Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз и овец

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз и овец"



На правах рукописи

Гвоздь Инна Михайлова«

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В МОЛОКЕ ТРАНСГЕННЫХ КОЗ И ОВЕЦ

03.00.23- Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровины - 2003

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно - исследовательского института животноводства РАСХН.

Научные руководители: академик РАСХН Лев Константинович Эрнст;

доктор биологических наук Наталия Анатольевна Зиновьева,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Нурбий Сафарбиевнч Марзанов; кандидат биологических наук Николай Петрович Зыкунов

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной мед ицины и биотехнологии им. К .И. Скрябина

Защита диссертации состоится 2003 года, в 10 часов, на

заседании диссертационного совета ДООб.013.01 при Всероссийском государственном научно- исследовательском институте животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район,

п. Дубровицы, ВИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа

^ , » Автореферат разослан « » *íL 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наУк

!')В .

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Повышение эффективности животноводства на современном этапе связано с разработкой новых биологических приемов, направленных на изменение генома сельскохозяйственных животных. По характеру локализации трансгена в организме животных трансгенные индивидуумы могут быть подразделены на два типа: генеративные и соматические. В зависимости от целей эксперимента, научный и практический интерес представляет получение обоих типов трансгенных животных.

Перспективным приемом соматического переноса генов является использование ретровнрусных векторов [Титова В.А..,2001, Волкова НЛ.,2002). Их способность переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся клеток, например, в секреторные клетки молочной железы, позволят экспрессировать рекомбннантный продукт с молоком. Это делает возможным получение белков, имеющих фармакологическое значение. Молочная железа трансгенных животных является идеальным источником производства рекомбикантных белков. Кроме того, молоко, содержащее рекомбннантные белки, имеет высокий гигиенический стандарт и может быть легко извлечено с использованием имеющихся технологий [Зиновьева Н.А. и др.,2001].

По сравнению с бактериальными и примитивными эукариотическимн системами в молочной железе трансгенных животных выполняются большинство постгрансляционных модификаций рекомбинантных белков (гидроксилирование, гликозилирование, у-карбоксилирование), происходит правильная складчатость белков, требующаяся для проявления их биологической активности. Актуальным является проведение исследований по изучению закономерностей и оптимизации экспрессии рекомбинантных белков в молоке трансгенных сельскохозяйственных животных. Изучение факторов, влияющих на уровень синтеза рекомбинантных белков с молоком трансгенных коз и овец позволит повысить эффективность трансгенных технологий в животно водстве.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение закономерностей и оптимизация экспрессии рекомбикантных белков в молоке соматических и генеративных трансгенных животных.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить соматических трансгенных коз методом инъекции клеток-упаковщиц, продуцирующих генные конструкции эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

2. Изучить эффективность трансформации клеток вымени коз на уровне ДНК.

3. Выполнить анализ экспрессии рекомбинантного эритроггоэтнна (ЭПО) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в молоке коз в ходе лактации.

4. Дать сравнительную оценку эффективности экспрессии рекомбинантных белков в молоке коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц,

Г-КСФ).

5. Выполнить исследования молочной продуктивности, состава молока и активности рекомбииантного химозина в молоке трансгенных овец при нормальной м индуцированной лактации.

6. Изучить структуру тканей вымени трансгенных овец и коз по сравнению с контрольными.

Научная новизна.

Впервые изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колоииестимулируюшего фактора и эритропоэтина человека, выявлена локальная трансформация клеток молочной железы коз. Исследована динамика экспрессии рекомбииантного эритропоэтина в гранулоцитарного колониестимулируюшего фактора человека в молоке опытных животных в течение лактации. Установлено влияние лактации, времени введения генных конструкций в молочную железу животных на уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком. Изучена продуктивность и уровень синтеза рекомбииантного химозина с молоком трансгенных овец при нормальной н индуцированной лактации.

Практическая значимость. Показана возможность использования ретро вирусных векторов для получения соматически трансгенных коз-продуцентов рекомбинантных белков. Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком. Показана возможность использования нндуин рованной лактации для повышения молочной продуктивности, получения большего количества рекомбииантного химозина с молоком трансгенных овец. Основные положения, выносимые на защиту.

•Получены соматически трансгенные козы- продуценты эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулируюшего фактора человека. •Установлен уровень и характер синтеза рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз в ходе лактации.

•Выявлены факторы, влияющие на эффективность получения соматических трансгенных коз.

•Изучена молочная продуктивность и активность химозина в молоке трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации.

Алробация работы.

Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых ВИЖа (2001); на международной научной конференции «Актуальные проблемы ДНК-технологнЙ и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных» (2002); на конференциях отдела биотехнологии ВИЖа (2001,2002).

Публикации результатов исследования.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Струюура и объем работы.

Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 13 таблиц и 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, который включает 159 источников.

2. Материалы н методы исследований

Работу проводили в отделе биотехнологии с 2000 по 2003 гг. по плану НИР ВИЖа.

Схема исследований приведена на рисунке I.

В качестве опытных животных служили 12 коз зааненской породы и б овец цигайской породы полученных путем мнкроинъекции в мужской пронуклеус зигот генной конструкции альфа- S |-казеи н/про химозин [Эрнст Л .К. и др., 1995]. Животных содержали на территории физиологического двора ВИЖа. Содержание и кормление коз и овец осуществляли согласно технологии, принятой на физиологическом дворе ВИЖа.

В работе били использованы рекомбинантные ретровярусные векторы pLNa н pLN-G-CSF, полученные на основе вируса лейкемии мышей Молони и помещенные в пакующую линию клеток АМ12. Вектор pLNa содержит кДНК эритропоэтина человека, ретровирусный вектор pLN-G-CSF - кДНК гранулоцитарного колониестимулирукицего фактора человека под контролем промотора aSj-казеина крупного рогатого скота.

Клетки-упаковщицы были наращены в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИЖа. Клетей -упаковщицы вводили глубоко в паренхиму молочной железы опытных коз (п=12), находящихся на разных стадиях сукозности. Три козы имели срок сукозности 3,5 месяца, четыре — 4 месяца, пять коз - 4,5 месяца. В течение лактации от опытных животных отбирали пробы молока. ДНК выделяли посредством солевой экстракции [Miller S.A.., 1988] и щелочного лизисного буфера [Зиновьева H.A. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК определяли методом ПЦР. Динамику экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке коз изучали методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) [Волкова H.A. и др.,2002]. Уровень Г-КСФ в молоке определяли с помощью набора ProCon-G-CSF (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург).

Образцы тканей молочной железы были зафиксированы в 10% формалине и залиты в парафин (Б. Ромейс, 1953). Гистологические срезы готовили на санном микротоме. Окрашивали срезы гематоксилин -эозином. Микроскопию и микрофотографирование проводили под микроскопом «Микрофот», объективы 6,5х и20х. С целью оценки влияния инъекции на структуру вымени , проводили гистологические исследования при участии профессора Шихова ИЛ.

С целью установления способности прохнмознна к отщеплению N-пептида н переходу в псевдохимозин и химозин выполняли активирование про химозина в молоке трансгенных животных по методике, описанной Зиновьевой H.A. и др. [1996].

Рисунок!. Схема исследований

3. Результаты собственных исследований

3.1. Оценка клеток-упаковщнц на наличие рекомбинантной вставки.

Перед введением в молочную железу используемые линии клеток

упаковщиц были предварительно оценены на наличие рекомбинантной вставки. ПЦР-аналш показал наличие провирусной ДНК-формы в клетках и подтвердил наличие рекомбинантной ДНК во всех исследованных пассажах,

3.2. Получение соматических трансгенных коз.

Клетки-упаковщицы вводили в паренхиму молочной железы коз. Для введения использовали 10 млн. клеток на каждую долю вымени. На протяжении лактации от животных отбирали пробы молока с целью выявления посредством ПЦР анализа рекомбинантной ДНК и изучения с помощью ИФА.. 3.2.1. Анализ интеграции генных конструкций и

рЬГ^С-СБГ. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из соматических клеток молока коз, выявил наличие рекомбинантной ДНК у всех опытных животных. Вместе с тем, следует отметить, что интеграция носила временный характер, то есть в течение лактации периоды, в которые было доказано наличие рекомбинантной ДНК, чередовались с периодами, в которых ДНК генной конструкции не обнаруживались. Результаты эффективности трансформации клеток вымени коз суммированы в таблице 1.

Таблица I Эффективность трансформации клеток молочной железы коз ретровирусними генными конструкциями.___

№ Стадия Констру Введено Исследова ПЦР ПЦР

козы введени кция клеток на но проб «+», п «+», %

я долю вымени

15 3,5 ЬЕро 10 млн 28 12 42

7 3,5 ЬО-СЭР 10 млн 24 0 0

9 3,5 Ьв-СБР 10 млн 26 0 0

В среднем 78 12 15,4

4 4 ЬЕро 10 млн 30 18 60

10 4 1)Еро 10 млн 24 16 66

5 4 ЬЯ-СЭР 10 млн 32' И 34

б 4 ЬО-СББ 10 млн 28 8 28

В среднем 114 53 46,5

12 4,5 ЬЕро 10 млн 30 21 70

13 4,5 ЪЕро 10 млн 36 23 63

14 4,5 Ьеро 10 млн 24 15 62

8 4,5 ЬО-С$Р 10 млн 30 И 36

11 4,5 Ьв-СБР 10 млн 32 18 56

В среднем 152 88 57,9

Как следует из данных таблицы 1, наибольшая эффективность трансформации секреторных клеток вымени отмечалась при введении клеток-упаковщнц на 4,5 месяце сукозности - 57,9%, а наименьшая - на 3,5 месяце

сукозносги. Использование для эксперимента опытных животных, находящихся на 4-ом месяце сукозносги, приводило к промежуточным результатам - 46,5%. Это связано с тем, что в 4,5 месяца сукозносги в молочной железе трансформированной оказывается наибольшая часть клеток.

Если рассматривать эффективность трансформации клеток вымени коз в зависимости от используемой генной конструкции, то следует отметить более высокую эффективность трансформации при использовании генной конструкции эритропоэтина. Так, при введении клеток-упаковщиц pL.Nct на 3,5 месяце сукозносги, в 42% проб соматических клеток, выделенных из молока в разные дни лактации, была выявлена ДНК генной конструкции, в то время, как ни в одной из 50 исследованных проб соматических клеток молока, полученных от коз, которым вводилась генная конструкция рЬЫ-<5-С$Р, рекомбинантная ДНК не диагностировалась.

Аналогичная закономерность наблюдалась и при введении клеток-упаковщиц на более поздних сроках сукозности. Так, в опытной группе коз, инъекцию клеток-упаковщиц которым осуществляли на 4-ом месяце сукозносги, эффективность трансформации секреторных клеток вымени генной конструкцией рЬМа составляла 63,0%, в то время как при использовании генной конструкции рШ-в-СЗР только 31,7% проб оказались положительными. В группе коз, которой клетки-упаковщицы вводились на 4,5 месяце сукозносги, эффективность трансформации генными конструкциями рЬЫа и рЬЫ-О-СЭР составляла, соответственно, и 65,6 и 46,8%. Результаты эффективности трансформации секреторных клеток вымени коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц и используемой генной конструкции представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 Эффективность трансформации секреторных клеток вымени коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц и используемой генной конструкции.

Вр1_Ыа ВриМЗ-СЭР О Всего

Л* 60

10

о

3,5 мес. 4 мес. 4,5 мес.

Стадия введения {месяц сукозносги)

3.2.2. Исследование экспрессии рекомбииантного эрнтропоэтнна в молоке коз.

Им мун »ферментный анализ показал, что содержание эритропштина в сыворотке молока опытных коз в течение лактации варьировало от 20 до 400 нг/мл. Экспрессия наблюдалась до 4-5 месяцев лактации, причем в ходе лактации отмечалась периодичность синтеза рекомбииантного продукта в молоко: периоды усиления экспрессии белка чередовались с периодами снижения его секреции.

Результаты анализа экспрессии рекомбинантного эритропоэтнна в молоке коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц суммированы в таблице 2

Таблица 2 Концентрация эритропоэтина в зависимости от стадии введения рекомбинантного вектора._

№ № Стадия Продолжи- Иссле- Концентрация ПЦР

жив. введения тельность довано hEpo (иг)

(месяц сукозности) лактации, Дн. проб* Мин. Макс.

3 15 3.5 140 36 20 300 +

2 4 4 180 54 20 350 +

3 10 4 140 45 5 350 +

4 12 4.5 150 44 20 370 +

5 13 4.5 190 56 20 400 +

6 14 4.5 150 32 20 400 +

*иммуноферместный анализ

Из таблицы 2 следует, что наибольший уровень экспрессии, составил у коз, генную конструкцию которым вводили на 4-4,5 месяцах сукозности. Таким образом, эффективность трансформации секреторных клеток вымени, оцененная методом ПЦР анализа (табл. I), коррелировала с эффективностью экспрессии, оцененной методом нммуноферментного анализа.

Все полученные соматические трансгенные козы характеризовались высоким уровнем изменчивости концентрации эритропоэтина в молоке в ходе лактации, однако какой-либо прямой зависимости уровня синтеза от дня лактации выявлено не было {рис.3).

Анализ экспрессии эритропоэтина по периодам лактации показал, что средняя концентрация эритропоэтина в сыворотке молока коз в первые дни лактации составила 120нг/мл, и постепенно возрастала, достигая 400нг/мл к 2750-му дням, после чего к 100-120-му дню происходило снижение концентрации до 5 0 нг/мл.

Рисунок $ Динамика изменения концентрации ЭПО в молоке коз в ходе

3.2.3 Исследование экспрессии рекомбинантного Г-КСФ в молоке коз. Результаты анализа экспрессии рекомбинантного Г-КСФ в сыворотке молока коз суммированы в таблице 3.

Таблица 3. Экспрессия рекомбинантного Г-КСФ человека в молоке коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц.__

№ Ла Стадия Продолжи- Иссле- Концентрация ПЦР

ЖИВ. введения тельность довано ИС-СБР (нг)

(месяц лактации, проб* Мин, Макс,

сукозности) Дн.

1 7 3.5 140 36 3 30 -

2 9 3.5 140 32 3 30 -

3 5 4 150 44 3 120 +

4 6 4 160 38 3 125 +

5 8 4.5 160 48 3 120 +

б И 4.5 160 56 3 200 +

"иммуноферментный анализ

Как следует из данных таблицы 3, наблюдалась аналогичная закономерность изменения концентрации Г-КСФ в молоке в зависимости от стадии сукозности, на которой осуществлялось введение клеток-упаковщиц. Экспрессия была минимальной при инъекции клеток-упаковщиц на 3,5 месяце

сукозности -30 нг/мл и максимальной (120-200 нг/мл)-при их инъекции на 4,5 месяце сукозности. В опытной группе коз, инъекцию которым проводили на 4-ом месяце сукозности, максимальные концентрации Г-КСФ достигали промежуточных значений- 120-125 нг/мл.

Как и в случае генной конструкции ЭПО, эффективность трансформации секреторных клеток вымени генной конструкцией Г-КСФ, оценненая методом ПЦР анализа (глава 3.2.1.), коррелировала с эффективностью экспрессии Г-КСФ, оцененной методом им му нофер ментного анализа.

Как и в случае синтеза эритропоэтнна, периоды активного синтеза Г-КСФ в молоке чередовались с периодами спада секреции, однако прямой зависимости от дня лактации выявлено не было (рис.4).

Рисунок 4. Динамика концентрации Г-КСФ в молоке коз в ходе лактации.

Давая оценку уровня экспрессии Г-КСФ в молоке коз в целом, следует отметить, что концентрация Г-КСФ была значительно ниже по сравнению с концентрацией эритропоэтина, полученной в аналогичных экспериментах {глава 3.2.1). В первые дни лактации уровень Г-КСФ в молоке составлял в среднем 16 нг/мл. Увеличение концентрации наблюдалось на 13-й Д4-Й и 40-й дни. Снижение концентрации наблюдалось, начиная с 62-го дня лактации.

3.3. Сравнительный анализ эффективности трансформации молочной железы коз генными конструкциями рЬИа (I рЬК-С-СЯР.

Проведенные нами исследования показали, что на экспрессию рекомбинантных белков в молоке соматических трансгекных коз оказывали

влияние стадия введения генных конструкций, период лактации, а также используемая генная конструкция.

«Период лактации.

Как следует из результатов исследований, приведенных в главе З.2., уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоке коз в ходе лактации сильно варьировал. Так, высокий уровень рекомбинантного эритропоэтина наблюдался на 18-20-й, 26-30-й и 50-60-й дни лактации. Содержание рекомбинантного белка в эти дни достигало 350-400 нг/мл. Максимальная концентрация Г-КСФ в молоке коз наблюдалась в основном на 13-ый, 17-20-ый, 24-26-ой и 40-ой дни лактации. Уровень рекомбинантного белка в молоко в эти периоды составлял 120-200 нг/мл.

Необходимо отметить, что наибольшее число пиков активного синтеза эритропоэтина и Г-КСФ наблюдалось, соответственно, первые 3-8 недель и 2-5 недель лактации, Начиная с четвертого месяца лактации, частота периодов синтеза рекомбинантного продукта в молоко снижалась. В период с 121-го по 150-й день содержание эритропоэтина в молоке снижалось и колебалось на уровне 20-50 нг/мл. Снижение рекомбинантного Г-КСФ отмечалось с 76-го по 123-й дни лаетации. Концентрация Г-КСФ в молоке коз в этот период находилась на уровне 3-5 нг/мл,

В таблице 4 суммированы данные о средней концентрации рекомбинантного эритропоэтина в молоке коз по периодам лактации.

Таблица 4. Среднее содержание рекомбинантного эритропоэтина в сыворотке молока опытных коз по периодам лактации (нг/мл)._

№ коз ы Стадия введения * Дни лактации

1-31 32-62 63-93 94-124 125-155 М±ш

15 3,5 146±5б 230±81 163±45 73±12 20 126±21

4 4 164±47 214±40 106±20 Н6+Н 61±13 132±12,01

10 4 154±51 250±29 183±38 73±12 25±0 137±19

12 4,5 117±34 340±36 233±52 156±20 60+13 181±25

13 4,5 280±45 300±66 250±25 100±25 90± 14 204±23

14 4,5 205±66 2бб±94 250±25 150±20 90 ±14 192±16

В среднем 177,7±40 267±20 197,5±25 111±16 57,8±13,0 162±19

* месяц сукозности

Средние концентрации эритропоэтина в сыворотке молока опытных коз первые 30 дней лактации составляли 177,7 ±40 нг/мл, с 32-го 61-ый дни -267±20 нг/мл, с 62-го по 92-ой дни - 197,5±25 нг/мл, с 93-го по 123-ий дни -111+16 нг/мл, с 124-го по 155-ый дни-57,8 ±13,0 нг/мл.

В таблице 5 представлены данные о концентрации рекомбинантного Г-КСФ в молоке опытных коз по периодам лактации.

Таблица 5, Средний уровень содержания рекомбингштного Г-КСФ е сыворотке молока опытных животных (иг/мл)._

№ жив. Стадия введения* Дин лактации

1-30 31-61 62-92 93-123 М±ш

7 3,5 22±4 '9,5±3 5,7±1,4 3 10,1±1,9

9 3,5 22±4 17,5±1,4 6+2 3 12,1 ±3,2

5 4 48 ±25 80±12 15±8 4 36,8±8

6 4 39±28 85±15 22±2 10 39,0+7

8 4,5 7Ш8 72,5+10 24,5 ±9 7 45,5±7

11 4,5 124±25 110ИЬ43 70±8 15 79,8±12

В среднем 55±17 62+14 23,8±5 7 37±6

• месяц сукозносш

В среднем у опытных коз экспрессия рекомбинантного Г-КСФ первые 30 дней лактации составила 55,5 иг/мл, с 31-го по 61-ый дни-66 нг/мл, с 62-го по 93-ий дни-23 нг/мл, с 94-го по 123-ий дни - около 3 нг/мл.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что экспрессия была относительно высокой в первый месяц лактации, далее поднималась и достигала максимальных значений во втором месяце лактации, после чего постепенно снижалась с третьего по пятый месяцы лактации.

»Стадия введения клеток -упаковщиц

На уровень экспрессии рекомбинаитных белков в молоке опытных коз значительное влияние оказывала стадия маммогенеза, на которой осуществлялось введение клеток упаковщиц (табл. 6).

Таблица 6. Влияние стадии введения клеток-упаковщиц иа уровень синтеза ЭПО и Г-КСФ в молоке коз.

Стадия введения* и Дни лактации

1-30 31-61 62-92 93-123 124-155 Средн.

Эритропоэтин

3,5 1 146±56 230±81 163±45 73±12 20 126±21

4 2 159±49 232±34 144±29 94±13 43+6 134±15

4.5 3 200±48 302±65 244±34 135+21 80±13 192±21

Г-КСФ

1-30 31-61 62-92 93-123 Средн.

3,5 2 22±4 13,5±2 5,85*1,7 3 11,1±2,5

4 2 43±26 82,5±13,5 18,5±5 7 37,9±7,5

4.5 2 Ю1±21 91±26 47,2±8,5 11 62,6±9,5

* месяц сукозности

Как следует из данных таблицы б, наиболее высокая экспрессия рекомбинантного продукта наблюдалась у опытных животных, введение клеток-упаковщиц которым осуществляли в 4- 4,5 месяца вуятнеетл

«Генная конструкция.

Сопоставляя результаты анализа эффективности трансформации клеток молочной железы коз двумя различными генными конструкциями по периодам лактации, можно сделать вывод об идентичном рисунке экспрессии (рис.5). Однако уровень экспрессии в зависимости от генной конструкции сильно различался.

Следует отметить, что генные конструкции эритропоэтнна и Г-КСФ были получены на основе одного ретро вирусного вектора. Кроме того, для производства рекомбинантных вирусных частиц использовалась одна линия клеток-упаковщиц. Несмотря на это, нами были въшвлены значительные различия в концентрации изучаемых рекомбинантных конструкций в абсолютном выражении. Этот факт, по нашему мнению, можно объяснить различной эффективностью упаковки рекомбинантной ДНК в инфекционные вирусные частицы, обусловленной размером и последовательностью ДНК. Кроме того, различия в экспрессии могут быть вызваны различной инфекционной способностью рекомбинантных ретровнрусов, а также различной эффективностью их интеграции в геном.

Рисунок 5. Сравнительный анализ эффективности трансформации клеток вымени коз генными конструкциями рШа и рЬМ-О-СЗБ

Периоды лактации, дн.

В качестве фактора, оказывающего вероятное влияние на экспрессию, следует учитывать эффективность транскрипции рекомбинантной мРНК, а также ее стабильность.

3.4 Сравнительное исследование гнстоструктуры вымени коз.

Гистострукгуру молочной железы коз исследовали через месяц после инъекции в период 4,5 месяца беременности. Следует отметить, что молочно-железистая ткань в это время была достаточно сформирована и представлена отдельными островками в толще соединительной ткани. В островках были видны развивающиеся эпителиальные ветви железы, заканчивающиеся альвеолами. Отдельные веточки находились в процессе формирования, просвет не был дифференцирован. Наблюдался рост и развитие концевых: отделов железы.

В отдельных альвеолах наблюдались секреторные включения в виде жировых (окрашенных Суданом Ш) шариков. Другие альвеолы были еще не сформированы, просвет их был слабо выражен.

Таким образом, нарушений и изменений в гистоструюуре вымени опытных коз выявлено не было.

3.5. Изучение биологических особенностей овцематок, трансгенных по генной конструкции альфа-$1-казенн / химозин.

Следующим разделом работы является исследование биологических и хозяйственно полезных признаков овец трансгенных по генной конструкции альфа-S 1-казеин-химозин,

3.5.1. Исследование молочной продуктивности и свойств молока трансгенных овец. Молоко от трансгенных овец получали посредством ручного выдаивания. Доение проводили в индивидуальных станках, 3 раза в сутки через одинаковые промежутки времени: 7, 13 и 19 часов. Перед доением вымя в течение 10 минут массажировали и для улучшения молокоотдачи осуществляли инъекцию окситоцина в дозе 10 ед. внутримышечно.

В таблице 7 представлены данные о молочной продуктивности трансгенных и контрольных овцематок.

Как следует из данных таблицы 7, все исследованные трансгенные овцематки характеризовались пониженным удоем за лактацию (от 0,15 до 3,9 литра за лактацию) по сравнению с контрольными овцами. Так, среднесуточный удой, трансгенных животных, в среднем был ниже, чем у интактных в 4,3 раза, а общин надой за период доения - в 26 раз.

Все трансгенные овцематки характеризовались укороченной лактацией (от 15-ти до 32-ух дней). У контрольных овец-аналогов средняя продолжительность лактации составляла в среднем 91,6 литра, то есть была выше в 23 раза.

Таблица 7. Молочная продуктивность трансгенных овцематок за 1-ую и вторую латцин. __

Ка овцы Продолжит, лактации, дн. 1-ая 2-ая

1-ая 2-ая С/сут. Удой, мл. Максим. Удой, мл. Итого, л. С/суг. удой, мл. Максим. Удой, мл Итого, л.

Трансгенные овцематки

6272 26 24 60 120 1,56 140 550 3,36

6215 30 30 ПО ПО 3,30 130 340 3,90

6295 32 28 34 82 1,08 120 350 3.36

6297 15 18 10 128 0,15 123 492 2,30

В средн. 25,8 25,0 53,5 110,0 1,52 129 408 3,23

Контрольные овцематки

6217 150 148 590 1800 88,5 605 1900 Г 89,5

6230 146 144 620 1950 90,5 650 2005 93,6

В средн. 148 146 605 1875 89,5 627,5 1952,5 91,6

Сопоставляя данные об удое трансгенных овец за первую и вторую лактации, следует отметить повышение, как среднесуточного, так и максимального дневного удоя, что в конечном итоге выразилось в увеличении количества молока, полученного за всю лактацию. Следует отметить, что степень увеличения удоя во вторую лактацию по сравнению с первой носила индивидуальный характер. В зависимости от животного удой во вторую лактацию по сравнению с первой был выше в 1,2-15,3 раза.

Молоко трансгенных овец по органолептическим параметрам отличалось от молока нетрансгенных аналогов. Молоко трансгенных овец имело показатели близкие к сыворотке молока со слабым молочным цветом. В трансгенном молоке наблюдались хлопья казеина.

Изучение белкового состава молока овец выявило существенные различия по содержанию и соотношению двух основных фракций молока — сывороточной и казеиновой. Если количество общего белка в молоке трансгенных и контрольных овец практически не различалось -соответственно, 4,69 и 4,47%, то молоко трансгенных овец характеризовалось значительным увеличением сывороточной фракции (рис. 6),

Так, на долю сывороточных белков в молоке трансгенных животных приходилось 3,05% или 65,7% от общего содержания белков молока, в то время как в молоке контрольных животных содержание сывороточных белков составляло 0,88% или 19,7% от общего белка молока. Процентное содержание казеина в молоке трансгенных и контрольных животных составляло,

соответственно, 1,65 и 3,59% или 34,3 и 80,3 % от общего количества белков в молоке. Таким образом, содержание казеина у трансгенных овец было в 2,2 раза ниже, а сывороточных белков - в 3,5 раза выше по сравнению с контрольными животными. Соотношение сывороточной и казеиновой фракций в молоке контрольных а трансгенных овец составляло, соответственно, 4,1:1 и 0,54; 1,

Рисунок б. Белковый состав молока трансгенных овец и их нетрансгенных аналогов.

Обдай бегюк Сывороточные Казеин белки

По всей видимости, такие изменения в составе молока трансгенных овец связаны с активацией прохимознна в период накопления молока в емкостной системе вымени овец, которая оказывает створаживающее действие на казенны, приводит к их коагуляции и, как следствие, к переходу в нерастворимую фракцию.

3.5.2. Исследование активности химозина в молоке трансгенных

овей.

Активность химозина в молоке трансгенных овец определяли методом коагуляционного теста. Результаты анализа суммированы в таблице 8.

Таблица 8. Активность химозина в сыворотке молока трансгенных овец..

Номер Лактация Продолжит. Количество Средн. уровень

животного лактации, исслед. активности за всю

дн. Проб лактацию СБи/мл

6215 2 30 15 26,2

6272 2 24 18 9,4

6295 2 28 15 19,4

6297 2 18 15 17,2

Как следует из данных таблицы 8, активность химозина в молоке овец у отдельных животных сильно варьировала: в среднем от 9,4 до 26 CFU/мл, при этом зависимости активности химозина от продуктивности выявлено не было.

Зависимость активности химозина в молоке по периодам лактации наглядно представлена на рисунке 7.

Как следует нз данных рисунка 7, у трех из четырех овец максимальная активность отмечалась в первую декаду лактации, после чего она снижалась во вторую декаду и достигала минимальных значений в третью декаду. У одной овцы во вторую декаду наблюдалось незначительное повышение активности, после чего в третью декаду активность снижалась до минимальных значений.

Анализ полученных данных показал, что относительное снижение активности химозина в молоке во вторую декаду по сравнению с первой составило от 12,1 до 33,3% за исключением одной овцы, у которой, наоборот, наблюдалось повышение активности на 7,2%. В третью декаду лактации уровень активности химозина по сравнению с первой декадой был ниже на 7,666,7%.

Рисунок 7. Экспрессия активного химозина в молоке овец по периодам лактации.

3-10 11-20 21-30

Период лактации, дн.

5.3.3. Электронно-микроскопическое исследование структуры выменн трансгенных овцематок. Электронно-микроскопический анализ ткани вымени овец показал, что в альвеолах молочной железы трансгенных овцематок содержится много нитевидных структур, которые на четвертый день лактации образуют элекгронно-плотные сгустки неправильной формы с

рыхлым» краями, заполняющими большую часть внутреннего пространства альвеол. Центральная часть альвеол заполнена электронно-плотным гомогенным материалом, по периметру которого расположены продукты секреции молочной железы, содержащие большое количество более мелких включений, идентичных сгусткам в центральной части. В альвеолах молочной железы контрольных овцематок, содержится большое число разнообразных мелких включений, вероятно, белковой природы, которые не образуют плотных сгустков, а также множество мелких округлых электронно-плотных включений липидной природы.

По остальным ультраструктурным характеристикам сегрегирующие клетки молочной железы трансгенных н контрольных животных не отличаются.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что подобные изменения в структуре ткани вымени траисгенных овец приводят к накоплению плотных сгустков в альвеолах, нарушают качество и количество характерных продуктов секреции и вызывают закупорку полостей.

5-3.4. Гистологические исследования структуры вымени трансгенных овцематок. Для исследования были взяты образцы биопсии вымени двух траисгенных и двух контрольных овец на втором месяце лактации.

Было установлено, что структура молочных желез трансгенных овец отличается от контрольных образцов закупоркой альвеол и первичных молочных протоков нерастворимым содержимым. Очень редко встречаются островки функционирующей ткани. В этих работающих участках секреторные клетки характеризуются признаками лакгогенной функции. В контрольных образцах молочной железы имеются все виды функционирующего секреторного эпителия. Исследования показали, что содержимое альвеол у трансгенных овец претерпевает определённые изменения, что, вероятно, компактнзацией молекулярной структуры и нодкисленнем содержимого альвеол. Таким образом, нарушаются процессы секреции н выделения молока. На основании полученных данных, можно предполоадгть, что ген химозина определяет синтез продукта, который не выделяется немедленно, а отстаивается определенное время в ёмкостной системе органа. Происходят определенные сдвига в химической природе содержимого. Эти сдвиги провоцируют переход прохимознна в активную форму-химозин, который створаживает молоко, выделяющееся клетками молочной железы, переводит его в нерастворимое состояние.

5.3.5. Изучение биологических особенностей лактации при индуиированной лактации.

В таблице 9 суммированы данные о молочной продуктивности овец при индуцированной лактации.

Анализируя таблицу в сравнении с нормальной лактацией (табл. 7), было установлено, что увеличение продолжительности лактации составило 1,6-2,45 раза, а удоя за лактащпо в 1,9-2,8 раза.

Таблица 9, Продуктивность трансгенных овец* при индуцированной лактации

№овцы Продолжительность лактации, дн. С/сут. Удой, мл Удой за лактацию, л.

6272 59 160 9,44

6215 48 155 7,44

6295 50 141 7,05

* у овцы № 6276 при гормональной обработке лактация не возобновилась.

Выводы

1. Получены соматические трансгенные козы посредством инъекции в молочную железу клеток упаковщиц, продуцирующих ретровирусные генные конструкции эритропоэтина (р1^а) и гранулоцитарного колокиестимулирующего фактора, Г-КСФ (рЬЖЗ-СЗР).

2. Показаны различия в эффективности трансформации клеток вымени коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц и от используемой генной конструкции. С увеличением срока сукозности от 3,5 до 4,5 месяцев наблюдалось повышение степени трансформации клеток вымени коз от 42,0 до 65,6% для генной конструкции pL.No и рЬЫ-О-СЗР, соответственно, от О до 46,8% и от 42,0 до 65,6%.

3. Установлена экспрессия эршропоэтниа и Г-КСФ в молоке опытных животных (п-12); Максимальный уровень экспрессии эритропоэтина в сыворотке молока коз составлял 300-400 иг/мл, Г-КСФ - 200 нг/мл при среднем содержании белков, соответственно, 162119 и 37±6 нг/мл.

4. Выявлено влияние стадии введения клеток-упаковщиц, дня лактации и вида генной конструкции на уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоке соматических трансгенных коз. При инъекции клеток-упаковщиц в 3,5, 4 к 4,5 месяцев беременности содержание эритропоэтина в молоке составляло в среднем 126+21,134,5*15,5 и 192±21,3 нг/мл, Г-КСФ -11,112,5, 37,9±7,5 и 62,6±9,5 нг/мл. Наибольшее число пиков активного синтеза эритропоэтина и Г-КСФ у исследованных животных наблюдалось, соответственно, в первые 3-8 и 2-5 недель. Экспрессия эритропоэтина была максимальной на втором месяце лактации. В 1-ом, 3-ем, 4-ом и 5-ом месяцах лактации концентрации эритропоэтина в молоке достигали, соответственно, 66,6,74,0,41,6 и 21,6% от максимального уровня, Г-КСФ - 88,37, 11,3 %от максимального уровня. Максимальные и средние концентрации эритропоэтина в молоке коз были достоверно выше по сравнению с Г-КСФ.

5. Выявлено укорочение лактационного периода и гнполактня у овец, трансгенных по генной конструкции альфа-81-казеин/химозин. Исследованием гистоструктуры железы установлено, что одной из причин нарушения лактации у трансгенных овец является видоизменения альвеол в заполнении их нерастворимым продуктом. Средний дневной удой и удой за лактацию у трансгенных овцематок был, соответственно, в 4,3 н 26 раз ниже по сравнению с контрольными аналогами.

6. Гормональная индукция лактации позволила удлинить период лактации в среднем до 27 дней и повысить удой за лактацию в 2 раза до 7,9 литров. Исследование белкового состава молока трансгенных и контрольных овец при приблизительно равном содержании общего белка (соответственно, 4,69 и 4,47%) выявило значительные различия в соотношении казеиновой и сывороточной фракций. Содержание казеина и сывороточных белков в молоке трансгенных овец составляло, соответственно, 34,3 и 65,7% от общего белка, в то время как у контрольных овец - 80,3 и 19,7%.

7, Установлено, что активность химозина в молоке овец сильно варьировала, у отдельных животных в ходе лактации. Максимальная активность (20,9СРи/мл) отмечалась в первую декаду лактации, после чего она начинала падать и во вторую и третью декады лактации составляла, соответственно,^ и 10,9 СБи/мл.

Практические предложения.

При создании трансгенных коз с молекулярной трансформацией молочной железы, рекомендуем использовать выявленные нами оптимальные с точки зрения уровня интеграции и экспрессии трансгена стадии введения клеток-упаковщиц на 4,5 месяце беременности.

В качестве приема повышения продуктивности овец, трансгенных по генной конструкции альфа-81 -казеин/химозин, рекомендуем гормональную индукцию лактацн» препаратами эстроген-прогестерон в фирменном приготовлении по соответствующей прописи введения.

Список опубликованных работ.

1. Гвоздь И.М., Титова В.А., Зиновьева Н.А., Чабан И.М., Эрнст Л.К. Оценка эффективности использования ретровирусных векторов для переноса экзогенных генов в молочную железу козУ/Материалы международной конференции «ДНК —технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных»-ВИЖ,—2001.-С. 105-106

2. Гвоздь И.М, Изучение закономерностей соматического переноса генов в молочную железу козУ/ Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентно способности животноводства и задачи кадрового обеспечения»- Быково.-2002.-С. 97.

3. Гвоздь И.М. Создание соматических трансгенных коз- продуцентов эритропоэтина человекаУ/ Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных»-ВИЖ-2002.-С. 106-109.

4. Гвоздь И.М. Об использовании ретро вирусньи векторных конструкций для интеграции чужеродных генов в клетки молочной железы коз //Сельскохозяйственная биология.- 2002,- №6. -С. 59-60. /

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, л. Дубровины Тел. (8 - 27) 65-14-24. (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 21.04.2003. Подписано в печать 22.04.2003 Заказ № Ю. Печ. л. 1,1. Тираж 80 зкэ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гвоздь, Инна Михайловна

Введение

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генно-инженерные технологии - новый путь развития 8 животноводства.

1.2 Методы получения трансгенных животных

1.3 Ретровирусы как векторы для переноса экзогенных 11 генов.

1.3.1. Жизненный цикл и строение ретровирусов.

1.3.2. Ретровирусные векторы.

1.4 Экспрессия чужеродных генов в молочной железе 19 трансгенных животных.

1.4.1. Производство рекомбинантных белков.

1.4.2. Химозин.

1.4.3. Эритропоэтин: биология, функции, методы 25 получения.

1.4.4. Биология, функции, получение и применение 29 гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ).

1.5. Выбор вида животных-продуцентов биологически 31 активных веществ.

1.5.1. Козы как продуценты рекомбинантных белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз и овец"

Актуальность темы. Повышение эффективности животноводства на современном этапе связано с разработкой новых биологических приемов, направленных на изменение генома сельскохозяйственных животных. По характеру локализации трансгена в организме животных трансгенные индивидуумы могут быть подразделены на два типа: генеративные и соматические. В зависимости от целей эксперимента, научный и практический интерес представляет получение обоих типов трансгенных животных.

Перспективным приемом соматического переноса генов является использование ретровирусных векторов [Титова В.А.,2001, Волкова Н.А. ,2002]. Их способность переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся клеток, например, в секреторные клетки молочной железы, позволят экспрессировать рекомбинантный продукт с молоком. Это делает возможным получение белков, имеющих фармакологическое значение. Молочная железа трансгенных животных является идеальным источником производства рекомбинантных белков. Кроме того, молоко, содержащее рекомбинантные белки, имеет высокий гигиенический стандарт и может быть легко извлечено с использованием имеющихся технологий [Зиновьева Н.А. и др.,2001].

По сравнению с бактериальными и примитивными эукариотическими системами в молочной железе трансгенных животных выполняются большинство посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков (гидроксилирование, гликозилирование, у-карбоксилирование), происходит правильная складчатость белков, требующаяся для проявления их биологической активности. Актуальным является проведение исследований по изучению закономерностей и оптимизации экспрессии рекомбинантных белков в молоке трансгенных сельскохозяйственных животных. Изучение факторов, влияющих на уровень синтеза рекомбинантных белков с молоком трансгенных коз и овец позволит повысить эффективность трансгенных технологий в животноводстве.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение закономерностей и оптимизация экспрессии рекомбинантных белков в молоке соматических и генеративных трансгенных животных.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить соматических трансгенных коз методом инъекции клеток-упаковщиц, продуцирующих генные конструкции эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

2. Изучить эффективность трансформации клеток вымени коз на уровне ДНК.

3. Выполнить анализ экспрессии рекомбинантного эритропоэтина (ЭПО) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в молоке коз в ходе лактации.

4. Дать сравнительную оценку эффективности экспрессии рекомбинантных белков в молоке коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц, периода лактации и генной конструкции (ЭПО, Г-КСФ).

5. Выполнить исследования молочной продуктивности, состава молока и активности рекомбинантного химозина в молоке трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации.

6. Изучить структуру тканей вымени трансгенных овец и коз по сравнению с контрольными.

Научная новизна.

Впервые изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и эритропоэтина человека, выявлена локальная трансформация молочной железы коз. Исследована динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в молоке опытных животных в течение лактации. Установлено влияние лактации, времени введения генных конструкций в молочную железу животных на уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком. Изучена продуктивность и уровень синтеза рекомбинантного химозина с молоком трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации. Практическая значимость.

Показана возможность использования ретровирусных векторов для получения соматически трансгенных коз-продуцентов рекомбинантных белков. Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком.

Показана возможность использования индуцированной лактации для повышения молочной продуктивности, получения большего количества рекомбинантного химозина с молоком трансгенных овец. Основные положения, выносимые на защиту.

•Получены соматически трансгенные козы- продуценты эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека. •Установлен уровень и характер синтеза рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз в ходе лактации.

•Выявлены факторы, влияющие на эффективность получения соматических трансгенных коз.

•Изучена молочная продуктивность и активность химозина в молоке трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых ВИЖа (2001); на международной научной конференции «Актуальные проблемы ДНК-технологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных» (2002); на конференциях отдела биотехнологии ВИЖа (2001, 2002).

Публикации результатов исследования.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 12 таблиц и 15 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы, который включает 156 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гвоздь, Инна Михайловна

Выводы

1. Получены соматические трансгенные козы посредством инъекции в молочную железу клеток упаковщиц, продуцирующих ретровирусные генные конструкции эритропоэтина (pLNa) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, Г-КСФ (pLN-G-CSF).

2. Показаны различия в эффективности трансформации клеток вымени коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц и от используемой генной конструкции. С увеличением срока сукозности от 3,5 до 4,5 месяцев наблюдалось повышение степени трансформации клеток вымени коз от 42,0 до 65,6% для генной конструкции pLNa и pLN-G-CSF, соответственно, от 0 до 46,8% и от 42,0 до 65,6%.

3. Установлена экспрессия эритропоэтина и Г-КСФ в молоке опытных животных (п=12); Максимальный уровень экспрессии эритропоэтина в сыворотке молока коз составлял 300-400 нг/мл, Г-КСФ - 200 нг/мл при среднем содержании белков, соответственно, 162±19 и 37±6 нг/мл.

4. Выявлено влияние стадии введения клеток-упаковщиц, дня лактации и вида генной конструкции на уровне экспрессии рекомбинантных белков в молоке соматических трансгенных коз. При инъекции клеток-упаковщиц в 3,5, 4 и 4,5 месяцев беременности содержание эритропоэтина в молоке составляло в среднем 126±21,134,5±15,5 и 192±21,3 нг/мл, Г-КСФ - 11,1±2,5, 37,9±7,5 и 62,6±9,5 нг/мл. Наибольший пик активного синтеза эритропоэтина и Г-КСФ у исследованных животных наблюдался, соответственно, впервые 3-8 и 25 недель. Экспрессия эритропоэтина была максимальной на втором месяце лактации. В 1-ом, 3-ем, 4-ом и 5-ом месяцах лактации концентрации эритропоэтина в молоке достигала, соответственно, 66,6, 74,0, 41,6 и 21,6% от максимального уровня. По Г-КСФ 88, 37, 11,3 % от максимального уровня. Максимальные и средние концентрации эритропоэтина в молоке коз были достоверно выше по сравнению с Г-КСФ.

5. Выявлено укорочение лактационного периода и гиполакгия у овец, трансгенных по генной конструкции альфа-Si-казеин/химозин. Исследованием гистоструктуры железы установлено, что одной из причин нарушения лактации у трансгенных овец является видоизменения альвеол в заполнении их нерастворимым продуктом. Средний дневной удой и удой за лактацию у трансгенных овцематок был, соответственно, в 4,3 и 26 раз ниже по сравнению с контрольными аналогами.

6. Показано, что гормональная индукция лактации позволила удлинить период лактации в среднем до 27 дней и повысить удой за лактацию в 2 раза до 7,9 литров. Исследование белкового состава молока трансгенных и контрольных овец при приблизительно равном содержании общего белка (соответственно, 4,69 и 4,47%) выявило значительные различия в соотношении казеиновой и сывороточной фракций. Содержание казеина и сывороточных белков в молоке трансгенных овец составляло, соответственно, 34,3 и 65,7% от общего белка, в то время как у контрольных овец - 80,3 и 19,7%.

7. Установлено, что активность химозина в молоке овец сильно варьировала, у отдельных животных в ходе лактации. Максимальная активность (20,9СРи/мл) отмечалась в первую декаду лактации, после чего она начинала падать и во вторую и третью декады лактации составляла, соответственно, 18 и 10,9 CFU/мл.

Практические предложения.

При создании трансгенных коз с молекулярной трансформацией молочной железы, рекомендуем использовать выявленные нами оптимальные с точки зрения уровня интеграции и экспрессии трансгена стадии введения клеток-упаковщиц на 4,5 месяце беременности.

В качестве приема повышения продуктивности овец, трансгенных по генной конструкции альфа-S1-казеин/химозин, рекомендуем гормональную индукцию лактации препаратами эстроген-прогестерон в фирменном приготовлении по соответствующей прописи введения.

1.6. Заключение.

В настоящее время во всем мире интенсивно ведутся научные исследования по получению трансгенных животных. При решении данной задачи исследователи сталкиваются с проблемой использования тех или иных методов переноса генетического материала в реципиентную клетку.

На сегодняшний день разработано много методов переноса чужеродных генов в геном сельскохозяйственных животных. При выборе метода необходимо учитывать, что каждый из них обладает как определенными преимуществами, так и недостатками.

Одним из самых распространенных и широко используемых методов трансгенеза в животноводстве является метод микроинъекции. Однако относительно низкая частота появления трансгенных особей требует использования в эксперименте значительного числа животных [Gordon J.W et al 1987]. В этой связи, возникает вопрос о разработке более эффективных способов получения генетически модифицированных животных.

Среди различных методов трансформации наиболее удобными для введения и экспрессии клонированных генов в клетки млекопитающих являются ретровирусные векторы. Несмотря на то, что чужеродные гены можно вводить в клетки животных в составе ДНК многих вирусов, лишь ретровирусы способны обеспечить стабильную высокоэффективную интеграцию этих генов в геном.

Развернувшиеся исследования в области молекулярной и клеточной генетики, а также развитие биотехнологии животных позволяет преобразовать животноводство в стабильный источник производства широкого спектра веществ, обладающих фармакологическими и иными полезными свойствами.

Открывается возможность трансформации клеток молочной железы взрослых животных и получения, таким образом, биопродуцентов важных в медицинском отношении белков. Мы в своей работе в качестве биопродуцентов использовали коз, молоко которых является доступным исходным сырьем для выделения нужных продуктов, входящих в его состав.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу проводили в отделе биотехнологии с 2000 по 2003 гг. по плану НИР ВИЖа, согласно приведенной схеме исследований (рис.1).

В качестве опытных животных служили 12 коз зааненской породы; 6 овец цигайской породы полученных путем микроинъекции в мужской пронуклеус зигот генной конструкции альфа-Згказеин/прохимозин [Эрнст JI.K. и др., 1995]. Животных содержали на территории физиологического двора ВИЖа. В работе были использованы рекомбинантные ретровирусные векторы pLNa и pLN-G-CSF, полученные на основе вируса лейкемии мышей Молони и помещенные в пакующую линию клеток АМ12. Вектор pLNa содержит к ДНК эритропоэтина человека, ретровирусный вектор pLN-G-CSF - кДНК гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека под контролем промотора aSi-казеина крупного рогатого скота.

Содержание и кормление коз и овец осуществляли согласно технологии, принятой на физиологическом дворе ВИЖа.

В течение лактации от опытных животных отбирали пробы молока. ДНК выделяли посредством солевой экстракции [Miller S.A., 1988] и щелочного лизисного буфера [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК определяли методом ПЦР. Динамику экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке коз изучали методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) [Волкова Н.А. и др.,2002]. Уровень Г-КСФ в молоке определяли с помощью набора ProCon-G-CSF (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург).

Образцы тканей молочной железы были зафиксированы в 10% формалине и залиты в парафин (Б. Ромейс, 1953). Гистологические срезы готовили на санном микротоме. Окрашивали срезы гематоксилин -эозином. Микроскопию и микрофотографирование проводили под микроскопом «Микрофот», объективы 6,5х и20х. С целью оценки влияния инъекции на структуру вымени проводили гистологические исследования при участии профессора Шихова ИЛ.

С целью установления способности прохимозина к отщеплению N-пептида и переходу в псевдохимозин и химозин выполняли активирование прохимозина в молоке трансгенных животных по методике, описанной Зиновьевой Н.А. и др. [1996].

На всех этапах исследований в качестве контроля использовали не трансгенных животных, которых отбирали по принципу аналогов (порода, возраст, живая масса, общее развитие).

Рис.1 Схема исследований

2.1. Реактивы и оборудование. Реактивы

Название Фирма Страна

1. ABTS Sigma США

2. Агароза L ifeTechnologies США

3. Борная кислота Roth Германия

4. Бромид димидия Boehringer Германия

5. BSA - бычий сывороточный альбумин Sigma США

6. Гидроксид натрия Merk Германия

7. Двузамещенный фосфат натрия Диа-М Россия

8. Додецилсульфат натрия (SDS) Serva США

9. Дитиотреитол (ДТТ) Boehringer Германия

Ю.Изоамиловый спирт Merk Германия

11 .Лимонная кислота Диа-М Россия

12.0ФД - о-фенилендиамин Sigma США

13.Протеиназа К Диа-М Россия

14.Смесь дНТФ Pharmacia-Biotech Швеция

15.Соляная кислота Merk Германия

16.Сульфат аммония Merk Германия

17.Taq-пoлимepaзa Диалат Россия

18.Твин-20 Диа-М Россия

19.Трисгидроксиметиламинометан (Трис) Roth Германия

20.Уксусная кислота Merk Германия

21 .Хлорид натрия Roth Германия

22.Хлорид магния Merk Германия

23 .Хлороформ Roth США

24.Этилендиамидтетрауксусная кислота Merk Германия

ЭДТА)

Оборудование.

Название Фирма Страна

1. Амплификатор Cyclotemp СТМ Россия

2. Амплификатор Amply 4L-50 Biokom Россия

3. Бидистиллятор Millipore Франция

4. Водяная баня Bio-Rad США

5. Источник тока Life Technologies США

6. Источник ультрафиолетового света Pharmacia Швеция

Biotech

7. Прибор для вертикального электрофореза Bio-Rad США

8. Прибор для горизонтального электрофореза Life Technologies США

9. Термостат Bio-Rad США

10.Фотометр «DYNATECH MR5000» Life Technologies США

11 .Центрифуга для пробирок типа Eppendorf Eppendorf США

Для работы использовали пластиковую посуду и полистирольные микропланшеты со средней сорбционной способностью (Costar, США). Все буферы приготавливали на воде, очищенной на приборе Mil На (Millipore).

2.2. Получение соматических трансгенных коз.

Рекомбинантные ретровирусные векторы pLNa и pLN-G-CSF, предоставлены к.б.н. Фоминым И.К., Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск. Клетки-упаковщицы были наращены в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИЖа. Клетки -упаковщицы вводили глубоко в паренхиму молочной железы опытных коз (п=12), находящихся на разных стадиях сукозности. Три козы имели срок сукозности 3,5 месяца, четыре - 4 месяца, пять коз - 4,5 месяца. Содержание и кормление коз и овец осуществляли согласно технологии, принятой на физиологическом дворе ВИЖа.

Перед введением в молочную железу клетки-упаковщицы предварительно оценивались на наличие рекомбинантной вставки методом ПЦР. Каждому животному было введено от 10 до 20 млн. клеток.

2.3. Подготовка и отбор проб молока у трансгенных коз и овец.

Использование трансгенных животных в биотехнологических целях перспективно, если рекомбинантная генная конструкция эффективно экспрессирует.

Для определения наличия рекомбинантной ДНК и определения уровня экспрессии отбирали пробы молока соматических трансгенных коз. Отбор проб проводили в утренние часы. Определение тканеспецифичной экспрессии в молочной железе проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве отрицательного контроля использовали молоко не трансгенных коз.

Молоко от лактирующих животных получали ручным сдаиванием; охлаждали, набирали в 1,5 мл. пробирки центрифугировали 5 мин.при 4 тыс.обр/мин., отделяли жир. Пробы хранили при -20° С.

2.4. Методика экстракции ДНК

ДНК выделяли из молока методом щелочного лизисного буфера [ Зиновьева Н.А. и др., 1998]

Используемые реагенты .

Буфер ТЕ ( хранить при комнатной температуре) ЮмМ Трис- НС1, рН=7,5; 1мМ ЭДТА, рН=8,0. Щелочной лизисный буфер, ALL (хранить при -20° С) 200 мМ КОН; 50мМ дитиотриэтол (ДТТ). Нейтрализационный буфер, NL (хранить при -И°С) 900мМ Трис- НС1, рН=8.3; ЗООмМ KCL; 200 мМ HCL.

2 мл охлажденного или оттаянного молока помещают в 2 мл центрифужные пробирки и центрифугируют при 3500 об/мин 3-5 мин при +4°С для осаждения клеток, удаляют жировую и жидкую фазы, оставляя при этом на дне пробирки осадок клеток. Осадок промывают буфером ТЕ.

Буфер ALL 10 мкл добавляют к осадку соматических клеток молока. Пробы инкубируют при 60° С в течение 30-45 мин. Затем лизать охлаждают, центрифугируют в течении нескольких секунд для осаждения конденсата и добавляют равный объём (10 мкл) нейтрализационного раствора NL. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания или с помощью пипетки, после чего пробирки вновь центрифугируют при 15000 об/мин 1 мин для осаждения нелизированых остатков. Для ПЦР используют 1 мкл лизата клеток.

Метод солевой экстракции, солевой экстракции [Miller S.A., 1988] и

Гомогенизированный буфер (хранить при комнатной температуре)

160 мМ сахароза; 80 мМ ЭДТА, рН=8,0; 100 мМ Трис-HCL, рН=8,0; 0,5%SDS.

Раствор NaCL (хранить при комнатной температуре) 4,5 М NaCL

CIA (хранить при +4° С)

Смешать 24 об. хлороформа с 1 об. изоамилового спирта.

Буфер ТЕ (хранить при комнатной температуре)

10 мМ Трис- HCL, рН=7,5; 1 мМ ЭДТА, рН=8,0.

К осадку соматических клеток добавляют 200 мкл гомогенизационного буфера с добавлением протеиназы К (20мг/мл) до конечной концентрации 0,5-0,1 мг/мл и инкубируют при 60-65° С 8-12 часов. К клеточному лизату добавляют 1 об.(200 мкл) 4,5 М NaCL и хорошо перемешивают. Затем добавляют 0,75 об.(300 мкл) CIA и после интенсивного смешивания (3-5 мин) центрифугируют 5 мин при 15000 об/мин.

Верхнюю ДНК содержащую фазу переносят в чистую пробирку, добавляют 2.5 об. 100% этанола для осаждения ДНК. В случае отсутствия шарика ДНК центрифугируют 2-3 мин при 15000 об/мин. После визуализации шарика удаляют надосадочную жидкость, добавляют 0,5-1,0мл 70% этанола (охлажденного до -20 °С) и инкубируют 5-10 мин при комнатной температуре. После удаления этанола шарик высушивают в течение 30-40 мин при комнатной температуре и ресуспендируют в 50-ЮОмкл дистиллированной воды или буфера ТЕ. Концентрацию ДНК, полученную методом солевой экстракции, и степень ее очистки определяли по методике, описанной Н.А. Зиновьевой и др. [1998].

Наличие рекомбинантной ДНК определяли методом ПЦР. С целью оценки влияния инъекции на структуру вымени были проведены исследования гистологических срезов ткани.

2.5. Анализ животных на наличие рекомбинантной вставки.

Для контроля степени очистки ДНК определяли соотношение оптической плотности раствора при длине волны 260 нм и 280 нм (OD260/OD280).

Для доказательства трансгенности использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) представляет собой метод энзиматической амплификации специфических участков ДНК in vitro [Saiki et al 1988], a несколько позднее вследствие применения термостабильной Tag-полимеразы метод был упрощен и автоматизирован. Количество выбранного

8 9 участка ДНК в ходе ПЦР может быть увеличено в 10-10 раз, что делает возможным его визуализацию. Метод ПЦР нашел применение во многих областях, таких как мутагенез ДНК in vitro, генетический фингерпринтинг, прямое секвенирование геномной ДНК и кДНК, определение присутствия инфекционных агентов, диагностика пола предимплантационных эмбрионов, пренатальный диагноз наследственных болезней, анализ различных аллельных вариантов ДНК.

Для выполнения ПНР используют два синтетических олигонуклеотидных праймера (обычно одноцепочные фрагменты ДНК длиной 18-22br), представляющие собой концевые последовательности интересующего фрегмента ДНК, благодаря которым ограничивается участок ДНК, который будет многократно скопирован ферментом Tag-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3'- концам праймеров и достраивающей их до заданной длины в несколько сот или тысяч пар оснований. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплиментарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой.

В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента по формуле 2П, где п -число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции-фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'- концами праймеров на исследуемом участке ДНК[24]. Праймеры в ПЦР служат начальными пунктами (затравками) синтеза ДНК термостабильной Tag- полимеразой, которая в присутствии ионов Mg2+ катализирует синтез новой цепи ДНК из дезоксирибонуклеотид трифосфатов (дНТФ) в направлении 5' —>3'.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объёме 20 мкл., применяя следующую инкубационную смесь: х10 буфер для ПЦР (166,7мМ (NH4)2S04; ЮОмМ Трис-HCl, рН=8,3; 1,5мМ MgCl2; 0,1% Tween 20); 0,2мМ dNTP, 25 пк мол каждого из праймеров, 1 ЕД Taq полимеразы. ДНК для анализа брали в объёме 1,0 мкл.

Последовательности используемых праймеров приведены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гвоздь, Инна Михайловна, Дубровицы

1. Альков Г.Л. Современное состояние и перспективы развития козоводства. Овцы, козы. «Шерстяное дело» № 1 2002 С. 9-14.

2. Альтштейн А.Д. Вирусные инфекции и генетическая инженерия // Биотехнология. -1987.-Т.З.- № 3.-С.276-282.

3. Алыптеин А.Д. Семейство Papovaviridae. Общая и частная вирусология Т.2// Под редакцией В.М. Жданова, С.Я. Гайдамович.- М Медицина.-1982.-С.463-477.

4. Бакулев А.Н. Большая медицинская энциклопедия. Т. 35 с. 766-770.

5. Баранов B.C., Гапала И., Грияч П.// Цитология и генетика.-1990.-Т.24.-№ 3.С. 3-27.

6. Богатырев А.Н., Эрнст Л.К. Генная инженерия сельскохозяйственных животных мощный рычаг селекции XXI века // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные/Сб. науч. тр. - 1995.- Вып.1,- С. 313.

7. Брем Г. Зиновьева Н. Эрнст Л.К. Генные фермы -новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // сельскохозяйственная биология- 1993 № 6 с 3-27.

8. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве // М. -РАСХН.- 1995.-326 С.

9. Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Сологуб В.К. и др. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных // Сельскохозяйственная биология.-1995.- №.4,- С.94-100.

10. Волкова Н.А. Интеграция и экспрессия экзогеннов в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованиемретровирусных векторов. Автореферат канд. Биол. Наук. Дубровицы 2002

11. Газарян К.Г., Тарантул В.З. Экспериментальный перенос генов в соматических клетках млекопитающих // Успехи современной биологии. 1981.-Т.92.-№ 2 -С. 163-179.

12. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных.- М.: Агропромиздат. 1990.-511С.

13. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. Наука.1989.- С.351.№10

14. Гловер Д Клонирование ДНК. Методы.- М: Мир-1988.-538С.

15. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. // М.: Мир.-1989.-368 С.

16. Гольдман И.Л., Разин С.В., Эрнст Л.К. и др. Молекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных // Биотехнология 1994.- №.2,- С.3-8.

17. Гоголевский П., Гольдман И., Гусев В. и др. Исследование экспрессии гена В-галактозидазы в трансгенных ранних эмбрионах кроликов // Доклады ВАСХНИЛ.- 1991.- №.10.- С.38-42.

18. Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А. Прогрессивная технология получения трансгенных овец // Докл. РСХА 1992.- №.9-10,- С.25-30.

19. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Гоголевский П. и др. Теоретическиевопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные / Сб. науч. Тр. Вып.1,- 1995,- С.93-102.

20. Дыбан А.П., Городецкий С.И., Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии.- Л.: Наука.-1985.-С.84-93.

21. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Интродукция в геном млекопитающих чужеродных генов пути и перспективы. Молекулярные и клеточные аспекты Л. Наука 1986 С. 82-97.

22. Жданов Р.И., Семенова Р.И., Арчаков А.И. Реальность и надежды генной терапии. // Вопросы медицинской химии. -2000.- № 3 .

23. Зиновьева Н. А., Эрнст Л.К. ,Попов А.Н., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // Дубровицы-.-1998.-47С.

24. Зиновьева Н.А., Л.К. Эрнст, Г. Брем. Трансгенные животные и возможности и использования. Молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве. ВИЖ 2001г. 128 С.

25. Иванова Л.Б. Создание векторов для тканеспецифической экспрессии генов эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе животных / Автореферат дис. Канд. Биолог, наук. Боровск.2002г. 23С.

26. Ларионов О. А., Добровольский В.Н., Лагутин О.В. Создание трансгенных мышей, синтезирующих гамма интерферон человека в молочной железе и секретирующих его в молоко // Тезисы докладов

27. VI конференции Российской федерации « Новые направления биотехнологии».- Пущино.-1994.С. 127.

28. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э Общая вирусология,- М Мир,-1984.-680 С.

29. Манианис Т., Фрич Э. Молекулярное клонирование. М.: Мир. -1985.-489 С.

30. Медведев С.Ю., Козикова Л.В., Бавин В.Г., Яковлев А.Ф. Рост и развитие трансгенных кроликов и свиней с перенесенным геном релизинг-фактора гормона роста человека // Сельскохозяйственная биология,- 1995.- №.6.- С.43-48.

31. Муромцев Г.С., Бутенко Р., Г., Тихоненко Г.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии // Москва. 1990.

32. На старт выходят генные инженеры. / Наука и жизнь №8 2000 С. 7172.

33. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы — Эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих // Молекулярная биология. 1989.- Т 23. - Вып. 2. - С. 8-12.

34. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы в генной терапии.//Вопросы медицинской химии. 2000. - № 3.C.28-32

35. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. Дубровицы. 1999. -95С

36. Савченкова И.П., Зиновьева Н.А., Булла Й., Брем Г. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использования в получении трансгенных животных // Успехи современной биологии.- 1996.-Т. 116.-№1 -С 78-91.

37. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир, 1998. Т.2. - 362 С.

38. Смирнова О.А., Шилов И.А., Розенкранц А.А., Никитин В.А., Шатский И. Н., Соболев А. С. Секреция светлячковой люциферазы в молоко мышей in vivo // Материалы Международной конференции, посвященной памяти академика Бабаева А.А.- Москва.-1996.-С. 63.

39. Спандидос Д.Уилкин.Н. Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих. В кн.: Трансфенкция и трансляция. Методы. М.: «Мир».-1987.-С 11-64.

40. Стронгин А.Я., Борухов С.И., Богуш В.Г. Природные и генно-инженерные белки сходство и отличия // Биотехнология. - 1987. -№ 3. - С. 325 -331

41. Титова В.А. Молекулярно- генетические аспекты использования реровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве. Автореф. Дисс. канд. Биол. Наук. Дубровицы. 2001 - 22 С.

42. Томилин Н. В. Новые системы генетической трансформации соматических клеток // Биотехнология. — 1987.- № 3 . — С. 325-331.

43. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В., Кочиева Е.З., Прокофьева М.И., Новикова Н. Н. Ковалев В.М., Калашников Д.В. Сельскохозяйственная биология.

44. Шихов И.Я. Структурные изменения в молочной железе трансгенных по по химозину овец. ДНК технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных. Дубровицы 2001г.С 98-100

45. Эрнст Л.К. Животноводство 21 век /информационный бюллетень в животноводстве,-1998г.№1 С 6-7.

46. Эрнст Л.К., Брем Г., Зиновьева Н. Генно-инженерные технологии — новый путь развития животноводства// Зоотехния.- 1994.- №.5.- С.2-4.

47. Alexander L.J., Stewart A.F., Nacrinlay A.G., Kapelinskaya T.V., Trfch T.M. and Gorodetsky S.I. / Isolation and characterisation of the bovine kappa-casein gene. Eur.J. Biochem.- 1988.-V.178.-P.395-401.

48. Ali S. and Clark A.J./ Characterization of the gene encoding ovine (3-lactoglobulin // J. Mol. Biol.-1988.-V. 199.-P. 415-426.

49. Andren A.Production of prochymosin, pepsinogen and progastricsin, and their cellular and intracellular localisation in bovine abomasal mucosa //scand. J. Clin. Lab. Invest. -1992.-V. 52.- Suppl. 210.-P.59-64.

50. Asato N., Rand A.G. Fractionation and isolation of multiple forms of prorennin(prochymosin)//Biochem. J.-1972.-V. 129. -P.841-846.

51. Asato N., Rand A.G/ Activation studies of the multiple forms of prochymosin (prorennin) // Biochem. J.- 1972. -У167.-Р. 429-434.

52. Bawden W.S., Passey R. J., Mackinlay A.G. The genes encoding the major milk-specific proteins and their use in transgenic studies and protein engineering // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 1994.-V. 12.- P. 89-137.

53. Bayna E.M., and Rosen J.M7 Tissue-specific, high level expression of the rat whey acidic protein gene in transgenic mice // Nucleic Acids Res.-1990.-V. 18.-P.2977-2985.

54. Behringer R.R., Ryan T.M., Reilly M.P. et.al. Synthesis of functional hyman hemoglobin in transgenic mice // Science 245,- 1989.- P.971-973.

55. Bishop J., Smith R. Mechanism of chromosomal integration of microinyection DNA // Mol. Biol. Med. 1989.- V.6.- P.283-298

56. Bonsing J., Ring J.M., Stewart A.F. and MacKinlay A.G./ Complete nucleotide sequence of bovine (3-casein gene // Abst. J.Biol. Sci.-1988.-V.41.-P. 527-537.

57. Bowerman В.,Brown P.O., Bishop J.M. A nucler protein complex mediates the integration of retroviral DNA // Genes Dev.-1989.-V.3.-P/469-478.

58. Brem G. Interifance and tissue-specific expression of transgenes in rabbits and pigs // Mol. Deprod. and. Dev.- 1993.- 36.- N.2.- P.242-244.

59. Brem G. Production of transgenic mice, rabit and pigs by microinjection into pronuclei // Zuchtyniene.- 1995.- V.20.- N.5.- P.134-139.

60. Brem G., Besenfelder U. and Harti P. / Production of foreign proteins in the mammary glands of transgenic mamels // Chimia oggi (International Journal of Chemistry and Biotechnology).- may 1993. -P.21-25.

61. Brem G., Brening В., Goodman H.M. et.al. Production of transgenic mice, rabbits and pig by microinjection into pronuclei // Zuchthug.- 1985,- V.20.-P.251-252.

62. Brem G., Muller M. Large transgenic mammals // Animals with novel genes / b;y Ed.N.Maclean.- Cambridge University Press.- 1994.- P. 179-224.

63. Bushman F.D., Craigie R. Sequence requirements for inegration of Molone у murine leukemia virus DNA in vitro // J. Virology.-1990.-V.64.-P.5645-5648.

64. Campbell S.M., Rosen J.M., Hennighausen L.G.,Strech- Jurk U.and Sippel A.E. / Comparison of the whey acidic protein genes of the rat and mouse // Nucleic Acids Res.12.-P 8685-8697.

65. Chamberlin M., Ryan Т./ Bacteriophage DNA-depend RNA polymerase.In: The enzymes, Vol. XVP.(Boyer ed.), Academic Press.-1982.-NY: 87-108.

66. Church R.B. Embryo manipulation and gene transfer in domestic animal. Trends -Biotechnol. 5,- 1987.-P.13-19.

67. Clark A., Bissinger P., Bullock D. et.al. Chromosomal position effects and modulation of transgene expression // Reprod. Fertil. Dev. 1994.- V.6.- N.5.-P.589-598.

68. Coffin J., Weiss R., Teich N. RNA Tumor Viruses Varmus H Cold Spring Harbor Laboratory.- New York 1984.- V. 2.- P .36.

69. Colbere-Garapin F.Ryhiner M.L., Garapin F.C. Expression and integration of exogenous DNAsequences transfected into mammalian celles.Adv. Res. Anim. Cell. Technol.:Proc. Nato Adv.Res. Worshop Sept.21-24.1987. Dordrecht etc.-1989.-P261-268.

70. Cone R.D., Mulligan R.C. High-efficiency gene transfer into mammalian cells: generation of helper free recombinant retrovirus with broad mammalian host range // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984.-V.81- P. 6349-6359.

71. Dale T.C., Krnacik M.J., Schmidhauser C.,Yang C>L.-Q., Bissel M.J., and Rosen J.M./ High-level expression of the rat whey acidic protein gene is mediated by elements in the promotor and 3' untranslated region // Mol.Cell. Biol. 12.-1992.-P. 905-914.

72. Donehower L.A., Huang A. L., Hager G.L. Regylatory and coding potential of the mouse mammary tumor virus long terminal redundancy // J. Virology.-1981. -V.37.- H.226-238.

73. Drohan W.N., Zhang D.W., Paleyanda R.K., Chang R., Wroble M., Velander W., Lubon H. Inefficient processing of human protein С in the mouse mammary gland // Transgenic Res. -1994. -V. 3.-P. 355-364.

74. Ebert K.M., Selgrath J.P., Ditullio P., Denman J., Smith Т.Е./ Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression // Bio/Tech.-1991.-V.9.-P. 835-838.

75. Evans M ., Bradley A., Robertson E J. Genetic manipulation of the mammalion ovum and early embryos // Bandbury Report.- Gold Spring Harbor, New York, 1985.

76. Evans M.J. and. Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature 292.- 1981.- P. 154-156.

77. Foltman В., Pedersen V.B., Jacobsen H., Kauffman D., Wybrandt G. The complete amino asid sequence of prochymosin //Proc.Natl. Acad. Sci. USA.-1977.-V. 74.-P. 2321-2324.

78. Foltman B.,Prochimosin and chymosin (prorenin and rennin) // Methods in Ensymol. 1970.-V.19.-P. 421-436.

79. Foltmann B. Gastric proteinases: structure, function, evolution and mechnism of action//Essays Biochem.-1981. Y.17. -P. 52- 84.

80. Fujiwara Т., Mizuuchi K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate // Cell.- 1988. V .54.- P.497-504.

81. Gavora J.S., Benkel В., Sasada H. et.al. An attempt at sprem mediated gene transfer in mice and chikens // Can.J. Anim.Sci. 71.-1991.- P.287-291.

82. Gordon J.W., Lee E., Vitale J. A. et.al. Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk // Biotechnology 5.- 1987.- P.l 183-1187.

83. Graham F.L., Van der Eb. A.J.Anew Technique for the assay of infectivty of human adenovirus 5 DNA // Virylogy.- 1973.-V52.-P456-467.

84. Graham F.L.Bacchetti S., Mc Kinnan R. Transformation of mammalian celles with DNA using the calcium technique. In: Introduction of macromolecules into lviable mammalian cells (Ed.by Baserga R.et.al.)New York .-1980.-P. 3-25

85. Hall L., Emery D.C., Davies M.S., Parker D. and Craig R.K./ Organization and sequence of the human alfalactalbumin gene // Biochem. J.242.-1987.-P.735-742.

86. Hammer R.E., Palmiter R.D., Brinster R.L. Partial correction of murine hereditary growth disorder by germline incorporation of a new gene // Nature.-V.311.- 1984.- P.65-67

87. Hammer R.E., Pursel V., Rexroad C. et.al. Production of transgenic rabbits sheep and pigs by microinjection // Nature.- 1985.- V.315.- P.680-683

88. Harris S., Ali S., Anderson S., Archibald A. L. and Clark A.J./ Complete nucleotide sequence of the genomic ovine P-lactoglobuline gene // Nucleic Acids Res. 16.-1988.-P. 10379-10380.

89. Hanemaaijer R., ArtsJ Koostra T et al.Plasminogen activator relation studies following transfection of human endothelial ctlles //Fibrinolysis. -1994.V.8. -#2.P. 19-21.

90. Heninghausen L.G. / The mammary gland as a bioreactor production of foreign proteins in milk // Protein Expression abd Purification.-1990.-V. 1 .-P.3-8.

91. Heninghausen L.G. and Sippel A.E. / Mouse whey acidic protein is a novel member of the family of "four-disulfide core" proteins // Nucleic Acids Res. 10.1982. -P. 2677-2684.

92. Hennighausen L. Transgenic factor VIII: the milky way and beyond // Nat Biotechnol. -1997. -V. 15.-P. 945-946.

93. Hirabayashi M., Kodaira K., Takahashi R., Sagara J., Suzuki Т., Ueda M. Transgene expression in mammary glands of newborn rats // mol. Reprod. Dev. -1996. V.43.-P145-149.

94. Hogan В., Costantini F. and Lacy E. Manipulation of the mouse embryo. In: Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 1986.

95. Huzar D., Balling R., Kothary R. et.al. Insertion of a bacterial gene into the mouse germ line using an infections retro virus vector // Proc. Natl. Acad. Sci. 82.- 1985.- P.8587-8591.

96. Jaehner D., Haase K., Mulligan R. et.al. Insertion of the bacterial gpt gene into germ of mice by retro viral infection // Proc. Natl.Acad. Sci. 82.- 1985.- P.6927-6931.

97. Jones W.K., Yu-Lee L.Y., Clift S. M., Brown T. L., and RosenJ.M./ The rat casein multigene family.// J. Biol. Chem. 260.- 1985. -P.7042-7050.

98. Ко J. H. Et al. Production of biologically active human granocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat // Transgenic Reseach / -V. 9.-2000.-P. 215-222.

99. Korhonen Y.P., Tolvanen M., Hyttinen J.M. et al. Expression of bovine beta-lactoglobulin human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits // Eur. J. Biochem. 1997. - V.15. - P.482-489.

100. Kostyo J.L. Rapid effect of growht hormone on amino acid transport and protein synthesis //Ann. N.Y. Acad.Sci.- V.148.- P.284-312.

101. Krimpenfort P., Rademakers A., Eyestone W., van de Schans A., Kooiman P., Kootwijk E., Platenburg G., PieperF. Generation of trasgenic dairy cattle using "in vitro " embrio prodauction // Bio/Technology. -1991. -V.9.-P. 844-847.

102. Laird J.E., Jach L., Hall L., Boulton A.P., Parker D. and Craig R.G. / Structure and expression of the quineapid a- lactalbumin gene // Biochem. J.254.-1980.-P.85-94.

103. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio Y.M. et.al. Sprem cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57. -1989.- P.717-723.

104. Lee K.F., DeMayo F.J., Atiee S.H., Rosen J.M./ Tissue -specific expression of the rat (3-casein gene in transgenik mice // Nucleic Acids Res, 16.-1988.-PI037-1041.

105. Maga E.A., Murray J.D. Mammary gland expression of transgenes and thepotential for altering the properties of milk // Biotechnol. 1995.-V. 13.- P. 1452-1457.

106. Martin J.B. Neural regulation of growth hormone secretion // New. Engl. S. Med.-1978.-V. 228-P1384-1388

107. Mannino R.J. and Gould-Fogerite S. Liposome mediated gene transfer // Bio Technigues 6.- 1988.- P.682-690.

108. Mansour S.L. Gene targeting in mouse embrionic stem cells: introduction of specific alteration into the mammalian genome II Gene-Anal. Tech. 7.- 1990.-P.219-227.

109. Mansour S.L., Thomas K.R. and Capecchi M.R. Diruption of the proto-oncogene int -2 in the mouse embrio derived stem calls; a general strategy for targeting mutations to nonselectable genes // Nature 336. - 1988.- P.348-352.

110. Massoud M., Attal J., Thepot D. et al. The deleterious effects of human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits // Reprod. Nutr. Dev. 1996. - V.36. - P.555-563.

111. Mehtali N., LeMeur V., Lathe R. The methylationfree ststus of a houskeeping transgene is lost at high copy number // Gene.- 1990.- V.91.- P.l79-184.

112. Miller AD et al. Construction and properties of retrovirus packaging cells based on gibbon ape leukemia virus J. Virol. 65: 2220-2224, 1991

113. Miller AD and Rosman GJ Improved retroviral vectors for gene transfer and expression BioTechniques 7: 980-990, 1989

114. Mizuuchi K., Craigie R. Stereochemical course of the HIV DNA strand transfer reaction: evidence for a one step transesterification mechanism // RNA tumor Virus Meeting.-1991.- V.23.- P.23.

115. Mowlem a. Milk and meat production from goats. Gjat Veter. Soc.J. 1985. 6.1 32-37.

116. Ninomiya Т., Harabayashi M., Sagara J., Yuki A. Functions of milk protein gene 5' flanking regions oh human growth hormone gene // mol. Reprod. Dev.- 1994.-V. 37. -P. 276-283.

117. Ord.T., Kolmer M., Yillems R, Saarma M. Structure of the human genomic region homologous to the bovine prochymozin- encoding gene // Gene. 1990.-V.91.-P. 241-246.

118. Page D.C., Moster R., Simpson E.m., Fisher E.M.,Mardon G., Pollack J., McGilluray В., de la Chapelle A., Brown L. G. The sex- determining region of the humany chromosome encodes a finger protein // Cell.- 1987.-V.51.-P. 10911104.

119. Paleyanda R.K., Drews R., LeeT.K., Lubon H. Sekretion of human furin into mouse milk // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272. -P. 15270-15274.

120. Pedersen V., Christensen K., Foltmann B. Investigations on the fctivation of bovine prochymosin // Eur. J. Biochem. -1979.-V. 94. P. 573-580.

121. Persuy M.A., Stinnakre M.G., Printz C., Mahe M.F. and Mercier J.C./ High expression of the carpine (3-casein gene in transgenic mice // Eur. J. Biochem. 205.-1992.-P 887-893

122. Pelliccer A.D., Robins B,Word.R.et al Altering genotypy and phenotype by DNA -mediated gene transfer // Ssience.- 1980.-V.209.-1414-1422.

123. Pursel V.G. et.al. II-th International Congress on Animal Reproduction and

124. Artificial Insemination, Dublin, 1988.

125. Pursel V.G., Bolt D.J., Mileer K. Expression and performance in transgenic pigs //J.Reprod. Fert. Suppl.- 1990.- V.40.- P.235-245.

126. Pursel V.G., Rexroad C., Pincert C. et.al. Progress on gene transfer in animals // Vet.Immunol. Immunopathol.- 1987.- V.17.- P.303-312.

127. Roberts В., Ditullio P., Vitale J., Hehir К and GordonK./ Cloning of the goat p-casein-encoding gene and expression in transgenic mice // Gene 121.-1992. -P.225-262.

128. Richard M. Comparison of anti-HIV-1 retroviral vectors and their use inan AIDS gene therapy trial in identical twins // J. Cell Biochem.- Suppl.21a.-1995.-P.397.

129. Seamon J.A. Inserting a nuclear targeting signal into a replication-competent Moloney murine leukemia virus affects viral export anl is not sufficient for cell cycle-independent infection//J. Virol.-V.76 (16).-2002.-P.8475-8484.

130. Sorge J., Wright D., Erdman V. D. Amphotropic retrovirus vector system for human cell gene transfer // Moll. Cell. Biol. 1984. - V.4.- P. 1730-1737

131. Simons. J.P., Wilmut I., Clark A.J., Archibald A.L., Bishop J.O. and Lathe.R./ Gene transfer into sheep // Bio /Technology.-6.-1988.-P. 179-183.

132. Sippel A.E., Saueressing H., Winter D. et.al. Transgenic animals. N.Y.L: Academic Press Inc.- 1992.-P.3-26.

133. Shimotohno K., Temin H.M. Evolution of retroviruses from cellular movable genetic elements//Quant. Biol.- 1981.-45.-P.719-732.

134. Schwartzberg P., Colicelli J., Gordon M Mutations in the gag gene of Moloney murine leukemia virus: effects on production of virions and reverse transcriptase // J. Virol.-1984.-V. 49.- P.918-924.

135. Thepot D., Devinoy E., Fontaine M.L. and Houdebine L.M./ Structure of the gene encoding rabbit p-cassein. // Gene.- 1991.-97.-P.301-306.

136. Thompson S., Clarke A.R., Row A.M. et.al. Cerm line transmission and expression of corrected HPRT gene produced by gene targeting in embryonic stem cells // Cell 56.- 1989.- P.313-321.

137. Thepot D., Devinoy E., Fontaine M.L. and Houdebine L.M./ Structure of the gene encoding rabbit (3-cassein. // Gene.- 1991.-91 -V.301-306.

138. Vilotte J.L., Soulier S., Mercier J.- C., Gaye P., Hue-Delahaie D. and Furet J.P. / Complete nucleotide seguence of bovine a-lactalbimine gene comparison with its rat counerpart. Biochim. -V.6. -1987. 609 -620.

139. Wagner E.F. Of transferring genes into sprem cells and mice // EMBO J.9. -1990.- P.3025-3052.

140. Wall R.J., Hawk H.W., Nel Neil. Varking transgenic livestok: genetic engineering on a large seale // J.Cell. Biochem.- 1992.- 49.- N.2.- P. 113-120.

141. Wall R.J., Pursel V.G., Shamay A., McKnight R.A., Pittius C.W. and Henninghausen L.,/ High- level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine // Proc. Natl. Acad. Sci USA88.- 199 1. P 1696-1700.

142. Wigler M.,Sulnerstein S., Lee L.S. et al. Transfer of purified herpes virus thymidine Kinase gene to cultured mouse ctelles //cell.- 1977.- Y.l 1.-P.223-232.

143. Wigler M., Sweet. R., Sim G. Transformation jof mammalian cells withh gene from prokaryotes and eucaryotes // Cell.-1978.-V. 16-P.777-785.

144. Wilmut I., Archibald A.L., Harris S. et.al. Metods of gene transfer and their and their potential use to modify milk composition // Theriogenology.- 1990.- V.33.-N.I.- P.l 13-123.

145. Yamada Т., Kaneko H., Jizuko H. et al. Elewation of lymphocyte and hematopoetic stem cell numbers mice transgenic for human granulocyte CSF // Lab/Invest. 1996. - V.74. - №2. - P.384-394.