина в молоке опытных животных;

• изучить характер распространения ретровирусных векторов в органах и тканях опытных животных.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы впервые была изучена эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза органов и тканей сельскохозяйственных животных, в частности свиней и коров. Была исследована обусловленная рекомбинантными провирусными последовательностями экспрессия рекомбинантных белков в молоке свиней и коров в динамике, выявлено влияние места, времени инъекции, а так же количества инъецированных клеток-упаковщиц на уровень экспрессии. Был выполнен анализ распространения и локализации рекомбинантных провирусов в органах и тканях животных при инъекции клеток-упаковщиц в молочную железу и кровь свиней и коров.

Практическая ценность работы.

• Разработана тест-система для выявления рекомбинантных провирусных последовательностей в органах, тканях и молоке опытных животных;

• Показана возможность обусловленного ретровирусными векторами синтеза в молоке коров и свиней рекомбинантных продуктов экспрессии, в частности эритропоэтина человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Возможность доставки генной конструкции эритропоэтина в ткани молочной железы животных как при инъекции ретровирусных векторов в паренхиму молочной железы, так и при внутривенной инъекции.

• Синтез рекомбинантного эритропоэтина в клетках молочной железы животных имеет место как после введения генной конструкции непосредственно в ткани молочной железы, так и после внутривенной инъекции.

• Распространение рекомбинантной генной конструкции происходит не только в пределах места инъекции, но наблюдается и в других органах и тканях, где оно имеет мелкоочаговый характер.

Апробация работы.

Материалы диссертационный работы были представлены на научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2000; конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001; научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2001; научных отчетах ВИЖа 2000-2001; научной конференции отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 10 таблиц, 8 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 130 источников, в т.ч. 103 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Титова, Виктория Андреевна

5.ВЫВОДЫ

1. Применение методики выделения ДНК с помощью перхлората натрия, позволяет получать высокоочищенную ДНК из спермы и слюны животных для последующего использования в постановке ПЦР-анализа.

2. Анализ ДНК, выделенной из молока опытных свиней и коров, показал наличие генной конструкции эритропоэтина у всех исследованных животных, что доказывает эффективность применения ретровирусных векторов для доставки рекомбинантной ДНК в органы-мишени.

3. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из спермы бычков с генной конструкцией эритропоэтина, выявил наличие провируса у всех трёх животных. Показана возможность сохранения генной конструкции в сперме в течение двух месяцев после инъекции, что демонстрирует возможность интеграции рекомбинантной генной конструкции в половые клетки самцов in vivo.

4. Уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке свиней при внутривенном введении клеток-упаковщиц достигал 70 нг/мл, а при введении в молочную железу - 450 нг/мл. В молоке коров эти данные составили 800 нг/мл.

5. Исследование динамики экспрессии эритропоэтина в молоке свиней и коров в ходе лактации выявили различия в концентрации рекомбинантного белка. Количество рекомбинантного эритропоэтина в молоке коров было максимально в первый месяц лактации, затем снижалось до 50 нг/мл ко второму месяцу и до 30 нг/мл к третьему месяцу лактации. После третьего месяца лактации, наличия эритропоэтина в молоке коров выявлено не было. У свиноматок экспрессия рекомбинантного белка наблюдалась на протяжении всего периода лактации.

103

6. Исследование внутренних органов опытных животных выявило, что распространение рекомбинантной генной конструкции происходит не только в пределах места инъекции, но наблюдается и в других, в основном, сильно пролиферирующих органах и тканях. Кроме тканей молочной железы наличие рекомбинантной ДНК было обнаружено в слюнной железе (3 из 10 проб), поджелудочной железе (2 из 10 проб), надпочечниках (1 из 10 проб), спинном мозге (1 из 10 проб). После внутривенной инъекции рекомбинантная генная конструкция была обнаружена в слюнной железе, щитовидной железе, селезенке, головном мозге и почках.

7.Обнаружено, что локализация генной конструкции в исследованных органах имеет мелкоочаговый характер. Процент участков, содержащих генную конструкцию составляет в среднем: в молочной железе - 50%, в слюнной железе - 30 %, в поджелудочной железе - 20 %, надпочечниках-20%, спинном мозге-20%.

104

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

При получении соматических трансгенных животных с генной конструкцией эритропоэтина рекомендуем использовать в качестве продуцентов крупный рогатый скот из-за большего содержания рекомбинантного белка в молоке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Титова, Виктория Андреевна, п. Дубровицы

1. Атабеков И.Г. Реализация генетической информации//М., Наука,1972.

2. Баранов В. Медицина на пороге революции//М. Наука и жизнь.-2000.-№9.-С. 8-11.

3. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л.К. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология.- 1993,- № 6.- С. 3-27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М. РАСХН. 1995.326 с.

5. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. //М.: Агропромиздат.- 1990.-511с.

6. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Марзанов Н.С, Эрнст Л.К., Брем Г. Методические рекомендации по определению вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина крупного рогатого скота методом ПЦР-ЦДРФ анализа // Дубровицы. 2001. - 15 с.

7. Голиков А.Н. Физиология сельскохозяйственных животных. //М.: Агропромиздат, 1991.

8. Дыбан А.П. Трансгенные млекопитающие в биологии развития. // Онтогенез. Т.20. №6. 1989:577-592.

9. Зиновьева Н. А., Попов А. Н., Эрнст Л. К., Марзанов Н.С., Бочкарёв В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве//Дубровицы. -1998.-47 с.

10. Ю.Зиновьева Н.А., Эрнст J1.K, Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве// ВИЖ.-2001.-128 с.

11. П.Медведев И.К., Нечипуренко J1.B. Пролиферация клеток молочной железы у жвачных животных на разных стадиях беременности и лактации.// Сельскохозяйственная биология.-1988.-№2.-С.32-34.

12. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы—эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих.// Молокулярная биология,-1989.-Т.23.-Вып.2.-С.8-12.

13. Сингер М., Берг П. Гены и геномы.//М. Мир.1998. Т.2. 362 с.

14. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных.//ВНИТИБП. М.,-1998.-С.363-460.

15. Эрнст JI.K. Животноводство—XXI век//Инф. бюл. Новое в животноводстве.-1998.-№ 1 (01 ).С .6-7.

16. Эрнст JI.K., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных// М. Агропромиздат. -1989.- 302 с.

17. Alexander L.J., Hayes G., Bawden W., Stewart A.F., Mackinley A.G. Complete nucleotide sequence of bovine (3-lactoglobulin gene // Animal Biotechnology. 1993. - V. 4. - P. 1-10.

18. AH S., Clarke A.J. Characterisation of the gene encoding ovine (3-lactoglobulin: similarity to the genes for retinol-binding protein and other secretory proteins// J. Mol. Biol. 1988. - V. 199. - P. 415-426.

19. Anderson W. Human gene terapy: Scientific and etical consideration.// Recombinant DNA Tech. Bull.-1985.-v.8.-P.55-63.

20. Bachiller D., Schellander K., Peli J., Ruther U. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1991. - V. 30. - P. 194-200.

21. Bank A. Human somatic cell gene therapy// Bioassays.-1986.-V.18.-P. 999-1007.

22. Bawden W.S., Passey R.J., Mackinlay A.G. The genes encoding the major milk-specific proteins and their use in transgenic studies and protein engineering // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews.- 1994,- V. 12,- P. 89-137.

23. Brem Transgenic animals.-In Biotechnology.//N.-Y.:VCH Press.-1993.-P.745- 832.

24. Brem G., Besenfelder U., Hartl P. Production of foreign proteins in the mammary glands of transgenic mammals // Chimica Oggi.- 1993.- V. 11.- P. 2125.

25. Brem G., Hartl P., Besenfelder U., Wolf E., Zinovieva N., Pfaller R. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits // Gene.- 1994.- V. 149.-P. 351-355.

26. Brinster R.L. Macking transgenic mice: is it really that easy? // Science. -1989. -V. 245. P. 590-591.

27. Brinster R.L., Zimmermann J.W. Spermatogenesis following malt germ-cell transplantation Proc. Natl. Asad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 11298-11302.

28. Bruce C., Whitelaw A. Truncated beta-lactoglobulin transgenes are expressed in the kidney // Gene. 1996. - V. 178. - P. 157-159.

29. Caffm J.P., Poutrel В., Rainard P. Physiological and pathological factors influencing bovine □-lactalbumin and D-lactoglobulin concentrations in milk // J. Dairy Sci. 1985. - V. 68. - P. 1087-1094.

30. Campbell S.M., Rosen J.M., Hennighausen L., Strech J.u., Sippel A.E. Comparison of the whey acidic protein genes of the rat and mouse // Nucl. Acids Res. 1984. - V. 12. - P. 8685-8697.

31. Chan A.W.S. Transgenic animals: current and alternative strategies // Cloning.-V. l.-N. l.-P. 25-46.

32. Chan A.W.S., Homan E.J., Ballou L.U., Burns J.C., Bremel R.D. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. - P. 14028-14033

33. Chan A.W., Kukolj G., Skalka A.M., Bremel R.D. Timing of DNA integration, transgenic mosaicism and pronuclear microinjection // Mol. Reprod. Dev.- 1999,- V. 52,- N. 4.- P. 406-413.

34. Chandan R.C., Parry R.M., Shahany K.M. Lysozime, lipase and ribonuclease in milk of various species // J. Dairy Sci.- 1968.- V. 51.- P. 606-607.

35. Clark A., Simons J., Wilmut I. et al. Pharmaceutical from transgenic livestock//Trends. Biotechnol.-1987.-V.5.-P.20-24.

36. Clarke R.A, Sokol D., Rigby N., Ward K., Murray J.D., Mackinlay A.G. Mammary gland specific expression of bovine aS 1 -casein derived transgenes in mice//Transgenics. 1994. -V. 1. - P. 313-319.

37. Conneely O.M., Headon D.R. Lactoferrin, lactoperoxidase and lysozyme: nature's protective proteins // In: Biotechnology in the Feed Industry, Proceedings of Alltech's Ninth Annual Symposium (ed.: Lyons T.P.).- 1993.- P. 123-131.

38. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes // Biol. Reprod.- 1999.- V. 61,- N. 5.- P. 1331-1339.

39. Ebner K.E., Schambacher F.L. Lactation (Eds.: Larson B.L., Smith V.R.), Academic Press. NY. - 1974. - V. 2. - P. 77-113.

40. Ekhterae D., Crumbleholme Т., Karson E. et al. Retroviral vector-mediated transfer of the bacterial neomycin resistance gene into fetal and adult sheep and human hematopoietic progenitors in vitro// Blood.-1990.-V.75.-P.365-369.

41. Ferry N., Heard JM. Liver-directed transfer vectors// Hum Gene Ther.-1998.-V.9.-N.14.-P. 1975-81.

42. Fox P.F. Chemistry of milk protein // In: Developments in dairy chemistry (Ed.: Fox P.F.), Applied Sci. Pub, NY.-1982,- P. 189-223.

43. Fox P.F. Heat-induced coagulation of milk // In: Developments in Dairy Chemistry (ed.: Fox P.F.), Applied Sci. Pub., NY.- 1982,- P. 189-223.

44. Gannon F., Powel R., Barry T. et al. Transgenic farm animals// J. Biotech.-1990.-V.16-P. 155-170.

45. Ghazizadeh S, Harrington R, Taichman L. In vivo transduction of mouse epidermis with recombinant retroviral vectors: implications for cutaneous gene therapy// Gene. Ther. -1999,- №6 (7).P. 1267-75.

46. Ghivizzani S., Lechman E., Tio C. et al. Direct retrovirus mediated gene transfere to the sinovium of the rabbit knee: implications for artritis gene therapy// Gene Ther.-1997.-V.4.-P.977-982.

47. Giangiacomo R., Nigro F., Messina G., Cattaneo T.M.P. Lysozyme: jast an additive or a technological aid as well? // Food Additives and Contaminants, 1992, V. 9, P. 427-433.

48. Goodman R.E., Shanbacher F.L. Bovine lactoferrin mRNA: sequence, analysis and expression in the mammary gland // Bichem. Biophys. Res. Comm. -1991,-V. 180. P. 75-84.

49. Gossler A., Doetschman Т., Korn R, et al. Transgenosis by means of blastocyst-dereived embryonic stem.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986.-Y.83.-P.9065-9069.

50. Green M.L., Marshall R.J. The acceleration by cationic materials of the coagulation of casein micelles by rennet// J. Dairy Res., 1977, V. 44, P. 521-531

51. Gruenbaum Y., Revel E., Fainsod A. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens // J. Cell Biochem.-1991.-Suppl.15.-P.194.

52. Gutierrez-Adan A., Maga E.A., Made H., Shoemaker C.F., Medrano J.F., Anderson G.B., Murray J.D. Alterations of the physical characteristics of milk from transgenic mice producing bovine kappa-casein // J. Dairy Sci.-1996.- V. 79.-P. 791-799.

53. Gutierrez-Adan A., Pindado B. The use of transgenic techniques in farm animals: outlook on altering milk composition // A.E.T.E. on the WEB.-1997.-P.5-7.

54. Haskell R., Bowen R. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev.-1995.-№(3)-P.386-390.

55. Hitchin E., Stevenson E.M., Clark A.J., McClenaghan M., Leaver J. Bovine beta-casein expressed in transgenic mouse milk is phosphorylated and incorporated into micelles // Protein Expr. Purif. 1996. - V. 7. - № 3. - P. 247252.

56. Hooper M. Manipulation of the mouse genome by homologouse recombination//-1996.-V.27-P. 13-15.

57. Hughey V.L., Johnson E.A. Antimicrobial activity of lysozyme againist bacteria involved in food spoilage and food borne disease // Appl. Environ. Mikrobiol.- 1987.- V. 53.-P. 2165-2170.

58. Huguet E., Esponda P. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa // Mol. Reprod. Dev.- 1998.- V. 51.- P. 42-52.

59. Jaenish R. Infection of mouse blastocysts with SV 40-specific DNA sequences in the adult animals // Cold Spring Harbor Symp. 1974. - V. 39. - P. 375-380.

60. Jaenish R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. -P. 1260.

61. Jaenish R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - V. 71. - P. 1250-1254.

62. Jaenish R.Transgenic animals//Science.-1988.-V.240.-P. 1468-1474.

63. Janne J., Alhonen L., Hyttintn J.M., Peura Т., Tolvanen Т., Korhonen V.P. Transgenic bioreactors // Biotechnol. Annu. Rev. 1998. - V. 4. - P. 55-74.

64. Jolivet G., Devinoy E., Fontain M.L., Houdebine L.M. Structure of the gene encoding rabbit alpha SI-casein // Gene. 1992. - V. 113. - P. 257-262.

65. Jolles P., Jolles J. What's new in lysozyme research // Mol. Cell. Biochem. 1984. - V. 63. - P. 165-189.

66. Kah-Whye Peng. Strategies for targeting therapeutic gene delivery // Molecular Medicine Today.-1999.-V.5.-P.448-453.

67. Key M.A., Rothenberg S., Landen C.N., Bellinger D.A. et al. In vivo gene therapy of hemofilia В:sustained partial correction in factor IX-deficient dogs//Science.- 1993,-V. 262. -P. 117-119.

68. Kim J.H., Jung-Ha H.S., Lee H.T., Chung K.S. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig// Mol. Reprod. Dev.- 1997.-V46.-P. 1-12.

69. Koczan G., Hobom G., Seyfert H.-M. Genomic organisation of the bovine aSl-casein gene//Nucl. Acids Res.- 1991.-V. 19,-P. 5591-5596.

70. Kotani H, Newton PB III, Zhang S, Chaing et al. Impruved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy// Hum Gene Ther.-1994.-V 5.-P. 19-28.

71. Krausslich H. Neue Techniken in der Tierzucht und ihre Anwendungsmoglicheiten// Zuchtungskunde.-1985.-V6.- P.381-393.

72. Krausslich H., Brem G. Tierzucht und Allgemeine Landwirtschaftslehre fur Tiemediziner.//Enke.-1997.-P.596.

73. Kuizinga A., vanHaeringen N.J., Kijlstra A. Inhibition of hydroxyl radical formation by human tears // Ophthalmol. Vis. Sci.-1987,- V. 28.- P. 305313

74. Lavitrano M., Camaioni A., Frati V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. Sperm Cells as vectors for introduction foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice//Cells.- 1989.-V. 57.-P. 717-723.

75. Lee C.S., Kim K., Yu D.Y., Lee K.K. An efficient expression of human growth hormone (hGH) in the milk of transgenic mice using rat beta-casein/hGH fusion genes // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. - V. 56. - P. 211-222.

76. Lee K., Atice S., Rosen J., Differential regulation of rat (-casein-chloramphenicol acetyltransferase fusion gene expression in transgenic mice // Molecular Cell Biology. 1989. - V.9. - P.560-565.

77. Lee K.F., DeMayo F.J.,Atiee S.H. et al. Tissue-specific expression of the rat (a-casein gene in transgenic mice)// Nucl. Acid. Res.- 1988.-VI6.-P. 10271041.

78. Limon A., Briones J., Puig T. et al. High-titre retroviral vectors containing the enchanced green fluorescent protein gene for efficient expression in hematopoietic cells // Blood.- 1997.-V.90.-P.3316-3321.

79. Maga E.A., Anderson G.B., Huang M.C., Murray J.D. Expression of human lysozyme mRNA in the mammary gland of transgenic mice // Transgenic Res.- 1994,- V. 3,-P. 36-42.

80. Maga E.A., Anderson G.B., Murray J.D. The effect of mammary gland expression of human lysozyme on the properties of milk from transgenic mice // J. Dairy Sci.- 1995.- V. 78.- P. 2645-2652.

81. Maga E.A., Murray J.D. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk // Biotechnology.- 1995.- V. 13.-P. 1452-1457.

82. Marziali A.S., Ng-Kwan-Hang K.F. Effect of milk composition and genetic polymorphism on coagulating properties of milk // J. Dairy Sci.- 1986.- V. 69.-P. 1793-1798.

83. Masson P.L., Heremans J.F. Lactoferrin in milk from different species // Сотр. Biochem. Physiol.- 1971,- V. 39В,- P. 143-147.

84. Moreadith R., Radford N. Gene targeting in embrionic stem cells: the new physiology and metabolism// J. Med.-1997.-V75 (3)-P.208-216.

85. Nagano M., Brinster R.L. Spermatogonial transplantation and reconstitution of donor cell spermatogenesis in recipient mice // APMIS.- 1998.-V. 106,-N. l.-P. 47-57.

86. Ninomiya Т., Harabayashi M., Sagara J., Yuki A. Functions of milk protein gene 5' flanking regions oh human growth hormone gene // Mol. Reprod. Dev.-1994.-V. 37.-P. 276-283.

87. Perry A.C., Wakayama Т., Kishikawa H., Kasai Т., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection //Science. 1999.-V. 284.-P. 1180-1183.

88. Pervaiz S., Brew K. Homology of b-lactoglobulin, serum retinol-binding protein and protein HC // Science. 1985. - V. 228. - P. 335-337.

89. Phillips D.C. The 3-dimensional structure of an enzyme molecule // Sci. Anim.- 1966,- V. 215.-P. 78-90.

90. Pitt В., Schwarz M., Pilewski J. et al. Retrovirus-mediated gene transfer in lungs of living fetal sheep// Gene Ther.-1995.-V.2-P.344-354.

91. Platenburg G.J., Kootwijk E.P.A., Kooiman P.M., Woloshuk S.L., Nuijens J.H., Krimpenfort P.J.A., Pieper F.R., de Boer H.A., Strijker R. Expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice // Transgenic Res., 1994, V. 3, P. 99-108.

92. Porada C., Tran N., Eglitis M. et al. In utero gene therapy: transfer and long-term expression of the bacterial neo(r) gene in sheep after direct injection of retroviral vectors into preimmune fetuses// Hum Gene Ther.-1998.-V.9-P. 15711585.

93. Qasba P.K., Safaya S.K. Similarity of the nucleotide sequences of rat a-lactalbumin and chicken lysozyme gene // Nature. 1984. - V. 308. - P. 377-380.

94. Rodriguez A., Castro F.O., Aguilar A., Ramos В., Del Baco D.G., Lleonart R., De la Fuente L. Expression of active human erythropoietin in themammary gland of lactating transgenic mice and rabbits // Biol. Res. 1995. - V. 28. -P. 141-153.

95. Rokkones E., Fromm S.H., Kareem B.N., Klungland H., Olstad O.K., Hogset A., Iversen J., Bjoro K., Gautvik K.M. Human parathyroid hormone as a secretory peptide in milk of transgenic mice // J. Cell Biochem. 1995. - V. 59. - P. 168-176.

96. Rottmann O.J., Stratowa Ch., Hornstein M., Hughes J. Tissue specific expression of hepatitis В surface antigen in mice following liposome-mediated gene transfer into blastocytes // Zbl. Vet. Med. A. 1985. - V. 32. - P. 676-682.

97. Salmons B, Gunzberg WHTargeting of retroviral vectors for gene therapy// Hum Gene Ther.-1993.-V4.-P.129-141.

98. Sato M., Jwase R., Kasai K., Tada N., Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative to sperm-mediated gene transter // Animal Biotechnology. 1994.-V. 5.-P. 19-31.

99. Schaar J. Effect of k-kasein geneticvariants and lactation number on the renneting properties of individual milks II J. Dairy Res.- 1984.- V. 51.- P. 97-106.

100. Schranner S. Untersuchungen zum maschinellen Milchentzug beim Kaninchen als Grundlage zur Bestimmung von Laktationsleistungen und Milchenthaltstoffen // Diss. Vet. Med.-Muenchen.- 1993.- P.95

101. Solaiman F, Zink MA, Xu G, Grunkemeyer J et al. Modular retroviral vectors for transgenic and therapeutic use.// Mol Reprod Dev.- 2000.- V56 (2Suppl).-P. 309-15.

102. Sperandio S., Lulli V., Bacci M.L., Fomi M., Maione В., Spadafora C., Lavitrano M. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species // Animal Biotechnology. 1996. - V. 7. - P. 59-77.

103. Stewart C.L., Vanek M., Wagner E.F. Expression of foreign genes from retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimeras // EMBO. 1985. - V. 4. - P. 3701-3709.

104. Stice S.L., Strelchenko N.S., Keefer C.L., Mathew L. Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer // Biol. Reprod. 1996. -V. 54. - P. 100-110.

105. Thepot D., Devinoy E., Fontaine M.L., Hubert C., Houdebine L.M. Complete sequence of the rabbit whey acidic protein gene // Nucl. Asids Res. -1990.-V. 18.-P. 3641.

106. Toman D. Production of human type I collagene in transgenic mouse milk // 3rd International Symposium 'Exploiting transgenic technology for commercial development'. 1995. - San Diego, USA.

107. Tran N., Porada C., Zhao Y. et al. In utero transfer and expression of exogenous genes in sheep.// Exp. Hematol. -2000.-V.28.-P. 17-30.

108. UckertW.,WaltherW. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy. // Pharmac.Ther.-V.63.-P.323-347.

109. Van Brunt J. Molecular farming: transgenic animals as bioreactors// Biotechnology.-1988 ,-V.6-№ 10-P. 1149-115 5.

110. Vilotte J.L., Soulier S. Isolation and characterisation of the mouse a-Lactalbumin-encoding gene: interspecies comparison, tissue- and stage-specific expression // Gene. 1992. - V. 119. - P. 287-292.

111. Vilotte J.L., Soulier S., Mercier J.C., Gaye P., Hue-Delahaie D., Furet J.-P. Complete nucleotide sequences of bovine a-lactalbumin gene: comparison with its rat counterpart // Biochemie. 1987. - V. 69. - P. 609-620.

112. Vilotte J.L., Soulier S., Stinnakre M.G., Massoud M., Mercier J.C. Efficient tissue-specific expression of bovine D-lactalbumin in transgenic mice // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 186. - P. 43-48.118

113. Wang G., Williamson R., Muller G. et al. Ultrasaund-guided gene transfer to hepatocytes in utero// Fetal Diagn. Ther.-1998.-V.13-P. 197-205.

114. Waugh D.F. Formation and structure of casein micelles // In: Milk proteins chemistry and molecular biologe (ed.: McKenzie H.A.).- Acad. Press.-NY.-1971.-P. 3-85.