Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические аспекты в решении задач современного животноводства

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические аспекты в решении задач современного животноводства"

уЬ

. к 0

На правах рукописи

ЗИНОВЬЕВА НАТАЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В РЕШЕНИИ ЗАДАЧ СОВРЕМЕННОГО ЖИВОТНОВОДСТВА

03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы, Московская область 1998

Диссертационная работа выполнена в лаборатории анализа трансгенных животных отдела биотехнологии Всероссийского НИИ животноводства, РАСХН.

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

академик РАСХН, профессор J1.K. Эрнст;

иностранный члан РАСХН, профессор Г. Брем.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Заслуженный деятель науки Российской федерации, доктор биологических наук, профессор Н.И. Сергеев; член-корреспондент РАСХН,

доктор биологических наук, профессор К.Г. Скрябин; доктор биологических наук, профессор A.C. Соболев.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЗВ).

Защита диссертации состоится « $ » декабря 1998 года в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д.020.16.02. при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская обл., Подольский р-н,

п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ животноводства. Автореферат разослан « S » ноября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета канд. с.-х. наук

В.П. Губанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии привело к широкому использованию молекулярно-генетических методов в различных областях науки и практики, в том числе и в животноводстве [Муромцев Г.С. и др. 1990, Эрнст Л.К. и др. i 993]. Они нашли применение в воспроизводстве и селекции сельскохозяйственных животных и становятся незаменимыми для сертификации существующих пород и популяций. Молекулярно-генетические подходы являются неотъемлемой частью программ по получению, анализу и использованию трансгенных сельскохозяйственных животных.

Актуальность темы. Серьезной проблемой при получении трансгенных животных является низкая эффективность переноса генов. Исходя из этого, актуальным является поиск методических подходов, способствующих повышению эффективности трансгенеза.

В настоящее время интерес для современной животноводческой науки и практического животноводства представляет получение и использование трансгенных животных, экспрессирующих рекомбинантные белки [Эрнст Л.К. 1997]. Животные-продуценты являются альтернативой микробиальным и эукариотическим производственным системам, которые характеризуются нарушением или не завершением в ряде случаев некоторых посттрансляционных модификаций [Стронгин А.Я. и др. 1987], большими потерями в конечном выходе и низкой рентабельностью [Томилин Н.В. и др. 1987].

Молочная железа трансгенных животных является идеальным источником синтеза рекомбинантных белков. Она обладает огромным синтетическим потенциалом, так как биологически приспособлена для синтеза и извлечения молочных белков. Кроме того, уже разработаны и внедрены в практику технологии содержания животных в санитарных условиях, что позволит извлекать молоко трансгенных животных без риска контаминации патогенными микроорганизмами [Брем Г. и др. 1993, Эрнст Л. К. и др. 1997]. В этой связи изучение синтеза рекомбинантных белков с молоком трансгенных животных имеет большое теоретическое и практическое значение.

Возможность практического использования молочной железы трансгенных животных как источника рекомбинантных белков предусматривает предпочтительное получение женских особей, что предопределяет научный и практический интерес к диагностике пола эмбрионов на предымплантационной стадии. Наиболее актуальным это является для животных, имеющих длинный генерационный интервал (КРС, овцы, козы). Кроме того, определение пола эмбрионов актуально в

воспроизводстве КРС. Как отмечает Б.П. Завертяев [1989], получение животных определенного пола является не только биологической, но и практической задачей. Трансплантация двух однополых эмбрионов позволяет избежать бесплодия (фримартинизма) телок, рождающихся в разнополых двойнях. Применение метода криоконсервирования эмбрионов делает реальным создание банка эмбрионов с заранее определенным полом от животных с выдающимся генотипом [Эрнст Л.К., Сергеев Н. И. 1989].

Молекулярно-генетические подходы играют важную роль в оценке животных по генотипу. В 1995 году был принят Федеральный Закон 'О племенном животноводстве', в котором в Ст. 19 говорится о необходимости сертификации всего племенного материала, в том числе и по генотипу. Генотипирование животных по полиморфным вариантам белков позволяет выявлять корреляции между различными аллелями и хозяйственно-полезными признаками и целенаправленно вести селекцию на сохранение желательных аллелей в популяции. На сегодня уже установлены корреляционные связи между полиморфными вариантами белков молока и хозяйственно-полезными признаками животных [Маринчук Г.Е. 1992, Ehrmann S. et al. 1993]. Молекулярно-генетические подходы незаменимы в выявлении ряда рецессивных наследственных заболеваний [Krausslich Н., Brem G. 1997]. Диагностика таких мутаций на уровне ДНК (ДНК-диагностика) сделает возможным не только разделение популяции на носителей и неносителей, но и обеспечит выявление, а следовательно, и выбраковку скрытых носителей, что позволит избавиться от нежелательного аллеля в популяции за одно поколение. Такая комплексная оценка животных предусматривает выполнение большого числа анализов. В этой связи актуальным является разработка методик, позволяющих эффективно и с наименьшими затратами проводить необходимые исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и оптимизация молекулярно-генетических методов исследований и их использование для решения проблемных вопросов современного животноводства. Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

• оптимизировать технологию получения трансгенных животных в части, касающейся состава микроинъекционного буфера;

• разработать новые и оптимизировать существующие методы для детального исследования транскрипционных и трансляционных процессов рекомбинантных белков у трансгенных животных с интеграцией кДНК инсулино-

подобного фактора роста 1 человека (hlGF-1) и гена прохимозина КРС под контролем промотора ccsi-казеина (asiCn) КРС;

• провести сравнительный анализ уровня экспрессии hlGF-1 у гемизиготных и гомозиготных трансгенных кроликов для выявления возможности повышения уровня экспрессии посредством селекции на гомозиготность;

• разработать оптимальную схему активирования прохимозина КРС в молоке трансгенных кроликов и овец для достижения максимальной активности фермента;

• оптимизировать метод диагностики пола эмбрионов КРС с использованием единичных бластомеров в качестве матрицы;

• разработать новые и оптимизировать существующие методы подготовки ДНК для анализа посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) из различных исходных материалов;

• разработать точный, эффективный и экономичный метод определения точковых мутаций у сельскохозяйственных животных на основе аллелеспецифической (АС) ПЦР;

• показать универсальность нового метода АС-ПЦР на примере точковых мутаций, обуславливающих злокачественный гипертермический синдром (MHS) у свиней, варианты к-казеина (кСп) у КРС, синдром лейкоцитарной адгезии у черно-пестрого скота (BLAD) и варианты р-лактоглобулина ((5LG) у овец.

Научная новизна. Впервые предложено использование микроинъекционного раствора на основе биологического буфера (синтетическая среда яйцеводов, MSOF) для микроинъекции зигот кроликов и по ряду показателей, таких как выживаемость зигот in vivo, степень трансгенности, общая эффективность переноса генов и др., показаны преимущества MSOF по сравнению со стандартным буфером ТЕ.

Разработана методика, позволяющая использовать молоко трансгенных животных для анализа экспрессии рекомбинантной мРНК.

Изучена на уровне мРНК экспрессия hlGF-1 и прохимозина КРС в молочной железе кроликов, трансгенных по генным конструкциям ctsiCn-hlGF-1 и asiCn-прохимозин, и овец, трансгенных по генной конструкции as-iCn-прохимозин. Показана строгая тканевая специфичность экспрессии рекомбинантных мРНК.

При исследовании транскрипции природного прохимозина в желудке КРС установлено существование альтернативного сплайсинга мРНК прохимозина. Показана полная идентичность рисунка экспрессии мРНК эндогенного фермента и прохимозина, синтезируемого трансгенными животными.

Дана характеристика экспрессии рекомбинантых hlGF-1 и прохимозина КРС в молочной железе трансгенных кроликов и овец. Выявлено, что большая часть рекомбинантных белков присутствует в казеиновой фракции и может быть идентифицирована только после отделения от мицелл казеина. С использованием функциональных тестов показана биологическая активность синтезируемых с молоком трансгенных животных hlGF-1 и прохимозина КРС.

На примере КРС показана возможность диагностики пола эмбрионов с использованием для анализа единичных бластомеров. С целью повышения точности результатов предложено выполнение повторных анализов.

Разработан универсальный метод на основе АС-ПЦР для диагностики точковых мутаций у сельскохозяйственных животных и на ряде примеров показаны его преимущества перед традиционными методами ПЦР-ПДРФ и стандартного АС-ПЦР.

Практическая ценность работы. Даны практические рекомендации по приготовлению и использованию для микроинъекции зигот кроликов буферного раствора MSOF. Показано, что предложенный инъекционный буфер по ряду физиологических показателей in vivo, а также по показателям эффективности трансгенеза превосходит стандартный инъекционный буфер ТЕ.

Выявлено наличие в молоке трансгенных кроликов и овец hlGF-1 и прохимозина КРС, способных к проявлению своих биологических функций, что делает возможным практическое использование синтезируемых трансгенными животными рекомбинантных белков.

Фракционные исследования молока трансгенных животных показали, что большая часть рекомбинантных белков присутствовала в казеиновой фракции (около 60%), что необходимо учитывать при очистке белков из молока с тем, чтобы исключить возможные потери в конечном выходе.

Диагностика пола предымплантационных эмбрионов имеет важное практическое значение при разведении трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков с молоком. Кроме того, диагностика пола эмбрионов, полученных in vitro, позволит пересаживать эмбрионы заранее известного пола и тем самым исключить появление разнополых двоен.

Предложен универсальный метод анализа точковых мутаций у сельскохозяйственных животных, позволяющий выполнять диагностику любых мутаций независимо от вида животных. Метод оптимизирован для анализа MHS у свиней, вариантов кСп у КРС, BLAD у черно-пестрого скота и вариантовриз у овец.

Основные положения, выносимые на защиту.

• новый подход в составе микроинъекционного раствора для более эффективного получения трансгенных животных;

• трансгенные животные как продуценты с молоком биологически активных белков hlGF-1 и прохимозина КРС;

• полная идентичность рисунка экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных и природных белков;

• достоверное повышение уровня экспрессии рекомбинантых белков в молоке (на примере hlGF-1) у гомозиготных животных по сравнению с гемизиготными;

• единичные бластомеры как материал для диагностики пола эмбрионов КРС, полученных in w'iro;

• методы подготовки ДНК для исследования методом ПЦР из наиболее доступных исходных материалов - молока и спермы животных;

• новый универсальный метод АС-ПЦР как альтернатива метода ПЦР-ПДРФ и стандартного метода АС-ПЦР для диагностики точковых мутаций у сельскохозяйственных животных.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены: 1) на конференции немецкого общества скотоводов в Геттингене (Германия), 28-29 сентября 1993 г.; 2) на Международной научной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» в Пушкине, Санкт-Петербург, 25-27 мая 1994 г.; 3) на Международной конференции общества по пересадке эмбрионов в Калгари (Канада), 2-8 января 1995 г.; 4) на заседании немецкого общества по пересадке эмбрионов (AET-d) в Клеве (Германия), 1-2 июня 1995 г.; 5) на конференции Европейской Ассоциации по животноводству в Праге (Чехия), 2-8 сентября 1995 г.; 6) на конференции Немецкого общества скотоводов в Ганновере (Германия), 20-21 сентября 1995 г.; 7) на 3 Международном Симпозиуме IBC «Использование трансгенных технологий для коммерческих разработок» в Сан-Диего (США), 30 ноября-1 декабря 1995 г.; 8) на научно-практической конференции IFA в Тулльне (Австрия), 25 апреля 1996 г.; 9) на II Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных» в Киеве, 15-17 мая 1996 г.; 10) на Международной конференции, посвященной памяти академика А.А.Баева, в ИБХ, Москва, 20-21 мая 1996 г.; 11) на XXVII международной конференции ISAG, Франция, 21-25 июля 1996 г.; 12) на украинско-австрийском симпозиуме «Сельское хозяйство: наука и практика» в г. Львов (Украина), 22-26 сентября 1996 г.; 13) на международной конференции

"Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" во ВНИИСХБ, Москва, 30-31 октября 1996 г.; 14) на научно-практической конференции 'Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения', в Быково, Моск. Обл., 16-20 июня 1997 г.; 15) на конференции IBC 'Трансгены-терапевты' в Вест Пальм Спринг (США), 7 февраля 1997 г.; 16) на VIII конференции РАН «Новые направления биотехнологии» в г. Москва, 27-29 апреля 1998 г.; 17) на австрийско-украинском симпозиуме «Сельское хозяйство: наука и практика» в г. Вена (Австрия), 14-16 сентября 1998 г.

Публикации. Опубликовано 47 работ, в т.ч. методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве (47 е.), публикации в журналах «Биотехнология», «Вестник РАСХН», «Доклады РАН», «Доклады РАСХН», «Онтогенез», «Сельскохозяйственная биология», «Успехи современной биологии», «Animal Biotechnology», «Gene», «Reproduction Domestic Animals», «Theriogenology», «Veterinary Records», Сборнике научных трудов РАСХН, материалах российских и зарубежных научных конференций. Переведена на русский язык и дана специальная редакция книги Брема Г., Кройслиха X., Штранцингера Г. «Экспериментальная генетика в животноводстве».

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ страницах,

содержит 33 таблицы, 52 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, который включает 295 источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Схема экспериментальных исследований наглядно представлена на рисунке 1.

Для получения трансгенных животных был использован метод микроинъекции раствора ДНК в мужской пронуклеус зигот [Hammer R.E. et at. 1985; Вгет G. et al. 1985]. В качестве инъекционных растворов использовали буфер ТЕ (10 мМ Трис-HCI, рН=7,4; 0,1 мМ ЭДТА, рН=8,0), а также апробированный нами буфер MSOF.

Для микроинъекции зигот кроликов применяли конструкции гена прохимозина КРС (р43, р77, р99) и кДНК hlGF-1 (р140) под контролем регуляторных элементов asiCn КРС. Зиготы получали от суперовулированных самок кроликов породы Zika. Подготовку доноров и реципиентов, извлечение и пересадку эмбрионов проводили по отработанной методике [Зиновьева Н.А. и др. 1996]. Микроинъекцию осуществляли в мужской пронуклеус под микроскопом при увеличении х400. В

Рисунок 1. Схема экспериментальных исследований

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ-ПРОДУЦЕНТЫ

| Подготовка доноров, реципиентов

Вымывание эмбрионов у доноров.

Микроинъекция зигот | msof | ¡"те |

а^Сп-прохимозин | «s1Cn-hlGF-

¿3 ей

р140

Овцы

Кролики

I

Пересадка эмбрионов реципиента!^

1 Анализ трансгенных животны)Г~1

Анализ | Анализ экспрессии|

ДНК

Г

мРНК

r^TFra

х

Белок

Создание трансгенных линий

ДИАГНОСТИКА ПОЛА ЭМБРИОНОВ

Культура in vitro

1 а

-U ф

I 2

? о

M

с ю

3

35

о> «

О.

§ s IS

i§

И Ô §

Лизис

ПЦР-1

2FX, ZFY специфический

ПЦР-2 аллелеспецифический

ПАГЭ

Окрашивание

Анализ фрагментов

Идентификация пола

ДИАГНОСТИКА ТОЧКОВЫХ МУТАЦИЙ

Биологические пробы

s

X

IJ

3" s

о g

о *

Метод Кавасаки

Солевой метод

Щелочной лизис (нов.)

Экстракция ДНК и создание банка ДНК

ПЦР-анализ

ПЦР-ПДРФ

Стандартный АС-ПЦР

Новый АС-ПЦР

Генотипирование

Свиньи

Овцы

il ta ю С О | с;

каждый эмбрион инъецировали 1-2 пкл раствора ДНК в концентрации 1000 копий/пкл. Пересадка инъецированных эмбрионов синхронизированным реципиентам была выполнена хирургически [ßesenfelder U. 1990] или с помощью лапароскопа [Besenfelder U., Brem G. 1993] профессором У. Безенфельдером (Вена, Австрия). Окролы ожидали на 31-ый день после пересадки эмбрионов. В случае задержки реципиентам вводили 0,3 МЕ окситоцина внутримышечно. Пробы тканей (кожа) отбирали на 4-5-ый день после окрола.

Две первичные трансгенные по р77 овцы № 586 и № 596 были получены в отделе биотехнологии ВНИИ животноводства к. мед. н. И.Л. Гольдманом с сотрудниками. Разведение трансгенных овец выполнялось в Биотехцентре РАСХН под руководством профессора М.И. Прокофьева (Горки Ленинские).

ДНК из проб тканей кроликов и овец выделяли модифицированными методами фенольно-хлороформовой и солевой экстракций [по Зиновьева H.A. и др. 1998]. Анализ на наличие трансгена выполняли методом ПЦР [Saiki R.K. et al. 1988) с использованием капиллярного амплификатора [Зиновьева H.A. и др., 7995]. Продукты амплификации разделяли в 1,6-1,8% агарозном геле с добавлением бромида димидия до конечной концентрации 30 нг/мл и рассматривали в ультрафиолетовом (УФ) свете. Число копий трансгена определяли методом Southern-блотанализа[AusubelF.M. etat. 1987].

РНК выделяли из тканей молочной железы и из других органов кислым гуанидин-изотиоцианатным методом [Chomcynski Р., Sacchi N. 1987]. Выделение РНК из молока трансгенных животных выполняли по методике, разработанной в ходе выполнения диссертации [Зиновьева H.A. и др. 1998]. Доказательство наличия трансгенной мРНК осуществляли посредством проведения реакции реверсивной транскрипции (РТ) с Олиго(сГГ)18 в качестве праймера с последующим специфическим ПЦР анализом транскриптов. Для характеристики наличия и длины альтернативных транскриптов прохимозина, выявленных в ходе РТ, использовали 16 комбинаций праймеров. Доказательство наличия РНК и контроль выполнения РТ вели с использованием праймеров, специфических для а-актина гладкой мускулатуры кроликов и ß-актина овец [Зиновьева H.A. и др. 1998]. Для установления корректной длины мРНК hlGF-1 и прохимозина КРС выполняли Nothern-блот анализ РНК, выделенной из молочной железы трансгенных самок [Ausubel F.M. et al. 1987].

Молоко получали от самок кроликов после введения 0,3 МЕ окситоцина внутримышечно с использованием машины для доения кроликов [Schranner S. 1993] или вручную. Молоко от трансгенных овец было получено в Биотехцентре РАСХН к. б. н. Мезиной М.Н. посредством ручного сдаивания. Пробы молока для белкового

анализа хранили при -20°С. Анализ наличия трансгенного белка вели раздельно в сывороточной и казеиновой фракциях. Для этого молоко центрифугировали при 15000 g в течение 30 мин. Экстракцию белков из казеиновой фракции осуществляли с помощью специального буфера (8 М мочевина; 20 мМ Трис-HCI, рН=7,6; 10 мМ ДТЕ). Для перехода неактивного прохимозина в молоке кроликов и овец в активные псевдохимозин и химозин с учетом выявленных закономерностей [Pedersen V. et а/. 1979; Pitts J.E. et at. 1992] были разработаны различные схемы активации при рН=2,5, рН=3,5 и рН=4,5. Активированные различными способами пробы молока трансгенных животных разгоняли посредством гель электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГЭ) [Laemmli U. 1970] и анализировали методом Western-блотинга. Для выявления специфических сигналов использовали тест-набор (ECL, Amersham). Концентрации рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных определяли посредством сравнения полученных сигналов с известными концентрациями коммерческих стандартов.

Биологическая активность hlGF-1, полученного из молока трансгенных кроликов, была определена в институте молекулярного животноводства при Университете имени Людвига-Максимилиана (Мюнхен, Германия) профессором Э. Вольфом посредством стимуляции синтеза ДНК в клетках MG-63. Для доказательства биологической активности химозина, получаемого с молоком трансгенных кроликов и овец, выполняли коагуляционный тест, основанный на свойстве химозина способствовать образованию казеинового сгустка вследствие специфического расщепления кСп. Количественное определение активности химозина в единицах активности (CU) вели с использованием калибровочной кривой (зависимость активности от времени сворачивания), построенной с использованием известных концентраций коммерческого химозина.

Для определения пола эмбрионов на предымплантационной стадии были использованы эмбрионы КРС, полученные in vitro в Баварском исследовательском центре по воспроизводству (Обершляйсхайм, Германия). Для диагностики был использован двухступенчатый метод ПЦР анализа фрагментов гомологичных генов ZFX и 2FY, локализованных соответственно на X и Y хромосомах [Aasen Е, Medrano J.F. 1990]. ПЦР-1 выполняли с помощью двух «наружных» общих для обоих генов праймеров. В ПЦР-2 использовали три «внутренних» праймера: один общий для обоих генов З'-праймер и два специфических для ZFX и ZFY генов 5'-праймера [Зиновьева Н.А, Брем Г. 1995]. Для определения пола от каждого эмбриона брали единичные бластомеры и ставили две или три независимые реакции с

использованием в качестве матрицы одного бластомера. Для положительного XX контроля использовали 1 гранулезную клетку из монослоя или 50 пкг женской ДНК крупного рогатого скота, а в качестве контроля XY - 50 пкг геномной ДНК быка. Продукты ПЦР разделяли посредством ПАГЭ в готовом 4-20% геле (BioRad), окрашивали в растворе бромида димидия и рассматривали в УФ свете.

Диагностику точковых мутаций у сельскохозяйственных животных осуществляли предложенным нами универсальным методом АС-ПЦР [Зиновьева Н.А. и др. 1997]. С целью упрощения анализа были предложены методики использования для анализа молока и спермы животных как наиболее доступных исходных материалов [Зиновьева Н.А. и др. 1998]. Контроль точности осуществляли параллельной амплификацией методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) [Saperstein D.A. et al. 1991]. Основные материальные и временные затраты предложенного подхода определяли в сравнении с методами ПЦР-ПДРФ и стандартного АС-ПЦР [Wu D.Y. et al. 1989]. Диагностика MHS у свиней была основана на определении рецессивной мутации Ц->Т в позиции +1843 гена Ryr1 свиней [Fujii J. et al. 1991]. Анализ вариантов А и В кСп КРС осуществляли посредством определения мутации Ц->Т в позиции 5345 гена кСп [Alexander L.J. et al. 1988]. Диагностика коров молочного типа швицкой -породы по вариантам кСп была выполнена к. б. н. А.Н. Поповым. Наличие BLAD у черно-пестрого скота устанавливали посредством диагностики рецессивной мутации А-»Г в позиции +488 гена CD18 [Shuster D.E. et al. 1992]. Анализ вариантов А и В pLG у овец проводили посредством диагностики мутации Т-Щ в позиции 1617 гена pLG (EMBL Х12817).

Результаты проведенных экспериментов обработаны статистически и документированы фотографиями.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. MSOF как основа микроинъекционного буфера.

С тем, чтобы исключить влияние внешних факторов, было проведено 6 независимых программ по получению трансгенных кроликов с интервалом в 1-2 недели, в каждой из которых было использовано 20-30 реципиентов. Для статистической обработки результатов были использованы реципиенты, имеющие 3 и > желтых тел (С. L.) на яичниках.

2.1.1. Анализ физиологических показателей.

Для выявления влияния буфера MSOF по сравнению с ТЕ на эмбрионы был проведен анализ физиологических показателей реципиентов в зависимости от используемого микроинъекционного буфера. Как показывают данные таблицы 1,

инъекция ТЕ по сравнению с МБОЯ приводила к уменьшению числа окропившихся реципиентов на 12,8%. Поскольку число С. Ь. в группах не различалось (можно принять, что прогестероновый статус реципиентов находился на одном уровне), изменение этого показателя объясняется влиянием ТЕ на жизнеспособность эмбрионов, их способность к имплантации и дальнейшему развитию.

Таблица 1.

Физиологические показатели реципиентов в зависимости от инъекционного буфера

Показатели МЭОР ТЕ Р

Число реципиентов 75 76

Число С. 1. на реципиента 7,3+1,6 7,8+1,9

Число окропившихся 55 46

реципиентов, п

Доля норм, окролов1 в % ■-■ 73, зШ ;Г МЗОР>ТЕ (р>б,05)

Пересажено эмбрионов на

одного реципиента 20,1±0,3 20,3+0,3

Родилось крольчат 234 143

из них мертворожд., % 9,0+1,9 25,2+3,6 МБОРсТЕ (р<0,001)

Размер гнезда 4,3+1,7 3,1+1,7 МЭОР>ТЕ (р>0,05)

Выживаемость2, % "15,5+0,9 9,3+0,2 МБС^ТЕ (р<0,001)

Выживаемость у окролив- 20,9+1,2 15,1+ 1,2 М50Р>ТЕ (р<0,001)

шихся реципиентов3, %

Отношение числа окропившихся реципиентов к общему числу реципиентов в %. Отношение числа родившихся крольчат к числу пересаженных эмбрионов в %. Отношение числа родившихся крольчат к числу эмбрионов, пересаженных окролившимся реципиентам, в %.

Важное значение имеет показатель среднего размера гнезда, так как он

рассчитывается только для тех реципиентов, которые оказались способными к вынашиванию потомства. В среднем от одного реципиента в группе МБОР было получено на 1,2 крольчонка больше по сравнению с группой ТЕ, в то время как число эмбрионов, в среднем пересаживаемых реципиентам, не различалось. Анализ процентного распределения реципиентов по размеру гнезда в двух группах показал, что 50% реципиентов в группе ТЕ приносили по 1-2 крольчонка на окрол, в то время как в группе МБОР - лишь 20% (р<0,001). Сравнение доли мертворожденных крольчат от общего числа потомков выявило достоверные различия (р<0,001) между группами: в группе ТЕ мертворожденность была выше на 16,2%. Вероятно, токсичное действие ТЕ по своей силе превосходило МЭОР и сказывалось даже на поздних стадиях эмбриогенеза, приводя к рождению нежизнеспособного потомства.

Основным физиологическим показателем, который позволяет напрямую выявить влияние инъекционного буфера на жизнеспособность эмбрионов, является показатель выживаемости эмбрионов. Как видно из данных таблицы 1, в группе МЭОР наблюдалась в 1,7 раза более высокая выживаемость эмбрионов (р<0,001).

Анализ этого показателя у окропившихся реципиентов выявил в 1,4 раза (р<0,001) лучшую выживаемость в группе МБОЯ. Таким образом, было показано, что МЭОР является более оптимальным буфером для эмбрионов по сравнению с ТЕ. 2.1.2. Эффективность трансгенеза.

Несмотря на важное значение физиологических показателей, они являются лишь предпосылками для успешного получения трансгенных животных. Показатели эффективности трансгенеза в исследовательских группах приводятся в таблице 2.

Таблица 2.

Показатели эффективности трансгенеза в исследовательских группах

Показатели МБОР ТЕ

Пересажено эмбрионов 1509 1542

Родипось крольчат 234 143

в т.ч. трансгенных 21 14

из них мертворожденных, п (%) 3 (14,3±7,6) 4 (28,6+3,7)

Степень интеграции1, % 9,0±1,8 9,8±2,5

Общая эффективность2, % 1,4±0,3 0,9±0,2

Эффективность у окролившихся

реципиентов3, % 1,9±0,6 1,5±0,4

'отношение числа трансгенных животных к общему числу родившихся крольчат в %. Отношение числа трансгенных животных к общему числу пересаженных эмбрионов в %. Отношение числа полученных трансгенных животных к числу эмбрионов, пересаженных окропившимся реципиентам, в %.

Как видно из данных таблицы 2, между группами не наблюдалось различий в

степени интеграции (9,0 и 9,8%). Этот факт вполне объяснимым, поскольку интеграция зависит, прежде всего, от метода, используемого для введения ДНК, и от вида животных. Эффективность получения трансгенных животных определяется, в первую очередь, количеством полученных трансгенных животных в зависимости от пересаженных эмбрионов. В наших исследованиях за счет использования физиологически оптимального буфера МБОР результативность увеличивалась в 1,6 раза и составляла 1,4% по сравнению с 0,9% при использовании ТЕ, что позволяет говорить о тенденции повышения эффективности программ по переносу генов за счет использования (\zISOF. Кроме того, что в группе МБОР было получено больше трансгенных животных, лишь 14,3% из них были нежизнеспособны в то время как в группе ТЕ нежизнеспособными оказались 28,6%" особей. Следовательно, имела место тенденция к снижению доли мертворожденных среди трансгенных животных при использовании МЭОР по сравнению с ТЕ.

Полученные результаты позволяют предположить, что применение МБОР за счет уменьшения числа эмбрионов, а, следовательно, доноров и реципиентов, требующихся для получения одного трансгенного животного, позволит сократить затраты на выполнение программ по переносу генов.

2.2. получение и анализ трансгенных животных.

Трансгенные по aSiCn-hlGF-1 кролики были получены микроинъекцией генной конструкции р140. Скрининг животных посредством ПЦР выявил наличие трех носителей трансгена. Общая эффективность трансгенеза составляла 1 % при степени интеграции 11%. Southern блот анализ показал, что все трансгенные животные интегрировали трансген без делеций и перестроек и передавали его по наследству. Программа по размножению трансгенных животных была выполнена с одной линией (№ 4117). Стабильная трансмиссия трансгена наблюдалась в семи полученных к настоящему времени поколениях трансгенных кроликов.

Кролики, трансгенные по asiCn-прохимозин, были получены микроинъекцией генных конструкций (р43, р77, р99), отличающихся небольшими модификациями в 5' и 3' регуляторных областях. ПЦР-анализ выявил наличие 17 трансгенных животных (9 самцов, 8 самок), из которых 8 (6 самок и 2 самца) дали начало трансгенному потомству. Southern-блот анализ ДНК трансгенных животных показал наличие в геноме от 3 до 50 копий трансгена. Все животные интегрировали трансген в тандемной ориентации без делеций и перестроек.

Овцы, трансгенные по конструкции asiCn-прохимозин, были получены микроинъекцией генной конструкции р77. Проведенный ПЦР анализ выявил наличие двух трансгенных ярок № 586 и № 596. Общая эффективность переноса генов составляла 2,9% при степени интеграции 9,1%. Передача трансгена по наследству была доказана только у овцы № 586, которая в дальнейшем была использования для создания трансгенной линии. Стабильная трансмиссия трансгена наблюдалась у трех размноженных до настоящего времени поколениях трансгенных овец.

Между всеми полученными трансгенными животными и нетрансгенными сибсами не наблюдалось каких-либо различий по фенотипическим показателям и показателям здоровья.

2.3. Анализ транскрипции у трансгенных животных.

2.3.1. Молоко как источник РНК для анализа экспрессии у трансгенных животных.

Традиционным источником получения специфической РНК молочной железы являются пробы ткани. Однако такой способ требует наркотизации животного, сопряжен с небольшим, но все же риском, а так же требует наличия у специалиста соответствующих навыков взятия биопсий и практически не приемлем, если стоит цель исследовать экспрессию РНК у одного животного в динамике. В этой связи, идеальным источником рекомбинантной РНК было бы молоко трансгенных животных, а именно присутствующие в нем соматические клетки. Нами была

предложена методика выделения РНК из молока с целью анализа экспрессии трансгена. Анализ полученной из молока трансгенных овец РНК методом РТ-ПЦР выявил наличие экспрессии трансгена и показал, что молоко может служить источником рекомбинантной мРНК и использоваться для характеристики экспрессии специфических для молочной железы генных конструкций у трансгенных животных.

2.3.2. Экспрессия мРНК ЬЮР-1 у трансгенных кроликов.

Для изучения экспрессии были использованы кролики линии № 4117. МоШегп-блот анализ общей РНК, выделенной из молочной железы лактирующих трансгенных самок показал наличие сигнала ожидаемой длины {рис. 2)

Рисунок 2.

Nothern-блот анализ кроликов, трансгенных no asiCn-hlGF-1

А. 1 2 3 4 5 6 Б. 1 2 3 4 5 6

28 S ► 28 S ►

18 S»^ 18S&-

«

f|f ;; ■ ' ■ ', «—

Гибридизация 15 мкг общей РНК трансгенной самки № 4701 (F2) (дорожки 1-3) и нетрансгенных сестер (дорожки 5, 6). 1 - молочная железа; 2 - печень; 3 - мышечная ткань; 4 - пустая дорожка; 5, б - молочная железа. А. Гибридизация с пробой, специфической для hlGF-1. Б. Контрольная регибридизация с пробой, специфической для asiCn кроликов. Ауторадиограмма была экспонирована на рентгеновскую пленку течение 18 ч. Позиции рибосомальной РНК 18S и 28S показаны черными треугольниками. Локализация специфических фрагментов маркирована стрелками.

Для характеристики тканевой специфичности экспрессионного вектора ctsiCn-hlGF-1 методом РТ-ПЦР была проанализирована РНК из мышечной ткани, печени, почек, легких, кишечника, поджелудочной железы, селезенки, слюнных желез, мозговой ткани и молочной железы лактирующих трансгенных самок. Наличие рекомбинантного транскрипта было установлено только в молочной железе.

Анализ стадиоспецифичности экспрессии трансгена был выполнен в сравнении с экспрессией эндогенной мРНК asiCn кроликов. Трансгенная экспрессия была выявлена только у лактирующих трансгенных самок. У молодых нелактировавших трансгенных самок, самок в послелактационный период (50 дней после окрола) и нетрансгенных лактирующих самок не было обнаружено специфических продуктов ПЦР. Экспрессия эндогенной мРНК asiCn кроликов была найдена у лактирующих

самок. Очень слабый сигнал был визуализирован у самок в послелактационный период. Учитывая количественное соотношение экспрессии ИЮР-1 и о^Сп кроликов, можно сделать вывод об идентичности рисунка экспрессии ЬЮР-1, обусловленной регуляторными элементами с^Сп КРС, и о^Сп кроликов.

2.3.3. Экспрессия мРНК прохимозина у трансгенных кроликов и овец.

Анализ экспрессии мРНК прохимозина был выполнен у 3 первичных

трансгенных животных (№ 3735, р43; № 2827, р77; № 2847, р77) и самок 4 трансгенных линий: линия 2290 (р43, ?2, № 3332 и № 3335), линия 2847 (р77, № 3321), линия 2848 (р77, № 3213 и № 3217) и линия 2953 (р99, № 3501).

У всех исследованных животных был найден специфический фрагмент ожидаемой длины. Анализ экспрессии мРНК прохимозина в 10 различных тканях лактирующих трансгенных самок показал, что молочная железа являлась единственным местом экспрессии трансгена.

Для анализа экспрессии мРНК прохимозина в молочной железе трансгенной овцы № 586 (Р) была использована РНК, выделенная из молока (глава 2.3.1.). РТ-ПЦР анализ показал наличие сигнала ожидаемой длины. Точность результатов была подтверждена амплификацией фрагмента кДНК р-актина овец.

2.3.4. Анализ продуктов сплайсинга гена прохимозина в желудке крупного рогатого скота и в молочной железе трансгенных животных.

Для характеристики продуктов сплайсинга мРНК прохимозина были использованы 18 пар праймеров, локализованных в различных участках гена прохимозина. РТ-ПЦР анализ транскриптов прохимозина как в молочной железе трансгенных кроликов и овец, так и в желудке теленка кроме продуктов ожидаемой длины выявил наличие более коротких продуктов. Было сделано предположение, что кроме мРНК прохимозина нормальной длины, существует также семь альтернативных транскриптов, характеризующихся отсутствием одного или нескольких экзонов. Клонирование продуктов РТ-ПЦР из желудка теленка и из молочной железы трансгенных кроликов и овец и их последующее секвенирование подтвердило, что найденные короткие фрагменты действительно являлись продуктами альтернативного сплайсинга мРНК прохимозина. Сравнение экспрессии мРНК прохимозина в желудке теленка и в молочной железе трансгенных животных показало полную идентичность рисунка экспрессии как по длине (РТ-ПЦР), так и по последовательности образующихся в ходе сплайсинга фрагментов (секвенирование). Количественное сравнение продуктов амплификации каждой из пар праймеров в ходе РТ-ПЦР показало, что в желудке теленка и в молочной железе трансгенной овцы на фоне преобладающей экспрессии полной мРНК прохимозина

альтернативные продукты синтезировались лишь в незначительной степени, в то время как у трансгенных кроликов синтез был смещен в сторону преобладания транскриптов с отсутствием экзона 6, экзонов 3, 4 и 6 и экзонов 3, 4, 6 и 8.

С тем, чтобы окончательно сделать вывод о наличии и числе альтернативных продуктов прохимозина в желудке телят и в молочной железе трансгенных кроликов и овец, были отобраны три пары праймеров (И1 или 0лиго250 как 5' праймеры и Р?Э5, РБЗ и Я579 в качестве 3' праймеров), которые с учетом выдвинутых предположений давали полную характеристику альтернативных транскриптов. Гибридизационный анализ продуктов РТ-ПЦР (рис. 3) выявил наличие четырех специфичных транскриптов различной длины, содержащих 8-ой экзон (1 полный транскрипт и 3 альтернативных) и четырех специфичных транскриптов, не имеющих 8-ого экзона (альтернативные транскрипты), причем у трансгенных животных присутствовали все альтернативные продукты сплайсинга мРНК прохимозина, как и у КРС. Сравнение относитепьного уровня экспрессии показало, что рисунок экспрессии у трансгенных овец по сравнению с трансгенными кроликами был ближе к КРС. Результаты проведенного анализа схематично представлены на рисунке 4.

Рисунок 3.

Анализ экспрессии мРНК прохимозина у КРС и трансгенных животных

РТ-ПЦР анализ мРНК прохимозина с праймерами РЛ (0лиго250) I (А), (0лиго250) / Р^З (Б), (0лиго250) / Я379 (В) с последующей гибридизацией с зондом 1. 1 • желудок теленка, 2 -молочная железа трансгенной овцы № 586 (р77, Р), 3 - молочная железа трансгенного кролика № 3213 (линия 2847, р77, ?2). Локализация фрагментов маркера 1 т.п.н. и их длины в парах нуклеотидов показаны слева.

2.4. Анализ синтеза рекомбинантных белков у трансгенных животных.

2.4.1. Исследование синтеза ЬЮР-1 у трансгенных кроликов.

Присутствие Ы6Р-1 в молоке трансгенных кроликов было доказано методом иммуноблотинга. Сравнение силы сигнала 11ЮР-1 в казеиновой и сывороточной фракциях молока у трансгенной родоначальницы линии № 4117, а также у 11 трансгенных кроликов поколений Р2-Р5 показало, что 60-70% ЫСР-1 было связано с мицеллами казеина и не могло быть выделено в сыворотку посредством

Схема продуктов альтернативного сплайсинга гена прохимозина КРС.

Э1 32 33 34 35 36 37 38 39 п.о.

п 87 | 151 118 119 | 200 114 145 | 99 | 274

I

1 -99 |

1 м 151 , 118 119 I 200 114 145 | | 274 J 1208 -99

I"«

2 87 | 151 118 119 | 200 145 I 99 274 J 1193 -114

| "99

3 ы 151 118 119 | 200 145 274 _j 1094 213

м | -24

4 119 | 200 114 145 I 99 | 274 J 1070 -237

пп — 1

5 119 | 200 114 145 I 274 J 971 336

[ТГ| | -15

6 119 | 200 145 I 99 | 274 ] 956 -351

flT] | -99

7 119 | 200 145 274 ] 857 - 150

Э1-Э9 - зкзоны прохимозина. Длины экзонов в ларах нуклеотидов (п.н.) приведены в соответствующих прямоугольниках. Отсутствующие экзоны показаны пунктиром. Длины транскриптов в п.н. заключены в серые прямоугольники. Уменьшение длины транскриптов по сравнению с полной мРНК прохимозина в п.н. указано со знаком «-».

центрифугирования. При анализе обезжиренного молока перечисленных выше трансгенных животных было обнаружено меньше hlGF-1, чем суммарно при раздельном анализе сывороточной и казеиновой фракций. Это было объяснено тем, что при использовании обезжиренного молока часть hlGF-1 не отделялась от казеиновых мицелл и присутствовала в высокомолекулярной фракции.

Концентрацию рекомбинантного hlGF-1 в молоке трансгенных кроликов определяли путем сравнения силы сигнала (денситометрически в геле, окрашенном нитратом серебра, и визуально в иммуноблоте) с различными концентрациями коммерческого hlGF-1. В молоке трансгенной родоначальницы линии № 4117 содержалось около 0,3 мг/мл hlGF-1. Уровень hlGF-1 у потомков (F2-F5), выявленный методом Western-блот анализа, колебался от 0,3 до 1,5 мг/мл.

Для анализа большого числа проб был проведен радиоиммунологический (RIA) анализ определения содержания hlGF-1. Было исследовано 11 животных поколений F2-F4, в том числе 8 гемизиготных и 3 гомозиготных (табл. 3).

У четырех животных концентрация hlGF-1 была определена в 1-ую и 2-ую лактации. У всех исследованных особей отмечалось увеличение содержания рекомбинантного белка во вторую лактацию по сравнению с первой. У гемизигот

RIA анализ содержания hlGF-1 в молоке трансгенных кроликов линии № 4117

1-ая лактация 2-ая лактация

Трансгенная Число Концентр. Мин.-макс. Число Концентр. Мин.-макс.

самка проб, hlGF-1 уровень проб, hlGF-1 уровень

(поколение) п [мкг/мл]; [мкг/мл] п [м кг/мл]; [мкг/мл]

3074 (Р2) 17 456±39 294-837 н.о.

3091 (Р2) 18 484±39 253-886 н.о.

819 (Рз) 6 209+51 157-396 н.о.

834 (Рз) 8 223122' 112-260 18 29918 241-362

836 (Р3) 5 255116" 222-312 12 353+11" 309-421

848 (Рз) 5 244±30 166-324 н.о.

854 (Рз) 6 321128 224-406 16 341+19 226-471

877 (Р4) 11 469+22 332-574 н.о.

3090"° (Рг) 15 /639187 : 239-1201 и.о.

869*° (Р4): 15 ! 360+15" ; ' 252-455: ■ 8 678+80" 348-999

6914Ьо (Р4) 9 ; 5671113 К 242-1255 :: Н.О.

** разница между средним содержанием (1ЮР-1 в первую и вторую лактации достоверна (*-р<0,01,**-р<0,001);

. н.о. - не определено; Ио - гомозиготные животные

содержание ИЮРИ в молоке в первую лактацию составляло 262±16 мкг/мл, а во вторую лактацию - 328±8 мкг/мл. Таким образом, происходило увеличение концентрации |1ЮР-1 на 20,1% (р<0,001). Аналогичная закономерность наблюдалась и у исследованной гомозиготной крольчихи № 869: концентрация ИЮР-1 в молоке во вторую лактацию увеличивалась на 45,4% по сравнению с первой (р<0,001).

В среднем гемизиготные животные продуцировали 363+12 мкг/мл ИЮР-1 (122 пробы от 8 кроликов), в то время как средняя концентрация в молоке гомозиготных животных составляла 543±41 мкг/мл (47 проб от трех кроликов). Таким образом, происходило увеличение концентрации ЫСР-1 у гомозиготных животных на 49,6% (р<0,001). Уровень эндогенного ЮР-1, измеренный в молоке трех контрольных нетрансгенных кроликов, был ниже 0,2 мкг/мл.

Все исследованные трансгенные животные характеризовались высокой изменчивостью содержания ЫСР-1 в ходе лактации, однако какой-либо зависимости содержания рекомбинантного ЬЮР-1 от дня лактации выявлено не было. Так, коэффициент изменчивости содержания |1ЮР-1 в молоке трансгенных кроликов колебался у гемизиготных животных от 11 ±2% до 37±11%, а у гомозиготных животных от 16±3 до 60±14% и составлял в среднем у гемизигот 37±2% и у гомозигот - 52±5%. Таким образом, гомозиготные животные характеризовались более высокой степенью изменчивости содержания рекомбинантного белка в молоке по сравнению с гемизиготными (р<0,01). Причины такой вариабельности до настоящего времени остаются неизвестными.

Исследование биологической активности 1пЮР-1 посредством измерения степени инкорпорации [3Н] тимидина в клетках МС-13 показало, что очищенный из молока трансгенных кроликов рекомбинантный ЫСР-1 стимулировал синтез ДНК в той же степени, что и коммерческий ЬЮР-1, используемый в качестве контроля.

Весь комплекс проведенных исследований показал, что трансгенные животные способны тканеспецифически синтезировать с молоком до 1,5 г/л ИЮР-1, обладающего биологической функциональностью, и, следовательно, могут с успехом использоваться как продуценты активного ЫСР-1 в коммерческих целях.

2.4.2. Анализ экспрессии прохимозина КРС у трансгенных кроликов.

Исследование молока трансгенных кроликов методом \Л/ез1егп-блотинга на наличие прохимозина КРС было выполнено у 14 животных семи различных линий. В среднем около 60% от общего количества прохимозина в молоке приходилось на казеиновую фракцию, в то время как в сывороточной фракции присутствовало около 40%. Результаты процентного распределения количества прохимозина между казеиновой и сывороточной фракциями полностью совпадали с данными, полученными нами при исследовании экспрессии ЫСР-1. На рисунке 5 представлен фракционный анализ молока трансгенного кролика № 4382.

Рисунок 5.

7\/еБ1ет-блот анализ молока трансгенного кролика № 4382

Электрофорез 0,5 мкл молока кроликов в 12% ПААГ. В качестве «-» контроля использовали казеиновую (1) и сывороточную (2) фракции молока нетрансгенного кролика № 5419. Как «+» контроль (3) в гель наносили 500 нг рекомбинантного химозина. Молоко трансгенного кролика № 4382: 4 - казеиновая фракция, 5 - сывороточная фракция, 6 -сывороточная фракция после осаждения хазеинов при рН=4,5, 7 - рН=2,5 - 1,5 ч., 8 -рН=2,5 -20 ч.

Локализация и длины фрагментов маркера в килодальтонах указаны слева от фотографии. Пх - прохимозин, Псх - псевдохимозин, X - химозин, АП - продукт альтернативного сплайсинга мРНК прохимозина, /д - иммуноглобулиновая фракция.

При анализе результатов \Л/ез1егп-блотинга кроме белка ожидаемой длины были также идентифицированы по крайней мере пять продуктов более короткой длины (рис. 5, дорожки 4, 5). С учетом результатов анализа мРНК можно предположить, что наличие коротких полос было обусловлено трансляцией части альтернативных транскриптов. На фоне незначительных количеств большинства альтернативных продуктов была отмечена экспрессия одного из них (обозначен АП),

1 2 3 4 5 6 7 8

83453218.

| 7,5 ■

.. :: V 4-1*4«; *->>

, V ' « О- а _ „

( ; -7 ,:'7 Псху

X ;АП ' ■ ' " V

по своей силе равная (сывороточная фракция) или даже превосходящая (казеиновая фракция) нормальный прохимозин. Сопоставление длины АП с длиной химозина показало, что АП имел длину значительно менее 323 АК (длина химозина). Учитывая представленные в разделе 2.3.4 результаты анализа мРНК прохимозина, можно предположить, что АП является продуктом экспрессии, в котором отсутствуют экзоны 6 и 8, экзоны 3 и 4 или экзоны 3, 4 и 8. При доведении в молоке кроликов рН до 4,5 с целью осаждения казеинов наблюдалось исчезновение АП (рис. 5, дорожка 6). Выявленная неустойчивость АП в кислой среде объясняет его отсутствие в экстракте из желудка теленка, так как в желудке поддерживается кислая рН.

Концентрации прохимозина в молоке трансгенных кроликов, установленные методом \Л/еэ1егп-блотинга приводятся в таблице 4.

Таблица 4.

Концентрация прохимозина (мг/мл) в молоке у трансгенных кроликов

Конс- Лини Поко- Номер Число Концентрация химозина

трукция я ление животного копии в молоке (мг/мл)

р43 2290 Р основатель 3 <0,1

F1 2876 3 <0,1

Fi 2884 3 <0,1

Fi 2965 3 <0,1

f2 3332 3 <0,1

3735 p основатель >50 до 10

2531 . Fi 3531 -10 1,8

Р77 2827 p 2827 -40 1-2,5

2847 p основатель 6 0,1-0,35

f2 3845 (гомо) 12 <0,1

f3 4351 6 <0,1

2848 p основатель -40 5

р99 2953 f2 3773 0,1

f3 4382 0,6-4

Как следует из данных таблицы 4, концентрация прохимозина в молоке трансгенных кроликов варьировала между различными линиями, среди животных внутри одной линии и у отдельных животных в различные дни лактации.

С целью определения оптимальных условий активирования прохимозина в молоке кроликов выполняли инкубацию молока при рН=2,5, при рН=3,5, при рН=4,5 от 1,5 ч. до 150 ч., после чего определяли качественные изменения, происходящие с прохимозином, методом Western-блот анализа и проводили одновременное тестирование активности в коагуляционном тесте.

Анализ трех независимых проб молока показал, что максимальная активность фермента достигалась при инкубации молока при рН=4,5 в течение 75 ч. Только при этой рН происходил непосредственный переход прохимозина в химозин. При рН=2,5

образовывался промежуточный продукт активации - псевдохимозин. При рН=3,5 был отмечен постепенный переход прохимозина в псевдохимозин, а затем в химозин, однако активность была ниже, чем при рН=4,5. Результаты активирования при рН=4,5 проиллюстрированы на рисунке 6.

Рисунок 6.

Динамика активирования прохимозина в молоке трансгенных кроликов при рН=4,5

\Л/ез(егп-Ьлот анализ молока трансгенного кролика № 4382, активированного при рН=4,5 (фото): 1 -без активирования, 2 - 1,5 ч., 3 - 5 ч., 4 -25 ч„ 5- 50 ч., 6- 75 ч., 7- 100 ч., 8- 125 ч., 9-150 ч.; 10 - молоко нетрансгенного кролика («-» контроль); 11 - 50 нг, 12- 100 нг, 13 - 200 нг и 14 - 300 нг коммерческого химозина. М - маркер 41,7 кД. Данные об активности химозина в соответствующих пробах приводятся в таблице,

1 234 56789 101112 13 14

№ дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Время инкубации (ч.) 0 1,5 5 25 50 75 100 125 150

Активность (СП/мл) 0 3,5 4,0 22,7 59,7 81,6 66,1 53,6 56,6

Хотя имеются литературные данные, что химозин формируется активацией при кислой рН до 5,5, при активировании фермента в молоке трансгенных кроликов при рН=5,5 до 100 ч. не было выявлено активности химозина.

Экспериментальным путем было установлено, что все исследованные линии трансгенных кроликов синтезировали прохимозин, способный к переходу при кислых рН в активный фермент. Данные об активности химозина в молоке трансгенных кроликов приводятся в таблице 5.

Таблица 5.

Активность химозина (С11/мл) в молоке трансгенных кроликов

Конструкция Линия Поколение Номер животного Активность химозина в молоке кроликов (Ед/мл)

р43 2290 Р основатель <2,5

2884 <2,5

3332 <2,5

2531 3531 42,5

р77 2827 Р основатель 23,5-60*

2847 Р основатель 8,3

Р1 3845 <2,5

р99 2953 3773 2,5

Яз 4382 15-82*

'Активность различалась в различные фазы лактации

Анализ данных о концентрации химозина, полученных методом \Л/ез1егп-блот . анализа и посредством пересчета активности химозина в концентрацию в коагуляционном тесте, показал, что с учетом наличия фермента как в сывороточной, так и в казеиновой фракциях, поправок на неактивный прохимозин и ошибок используемых методов результаты обоих методических подходов совпадали.

Анализ активности химозина в молоке трансгенной крольчихи № 4382 в ходе лактации (21 проба в течение 42 дней лактации) показал, что активность колебалась от 15 до 82 Си/мл и составляла в среднем 43,5+5,7 Си/мл (Су=59,5+9,2%).

Все исследованные трансгенные животные, экспрессирующие с молоком рекомбинантный прохимозин, по фенотипическим признакам, а также по показателям здоровья не отличались от нетрансгенных кроликов. Следует лишь отметить, что две первичные трансгенные самки №3735 и № 2848 с наиболее высоким уровнем экспрессии 10 и 5 мг/мл характеризовались очень коротким лактационным периодом. Однако, по нашему мнению, это не было связано со сверхэкспрессией, так как в других линиях подобная тенденция не наблюдалась.

2.4.3. Анализ синтеза прохимозина КРС у трансгенных овец.

Исследование казеиновой и сывороточной фракций молока двух трансгенных овец линии № 586 (№ 586 (Р), № 6 (Рг)) методом \Л/ез1егп-блот анализа показало наличие рекомбинантного прохимозина в обеих фракциях, причем, как и в молоке трансгенных кроликов, большая часть фермента (около 60%) приходилась на казеиновую фракцию. Овца № 586 продуцировала максимально около 3,5 мг/мл прохимозина (1,5 мг/мл в сыворотке). В молоке овцы № 6 содержалось около 2,0 мг/мл прохимозина, в том числе 0,8 мг/мл - в сывороточной фракции.

Исследование превращения неактивного прохимозина в активные формы при различных рН в молоке трансгенных овец показало, что закономерности, выявленные на трансгенных кроликах, полностью соблюдались. Результаты анализа трансгенной овцы № 6 суммированы в таблице 6.

Таблица 6.

Активность химозина (С11/мл) в молоке трансгенной овцы № 6 при различных условиях активации_

рН Время активации (ч.)

0 1,5 5 25 50 75 100 125 150

2,5 0 4,0 5,9 8,7 6,4 6,6 6,6 3,0

3,5 0 6,1 3,8 8,7 16,5 7,9 7,3 5,4 5,4

4,5 0 0 0,5 3,5 7,6 11,4 23,6 10,1 11,1

У трансгенных овец, как и у трансгенных кроликов, максимальная активность химозина отмечалась при инкубации молока при рН=4,5. Однако, если для

достижения максимального значения в молоке кроликов требовалось 75 ч., то в молоке овец - 100 ч. (рис. 7). Анализ молока овцы № 586 в ходе лактации выявил высокую вариабельность активности химозина. В пробах молока (п=21), взятых в течение 47 дней лактации, активность варьировала от 7,2 до 42,5 Си/мл и составляла в среднем 23,8+1,8 мг/мл (С»=35,5±5,5 Си/мл).

Рисунок 7.

Сравнительный анализ изменения активности химозина в молоке трансгенных кроликов и овцы при рН=4,5

Кролик (1) —О-Кролик (2) д Кролик (3) —X— Овца

5 25 50 75 100 125 Время активирования (ч.)

150

Проведенные нами исследования показали, что молочная железа трансгенных животных (кролики и овцы) может служить источником биологически активных белков - IGF-1 человека и химозина крупного рогатого скота. Был разработан и оптимизирован ряд молекулярно-генетических подходов, которые с успехом могут быть использованы для анализа любых трансгенных животных, синтезирующих рекомбинантные белки с молоком.

2.5. Определение пола предимплантационных эмбрионов крс. Нами был предложен метод диагностики пола эмбрионов КРС с использованием для анализа единичных бластомеров. Было проанализировано 162 эмбриона, полученных in vitro, и 14 эмбрионов, полученных ex vivo. Для сравнения с использованием двух бластомеров было проанализировано 52 эмбриона.

Для контроля точности метода был проведен анализ животных известного пола (5 самцов, 5 самкок). Во всех случаях результаты исследования совпали с истинным полом животных. Результаты анализа эмбрионов КРС суммированы в таблице 7.

Данные таблицы 7 показывают, что для достоверного повышения

результативности определения пола эмбрионов следует проводить параллельный «

анализ единичных бластомеров в двух (р<0,05) или трех (р<0,01) независимых

Таблица 7.

Результаты диагностики пола эмбрионов КРС с использованием в качестве матрицы единичных бластомеров

Число Эмбрионы in vitro Эмбрионы ex vivo

повторов Число эмбрионов (п) Определение пола(%) Число эмбрионов (п) Определение пола (%)

1 19 68,4+10,7* ** - -

2 102 91,2+2,8* *** 7 100,0***

3 41 97,6+2,4** 7 100,0

*** разница достоверна (* р<0,05, ** "* р<0,01).

повторах. Следует заметить, что культура эмбрионов in vitro характеризовалась худшей степенью развития (число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, от общего числа яйцеклеток) по сравнению с эмбрионами, полученными ex vivo, что, по всей видимости, и было причиной более низкой эффективности анализа пола эмбрионов, полученных in vitro, по сравнению с эмбрионами ex vivo. Так, при анализе единичных бластомеров от 14 эмбрионов, полученных ex vivo, при проведении двух и трех независимых реакций результаты были получены в 100% случаев (табл. 7). Достоверные различия в степени определения пола эмбрионов, полученных in vitro и ex vivo, при проведении двух повторов (р<0,01), позволяют предположить, что более низкий % успеха при диагностике пола in vitro эмбрионов был связан с тем, что часть бластомеров содержала ДНК, которая уже частично деградировала и поэтому не могла быть амплифицирована посредством ПЦР.

Следует отметить, что выполнение повторных анализов каждого из эмбрионов позволило лишь в менее 2,5% случаев выявить расхождение результатов анализа.

Для сравнения была выполнена диагностики пола эмбрионов с использованием в качестве матрицы двух бластомеров {табл. 8).

Таблица 8.

Результаты диагностики пола эмбрионов КРС с использованием в качестве матрицы двух бластомеров -

Число повторов Число эмбрионов (п) Определение пола (%)

1 18 72,2±10,6

2 25 92,0+5,4

3 9 100,0

Сравнение результатов анализа пола эмбрионов с использованием в одной реакции одного и двух бластомеров позволяет рекомендовать в случае ограничения числа бластомеров двумя клетками проведение раздельного анализа бластомеров в двух повторах. В этом случае число эмбрионов, у которых был результативно

определен пол, составляло 91,2+2,8% (табл. 7), что было выше на 19% по сравнению с анализом двух бластомеров в одной реакции - 72,2+10,6% (табл. 8).

На рисунке 9 представлены результаты анализа единичных бластомеров от двух эмбрионов КРС, полученных in vitro, в нескольких независимых повторах.

Рисунок 9.

з КРС с целью диагностики пола

Электрофорез в 25-35% градиентном ПААГ с окрашиванием бромидом димидия. 1 - маркер 1 т.п.н.; 2-5 - эмбрион 1; 6-9 -эмбрион 2; 10 - «-» контроль (среда для культивирования); 11 - «+» контроль XX (одна гранулезная клетка); 12 - «+» контроль XY (50 пг ДНК быка). Длины фрагментов в парах нукпеотидов указаны справа.

С целью выяснения возможности контаминации реакций за счет присутствующих в культуре in vitro спермиев была выполнен аналогичный анализ с использованием в качестве матрицы спермиев. Было проанализировано 10 реакций с 2-5 спермиями. Ни в одном случае не было найдено продуктов амплификации.

В заключение следует суммировать преимущества метода. Во-первых, происходит одновременный анализ последовательностей как X, так и Y хромосом, что не требует наличия внутреннего контроля амплификации как при использовании Y-специфических праймеров. Во-вторых, использование аллелеспецифических праймеров не требует проведения анализа ПДРФ, что сокращает затраты времени на 1-2 часа. В-третьих, используемый метод подготовки бластомеров к анализу исключает возможность контаминации реакций за счет спермиев. В-четвертых, выполнение повторных анализов позволяет исключить вероятность ошибки вследствие нарушения амплификации фрагментов X или Y хромосом в одной из реакций. В-пятых, метод разработан с использованием генов ZFX и ZFY, которые найдены так же у свиней, коз и овец, что позволит использовать предложенный подход для определения пола эмбрионов у этих видов животных.

2.6. Диагностика точковых мутаций у сельскохозяйственных животных.

2.6.1. Новый универсальный метод АС-ПЦР для анализа точковых мутаций у сельскохозяйственных животных.

Нами был разработан новый универсальный метод диагностики точковых мутаций с использованием АС-ПЦР. Суть метода заключается в сочетании в одной реакции четырех различных праймеров (рис. 10).

ПЦР-анализ единичных бластоме

Схема нового универсального метода АС-ПЦР

Внутренние специфические для двух различных аллелей праймеры 11\1Т1 и 11^Т2 (показаны серыми прямоугольниками) последними нуклеотидами приходятся на точковую мутацию (указана стрелкой). В комбинации с наружными праймерами ЕХТ1 и ЕХТ2 (показаны черными прямоугольниками) они приводят к амплификации фрагментов длиной X п.н. для одного из аллелей и У п.н. для другого аллеля. Длина общего для обоих аллелей фрагмента амплификации "наружных" праймеров обозначена 7..

Анализ затрат показал, что по сравнению с методами ПЦР-ПДРФ и АС-ПЦР при использовании нашего метода основные материальные затраты уменьшались, соответственно, на 28% и 46%. Кроме того, были сокращены затраты времени, требующегося для выполнения исследований.

Предлагаемый нами универсальный метод АС-ПЦР может быть использован для диагностики мутаций у всех видов сельскохозяйственных животных независимо от пола, возраста и физиологического состояния индивидуумов.

2.6.2. Использование молока и спермы животных для анализа точковых мутаций методом ПЦР.

При анализе КРС наиболее доступными материалами для исследований являются молоко коров и сперма производителей. Нами была оптимизирована методика, позволяющая после небольшой подготовки использовать молоко и сперму животных для выполнения ПЦР. Было протестировано 146 проб молока и 65 проб спермы КРС. Суть метода заключается в щелочном лизисе образцов с последующей нейтрализацией реакций. Для проб молока предварительно проводили концентрацию содержащихся в молоке соматических клеток.

Метод очень прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов и выполнения очистки ДНК с использованием органических растворителей фенола и хлороформа. Полученный лизат может храниться при -20°С в течение нескольких месяцев и успешно использоваться для проведения повторных анализов.

2.6.3. Определение MHS у свиней.

Новый метод был оптимизирован для анализа MHS у свиней. Всего было исследовано 93 животных. Результаты анализа проиллюстрированы на рисунке 11.

Анализ свиней по MHS-генотипу с использованием нового метода АС-ПЦР

, 479 п.н. . 316 п.н. ' 208 п.н.

Электрофорез в 1,8% агарозном геле в буфере TBE. 1 - маркер 1 т.п.н.; 2, 3 -животное-неноситель (генотип NN); 4, скрытый носитель (генотип Nn); б, животное-носитель (генотип nn); 8 -контроль (все компоненты реакции исключением ДНК). Длины фрагментов в парах нуклеотидов указаны справа.

5 -

7 -«-»

за

52 свиньи породы петряну и 41 свинья породы крупная белая с известным генотипом по MHS, установленным нами ранее методом ПЦР-ПДРФ, были проанализированы предлагаемым методом. Результаты анализа совпадали в 100% случаев. Из 52 свиней породы петряну 19 особей (36,5%) имели генотип NN, 16 (30,8%) - Nn и 17 (32,7%) - nn. Частоты встречаемости аллелей составляли pN=0,519 и qn=0,481. Исследование 41 свиньи крупной белой породы выявило у 26 животных (63,4%) генотип NN и у 15 животных (36,6%) - генотип Nn. Частоты аллелей составляли рм=0,817 и qn=0,183. Анализ генетической структуры популяции свиней породы петряну методом (р=0,01) выявил достоверное смещение генного равновесия в популяции в сторону гомозиготных генотипов, в то время как у свиней крупной белой породы генное равновесие сохранялось (р=0,01).

2.6.4. Анализ вариантов к-казеина у крупного рогатого скота.

Новый метод АС-ПЦР был апробирован для определения вариантов кСп у КРС с использованием для анализа спермы быков и молока коров. Было исследовано 65 проб спермы и 146 проб молока. Результаты анализа представлены на рисунке 12.

Рисунок 12.

Анализ КРС по вариантам кСп с использованием нового метода АС-ПЦР

Электрофорез в 1,8% агарозном геле в буфере ТВЕ. 1 - маркер 1 т.п.н.; 2, 4 -генотипы АА; 3, 6 - генотипы АВ; 5, 7 -генотипы ВВ. Длины фрагментов приводятся в парах нуклеотидов справа от фотографии.

С использованием предложенного метода и метода ПЦР-ПДРФ было исследовано 65 быков-производителей черно-пестрой породы. Результаты были

идентичными в 100% случаев. 17 животных (26,1%) имели генотип АА, 20 животных (30,8%) - АВ и 28 животных (43,1%) - ВВ, что соответствовало частотам аллелей рА=0,415 и дв=0,685. Анализ генетической структуры популяции показал достоверное смещение (р=0,01) генного равновесия в сторону гетерозигот.

Анализ 142 коров молочного типа швицкой породы новым методом позволил установить генотипы всех исследованных животных. 17 коров (11,6%) имели генотип АА, 45 (30,8%) - АВ и 84 (57,6%) - ВВ, что соответствовало частотам аллелей рА=0,271 и qв=0,729. Фактическое распределение генотипов достоверно отклонялось от теоретически ожидаемого (р=0,01) и было смещено в сторону гетерозигот.

2.6.5. Диагностика В1_АО у черно-пестрого скота.

Новый метод был нами апробирован для диагностики ВЦШ у черно-пестрого скота. Была предложена модификация универсального метода АС-ПЦР. Так как все гомозиготные носители В1_АО погибают в ходе эмбрионального развития или в течение первых недель жизни, популяция животных разделяется на гомозиготных по нормальному аллелю неносителей (NN1 и гетерозиготных скрытых носителей (№). Таким образом, мутантный аллель п присутствует только у гетерозиготных животных, что позволяет использовать для диагностики вместо четырех три праймера: наружные праймеры, которые амплифицируют контрольный фрагмент, и аллелеспецифический для мутантного аллеля праймер В1.-П (рис. 13).

Рисунок 13.

В!_АО новым методом АС-ПЦР

Мутируемый нуклеотид

выделен жирным курсивом. Нуклеотиды в последовательности праймеров, влияющие на аллелеспецифичность реакции выделены жирным шрифтом, при этом нуклеотиды не

комплиментарные матрице

маркированы звездочкой.

Схема расположения праймеров для диагностики

нормальный 51 лцф" СШ8 «^цп

мутантный 5' | ГЦЦТ С018

(вию)

12.4 I

-Н221 воп

41 п.ч. 152 п.и.

152 л.н.

Был выполнен анализ 9 животных - неносителей В1_АО (ММ). В качестве контроля была использована ДНК, полученная от скрытого носителя (1Мп). Для оценки разработанного подхода проводили ПЦР-ПДРФ анализ. Результаты обоих методов полностью совпадали. На рисунке 14 представлен анализ животных на ВЦШ.

Анализ крупного рогатого скота на BLAD методом АС-ПЦР

Электрофорез продуктов ПЦР в 2% агарозном геле; 1 - маркер 50 п.н.; 2 -скрытый носитель (праймеры 12.4, BL-n); 3

- скрытый носитель (праймеры 12.4, 12.5); 4

- неноситель (праймеры 12.4, BL-n); 5 -неноситель (праймеры 12.4, 12.5), 6 - скрытый носитель (праймеры 12.4, 12.5, BL-n), 7 - неноситель (праймеры 12.4, 12.5, BL-n). Длины фрагментов в парах нуклеотидов указаны справа.

2.6.6. Определение вариантов р-лактоглобулина у овец.

Выше были описаны три возможности применения нового метода анализа точковых мутаций в животноводстве. Используя принципы и закономерности предложенного подхода, можно выполнять диагностику любых мутаций, которые по тем или иным причинам являются нежелательными для распространения в популяциях животных, а также поиск маркерных генов. Так, например, метод был применен для тестирования овец по вариантам рЬв. Результаты анализа 10 овец полностью совпадали данными, полученными посредством ПЦР-ПДРФ.

Преимущества разработанного метода могут быть суммированы в следующих положениях: 1) позволяет вести анализ любых точковых мутаций; 2) в сочетании с предложенными методами выделения ДНК может быть использован независимо от исходного материала; 3) позволяет вести анализ животных независимо от вида, пола, возраста; 4) не требует выполнения рестрикционного анализа продуктов ПЦР, как это необходимо при использовании метода ПЦР-ПДРФ; 5) не требует наличия сайта рестрикции или его создания посредством использования соответствующих праймеров, что позволяет использовать данный метод для анализа любых нуклеотидных замен; 6) не требует выполнения двух параллельных реакций от одного животного, как это необходимо при использовании стандартного метода АС-ПЦР; 7) уменьшает материальные и временные затраты на проведение анализа.

ВЫВОДЫ

1. Исследование использования нового инъекционного буфера на основе МБОР для получения трансгенных кроликов выявило его превосходство по физиологическим показателям и показателям эффективности трансгенеза по сравнению со стандартным буфером ТЕ:

1 2 3 4 5 6 7

W L...V _153 п.н.

41 п.н.

"^шШ^яМшшШшШШшж

а) наблюдалось снижение выживаемости эмбрионов на 6,2% (р<0,001): выживаемость эмбрионов, инъецированных МБОЯ, составляла 15,5±0,9%, в то время как при применении ТЕ - 9,3±0,2%;

б) размер гнезда в группе МБОР был больше, чем в группе ТЕ и был равен, соответственно, 4,3+1,7 и 3,1+1,7. Таким образом имела место тенденция к снижению многоплодия за счет инъекции ТЕ;

в) степень мертворожденное™ в группе МБОР была ниже на 16,2% (р<0,001) по сравнению с группой ТЕ (соответственно, 9,0±1,9% и 25,2+3,6%), следовательно вредное действие ТЕ сказывалось сильнее и на поздних стадиях эмбриогенеза;

г) анализ эффективности трансгенеза выявил тенденцию к повышению общей эффективности переноса генов при использовании МвОР по сравнению с ТЕ (соответственно, 1,4+0,3% и 0,9±0,2%).

2. С использованием существующих и впервые предложенных в диссертации методов выполнено детальное молекулярно-генетическое исследование экспрессии рекомбинантных ЫСР-1 и прохимозина КРС в молочной железе трансгенных кроликов и овец:

а) стабильная трансмиссия трансгена была доказана в шести размноженных до настоящего времени поколениях кроликов, трансгенных по генной конструкции аз1Сп-ЮР-1,.четырех поколениях кроликов и трех поколениях овец, трансгенных по генным конструкциям с^Сп-прохимозин;

б) исследование рисунка экспрессии в различных тканях трансгенных животных показало, что молочная железа являлась единственным местом синтеза трансгенных продуктов, что подтверждает специфичность выбранного нами вектора аэ1Сп и исключает возможное вредное влияние рекомбинантных белков на здоровье и жизнеспособность трансгенных животных вследствие эктопной экспрессии;

в) детальное исследование мРНК прохимозина в молочной железе трансгенных кроликов и овец, а также в желудке КРС выявило существование альтернативного сплайсинга мРНК прохимозина и показало полное соответствие рисунка экспрессии прохимозина у КРС и трансгенных животных, что служит доказательством идентичности природных и рекомбинантных продуктов экспрессии и делает возможным последующее использование производимого трансгенными животными рекомбинантного прохимозина в пищевой промышленности;

г) фракционное исследование молока трансгенных животных показало, что рекомбинантные белки помимо сывороточной фракции присутствовали также в казеиновой фракции (около 60%) и не могли быть выделены в сыворотку посредством простого центрифугирования;

д) анализ содержания ЬЮР-1 в молоке трансгенных кроликов выявил увеличение концентрации рекомбинантного белка в молоке гомозиготных животных по сравнению с гемизиготными на 49,6% (р<0,001): соответственно, 363+12 мкг/мл (122 пробы от 8 кроликов) и 543±41 мкг/мл (47 проб от 3 кроликов). Исследование содержания ИЮР-1 в молоке кроликов в 1-ую и 2-ую лактации показало увеличение уровня синтеза во 2-ую лактацию по сравнению с 1-ой у гемизиготных животных на 20,1% (р<0,001) и у гомозиготных животных - на 45,4% (р<0,001). Выявленные закономерности могут быть использованы как фактор повышения продуктивности трансгенных животных в отношении рекомбинантных белков;

е) посредством функциональных тестов была доказана биологическая активность синтезируемых трансгенными животными ЫвЯН и химозина крупного рогатого скота, что делает возможным их использование в качестве продуцентов этих рекомбинантных белков. Были установлены следующие концентрации рекомбинантных белков: Ы6Я-1 в молоке трансгенных кроликов - от 0,3 до 1,5 мг/мл, прохимозин в молоке трансгенных кроликов и овец - соответственно, от 0,1 до 10 мг/мл и от 0,1 до 3,5 мг/мл.

3. Разработана методика, позволяющая использовать молоко трансгенных животных для анализа экспрессии рекомбинантной мРНК прохимозина КРС, что значительно упростило определение экспрессии специфических для молочной железы генных конструкций у трансгенных животных.

4. Предложен и оптимизирован ряд методик по выделению ДНК из различных тканей и тканевых жидкостей с целью последующего анализа посредством ПЦР: метод солевой экстракции из крови животных,. позволяющий исключить использование фенола, метод щелочного лизиса клеток из молока и спермы животных, делающий возможным непосредственное использование лизата для выполнения ПЦР.

5. Предложен метод диагностики пола эмбрионов КРС посредством АС-ПЦР с использованием единичных бластомеров. При проведении двух и трех повторных анализов каждого из эмбрионов результативность метода составляла, соответственно, 91,2 и 97,6%. Вероятность ошибочной диагностики пола не превышала 2,5%.

6. Разработан новый универсальный метод анализа точковых мутаций у сельскохозяйственных животных, не уступающий по точности методу ПЦР-ПДРФ и позволяющий сократить материальные и временные затраты на выполнение анализов. По сравнению с методами ПЦР-ПДРФ и АС-ПЦР основные материальные затраты снизились, соответственно, на 28% и 46%.

7. Оптимизация и использование нового метода АС-ПЦР для анализа злокачественного гипертермического синдрома у свиней (п=93), вариантов кСп у КРС (п=65), дефицита лейкоцитарной адгезии у черно-пестрого скота (л=10) и вариантов ßLG у овец (п=10) в сравнении с контрольными методами подтвердили точность предлагаемого подхода и показали его универсальность для диагностики любых точковых мутаций независимо от вида животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Лабораториям по получению трансгенных животных с целью повышения эффективности переноса генов у животных рекомендуем использовать в качестве основы буфера для микроинъекции синтетическую среду яйцеводов (MSOF) как физиологически более оптимальную для эмбрионов.

2. Специалистам по исследованию трансгенных животных для характеристики транскрипции специфических для молочной железы генных конструкций рекомендуем использовать в качестве источника рекомбинантной мРНК молоко трансгенных животных как наиболее доступный исходный материал.

3. Лабораториям по получению и культивированию эмбрионов in vitro для повышения результативности диагностики пола эмбрионов с использованием в качестве матрицы единичных бластомеров рекомендуем проводить анализ в двух или трех независимых повторах.

4. Специалистам, занимающимся сертификацией и исследованием сельскохозяйственных животных на молекулярно-генетическом уровне, с целью упрощения методики и сокращения основных временных и материальных затрат рекомендуем использовать для диагностики точковых мутаций предложенный универсальный метод АС-ПЦР, не уступающий по точности методу ПЦР-ПДРФ и стандартному методу АС-ПЦР.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л.К. Генные фермы - новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология. 1993. - № 6. - С. 3-27.

2. Зиновьева Н. Применение PCR для тестирования животных на интеграцию генных конструкций // Материалы 46-ой научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых по проблемам интенсификации животноводства. -ВИЖ. -17-18 июня 1993.

3. Zinovieva N„ Brem G. Molekulargenetische Analyse milchdruesenspezifischer Genkonstrukte// DGfZ/GfT-Tagung. - Goettingen. - 28.-29. September 1993. - D19.

4. Зиновьева Н., Брем Г., Эрнст Я. Исследование интеграции и экспрессии генных конструкций химозина у трансгенных кроликов // Материалы симпозиума "Молекулярная. генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных". - Пушкин. - 24-26 мая 1994. - С. 4-5.

5. Эрнст Л.К., Некрасов A.A., Зиновьева H.A., Шихов И.Я., Галочкин A.B., Данч С.С., Устин В.В. Некоторые особенности трансгенных животных // Материалы симпозиума "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных". - Пушкин. - 24-26 мая 1994. - С. 3.

6. Besenfelder U., Zinovieva N., Dietrich E., Sohnrey В., Holtz W., Brem G. Tubal transfer of goat embryos using endoscopy//The Veterinary Record. - 1994. - November 12.-P. 480-481.

7. Brem G., Hartl P., Besenfelder U., Wolf E., Zinovieva N., Pfaller R. Expression of syntetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1 (1GF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits // Gene. - 1994. - V. 149. -P. 351-355.

8. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Брем Г. Метод капиллярной полимеразной цепной реакции как быстрая и более дешевая альтернатива доказательства различных вариантов ДНК // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. -Сб. науч. Трудов. - 1995. - Т. 1. - С. 244-248.

9. Зиновьева Н., Брем Г. Определение пола предимплантационных эмбрионов крупного рогатого скота путем аллелеспецифической амплификации генов ZFX и ZFYII Биотехнология. - 1995. - № 1-2. - С. 50-53.

10. Попов А.Н., Зиновьева H.A., Брем Г. Экспресс-метод тестирования новоро>еденных поросят на интеграцию в геном чужеродных генов // Сельскохозяйственная биология. - 1995. - № 6. - С. 136-138.

11. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Зиновьева H.A., Башкеев М.Д., Гоголевский П.А., Кадулин С.Г., Брем Г. Получение овец трансгенных по генной конструкции asi-казеин/химозин //Доклады РАН. - 1995. - Т. 345. - № 4. - С. 555-558.

12. Brem G., Besenfelder U., Zinovieva N., Seregi J., Solti L„ Hartl P. Mammary gland specific expression of chymosin constructs in transgenic rabbits // Theriogenology. - 1995.-V. 43.-№1 P. 175.

13. Zinovieva N., Palma G., Mueller M., Brem G. A rapid sex determination test for bovine blastomeres using allele-specific PCR primers and capillary PCR// Theryogenology. - 1995. -V. 43. - № 1. - P. 365.

14. Zinovieva N., Mueller M„ Sachartchenko V., Palma G., Brem G. PCR schnell-Diagnostik an Einzel-Blastomeren von bovinen IVP-Embryonen// Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryo-Transfer Deutschlands (AET-d). - Kleve. - 1-2 Juni 1995.

15. Zinovieva N., Zachartchenko V., Mueller M., Brem G. Sex determination in single bovine blastomeres by allele-specific PCR amplyficatíon of the singl copy genes ZFX and ZFY// Meeting of Europian Assotiation for Animal Production. -Prague. - 2-8 September 1995.

16. Zinovieva N., Mueller M., Besenfelder U„ Brem G. Integration und Expression von IGFI-Konstrukten in Kaninchen II DGfZ/GfT-Tagung. - Hannover. - 2021 September 1995.

17. Zinovieva N., Besenfelder U., Hartl P., Mueller M., Brem G. Expression of human IGF-I in the mammary gland of transgenic rabbits// IBC's 3rd International Symposium "Exploiting transgenic technology for commercial development". - San-Diego (CA). - 30 November -1 December 1995.

18. Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А., Кадулин С.Г., Зиновьева H.A., Прокофьев М.И., Эрнст Л.К., Брем Г. Получение первичных трансгенных овец для создания биотехнологического производства фармакологических и технологических белков Н Материалы международной конференции, посвященной памяти академика A.A. Баева. - Москва. - 20-21 мая 1996. - С. 46, 232.

19. Зиновьева H.A., Безенфельдер У., Брем Г. Получение яйцеклеток и пересадка микроинъецированных зигот у кроликов // Онтогенез. - Т. 27. - № 3. - С. 214-217.

20. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Хартл П., Мюллер М., Брем Г. Исследование экспрессии IGF-1 человека у трансгенных кроликов It Материалы международной конференции, посвященной памяти академика A.A. Баева. - Москва. -20-21 мая 1996.-С. 49, 250.

21. Зиновьева H.A., Васичек Д., Айгнер Б., Попов А.Н., Брем Г. Диагностика различных аллельных вариантов ДНК "single tube" методом аллелеспецифической полимеразной цепной реакции // Биотехнология. - 1996. - № 6. - С. 45-49.

22. Зиновьева H.A., Попов А.Н., Полежаева В., Брем Г. "Single tube" метод аллелеспецифической PCR как альтернатива RFLP анализа при диагностике точковых мутаций у сельскохозяйственных животных II Материалы международной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". - Москва. - 30-31 октября 1996. - С. 30.

23. Попов А.Н., Марзанов Н.С., Фролкин Д А., Зиновьева H.A., Брем Г., Васильева Э.Г. Генотипирование свиней по стрессорезистентности II Материалы II Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных". -Киев. -15-17 мая 1996. - С. 18.

24. Прокофьев М.И., Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Зиновьева H.A., Мезина М.Н., Брем Г. Получение трансгенных овец, продуцирующих с молоком прохимозин II Материалы международной конференции, посвященной памяти академика A.A. Баева. - Москва. - 20-21 мая 1996. - С. 58, 241.

25. Савченкова И.П., Зиновьева Н,А., Булла Й., Брем Г. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных // Успехи современной биологии. -1996. - Т. 116. -№ 1. - С. 78-91.

26. Zinovieva N., Besenfelder U., Mueller M., Brem G. Produktion von rekombinanten Chymosin fuer die Kaeseproduktion in der Milchdruese transgener Saeugertiere II Symposiums 'Ukraine-Oesterreich: Landwirtschaft. Wissenschaft und Praxis'. - Lviv. - 22-26 September 1996.

27. Zinovieva N., Vasicek D„ Aygner В., Mueller M., Brem G. Single tube allele-specific (STAS)-PCR for direct determination of the mutation in the porcine ryanodine receptor gene associated with malignant hyperthermia II Animal Biotechnology. - 1996. - V. 7. -№2. - P. 173-177.

28. Zinovieva N., Vasicek D., Mueller M., Brem G. Single tube allele-specific (STAS) PCR for direct determination of point mutation as an alternative to restriction fragment length polymorphism analysis II Proceedings of XXVII International Conference on Animal Genetics (ISAG) France. - 21-25 July 1996. - P. 158-159.

29. Бочкарев В.В., Зиновьева Н.А., Марзанов Н.С., Попов А.Н., Брем Г. Изучение полиморфизма гена р-лактоглобулина овец методом ПЦР-анализа II Материалы конференции «Повышение конкурентно-способности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - Быково. -16-20 июня 1997. - С. 105-106.

30. Васильева С.Г., Васильев И.М., Зиновьева Н.А., Эрнст Г. Эмбриональные стволовые клетки млекопитающих: получение, свойства и перспективы использования // Сельскохозяйственная биология. - 1997. - № 6. - С. 3-14.

31. Марзанов Н.С., Попов А.Н., Зиновьева Н.А., Полежаева В.А., Игнатьев В.М., Брем Г. Скрининг гена BLAD-синдрома у животных черно-пестрого корня // Вестник РАСХН. - 1997. - № 4. - С. 59-61.

32. Некрасов А.А., Сотникова О.А., Марзанов Н.С., Зиновьева Н.А., Попкова Л.И., Данч С.С., Кленовицшй П.М., Гоголевская И.А., Попов А.Н., Чичилов А.А., Брем Г. Характеристика трансгенных свиней по генетическим маркерам II Доклады РАСХН. - 1997. - № 4. - С. 26-28.

33. Brem G., Coulibaly S., Zinovieva N., Besenfelder U., Hatzipanagiotou A. Expression of recombinant proteins in transgenic rabbits I/ Proc. First International Workshop on Mammary Gland Biotechnology. - Budapest. -16-17 August 1997.

34. В rem G., Coulibaly S., Zinovieva N., Besenfelder U., Mueller M. Expression of human nerve growth factor (hNGF) in the milk of transgenic rabbits// Proceeding of IBC's Conference 'Therapeutics Transgenic'. - West Palm Spring (USA). - 7 Feb. 1997.

35. Brem G., Zinovieva N., Besenfelder U., Prokoviev M., Ernst L. Transgenic Production of recombinant bovine chymosin U Proceeding of IBC's Conference 'Therapeutics Transgenic'. - West Palm Spring (USA). -7 Feb. 1997.

36. Coulibaly S., Besenfelder U., Zinovieva N., Müller M., Brem G. Produktion von biologisch aktivem Nerve Growth Factor in der Milchdruse transgener Kaninchen II dGfZ/GfT-Tagung, - Bonn. -10-11 Sept. 1997.

37. Flekna G., Zinovieva N., Mueller M., Brem G. A time and cost effective method for k-casein genotyping ofbreeding bulls//Repr. Dom. Anim. - 1997 . - V. 32. - P. 171-173.

38. Барминцев B.A., Гращук M.H., Зиновьева H.A., Рекубратский A.B., Дума Л.H. Наследственная передача трансгена у костистых рыб: анализ трансгенных производителей (ТдРо) и первого поколения (TgFi) // Материалы VIII конференции «Новые направления биотехнологии». - Москва. - 27-29 апреля 1998. - С. 37.

39. Бочкарев В.В., Зиновьева H.A., Попов А.Н., Марзанов Н.С., Брем Г. Новые молекулярно-генетические подходы для анализа вариантов гена Ь-лактоглобулина у овец // Материалы VIII конференции «Новые направления биотехнологии». - Москва. - 27-29 апреля 1998. С. 41.

40. Бочкарев В.В., Иолычев Б., Зиновьева H.A., Марзанов Н.С., Эрнст Л.К., Брем Г. Сравнение двух методов изучения полиморфизма b-лактоглобулина овец // Доклады РАСХН. - 1998. - № 3. - С. 27-29.

41. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С., Мюллер М., Эрнст Л., Брем Г. Исследование экспрессии IGF-I человека у трансгенных кроликов // Биотехнология. -1998.-№ 1.-С. 3-11.

42. Зиновьева H.A., Попов А.Н., Эрнст Л.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // ВИЖ. - 1998. - 47 с.

43. Зиновьева H.A., Безенфельдер У., Мюллер С., Мюллер М., Эрнст Л.К., Брем Г. Синтетическая среда яйцеводов как основа микроинъекционного буфера для получения трансгенных животных II Материалы VIII конференции «Новые направления биотехнологии». - Москва. - 27-29 апреля 1998. - С. 46.

44. Попов А.Н., Зиновьева H.A., Романосова Е.Г., Полежаева В.А., Брем Г. Ген каппа-казеина как маркер локусов количественных признаков (QTL) молочной продуктивности у крупного рогатого скота II Материалы VIII конференции «Новые направления биотехнологии». - Москва. - 27-29 апреля 1998. - С. 47.

45. Зиновьева H.A., Безенфельдер У., Мюллер М., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные кролики как продуценты химозина крупного рогатого скота с молоком // Биотехнология. - 1998. - № 4. - С. 17-31.

46. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Мезина М.Н., Юткин В.В., Брем Г. Молоко как источник РНК для анализа экспрессии у трансгенных животных II Доклады РАСХН. - 1998. - № 4. - С. 28-30.

47. Mueller S., Zinovieva N., Aigner В., Brem G., Mueller M. Molekulargenetische Analyse von Defekt- und Leistungsgenen bei landwirtschaftlichen Nutztieren // Symposiums 'Ukraine-Oesterreich: Landwirtschaft. Wissenschaft und Praxis'. - Wien. -1416 September 1998.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Зиновьева, Наталия Анатольевна, Дубровицы

:. ^зидкум В А..л,

от " . " ......

7.7 ■

^льпик ynpcDAs:::jn ВАК Гч

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

На правах рукописи

ЗИНОВЬЕВА НАТАЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В РЕШЕНИИ ЗАДАЧ СОВРЕМЕННОГО ЖИВОТНОВОДСТВА

Специальность 03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

д. с.-х. н., академик РАСХН Л.К. Эрнст

д. в. н., профессор Г. Брем

Дубровицы -1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15

2.1. Трансгенные животные и возможности их использования в животноводстве. 15

2.2. Молочная железа трансгенных животных как источник синтеза рекомбинантных белков. 20

2.2.1. Принципы тканеспецифической экспрессии в молочной

железе трансгенных животных. 21

2.2.1.1. Кислый сывороточный протеин. 22

2.2.1.2. р-лактоглобулин. 27

2.2.1.3. а-лактальбумин. 35

2.2.1.4. р-казеин. 38

2.2.1.5. а81-казеин. 43

2.2.2. Возможности использования молочной железы трансгенных животных. 48

2.2.2.1. Производство рекомбинантных белков. 48

2.2.2.1.1. ЮЯ-1 человека. 51

2.2.2.1.2. Химозин крупного рогатого скота. 53

2.2.2.2. Изменение состава и свойств молока. 59

2.2.3. Выбор вида трансгенных животных-продуцентов для

«генных ферм». 62

2.3. Диагностика пола предимплантационных эмбрионов крупного

рогатого скота. 63

2.4. Анализ точковых мутаций у сельскохозяйственных животных. 66

2.5. Заключение. 72

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 74

3.1. Реактивы и оборудование. 74

3.2. Получение трансгенных животных. 77

3.3. Анализ животных на трансгенность. 80

3.4. Исследование экспрессии трансгенных мРНК. 81

3.5. Исследование экспрессии трансгенных белков. 85

3.6. Диагностика пола эмбрионов крупного рогатого скота. 88

3.7. Анализ точковых мутаций у сельскохозяйственных животных. 89

3.8. Статистическая обработка результатов. 92

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 93

4.1. МвОР как основа микроинъекционного буфера. 93

4.1.1. Анализ физиологических показателей. 94

4.1.2. Эффективность трансгенеза. 98

4.2. Получение и анализ трансгенных животных. 101

4.3. Анализ транскрипции у трансгенных животных. 106

4.3.1. Молоко как источник РНК для анализа экспрессии у

трансгенных животных. 106

4.3.2. Экспрессия мРНК ЮР-1 человека у трансгенных кроликов. 108

4.3.3. Экспрессия мРНК прохимозина крупного рогатого скота у трансгенных кроликов и овец. 113

4.3.4. Анализ сплайсинга мРНК прохимозина в желудке крупного рогатого скота и в молочной железе трансгенных животных. 118

4.4. Анализ синтеза рекомбинантных белков у трансгенных животных. 128

4.4.1. Исследование синтеза ЫОР-1 в молочной железе

трансгенных кроликов. 129

4.4.2. Анализ экспрессии прохимозина крупного рогатого скота в молочной железе трансгенных кроликов. 137

4.4.3. Анализ синтеза прохимозина крупного рогатого скота в

молочной железе трансгенных овец. 157

4.5. Определение пола предимплантационных эмбрионов крупного

рогатого скота. 165

4.6. Диагностика точковых мутаций у сельскохозяйственных

животных. 175

4.6.1. Новый универсальный метод АС-ПЦР для анализа точковых мутаций у сельскохозяйственных животных. 175

4.6.2. Использование молока и спермы животных для анализа

точковых мутаций методом ПЦР. 178

4.6.3. Определение злокачественного гипертермического

синдрома у свиней (МНв-тест). 181

4.6.4. Анализ вариантов к-казеина у крупного рогатого скота. 186

4.6.5. Диагностика В1_АО у черно-пестрого скота. 191

4.6.6. Определение вариантов р-лактоглобулина у овец. 197

5. ВЫВОДЫ 199

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 203

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 204 Список сокращений 240

1. ВВЕДЕНИЕ

Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии привело к широкому использованию молекулярно-генетических подходов в различных областях науки и практики, в том числе и в животноводстве [26, 42]. Они нашли применение в воспроизводстве и селекции сельскохозяйственных животных и являются незаменимыми для сертификации существующих пород и популяций. Молекулярно-генетические аспекты являются неотъемлемой частью программ по получению, анализу и использованию трансгенных сельскохозяйственных животных.

Актуальность темы.

Серьезной проблемой при получении трансгенных животных является низкая эффективность переноса генов [43]. Исходя из этого, актуальным является поиск методических подходов, способствующих повышению эффективности получения трансгенных животных.

В настоящее время интерес для современной животноводческой науки и практического животноводства представляет получение и использование трансгенных животных, экспрессирующих рекомбинантные белки [39]. Еще недавно единственной возможностью получения белков была их экстракция из крови доноров или из органов трупов. Однако кроме низкого конечного выхода использование данной технологии сопряжено с риском патогенной контаминации. Химический синтез белков позволяет получать лишь короткие пептиды и поэтому не может быть достаточно успешно использован для синтеза фармацевтических белков. Применение в качестве продуцентов микроорганизмов является ограниченным, так как целый ряд белков не может быть ими произведен в своей

активной форме, вследствие отсутствия в бактериях или незавершенности посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, карбоксилирование, фосфорилирование и др. [33]. Кроме того, очистка белков из микроорганизмов достаточна трудоемка, требует больших затрат и часто сопряжена с большими потерями в конечном выходе. Использование эукариотических производственных систем для синтеза белков характеризуется низкой рентабельностью, поскольку затраты на поддержание условий культивирования довольно большие, а концентрация белков относительно низкая [35]. К недостаткам следует так же отнести нарушение или не завершение вследствие сверхэкспрессии некоторых посттрансляционных модификаций, например, у-карбоксилирования, что отрицательно сказывается на биологической активности белка.

Молочная железа трансгенных животных является идеальным источником синтеза рекомбинантных белков. Она обладает огромным синтетическим потенциалом, так как биологически приспособлена для синтеза и извлечения молочных белков. Кроме того, уже разработаны и внедрены в практику технологии содержания животных в санитарных условиях, что позволит извлекать молоко трансгенных животных без риска контаминации различными патогенами [5, 43]. В этой связи, изучение синтеза рекомбинантных белков с молоком трансгенных животных имеет большое теоретическое и практическое значение.

Возможность практического использования молочной железы трансгенных животных как источника рекомбинантных белков предусматривает предпочтительное получение женских особей. Исходя из этого интерес представляет диагностика пола эмбрионов на предимплантационной стадии. Особенно актуальным это является для животных, имеющих длинный

генерационный интервал (крупный рогатый скот, овцы, козы). Так, при наличии первичного трансгенного бычка тестирование экспрессии возможно не ранее, чем через 5 лет, в то время как данные о синтезе рекомбинантных белков у женских особей могут быть получены в два раза быстрее. Определение пола эмбрионов имеет важное значение в воспроизводстве крупного рогатого скота. Как отмечает Б.П. Завертяев [13], получение животных определенного пола является не только биологической, но и практической задачей. Трансплантация двух однополых эмбрионов позволяет избежать бесплодия (фримартинизма) телок, рождающихся в разнополых двойнях. Применение метода криоконсервирования эмбрионов делает реальным создание банка эмбрионов с заранее определенным полом от животных с выдающимся генотипом [44].

Молекулярно-генетические аспекты играют важную роль в оценке животных по генотипу. В 1995 году был принят Федеральный Закон 'О племенном животноводстве', в котором в Ст. 19 говорится о необходимости сертификации всего племенного материала, в том числе и по генотипу. Генотипирование животных по полиморфным вариантам белков позволит выявлять корреляции между различными аллельными вариантами и хозяйственно-полезными признаками и целенаправленно вести селекцию на сохранение желательных аллелей в популяции. На сегодня уже установлены корреляционные связи между различными полиморфными вариантами белков молока и хозяйственно-полезными признаками животных [105]. Молекулярно-генетические подходы незаменимы в выявлении ряда рецессивных наследственных заболеваний. Уже определены нуклеотидные последовательности и выявлены точковые мутации, обуславливающие такие наследственные аномалии сельскохозяйственных животных, как наследственная зобовидная болезнь, цитруллинемия, дефицит

лейкоцитарной адгезии (BLAD), дефицит уридинмонофосфатсинтазы (DUMPS) и синдром Вивера у крупного рогатого скота, злокачественная гипертермия (MHS) у свиней и HYPP у лошадей [169]. Диагностика таких мутаций на уровне ДНК (ДНК-диагностика) делает возможным не только разделение популяции на носителей и неносителей, но и обеспечивает выявление, а следовательно, и выбраковку скрытых носителей, что позволяет избавиться от нежелательного аллеля в популяции за одно поколение. Такая комплексная оценка животных предусматривает выполнение большого числа анализов. В этой связи, актуальным является разработка методик, позволяющих надежно, эффективно и с наименьшими затратами выполнять необходимые исследования.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является разработка и оптимизация молекулярно-генетических методов исследований и их использование для решения проблемных вопросов современного животноводства.

Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

• оптимизировать технологию получения трансгенных животных в части, касающейся состава микроинъекционного буфера;

• разработать новые и оптимизировать существующие методы для детального исследования транскрипционных и трансляционных процессов рекомбинантных белков у трансгенных животных с интеграцией кДНК инсулино-подобного фактора роста 1 человека (hlGF-1) и гена прохимозина КРС под контролем промотора asi-казеина (as-iCn) КРС;

• провести сравнительный анализ уровня экспрессии hlGF-1 у гемизиготных и гомозиготных трансгенных кроликов для выявления возможности повышения уровня экспрессии посредством селекции на гомозиготность;

• разработать оптимальную схему активирования прохимозина КРС в молоке трансгенных кроликов и овец для достижения максимальной активности фермента;

• оптимизировать метод диагностики пола эмбрионов КРС с использованием единичных бластомеров в качестве матрицы;

• разработать новые и оптимизировать существующие методы подготовки ДНК для анализа посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) из различных исходных материалов;

• разработать точный, эффективный и экономичный метод определения точковых мутаций у сельскохозяйственных животных на основе аллелеспецифической (АС) ПЦР;

• показать универсальность нового метода АС-ПЦР на примере точковых мутаций, обуславливающих MHS у свиней, варианты к-казеина (кСп) у КРС, BLAD у черно-пестрого скота и варианты р-лактоглобулина (PLG) у овец.

Научная новизна.

Впервые предложено использование микроинъекционного раствора на основе биологического буфера (синтетическая среда яйцеводов, MSOF) для микроинъекции зигот кроликов и по ряду показателей, таких как выживаемость зигот in vivo, степень трансгенности, общая эффективность переноса генов и др., показаны преимущества MSOF по сравнению со стандартным буфером ТЕ.

Разработана методика, позволяющая использовать молоко трансгенных животных для анализа экспрессии рекомбинантной мРНК.

Изучена на уровне мРНК экспрессия ИЮР-1 и прохимозина КРС в молочной железе кроликов, трансгенных по генным конструкциям о^Сп-ИЮР-! и аэ^п-прохимозин, и овец, трансгенных по генной конструкции ссэчСп-прохимозин. Показана строгая тканевая специфичность экспрессии рекомбинантных мРНК.

При исследовании транскрипции природного прохимозина в желудке КРС установлено существование альтернативного сплайсинга мРНК прохимозина. Показана полная идентичность рисунка экспрессии мРНК эндогенного фермента и прохимозина, синтезируемого трансгенными животными.

Дана характеристика экспрессии рекомбинантых ЫОР-1 и прохимозина КРС в молочной железе трансгенных кроликов и овец. Выявлено, что большая часть рекомбинантных белков присутствует в казеиновой фракции и может быть идентифицирована только после отделения от мицелл казеина. С использованием функциональных тестов показана биологическая активность синтезируемых с молоком трансгенных животных ЫОР-1 и прохимозина КРС.

На примере КРС показана возможность диагностики пола эмбрионов с использованием для анализа единичных бластомеров. С целью повышения точности результатов предложено выполнение повторных анализов.

Разработан универсальный метод на основе АС-ПЦР для диагностики точковых мутаций у сельскохозяйственных животных и на ряде примеров показаны его преимущества перед традиционными методами ПЦР-ПДРФ и — стандартного АС-ПЦР.

Практическая ценность работы.

Даны практические рекомендации по приготовлению и использованию для микроинъекции зигот кроликов буферного раствора MSOF. Показано, что предложенный инъекционный буфер по ряду физиологических показателей in vivo, а также по показателям эффективности трансгенеза превосходит стандартный инъекционный буфер ТЕ.

Выявлено наличие в молоке трансгенных кроликов и овец hlGF-1 и прохимозина КРС, способных к проявлению своих биологических функций, что делает возможным практическое использование синтезируемых трансгенными животными рекомбинантных белков.

Фракционные исследования молока трансгенных животных показали, что большая часть рекомбинантных белков присутствовала в казеиновой фракции (около 60%), что необходимо учитывать при очистке белков из молока с тем, чтобы исключить возможные потери в конечном выходе.

Диагностика пола предымплантационных эмбрионов имеет важное практическое значение при разведении трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков с молоком. Кроме того, диагностика пола эмбрионов, полученных in vitro, позволит пересаживать эмбрионы заранее известного пола и тем самым исключить появление разнополых двоен.

Предложен универсальный метод анализа точковых мутаций у сельскохозяйственных животных, позволяющий выполнять диагностику любых мутаций независимо от вида животных. Метод оптимизирован для анализа MHS у свиней, вариантов кСп у КРС, В LAD у черно-пестрого скота и вариантоврЦЗ у овец.

Основные положения, выносимые на защиту.

• новый подход в составе микроинъекционного раствора для более эффективного получения трансгенных животных;

• трансгенные животные как продуценты с молоком биологически активных белков hlGF-1 и прохимозина КРС;

• полная идентичность рисунка экспрессии рекомбинантных белков у трансгенных животных и природных белков;

• достоверное повышение уровня экспрессии рекомбинантых белков в молоке (на примере hlGF-1) у гомозиготных животных по сравнению с гемизиготными;

• единичные бластомеры как материал для диагностики пола эмбрионов КРС, полученных in vitro;

• методы подготовки ДНК для исследования методом ПЦР из наиболее доступных исходных материалов - молока и спермы животных;

• новый универсальный метод АС-ПЦР как альтернатива метода ПЦР-ПДРФ и стандартного метода АС-ПЦР для диагностики точковых мутаций у сельскохозяйственных животных.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены:

1) на конференции немецкого общества скотоводов в Геттингене (Германия), 28-29 сентября 1993 года;

2) на Международной научной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» в Пушкине, Санкт-Петербург, 25-27 мая 1994 года;

3) на Международной конференции общества по пересадке эмбрионов в Калгари (Канада), 2-8 января 1995 года;

4) на заседании немецкого общества по пересадке эмбрионов (AET-d) в Клеве (Германия), 1-2 июня 1995 года;

5) на конференции Европейской Ассоциации по животноводству в Праге (Чехия), 2-8 сентября 1995 года;

6) на конференции Немецкого общества скотоводов в Ганновере (Германия), 20-21 сентября 1995 года;

7) на 3 Международном Симпозиуме IBC «Использование трансгенных технологий для коммерческих разработок» в Сан-Диего (США), 30 ноября 1995 г.;

8) на научно-практической конференции института аграрной биотехнологии (IFA) в Тулльне (Австрия), 25 апреля 1996 года;

9) на II Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных" в Киеве, 15-17 мая 1996 года;

10) на Международной конференции, посвященной памяти академика А.А.Баева в ИБХ, Москва, 20-21 мая 1996 года;

11) на XXVII международной конференции по генетике животных (ISAG), Франция, 21-25 июля 1996 года;

12) на украинско-авст