Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интеграция и экспрессия экзогенов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интеграция и экспрессия экзогенов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов"



На правах рукописи

ВОЛКОВА Наталья Александровна

ИНТЕГРАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ЭКЗОГЕНОВ В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ СОМАТИЧЕСКИХ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ПОЛУЧЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, Московской области 2002 г

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства

Научные руководители: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

академик РАСХН Лев Константинович Эрнст доктор биологических наук, профессор Игорь Яковлевич Шихов

доктор биологических наук, профессор Борис Савельевич Народиицкий. кандидат биологических наук Людмила Федоровна Новикова

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. 11 Скрябина

Защита диссертации состоится « $ » О^^Ч^с'< 2002 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д006.013.01 при Всероссийском государственном гаучго-нсследовательском институте животноводства

Адрес института: 142П:1 ' п,Д>+.

С диссертацией можно озилко.и ( Автореферат разослан о0»£1. .

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических

и 1 район,

, ) В .11.Губанова

г.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Одним кз направлений в биотехнологии, интенсивно развивающихся в последнее годы, является создание трансгенных животных -- продуцентов рекомбинантных белков фармакологического назначения. Учитывая сложность получения лекарственных препаратов белков из органов и биологических жидкостей человека ввиду их низкой кон центр ацин,_а также ограниченного объема сырья и возможности переноса опасных инфекций, производство рекомбинантных белков с помощью трансгенных животных имеет в настоящее время огромный коммерческий интерес. При этом наиболее интересным представляется получение биологически активных протеинов с молоком сельскохозяйственных животных. Экспрессия чужеродных белков в молочной железе трапегенных животных может достигать 1 г/л. Причем, выделение данных белков из молока становится возможным уже при их концентрации от 25 нг/мл (Vclander W. et al, 1992; Denman J. et al., 1991; Wright G. et al., 1991; van Gott et al.t 1997; DiTulio P, ct al., 1995 ндр.).

Однако, стоимость производства трансгенных животных на сегодняшний день остается высокой. Кроме того, экспрессирусмые уровни трансгена у крупных животных не всегда коррелируют с теми, которые были получены у лабораторных животных (Wall R. et al., 1991). Отрицательным моментом также является и то, что у крупных животных только 1% эмбрионов, микрошгьецированных экзогенной ДНК, развивается в трансгенное животное, причем около 40% из них не экспрессируют трансген (Wilmutl.etal.,1991;HennighausenL.etal., 1992). -

В рамках данной проблемы актуальным является разработка методов получения трансгснных животных, характеризующихся высокой эффективностью трансгенеза и низкими материальными затратами. Как перспективный в данном отношении метод рассматривают использование ретровирусных, векторов. По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. На этом основано использование ретровирусных векторов для получения соматических трансгенных животных, т.е. животных с трансформацией отдельных органов (Брем Г. и др., 1995). Введение экзогенных генов в органы взрослых животных позволяет значительно сократить .сроки с момента введения генных конструкций до получения первых данных об уровне экспрессии чужеродных белков, что особенно важно для животных, характеризующихся большим генерационным интервалом (крупный рогатый скот, козы, свиньи). В связи с этим интересным представляется проведение

цен ТР/.ЛЪНАЯ НЛУЧ(-!/:■) : ■..).';■'.ОТГ.ИА Moo*, слг.-ЛУ-

т.:. К. а. • ' • -¿г

экспериментов по переносу экзогенной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных с целью получения продуцентов рекомбинантных белков.

1.З.Целъ 1) задачи исследования.

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение интеграции и экспрессии экгогеной ДНК в молочной железе соматических трзнсгашых животных, полученных с использованием ретровирусных векторов.

Для достижения указанной целя были поставлены следующие задачи:

1. Оценить используемые линии клеток-упаковщиц на наличие рекомбинантной вставки методом ПЦР;

2. Оценить эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулотштаркого кодонисстимулирующего фактора к зритропоэтина человека, для осуществления переноса экзогенной ДНК в секреторные клетки вымени после введения клеток-упаковщиц в молочную железу крупного рогатого скота и свиней;

3. Изучить динамику экспрессии рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и зритропоэтина человека в молоке коров н свиноматок в течение лактации;

4. Выявить факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоко;

5. Провести анализ распространения ретровирусных векторов в других органах к тканях опытных животных.

1.3 .Научная новизна.

8 ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно была изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного кологшеста мулнрующето фактора к эритропеэтина человека, для осуществления локальной трансформации отдельных органов, в частности молочной железы коров и свиней. Была исследована динамика экспрессии рекомбинантного зритропоэтина и гранулоцитарного колон и естимулирующега фактора человека в молоке опытных живогных в течение лактации.

Выявлено влияние лактации, времени введения генных конструкций в молочную железу, возраста и вида животных на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко.

Проведен анализ интеграции генных конструкций в органах и тканях коров и свиней после введения ретровирусных векторов в молочную железу.

1.4. Практическая значимость работы.

- Показана возможность использования ретровирусных векторов для получения животных - продуцентов ре комбинантных белков.

Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко.

1.5. Основные положения, выносимые на 1ащиту:

- Возможность доставки генных конструкций эритропоотина и гранулоцитарного колонисстимулирующего фактора в секреторные клетки вымени на основе использования ретровирусных векторных систем, вводимых п молочную железу.

- Синтез рекомбинантного белка в молоко в течение лактации носит периодический характер.

- Распространение ретровирусных векторов наблюдается как в месте инъекции, так и в других органах и тканях.

1.6.Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «ДНК-тсхкологни в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, н.Дубровицы, 2001; конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п.Дубровнцы, 2001; международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, научных отчетах ВИЖа за 2000-2002.

1.7.11 убликацн я результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

1.8.Структура н объём работы.

Диссертация изложена на 100 страницах, содержит И таблиц, 17 рисунков, состоит из введения, обзора литераторы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 130 источников.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась в лаборатории молекулярной генетики и цитогенстики, ОПХ "Дубровнцы", ОПХ "Клёново-Чегодаево" Всероссийского научно-исследовательского института животноводства и агрофирме «Толмачево» Нижегородской области.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке L

В работе были использованы ре ком бин антные ретровирусные векторы pLNa и pLN-G-CSF (предоставлены х.б.н. Фоминым И.К., Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск), полученные па основе вируса лейкемии мышей Мол он и и помещенные в пакующую линию клеток А М-12. Рекомбинантный ретровируспый вектор pLNa содержал кДНК эритопоэтина человека, ретровирусиый вектор pLN-G-CSF — кДНК гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека под контролем промотора aSi-казеина крупного рогатого скота.

Клетки-упаковщицы и культур алы |ую жидкость, содержащие ретровирусный вектор, вводили в паренхиму маточной железы опытным животным: свиноматкам (8 голов), нетелям (11 голов) и коровам (2 головы).

ДНК выделяли посредством солевой экстракции [Miller S.A., 1988] и щелочного лизисного буфера [Зиновьева H.A. и др., 1998]. Концентрацию ДНК и степень ее очистки определяли по описанной методике H.A. Зиновьевой с соавторами [1998].

Полимеразную цепную реакцию проводили в объёме 20 мкл., применяя следующую инкубационную смесь: х10 буфер для ПЦР (166,7мМ (NH^jSO,,; 100мМ Трис-HCt, рН=8,3; 1,5мМ MgCl2; 0,1% Tween 20); 0,2мМ dNTP, 25 пкмол каждого из праймеров,1 ЕД Taq полимеразы. ДНК для анализа брали в объеме 1,0 мкл. ПЦР проводили на амнлификаторе Amply 4-L-50 /Шосот/. Реакции проводились в следующем температурпо-временком режиме: 95°С-5 мин, 1 цикл; 94°С-1 мин, 60°С-1 ми«, 72°С-1мин, 37 циклов. Для анализа продуктов реакции после амплификации ДНК 10 мкл смеси разделяли в 2% агарозшм геле при 120V в буфере ТАЕ с добавлением бромистого димвдия до конечной концентрации 30 нг/мл.

Определение концентрации эритропоэтина в молоке осуществляли методами твердофазного конкурентного иммуноферментпого анализа (ИФА) и Westem-biotting (Western Blotting Kit «Ашада», ICN), Уровень экспрессии гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) определяли иммуиоферментным анализом с помощью набора ProCon-G-CSF (ООО «Протеиновый контур») на фотометре «DYNATECH MR5000».

Образцы тканей молочной железы были зафиксированы в 10% формалине и залиты в парафин (Б.Ромейс, 1953), Гистологические срезы

Рис. 1 Общая схема исследования

готовили на санном микротоме. Окрашивали срезы гематоксилин-эозином. Микроскопию и микрофотографирование проводили под микроскопом «Микрофаг», объективы 6,5х и 20х.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.0 ненка клеток-упаковщиц на наличие рекомбинантной вставки.

Перед введением в молочную железу используемые линии клеток-упаковщиц были предварительно оценены на наличие рекомбинантной вставки. ПЦР-анализ показал наличие провирусной ДНК-формы в клетках и подтвердил наличие рекомбинантной ДНК во всех исследованных пассажах.

3.2. Введение ретро вирусных векторов в молочную железу сельскохозяйственных животных in vivo

3.2.1. Эффективность трансформации клеток молочной железы ретровирусньш вектором pLNa.

Оценку способности ретровирусного вектора pLNa переносить экзогенную ДНК в клетки молочной железы проводили на 9 нетелях, 1 корове и 7 свиноматках.

В эксперименте были использованы животные, находящиеся на разных стадиях беременности. Введение клеток-упаковщиц опытным животным осуществляли в паренхиму молочной железы в концентрации от 12 млн. до 140 млн. на животное. На протяжения лактации от указанных выше животных отбирали пробы молока с целью выявления посредством ПЦР-аиализа рекомбинантной ДНК и изучения с помощью методов ИФА н Westem-blottmg экспрессии рекомбинантного продукта.

3.2,1.1. Анализ интеграции генной конструкции pLNa.

ПЦР-анализ ДНК, выделенной из соматических клеток молока, выявил наличие рекомбинантной ДНК у опытных животных. Причем, положительные сигналы наблюдались также в пробах молока, взятых из долей вымени, инъекцию клеток-упаковщиц в которые не осуществляли. Так, у коровы №1328 (рис.2) кроме опытных долей вымени наличие I 2 3 4 5 6

Рис.2, ПЦР-анализ ДНК, выделенной из молока коровы №1328 на 72 день лактации.

дорожки 1,2*,3*,4* - лолн вымени (звездочкой помечены проинъециробанные лоли), 5 -отрицательный контроль (ДНК интзктноП коровы), б - положительный контроль {ДНК человека).

рскомб иная гной вставки было выявлено в передней правой доле (дорожка 1), введение ретровирусных векторов в которую не проводили. Распространение генной конструкции в соседнюю долю вымени, по-видимому, происходило через кровь.

Однако не во всех пробах молока, взятых от каждого животного на протяжении лактации, была выявлена рекомбннантная ДНК (табл. I и 2).

Таблица 1. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из соматических клеток молока коров, после введения в молочную железу ретровируеного вектора р!Л\1а.

№ живот кого Доля вымени Стадия введения (мес. стельности) Кол-во введен, клеток, млн. Исследо вано ироб молока Положительно по ПЦР

п %

2218 * 1,5 мес. 140 32 2 6

2326 * 2 мес. 140 32 1 3

2214 * 2 мес. 140 30 1 3

2241 * 3,5 мес. 140 31 2 5

3180 зп 4 мес. 30 40 28 70

зл 4,5 мес. 30 40 32 80

пл 5 мсс. 30 40 25 62

пп 6 мес. 25 40 34 85

2340 * 6,5 мсс. 140 42 27 65

3284 зп 6,5 мес. 30 38 30 79

зл 6,5 мес. 30 38 22 58

пл 6,5 мес. 30 38 28 73

пп 6,5 мсс. 30 38 26 68

2227 * 7 мес. 140 42 29 69

2376 * 8 мсс. 140 40 30 76

1328 зп 8 мес. 30 35 23 66

ЗЛ 8,5 мсс. 30 35 22 63

пл 9 мес. 25 35 26 74

пп • - 35 19 54

Примечание: зп-задняя правая доля вымени, зл- задняя левая доля вымени, пп - передняя правая доля вымени, пл — передняя левая доля вымени, * — все доли вымени.

Таблица 2. Результаты ПЦР-анализа молока свиноматок

№ Доля Стадия Кол-во Исследо 1 [оложительно

живот йоге вымени введения (мес.супо-ростности) ввел, клеток млн. вано проб поПЦР

п %

5163 1-я правая 1 мес 6 7 2 29

2-я правая 1 мес. 6 7 3 43

3-я правая - - 7 2 29

5197 1-я правая I мес. 6 7 3 43

2-я правая 1 мес. 6 7 3 43

3-я правая - - 7 2 29

1293 1-я правая 2 мес. 10 7 3 43

2-я правая 2 мес. 10 7 1 14

3-я правая 2 мес. 10 7 2 29

4-я правая 2 мес. 10 7 2 29

5-я правая 2 мес. 10 7 1 14

6-я правая 2 мес. 10 7 1 14

1-я левая - - 7 1 14

2-я левая - - 7 1 14

5185 1-я правая 2 мес. 6 7 3 43

2-я правая 2 мес. 6 7 2 29

3-я правая - - 7 1 14

5175 1-я правая 3 мес. 6 7 5 71

2-я правая 3 мес. 6 7 4 57

3-я правая - - 7 5 71

5183 1-я правая 3 мес. 6 7 4. 57

2-я правая 3 мес. 6 7 б 85

3-я правая - - 7 4 57

3973 1-я правая 3 мес. 10 7 4 57

2-я правая 3 мес. 10 7 5 71

3-я правая 3 мес. 10 7 5 71

4-я правая 3 мес. 10 7 3 43

5-я правая 3 мес. 10 7 3 43

б-я правая 3 мес. 10 7 4 57

1-Я левая - - 7 2 29

2-я левая - - 7 3 43

У животных, введение клеток-упаковщиц которым осуществлялось во второй половине беременности, положительные сигналы наблюдались в 6485% случаев. При введении ретровнрусных векторов на ранних стадиях беременности процент интеграции генных конструкций в секреторные

клетки вымени был ниже и составил у крупного рогатого скота 3-6%, у свиней —14-43%.

Между ПЦР и ИФА не было выявлено прямой зависимости. В пробах молока, положительных по ИФА, ПЦР не всегда показывал наличие рекомбинантной вставки. Кроме того, интенсивность сигнала в ряде случаев не соответствовала выявленному уровню экспрессии. Но зная, что на долю эпителиальных клеток вымени приходится незначительный процент от общего числа соматических клеток, присутствующих в молоке, отсутствие сигналов можно объяснить недостаточной чувствительностью метода, когда процент трансформированных клеток в молоке достаточно мал.

3.2.1.2. Исследование экспрессиирекомбинантного эритропоэтина в

молоке крупного рогатого скота и свиней.

Экспрессия в молочной железе рекомбинантного эритропоэтина наблюдалась у всех опытных животных. В молоке крупного рогатого скота данный белок бьш выявлен в количестве до 400 нг/мл, свиней - 600 нг/мл.

Данные об уровне экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке опытных животных представлены в таблице 3.

Результаты, полученные методом ИФА, были подтверждены методом Western- blotting (рис. 3). Имеющиеся различия были незначительны.

12345678 9 10

Рис.3. Westem-blotting сыворотки молока опытных коров дорожки 1 - корова №J32S <101 день лактации), 2 - первотелка №3180 (46 день лактацинХ 3- первотелка №3180 (91 день лактации), 4 - первотелка №2376 (90 день лактации), 5 - первотелка №3284 (76 день лактации), 6 - первотелка №3284 (120 лень лактацкн), 7 ~ первотелка №2227 (IOS день лактацнк), 8, 9 - отрицательный контроль (молоко интактной коровы), 10 - эритропоэтнн человека (стандарт- 200 нг/мл).

Таблица 3. Уровень экспрессии рекомбинантиого эритропоотина в молоке крупного рогатого скота и свиней

№ животного Стадия введения (месяц беременности) Кол-во введенных клеток, млн. Уровень экспрессии, нг/мл

ИФА Westeгn-Ыotting

макс. М±т макс.

Крупный рогатый скот

1328 8-9 85 78±15,46 300 17,04 300

2376 8 140 12Ш6Д) 400 130± 15,23 480

2227 7 140 65±8,65 200 60±б,94 180

3284 6,5 120 И8±15,31 350 110±16,31 350

2340 6,5 140 84± 15,02 400 90± 12,36 320

3180 4-6 115 138± 17,92 400 147*15,96 400

2241 3,5 140 2±1,27 40 <50 <50

2326 2 140 1±0,6 25 <50 <50

2214 2 140 1±0,9 30 <50 <50

2218 1,5 140 1±0,73 25 <50 <50

Свиноматки

5183 3 12 185±34,81 400 - -

5175 3 12 177±39,16 400 - -

3973 3 60 153±51,54 600 - -

5185 2 12 116±44,П 330 - -

1293 2 60 65±9,94 200 - -

5197 1 12 140±48,61 600 120*39,12 570

5163 1 12 8 7± 19,33 185 90*24,56 170

3,2,2, Эффективность трансформации клеток молочной железы ретроенрусным вектором, содержащим генную конструкцию рЬК-С-СХР Трансфецирующую способность ретровирусного вектора, содержащего генную конструкцию рЬМ-ОСБР, изучали на крупном рогатом скоте и свиньях (1 корове, 2 негелях и I свиноматке), в молочную железу которых на разных сроках беременности была введена суспензия клеток-упаковщиц, содержащих данную конструкцию, в количестве от 100 до 120 млн. клеток.

3.2.2.1. Анализ интеграции генной конструкции рЬН-С-СЯР ПЦР показал наличие рекомбинантной ДНК у всех исследованных животных. На рисунке 4 представлен ПЦР-анализ ДНК, выделенной из молока свиноматки №1397 на 7 и 14 дни лактации.

12 5 4 5 6 7 К 9 10 И 12 13 14

Рис.4, ПЦР-анализ ДНК, выделенной из молока свиноматки №1397 на 7 и 14 дни лактации.

дорожки I*, 2*, 3*, 4*, 5*. 6,7*, 8*, 9*, 10*, 11*. 12-доли вымени (звездочкой помечены доли проинъешро ванные), 13 - отрицательный контроль (ДНК ннтактной свиньи), 14 -положительный контроль (ДНК человека).

Результаты ПЦР представлены в таблице 4.

Таблица 4. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из соматических клеток молока опытных животных после введения в молочную железу генной конструкции рЬЫ-О-СКР

№ Доли вымени Стадия Кол-во Взято Положительно по

живот введения введен. проб ПЦР

ного (мес. бере- клеток моло п %

менности) млн. ка

Крупный рогатый скот

3204 задняя правая 5 мес. 30 38 17 45

задняя левая 5,5 мес. 30 38 22 58

передняя левая 6 мес. 25 38 18 47

переднях правая 6,5 мес. 30 38 15 39

3340 задняя правая 7 мес. 30 34 14 41

зааняя левая 7 мес. 30 34 13 38

передняя левая 7 мес. 30 34 12 35

передняя правая 7 мес. 30 34 16 47

802 задняя правая 8 мес. 30 35 16 44

задняя левая 8,5 мес. 30 35 15 43

передняя левая 9 мес. 25 35 17 49

передняя правая - - 35 12 34

Свиноматки

1397 правые доли 3 мес. 50 35 20 57

левые доли 3 мес. 50 35 18 51

По данным таблицы 4, рекомбинантная ДНК была выявлена не во всех пробах молока, взятых от каждого животного на протяжении лактации. Интеграция генной конструкция в клетки молочной железы у крупного рогатого скота отмечалась в 34-58% случаев, у свиней -в 51-57%.

3.2.2.2. Экспрессия рекомбинантного Г-КСФ в молоко крупного рогатого скота и свиней _

Динамику экспрессии рекомбинантного Г-КСФ в молоке коров и свиноматок изучали в течение всей лактации методом ИФА.

Данные об уровне экспрессии рекомбинантного Г-КСФ в молоке опытных животных представлены в таблице 5.

Таблица 5. Уровень экспрессии рекомбинантного Г-КСФ в молоке опытных животных

Показатели № животного

3204 3340 802 1397

Вид животного КРС КРС КРС Свиноматка

Стадия введения ретро-вирусных векторов в молочную железу 4-6 мес. стельности 7 мес. стельности 8-9 мес. стельности 3 мес. сулорост-ности

Кол-во введенных клеток, млн 115 120 85 60

Уровень экспрессии, нг/мл: а) М±ш; б) максимальный. 34±9,79 200 20±3,12 60 24±6,04 100 25±4,05 60

В молоке опытных животных среднее содержание Г-КСФ в течение лактации составило от ■ 20±3,12 до 34±9,79 иг/мл. Максимальная концентрация данного белка наблюдалась у первотелки №3204 - 200 нг/мл.

Влияние различных факторов на эффективность трансформации клеток молочной железы m vivo

Проведенные нами исследования показали, что экспрессия рекомбинантного белка в молоке коров и свиней обуславливалась рядом факторов. Была выявлена зависимость уровня экспрессии рекомбинантного продукта от дня лактации, физиологического состояния, возраста и вида животного.

3.3.1. Экспрессия рекомбинантного белка на протяжении лактации,

В ходе лактации уровень экспрессии рекомб и н антных белков был различен. Экспрессия экзогенов в молочной железе крупного рогатого скота и свиней носила периодический характер: периоды усиления секреции ре комби нантного продукта в молоко чередовались с периодами ее спада. Период активного синтеза рекомбинантного белка продолжался 12-30 дней, после чего наблюдалось снижение его экспрессии.

Максимальная концентрация рекомбинантного эритропоэтина в молоке наблюдалась в основном на 85-108, 120-130, 150-160 и 196-210 дни лактации. Содержание рекомбинантного белка в эти дни достигало 400 нг/мл у крупного рогатого скота и 400-600 нг/мл у свиней. Высокий уровень рекомбинантного Г-КСФ наблюдался в первую неделю лактации (до 100 нг/мл) и на 104-112 (100 нг/мл), 127(200 нг/мл) дни лактации.

Необходимо отметить, что наибольшее число пиков активного синтеза белка наблюдалось в первые 100 дней лактации. В последующие 100 дней частота периодов синтеза рекомбинантного продукта в молоко падала. К концу лактации (200-300 дни) у некоторых животных отмечалось незначительное усиление экспрессии экзогенов в молочной железе.

Среднее содержание рекомбинантного эритропоэтина в первые 100 дней лактации составило 134±8,6 нг/мл (табл. 6). Со 101 дня отмечался спад секреции рекомбинантного белка в молоко. Концентрация в молоке данного белка снизилась в среднем на 46% и составила 72±13,4 нг/мл. На 201-300 дни наблюдалось незначительное увеличение средней концентрации рекомбинантного эритропоэтина в молоке до 77±2б,3 нг/мл.

Экспрессия рекомбинантного Г-КСФ в первые 100 дней лактации составила в среднем 34±5,2 нг/мл. В последующие дни ре комби нантный Г-КСФ был выявлен в меньшем количестве. Среднее его содержание в молоке на 101-200 дни лактации составило 30±6,5 нг/мл (89% от уровня экспрессии рекомбинантного белка в первые 100 дней лактации), на 201-300 дни —11±0,6 нг/мл (47%).

Таким образом, высокая экспрессия рекомбинантного белка в молоке крупного рогатого скота наблюдалась в первые 100 дней лактации. В последующие дни отмечалось снижение содержания белка в молоке.

У свиноматок экспрессия рекомбинантного эритропоэтина также была непостоянна, В ходе лактации содержание чужеродного белка в молоке свиноматок варьировало. Как и у крупного рогатого скота, отмечались периоды усиления и снижения экспрессии рекомбинантного белка в молоко. Максимальная экспрессия наблюдалась на 21 и 35 дни лактации. Содержание эритропоэтина в молоке в эти дни достигало 600 нг/мл.

Таблица 6. Экспрессия рскомбинаптных белков в молоке крупного рогатого скота в течение лактации, нг/мл (Mim)

№ животного Стадия введения Дни лактации

1-100 101-200 201-300

Эрнтропоэтин

1328 8-9 мсс. 96±25,8 65±21,9 57±20,6

2376 8 мес. 140±18,0 100±31,2 116±40,1

2227 7мес. 97±12,4 44±10,3 66±20,1

3284 6,5 мес. 181±19,7 57±12,4 86±33,1

2340 6,5 мес. 118±25,3 90±21,3 67±19,8

3180 4-6 мес. 169±20,8 113 ±30,2 112±43,7

В среднем 134±8.б 72±13,4 77±26,3

2241 3,5 мсс. 9±4,3 0 0

2214 1,5 мсс. 3±2,7 0 0

2218 1 мсс. 4±3.6 0 0

2326 1 мес. 2,5±2,2 0 0

Г-КСФ

3204 4-6 мес. 44±19,6 42±20 13±2,98

3340 7 мсс. 27±б,9 20±4,9 12±1,92

802 8-9 мсс. 32±11,4 28±12.8 10±3,30

В среднем 34±5,2 30±б,5 11±0,б

Средние показатели уровня экспрессии рекомбимантного эритропоэтнна в молоке свиноматок были несколько выше по сравнению с аналогичными показателями у крупного рогатого скота (табл.7).

В первые 15 дней лактации среднее содержание ре комби на нтн ого белка в молоке свиней составило 160± 15,24 нг/мл. В последующие дни, как и у коров, отмечался спад секреции рекомбинантного продукта. На 16-30 дни среднее содержание рекомбинантного эритропоэтнна в молоке снизилось до 141±5,5 нг/мл, на 31-45 дни-до 121±46 нг/мл, что меньше по сравнению со средним уровнем экспрессии белка в первые 2 недели лактации на 12% и 24% соответственно.

Периодичность синтеза рекомбинантного белка в молоко мы связываем с тем, что не все клетки вымени несут конструкцию с чужеродным геном. При введении ретровирусных векторов в маточную железу трансформированной оказывается только часть секреторных клеток.

Таблица 7. Динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке свиноматок в течение лактации, нг/мл (М±т)

Лз животного Дни лактации

1-15 16-30 31-45

5183 185±7,64 200*7,5 313±37,5

5175 133±8,33 183±42,5 363±!2,5

3973 183 ±46,40 350*137 45±13,5

5185 285±45,52 25±0 37,5*12,5

5197 122±23,51 122±51,5 263*237,5

5163 )52± 13,64 25±0 38±12,5

1293 61±31,93 82±7 61*2,5

В среднем 160± 15,24 141±5,5 121±46

Возможной причиной варьирования содержания рекомбинантного белка в молоке является неравномерность созревания и накопления секрета в различных альвеолах вымени. На полученных нами гистологических препаратах молочной железы коровы видны растянутые альвеолы, окружающие со всех сторон островок активной секреторной ткани, альвеолы которой не наполнены молоком.

3.3.2. Физиологическое состояние животных.

Введение генных конструкций в молочную железу коров и свиноматок на разных сроках беременности обуславливало определенный уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко. Проведенные исследования показали, что наиболее высокая экспрессия рекомбинантного продукта наблюдалась у опытных животных, введение клеток-упаковщиц которым осуществляли во второй половине беременности.

У крупного рогатого скота наиболее высокая концентрация рекомбинантного белка в молоке наблюдалась при введении генных конструкций в молочную железу на 4-6 месяцах стельности (таблица 8). Среднее содержание рекомбинантного эритропоотина в молоке данных животных в течение лактациисоставило 118*11,7 нг/мл.

У животных, инъекцию ретровирусных векторов которым осуществляли на 7-9 месяцах стельности, данный показатель был ниже на 24% и составил в среднем 90±9,91 нг/мл.

Таблица S. Уровень экспрессии рекомбинаитного эрн троп сатина в молоке опытных животных в зависимости от времени введения генных конструкций в молочную железу, нг/мл (М±т)

Дни лактации Стадия введения (месяц беременности)

Крупный рогатый скот

1-3 мес. 4-6 мес. 7-9 мес.

1-100 4,6±1,2 156±12, 4 111±12,3

■ 101-200 0 87±15,б 7fttl6,8

201-300 0 88±31,2 79±58,Э

В среднем 1,1 ±0.4 118±11,7 90±9,91

Свиноматки

1 мес. 2 мес. 3 мес.

М5 137±18,3 173±31,25 167±13.27

16-30 73±25,75 54±3,5 244±6,67

31-45 150*112,5 49±7,5 240±21,17

В среднем П3±23,42 90±22,67 172±28,29

При введении генных конструкций на ранних сроках стельности (1,53,5 месяцев) в дальнейшем отмечался низкий уровень экспрессии рекомбинаитного продукта в молоко. Экспрессия рекомбинаитного белка наблюдалась только первые два месяца лактации. Среднее содержание рекомбинаитного эритропаэтииа в молоке в первые 100 дней лактации составило 4,6± 1,2 нг/мл, в течение всей лактации - 1,1±0,4 иг/мл.

У свиноматок максимальный уровень экспрессии рекомбинаитного белка наблюдался при введении клеток-упаковщиц в молочную железу на 3 месяце суноросности. Среднее содержание рекомбинаитного эритропоэтина в молоке данных животных достигало 172±28,29 нг/мл.

У животных, трансфецироваиных ретровирусными векторами на 1 и 2 месяцах суноросности, средний уровень экспрессии рекомбинаитного продукта был ниже и составил 113±23,42 нг/мл и 90±22,67 нг/мл соответственно.

Таким образом, приведенные данные позволяют считать наиболее эффективным введение экзогенной ДНК в середине стельности у крупного рогатого скота и ближе к концу супоростности у свиней.

3.3.3. Возраст животного.

Введение генных конструкций в молочную железу нетелей оказалось более эффективным. В последующем у них наблюдался более высокий

уровень экспрессии рекомбинантного продукта, чем у коров. Максимальное содержание рекомбинантного эритропоэтина в молоке у первотелок достигало 350-400 нг/мл, Г-КСФ - 200 иг/мл. У коров данный показатель был ниже и составил 300 нг/мл и 100 нг/мл соответственно. Кроме того, у первотелок рекомбинантный белок экспрессировался в течение всей лактации, в то время как у коров его экспрессия наблюдалась не во все дни лактации.

Более высокий уровень экспрессии рекомбинантного продукта в молоке первотелок можно объяснить тем, что у нетелей в период стельности пролиферация клеток молочной железы идет более интенсивно, чем у коров, процесс протекает с «чистого листа», впервые формируется древо молочпо-железистой ткани. В связи с чем и число секреторных клеток, секретирующих рекомбинантный белок после введения ретровирусных векторов в молочную железу, у нетелей оказывается больше.

3.3.4. Вид животного.

Уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоке крупного рогатого скота и свиней был различен. Средняя концентрация рекомбинантного эритропоэтина в молоке свиноматок составила 141±17,1 нг/мл, крупного рогатого скота - 101±9,0 нг/мл. Максимальная концентрация рекомбинантного эритропоэтина наблюдалась у свиноматок - 600 нг/мл, В молоке крупного рогатого скота концентрация .эритропоэтина в период пиков активности синтеза белка достигала 400 нг/мл.

Необходимо отметить, что по сравнению с крупным рогатым скотом экспрессия экзогенной ДНК. в молочной железе свиноматок характеризовалась меньшей изменчивостью, что возможно связано с непродолжительностью их лактации, а также с особенностями строения молочной железы. На полученных нами гистопрепаратах молочной железы свиньи видно, что в альвеолах вымени секрет не накапливается в той мере как у коров, и выводится в выводные протоки. У крупного рогатого скота альвеолы имеют свойство накапливать секрет, стенка альвеолы при этом растягивается, эаителий уплощается, что у свиней по нашим наблюдениям не выражено. Этим же можно объяснить и более высокие средние показатели уровня экспрессии рекомбинантного белка в молочной железе свиней по сравнению с аналогичными показателями у коров.

Экспрессия рекомбинантного Г-КСФ в молоке коров и свиноматок была ниже. Максимальное содержание рекомбинантного белка было выявлено в молоке первотелок и составило 200 нг/мл. У свиноматки рекомбинантный Г-КСФ синтезировался в молоко в количестве до 60 нг/мл.

Средняя концентрация рекомбинантного продукта в молоке крупного рогатою скота составила 26±5,14 нг/мл, свиноматки - 25±4,05 нг/мл.

3.4. Исследование интеграции генной конструкции в клетки других органов и тканей

Исследование интеграции генной конструкции эритропоэтина в клетки других органов и тканей после введения ретровирусных векторов в молочную железу проводили иа 2 опытных животных. После забоя от данных животных были взяты Пробы органов и тканей, выделенная ДНК из которых была подвегнута ПЦР-анализу иа наличие ре комби нанпгой вставки. Были проведены следующие опыты.

Опыт №1. На шестой месяц после отела первотелку №3006 забили и взяли пробы внутренних органов для исследования на наличие ДНК провируса. Рекомбинантная ДНК была выявлена в слюнной железе, надпочечниках и молочной железе (табл. 9).

Опыт №2. Свиноматка № 1374 была забита на второй месяц после опороса. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из различных органов и тканей, показал наличие провируса в молочной железе, надпочечниках, поджелудочной и слюнной железах (табл. 9).

Таблица 9. Результат 1ЩР-анализа ДНК, выделенной нз различных органов и тканей опытных животных_

Исследуемый орган Исследовано проб № животного

3006 1374

ПЦР «+» % ПЦР «+» %

Слюнная железа 10 2 20 2 20

Надпочечники 10 1 10 1 10

Поджелудочная железа 10 0 0 1 10

■ Спинной мозг 10 0 0 0 0

Печень 10 0 0 0 0

Селезенка 10 0 0 0 0

Молочная железа 40 5 12 8 20

Таким образом, у опытных животных сигналы были выявлены в слюнной железе (20%), надпочечниках (10%), поджелудочной железе (10%) и молочной железе (20%), что согласуется с проведенными ранее исследованиями (Титова В.А., 2001).

4.ВЫВ0ДЫ

К Показана эффективность использования ретровирусных векторов для осуществления локального трансгекеза отдельных органов сельскохозяйственных животных, в частности молочной железы коров и свиней. Наличие генных конструкций эритропоэтнна и Г-КСФ после введения ретровирусных векторов и молочную железу выявлено у всех исследованных животных,

2. Установлена экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе опытных животных. Содержание эрктрогтоэтина человека в молоке крупного рогатого скота достигало 400 нг/мя, свиней - 600 иг/мл. РекомбннантныЙ Г-КСФ экспрессировался у крупного рогатого скота в количестве до 200 нг/мл, у свиней - до 60 нг/мл.

3. Изучение динамики экспрессии рекомбинантных белков в течение лактации показало, что синтез рекомбинантного продукта в молоко носил периодический характер: периоды увеличения концентрации рекомбинантного белка смеялись периодами се слада. Период активного синтеза белка продолжался 12-30 дней, после чего экспрессия чужеродного белка в молочной железе опытных животных падала. Максимальная концентрация эритрояоэтина в молоке коров наблюдалась на 85-108, 120130, 150-160 и 196-210 дни лактации и составила 400 нг/мл. Максимальный уровень рекомбинантного Г-КСФ отмечался в первую наделю и на 104-П2, 127 дни лактации - 100-200 иг/мл.

У свиноматок содержание рекомбинантного эритропоэтнна в молоке достигало максимального значения на 21 и 35 дни лактации - 500-600 нг/мя,

4. Установлено влияние дня лактации, времени введения ретровирусных векторов в молочную железу, возраста в вила животных на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко. Максимальное число пиков активного синтеза белка наблюдалось в первые 100 дней лактации. В последующие дни частота данных периодов снижалась.

Более высокий уровень экспрессии рекомбинантного продукта & молоко отмечался при введении ретровирусных векторов в молочную железу опытных животных во второй половине беременности: у крупного рогатого скота - па 4-6 месяцах стельности, у свиней - иа 3 месяце супоростности. При этом введение ретровирусных векторов в молочную железу нетелей оказалось более эффективным, чем у коров.

5. Исследование внутренних органов животных выявило, что распространение генных конструкций не носит локального характера. Так, после введения ретровирусных векторов в молочную железу коров и свиней

ПЦР показал наличие рекомбинантпой ДНК в слюнных железах, надпочечниках и поджелудочной железе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для получения соматических трансгенных животных рекомендуем использовать векторные конструкции на основе ретровирусов, оптимальным сроком введения которых в паренхиму молочной железы, являются 4-6 месяца стельности для крупного рогатого скота и в последняя треть супоростности для свиней.

2. Использовать в качестве биопродуцентов первотелок и свинок первого опороса как наиболее эффективных соматических трансгенов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

]. Волкова H.A., Иолчиев Б.С.,Титова В.А., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. Динамика экспрессии рекомби нантного эритропоэтина в молоке соматических трансгснных животных// Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных»-ВИЖ.-2001.-С. 58-61.

2. Титова В.А., Зиновьева H.A., Волкова H.A., Савченкова И.П., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К. Использование рехровирусных векторов для переноса генов в органы-мишени сельскохозяйственных животных// Материалы международной конференции «ДНК-технологаи в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных» - ВИЖ.-200К- С. 90-93.

3. Титова В.А., Волкова H.A., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. Влияние различных факторов на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко соматических трансгенных животных // Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства я задачи кадрового обеспечения» - Быково. - 2002. - С. 5960.

4. Волкова НА., Титова В.А., Зиновьева Н.А„ Чабан И.М., Костерена Н.В., Эрнст Л.К. Ретровирусные векторные системы для получения животных - продуцентов рекомби наитных белков // Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» -Быково.-2002.- С. 61-62.

Издательство Р УЦ ЭВТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-и, п. Дубротицы Тел. (&-27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14/17

Лицензия ЛР К» 021248 от 21,12,97

Сдано а набор 17,08.2002. Подписано в печать 17.08.2002 Заказ № 19 . Печ. л. 1,0, Тираж 83 экз._

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волкова, Наталья Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы получения трансгенных животных

1.1.1. Микроинъекция

1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки

1.1.3. Ретровирусные векторы

1.1.4. Аденовирусные векторы

1.1.5. Аденоассоциированные векторы

1.1.6. Липосомы

1.1.7. Спермии

1.2. Ретровирусы как векторы для переноса экзогенных генов

1.1.1. Молекулярно-генетическая организация ретровирусов

1.1.2. Конструирование ретровирусных векторов

1.1.3. Основные этапы переноса чужеродных генов с помощью ретровирусных векторов

1.1.4. Использование ретровирусных векторов для направленного переноса генов

1.3. Использование молочной железы животных для синтеза рекомбинантных белков

1.3.1. Получение белков фармакологического назначения

1.3.2. Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных

1.4. Эритропоэтин: биология, функции, методы получения

1.5. Биология, функции, получение и применение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интеграция и экспрессия экзогенов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов"

Актуальность темы.

Одним из направлений в биотехнологии, интенсивно развивающихся в последнее годы, является создание трансгенных животных - продуцентов рекомбинантных белков фармакологического назначения. Учитывая сложность получения лекарственных препаратов белков из органов и биологических жидкостей человека ввиду их низкой концентрации, а также ограниченного объема сырья и возможности переноса опасных инфекций, производство рекомбинантных белков с помощью трансгенных животных имеет в настоящее время огромный коммерческий интерес. При этом наиболее интересным представляется получение биологически активных протеинов с молоком сельскохозяйственных животных. Экспрессия чужеродных белков в молочной железе трансгенных животных может достигать 1 г/л. Причем, выделение данных белков из молока становится возможным уже при их концентрации от25нг/мл (121,47,129,119,49).

Однако, стоимость производства трансгенных животных на сегодняшний день остается высокой. Кроме того, экспрессируемые уровни трансгена у крупных животных не всегда коррелируют с теми, которые были получены у лабораторных животных (123). Отрицательным моментом также является и то, что у крупных животных только 1% эмбрионов, микроинъецированных экзогенной ДНК, развивается в трансгенное животное, причем около 40% из них не экспрессируют трансген (125,69).

В рамках данной проблемы актуальным является разработка методов получения трансгенных животных, характеризующихся высокой эффективностью трансгенеза и низкими материальными затратами. Как перспективный в данном отношении метод рассматривают использование ретровирусных векторов. По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток.

На этом основано использование ретровирусных векторов для получения соматических трансгенных животных, т.е. животных с трансформацией отдельных органов (3). Введение экзогенных генов в органы взрослых животных позволяет значительно сократить сроки с момента введения генных конструкций до получения первых данных об уровне экспрессии чужеродных белков, что особенно важно для животных, характеризующихся большим генерационным интервалом (крупный рогатый скот, козы, свиньи). В связи с этим интересным представляется проведение экспериментов по переносу экзогенной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных с целью получения продуцентов рекомбинантных белков.

Цель и задачи исследования.

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение интеграции и экспрессии экгогеной ДНК в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить используемые линии клеток-упаковщиц на наличие рекомбинантной вставки методом ПЦР;

2. Оценить эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и эритропоэтина человека, для осуществления переноса экзогенной ДНК в секреторные клетки вымени после введения клеток-упаковщиц в молочную железу крупного рогатого скота и свиней;

3. Изучить динамику экспрессии рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и эритропоэтина человека в молоке коров и свиноматок в течение лактации;

4. Выявить факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоко;

5. Провести анализ распространения ретровирусных векторов в других органах и тканях опытных животных.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно была изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и эритропоэтина человека, для осуществления локальной трансформации отдельных органов, в частности молочной железы коров и свиней. Была исследована динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в молоке опытных животных в течение лактации.

Выявлено влияние лактации, времени введения генных конструкций в молочную железу, возраста и вида животных на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко.

Практическая значимость работы.

- Показана возможность использования ретровирусных векторов для получения животных - продуцентов рекомбинантных белков.

- Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Возможность доставки генных конструкций эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в секреторные клетки вымени на основе использования ретровирусных векторных систем, вводимых в молочную железу.

- Синтез рекомбинантного белка в молоко в течение лактации носит периодический характер. 8

- Распространение ретровирусных векторов наблюдается как в месте инъекции, так и в других органах и тканях.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п.Дубровицы, 2001; конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п.Дубровицы, 2001; международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, научных отчетах ВИЖа за 2000-2002.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 11 таблиц, 17 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 130 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Волкова, Наталья Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Показана эффективность использования ретровирусных векторов для осуществления локального трансгенеза отдельных органов сельскохозяйственных животных, в частности молочной железы коров и свиней. Наличие генных конструкций эритропоэтина и Г-КСФ после введения ретровирусных векторов в молочную железу выявлено у всех исследованных животных.

2. Установлена экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе опытных животных. Содержание эритропоэтина человека в молоке крупного рогатого скота достигало 400 нг/мл, свиней - 600 нг/мл. Рекомбинантный Г-КСФ экспрессировался у крупного рогатого скота в количестве до 200 нг/мл, у свиней - до 60 нг/мл.

3. Изучение динамики экспрессии рекомбинантных белков в течение лактации показало, что синтез рекомбинантного продукта в молоко носил периодический характер: периоды увеличения концентрации рекомбинантного белка сменялись периодами ее спада. Период активного синтеза белка продолжался 12-30 дней, после чего экспрессия чужеродного белка в молочной железе опытных животных падала. Максимальная концентрация эритропоэтина в молоке коров наблюдалась на 85-108, 120130, 150-160 и 196-210 дни лактации и составила 400 нг/мл. Максимальный уровень рекомбинантного Г-КСФ отмечался в первую неделю и на 104-112,127 дни лактации - 100-200 нг/мл.

У свиноматок содержание рекомбинантного эритропоэтина в молоке достигало максимального значения на 21 и 35 дни лактации - 500-600 нг/мл.

4. Установлено влияние дня лактации, времени введения ретровирусных векторов в молочную железу, возраста и вида животных на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко. Максимальное число пиков

87 активного синтеза белка наблюдалось в первые 100 дней лактации. В последующие дни частота данных периодов снижалась. Более высокий уровень экспрессии рекомбинантного продукта в молоко отмечался при введении ретровирусных векторов в молочную железу опытных животных во второй половине беременности: у крупного рогатого скота - на 4-6 месяцах стельности, у свиней - на 3 месяце супоростности. При этом введение ретровирусных векторов в молочную железу нетелей оказалось более эффективным, чем у коров.

5. Исследование внутренних органов животных выявило, что распространение генных конструкций не носит локального характера. Так, после введения ретровирусных векторов в молочную железу коров и свиней ПЦР показал наличие рекомбинантной ДНК в слюнных железах, надпочечниках и поджелудочной железе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Наталья Александровна, Дубровицы, Московской обл.

1. Атабеков И.Г. Реализация генетической информации. М.: Наука, 1972.

2. Богдатенко Е.В., Свиридов Ю.В., Московцев A.A. и др. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии //Вопросы медицинской химии. -2000. -№3.

3. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст JI.K. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными //Сельскохозяйственная биология.- 1993.- № 6.- С. 3-27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. М.: РАСХН, 1995. - 326 с.

5. Генная терапия//Еженедельник Аптека. №6(227).

6. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Агромромиздат, 1990. - 511с.

7. Гинтер Е.К. Генотерапия наследственных болезней //Вопросы медицинской химии.- 2000. №3.

8. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997. - 287 с.

9. Грачев И.И., Попов С.М., Скопичев В.Г. Цитофизиология секреции молока. JL: Наука, 1976. - 242 с.

10. Жданов Р.И., Семенова Р.И., Арчаков А.И. Реальность и надежды генной терапии //Вопросы медицинской химии 2000. - №3.

11. Зиновьева Н. А., Попов А. Н., Эрнст JI. К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы,1998.- 47 с.

12. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве. ВИЖ, 2001.-128 с.

13. Иванова Л.Б. Создание векторов для тканеспецифической экспрессии генов эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе животных //Автореф. дисс.канд. биол. наук. Боровск, 2002. - 23 с.

14. На старт выходят генные инженеры // Наука и жизнь. №8. - 2000. -с.71-72.

15. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д.Гловера. М.: Мир, 1989.-368 с.

16. Прасолов В.С. Ретровирусные векторы в генной терапии./УВопросы медицинской химии. 2000. - №3

17. Прасолов В.С. Ретровирусные векторы—эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих // Молокулярная биология. 1989. - Т.23. - Вып.2. - С.8-12.

18. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир, 1998. - Т.2.- 362 с.

19. Спиер Р.Е., Адаме Г.Д., Дж.Б.Гриффитс и др. Биотехнология клеток животных. М.: Агромпромиздат, 1989. - 520 с.

20. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. ВНИТИБП. М., 1998.-С.363-460.

21. Титова В. А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трасгенеза в животноводстве // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Дубровицы. - 2001 - 22 с.

22. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1997. - 4.2. - 400с.

23. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1995. - 192 с.

24. Abad J.L. et al. Single-step, multiple retroviral transduction of human T cells 11 J: Gene Med. V.4(l). - 2002. - P.27-37.

25. Anderson W. Human gene therapy: Scientific and ethical consideration // Recombinant DNA Tech. Bull. -V.8. 1985.-P.55-63.

26. Anderson W.F. Human gene therapy //Nature. 1998. - V.8. - P.25-30.

27. Archibald A.L. Molekular Biological Approaches and their Possible Aplications, in J.W. Owen and R.F.E. Axford (eds), Breeding for Disease Resistance in Farm Animals, C.A.B. International, UK. -1991. P.100-122.

28. Ayuk F.A., Zander A.R., Fehse B. T lymphocytes as targets of gene transfer with Moloney-type retroviral vectors //Curr Gene Ther. V.l(4). - 2001. -P.325-337.

29. Bachiller D. et al. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells.// Mol. Reprod. and Dev. -N30. 1991. - P. 194-200.

30. Bayna E.M., Rosen J.M. Tissue-specific high level expression of the rat whey acidic protein gene in transgenic mice //Nucleis Acids Res. N 18. - 1990. -P.2977-2985.

31. Bern N., Smith D., Goldwasser E. Evidance suggesting negative regulation of the erythropoietin gene by robonucleoprotein // J.Biol.Chem. 1990. - V.265. -P.14100-14104.

32. Blake J., Salinas P.S., Hughes S.M. Beta geo, a combined selection and reporter gene for retroviral and transgenic studies //Biotechnigues. V.23(4). -1997. -P.690-695.

33. Brem G. Transgenic animals In Biotechnology // N.-Y.:VCH Press.-1993.-P.745- 832.

34. Brinster R.L. et al. No simple solution for making transgenic mice //Cell. -Y.59. 1989. -P.239-241.

35. Brinster R.L., Avarbock M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation // Proc. Natl. Acad. Sei., USA. -V.91.-1994.-P.l 1303-11307.

36. Brinster R.L., Zimmerman J.W. Spermatogenesis followin male gern- cell transplantation //Proc. Natl. Acad. Sei., USA. V.91. - 1994. - P.l 129811302.

37. Carver A.S. etal. Transgenic liverstock as bioreactors: stable expression of human alfa-l-antitripsin by a flock of sheep //Biotechnology. V.l 1. - 1993. — P.1263-1270.

38. Castro F.O. et al. Introduction of foreign DNA into the spermatozoa of farm animals //Theriogenology. -N 34. 1990. - P. 1099-1110.

39. Castro F.O. et al. Secretion of human erythropoetin by mammory gland expiants from lactating transgenic rabbit //Theriogenology. V.34. - 1999.

40. Chang L.G., Gay E.E. The molekular genetics of lentiviral vectors-current and future perspectives // Curr Gene Ther. V. 1(3). - 2001. - P.237-251.

41. Clark A.J. et al. Expression of human antihemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep //Bio/Technology. -N 7. 1989. - P.487-492.

42. Colman A. Production of therapeutic protein in the milk of transgenic livestock//Biochem Soc. Symp. V.63. - P. 141-147.

43. Colony stimulating factors receiving more attention and results./ Appl. Genet. News.- 1987.-N1.-P.1-2.

44. Crystal R.G., MaElvaney N.G., Rosenfeld M. et al. //Nature Genet. 1994. -V.8. -P.42-51.

45. Denman J., Hayes M., Day S. et al. //Biotechnology. 1991. - V.8. - P.839-843.

46. Dillon N. Regulating gene expression in gene therapy // Trends Biotechnol. -1993. -V.ll. P. 167-172.

47. DiTulio P., Ebert K., Pollock J. et al. //In: Trancgenic animals: Generation and Use. 1995.- P.465-467.

48. Douglas J.J. Process development of viral vector //The Second Annual us Biotechnology Symposium Nov. 7-9. 1999.

49. Ebert K.M. et al. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasmingen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression //BioTechnology. N 9. - 1991. - P.835-838.

50. Egrie J.C., Strickland T.W. , Lane J. et al. Characterization and biological effects of recombinant human erythrioietin // Immunibiol. 1986. - V.172. -P.213-224.

51. Emery D.W. et al. Development of a condensed locus control region cassette and testing in retrovirus vectors for a gamma-globin //Blood Cells Mol Dis. -V.24(3). 1998. -P.322-339.

52. Erickson R.P. Minireview: creating animal models of genetic diseases //Amer. J. Hum. Genet. 1988. - V.43. -P.382-386.

53. Evans M.G., Kaufman M. Establishment in culture of plurepotential cells from mouse embryos //Nature. 1982. - V.292. - P. 154-156.

54. Fransolini M. et al. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells //Mol. Reprod. and Dev. -N 34. 1993. - P.133-139.

55. Fried W. The liver as a sourse of extrarenal erythropoietin production // Blood. 1972. - V.30. - P.671-677.

56. Gail D. Gene therapy likely to target cancer patients on large scale // Genet. Eng. News. -N 2. -1994. P. 14-15.

57. Gao X., Huang L. Cationic liposome-mediate gene therapy //Gene Ther. V.2. - 1995. -P.710-722.

58. Garcia J.F., Ebbe S.N., Hollander L. et al. Radioimmunoassay of erythropoietin: circulating levels in normal and polycythemic human being // J.Lab.Clin.Med. 1982. - V.99. - P.624-635.

59. Gene therapy averts restenosis in pigs //Biotechnol. News 1994 - N 20- c.4-5.

60. Gene therapy for cystic fibrosis // Biotechnol. News. 1994. - N 5. - c.7.

61. Ghazizadeh S., Harington R., Taichmann L. In vivo transduction of mouse epidermis with recombinant retroviral vectors: implications for cutaneous gene therapy // Gene Ther. 1999. -N.7. - P. 1267-1275.

62. Gordon K., Lee E., Vitale J.A., Smith A.E., Westphal H., Hennighausen L. Production of human plasminogen activator in transgenic mouse milk // BioTechnology. 1987. - V.5. - P.l 183-1187.

63. Gottschalk S. Synthetic vehicles for effecient gene transfer and expression in mammalian cells // J. Cell Biochem. Suppl. 21a.- 1995. - P.393.

64. Gruenbaum J. et al. Sperm cells as vector for generation of transgenic chickens //J.Cell Biochem. -1991. Suppl. 15 E. - P. 194.

65. Haskell R.E., Bowen R.A. Efficient production of transgenic cottle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev. V.3. - 1995. -P.386-390.

66. Heinz R., Reisner R, Pittermann E. Erythropoietin for chemotherapy patients refusing blood transplantation // Lancet. 1990. - V.335. - P.542-543.

67. Henighausen L. //J. Cell. Biochem. 1992. - V.49. - P.325-332.

68. Hicks G.C. et al. Retrovirus gene traps // Metods Enzumol. V.254. - 1995. -P.263-275.

69. Hodgson C.P. The vector void in gene therapy //Biotechnology. 1995. -V.13.-P.222-225.

70. Jacobson C.O., Goldwasser E., Fried W. et al. Role of kidney in erythropoiesis //Nature . 1957. - V.179. - P.633-634.

71. James D.S. et al. N-Glycocylation of recombinant human interferon-gamma produced in different animal expression system //BioTechnology. V.13. -1995. -P.592-596.

72. Yamada T., Kaneko H., Jizuko H. et al. Elewation of lymphocyte and hematopoetic stem cell numbers mice transgenic for human granulocyte CSF // Lab/ Invest. 1996. - V.74. - №2. - P.384-394.

73. Johnson L.G. Retroviral approaches to gene therepy of cistis fibrosis //Ann. Acad. Sci. V.953. - 2001. - P.43-52.

74. Kasahara N. et al. Tissue-specific targeting of retroviral vectors through ligand-receptor interactions //Science. 1994. - V.266. - P.1373-1376.

75. Kaufmann R.J. Advances toward gene therapy for hemophilia at the millenium// Hum. Gene Ther. V.10. - 1999. - P. 2097-2107.

76. Khoo H.-W., Patil J., Chen E. Sperm-mediated gene transfer: a review// SEAMEO Jasper Fellowship Monograph 1993 Series 1. 1993.

77. Ko J.H. et al. Production of biologically active human granocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat // Transgenic Reseach. V. 9. - 2000.-P.215-222.

78. Korhonen V.P., Tolvanen M., Hyttinen J.M. et al. Expression of bovine beta-lactoglobulin human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits // Eur. J. Biochem. 1997. - V.15. - P.482-489.

79. Kotani H. Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy //Hum Gene Ther. V.45. - 1994. - P. 19-28.

80. Krystal G., Pancratz H., Farter N. et al. Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure // Blood. 1986. - V.67. - P.71-80.

81. Labosky P.A., Barlow D.P., Hogan B.L. //Development. 1994. - V.120. -P.3197-3204.

82. Lai F.F., Everett R., Wang F. et al. Structural characterization of human erythropoietin// J.Biol.Chem. 1986. - V.261.- P.3116-3121.

83. Lavitrano M. et al. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice // Cell. -1989. V.57. - P.717-723.

84. Lee-Huang S. Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in E.coli. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1984. - V.81. - P.2708-2712.

85. Lin F.-K. , Suggs S. , Lin C.-H. et al. Cloning and expression of the human erythropoietin gene //Proc.Natl.Acad.Sci. 1985.- V.82. - P.7580-7584.

86. Lu Y.F., Tian C., Deng J.X. et al. Cloning of human G-CSF genomic gene and its expression transgenic mice mammery gland // Chuan Nsueh Pao. -1999. V.26. - №4. - P.281 -287.

87. Lu J. Viral based gene therapy for prostate cancer //Curr Gene Ther. V. 1(2). -2001. -P.183-200.

88. Lubon H. Transgenic animal bioreactors in biotechnology and production of blood proteins //Biotech. Annu Rev. V.4. - 1998. - P. 1-54.

89. Maeda H. , Hitomi Y. , Hizata R. et al. Erythropoietin and autologous blood donation // Lancet. 1989. - V.334. - P.284-285.

90. Massoud M., Attal J., Thepot D. et al. The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits // Reprod. Nutr. Dev. 1996. - V.36. - P.555-563.

91. Meade H.L. et al. Bovine aSi-casein gene seguences direct high level expression of active human urokinase in mouse milk //Biotechnology. V.8. -1990. -P.443-446.

92. Mitani K. Delivering therapeutic genes matchung approach and application// Trends Biotechnol. - 1993. - V. 11. - P. 162-166.

93. Moore M.A. The clinical use of G-CSF // ARI. 1991. -V.9. - P. 159-191.

94. Nagano M. et al. Retrovirus-mediated gene deliveryinto male germ line sterm cells // FEBS Letters. V.475. - 2000. - P.7-10.

95. Nagano M. et al. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ line stem cell //PNAS. V.98. -2001. -P.13090-13095.

96. Nagata S. et al. Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony stimulating factor // Nature. 1986. - V.319. - P.415-418.

97. Nagata S. Gene structure and function of G-CSF // BioEssays. -1989. -V.10. — P. 113-117.

98. Niemann H. et al. Expression of human cattihg factor VIII cDNA construct in the mammary gland of transgenic sheep //Transgenic animals in Agriculture Conference, Tahol City, CA, USA. 1997. - P.48.

99. Nilson B.H.K. et al. Targeting of retrovirae vectors through protease- substrate interactions //Gene Ther. 1996. - V.3. - P.280-286.

100. Peng K-W. et al. Retroviral gene delivery system activatable by plasmin// Tumor Targeting. 1998. - V.3. - P. 112-120.

101. Peng K-W. Strategies for targeting therapoutic gene delivery //Molec. Medicine today. 1999. - V.5. - P.448-453.

102. Persuy M.A. et al. High expression of the caprine ^-casein gene in transgenic mice //Eur.J.Biochem. V.205. - 1992. - P.887-893.

103. Platzer et al. Biological activities of a human granulocyte colony stimulating factor on normal and leukemic cells // JEM. 1985. -V.162. - P.1788-1801.

104. Powell J.S., Berkner K.L., Lebo R.V. et al. Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells and chromosomal localization//Proc.Natl.Acad.Sci. 1986 . - V.83. - P.6465-6469.

105. Richard M. Comparison of anti-HIV-1 retroviral vectors and their use inan AIDS gene therapy trial in identical twins //J.Cell Biochem. Suppl. 21a. -1995.-P.397.

106. Rubanyi G. The future of human gene therapy //Mol. aspects of Medicine. -2001.-V.22.- P.113-142.

107. Russell S.J. Gene therapy: Science, medicine and the future //Br. Med. J. -1997. -V.315. -P.803-815.

108. Seamon J.A. Inserting a nuclear targeting signal into a replication-competent Moloney murine leukemia virus affects viral export and is not sufficient for cell cycle-independent infection //J. Virol. V.76(16). - 2002. - P.8475-8484.

109. Sheridan W.P/ et al. Granulocyte colony stimulating factor and neutrophil recovery after high-dose chemotherapy and autologous bone marrow transplantation //Lancet. -1989. V.2. - P.891-891.

110. Sherwood J.B. The chemistry and physiology of erythropoietin // Vitam.Horm. 1984. - V.41. - P.161-211.

111. Simons J.P. et al. Alteration of the guality of milk by expression of sheep P-lactoglobulin in transgenic mice //Nature. V.328. - 1987. - P.530-532.

112. Snuder R.O. et al. Correction of hematophilia B in canine and murine models using recombinant adeno-associated viral vectors //Gene Ther. Res. 1999. -V.5. -P.64-70.

113. Sommerfeit M.A. Retrovirus receptors //J. Gene Virol. 1999. - V.80. -P.3049-3064.

114. Steward W.P. Granulocyte and granulocyte-macrophage colonystimulating factors // Lancet. -1993. Y.342. - P. 153-157.

115. Tran N.D. et al. In utero transfer and expression of exsogenous genes in sheep // Exp. Hematol. V.l. - 2000. - P. 17-30.

116. Uckert W., Walther W. Retro virus-mediated gene transfer in cancer therapy// Pharmac. Ther. V.63. - P.323-347.

117. Van Cott K.E., Lubon H., Rüssel C. et al. //Transg. Res. 1997. - V.6. -P.203-212.

118. Velande W.H. et al. Expression of human protein C in trancgenic swine // Harnessing biotechnology for the 21st century: Proc. 9th International Biotechnology Symposium and Exposition Virginia, August 16-21. 1997. -P.34-37.

119. Velander W., Johnson J., Page R. et al. //Proc. Natl. Acad. Sei., USA. 1992. - V.89. - P. 12003-12007.

120. Vilotte J.S. et al. Complete nucleotide seguence of bovine a-lactalbumin gene: comparison with its rat counterpart //Biochimie. V.69. -1987. - P.609-620.

121. Wall R.J. High level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine //Proc. Natl. Acad. Sei. V.88. -1991. - P. 16961700.

122. Wall R., Pussel V., Shamay A. et al. //Biotechnology. 1991. - V.8. - P.710-715.

123. Wilmut I., Archibald A., McClenaghan M. et al. //Experientia. — 1991. — V.47. P.905-912.

124. Wivel N.A. Regulatory considerations for gene therapy strategies and products // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 189-191.

125. Wojchowski D.M., Orkin S.H., Sytkowski A.S. Active human erythropoietin expressed in insect cells using a baculovirus vector: a role for N-linked oligosacharide // BBA. 1987. - vol.910. - P.224-232.100