Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические и продуктивные особенности овец, трансгенных по гену химозина

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Биологические и продуктивные особенности овец, трансгенных по гену химозина"



МЛ

ООЭ1Б7173

На правах рукописи

КАЛМЫКОВ СЕРГЕИ ПЕТРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ПРОДУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОВЕЦ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНУ ХИМОЗИНА

06 02.01 - разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Лесные Поляны Московская область 2008 год

003167173

Работа выполнена в научно-производственном биотехцентре Всероссийского НИИ лекарственных и ароматических растений РАСХН

Научный руководитель- кандидат биологических наук

Черных Венадий Яковлевич Всероссийский НИИ ароматических и лекарственных растений.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Калашникова Любовь Александровна

Всероссийский НИИ племенного дела

доктор биологических наук, профессор Шайдуллин Ильяс Нургалиевич Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

Ведущая организация- Российская академия менеджмента в животноводстве.

Защита диссертации состоится 14 марта 2008 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220 017 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела. 141212, Московская область, Пушкинский район, п. Лесные Поляны, ВНИИплем, факс: 515-95-57.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского НИИ племенного дела.

Автореферат разослан 11 февраля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,. ^

доктор биологических наук, профессор Ерохин А С

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность работы. Среди молочных продуктов особым спросом у населения пользуются сыры, как биологически высокоценные диетические продукты питания Ежегодное производство сыров в России составляет 371 тыс т/год (Сельское хозяйство России, М, ФГНУ «Росин-формагротех», 2006) Технология производства сыра основана па использовании створаживающего молоко фермента - химозина, иначе называемого сычужным ферментом

Традиционно химозин получают из сычугов молочных телят и ягнят Однако в последние годы в Российской Федерации объем заготовок сычугов резко снизился по той простой причине, что забой животных в молодом возрасте экономически не оправдан Вместе с тем, потребность в химозине довольно большая - на каждые 100 кг молока при приготовлении сыра требуется от 2,66 до 3,2 г этого фермента (Чепурков, Тезиев, 2006), а общая потребность для всего сыродельческого производства страны составит около 12 т в год Острый дефицит сычужного фермента в нашей стране вынуждает импортировать этот продукт, что существенно удорожает конечную продукцию

Для решения этой проблемы был разработан метод производства химозина путем микробного синтеза Однако использование такого препарата в сравнении с полученным из сычугов телят также повышает себестоимость производимого сыра более чем на 10%, и сопровождается ухудшением качества сыра (Югова, Дорохов, 1988)

Эта ситуация привела к необходимости поисков других путей получения химозина В частности, это может быть достигнуто биотехнологическим путем - созданием трансгенных животных, в геном которых встроен рекомбинантныи ген этого фермента Экспрессия этого гена в секрети-рующих клетках, в частности в молочной железе, позволит получать химозин непосредственно с молоком (Эрнст, Гольдман, Кадулин и др, 1993)

Усилиями международного научного коллектива, в России была получена первичная трансгенная овца многоплодной романовской породы со встроенным в геном рекомбинантным геном химозина (Гольдман, Эрнст, Брем и др, 1994) Это, в свою очередь, поставило задачу изучения особенностей разведения таких животных и использования их как продуцентов химозина

1.2. Цель и задачи исследований. Целью наших исследований было выяснить особенности воспроизводительной, лактогенной и других функций овец, трансгенных по гену химозина, и на базе полученных данных разработать технологию производства химозина

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи от первичной, трансгенной овцематки, создать популяцию животных-аналогов, выяснить при этом влияние трансгенеза на отдельные физиологические функции овец

- состояние воспроизводительной функции, рост и развитие трансгенных ягнят,

- наследование гена химозина,

- способность экспрессии гена химозина в молочной железе и выход продукта экспрессии с молоком,

-морфологию и функцию молочной железы и молочной продуктивности трансгенных овец,

-действие отдельных факторов на молочную продуктивность трансгенных овец кратности доения и длительности предшествующего доению подсоса Разработать методы

- определения содержания прохимозина в молоке,

- гормональной стимуляции лактогенной функции у овец,

- выделения химозина из молока трансгенных овец

1.3. Научная новизна работы. Впервые установлено, что реком-бинантный ген химозина, встроенный в геном овцы, способен передаваться по наследству и экспрессировать в молочной железе с выделением в молоко продукта экспрессии, прохимозина Трансген-

ность животного не отражается на состоянии воспроизводительной функции животных, на росте и развитии потомства, как самцов, так и самок, но подавляет молочную продуктивность из-за перехода прохимозина в химозин непосредственно в альвеолах молочной железы Потерю молочной продуктивности отчасти можно компенсировать высокой частотой доения, подсосом ягнят перед периодом доения, а также гормональными обработками

1.4. Практическая значимость. На настоящем этапе развития технологии получения химозина из молока трансгенных овец решены вопросы разведения гемизиготных трансгенных особей от одной первичной трансгенной овцематки - получения потомства, выявления трансгенных потомков, их выращивания и эксплуатации Разработаны приемы активации лактогенной функции режимом доения и предшествующим подсосом, а также гормональными обработками Разработаны методы выявления химозина в молоке трансгенных овец и выделения его в виде готового продукта

1.5. Лпробаиия работы. Материалы диссертации были доложены

На совместной, научно-практической конференции Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ) и Всероссийского научно-исследовательского института свиноводства (ВНИИС), по проблемам «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», «Эффективность развития свиноводства в современных условиях рыночной экономики», Быково, Московская область, 9-14 июня 1998 года, на международной научно-практической конференции Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ) по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, Московская область, 2002 года, на научной конференции ВШ1АР, 2007г

1.6. Публикаиии результатов исследований, По результатам исследований опубликовано 5 научных работ, в том числе в рецензируемых журналах - 2

1.7. Объем работы. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических предложений В тексте имеются 25 таблиц, 10 рисунков, 4 фотографии и 2 схемы Список использованной литературы состоит из 122 источников, в том числе 22 иностранных

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в Биотехцентре РАСХН (п Горки Ленинские, Московская область), в племхозе «Трудовое» (Саратовская область), в Северо-Кавказском НИИ животноводства (Краснодарский край), на Московском заводе сычужного фермента, схема 1

Создание популяции овец, трансгенных по гену химозина

Исследование биологических особенностей

Функции воспроизведения

]

Наследования имплантированного гена

Лактогенной функции

Постнатального роста и развития ягнят

Разработка технологии получения химозина

Разведение трансгенных овец

Восстановление депрессиро-ванной лактогенной функции

I Определена I химозин;

Определение присутствия химозина в молоке

Выделение химозина из мо- ! лока - приготовление готово

Схема 1

Исследование биологических особенностей трансгенных овец, и разработка технологии получения химозина

Исследование воспроизводительной способности трансгенных овец сочетали с разведением и созданием популяции трансгенных животных

Искусственное осеменение Взятие семени от баранов и его оценку проводили в соответствии с «Инструкцией по искусственному осеменению овец и коз» (1986) Замораживание семени проводили по методу ВНИИПлем (Платов, 1988)

Осеменение овец свежевзятым семенем осуществляли традиционным визоцервикштьным методом (Милованов, 1962) Овец в охоте выбирали 2 раза в сутки - утром и вечером с помощью баранов-пробников, возможность покрытия овец которыми была блокирована надетыми фартуками Осеменение проводи™ двукратно в охоту, сразу после выявления охоты и повторно через 12 часов

Осеменение криоконсервированным семенем проводили внут-риматочно с лапароскопическим контролем (Armstrong, Evans, 1984) Выявление овец в охоте при этом проводили 3 раза в день После установления рефлекса неподвижности овец в течение 12 часов выдерживали на голодной диете Техника внутриматочного осеменения была следующей Овцу помещали на станок под углом 45° головой вниз Операционное поле выбривали и обрабатывали настойкой йода В месте прокола брюшной стенки троакаром делали местную внутримышечную анестезию, инъецируя 1 мл 2% ледокаина Прокол брюшной стенки троакаром проводили, отступая от белой линии живота на 1,5-3 см в сторону и на расстоянии 4-5 см от молочной железы В брюшную полость через троакар нагнетали воздух Под визуальным контролем через лапароскоп семя вводили шприцем через длинную инъекционную иглу Люэра в верхнюю часть канала обоих рогов матки, в дозе по 0,2 мл Осеменение проводили однократно в охоту Естественное осеменение проводили методом ручной случки Рост и развитие трансгенных ягнят изучали в условиях племхоза «Трудовое» Ягнят взвешивали при рождении и каждый месяц до отьема их от матерей в 4-месячном возрасте

Для определения наследуемости встроенного рекомбинантного гена в трех поколениях определяли соотношение ягнят с трансгенным и интактным геномом. Присутствие в тканях гена химозина определяли, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (Зиновьева, Потов, Эрнст и др, 1998)

Экспрессию гена химозина в клетках молочной железы устанавливали по присутствию химозина в молоке овец Для этого нами при сотрудничестве с Московским заводом сычужного фермента была разработана методика определения химозина в молоке овец

Была испытана эффективность восстановления депрессирован-ной лактогенной функции трансгенных овец путем увеличения частоты доений в сутки и применением предварительного подсоса перед периодом доения.

В связи с тем, что трансгенные овцы рано прекращали лактировать, было решено испытать возможность возобновления лактации посредством гормональной обработки За основу была взята модернизированная нами методика (АЬГакюйэ, К^апоэ, HatJlmmaoglou, 1980)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Воспроизводительные способности овец, трансгенных по гену химозина

По количественным и качественным характеристикам семя трансгенного барана, полученного от первичной трансгенной овцематки, соответствовало требованиям «Инструкции по искусственному осеменению овец и коз» (1986), и было типичным для интактных особей исходной романовской породы В среднем объем эякулята составлял 0,8 мл, концентрация сперматозоидов - 2 млрд /мл, подвижность - 8 баллов

Как видно из данных таблицы 1, результаты осеменений интактных овец трансгенными баранами существенно различаются в связи с методом, искусственным или естественным

Таблица 1

Воспроизводительные способности трансгенных баранов _при различных способах осеменения _

Место проведения опыта Способ осеменения Осеменено овец Из них объягнились

чисто %

Племхоз «Трудовое» Искусственное ! 154 630 54,6±1,5

Племхоз «Трудовое» Искусственное 1330 440 33,1±1,3

Всего Искусственное 2484 1070 43,1±0,99

Биотехцентр Естественное 45 32 71,1+6,8

Племхоз «Трудовое» Естественное 433 400 92,4±1,3

Всего Естественное 478 432 90,4±1,3

Всего Искусственное и естественное 2962 1502 50,7+0,9

Хотя разница чрезвычайно большая, но она понятна При искусственном осеменении учет результатов веде1ся после осеменения в один половой цикл, в то время как результаты естественного осеменения можно было учесть по данным всего случного сезона, когда матка могла быть покрыта бараном после одного или нескольких перегулов в последующие циклы Вместе с тем, судя по этим результатам, трансгенные бараны обладают достаточно высокой воспроизводительной способностью

В Северо-Кавказском НИИ животноводства совместно с сотрудниками института было проведено искусственное осеменение интактных овец замороженным семенем трансгенного и ин-тактных баранов лапароскопическим методом (табл 2) Как видно из данных таблицы 2, процент объягнившихся овец, осемененных замороженным семенем трансгенного барана, был выше, чем семенем интактных, на величину, близкую к статистически достоверной, 17%(Р>0,95) Эту разницу в результатах осеменения трудно объяснить специфическим действием трансгенности животного

Эффективность внутриматочного осеменения овец под контролем лапа_зоскопа криоконсервированным семенем_

Бараны Подвижность оттаянного семени, баллы Осемене- Из них объягнились

но овец число %

Интактные 4 38 18 47±8

Трансгенный 3 И 7 64±14

Разница 17±8

к 2,13

Р 0,967

Более вероятно, что здесь имел влияние длительный срок хранения семени интактных баранов в жидком азоте, более 10 лет Отрицательное действие на результаты осеменения оказало не столько само сохранение, сколько менее совершенная технология криоконсервации семени десятилетней давности

Вместе с тем, эти данные позволяют заключить, что семя, полученное от трансгенных баранов, устойчиво при замораживании-оттаивании и к нему вполне применим метод длительного сохранения в глубоко-охлажденном состоянии

В 1998 году в племхозе «Трудовое» были осеменены естественным способом трансгенные и нетрансгенные овцематки, полученные от скрещивания интактных овец цигайской породы с трансгенным романовским бараном Нетрансгенных овцематок осеменяли трансгенными баранами-помесями (романовская х цигайская), а трансгенных овцематок - интактными баранами остфризской породы (табл. 3)

Как видно из результатов в таблице 3, процент объягнившихся трансгенных овцематок (82±4%) не отличается от нетрансгенных (80+2,5%)

Таблица 3

Результаты осеменения трансгенных и нетрансгенных овец __в племхозе «Трудовое»_

Овцематки трансгенные нетрансгенные

Бараны интактные трансгенные

Число осемененных овец 92 242

Чисто объягнившихся овец 75 194

Процент объягнившихся 82+4 80+2,5

овец

Таким образом, воспроизводительные способности трансгенных и интактных овец, как баранов так и маток, не различаются, то есть трансгенные особи обоих полов обладают воспроизводительным потенциалом, присущим интактным овцам

3.2. Рост и развитие трансгенных ягнят

В племхозе «Трудовое» исследовали рост и развитие трансгенных и нетрансгенных ягнят - полусибсов, табл 4

Таблица 4

Рост и развитие трансгенных и нетрансгенных ягнят, полученных от интактных овцематок и трансгенного барана

Возраст ягнят, мес Живая масса ягнят, кг

трансгенных (п=50) нетрансгенных (п=50)

баранчики ярочки баранчики ярочки

0 (при ролодении) 4,1±0,8 4,0+0,7 4,2+0,8 4,0+0,8

1 11,7+1,1 11,4±0,9 10,9+1,4 11,4+13

2 17,5+0,7 17,2+1,0 17,6+0,8 17,0+0,7

3 23,3+1,0 22,4+1,2 23,2+1,4 22,5+0,3

4 29,4+1,3 27,6+1,7 29,9+1,5 28,3+1,8

Как показали результаты, (табл 4), скорость роста трансгенных и нетрансгенных ягнят, как баранчиков, так и ярочек, не различалась до четырехмесячного возраста

Таким образом, эти данные говорят, что интеграция в геном овец чужеродной генной конструкции не ведет к изменению физиологической ситуации в организме животных

3.3. Наследованиерекомбинантного гена химозина

Основным условием использования трансгенных животных является гарантия передачи встроенного гена потомству, без чего теряется всякий смысл разведения трансгенных особей, табл 5

Таблица 5

Наследование рекомбинантного гена потомством первичной трансгенной овцы

Ягнение Родилось ягнят, Из них трансгенных

всего число %

1-е 2 1 50

2-е 2 1 50

3-е 3 2 67

4-е 1 0 0

5-е 1 1 100

Итого 9 5 56±17

Как видно из таблицы 5, более половины потомства первичной трансгенной овцы от пяти ягнений - трансгенны В 1997-98 годах был проведен анализ наследования гена у овец второго и третьего поколений, полученных в племхозе «Трудовое» (табл 6) Выяснилось, что во втором поколении по сравнению с первым наследование чужеродного гена снизилось с 56±17 до 34,8+2,1%. Ягнятами третьего поколения наследование гена химозина (табл 6), снова снизилось с 34,8+2,1 до 27,3±2,2% При этом значительно большее снижение наблюдается среди ярок с 37,7+3 до 24,4+3,0%

Таблица б

Наследование гена химозина потомством

Пол Второе поколение Третье поколение

Родилось ягнят, всего Из них трансгенных Родилось ягнят, всего Из них трансгенных

число % число %

Баранчики 271 87 32,1 ±2,8 224 67 29,9±3,1

Ярочки 257 97 37,7±3,0 201 49 24,4±3,0

Всего 528 184 34,8±2,1 425 116 27,3±2,2

В наших опытах всегда один из родителей был гемизиготным по гену химозина, второй - интактный По законам статистики в этом случае трансгенными должна быть четвертая часть всего потомст-

и

ва Следовательно, в третьем поколении соотношение трансгенного и нетрансгенного потомства, 3 1, оказалось статистически детерминированным

В связи с этим, при работе с гемизиготными, трансгенными по гену химозина овцами с целью дальнейшего изучения их биологических и продуктивных особенностей мы рекомендуем следующую схему их разведения

- гемизиготных трансгенных овцематок осеменять интактны-ми баранами, желательно высокомолочных пород, с целью повышения в дальнейшем молочной продуктивности их потомства,

- гемизиготных трансгенных овцематок осеменять гемизиготными трансгенными баранами с целью получения гомозиготных животных,

- полученных от этих комбинаций трансгенных овец спаривать с интактными баранами неродственных линий или других пород, нетрансгенных - с трансгенными баранами, при возможности в наименьшей степени инбридинга,

- часть трансгенных баранчиков оставлять для племенного использования, остальных вместе с нетрангенными реализовывать на мясо

3.4. Экспрессия гена химозина в молочной железе Как видно из данных таблицы 7, у трансгенных овец всех поколений наблюдаются значительные колебания содержания химозина в молоке, как в различные дни лактации, так и между животными, из которых трудно вывести какую-либо закономерность

Однако данные позволяют сделать заключение, что трансгенные овцы первого и второго поколений сохраняют способность к экспрессии встроенного рекомбинантного гена химозина

Секреция прохимозина с молоком трансгенных овец

Поколение Лактация Число овец Дни лактации Число проб Активность, у е

М*т Ьт

Ро 3-я 1 3-10 5 20,8±1Д 19,0-22,1

11-20 10 14,1 ±2,6 12,1-20,2

21-30 8 22,3+43 15,1-19,0

4-я 3-10 5 20,3+6,8 12,6-27,6

11-20 10 23,1+5,7 18,4-32,9

21-30 6 14,8+8,2 5,9-29,5

и, 1-я 1 3-10 5 33,9±11,4 18,9-46,3

11-20 5 36,9+13,2 18,9-52,9

21-30 6 24,9+5,2 19,5-32,0

2-я 3-10 6 17,7±2,8 10,8-183

11-20 8 12,3+3,0 10,9-19,4

21-30 6 12.6+7.7 3.9-22.7

4-я 2 3-10 13 26,3±8,4 153-41,1

11-20 8 24,3±6,8 12,7-36,8

21-30 16 28,2+5,6 18,5-38,2

3.5. Молочная продуктивность трансгенных овец

Данные таблицы 8 показывают, что молочная продуктивность трансгенных овец почти в 18-30 раз ниже, чем гаггактных. Причина депрессии лактогенной функции у трансгенных особей понятна в свете гистологических исследований молочных желез У трансгенных овец альвеолы молочной железы в значительной своей части заполнены свернувшимся молоком, чем подавлена их секреторная функция

Происходит это, вероятно, вследствие перехода секретируемого прохимозина в химозин, который и производит створаживание молока непосредственно в месте его образования. Причина этого перехода пока непонятна Для активации прохимозина нужна очень кислая среда, в пределах рН=1-2, чего не может быть в молочной железе. Тем не менее, такой процесс очевидно происходит Эти данные выдвигают новую научную задачу. выяснить механизм перехода прохимозина в химозин и разработать метод предотвращения такого перехода.

Молочная продуктивность трансгенных и интактных овец

Период доения, дней Число овец Период лактации, дней Среднесуточный удой за период доения (мл) Надоено на овцу за период доения, (л)

на 1 овцу, мл мин макс

Интактные овцы

107 5 152 860 410 2009 92,02

Трансгенные овцы

45 6 88 109 77 131 4,91

94 8 125 53 43 65 4,98

65 16 102 27 13 35 1,76

3.6. Влияние кратности доения и продолжительности подсосного периода на молочную продуктивность трансгенных овцематок

В целях активации депрессированной лакгогенной функции у трансгенных овец нами была предпринята попытка решить путем увеличения кратности доения.

Таблица9

Молочная продуктивность трансгенных овцематок при разной кратности доения

Доений за сутки Число овец Период доения, дней Среднесуточный удой, мл Надоено на овцу за период доения, л

3 7 7 79 0,55

5 3 7 323 2,26

10 3 7 1067 7,47

Из данных таблицы 9 и рис.1 видно, что удой трансгенных овец увеличивается в прямопропорциональной зависимости от частоты доений, которая выражается регрессионным уравнением. у—366,0256+142,6154х. Воспользовавшись этой формулой, можно прогнозировать удой и при других частотах доения (рис 1) Экстрапо-

ляция этих данных на увеличение частоты доения до непрерывного с интервалом в один час (24 раза в сутки) теоретически может привести к удою до трех литров в сутки

С физиологических позиций механизм положительного действия высокой часгогы доения на среднесуточный удой состоит в следующем Очень низкая секреция молока у трансгенных овец, как уже отмечалось, связана с подавлением секреции, свернувшимся молоком Свободное от сгустка пространство в альвеолах быстро заполняется молоком, блокируя дальнейшую секрецию Часто освобождая альвеолы от неуспевшего свернуться молока, мы снимаем блокаду секреции и позволяем альвеолам секретировать его постоянно

Ранее было установлено, что нахождение ягнят на подсосе положительно влияет на молочную продуктивность (Милз, 1983, Ко-мов, 1994) В связи с этим, мы сделали попытку применить аналогичный приём для трансгенных овцематок с целью восстановления их лактогенной функции

Таблица 10

Молочная продуктивность трансгенных овцематок в связи с продол-

жительностью подсосного периода

Продолжительность подсосного периода, дней Число животных Число дней доения Среднесуточный удой, мл Максимальный суточный удой, мл Надоено на овцу за период доения, л

21 7 81 36 104 3,01

36 13 78 41 153 3,16

45 10 49 73 248 3,43

Рис 1

Действие частоты доения на среднесуточный удой

Выяснилось, что чем больше продолжительность подсосного периода, тем выше последующая молочная продуктивность (табл 10, рис 2) По-видимому, когда ягнята находятся с овцематками, то они осуществляют такое же действие на молочную железу, что и предыдущий прием, частое доение и массаж Возможно также, что при сосании ягнят в какой-то мере удаляются сгустки, увеличивая свободное пространство в альвеолах Как показывают данные рис 2, зависимость между продолжительностью подсоса и последующим

надоем прямая, но не линейная, выражающаяся квадратным уравнением у=130,5-7,3194х+0,1343х:. По мере увеличения продолжительности подсоса последующий суточный удой возрастает, но укорачивается период доения Возникает необходимость определения оптимального срока подсоса для получения максмального надоя.

75 70 65 60 55 | 50

у = 130,5-7,3194*х+0,1343*х2

45 40 35 30 25

20 24 28 32 36 40 44 22 26 30 34 38 42 46

Подсосный период, дней

Рис 2

Зависимость между продолжитель но-стью подсоса и последующей среднесуточной продуктивностью трансгенных овец

Из данных графика на рис.3 видно, что оптимум длительности периода подсоса для надоя, кроме всего прочего, зависит от общей продолжительности лактации, включающей период подсоса и период доения При лактации в 240 дней длительность оптимального подсоса составляет 55 дней и за оставшийся период доения, 185 дней, будет надоено 193,4 л молока При лактации в 180 дней оптимальный период подсоса составит 45 дней, а за оставшийся период, 135 дней, надой составит 79,5 л.

.?. 7. Гормональная индукция лактации у трансгенных овцематок, находящихся в запуске

В течение 7 дней овцам ежедневно подкожно инъецировали спиртовые растворы прогестерона, 70 мг/гол, и эстрадиола в дозе 25 мг/гол После 6-ти дневного перерыва и на 14-й день, производили однократные внутримышечные инъекции преднизолона и дексаметазона в дозе 30 и 10 мг/гол соответственно Из результатов таблицы 11 видно, что на инъекции прогестерона и эстрадиола реакция была гораздо слабее, чем у животных, дополнительно обработанных преднизолоном и дексамета-зоном У овцематок, обработанных только прогестероном и эстрадиолом, имело место даже некоторое снижение удоев Однако после однократных инъекций преднизолона и дексаметазона, введением которых заканчивался период гормональной обработки, у животных обеих групп произошло значительное увеличение среднесуточных удоев

Срок подсоса, дней Рис 3

Расчетный надой трансгенной овцы за лактацию после разных сроков подсоса

Таблица 11

Молочная продуктивность трансгенных овцематок после гормонального вызывания лактации по методу 2

Пепиопы после инъекций

Групп Число овец Спонтанная лактация 1 прогестерона+ эстрадиола 2 преднизолона и дек-саметазона

число суточный число суточный число суточный

дней удои, мл дней удой, мл дней удои, мл

1 5 17 12 14 8 25 58

2 5 17 0 14 9 25 122

В среднем 17 6 14 8,5 25 90

В условиях вивария Биотехцентра в 1999 году был успешно проведен опыт, в котором гормональной обработкой по методу 2 удалось вызвать лактацию у ранее ни разу не ягнившихся животных, (ярок) Этот прием может быть использован для раннего выявления ярок - потенциальных продуцентов химозина

3.8. Экспрессиярекомбинаптиого гена химозина С использованием разработанного нами метода была исследована зависимость продукции химозина от отдельных физиологических и зоотехнических факторов Результаты приведены в таблице 12

Таблица 12

Изменения активности химозина в молоке трансгенных овец по поко-_ лениям, по лактациям и по периодам лактации_

Актив- Актив- Актив-

ность ность Периоды ность

Поколения химозина в Лактации химозина в лактации, химозина в

молоке, молоке, ДНИ молоке,

у е у е у е

Ро 19,2±0,7 1-я 24,9±3,1 3-10 24,2+3,2

22,7±3,4 2-я 14,0±2,9 11-20 20,7+3,3

26,7±4,0 4-я 23,1+2,1 21-30 22,5+2,9

Активность химозина в молоке овец линейно повышается от поколения к поколению Однако не выявлена объяснимая закономерность зависимости ее от возраста овцематки (порядкового номера лактации) и периодов лактации Нельзя сделать вывод о закономерном увечиче-

нии или снижении концентрации прохимозина в мотоке трансгенных овец в течение лактационного периода Для выявления этих закономерностей необходимо проведение более углубленных исследований, наблюдая весь период лактации

3.9, Методики определения присутствия химозина в молоке трансгенных овец

Экспресс-методика была разработана нами в Биотехцентре и практически применена для определения экспрессии встроенного в геном овцы рекомбинантного гена химозина Методика включала следующие процедуры

(1) Взятие проб овечьего мочока

(а) пробы овечьего молока берут на 7,9 и 11 день лактации, не менее 5 мл,

(2) Приготовление раствора молочного субстрата

(а) 100±0,01 г сухого обезжиренного коровьего молока (ГОСТ 10970-87) отвешивают в химический стакан емкостью 1 л, добавляют 800 мл 0,01 N раствора хлористого кальция (реактив по ТУ 6094711-81 обезвоженный) при температуре +35°С,

(б) после полного растворения смесь фильтруют через 3-4-х слойный марлевый фильтр, вложенный в стеклянную воронку,

(в) приготовленный раствор субстрата из сухого молока доводят до рН 6,45 6,5 Ш раствором едкого натра,

(г) раствор субстрата переливают в мерную колбу емкостью 1 л, объем доводят до метки 0,0 Ш раствором хлористого кальция, выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре, затем фильтруют через ватный фильтр, вложенный в стеклянную воронку

(3) Определение наличия химозина в лююке

(а) пробу молока объемом 5 мл наливают в стеклянный мерный стакан и добавляют 5 мл дистиллированной воды, титруют концентрированной со та ной кислотой до рН 1,7 для активации прохимозина в активный химозин,

(б) молочный субстрат разливают в пробирки по 10 мл, пробирки помещают в водяную баню и инкубируют при температуре + 35°С,

(в) го пробы овечьего молока отбирают 0,1 мл и добавляют в пробирку с субстратом,

(г) если свертывание во всех трех пробах не наступает в течение 30 минут, считается, что химозин в молоке отсутствует,

(д) активность химозина оценивают в условных единицах - обратных величинах доли времени, необходимого для полного створаживания субстрата Молокосвершваюшую акшвнсхль 1 г молокосвершвающего ферментного препарата (МФП) в тыс условных единиц вычисляли по формуле

Х=Ах 71 72 .гДе

А-усганоапенная активность ПЭТ сычужного фермента, равная 100000 уе, Т1 - гфодолжительность свёртывания молока ПЭТ сычужного фермента, сек, Т2 - продолжительность свертывания молока раствором МФП, сек.

Экспресс-методика определения наличия химозина в молоке овец была успешно применена на овцах, содержащихся в племхозе «Трудовое» От 320 овец, полученных от трансгенного барана и овец цигайской породы, было взято более 1200 проб молока Наличие химозина в молоке было установлено у 72 (22,5±2,3%) овец в первые дни лактации

Эта пропорция овец, секрегаруюпщх химозин, предельно близка к доле гемизиготных трансгенных ягнят, получаемых от интактных овец и трансгенных баранов Таким образом, совместно с методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью нашей методики возможно выявление в стаде трансгенных и к тому же с экспрессией рекомбинантного гена особей

Преимущество данной методики в том, что она не требует сложного оборудования и подготовки специальных кадров Кроме того, с помощью экспресс-методики можно в короткие сроки выявить трансгенных овец, пригодных для доения с целью получения молока, содержащего химозин. Эти преимущества метода позволили использовать его в производственных условиях, непосредственно на ферме

ЗЛО. Метод получения химозина из молока трансгенных овей

(1) Отделение казеиновой фракции Молоко в соотношении 1 4 разбавляют водой при комнатной температуре (+20 - +25°С), подкисляют до рН=4,5, добавляя концентрированную соляную кислоту тонкой струйкой при постоянном помешивании и снимая показания рН-метра. Подкисленное молоко выдерживают при комнатной температуре 10-15 минут до коагуляции казеина, после чего казеиновую фракцию отделяют от сыворотки Для этого молоко разливают в мешки из технического лавсана Мешки завязывают и подвешивают над емкостью из химически не активного материала, в которую стекает отфильтрованная сыворотка Фильтрование проводят до полного отделения сывороточной фракции Сывороточная фракция после фильтрации должна быть прозрачной, желтоватого цвета Если сыворотка мутная, фильтрацию повторяют, пока сыворотка не станет прозрачной

(2) Активирование и отделение химозина Отфильтрованную сыворотку подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 2,5 В сыворотку добавляют КаС1 из расчета 250 г соли на 1 л сыворотки, постоянно помешивая раствор шпателем до полного растворения соли и настаивают около 1 часа

После настаивания раствор разливают в мешки из технического лавсана или капрона для новой фильтрации с одновременным самопрессованием Фильтрацию проводят до момента, пока на фильтрах не останется пастообразная масса влажностью 50-70% После окончания фильтрации фильтры или фильтровальные мешки выворачивают, со стенок собирают полученную пастообразную массу Отбирают пробы пастообразной ферментной массы и анатизируют на ферментативную активность

(3) Сушка и хранение Для получения порошковой формы ферментного препарата пастообразную массу сушат в лиофильной сушилке при температуре конденсации влаги от -20°С и ниже После окончания сушки порошковый препарат химозин упаковывают в герметичные полиэтиленовые пакеты или стеклянные флаконы, и хранят в сухом темном месте при комнатной температуре (20 . 25°С)

За время выполнения опытов их молока трансгенных овец в племхозе «Трудовое» в общей сложности было получено 16 кг сухого препарата химозина, использование которого было бы достаточно для производства 400 тонн сыра

ВЫВОДЫ

1 Интеграция рекомбинантного гена химозина в г еном овец не изменяет воспроизводительных способностей, как овцематок, так и баранов

2 Биохимические и клинические характеристики крови трансгенных овец находятся в пределах физиологических норм интактных животных

3 При воспроизведении, когда трансгенный один из родителей, независимо овцематка или баран, трансгенное потомства составляет 27,3 -34,8% Это соотношение трансгенных и нетрансгенных потомков сохраняется в трёх поколениях

4 Рекомбинантный ген химозина, локализованный в секреторных клетках молочной железы, способен экспрессировать с выходом продукта экспрессии, прохимозина, непосредственно в молоко

5 Трансгенные овцы имеют в сравнении с интактными многократно пониженный суточный удой и укороченный период лактации, вследствие створаживания молока непосредственно в альвеолах молочной железы и подавления таким образом лактогенной функции.

6 Лактацию трансгенных овец, находящихся в запуске, можно вызывать инъекциями гормональных препаратов, с одновременным проведением массажа сосков и вымени

7 Установлено, что молочную продуктивность трансгенных овец можно многократно повысить путем увеличения кратности доения, а также применением предварительного подсоса

8 Гормональной обработкой возможна индукция лактации у холостых, никогда не ягнившихся животных (ярок) для раннего выявления особей - продуцентов химозина

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуем биотехнологическим лабораториям для оценки биологических и продуктивных особенностей овец, трансгенных по гену химозина, использовать метод разведения гемизиготных трансгенных овец с использованием ПЦР-диагностики и метода ранней диагностики экспрессии гена химозина у ярок

Для преодоления депрессии лактогенной функции у трансгенных по гену химозина овец предлагаем метод гормональной стимуляции, для определения присутствия химозина в молоке - экспресс-методику и метод выделения химозина из молока в виде готового продукта

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Калмыков С П Использование лапароскопии для извлечения и пересадки эмбрионов при получении трансгенных коз для «генных ферм» /Прокофьев МИ, Эрнст Л К // Доклады РАСХН -2000 - №3 - С 30-32

2 Калмыков С П Зоотехнические свойства овец, трансгенных по ре-комбинантному гену фермента химозина /Калмыков СП// Зоотехния. -2008 -№ 2 -с 37-39

3 Калмыков С П Молочная продуктивность овцематок, трансгенных по гену химозина / Прокофьев М И, Черных В Я // Материалы международной научно—практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» -Выл 8 - Быково -2002 - С 201-204

4 Калмыков С П Молочная продуктивность овцематок, трансгенных по гену химозина после гормонального вызывания лактации / Прокофьев М И, Черных В Я // Материалы международной научно - практической конференции по проблеме. «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» - Вып 8 - Быково - 2002 - С 197-200

5 Калмыков С П Эффективность размножения трансгенных по гену химозина овец / Юткин ЕВ //Тезисы совместной научно-пракшческой конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» - Быково - 2005 - С 38-39

Заказ № 3_Объем 1.0 пл. Тираж 60 экз.

Типография ВНЮТплем

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калмыков, Сергей Петрович

Введение

1.0бзор литературы

1.1. Химозин, его получение, свойства и практическое применение

1.2. Воспроизведение овец

1.3. Молочная продуктивность овец

1.4. Факторы, влияющие на молочную продуктивность овец

1.5. Отбор овец для доения

1.6. Доение овец

1.7. Гигиенические требования к овечьему молоку

1.8. Использование овечьего молока как продукта питания 36 2. Материалы и методы исследований

2.1. Содержание и кормление овец

2.2. Разведение и изучение воспроизводительных способностей трансгенных овец

2.2.1. Получение и замораживание семени трансгенных баранов

2.2.2. Искусственное осеменение

2.2.3. Естественное осеменение

2.2.4. Изучение воспроизводительных способностей трансгенных

2.3. Изучение особенностей роста и развития трансгенных и не-трансгенных ягнят

2.4. Определение гематологических показателей трансгенных и интактных овец

2.5. Определение наследования гена химозина в различных поколениях овец

2.6. Исследование экспрессии рекомбинантного гена химозина в молоко у трансгенных овцематок

2.7. Технология доения трансгенных овец

2.8. Определение молочной продуктивности трансгенных

2.9. Гистологическое исследование особенностей молочной железы трансгенных овец

2.10. Гормональная обработка трансгенных овцематок, находящихся в запуске, с целью возобновления лактации

2.11. Изучение влияния кратности доения на молочную продуктивность трансгенных овцематок

2.12. Изучение влияния продолжительности подсосного периода на молочную продуктивность трансгенных овцематок

3. Результаты исследований

3.1. Воспроизводительные способности овец, трансгенных.по гену химозина

3.2. Рост и развитие трансгенных и нетрансгенных ягнят

3.3. Гематологические показатели трансгенных и интактных овец

3.4. Наследование рекомбинантного гена химозина

3.5. Гистологические и морфологические особенности молочной железы трансгенных овец

3.6. Молочная продуктивность трансгенных овцематок

3.7. Влияние кратности доения на молочную продуктивность трансгенных овцематок

3.8. Влияние продолжительности подсосного периода на молочную продуктивность трансгенных овцематок

3.9. Реакция трансгенных овец, находящихся в запуске, на обработку гормонами с целью возобновления лактации

3.10. Экспрессия гена химозина в секреторных клетках молочной железы

3.10.1. Методика определения присутствия химозина в молоке трансгенных овец и метод его получения в виде готового продукта

3.10.2. Зависимость экспрессии гена химозина от поколения трансгенных овцематок, их возраста и периода лактации

Обсуждение результатов исследований

Выводы

Практические предложения Список литературы

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Биологические и продуктивные особенности овец, трансгенных по гену химозина"

Достижения фундаментальных наук: биохимии, молекулярной биологии, генетики и других в последние десятилетия привели к возникновению новых прикладных отраслей - генной инженерии, биотехнологии, направленных на изменение генома прокариотов и эукариотов, животных и растений. Выяснение первичной структуры отдельных белков, порядка аминокислот, позволили кон-струироватъ адекватные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные ДНК и РНК, встраивать их в геном живых организмов и таким образом превращать их в живые биореакторы для производства соответствующих белковых препаратов.

Одним из объектов, к которому могла быть применена такая? ультрасовременная технология, - ферментный препарат химозин (сычужный фермент), необходимый при производстве сыров. Первоначальный биотехнологический вариант производства был основан на синтезе его генно-инженерными микроорганизмами, но получаемый продукт при этом оказался недостаточно высокого качества, к тому же чрезвычайно дорогим. В связи с этим решено было пойти другим путём, когда в качестве производителей использовать крупных трансгенных животных, включив в их геном соответствующую рекомбинантную ДНК.

Усилиями российских и австрийских ученых были созданы трансгенные овцы, в геном которых был включён синтетический ген химозина. Нам предстояло выполнить следующий этап — разработать биотехнологию производства химозина, для чего нужно было от первичной трансгенной овцематки создать популяцию овец в количестве, необходимом для выполнения всей программы исследований, выяснить влияние трансгенеза на физиологические и продуктивные качества животных, и на базе полученных результатов разработать условия оптимальной эксплуатации овец как биореакторов для производства химозина.

Актуальность исследований. Среди молочных продуктов особым спросом у населения пользуются сыры, как биологически высокоценные диетические продукты питания. Ежегодное производство сыров в России составляет 371 тыс. т/год (Сельское хозяйство России, М., ФЕНУ «Росинформагротех», 2006). Технология производства сыра основана на использовании створаживающего молоко фермента-химозина, иначе называемого сычужным ферментом.

Традиционно химозин получают из сычугов молочных телят и ягнят. Однако в последние годы в Российской Федерации объем заготовок сычугов резко снизился по той простой причине, что забой животных в молодом возрасте экономически не оправдан. Вместе с тем, потребность в химозине довольно большая — на каждые 100 кг молока при приготовлении сыра требуется от 2,66 до 3,2 г этого фермента (Чепурков, Тезиев, 2006), а общая потребность для всего сыродельческого производства страны составит около 12 т в год. Острый дефицит сычужного фермента в нашей стране вынуждает импортировать этот продукт, что существенно удорожает конечную продукцию.

Для решения этой проблемы был разработан метод производства химозина путем микробного синтеза. Однако использование такого препарата в сравнении с полученным из сычугов телят также повышает себестоимость производимого сыра более чем на 10%, и сопровождается ухудшением качества сыра (Югова, Дорохов, 1988).

Эта ситуация привела к необходимости поисков других путей получения химозина. В частности, это может быть достигнуто биотехнологическим путём -созданием трансгенных животных, в геном которых встроен рекомбинантный ген этого фермента. Экспрессия этого гена в секретирующих клетках, в частности в молочной железе, позволит получать химозин непосредственно с молоком (Эрнст, Гольдман, Кадулин и др., 1993).

Усилиями международного научного коллектива, в России была получена первичная трансгенная овца многоплодной романовской породы со встроенным в геном рекомбинантным геном химозина (Гольдман, Эрнст, Брем и др., 1994). Это, в свою очередь, поставило задачу изучения особенностей разведения таких животных и использования их как продуцентов химозина.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований было выяснить особенности воспроизводительной, лактогенной и других функций овец, трансгенных по гену химозина, и на базе полученных данных разработать технологию производства химозина. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи.

От первичной; трансгенной овцематки, создать популяцию животных-аналогов, выяснить при этом влияние трансгенеза на отдельные физиологические функции овец:

-состояние воспроизводительной функции; -рост и развитие трансгенных ягнят; -наследование гена химозина;

-способность экспрессии гена химозина в молочной железе и выход продукта экспрессии с молоком; -морфологию и функцию молочной железы и молочной продуктивности трансгенных овец; -действие отдельных факторов на молочную продуктивность трансгенных овец: кратности доения и длительности предшествующего доению подсоса. Предстояло разработать методы:

- определения содержания прохимозина в молоке;

- гормональной стимуляции лактогенной функции у овец;

- выделения химозина из молока трансгенных овец.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что рекомбинант-ный ген химозина, встроенный в геном овцы, способен передаваться по наследству и экспрессировать в молочной железе с выделением, в молоко продукта экспрессии, прохимозина. Трансгенность животного не отражается на состоянии воспроизводительной функции животных, на, росте и развитии потомства, как самцов, так и самок, но подавляет молочную продуктивность из-за перехода прохимозина в химозин непосредственно в альвеолах молочной железы. Потерю молочной продуктивности отчасти можно компенсировать высокой частотой доения, подсосом ягнят перед периодом доения, а также гормональными обработками.

Практическая значимость. На настоящем этапе развития технологии получения химозина из молока трансгенных овец решены вопросы разведения гемизиготных трансгенных особей от одной первичной трансгенной овцематки - получения потомства, выявления трансгенных потомков, их выращивания и эксплуатации. Разработаны приёмы активации лак-тогенной функции режимом доения и предшествующим подсосом, а также гормональными обработками. Разработаны методы выявления химозина в молоке трансгенных овец и выделения его в виде готового продукта.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены:

На совместной, научно-практической конференции Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ) и Всероссийского научно-исследовательского института свиноводства (ВНИИС), по проблемам-: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения»; «Эффективность развития свиноводства в современных условиях рыночной экономики», Быково, Московская область, 9-14 июня 1998 года; на международной научно-практической конференции Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ) по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, Московская область, 2-5 июля 2002 года; на научной конференции ВИЛАР, 2007 год.

Публикации результатов исследований

По результатам исследований опубликовано пять научных работ, в том числе в рецензируемых журналах - две.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Калмыков, Сергей Петрович

ВЫВОДЫ

1. Интеграция рекомбинантного гена химозина в геном овец не изменяет воспроизводительных способностей, как овцематок, так и баранов.

2. Постнатальные рост и развитие потомства, полученного как от трансгенных овцематок и интактных баранов, так и от интактных овцематок и трансгенных баранов находятся на уровне, присущем интактным особям.

3. Биохимические и клинические характеристики крови трансгенных овец находятся в пределах физиологических норм интактных животных.

4. При воспроизведении, когда трансгенный один из родителей, независимо овцематка или баран, трансгенное потомства составляет 27,3 -34,8%. Это соотношение трансгенных и нетрансгенных потомков сохраняется- в трёх поколениях.

5. Рекомбинантный ген химозина, локализованный в секреторных клетках молочной железы, способен экспрессировать с выходом продукта экспрессии, прохимозина, непосредственно в молоко.

6. Трансгенные овцы имеют в сравнении с интактными многократно пониженный суточный удой и укороченный период лактации, вследствие створаживания молока непосредственно в альвеолах молочной железы и подавления таким образом лактогенной функции.

7. Лактацию трансгенных овец, находящихся в запуске, можно вызывать инъекциями гормональных препаратов, с одновременным проведением массажа сосков и вымени.

8. Установлено, что молочную продуктивность трансгенных овец можно многократно повысить путем увеличения кратности доения, а также применением предварительного подсоса.

9. Гормональной обработкой возможна индукция лактации у холостых, никогда не ягнившихся животных (ярок) для раннего выявления особей — продуцентов химозина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуем биотехнологическим лабораториям для оценки биологических и продуктивных особенностей овец, трансгенных по гену химозина, использовать метод разведения гемизиштных трансгенных овец с использованием ПЦР-диагностики; метод ранней диагностики экспрессии гена химозина у ярок.

Для преодоления депрессии лактогенной функции у трансгенных по гену хемо-зина овец предлагаем метод гормональной стимуляции, для определения присутствия химозина в молоке - экспресс-методику, и метод выделения химозина из молока в виде готового продукта.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Калмыков, Сергей Петрович, п. Лесные Поляны Московской обл.

1. Абулашвили И.И. Влияние дойки на продуктивные качества тушинских маток и их приплода // Дис. канд. с.-х. наук. Тбилиси, 1978. - С. 144.

2. Арзуманян Е.А. // Животноводство. Под. ред. Москва, 1991. - С. 54.

3. Арипов У.Х., Виноградова В.М. и др. // Овцеводство и козоводство. Справочник. Москва, 1990. - С.65-69.

4. Арсеньев Д.Д. Селекция на многоплодность в романовском овцеводстве // Овцеводство, 1972. № 9. С. 26-29.

5. Арсеньев Д.Д, Арсеньева Т.В. // Селекция романовских овец. Москва, 1985.-С. 172.

6. Асатиани B.C. // Биохимическая фотометрия. Москва, 1957. - С. 569.

7. Атаев Д.А., Лавриненко Г.С. Характеристика молочной продуктивности овцематок грозненской тонкорунной породы // Сб. научно-исследовательских работ аспирантов ВНИИОК. Ставрополь, 1968. - Вып. 1. - С. 84-94.

8. Атаев ДА. Влияние молочности овец на шерстную продуктивность // Сб. науч. работ аспирантов ВНИИ овцеводства и козоводства. Ставрополь, 1968.-Вып. 1.-С. 62-69.

9. Атаев Д.А., Абетуллаев М.И. Шерсть и молоко // Сельские зори. 1985. -№5.-С. 51.

10. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л. «Генные фермы» новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // С.-х. биология. - 1993. - С. 27.

11. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. // Экспериментальная генетика в животноводстве. Москва, 1996.

12. Бурдуковская Т.К., Гребенюк А.З. и др. // Производство овцеводческой продукции. Справочник. Москва, 1989. - С. 45-52.

13. Вениаминов A.A., Буйлов C.B., Хамицаев P.C., Винников Н.И., Мгли-нец А. А. Изучение мясной продуктивности овец // Методические рекомендации ВИЖ. Москва, 1978. - С. 4-6.

14. Вениаминов A.A. // Породы овец мира. Москва, 1984. - С. 116, 206.

15. Волков A.C. Совершенствование методов искусственного осеменения овец // Пути повышения продуктивных и породных качеств овец. Москва, 1985. - С. 90-95.

16. Гизбрехт Я., Терлецкий В. Продуктивные качества у овец различных поведенческих типов и некоторые вопросы интенсификации овцеводства Сибири // Сб. науч. трудов СИБНИВИ. Омск, 1979. - С. 77-83.

17. Гольцблат А.И., Шацкий А.Д. // Повышение продуктивности овец. -Москва, 1982.-С. 221.

18. Гольцблат А.И., Ерохин А.И., Ульянов А.Н. // Селекционно-генетические основы повышения продуктивности овец. Ленинград, 1988. - С. 280.

19. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Брем Г. и др. Получение трансгенных овец-продуцентов молока, содержащего физиологически активные белки, в условиях племенной фермы // С.-х. биотехнология. 1994. - С. 53.

20. Гольдман И.Л., Захарова Е.С., Кадулин С.Г., Сураева Н.М. Химозин — новый биотехнологический продукт // Биотехнология. 1996. - № 12. - С. 3-16.

21. Грачева A.A., Сафин Ф.Б. Молочная продуктивность маток //Овцеводство. 1982. - № 2. - С. 28-29:

22. Гребень Л.К. Молочность цигайских овец в сравнении с метисными,и другими чистопородными овцами // Бюл. зоотехн. опыт, и плем. станции в госзаповеднике «Чапли» (с. Аскания-Нова). 1931. - № 6. - С. 253-273.

23. Груев В. Корреляции между молочностью, шерстностью и живым весом овец // Междунар. с.-х. журн. 1959. - № 2. - С. 108-118.

24. Деревщикова И.Д. Влияние некоторых факторов на многоплодность романовских овец // Автореф. дис. канд. с.-х. наук, 06.02.04. Кострома, 1974.-С. 31-34.

25. Джанчаров ДМ1 Хозяйственная и племенная ценность овец романовской породы с разной плодовитостью // Дис. канд. с.-х. наук.—Москва, 1990. -С. 68-80.

26. Димов Н. Дойка овец в Болгарии // Овцеводство. 1958. - № 7. - С. 43-44.

27. Ерохин А.И. // Совершенствование мясо-шерстных пород овец. Москва, 1981.-С. 135.

28. Ерохин А.И., Карасев Е.А. Продуктивные качества овец романовской породы, финский ландрас и их помесей // Резервы повышения продуктивности романовского овцеводства. 1988. - С. 80-83.

29. Ерохин А.И., Ерохин С.А. Современное состояние овцеводства в мире // Овцы, козы, шерстяное дело. 1999. - № 3. - С. 1-4.

30. Желтобрюх H.A., Ивахненко В.К., Айбазов М.М. Оплодотворяющая? способность спермы баранов, замороженной в раффинозной и лактозно-гуммиарабиковой средах // Методы и приёмы эффективной селекции овец и коз. 1987. - С. 79-84.

31. Зайцева JI.B. Химический состав молока овец дагестанской горной породы // Тр. молодых ученых и аснир. Дагест. НИИСХ. Махачкала, 1969. -Т. 3. - С. 72-74.

32. Заморышев A.B. // За высокую продуктивность романовских овец. -Вологда, 1952. С.43.

33. Зарытовский B.C., Емельянов Г.И. Взаимодействие типов поведения с молочностью маток и резистентностью ягнят романовской породы в условиях промышленной технологии // Научные исследования в романовском овцеводстве. 1982. - С. 39 ■

34. Зарытовский B.C., Крисюк В.И., Вениаминов A.A. и др. // Справочник по овцеводству. Москва, 1982. - С. 239:

35. Зарытовский B.C., Лиев М.И., Емельянов Г.И. // Этология овещ Москва, 1990. - С. 35-40.

36. Зиновьева H.A. Трансгенные кролики как продуценты химозина // Биотехнология. -1998. №4. - С. 7-31.

37. Зиновьева H.A., Попов A.H., Эрнст Л.К., Марзанов Н.С., Бочкарёв В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использовнию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // Дубровицы, 1998. - С. 46.

38. Илялетдинов E.H. Удой и состав молока кроссбредных маток от разных вариантов скрещивания // Вестн. с.-х. наук. Алма-Ата, 1968. - № 2. -С 43-48.

39. Инструкция по искусственному осеменению овец и коз // Москва, 1986.

40. Каюкова Н.В. Овечье молоко и продукты его переработки // Докл. ТСХА. 1995.-С. 15.

41. Карасев Е.А. Продуктивность и биологические особенности овец романовской породы, финский ландрас и их помесей от реципрокного скрещивания // Дис. канд. с.-х. наук. Москва, 1984. - С. 121.

42. Калашников А.П., Клеймёнов Н.И., Баканов В.Н., Венедиктов А.М., Викторов П.И., Герасимов Е.А., Махаев Е.А., Хаданович И.В. и др. // Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Москва, 1985. - С. 352.

43. Кесаев Х.Е. Зависимость молочности маток от уровня кормления // Овцеводство.^ 1982. - № 3. - С. 25-26.

44. Князев А.И. Влияние уровня кормления на молочную продуктивность тонкорунных овец различных конституциональных типов // Докл. ТСХА. -Вып. 5.- 1960.-С. 21.

45. Ковач В. Вопросы современного ухода за овцами // Сельское хозяйство за рубежом. 1956. - № 5. - С. 41-43.

46. Ковнерев И.П. О многоплодии маток и интенсивности развития молодняка романовских овец // Овцеводство. 1969. - № 5. - С. 25-27.

47. Ковнерев И.П. Крупноплодность в зависимости от численности и пола приплода// Овцеводство. 1973. - № 11. - С. 18-19.

48. Ковнерев И.П. Селекционно-племенная работа в романовском овцеводстве // Овцеводство. 1984. - № 12. - С. 24-26.

49. Кольмер М.И., Эрд Т. А., Улманен И. Клонирование и экспрессия химозина в клетках млекопитающих // Биохимия. 1989. - Том 308. - № 1. - С. 234-237.

50. Комов И. Остфризская молочная овца//Животновод. -1994. № 7-8. - С. 1415.

51. Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и др. // Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. Москва, 1985. - С. 287.

52. Коцарев В.Е., Винников Н.И., Белинский В.Е. // Производство и переработка овечьего молока. Москва, 1988. - С. 10-11.

53. Кравченко Н.А. // Племенной подбор. Москва, 1957. - С. 399 .

54. Кулешов П.Н. // Овцеводство. Москва, 1925. - С. 15.

55. Лебедев П.Т., Усович А.Т. Методы исследования кормов, органов и тканей животных // Москва, 1976.

56. Лискун Е.Ф.7/ Общее животноводство. Москва; 1935. - С. 107-109.

57. Лущихин М.Н. Молочность маток киргизской тонкорунной породы // Кормление и разведение с.-х. животных. Фрунзе, 1968. - G. 27-31.

58. Магомедов И.М. Развитие живой массы тройневых романовских ягнят в зависимости от уровня молочности и конституционально-продуктивного типа матерей // Научные исследования в романовском овцеводстве. 1976. - С. 49-53.

59. Маринов П.И. Грудова Ч.Н. Проучване на влиянието на различии про-тектори върху чувствителността на овчине сперматозоиди при криокон-сервация // Biol. Immunol, reprod. София, 1984. - Т. 9. - С. 26-31.

60. Мезина М.Н., Ермолаев В.И., Демидович С.С.,Черных В.Я. Получение химозина из молока трансгенных овец // Зоотехния. 1999. - № 10. - С. 25-26.

61. Миллз О. Молочное овцеводство //Москва, 1983.

62. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных // Москва, 1962.

63. Милованов В.К. Приоритет Советского Союза в создании метода искусственного осеменения и современные проблемы долгосрочного хранения семени баранов. Проблемы долгосрочного хранения семени баранов // Труды ВИЖа. Вып.51. - Дубровицы, 1989. - С. 5-54.

64. Модянов А.В. Потребность в кормах у суягных и подсосных овец и её физиологическое обоснование // Вестн. с. х. науки. Животноводство. — 1940.-№2.-С. 21-42.

65. Николаев А.И., Ерохин А.И. Овцеводство//Москва, 1987. С. 383.

66. Никулина К.Н., Никулин Н.М. Молочная продуктивность цигайских овец приазовского типа// Овцеводство. 1966. - № 2. - С. 21-24.

67. Охотина Д.Н. Молочная продуктивность асканийских тонкорунных овец // Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Кировобад, 1960. - С. 19.

68. Платов Е.М., Кузнецов М. А., Чернова Н.Е. Технология длительного хранения спермы // Овцеводство. 1985. - № 5. - С. 22-24.

69. Платов Е.М., Балбасов Е.Ф. Научно-технический прогресс в искусственном осеменении овец // Зоотехния. 1988. № 4. - С. 51-54.

70. Платов Е.М. Криоконсервация спермы баранов // В кн. Курбатов А. Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Наук В.А. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. Ленинград, 1988. - С. 161-195.

71. Погосян Г.А. Молочная продуктивность армянской полугрубошерстной породы овец (Мартунинский внутрипородный тип) и пути её повышения // Дисс. канд. с.-х. наук МСХА. Москва, 1988. - С. 112.

72. Покатилова Г.А. Селекция в мясо-шерстном овцеводстве//Обзорная информация. 1983. - С. 14-34.

73. Рощупкин Г.А. Тушинская овца // Автореферат, дисс. д-ра с.-х. наук. -Тбилиси, 1958.-С. 36.

74. Рухкян А.А. // Овцеводство-Армянской ССР и пути его качественного улучшения. Ереван, 1948. - С. 489.

75. Санников М.И., Снеговой В.В., Шиянов И.Е. Молочность маток важный селекционный признак в тонкорунном овцеводстве // Овцеводство. -1965.-№4.-С. 25-27.

76. Северин B.C. Молочность цигайских маток и развитие ягнят при разном многоплодии маток // Овцеводство. 1974. - С. 30-31.

77. Селянин Г.И. Подбор романовских овец по типам конституции// Овцеводство. 1983. - № ц. - С. 31-34.

78. Сельское хозяйство России // Москва. - ФГНУ «Росинформагротех», 2006.

79. Смирнов Л.Ф. // Романовская овца. Ярославль, 1950. - С. 153.

80. Смирнов Л.Ф. // Романовская овца. Москва, 1953. - С. 231.

81. Смирнова В Я. Молочная продуктивность овец романовской породы // Сб. науч. тр. Ярославль, 1958. - Вып. 3. - С. 276—288.

82. Соколов В.В., Куц Г.А. Мировое овцеводство. Справочник // Ижевск, 1994.-С. 335.

83. Теребиленко Н.Б. и др. // Интенсификация овцеводства. Москва, 1983. -С. 33-35.

84. Терновенко Н.М. Молочность маток кавказской породы//Овцеводство. -1958.-№4.-С. 24-25.

85. Тощев В.К. Некоторые вопросы интенсификации романовского овцеводства// Овцеводство. 1983. - №3. - С. 9.

86. Триччер Т.Т. Возможности улучшения продуктивности подсосных маток с тремя и более ягнятами при пастбищном содержании // Генетика воспроизведения у овец. Москва, 1987.

87. Ульянов А.Н., Рыжков A.B. // Рекомендации по технологии доения овец в Краснодарском крае. Краснодар, 1989. - С. 7-13.

88. Хоружий Ю.Ф. Воспитание цигайских ягнят при сдваивании под матерями и использование освободившихся маток для дойки // Бюл. сектора овцеводства института гибридизации и акклиматизации животных в Аска-нии-Нова. 1935. - № 8. - С. 104-116.

89. Хэммонд Д. // Рост и развитие мясности у овец. Москва, 1937. - С440.

90. Чепурков А., Тезиев Т. Сыропригодность молока коров в Центральном Предкавказье // Молочное и мясное скотоводство. 2006. - № 2. - С. 31-32.

91. Черекаев A.B., Герман A.A. Молочность чистопородных и помесных алтайских маток // Овцеводство. 1988. - № 2. - С. 24-26.

92. Шихов И.Я. Структурные изменения в молочной железе трансгенных по химозину овец // Международная конференция: ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных. Дубровицы, 2001. - С. 98-100.

93. Эрнст Л.К., Соколовская И.И., Шайдуллин И.Н. Дальние перевозки семени и отдалённая гибридизация // Проблемы долгосрочного хранения семени баранов. Труды ВИЖа. Дубровицы, 1989. - Вып. 51. - С. 86-93.

94. ЭрнстЛ.К., Гольдман И.Л., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца// Биотехнология. 1993.- №5. - С. 2-14.

95. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Зиновьева Н.А., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А., Кадулин С.Г., Брэм Г. Получение овец, трансгенных по генной конструкции альфа aSl-казеин/химозин // Доклады АН/РАН. — 1995. Том 345. - № 4. - С. 555-558.

96. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А., Брэм Г. // Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве. Москва, 2002. -С. 341.

97. Югова Л.В., Дорохов В.В. Производство и применение продуктов микробиологических производств. Микробные заменители сычужного фермента»// Обзорная информация. Москва, 1988. - С. 20.

98. Ядричев В.И. Селекция романовских овец на промышленных комплексах// Научные исследования в романовском овцеводстве. 1975. - С. 31-36.

99. Ясаков А.П. и др. // Производство продукции овцеводства на промышленной основе. Москва, 1978. - С. 63-71.

100. Alifakiotis Т. A., Katanos I., Hatjiminaoglou I., Zervas N., and Zerfiridis G. Induced Lactation in Dairy Ewes by Various Brief Hormone Treatments J Dairy Sci // 1980. T. 63. - P. 750-755.

101. Alvarez P.J., GuaelaJ.A., Jorita E. Influencia del piano de ingestion«dupanta la lactación sobre la producion de leche en ovegas de opdeni deraza «Churra» // 1984. P. 47-68.

102. Armstrong D.T., Evans G. Intrauterine insemination enhances fertility of frozen semen in superovulated ewes J. Reprod. Fértil // 1984. Т. 71.-NI.-P. 89-94.

103. Baia, Gh et al. Contributi la choasterea Productiet de Lapte aoilortigaie rugini //Anaiette, 1956. 14. - P. 567-577.

104. Bochenek M., Kareta W. Domaciczna inseminacja owiec obnizona dawka nasienia mrozonego i swiezego // Med.weter. 1993. R.49. - N 4. - S. 172-174.

105. Brem G., Besenfelder U.,ZinovievaN. et al.//Teriogenology. 1995. -V. 43(1). -P. 175.

106. Davies H. Milk yield of Aystralian Merino owes and lami growthunder pastural conditions // Proc. Austral. Soc. Animal Product. 1958. - V. 2. - P. 140.

107. Handen T,J., Thomas C.R. and Forsyth I.A. // J. Dairy sei; 1979. - Vol: 62.- No 1.-P. 53-57.

108. Homayouni Rad A., Ehsani M.R., Mousavi S.M., Valizadeh M. and Emam-Djomeh Z. Improving the quality of low-fat ice cream by hydrolysis of casein micelles with chymosin (II) // Indian journal agricultural science, 2006. vol: 3 6i - No 6. -P.22. ; '

109. Hostiu C et. al. Cercetari asupra productielde lapte la oile Kapakulsiturcana brumaril // Analele, 14. P. 255 -277. - 1956.

110. Hunton J.R., Flecker S.E.; Maxwell W.M.C. Pregnancy rates following intra-uterine insemination with pellet or straw-frozen ram semen // J. agr. Sc. -1987.-T. 109.-Nl.-P. 189-191.

111. Katanos J.; Alifakiotis T. Induction of lactation in ewes of dairy breeds by hormonal treatment // Summaries 1. Vol. 2. - 1986. - P. 186.

112. Menger H., Nenbert L., Wenig H. Der Einflüss der Jareszeit auf die Qualität von Schafboc ksperma und seine In-vitro und In-vivo Konservierfahig-keit // Mh. Veter.-Med., 1986.« Bd.41. - H.2. - S.55-69.

113. Munor C. Problemas j perspektivas del ganadoovino ante lacommidad Economica Europa //Avances en Aliment mejora amin. 1983. - V. 24. - №4. - P. 11-26.

114. Peters A.R., Ball P. J. H. Reproduction in cattle // London, 1986. P. 188.

115. Regelj I., Perco B., Francky A. et al. Recombinant lamb chymosin // J: dairy science. -2001. 84 vol. - No 5. - P. 1020-1026.

116. Salamon S. Fertility of ram spermatozoa following pellet freezing on dry ice at -79°C and -140 °C // Aust. J. Biol. Sei. 1971. - 24 vol. - No 1. - P. 183185.

117. Salamon S. Fertility of ram spermatozoa frozen-stored for three years. // Proc. 7 Intern. Congr Anim.Reprod. AI, Munich. 1972. 2 vol. - P. 1493-1495.

118. Salamon S., Maxwell W.M.C. Storage of ram semen // Anim.Reprod.Sc. — 2000.- Vol. 62.-N1/3.-P. 77-111.

119. Takenaka S., Fukui Y., Ono H. Intrauterine insemination with frozen semen in the ewe using a laparoscope // Japan. J. anim. Reprod. 1985. - T. 31. -Nl.-P. 25-27.