Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров

Богачева, Наталия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров"

005020593

На правах рукописи

БОГАЧЕВА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СЕЛЕКЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ САХАРНОЙ СВЁКЛЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР ¿012

РАМОНЬ - 2012

005020593

Диссертационная работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы им. А. Л. Мазлумова» Россельхозакадемии в 2004-2011 гг.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I»

Защита состоится « 27 » апреля 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.065.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы имени A. J1. Мазлумова» по адресу: 396030, Воронежская область, Рамонский район, п. ВНИИСС, д. 86; тел./факс (47340) 5-33-26,

e-mail: dissovetvniiss@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы им. А. Л. Мазлумова»,

Автореферат размещен на сайте ГНУ ВНИИСС: www.gnuvniiss.narod.ru и разослан » марта 2012 г. на сайте ВАК РФ: www.vak2.ed.gov.ru

«22» марта 2012 г.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Жужжалова Татьяна Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Буторина Анастасия Константиновна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Тороп Александр Андреевич

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О.И. Стогниенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Важнейшей задачей современной селекции сахарной свеклы является получение новых исходных форм и ускоренное создание гибридов с повышенной продуктивностью и другими хозяйственно-полезными признаками и свойствами.

Независимо от средств и методов селекции самой сложной частью работы является выявление генетической изменчивости в исходном селекционном материале и отбор желаемых генотипов (Жученко, 2001). Запасы такой изменчивости составляют генетический потенциал формообразования вида и популяции, но в силу сложности обнаружения селекционеру они малодоступны, а некоторые из них обычными методами генетического анализа совсем не раскрываются.

Методы молекулярного маркирования открывают широкие возможности для идентификации селекционных материалов сахарной свеклы, что позволяет решать проблему недостатка морфологических маркеров (Конарев, 2000). С использованием изоферментных маркеров изучен генетический полиморфизм материалов сахарной свеклы, установлено наследование изоферментных локусов, проведено тестирование устойчивости сахарной свеклы к нематоде (Левитес, 1984; Jung, Zoplien, 1986; Smed, Van Geyt, Oleo, 1989; Федулова, 2005). Применение белковых маркеров позволило идентифицировать формы кормовой, столовой и сахарной свеклы (Лесневич 1989; Буренин, Гаврилюк, 1994; Митин, 2004). Методами ДНК-генотипирования (RELP, SSR, RAPD) проведены работы по созданию генетической карты генома сахарной свеклы (Barzen et al.,1995; Shondelmaier, Steinrucken, Jung, 1996), исследованию полиморфизма видов рода Beta (Шаюк, 2003), идентификации гиногенетических линий (Свирщевская, Милько, Кильчевский, 2011).

Однако до настоящего времени остаются неясными основные механизмы становления такого полигенного количественного признака, как продуктивность (Титок, 2008). Одним из возможных путей в решении этой проблемы является анализ связей между молекулярно-генетическими особенностями и хозяйственно-полезными свойствами, основанными на применении молекулярных и биохимических маркерных признаков.

На современном этапе актуальным является изучение возможности применения совокупности молекулярно-генетических маркеров на основе RAPD-, IS SR-, и белкового анализов, которые позволяют группировать изучаемый материал по степени генетического родства (Yong-Il Cho et al., 1996), выявлять генетические различия между контрастными по качественным и количественным признакам растений (Xiao, Li, et al., 1996 и др.). Представляется перспективным применение ДНК-технологий и других методов молекулярного маркирования, с помощью которых станет возможным решение таких задач современной селекции, как контроль за переносом генетического материала дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях (Велишаева, Шилов, Хавкин, 2006).

В связи с этим исследование возможности применения методов молеку-лярно-генетического маркирования (RAPD, ISSR, белковых) для идентификации селекционных материалов, при разработке программ скрещивания, отборе интрогрессивных форм сахарной свеклы является актуальным направлением исследований.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в выявлении генетической структуры селекционных материалов и интрогрессивных форм сахарной свеклы на основе молекулярно-генетического анализа для повышения эффективности селекционного процесса.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

1) Выявить электрофоретический состав запасных белков семян (11S глобулинов) и определить генетические дистанции скрещиваемых исходных форм сахарной свеклы при получении пробных гибридов.

2) Оценить генетическое разнообразие селекционных материалов сахарной свеклы с использованием одиночных произвольных (RAPD) праймеров для осуществления молекулярно-генетической идентификации.

3) Изучить генетическую структуру межвидовых гибридов Fi Beta vulgaris L. x Beta corolliflora Zoss. с использованием белковых маркеров.

4) Выявить интрогрессивные формы при проведении межвидовой гибридизации сахарной свеклы с использованием видоспецифических ДНК-маркеров.

Научная новизна исследований. Впервые установлено, что генетические дистанции по типам белковых спектров 3 3 S глобулинов с максимальной частотой встречаемости (35-76 %) являются основой для определения гено-типических различий между исходными формами сахарной свеклы и подбора пар при гибридизации. Получены новые данные, свидетельствующие о возрастании уровня истинного гетерозиса по урожайности гибридов сахарной свеклы по мере увеличения генетической удаленности родительских компонентов (D>2,24). Обнаружены оригинальные типы белковых спектров для межвидовых гибридов В. vulgaris х В. corolliflora. Электрофоретические фрагменты с относительной подвижностью Rf = 0,05; 0,07; 0,47; 0,85; 0,90, характерные для дикой свеклы, позволяют выявлять элементы генома В. corolliflora в межвидовых гибридах.

Впервые на основе RAPD-профилей геномной ДНК, полученных с одиночными праймерами PAWS 5, PAWS 6, PAWS 16, PAWS 17, составлены генетические формулы позволившие осуществить молекулярно-генетическую идентификацию селекционных материалов сахарной свеклы. Наибольший полиморфизм установлен для праймеров к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК PAWS 5 и PAWS 17 для выявления различий между генотипами. С использованием произвольных одиночных праймеров определены генетические дистанции и проведена кластеризация для 33 комбинаций скрещиваний, что дает возможность наиболее обоснованно подбирать родительские компоненты гибридов сахарной свеклы.

Максимальные генетические расстояния между мужскостерильными линиями и сростноплодными опылителями составляют D=3,74-3,87.

В геноме межвидовых гибридов В. vulgaris х В. corolliflora различной плоидности установлено присутствие сателлитной последовательности HaeHI (161 п.н.), являющейся видоспецифическим признаком дикого вида В. corolliflora. Праймеры к данному сателлиту позволяют эффективно осуществлять отбор интрогрессивных форм свеклы. Данные исследования расширяют и углубляют теоретические представления о структурно-функциональной организации генома сахарной свеклы и интрогрессивных форм, что открывает большие перспективы для внедрения молекулярно-генетических методов в селекционный процесс.

Практическая ценность работы. Разработанный метод подбора родительских пар на основе установленных генетических расстояний по белковым маркерам может служить принципиальной основой создания новых высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы. Выявленные электрофо-ретические компоненты белковых спектров дикой свеклы В. corolliflora могут использоваться для тестирования интрогрессивных форм в потомстве от межвидовых скрещиваний.

Выявленная генетическая структура исходных родительских форм и гибридов сахарной свеклы на основе RAPD-анализа геномной ДНК позволяет осуществлять их генотипирование. Разработаный метод идентификации селекционных материалов по ДНК-маркерам рекомендуется использовать при регистрации гибридов, а так же для защиты авторских прав селекционеров.

Метод ПЦР с использованием видоспецифических праймеров к сателлитной ДНК HaeHI позволяет эффективно и быстро осуществлять отбор форм с интрогрессией В. corolliflora, ускоряя селекционный процесс. Разработанные в процессе исследований методические подходы могут найти широкое применение в селекции сахарной свеклы, а также использоваться в учебных программах по биологии и селекции в высших и средних учебных заведениях и в различных областях биотехнологии.

Положения, выносимые на защиту:

1) Использование запасных белков семян IIS глобулинов позволяет осуществлять подбор родительских пар для гибридизации сахарной свеклы с учетом их генетической удаленности.

2) RAPD - анализ геномной ДНК с использованием одиночных произвольных праймеров дает возможность идентифицировать и выявлять генетический полиморфизм селекционных материалов сахарной свеклы.

3) Электрофоретические фрагменты запасного белка IIS глобулина и ви-доспецифическая ДНК HaeHI позволяют выявлять скрытую генетическую изменчивость интрогрессивных форм при межвидовой гибридизации В. vulgaris х В. corolliflora.

Организация исследований и вклад автора. Работа выполнена в 20042011 годах во Всероссийском научно-исследовательском институте сахарной свеклы им. А.Л. Мазлумова и на кафедре физиологии и биохимии клет-

ки Воронежского государственного университета. Исследования проводились в соответствии с тематическими планами НИР института по заданиям 04.03.02.01: «Изучить проявление молекулярно-генетических признаков геномов В. vulgaris и В. corolliflora у межвидовых гибридов» и 04.03.02.02: «Молекулярно-генетическое изучение родительских форм при создании высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы на стерильной основе».

Автору принадлежит постановка проблемы, разработка программы и методики исследований, проведение эспериментальных исследований, статистическая обработка и интерпретация полученных данных, формулировка выводов и предложений. Доля личного участия диссертанта в получении и обобщении результатов исследований составляет 80 %.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены: на межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки» (Воронеж, 2005); на II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (г. Санкт-Петербург, 2007); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (г. Москва, 2008); на IX молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 2009); на IV Международной научной конференции молодых ученых «Новейшие направления аграрной науки в работах молодых ученых» (г. Новосибирск, 2010); на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2010); на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011); на XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 2011), на заседаниях Ученого совета ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им. A. JI. Мазлумо-ва» (в настоящее время ГНУ ВНИИ сахарной свеклы им. A. JI. Мазлумова Россельхозакадемии) в 2005-2011 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, рекомендаций для селекционной практики, выводов, приложений; включает 13 таблиц, 30 рисунков, 2 приложений.

Список использованной литературы включает 189 источников, в том числе 64 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве материалов для молекулярно-генетических исследований были использованы растения сахарной свеклы: исходные родительские формы (мужскостерильные линии (МС) №№ 08112, 1113, 1117, 1131, 1134, 08131,

08077, 1137, 1141, И-08015, И-08001, И-08016; многосемянные опылители (ОП)№№ 08008, 08016, 08197, 1165, 1172, 1180, 1187, 1195, 1203, 15202) и гибридные комбинации №№ - 08002, 08003, 08005, 08010, 08011, 08013, 08180, 08181, 08183, И-08015 хОП 15202, И-08001 хОП 15202, И- 08016 х ОП 15202, МС 94 Ар х ОП 15202), а так же полученные нами межвидовые гибриды: МС И-08015 хВ. corolliflora, МС И-08001 х В. corolliflora, гамма-МС-70 х В. corolliflora, МС № 32 хВ. corolliflora, МС № 31 хВ. corolliflora, МС № 172 х В. corolliflora.

В качестве материнских исходных форм при межвидовой гибридизации В. vulgaris х В. corolliflora использовались мужскостерильные растения культурной сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): гамма-МС-70, растения МС-линий № И-08001, № И-08015, № 32, № 31, № 173. Отцовской формой в скрещивании служила дикая свекла В. corolliflora Zoss. Для исследований использовали растения и семена, полученные при отдаленной гибридизации.

При создании межвидовых форм сахарной свеклы применяли методы принудительного опыления и культивирования оплодотворенных семяпочек с незрелыми зародышами в условиях in vitro (Подвигина, 2004).

Подсчет хромосом осуществляли под микроскопом в метафазных пластинках делящихся соматических клеток вегетативных органов свеклы по стандартной методике, окрашиванием ацетокармином (Ярмолюк, Ширяева, 1987). Измерение плоидности растений осуществляли с использованием проточного цитометра Partee* РА (Германия).

В работе применяли базовую методику проведения Ds-Na-электрофореза запасного белка семян 11S глобулина сахарной свеклы в 10% ПААГ (Кона-рев, 2000).

Геномную ДНК выделяли из 0,2 г зеленых листьев с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода с использованием СТАВ (Chomczynski, 1987). Качество выделенной ДНК определяли электрофорезом в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия (Маниатис, 1984). Полученную ДНК растворяли в ЮмМ трис- HCl-буфера, рН 8.0, содержащем 0,1мМ ЭДТА. ПЦР-анализ проводили в амплификаторе «Тер-цик» («ДНК-технология», Россия). Параметры амплификации были следующие: предварительная денатурация при 95°С в течение 10 минут, затем 30 циклов: 95°С - 40с, 60°С - 40с, 72°С - 40с и начальный этап элонгации цепи 72°С- 5 мин.

Для выявления интрогрессивных форм использовали праймеры, подобранные на основе нуклеотидной последовательности сателлитной ДНК HaelII, многократно повторяющейся во многих хромосомах В. corolliflora: /1 ggccaatttt tgccttttcg cgtccctttc gtacttatcg agtcatttaa ccccaaatta 61 ttttgaaca tgattatatg aggtataatg taactattgt gtagattttt aggcttgtat 121 atgttttgg ttgaatttcg ggaacgaaaa ggtcatttta g II.

Специфичность сателлитной ДНК НаеШ была показана F. Gindallis et al. (2001). В качестве праймеров использовали следующие нуклеотидные по-

следовательности: прямой - 5'-CCAATTTTGCCTTTTCG-3'; обратный - 5'-AAAATGACCTTTTCGTTCC-3'. Для создания специфических праймеров применяли программу РптегЗ.

Для анализа полиморфизма рассеянных повторяющихся последовательностей генома материалов сахарной свеклы в работе использованы следующие произвольные праймеры: PAWS 5 (5'- AAC-GAG-GGG-TTC-GAG-GCC-3'), PAWS 6 (5'- GAGTGTCAAACCCAACGA-3'), PAWS 16 (5'- ACC-TCT-GCG-CTT-GGA-GGC-3'), PAW S 17 (5'- CTA-CAC-GGA-CTG-GGT-CCG-3'). Олигонуклеотиды синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

Величину истинного гетерозиса вычисляли по формуле (Омаров, 1975):

Гист- = (Fi - Рл) / Рл х 100 %,

где Гист- - истинный гетерозис (%); Fi - значение изучаемого признака у гибридов первого поколения; Рл- значение признака у растений лучшей родительской формы.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли по стандартной методике (Доспехов, 1973). Кластерный анализ проводили с помощью программы Statistica 6.0. Повторность каждого опыта Зх - кратная биологическая.

ПОЛИМОРФИЗМ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН 11S ГЛОБУЛИНОВ В ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

Изучение генетической структуры исходных линий сахарной свеклы

В последние годы молекулярные маркеры становятся неотъемлемым элементом селекционного процесса для быстрого и эффективного отбора нужных генотипов растений. В связи с этим представляет интерес осуществление идентификации родительских компонентов сахарной свеклы и выявление генетических взаимоотношений в генофонде В. vulgaris для использования этих данных в селекционном процессе при создании новых гибридов.

В процессе нашей работы исследовано 17 исходных линий, использующихся для получения пробных гибридов на основе ЦМС. На основе полученных данных - электрофореграмм составлены генетические формулы. Всего для исследованных материалов обнаружено 69 типов белковых спектров, с частотой встречаемости от 2 до 76 % для индивидуальных селекционных материалов.

Для большинства исходных материнских линий обнаружен полиморфизм, представленный двумя-пятью типами электрофоретических спектров. Для МС-линии 94 Ар выявлено 7 типов спектров с частотой встречаемости от 5 до 35 %. Однако две пары характерных для данной линии типов спектров: № 22 и № 23 с частотой встречаемости, соответственно, 12 % и 10 %, а так же № 24 и № 25 с частотой встречаемости 9 % и 13 % различаются лишь интенсивностью проявления полипептидов. Для МС - линии И-08001 выявлено 5 типов спектров, из них схожими по компонентному составу оказа-

лись типы спектров с частотой встречаемости 64%, 13%, 5% (№№ 6, 7, 8) и типы спектров № 9-10 (различаются лишь интенсивностью проявления белковых полос). Подобные результаты получены и для других мужскосте-рильных линий. Для линий МС 1134, МС 1137, МС 1117 выявлено от 2 до 3 характерных для них типов спектров, различающихся лишь интенсивностью проявления. Выявленный полиморфизм 118 глобулинов свидетельствует о генетической однородности и гомозиготности материнских компонентов пробных гибридов.

Для сростноплодных опылителей в зависимости от генотипа выявлено наличие 4-8 типов спектров. Так, образец ОП 15202 характеризуется наличием наибольшего числа составляющих его биотипов, что отражается присутствием в его структуре по ПБ глобулинам восьми типов спектров с частотой встречаемости от 2 до 48%. Четыре из характерных для данного селекционного материала типов белковых формул являются минорными (частота встречаемости от 2 до 3%), типы спектра № 16 и № 17 - различаются лишь

интенсивностью полос.

Таким образом, в результате электрофоретического фракционирования запасных белков семян сахарной свеклы (ПБ-глобулинов) исходных родительских компонентов сахарной свеклы выявлена их генетическая структура, характеризующаяся наличием или отсутствием полипептидов с различной электрофоретической подвижностью, а также интенсивностью их проявления, что позволило составить генетические формулы.

Кластерный анализ в исследовании исходного селекционного материала сахарной свеклы

Анализ генетического разнообразия полезен при планировании скрещиваний с целью вовлечения в гибридизацию генетически дивергентных линий (Конарев, 1998).

Метод белковых маркеров является достаточно простым, удобным и дешевым, поэтому нами изучены генетические различия исходных родительских форм сахарной свеклы кластерным анализом матрицы белковых генетических профилей. При определении евклидова расстояния между генотипами обработке подвергались данные электрофоретического состава типов спектров с максимальной частотой встречаемости, характерных для индивидуальных линий. Интенсивность проявления полос в сравнительном анализе генетической структуры селекционных материалов методом кластеризации не учитывали.

Математическая обработка матрицы белковых профилей позволила сгруппировать селекционные материалы по степени генетического родства и определить попарные генетические дистанции всех возможных комбинаций скрещиваний исследованных родительских форм, на основе которых были построены дендрограммы.

Наибольшие генетические расстояния (0=2,24) выявлены для мужскосте-рильных линий № 1141,1134 и сростноплодных опылителей № 1165,1197 и 1181 Наименьшие дистанции (0=1,0) определены для комбинаций скрещи-

ваний МС 1117 х ОП 1172, МС 1137 х ОП 1172, МС 1113 * ОП 1172, МС 1141 х 1172, что свидетельствует об их относительной генетической близости (табл. 1).

Таблица 1 - Значения генетических расстояний (евклидовых) между исходными линиями сахарной свеклы (2011г.)

Селекционные материалы ОП 1203 ОП 1195 ОП 1197 ОП 1181 ОП 1172 ОП 1165

МС 1131 2,0 1,41 2,0 1,41 1,73 2,0

МС 1134 1,73 1,73 2,24 2,24 1,41 2,24

МС 1141 1,73 1,73 2,24 2,24 1,41 2,24

МС1113 1,41 0,00 1,41 1,41 1,00 1,41

МС 1137 1,41 1,41 2,00 2,00 1,00 2,00

МС 1117 1,41 1,41 2,00 2,00 1,00 2,00

Результаты кластеризации селекционных материалов сахарной свеклы позволили сгруппировать исследованные линии в два кластера (рис. 1).

Tree Diagram lor 12 VaniDlcJ Single Linkage Euclidean distances

1.6 -,-.-,-.-.-—.--,- ■ —■-■—-—■——■

1.4 -----1-

1,2

I 1.0 ■ .... ......

I 0.S

1 o.e

0,4

0.2 ........ ■

0,0 ---——I--—---—J—---—-

on 1165 Oniig7 on 1203 MC 1113 MC 1117 MC1141

ОП 1181 MC 1134 ОП 1195 ОП 1172 MC 1137 MC 1131

Рис. 1. Дендрограмма генетических расстояний между исходными линиями сахарной свеклы

Таким образом, в результате кластеризации исходных родительских форм (мужскостерильных линий и сростноплодных опылителей) на основе анализа компонентного состава запасных белков семян сахарной свеклы (IIS глобулинов) выявлена генетической отдаленность исходного материала.

Применение белковых молекулярных маркеров при подборе пар для скрещиваний

Получение высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы, как и других сельскохозяйственных культур, предполагает привлечение для скрещивания ценного в селекционном плане материала. В связи с этим, необходимы надежные методы оценки линий и способы прогнозирования гетерозиса.

Известно, что часто у гибридов с высоким гетерозисным эффектом родительские линии имеют существенные различия по белковым спектрам. Анализ этих отличий вселяет надежды на разработку эффективных критериев подбора пар (Конарев, 1993).

Оценку возможности использования метода белковых маркеров для эффективного отбора пар в гетерозисной селекции сахарной свеклы проводили одновременно с анализом урожайности корнеплодов родительских формами и вычисляли величину истинного гетерозиса.

Исследование взаимосвязи генетической отдаленности 15 исходных материалов сахарной свеклы и значений уровня истинного гетерозиса показало, что скрещивание линий с высокими значениями генетических дистанций позволяет получить наибольшее число гетерозисных гибридов - 66,6 %, от всех гибридов, полученных при скрещивании линий с Б = 2,24 (табл. 2).

Максимальное значение гетерозиса по урожайности корнеплодов для пробного гибрида МС 1141 хОП 1197 составило 16,28%, родительские линии данного гибрида имеют наибольшее генетическое расстояние между собой (0=2,24). Еще три гибрида с Б=2,24: МС 1141 х ОП 1165, МС 1134 х ОП 1181, МС 1134 х ОП 1197 имели значения гетерозиса 6,66 %; 7,13% и 3,23 %, соответственно.

Таблица 2 - Уровень проявления гетерозиса и генетическое расстояние между исходными формами у пробных гибридов сахарной свеклы (2011 г.)

Комбинация Генетическое рас- Урожайность корнеплодов

скрещивания стояние между у гибридного у лучшей ро- Гнет,

исходными роди- поколения, дительской %

тельск. формами, Б р1,т/га формы, Рл, т/га

МС 1113 хОП 1195 0,00 34,13 36,49 -6,46

МС 1117 ХОП 1172 1,0 33,43 34,23 -2,33

МС 1137 ХОП 1172 1,0 33,79 34,23 -1,28

МС 1113 X ОП 1172 1,0 32,70 36,49 -10,38

МС 1141 ХОП 1165 2,24 38,09 33,79 12,72

МС 1141 ХОП 1181 2,24 32,26 33,59 ■3,9

МС 1134 ХОП 1181 2,24 36,49 34,06 7,13

МС 1141 ХОП 1197 2,24 39,06 33,59 16,28

МС 1134 ХОП 1197 2,24 35,16 34,06 3,23

МС 1134 ХОП 1165 2,24 32,50 34,06 -4,6

НСРо! - 1.1 1,1 -

Для гибридных комбинаций МС 1113 х ОП 1195, МС 1117 х ОП 1172, МС 1137х ОП 1172, МС 1113 л- ОП 1172 выявлены минимальные генетические дистанции (Б=0,00-1,0), вычисленные значения истинного гетерозиса для полученных пробных гибридов имели отрицательные значения (от -1,28 до -10,38).

Следует отметить, что две гибридные комбинации сахарной свеклы МС 1141 х ОП 1181 и МС 1134 х ОП 1165 с отрицательными значениями гетерозиса (-3,9 и -4,6 %, соответственно) имеют значительное генетическое расстояние между исходными формами (О = 2,24). Исключением так же является гибрид № 1179 (МС 1131 х ОП 1181; 1,41), его урожайность 119,5% от стандарта (Гист=13,81).

Наши исследования показали, что по мере увеличения генетических расстояний мевду родительскими линиями возрастал уровень истинного гете-

розиса пробных гибридов, что согласуется с результатами исследований других авторов (Кожухова, Вареник, Сиволап, 2005).

Таким образом, сопоставление данных по продуктивности исследованных селекционных материалов с результатами кластерного анализа показало, что скрещивание линий, наиболее генетически отдаленных друг от друга, играет важную роль в проявлении эффекта гетерозиса у гибридов. Гибридные комбинации с генетическим расстоянием менее 1,41 целесообразно исключать из дальнейшего изучения в связи с низкой продуктивностью. Исследования позволили разработать метод подбора подбора пар для скрещиваний при получении гетерозисных гибридов сахарной свеклы на основе анализа белковых спектров, включающий подсчет частоты встречаемости основных типов спектров у родительских компонентов, определение родства на основе генетических расстояний с учетом наибольшей их удаленности друг от друга.

RAPD-MAPKEPbl В ИССЛЕДОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ИСХОДНЫХ ЛИНИЙ И ГИБРИДОВ САХАРНОЙ

СВЁКЛЫ

Генотипирование исходного материала сахарной свеклы на основе полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей генома

Для интенсификации селекционного процесса, решения проблем семеноводства сахарной свеклы и защиты авторских прав необходима дифференциация селекционных материалов.

Принципиально новые возможности для идентификации селекционных материалов открылись с появлением методов основанных на применении ДНК-маркеров, которые используют для точной и быстрой паспортизации различных видов и сортов растений, изучения филогенетического родства и т.д. (Ковеза, 2005).

Одним из методов исследования ДНК - гетерогенности селекционного материала является RAPD - метод (random amplified polymorphic DNA) поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с использованием короткого случайного праймера (Сиволап, 1995; Martin, 1997 и др.). Данный метод позволяет выявлять высокополиморфные «анонимные» последовательности ДНК, фланкированные инвертированными повторами декануклеотидов, в частности терминальными участками ретротранспозонов. Одно из достоинств этого метода - возможность генотипирования одновременно по многим локусам, локализованным в разных участках генома, что особенно важно (Созинова, 2008).

Молекулярный анализ исходных родительских компонентов и некоторых гибридов сахарной свеклы с использованием праймеров к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК семейства R 173: PAWS 5, PAWS 6, PAWS 16, PAWS 17 (Rogowsky, 1991) позволил выявить для каждого исследованного генотипа определенный набор ДНК-фрагментов, отличающий его от других селекционных материалов (Федулова и др., 2010).

Анализ экспериментальных данных, полученных при использовании праймера PAWS 5 позволил амплифицировать наибольшее число фрагментов ДНК на генотип - до восьми, PAWS 17 - до четырех, PAWS 6 - до трех, праймер PAWS 16 - до двух ПЦР-продуктов различной длины на индивидуальный генотип, т.е. оказался наименее информативным. Для исследуемых материалов с использованием праймера PAWS 5 получено 9 полиморфных фрагментов ДНК (100%), общее количество ампликонов, полученных с этим праймером - 80 (рис. 2). Диапазон длин полученных фрагментов ДНК при использовании четырех праймеров — от 250 до 2000 п.н.

Рис. 2. Амплификация геномной ДНК свеклы с праймером PawS 5

1 - 08011, 2 - 08010, 3 - 08013, 4 - 08003, 5 -ОП 08008, 6 - ОП 08016, 7 - 08005, 8 - ОП 08197, 9 -08180, 10-MC 08077, 11 -08183, 12-MC 08012, 13-MC 08131, 14-08002, 15- 08077, М - маркер молекулярных масс

Для праймера PAWS б полиморфными оказались 7 фрагментов ДНК (100%), общее количество ампликонов, полученных с данным праймером для всех генотипов составило 34, длина ДНК-фрагментов составила от 200 до 800 п.н. Для праймера PAWS 16 выявлено 3 (100%) полиморфных RAPD - фрагмента длиной 400, 500 и 800 п. н. Для всех генотипов в сумме получено 22 ПЦР-продукта. Для селекционных материалов №№: 08011, 08010, 08003, 08008, 08016, 08005, 08197, 08180, 08077, 08183, 08012, 08131, 08002, 08180 при амплификации праймером PAWS 16 обнаружены общие RAPD - фрагменты длиной 500 п.н. Это может свидетельствовать об относительной генетической близости данных селекционных материалов.

С использованием короткого одиночного праймера PAWS 17 выявлено 7 полиморфных фрагментов ДНК, длиной от 700 до 2000 п. н. Общее количество ампликонов, полученных с данным праймером - 36 (рис. 3).

Рис. 3. Амплификация геномной ДНК свеклы праймером PawS 17

1 - 08181, 2 - 08002, 3 - 08003, 4 - 08005, 5-ОП 08008, 6 - ОП 08197, 7 - 08183, 8-МС 08077, 9 -МС 08131, 10-МС 08012, И-08180, 12 - 08011, 13-ОП08016, М - маркер молекулярных масс По результатам ДНК-амплификации с указанными произвольными прай-мерами выявлены специфические RAPD-спектры, характеризующие исходные родительские формы и некоторые гибриды. На основе полученных

данных составлены молекулярно-генетические формулы, которые отражают генетическую структуру индивидуальных материалов сахарной свеклы (табл. 3).

Таблица 3 - Генетические формулы некоторых селекционных материалов сахарной свеклы

Селекционный материал Общая формула полиморфных фрагментов

МС 08012 иА2їоиАзмиА4оо1А5оо1А7ооІАїм1А9ооІАіооо1Аі5(ю lB2W),JB4oo1B5ooUB(;00lB6jfiuB7ooUB 800 °С400 'с500 OCiMOD7MODI|00°D9M'DIM0 Dlloo'DjdM DMM

МС 08131 А:<о Ajoo A400 Ази А?» Asm A900 A1000 A1500 Bjoo B400 B500 В«м Bfiso B700 В 800 ^400 *С5оо Ч^ОО^ОО D80oDD900°Dl(K«0Dl1001D|600 Djooo

МС08077 uA:iо"A3ck)UA<¡1(11 A5(X,'АAs!K,1A1A]1Л,5иВ2миВ40о>Вяю1І}бооиВб5о,,В7(н)иВ soo C400 C500 Cgoo D700 Dioo D^oo D1000 Dnoo D1600 D2000

ОП 08008 A250 A3oo A400 A500 A700 АЯоо A900 Аким Аіям Bjoo B400 B5M B60o B«o Втзд В 800 C400 C500 Cgoo D700 D«00 D900 Dlfloo Оцоо D1600 D2000

ОП 08016 °А2501Аз0о1А400ОА5ГюІА700иАв001А»0ОіА1000,Аі500 ,B2„0"B400,B5M"B6M),Bi50UB7M)"B шСт 'Cjoo °Своо'D7(yj°Dgfio DWO0DIOOO°DMOOIОібоо' D2000

Соответствие праймеров и букв латинского алфавита, используемых для записи полученных полиморфных фрагментов: А - фрагменты ДНК, выявленные с помощью прайме-ра PawS 5, В- PawS 6, С - PawS ¡6, D - PawS 17. Молекулярный вес фрагмента, полученного с конкретным праймером обозначен нижним индексом, верхним индексом обозначено наличие (1) или отсутствие (0) фрагмента на электрофореграмме

Полученные данные молекулярно-генетической паспортизации могут быть использованы для быстрой (в течение 2-3 часов) идентификации исследованных селекционных материалов, защиты авторских прав селекционеров.

Таким образом, использование в полимеразной цепной реакции праймеров к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК семейства R 173: PAWS 5, PAWS 6, PAWS 16, PAWS 17 позволяет выявлять фрагменты ДНК, фланкированные инвертированными повторами терминальных участков ретротранспозонов и устанавливать индивидуальные особенности селекционных материалов сахарной свеклы (исходных родительских компонентов и некоторых гибридов). Количество выявляемых ДНК-фрагментов в зависимости от генотипа и локуса варьировало от 1 до 8. Диапазон длин получаемых фрагментов составил от 250 до 2000 п.н. Для 21 генотипа сахарной свеклы (11 исходных линий и 10 гибридов) с использованием RAPD-метода получены генетические профили, позволяющие их идентифицировать и различать, составлены генетические формулы. Отобраны праймеры PAWS 5 и PAWS 17, как наиболее полиморфные для исследованных селекционных материалов и перспективные для генотипирования.

Изучение взаимосвязи генетической структуры пробных гибридов по RAPD-маркерам с продуктивностью

Анализ генетической структуры гибридных комбинаций с различной продуктивностью и родительских форм сахарной свеклы на основе составленной матрицы присутствия/отсутствия RAPD-фрагментов позволил выявить новые молекулярно-генетические особенности гетерозисных гибридов (рис. 4).

МС №08131 000000111 МС №08012 000111111

ОП № 08016 011010111 ОП №08197 000011111

Гибр. № 08011 000011110 Гибр. №08180 000111110

МС № 08131 000000111 МС № 08077 000110111

ОП № 08008 000000111 ОП №08197 000011111

Гибр. № 08003 111011111 Гибр. №08183 000011111

Рис. 4. Матрица присутствия / отсутствия компонентов на электрофореграмме продуктов

ПЦР с праймером PawS 5 некоторых родительских форм и гибридов сахарной свеклы Цифрами обозначено: «1» - наличие ДНК-ампликона; «О» - отсутствие ДНК - ампликона

С использованием праймера PAWS 5 для гибрида № 08003, превышающего по урожайности (29,11 т/га) стандарт на 8% и наиболее продуктивного по сбору сахара - 112,2 % от стандарта (табл.4) обнаружено 8 ампликонов длиной от 250 п.н. до 1500 п.н. (Федулова, Богачева и др., 2010). У каждого из родительских компонентов (ОП 08197 и МС 08112) этого гибрида выявлено значительно меньшее количество ПЦР-продуктов - по три фрагмента ДНК.

Таблица 4 - Урожайность и сахаристость гибридов и родительских компонентов сахарной свеклы (данные лаборатории ЦМС, 2009 год)

Селекционый номер Урожайность, Саха ристость, Сбор сахара

т/га % от станд. % % от станд. т/га % от станд.

МС 08112 26,44 98,1 19,88 108,1 5,25 105,8

МС 08131 28,33 105,2 19,0 103,3 5,38 108,4

МС08077 29,50 109,5 19,15 104,1 5,65 113,8

ОП 08008 27,56 102,3 19,27 104,8 5,32 107,2

ОП 08016 25,44 94,4 18,70 101,7 4,76 96,0

ОП 08197 29,72 110,3 18,90 102,8 5,63 113,4

Гибрид 08003 29,11 108,0 19,13 104,0 5,57 112,2

Гибрид 08005 28,00 103,9 19,13 104,0 5,36 107,9

Гибрид 08011 29,83 110,7 18,57 101,0 5,54 111,6

Гибрид 08180 27,28 98,8 18,83 102,4 5,01 101,0

Гибрид 08181 27,39 101,8 19,17 101,6 5,25 103,4

Гибрид 08183 29,11 108,2 18,58 98,4 5,40 106,4

НСР 0,5 3,15 - 0,51 - 0,59 -

Гибрид № 08011, превышающий стандарт по урожайности на 10,7 %, имеет спектр продуктов амплификации праймером PAWS 5, включающий 2 фрагмента ДНК, идентичных по длине своим родителям (900-1000 п.н.), один ампликон, характерный для отцовского родителя ОП № 08016 (500 п. н.) и один специфический фрагмент с длиной 800 п.н. Родительские формы данного гибрида различаются присутствием/отсутствием трех фрагментов ДНК (длиной 300, 400 и 700 п.н.). Низкопродуктивный гибрид № 08180 (урожайность от стандарта 98,8 %) имеет 5 компонентов на фореграмме, полученной с праймером PAWS 5. В ДНК- спектре для данного гибрида отсутствует фрагмент ДНК (1500 п.н.), характерный для обоих его родителей. Спектры его родительских форм МС №08012 и ОП № 08197 различаются присутствием/ отсутствием одного компонента (500 п.н.).

Увеличение повторов локуса при гибридизации, возможно, объясняется эпистатическим межгеномным взаимодействием и является основой проявления гетерозиса и усиления признака продуктивности.

Таким образом, анализ электрофоретических ДНК-спектров гибридных комбинаций позволил выявить некоторые интересные факты - установлены различия по количественному соотношению повторов умеренно-повторяющихся последовательностей ДНК у родительских форм и некоторых гибридов сахарной свеклы (Федулова и др., 2011). Гибриды, имеющие урожайность выше, чем у родительских форм, характеризуются увеличением количества ампликонов, выявляемых праймерами PawS 5, появлением новых компонентов ДНК-спектров, отсутствующих у родительских форм. Их родительские компоненты имеют генетические различия, выявляемые на электрофоре грамме продуктов амплификации. Низкопродуктивные гибриды характеризуются уменьшением числа ампликонов, отсутствием фрагментов ДНК, характерных для родительских исходных форм. Однако выявленные нами закономерности требуют дальнейшего исследования с применением большего количества ДНК-маркеров (Богачева и др. 2011),

Определение генетической отдаленности исходного селекционного материала сахарной свеклы

Исследование генетического полиморфизма селекционных материалов сахарной свеклы с использованием четырех одиночных RAPD-праймеров позволило выявить 172 полосы на электрофореграммах разделения ПЦР-продуктов для исходных селекционных материалов.

Результаты экспериментов использованы для определения уровня дивергенции между исследованными линиями методом кластеризации, были рассчитаны генетические расстояния (евклидовы), которые варьировали от 1,0 до 3,87. Все материалы кластеризовались на две группы (рис. 5).

Tree Diagram 1оИ1 Variable* Single Linkage Euclidean distances

MC 06012 -

ОП 08008 --—-1

ОП 08197 ---'

MC 08131 -—-

MC08077 -—--—- -

ОП 08018 ------—-----

MC И-08001 -1_

МСИ-08015 -1_I

ОП15202 -' ----

MC/-08016 -1_

MC 94 Ap. -'

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Linkage Distance

Рис. 5. Дендрограмма генетических расстояний между исходными линиями сахарной свеклы

Наименьшие генетические расстояния выявлены для комбинаций скрещиваний (D= 1,0) MC И-08015 и ОП 15202. Наибольшие генетические расстояния установлены для родительских пар МС И-08001 х ОП 08197

(D=3,87), MC И-08001 * ОП 08001 (D= 3,74), МС И-08016 * ОП 08008 (D=3,46), МС И-08015 х ОП 08008 (D=3,74), МС 94 Ар х ОП 08008 (D= 3,46), МС И-08016 хОП 08016 (D= 3,74) и др. Данные пары могут быть рекомендованы для проведения скрещиваний. Взаимные генетические дистанции между мужскостерильными линиями варьировали от 1, 41 до 3,87, между опылителями от 1,73 до 3,61.

Таким образом, в результате проведенных исследований осуществлена дифференциация исходных линий сахарной свеклы, полученные данные о генетической удаленности селекционных материалов могут быть использованы для более обоснованного подбора пар при гибридизации сахарной свеклы.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СКРЫТОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

Оценка геномного состава межвидовых гибридов B.vulgaris х В. corolliflora по белковым маркерам

В настоящее время актуальным является расширение генетической изменчивости сахарной свеклы за счет ее дикого сородича В. corolliflora Zoss.

Для более эффективного использования в селекции межвидовых гибридов важно контролировать процесс межвидовой гибридизации. Для этого необходимо иметь эффективные маркерные системы.

Метод белковых маркеров дает возможность выявлять в геномах и отдельных хромосомах сортов и линий чужеродный генетический материал (Конарев, 1998). За счет большого числа характеристик белковые маркеры позволяют определять генетическую изменчивость в морфологически однородных популяциях.

Исследование электрофоретического спектра 11S глобулинов родительских форм, используемых в межвидовой гибридизации, показало их него-мологичность друг с другом - для дикой и культурной сахарной свеклы общих типов спектра не было обнаружено. Анализ белковых спектров 11S глобулина исходных родительских форм (рис. 6), используемых в межвидовой гибридизации показал большую гетерогенность белков дикой свеклы (14 типов спектров) по сравнению с мужскостерильными формами сахарной свеклы, которые были использованы в гибридизации в качестве материнских форм (5-6 типов спектров). Широкий спектр генетической изменчивости по данному белковому признаку у дикой свеклы, возможно, связан с отсутствием применения к этому дикому виду искусственного отбора. По числу компонентов и интенсивности окрашивания белковых зон и общему количеству типов спектров В. corolliflora значительно превосходит исследованные селекционные образцы сахарной свеклы.

Рис. 6. Частоты встречаемости типов спектров у дикой свеклы В. согоІЩога (слева) и

материнской формы - МС-линии И-08015 (справа) по Ив глобулина Белковые профили дикой свеклы характеризуются большим полиморфизмом по количеству типов спектров по сравнению с сахарной свеклой. В процентном соотношении к общему количеству типов спектров дикая свекла более богата генотипами с частотой встречаемости от 2% до 10% (59 % от общего числа типов спектров) по сравнению с культурной (от 4% до 20 %).

Большое количество минорных типов спектра (рис. 7), вероятно, ооеспечи-вает наибольшую приспособленность и выживаемость дикого вида в условиях среды обитания.

60% 40% 20% 0%

ГГ"

вВеїасогоІІіПога з МС И-08015

амси-о8ооі

Огамма-МС-70

Рис. 7. Доля типов спектров с частотой встречаемости от 2% до 10% у В. сого1Щога и

сахарной свеклы

Семена от всех комбинаций межвидовых скрещиваний характеризовались наличием новых типов спектров - гибридных. Белковые формулы гибридных семян включают материнские, отцовские и общие компоненты, а также в некоторых случаях характеризуются усилением белковых зон: № 18 (Ы£=0,02; тМ 77кД), № 9 (Я£=0,54; тМ 39кД) и др. В гибридных спектрах наблюдалось присутствие компонентов № 3 (ЯМ),90; тМ ПкД), № 4 (МЧ),85; тМ ПкД), № 10 (М=0,47; шМ 44 кД), № 16 (№0,07; тМ 73кД), № 17 (ШЮ,05; тМ 56кД), характерных только для дикой свеклы В.согоШ/1ога и отсутствующих у соответствующих материнских форм сахарной свеклы. По-видимому, скрещивание отдаленных видов влечет за собой изменения в геноме, связанные с регуляцией синтеза белка (Герасимова, 1985; Родин, 1989). Изменчивость по белковому признаку в гибридных семенах наблюдается как в зоне кислых, так и основных полипептидов.

Таким образом, изучение генетической структуры исходных родительских форм (дикой свеклы В. согоШ/1ога, мужскостерильных линий № И-08001, № И-08015 и гамма-МС-70) и гибридов В.vulgaris *В.согоШ/1ога ме-18

тодом белковых маркеров позволило выявить скрытую генетическую изменчивость, возникающую при проведении отдаленной гибридизации. Межвидовая гибридизация вызывает изменения в электрофоретическом составе белков семян свеклы. Выявленные нами электрофоретические компоненты дикой свеклы В.corolliflora, встречающиеся в гибридных спектрах, могут быть использованы для осуществления контроля межвидовой гибридизации (Усачева, Богачева, 2007).

Детекция интрогрессии элементов генома В. corolliflora в межвидовых гибридах с использованием видоспецифических маркеров

Применение в селекции межвидовой гибридизации предполагает включение нового генетического материала в геном сахарной свеклы. В связи с этим, важнейшим элементом селекционного процесса с использованием межвидовой гибридизации является отбор интрогрессивных форм сахарной свеклы. ДНК- маркеры позволяют исследовать генетическую изменчивость не на уровне продуктов экспрессии гена, а на уровне генома.

Хромосомы В. corolliflora и В. vulgaris сходны по размеру и морфологии, поэтому определения их количества путем подсчета под микроскопом не достаточно, чтобы идентифицировать генотипы и контролировать процесс межвидовой гибридизации при анализе большого количества гибридных растений.

Высокой эффективностью для идентификации генетического материала В. corolliflora обладает сателлитная ДНК НаеШ, специфичность последовательности которой для этого вида показана Gindallis et al. (2001) с помощью in situ гибридизации.

Проведенный ISSR-ПЦР-анализ геномной ДНК дикой свеклы и растений, полученных от межвидовых скрещиваний В. vulgaris х В. corolliflora, с подобранными нами праймерами к сателлиту НаеШ, показал наличие одной полосы на гель-электрофорезе (рис. 8).

M 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 8. Амплификация геномной ДНК дикой свеклы и гибридных растений, со специфическими праймерами к сателлитной последовательности НаеШ 1 - В. corolliflora; 2-5 - растения, полученные в результате скрещивания В. vulgaris хВ. corolliflora (4 - триплоид, 2,3,5- диплоиды); материнские компоненты: 6 - МС И-08015; 7 - гамма-МС-70; S - МС И-08001; М - маркер молекулярной массы ДНК

Длина полученного ампликона (161 п.н.) в каждом из гибридов и дикой свекле совпадает с размером исследуемой нуклеотидной последовательно-

сти (рис. 8). Один ПЦР-лродукт является результатом специфического связывания праймера с матрицей и подтверждает наличие сателлитной ДНК HaelII (видоспецифической для В. corolliflora, многократно-повторяющейся во многих ее хромосомах) в геноме вышеуказанных растений. Анализ материалов сахарной свеклы, использовавшихся в качестве материнских форм в гибридизации не выявил присутствия искомой сателлитной последовательности в их геноме (Богачева и др., 2007; Епринцев и др., 2008).

Наши исследования показали, что сателлитная ДНК HaelII присутствует в триплоидных и диплоидных растениях, полученных в результате скрещивания В. vulgaris х В. corolliflora, т. е. выявлено наличие интрогрессии элементов генома дикой свеклы в гибридные формы. Так как триплоидные гибриды обладают рядом отрицательных признаков, наиболее нежелательными из которых является глубокое залегание корня и склонность его к разветвлению, то они, очевидно, малопригодны для использования в селекции. Диплоидные интрогрессивные растения, обладающие фенотипом сахарной свеклы и положительными признаками, могут быть вовлечены в селекционный процесс (Богачева, Усачева, Жужжалова, 2009).

Вместе с тем, используемые нами методы не позволяют определить объем и способ передачи генетического материала дикой свеклы в геном сахарной. О передаче генетического материала отцовских форм при межвидовой гибридизации, когда полученные гибриды по фенотипу и хромосомному набору не отличались от материнских форм, свидетельствуют данные авторов, выдвинувших гипотезу о возможной гибридизации фрагментов ДНК отдаленных видов растений (Zhou, 1979; Wet J.M.J. De, 1984). Они предположили, что целые хромосомы вида элиминируются, однако некоторые участки ДНК, имеющие генетическое сродство, могут гибридизоваться с материнским геномом. Согласно современным данным хромосомы сахарной свеклы имеют горячие точки транслокаций, например, в девятой хромосоме, как это было установлено с помощью RFLP-метода (Schulte et al., 2006). Это позволило нам предположить, что наличие у диплоидов последовательности HaelII, по-видимому, является результатом произошедшей транслокации, при которой участок хромосомы материнской формы В. vulgaris, был замещен участком В. corolliflora. Однако, это требует дальнейшего более глубокого исследования.

Таким образом, применение полимеразной цепной реакции с использованием видоспецифических праймеров к сателлитной ДНК HaelII В. corolliflora позволяет осуществлять быстрый отбор интрогрессивных форм сахарной свеклы благодаря высокой консервативности сайтов праймирова-ния, что значительно упрощает задачи селекционеров.

ВЫВОДЫ

1. Установлена генетическая структура исходных селекционных материалов сахарной свеклы на основе полиморфизма запасных белков семян 11S глобулинов, позволившая составить молекулярно-генетические формулы для

идентификации и паспортизации. Для исследованных материалов выявлено 69 оригинальных типов электрофоретических спектров с частотой встречаемости от 2 % до 76 %. Типы спектров мужскостерильных линий характеризовались в основном различиями в интенсивности проявления полипептидов.

2. Использование кластерного анализа на основе компонентного состава основных белковых спектров 11S глобулинов позволяет сгруппировать исходные линии сахарной свеклы по степени генетического родства. Показано, что с увеличением генетической удаленности родительских компонентов (D > 2,24) возрастает уровень истинного гетерозиса гибридов сахарной свеклы.

3. Разработан метод подбора родительских пар по белковым маркерам, включающий: подсчет частоты встречаемости основных типов спектров у родительских компонентов, определение родства на основе генетических расстояний с учетом наибольшей их удаленности друг от друга, что позволяет наиболее обоснованно подбирать компоненты для скрещиваний для повышения эффективности селекционного процесса.

4.Установлено, что при межвидовой гибридизации наблюдаются генетические изменения, выявляемые методом электрофоретического фракционирования запасных белков семян. Выделены электрофоретические компоненты спектров 11S глобулинов дикой свеклы В. corolliflora (с относительной подвижностью Rf = 0,05; 0,07; 0,47; 0,85; 0,90) которые могут быть использованы для обнаружения чужеродного генетического материала в межвидовых гибридах.

5. Наиболее полиморфными и перспективными для идентификации селекционных материалов сахарной свеклы являются праймеры к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК семейства R 173: PAWS 5 и PAWS 17. Исследованные селекционные материалы сахарной свеклы характеризовались варьированием числа выявляемых ДНК- ампликонов в зависимости от генотипа и локуса от 1 до 8 и диапазоном длин получаемых RAPD- фрагментов от 250 до 2000 п,н.

6. На основе данных RAPD-анализа определены генетические дистанции между 11 исходными родительскими линиями сахарной свеклы (для 33 возможных комбинаций скрещивания). Наибольшие значения генетических расстояний выявлены для родительских пар МС И-08001 X ОП 08197 (D=3,87), МС И-08001 X ОП 08001 (D= 3,74), МС И-08016 X ОП 08008 (D=3,46), МС И-08015 X ОП 08008 (D= 3,74), МС 94 Ар X ОП 08008 (D= 3,46), МС И-08016 X ОП 08016 (D= 3,74) и др. Данные родительские пары рекомендованы для проведения скрещиваний.

7. Разработаны метод идентификации селекционных материалов по RAPD-маркерам и метод подбора родительских пар на основе анализа геномной ДНК, основанные на присутствии / отсутствии фрагментов ДНК, с учетом евклидовых расстояний.

8. Установлено присутствие сателлитной ДНК Яде/// в геноме триплоидных и диплоидных форм межвидовых гибридов Beta vulgaris х Beta corolliflora. ISSR-ПЦР-анализ с видоспецифическими праймерами, сконструированными к данной последовательности ДНК, является точным методом детекции и позволяет быстро отбирать растения, несущие в своем геноме генетический материал дикой свеклы В.corolliflora, что позволяет значительно упростить и ускорить селекционный процесс.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. Для повышения эффективности селекции сахарной свеклы при создании гибридов с повышенной продуктивностью рекомендуется использовать метод, основанный на выявлении генетических дистанций исходных линий сахарной свеклы, рассчитанных на основе компонентного состава основных типов белковых спектров.

2. Для проведения молекулярно-генетической идентификации предлагается применять RAPD-анализ с использованием одиночных произвольных прай-меров при регистрации гибридов, а так же для защиты авторских прав селекционеров.

3. При проведении межвидовой гибридизации сахарной свеклы с диким видом Beta corolliflora loss, предлагается использовать метод ISSR-ПЦР с видоспецифическими праймерами к сателлитной ДНК НаеШ, позволяющий отбирать интрогрессивные формы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Богачева H.H. Идентификация генетического материала дикой свеклы в геноме межвидовых гибридов / H.H. Богачева, Р.В. Усачева, Т.П. Жужжалова, Т.П. Федулова, А.Т. Епринцев, Д.Н. Федорин // Вестник РАСХН. - 2009. - №. 3. - С. 59-61.

2. Федулова Т.П. Молекулярно-генетическое изучение родительских форм и гибридов сахарной свеклы / Т.П. Федулова, H.H. Богачева, Д.Н. Федорин, М.А. Богомолов, В.П. Ошевнев // Сахарная свекла. - 2010. - №8. - С. 8-10.

3. Богачева H.H. Получение интрогрессивных форм свеклы при проведении межвидовой гибридизации / H.H. Богачева, Д.Н. Федорин, Т.П. Федулова // Сахарная свекла,-2010. - №4. - С.10-12.

Публикации по теме диссертации в иных изданиях

4. Богачева H.H. Индуцирование генетической изменчивости при проведении межвидовой гибридизации (Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss.) I H.H. Богачева II Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки: Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых. - Воронеж, 4.2. - 2005. - С.95-97.

5. Богачева H.H. Электрофоретический анализ белков семян, полученных при межвидовой гибридизации (Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss.) / H. H. Богачева, P.B. Усачева II Селекция и семеноводство полевых культур: Юбилейный сборник научных трудов,- Воронеж, ВГАУ, 4.2. - 2007. - С.34-35.

6. Богачева H.H. Детекция интрогрессии элементов генома Beta corolliflora Zoss. в геноме сахарной свеклы Beta vulgaris L. / Н. Н. Богачева, Р.В. Усачева, А.Т. Епринцев, Д.Н. Федорин, Т.П. Федулова // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: Материалы II Вавиловской международной конференции. - С.-Пб, 2007. - С. 244-245.

7. Усачева P.B. Биохимическая характеристика межвидовых гибридов (Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss.) / P.B Усачева, H.H. Богачева // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: Материалы II Вавиловской международной конференции. - С.-Пб,

2007. - С . 360-361.

8. Богачева H.H. Создание и молехулярно-генетическое изучение межвидовых гибридов свеклы Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. / H.H. Богачева,Т.П. Жужжалова, A.T. Епринцев, Д.Н. Федорин // Биология клеток растений in vitro-и биотехнология: Материалы IX международной конференции. - М., 2008. - С.50-51.

9. Епринцев А.Т. Молекулярно-биохимические особенности межвидовой гибридизации Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. / A.T. Епринцев, Д.Н. Федорин, H.H. Богачева, Т.П. Жужжалова, Т.П. Федулова // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - Выпуск 10. - ВГУ. - Воронеж,

2008. - С. 89-96.

10. Богачева H.H. Применение культивирования in vitro и молекулярного маркирования для осуществления и контроля межвидовой гибридизации Beta vulgaris х Beta corolliflora / H.H. Богачева, P.B. Усачева // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Материалы IX молодежной научной конференции. - М., 2009. - С. 8-9.

11. Богачева H.H. Получение новых форм сахарной свеклы путем отдаленной гибридизации Beta vulgaris L. *Beta corolliflora Zoss. / H.H. Богачева // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: Труды IV международной конференции молодых, ученых. - Новосибирск, 2010. - С. 226-229.

12. Федулова Т.П. Подбор родительских пар для гибридизации с использованием ДНК-маркеров / Т.П. Федулова, М.А. Богомолов, H.H. Богачева, Т.П. Жужжалова, Д.Н. Федорин, В.П. Ошевнев, А.С Хуссейн // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы VI Московского международного конгресса,- М., 2011. - ч. I. - С. 234-235.

13. Богачева H.H. Молекулярно-генетическое исследование гибридов сахарной свеклы с разным уровнем продуктивности / H.H. Богачева, Т.П. Федулова, Д.Н. Федорин // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Материалы XI молодежной научной конференции. - М., 2011. - С.13-14.

Подписано в печать 22.03.2012. Формат 60 х 84/16. Бумага офсетная.

Усл. печ. л. 1,3 Тираж 100 экз. Заказ №746

Отпечатано в типографии Воронежского ЦНТИ - филиала ФГБУ «РЭА» Минэнерго России

394036, г. Воронеж, пр. Революции, 30.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Богачева, Наталия Николаевна, Рамонь

61 12-3/1219

Российская академия сельскохозяйственных наук

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы

им. А. Л. Мазлумова

БОГАЧЕВА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК 633.63:575:632.52.577.1

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Т. П. Жужжалова

Рамонь - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................10

1.1. Использование молекулярных маркерных систем в селекционной практике сельскохозяйственных растений.......................................10

1.2. Методы молекулярного маркирования в генетико-селекционных исследованиях сахарной свеклы......................................................20

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................25

2.1. Материалы исследований......................................................25

2.2. Методика проведения исследований.........................................25

3. ПОЛИМОРФИЗМ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН IIS ГЛОБУЛИНОВ В ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ.........................................................................29

3.1. Изучение генетической структуры исходных линий сахарной свеклы.........................................................................................29

3.2. Кластерный анализ в исследовании исходного селекционного материала сахарной свеклы.........................................................35

3.3. Применение белковых молекулярных маркеров при подборе пар для скрещиваний............................................................................40

4. RAPD-MAPKEPbl В ИССЛЕДОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ИСХОДНЫХ ЛИНИЙ И ГИБРИДОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ.........................................................................................49

4.1. Генотипирование исходного материала сахарной свеклы на основе полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей генома..........................................................................................49

4.2. Изучение взаимосвязи генетической структуры пробных гибридов по RAPD-маркерам с продуктивностью..............................................57

4.3. Определение генетической отдаленности исходного селекционного материала сахарной свеклы........................................................61

5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СКРЫТОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИ

ПРОВЕДЕНИИ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ ..................... 65

5.1. Оценка геномного состава межвидовых гибридов В.vulgaris L. х B.corolliflora Zoss. по белковым маркерам......................................65

5.2. Детекция интрогрессии элементов генома Beta corolliflora Zoss. в межвидовых гибридах с использованием видоспецифических маркеров.........................................................................................83

6.3АКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................92

7. ВЫВОДЫ............................................................................95

8 .РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ.................97

9. ЛИТЕРАТУРА......................................................................98

10. ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................119

ВВЕДЕНИЕ

Методы молекулярного маркирования открывают широкие возможности для идентификации селекционных материалов сахарной свеклы, что позволяет решать проблему недостатка морфологических маркеров (Конарев, 2000). С использованием изоферментных маркеров изучен генетический полиморфизм материалов сахарной свеклы, установлено наследование изоферментных локусов, проведено тестирование устойчивости сахарной свеклы к нематоде (Левитес, 1984; Jung, Zoplien, 1986; Smed, Van Geyt, Oleo, 1989; Федуло-ва, 2005). Методом белковых маркеров идентифицированы формы кормовой, столовой и сахарной свеклы (Лесневич 1989; Буренин, Гаврилюк, 1994; Ми-тин, 2004). Методами ДНК-генотипирования (RELP, SSR, RAPD) проведены работы по созданию генетической карты генома сахарной свеклы (Barzen et al.,1995; Shondelmaier, Steinrucken, Jung, 1996), исследованию полиморфизма видов рода Beta (Шаюк, 2003), идентификации гиногенетических линий (Свирщевская, Милько, Кильчевский, 2011).

является анализ связей между молекулярно-генетическими особенностями и

хозяйственно-полезными свойствами, основанными на применении молекулярных и биохимических маркерных признаков.

Представляется перспективным применение ДНК - технологий и других методов молекулярного маркирования, с помощью которых станет возможным решение таких задач современной селекции, как контроль за переносом генетического материала дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях (Велишаева, Шилов, Хавкин, 2006).

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

3) Изучить генетическую структуру межвидовых гибридов F1 Beta vulgaris L. х Beta corolliflora Zoss. с использованием белковых маркеров.

Научная новизна исследований. Впервые установлено, что генетические дистанции по типам белковых спектров 11S глобулинов с максимальной частотой встречаемости (35-76 %) являются основой для определения геноти-пических различий между исходными формами сахарной свеклы и подбора пар при гибридизации. Получены новые данные, свидетельствующие о возрастании уровня истинного гетерозиса по урожайности гибридов сахарной свеклы по мере увеличения генетической удаленности родительских компонентов (D>2,24). Обнаружены оригинальные типы белковых спектров для межвидовых гибридов В. vulgaris х В. corolliflora. Электрофоретические фрагменты с относительной подвижностью Rf = 0,05; 0,07; 0,47; 0,85; 0,90 характерные для дикой свеклы, позволяют выявлять элементы генома В. corolliflora в межвидовых гибридах.

В геноме межвидовых гибридов В. vulgaris х В. corolliflora различной пло-идности установлено присутствие сателлитной последовательности НаеШ (161 п.н.), являющейся видоспецифическим признаком дикого вида В. corolliflora. Праймеры к данному сателлиту позволяют эффективно осуществлять отбор интрогрессивных форм свеклы. Данные исследования расширяют и углубляют теоретические представления о структурно-функциональной организации генома сахарной свеклы и интрогрессивных форм, что открывает большие перспективы для внедрения молекулярно-генетических методов в селекционный процесс.

Практическая ценность работы. Разработанный метод подбора родительских пар на основе установленных генетических расстояний по белковым маркерам может служить принципиальной основой создания новых высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы. Выявленные электрофоретические компоненты белковых спектров дикой свеклы В. corolliflora могут использоваться для тестирования интрогрессивных форм в потомстве от межвидовых скрещиваний.

Метод ИТ IP с использованием видоспецифических праймеров к сателлитной ДНК НаеШ позволяет эффективно и быстро осуществлять отбор форм с интрогрессией В. corolliflora, ускоряя селекционный процесс. Разработанные в процессе исследований методические подходы могут найти широкое применение в селекции сахарной свеклы, а также использоваться в учебных программах по биологии и селекции в высших и средних учебных заведениях и в различных областях биотехнологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование запасных белков семян IIS глобулинов позволяет осуществлять подбор родительских пар для гибридизации сахарной свеклы с учетом их генетической удаленности.

2. RAPD - анализ геномной ДНК с использованием одиночных произвольных праймеров дает возможность идентифицировать и выявлять генетический полиморфизм селекционных материалов сахарной свеклы.

3. Электрофоретические фрагменты запасного белка IIS глобулина и ви-доспецифическая ДНК НаеШ позволяют выявлять скрытую генетическую изменчивость интрогрессивных форм при межвидовой гибридизации В. vulgaris х В. corolliflora.

Организация исследований и вклад автора. Работа выполнена в 2004-2011 годах во Всероссийском научно-исследовательском институте сахарной свеклы им. A.JI. Мазлумова и на кафедре физиологии и биохимии клетки Воронежского государственного университета. Исследования проводились в соответствии с тематическими планами НИР института по заданиям 04.03.02.01: «Изучить проявление молекулярно-генетических признаков геномов В. vulgaris и В. corolliflora у межвидовых гибридов» и 04.03.02.02: «Молекулярно-генетическое изучение родительских форм при создании высокопродуктивных гибридов сахарной свеклы на стерильной основе».

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены: на

межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых

«Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки» (Воронеж,

2005); на II Вавиловской международной конференции «Генетические ресур-

сы культурных растений в XXI веке» (г. Санкт-Петербург, 2007); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (г. Москва, 2008); на IX молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 2009); на IV Международной научной конференции молодых ученых «Новейшие направления аграрной науки в работах молодых ученых» (г. Новосибирск, 2010); на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2010); на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011); на XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 2011), на заседаниях Ученого совета ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им. A. JI. Мазлумова РАСХН» (в настоящее время ГНУ ВНИИ сахарной свеклы им. A. JI. Мазлумова РАСХН) в 2005-2011 гг.

Список использованной литературы включает 189 источников, в том числе 64 иностранных.

1. Обзор литературы 1.1. Использование молекулярных маркерных систем в селекционной практике сельскохозяйственных растений

Важнейшей проблемой современной селекции является ускоренное создание нового исходного материала и гибридов сельскохозяйственных растений с высоким потенциалом продуктивности и устойчивостью к биотическим и

абиотическим стрессам.

Традиционные методы селекции, основанные на использовании морфологических признаков, являются трудоемкими для решения этих задач. Поэтому технологии молекулярного маркирования в настоящее время являются важнейшим направлением науки и призваны улучшить и ускорить селекционный процесс. За последние 30 лет были выявлены и использовались несколько таких маркеров - от электрофоретических вариантов белков, отражающих полиморфизм соответствующих структурных генов, до высокополиморфных последовательностей ДНК, позволяющих исследовать генетическую изменчивость не на уровне продуктов экспрессии гена, а на уровне генома (Созинова и др., 2008; Мухина, Дубина, 2011).

Белковые и ДНК-маркеры широко используются в решении прикладных и теоретических проблем генетических ресурсов растений, селекции, сортоиспытания, семеноводства и семенного контроля (Конарев, 2000). Методы молекулярного маркирования применяют в работе с генетическими ресурсами растений для идентификации и паспортизации генетического разнообразия (образцов коллекции, сортов и т. д.); для выделения генотипов с ценными свойствами; для поиска нового генетического разнообразия (образцов) и привлечения его в мировые коллекции; в анализе генетической структуры коллекций (выяснение степени генетической дифференциации генофондов видов, популяционные исследования); для выявления дублетных образцов в мировых коллекциях; для выяснения степени генетической целостности сохраняемых и периодически пересеваемых образцов коллекции; для охраны

авторских прав при использовании образцов в качестве источников или до-

норов в селекции и т.д. (Конарев, 2001), в осуществлении маркирования селекционно-ценных признаков (Messeguer et al. 1991, Barzen et al., 1997), a также важны при изучении полигенных локусов количественных признаков (QTL) (Van der Knaap et al., 2002).

Полиморфизм белков и ДНК используется для анализа внутривидовых связей, родства видов и геномов. Молекулярные маркеры применимы для контроля за стабильностью генотипов растений, представляющих генетические линии (Конарев, 1998).

Молекулярное маркирование основано на полиморфизме, найденном в белках и нуклеиновых кислотах. Перед тем, как маркер может использоваться для решения каких-либо конкретных задач, корректность его использования должна быть аргументирована с генетических и биохимических позиций (Конарев, 1998).

Белковые маркеры ближе других субстанций стоят к носителям наследственной информации, ДНК-маркеры - сами ими являются. Белковые и ДНК-спектры используются для маркирования генотипов

Информация о работе

Богачева, Наталия Николаевна
кандидата биологических наук
Рамонь, 2012
ВАК 06.01.05

Диссертация

Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы