Популяционно-генетические основы сохранения ресурсов генофондов доместицированных видов животных

Столповский, Юрий Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Популяционно-генетические основы сохранения ресурсов генофондов доместицированных видов животных
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Популяционно-генетические основы сохранения ресурсов генофондов доместицированных видов животных"

0046

На правах рукописи

столповский

ЮРИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

СОХРАНЕНИЯ РЕСУРСОВ ГЕНОФОНДОВ ДОМЕСТИЦИРОВАННЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2010

2 1 ОКТ ?0Ю

004610763

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор

биологических наук, профессор Илья Артемьевич Захаров-Гезехус

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Марлеп Мкртычевич Аслапяи доктор биологических наук, профессор Александр Федорович Смирнов доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Дмитрий Васильевич Карликов

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится » ИО^иРЯ 2010 года в 14 час мин. на заседании диссертационного Совета (Д 002.214.01) при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, 3. факс: (499) 132-89-62, e-mail: aspirantiira@vigg.ru

С дисертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН Автореферат разослан 4 » С&Щр^Я^^Л- 2010 года

Ученый секретарь Диссертационного \

кандидат биологических наук / Т.А. Синелыцикова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблемы контроля и управления породами сельскохозяйственных животных приобретают международное значение, поскольку затрагивают многие страны мира, особенно обладающие большой территорией, различными агроэкологическими и экономическими условиями. Проблему сохранения генетических ресурсов местных пород животных мировое сообщество тесно связывает с необходимостью сохранения культурных традиций, биолоппации сельского хозяйства, с продовольственной безопасностью, устойчивым развитием сельского хозяйства и агроэколаидшафтов в мире и его отдельных регионах, а также качеством жизни в целом.

Мировая тенденция индустриализации сельского хозяйства несет в себе множество рисков. Один из них — это сокращение национальных генетических ресурсов животных и растений (Доктрина продовольственной безопасности РФ, 2010). Включение в отечественное сельское хозяйство транснациональных животноводческих индустрии создает опасность сокращения собственных генетических ресурсов сельскохозяйственных видов, зависимость от импорта, а также угрозу глобализации распространения инфекций и скрытых генетических дефектов. В то же время создание индустриальных цепочек производства продовольствия уменьшает эффективность использования богатства природных ландшафтов, особенно разнообразных на территории России, и тормозит развитие биоорганического сельского хозяйства. Отсюда следует все возрастающая важность сохранения г енофондов отечественных сельскохозяйственных видов животных.

Потеря породного разнообразия оказывается не только утратой уникального и бесценного генетического разнообразия, но и сужением генетического потенциала, принципиально ограничивающим возможности селекционной работы, породообразовательного процесса в настоящем и будущем (Иванов М., 1924, 1970; Серебровскии, 1928; Адамец, 1933; Лобашев, 1954; Maijala, 1970; Глем-боцкий и др., 1972; Simon, 1984; Беляев, 1987; Bodo, 1989; Дмитриев и Эрнст, 1994; Алтухов, 2004; Паронян и Прохоренко, 2008; FAO, 1981-2009; Slow Food, 2000-2009).

Важность сохранения «культурного» биоразнообразия подтверждена в международной конвенции о биологическом разнообразии, принятой на форуме «Повестка дня на XXI век». В конвенции подчеркивается значение сохранения и регионального использования генетических ресурсов для продовольствия и сельского хозяйства, с учетом взаимозависимости стран, обладающих этими ресурсами, для продовольственной безопасности планеты (Конвенция о биологическом разнообразии, 1992, 2002).

«стандарте» породы, отсутствуют данные и принципы выявления генетического, генофондного «стандарта» породы, нет четкого представления о таких понятиях, как «единица, эффективность и потенциал сохранения, генетические: уникальность, мониторинг и паспортизация», об оценке генетического разнообразия на молекулярно-генетическом уровне и т.д.. Отсутствие фундаментальных знаний, концепций, стратегий, тактик и законов о сохранении генетических ресурсов животных в целях обеспечения продовольственной безопасности препятствует согласованным действиям на региональном, федеральном и международном уровнях, формированию надежных и современных механизмов сохранения и управления породным разнообразием и поро-дообразовательпым процессом в Российской Федерации.

Очевидно, что первым этапом в разработке программ по сохранению пород является определение методов и принципов выявления их генетического своеобразия. Исследования генетической структуры локальных пород различных видов сельскохозяйственных животных с помощью популяционно-генетических методов необходимы, прежде всего, для создания генетически обоснованных программ по выявлению генетической изменчивости, ее анализу, в целях дальнейшего сохранения и использования, в том числе для нужд современного агропромышленного комплекса.

Цель и задачи исследования. Основная цель исследования заключалась в разработке концепции и принципов сохранения генофондов ау-тохтонных пород доместицированных видов, единой организационной системы сохранения и генетического мониторинга на основе популяционно-генетических и статистических методов.

Конкретные задачи данного исследования сводились к следующему:

• Оценить качественные и количественные характеристики породного разнообразия России. Провести анализ динамики численности пород основных сельскохозяйственных видов и породного разнообразия на примере крупного рогатого скота (КРС);

• Определить породообразовательные центры в Российской Федерации;

• Разработать новую организационную схему для сохранения генетических ресуров доместицированных видов на территории РФ;

• Разработать пршщипытенетическогомониторингаиоценокмежпородного и видового генетического разнообразия, а также чистопородное™ пород, сохраняемых в генофоидных хозяйствах;

• Провести сравнительный анализ генетической структуры аутохтонных пород доместицированных видов с использованием морфологических признаков, структурных генов, полилокусных ДНК-маркеров;

• Разработать генетические характеристики видов и пород, в том числе генофондный стандарт породы на основе ISSR-фингерпринтинга;

• Разработать принципы создания генетически обоснованных программ по сохранению (управлению) генетическими ресурсами домашних животных, а также стратегии по их сохранению in situ.

Научная новизна полученных результатов. Сопоставление происхождения 198 пород 33-х доместицированных видов впервые позволило локализовать на территории России пять основных центров наиболее интенсивного породообразования. Впервые на основании выявленных породообразователь-ных центров сформулирована концепция и организационная схема сохранения генофондов доместицированных видов in situ. Предложена система генетического мониторинга, основанная на ионушщиоио-генетическом анализе морфологических признаков, полиморфизма структурных генов и иолилокусных маркеров ДНК. Впервые выполнены комплексные популяцнонно-генетические исследования генофондов целого ряда видов и пород, которые позволили оценить генетическое разнообразие и выявить видо- и породоспенифические характеристики. Сочетания фенов, аллелей структурных генов, иолилокусных спектров последовательностей ДНК позволяют надежно дифференцировать породы, выделять породоспецифнческие признаки, породоспецифнческие аллели структурных генов, отслеживать изменения генетического разнообразия во времени и пространстве. Впервые разработана общая шкала длин фрагментов ДНК, фланкированных дииукяеотвдными микросателлитами (GA)9C и (ЛС)9С, для 6 видов парнокопытных, которая позволяет надежно генотипировать животных одновременно по 38 продуктам ПЦР, выполнять внутри- и межпородные, межвидовые сравнения, проводить мониторинг генофондов, определять параметры генетического разнообразия, контролировать чистопородность животных. Впервые выполнении сравнительные исследования спектров иолилокусных фрагментов ДНК, фланкированных участками микросателлитпых ло-кусов (ISSR-PCR), ряда пород крупного рогатого скота, яка, овец, коз, свиней, верблюдов, которые позволили выявить консервативные ПЦР-продукты, вариабельные, а также породоспецифнческие спектры фрагментов. На основании полученных данных впервые сформулированы понятия «генофондного профиля» вида (породы), «видо- и породоспецифического паттерна», «генофондного стандарта породы». Использование мультилокусного межмикросателлитного анализа (ISSR-PCR) совместно с методом к-кластеризации популяционных структур стало основой для создания ряда тестов молекулярно-генетической экспертизы и исследования иопуляционной структуры доместицированных видов животных. Впервые с помощью ISSR-маркеров показаны возможности анализа иопуляционной структуры доместицированных видов, сходства и различия генофондов пород (внутрипородных групп), их идентификации и наглядной оценки консолидированное™, чистопородности и генеалогических связей. На основании полученных данных вычислен «нротогепофонд» крупного рогатого скота, установлены наиболее приближенные к «прапопушщии» породы и филогенетические связи между исследуемыми группами животных, что позволяет устанавливать приоритеты в сохранении породного разнообразия. Анализ параметров генетического разнообразия позволил обосновать предположение о том, что в популяциях крупного рогатого скота существует некий «оптимум» средней гетерозиготности пли благоприятные показатели по определенным гене-

тическим параметрам. Их колебания могут сигнализировать о различных процессах, происходящих в популяции, или стать генетическим инструментом контроля над генофондом породы.

Научно- практическое значение полученных результатов. Разработана новая организационная схема сохранения генофондов отечественных пород, основанная на международном и отечественном опыте и географическом расположении породообразовательных центров в Российской Федерации. Предложена концепция генетического мониторинга — комплексный метод анализа и контроля генетической структуры пород доместицированных видов, основанный на оценке параметров генетического разнообразия.

Предложен метод оценки консолидации и чистопородности популяций домашних животных, основанный на полиморфизме ISSR-маркеров, который может быть использован в генофондных и племенных хозяйствах РФ. На примере популяций крупного рогатого скота и овец показан алгоритм действий для анализа меж- и внутри- популяционной генетической изменчивости на геномном уровне, который позволяет определить:

• прапопуляцию породы, что важно при сохранении изначальной генетической структуры породы;

• принадлежность популяции (индивидуальной особи) к той или иной породе, виду;

• наиболее типичных для породы популяции (особей), с точки зрения, современной сформировавшейся генетической структуры;

• чистопородные и синтетические стада (популяции). Предложенный алгоритм исследования позволяет в зависимости от поставленных задач выбирать селекционную тактику при разведении и сохранении пород in situ, в том числе и контролировать процесс восстановления породы, после интродукции в нее производителей других пород.

На основании разработанных подходов выполнен анализ генетических структур стад 40 хозяйств базовых доместицированных видов, претендующих на получение генофондного статуса, позволивший выделить среди них наиболее консолидированные и наиболее гетерогенные.

На примере пород крупного рогатого скота предложен метод оценки пород, как генетического объекта сохранения, и метод определения вклада конкретной породы в общее разнообразие по ISSR-маркерам, что может стать одним из критериев при выборе пород для сохранения in и ex situ.

Полученные материалы могут быть использованы при разработке национальной доктрины развития российского животноводства, в частности его «генофондного» направления.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

Разработка концепции сохранения и управления генофондами доместицированных видов животных требует качественно новых, геномных

методов их мониторинга. В связи с этим к основным положениям диссертационной работы, выносимым на защиту, относятся следующие:

1. Использование межмикросателлитного анализа совместно с методом к-кластеризации популяционных структур является основой тестов молекулярно-генетической экспертизы и исследования генофонда домести-цированных видов животных. Предложена универсальная шкала, которая позволяет надежно генотипировать 38 ГЩР-продуктов, полученных методом ISSR-PCR.

2. Выявление и одновременная оценка не менее 20-30 независимых локусов в одном геноме с помощью ISSR-маркеров позволяют выявлять генофонд-иые особенности на уровне популяций, пород, помесных групп животных и видов, что может быть использовано как компонент комплексного генетического мониторинга динамики генофонодов и сохранения разнообразия доместицированных видов.

3. В полученном методом ISSR-PCR спектре ГГЦР-продуктов выделяются сочетания фрагментов ДНК, ассоциированные с генеалогическими связями между исследованными группами животных, а также эволюционно консервативные у разных видов.

4. С помощью ISSR-фингерпринганга получены оценки, которые позволяют количественно характеризовать ценность каждой породы, пре,сложен критерий для выбора пород, подлежащих сохранению, на основе молекулярно-генетических данных.

Апробация работы. Результаты исследований были представленны и докладывались на III-й школе-семинаре по генетике и селекции животных (Новосибирск-Горно-Алтайск, 1989), Российско-украинском совещании по генетике сельскохозяйственных животных (Аскашш-Нова, 1992), на I, II международных конференциях «Молекулярно-геиетические маркеры животных» (Киев, 1994, 1996); 46-ом конгрессе ЕААР (Прага, 1994); международной конференции «Проблемы сохранения редких пород домашних животных и близкородственных диких видов» (Пущино, 1996); международной конференции «ДНК-технологии» (Киев, 1997), первой научной школе-конференции «Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва-Минск, 2001), международном конгрессе по сохранению биологического разнообразия (Неаполь, 2003), I и II международных научно-практических конференциях «Биоразнообразие и сохранение генофонда флоры, фауны и народонаселения Центрально-Азиатского региона» (Кызыл, 2003, 2007), международном форуме Terra Madre I, И, III (Турин, 2004, 2006, 2008), конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005), Всероссийском учредительном съезде-конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006), научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития звероводства» ВВЦ «Золотая Осень» (Москва,

2007), международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова—фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), заседании конвивиума «Суздаль-Пива» международной организации «Слоу-Фуд» (Суздаль, 2007), Семинаре ФГОУ ВПО МГВМиБ им. Скрябина и ВННИЖ «Новый порядок аттестации племенных хозяйств, правила определения видов организаций по племенному животноводству. Проблемы, возникающие при работе с импортным скотом, и пути их решения» (Дубровицы, 2008), 59 и 60-ой международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе» (Кострома, 2008, 2009), международной конференции «Продуктивность, ветеринария, агроэкономи-ка и продовольственная безопасность» (Черногория, 2008), V всероссийском съезде г енетиков и селекционеров (Москва, 2009), семинаре животноводов в республике Алтай (Кош-Агач, 2009). Материалы исследования были использованы в учебном процессе — курсе лекций «Генетика сельскохозяйственных животных» для студентов сельскохозяйственного факультета Российского Университета Дружбы Народов, в рабочей программе «Генофонд сельскохозяйственных животных и его использование в селекции» ГОУВПО «Новгородский государственный университет им. Ярослава Мудрого», в учебном процессе Тывинского государственного университета (кафедра зоотехнии).

Декларации личного участия автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные и аналитические материалы, полученные лично автором и совместно с сотрудниками лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН им. Н.И. Вавилова. Автору принадлежит решающая роль в разработке плана экспериментов, их осуществлении, анализе и обобщении полученных результатов, а также организации экспедиций по сбору образцов биологических тканей у представителей различных пород доместицированных видов. Суммарно личное участие автора составляет около 80 %.

Благодарности. Значительная часть работы по изучению структуры«, генов, морфологических признаков была выполнена на базе Института Цитологии и Генетики СО РАН. Автор выражает искреннюю благодарность за помощь в сборе и обсуждении материала данной работы, получении первых навыков в исследовании полиморфизма структурных генов, митохондриальной ДНК доктору биологических наук С.М. Закияну (ИЦиГ СО РАН), С.Б. Кузнецову (University of Rhode Island, USA), M.P. Мулакандову, H. Холодшюву, M. Бочка-реву и О.Б. Прушинской (ИЦиГ СО РАН). Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН: профессору Г.Е. Сулимовой, И.Г. Моисеевой, C.B. Уханову, С.Н. Каштанову, Н.В. Кол, М.П. Рузиной, В.Н. Воронцовой за помощь в исследовании полиморфизма ISSR-маркеров и в разработке концепции сохранения генофондов доместицированных видов. Автор признателен В.И. и Т.Т. Глазко (ТСХА) за совместное исследование генофондов животных Украины и России. Автор благодарит A.C. Баранова (ИБР РАН) за помощь в изучении фенов КРС и всесторон-

нюю поддержку. Большую роль в организации экспедиций в саяно-алтайском регионе оказали Ч.М. Доржу (Тывинский Университет) и Цэндсурэн Цэдев (Институт Биологии МАИ). Автор выражает искреннюю признательность за совместную работу и за помощь в сборе биологического материала ветеринарным врачам: С. Елекову, А.П. Тодошеву, а также И.Е. Кадцину (республика Алтай) и Т.Д. Халматовой (ДИАМ, Москва), A.A. Шаршову (ИЦиГ СО РАН). Автор признателен А.Н. Евсюкову (ИОГен РАН), Д.В. Щепоткину (ИБР РАН) за помощь в статистической обработке данных, их обсуждении и оформлении. Автор благодарит за техническую и моральную поддержку Г.В. Косттопину и Г.Х. Абидулину (ИОГен РАН). Неоценимую роль в сборе информации и обсуждении проблемы сохранения генетических ресурсов животных в мире оказали сотрудники международной организации Slow Food International (Italy) Лилия и Виктория Смелковы и Л.В. Щербак (МСХ РФ).

Автор выражает большую признательность и благодарность своему научному консультанту и учителю профессору Илье Артемьевичу Захарову-Гезехусу.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ — 6 монографий, 61 статья в научных и научно-популярных журналах, сборниках трудов, научных вестниках, международных бюллетенях и 19 сообщений в материалах и тезисах отечественных и международных конференций.

Структура и работы. Диссертационная работа изложена на 339 страницах печатного текста и включает 42 таблицы и 74 рисунка. Диссертация состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы», четырех глав, излагающих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 333 источников, в том числе 170 публикаций на русском языке, и 9 приложений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный материал получен при проведении экспедиционных исследований в период с 1986 по 2009 годы, а также на базе НИЦ Института общей генетики РАН при проведении молекулярно-генетического тестирования животных на предмет установления или подтверждения генофонднош и племенного статусов хозяйств. Всею различными генетю-сеяекционными методами исследовано 35 пород среди 6 доместицировапных видов: 21 порода КРС; 4 — овец; 3 - свиней; 3 - коз; 2 - верблюдов; алтайский, тувинский, монгольский яки. Итого 3422 животных го 70 популяций России, Украины, Монголии, Венгрии, Германии, Ирландии. Образцы ряда пород КРС любезно предоставлены сотрудниками сельскохозяйственного университетского колледжа г. Дублина (Ирландия) и научно-исследовательского центра животноводства Академии сельскохозяйственных наук (Дюссельдорф-Росток, Германия).

Электрофорез проводили в вертикальных пластинах полиакриламидно-го геля в буферных системах Лэммли (Laemmli, 1970) и Гаю (Gähne, 1977)

с некоторыми нашими модификациями. Для типирования трансферринов нами использовались эталонные сыворотки, любезно предоставленные Blood group Laboratory, Central Association A.I. (Финляндия) и Blood Typing Laboratory, Livestock Improvement Association of A.I. (Япония). Электрофоретические варианты ряда ферментов выявляли с использованием электрофореза в крахмальном геле по методике (Smithies, 1955) с последующим гистохимическим окрашиванием.

В качестве маркеров полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов (ISSR-PCR маркеры), использовали стандартный метод, разработанный Зиеткевичем и соав. (Zi-etkiewicz et al, 1994). Молекулярные массы продуктов амплификации оценивали с применением маркера молекулярных масс 0,1-kb (тысяч нар оснований) DNA Ladder (Gibco BRL).

Для оценки морфологических фенов у крупного рогатого скота использовали метод визуальной оценки и фотографирования морфологических фенов по методике, разработанной автором. Расчет коэфициентов фенетического разнообразия выполняли по Животовскому (Животовский, 1980).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью стандартных компьютерных программ «BIOSYS-I» «STATISTICA 8.0» (StatSoft. STA-TISTICA for Windows (computer program manual) / 1996. StatSoft, Inc., Tulsa, OK), «POPGENE 1.32» (Yeh EC., Yang R.-C. Boyle T. POPGENE VERSION 1.31 Microsoft Window-based Freeware for Population Genetic Analysis Quick User Guide/ 1999.). STRUCTURE 2.2, 2.3.3 (Pritchard et al, 2000, Negrini et al, 2007; Mosher et al., 2009). Генетическое расстояние между внутрииородными группами определяли по Нею (Nei, 1972).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Состояние генетических ресурсов доместицироавнных

животных Российской Федерации

Для подтверждения актуальности разработок методов генофондного контроля и сохранения отечественных сельскохозяйственных видов выполнены анализ и обощение информации, представленной в изданиях Министерства сельского хозяйства Российской Федерации в течение последних 20 лет, и дополненные материалами регулярных экспедиций, проводимых Институтом общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН в течение 1990 - 2009 гг, в различных эколого-географических регионах России. Получены следующие данные.

IIa территории Российской Федерации разводится более 400 пород, относящихся к 46 видам сельскохозяйственных животных — млекопитающих, птиц, рыб и насекомых. Среди одомашненных представителей зоологических классов лидируют млекопитающие (21 вид), затем следуют рыбы (14), птицы (9) и насекомые (2). Наибольшее число пород в виде на территории России за-

регистрировано у собак (56 пород), кур (52), лошадей (40), овец (38), крупного рогатого скота (33), гусей (24), свиней (21), американских норок (15), карпов (12). Доля исконно российских пород, то есть выведенных в России, среди общего количества разводимых в РФ (2007 г.) колеблется от 27 % (куры) и до 70 % (овцы, лошади) и 85-91 % (козы и карпы) (рис. 1).

С 1990 года по 2009 годы в России численность сельскохозяйственных животных уменьшалась. Так, поголовье КРС сократилось на 36 млн 21 тыс. или на 63,2 %, лошадей на 1 млн 269 тыс. или 49,5 %, свиней на 22 млн 151 тыс. или на 57,9 %, овец и коз на 36 млн 651 тыс. или на 63 %, птицы на 322 млн или на 49 %.

Снижение численности привело к сокращению породного разнообразия, исчезли как малочисленные ранее завезенные импортные, так и отечественные породы, а также повысилась вероятность генетической эрозии за счет снижения генетического разнообразия.

100 90 8070 60 5040 -30201 10

лошади

овцы

1__

козы крупный гуси рогатый скот

куры

карпы

форель радужная

Одомашненные виды

□ российские (местные)

□ иностранные (международные)

Рис. 1. Соотношение российских (местных) и иностранных (международных) пород, зарегистрированных в Госреестре РФ (%), 2007 г.

3.1.1. Сравнительный анализ породного состава эколого-географических регионов России для выявления отечественных центров породообразования

На основании полученных данных предпринята попытка определения основных центров породного богатства (или условные центры породообразования) в России. В этих целях выполнен анализ происхождения 198 пород российской селекции 33-х сельскохозяйственных видов, представленных в Государственном реестре селекционных достижений, допущенных к использованию ФГУ «Государственная комиссия Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений» МСХ Российской Федерации. Это позволило впервые оценить географические закономерности распределения отечественных пород по 66 регионам Российской Федерации (см. рис. 2).

В результате анализа количества сформированных пород на территории Российской Федерации выделяется 5 основных центров с наибольшим количеством выведенных пород:

• Северно-европейский (Ленинградская область)

• Центрально-европейский (Московская, Воронежская, Кировская области)

• Южно-европейский (Краснодарский, Ставропольский края, Ростовская область)

28. Марий Эл

29. Краснодарский фай

30. Ростовская

31. Волгоградская

32. Саратовская

33. Карачаево-Черкессия

34. Кабардино-Балкария

35. Северная Осетия - Алания

36. Ставропольский край

37. Калмыкия

38. Астраханская

39. Ингушетия

40. Дагестан

41. Ульяновская

42. Татарстан

43. Удмуртия

44. Пермский край

45. Самарская

46. Оренбургская

47. Башкортостан

48. Свердловская

49. Курганская

50. Тюменская

51. Ханты-Мансийский АО

52. Ямало-Ненецкий АО

53. Омская

54. Томская

55. Новосибирская

56. Кемеровская

57. Красноярский край

58. Алтай

59. Хакасия

60. Тыва

61. Бурятия

62. Читинская

63.Якутия

64. Чукотский АО

65. Магаданская

66. Камчатская

Рис. 2. Центры породообразования в России на основании данных по 33-м доме-стицированным видам животных

Количество выведенных пород в областях РФ

1. Калининградская

2. Псковская

3. Ленинградская

4. Карелия

5. Мурманская

6. Архангельская

7. Республика Коми

8. Смоленская

9. Тверская

10. Ярославская

11. Вологодская

12. Костромская

13. Кировская

14. Орловская

15. Тульская

16. Московская

17. Владимирская

18. Нижегородская

19. Курская

20. Белгородская

21. Липецкая

22. Рязанская

23. Воронежская

24. Тамбовская

25. Пензенская

26. Мордовия

27. Чувашия

Ат1с Осеап

• Кавказский (Дагестан, кавказские республики РФ)

• Западно-Сибирский (Алтай и Тыва).

Уникальность российского генофонда местных пород обусловлена еще и тем, что среди 33-х видов одомашненных животных 198 пород представлено породами российской селекции (около 2,5 % мирового породного разнообразия).

Выявленные условные центры породообразования являются исторически сложившимися «точками роста и сохранения» как породного разнообразия, так и скрытой генетической изменчивости. Для сохранения их генофондов необходимы новые организационные принципы их контроля и управления.

3.2. Новая организационная система и принципы сохранения

генетических ресурсов животноводства России.

Современное животноводство России делится на два основных направления: «племенное» и «генофондное». Это два по своей сути взаимодополняющих направления животноводческой отрасли, без которых невозможно достичь устойчивого развития животноводства. На данном этапе племенное направление в животноводстве доминирует и поддерживается государством, научным сообществом (РАСХН), как на законодательном, так и финансовом, интеллектуальном уровнях. На 1.12.2008 г. в МСХ РФ было зарегистрировано 2335 племенных заводов и репродукторов. Генофондное направление представлено 79 хозяйствами по 10 одомашненным видам, что составляет 3 % от всех животноводческих организаций, включая племенной завод, племенной репродуктор и генофондное хозяйство (данные 2009 года).

Способ государственной поддержки генофондов доместицированных видов на данный момент в России один — это дотация на содержание условной головы. Мировой и российских опыт показывают, что для сохранения и управления генофондами локальных пород государственных дотаций явно недостаточно, если нет системы сохранения.

С учетом полученных данных по породообразовательным центрам России необходимо формирование генофондных центров, которые должны стать основой федеральной системы сохранения и управления генофондными хозяйствами в регионах РФ. Для сохранения генофондов в сфере животноводства РФ необходимо, помимо оптимизации законодательно-правовой базы и финансирования, создать соответствующие организационные структуры как инструмент для выполнения главной цели — устойчивого развития «гено-фондного» направления животноводства.

Главной опорой в этом должна стать межведомственная структура, с условным названием «Российская Генофондная Корпорация» («РГК») — федеральная структура, созданная при участии четырех ведомств РФ — Министерства сельского хозяйства РФ, Министерства природных ресурсов РФ, Российской Академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) и Российской Академии наук (РАН) (см. схему, рис. 3).

Рис. 3. Организационная схема сохранения доместицированных видов животных

Предлагаемая организационная схема сохранения генофонда пород основана на современных принципах сохранения пород ех и in situ, где основными единицами сохранения должны стать породы, разводимые в генофондных хозяйствах или агропарках под эгидой «Генофондных центров», образующих «Российскую генофондную корпорацию» (РГК). Ее основная задача — объединить все оставшиеся на сегодняшний день генофондные хозяйства, группы животных, незарегистрированные породы в единую государственную систему управления и консервации породного разнообразия. Под управляемой консервацией подразумевается комплекс действий, направленных на управление генетическими ресурсами сельскохозяйственных животных по их учету, наилучшему использованию и развитию этих ресурсов в целях удовлетворения текущих и краткосрочных потребностей в продовольствии и сельскохозяйственной продукции, а также по обеспечению сохранности имеющегося разнообразия в целях удовлетворения возможных долгосрочных потребностей. В состав «Российской геиофондной корпорации» должны входить или иод ее управлением формироваться структуры, выполняющие следующие задачи.

1. Сертификационный центр (СЦ) с международной сертификацией по выявлению генов, связанных с заболеваниями, продуктивностью, чистопо-родностью, жизнеспособностью пород и качеством продуктов питания. СЦ должен тестировать и курировать работу лицензированных государством межведомственных лабораторий.

2. Информационный банк данных (зоотехническая, ветеринарная и генетическая информация)

3. Единая государственная система контроля за происхождением, основанная на инвентаризации каждого генофондного животного (макробиочи-пирование).

4. Федеральный банк спермы и эмбрионов.

5. Пять региональных генофондных центров, обслуживающих сохранение и управление породами, разводимыми в генофондных хозяйствах.

С помощью предлагаемых нами новой организационной системы и принципов сохранения генофондов сельскохозяйственных видов можно превратить невостребованный сегодня потенциал отечественных малочисленных пород в единую сеть г енофондных хозяйств по производству животноводческой продукции, ориентированную не только на внутренний, но и на внешний рынок. Это может способствовать совершенствованию экономических основ сохранения местных пород и увеличению их прибыльности.

3.3. Сравнительный анализ методов генетического мониторинга

породного генофонда

Сохранение генофондов пород и оптимизация их использования непосредственно зависят от степени разработанности методов контроля их популяционно-генетического своеобразия. Несмотря на наличие большого разнообразия подходов к генотипированию животных по разным маркерам полиморфизма, до настоящего времени отсутствуют методы, позволяющие надежно выявлять ге-нофондные изменения и контролировать генофондный «стандарт» породы. В целях сравнительной оценки разных методов генетического мониторинга для описания специфических особенностей породных генофондов и их пространственной и временной динамики, в качестве модельного объекта в наших исследованиях была использована одна из древнейших пород КРС в мире — серая степная (украинская) (Bos iminis primigenius). В период с 1986 года по 2009 года нами были исследованы как качественные, так и количественные признаки этих животных, а именно: признаки продуктивности, экстерьера, формирования масти, особенности поведения, показатели естественной резистентности, морфологические фены, эритроцитарные антигены, белки и изоферменты крови, рестрикционный полиморфизм митохондриалыюй ДНК, ISSR-маркеры (Стол-повский, 1990-2010). В наших исследованиях с помощью зоотехнических и генетических методов выявлены уникальные признаки и аллелыюе разнообразие серой степной породы. В результате выполненных исследований предложена система генетического мониторинга для пород основных доместнцированных видов, элементы которой рассматриваются ниже.

3.3.1. Популяционно-фенетический анализ генофондного

разнообразия серой степной (украинской) породы.

Фонетический подход обоснован и разработан II.B. Тимофеевым-Ресовским и A.B. Яблоковым (1973, 1988). Контроль фенов может способствовать поддержанию уникальности генофонда породы на основании анализа распределения генетически детерминированных дискретных (альтернативных) признаков фенотипа (фенов). Нами выявлены и оценены различия в составе и структуре фенофонда трех популяций серого степного скота, разводимых на Украине —• в хозяйствах «Аскании-Нова» и «Поливаиовке», в России — в алтайском экспериментальном хозяйстве «Черга». Выделено 13 феногрупп или 66 дискретных признаков. Наибольшие различия обнаружены по масти, окраске головы, наличию «очков» вокруг глаз, масти челки, распределению светлых и темных участков в окраске туловища. Половой диморфизм и распределения частот встречаемости 12 фенов среди трех генофондных стад представлены на векторных диаграммах (рис. 4).

Для породы в целом характерно 8 типов масти, основными из которых являются серая — 69 % и светло-серая — 13 %. В алтайском стаде отсутствуют красио-серые, мышастые, белые животные, в Асканийском помимо указанных есть особи с черной мастью. Окраска головы представлена 10 типами. Наибольшую группу составляют животные, имеющие полностью серую окраску головы (33 %) (рис.5).

Наибольшее количество животных, имеющих фен — черные «очки» вокруг- глаз (ем. рис. 5) встречается в поливановском стаде —13,1 % (в целом по породе 10,7 %). По феногрупне «распределение светлых и темных участков окраски» покровов) в маточном поголовье явное преобладание животных с признаками равномерного окрашивания — 71,1 %. Более темную переднюю треть туловища имеют 23,8 % животных, максимальная концентрация данного фена отмечена в алтайском стаде — 32,6 %.

Сравнение фенофондов трех стад серой степной (украинской) породы по двум показателям внутрипопуляциошгого разнообразия (габл.1) показало, что, как по среднему, так и по доле редких фенов представленные группы животных различаются незначительно. Несколько выше доля редких фенов в алтайской группе, а средняя степень разнообразия — в поливановском стаде.

Таблица 1. Коэффициент фенетического разнообразия (и) и доля редких фенов (h)

трех популяций серой степной породы

Популяция п М h

"Поливановка" 320 2,41±0,035 0Д7±0,028

"Аскания-Нова" 117 1,95±0,033 0,15±0,015

"Черга" 95 2,03±0,047 0,20±0,014

Поливановка Аскания-Нова Черга

Рис. 4. Рапределение частот встречаемости 12 фенов у быков и коров (внизу) и в 3-х популяциях (маточное поголовье) (вверху) серой степной породы. 1 — серая масть 2 — наличие светлых «очков» вокруг глаз; 3 — наличие черных «очков» вокруг глаз; 4 — черные «очки» над глазом; 5 — отсутствие черных «очков»; б — черная кайма на ушах; 7 — горбоносости нет; 7" — серая масть челки между рогами; 8 — светлоокрашенное кольцо вокруг носогубного зеркала; 9 — вульва пигментирована; 9" — горбоносости нет; 10 — подпалины есть; 11 — «барсучий» тип окраски; 12 — передняя треть туловища темная

Наблюдая внутри породы достаточную гетерогенность по морфологическим признакам, мы пришли к выводу; что современная популяция серого степного скота представляет собой смешанные остатки нескольких древних отродий степного скота. Наличие в генотипе серой степной породы генов исходной формы дикого тура (В. ргипщетиз) проявляется в таких фенотшшческих особенностях, как светлый ремень по хребту, кольцо вокруг носогубного зеркала, темные подпалины по туловищу. В то же время ряд морфологических признаков (затрагивающих окраску всего животного) в комплексе могут считаться породоспецифичными для серого степного скота (не исключено, что и для всех пород серого корня). Этим животным свойственно проявление основных черт окраски, называемой акромеланизмом: при общей светлой окраске все выступающие части конечностей, хвоста, ушей, носа — темные. Для исследуемой породы — это черная окраска каймы на ушах, кисточки хвоста, верхней трети рогов, полоски на семенниках, копыт и носогубного зеркала. Перечисленные особенности характерны для большинства современных представителей серой степной породы.

Рис.5. Окраска головы — светло-серый волос по фронтальной части, темно-

серый низ (Д ); маска вокруг глаз—наличие черных «очков» (Сз); черная кайма на ушах есть ф); завитка шерсти на лбу нет (Р)

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследованный серый степной скот обладает уникальным набором дискретных морфологических признаков, по которым можно осуществлять контроль за генетической структурой популяции при ее сохранении. Исследованные стада различаются как по представленности, так и по частотам встречаемости разных фенов. Таким образом, фены могут служить объектом отбора и подбора в генетико-селекционных программах и использоваться при генетическом мониторинге локальных пород. Феиешческий метод может стать весьма перспекгавным при решении задач сохранения и поддержания генетического разнообразия, а также при создании новых форм домашних животных.

3.3.2. Популяционно-генетический анализ внутрипородного разнообразия серого степного скота с использованием оценок полиморфизма электрофоретических вариантов белков плазмы крови

Выполнен анализ продуктов 29 локусов, полиморфизм выявлен но 12 генетико-биохимическим системам, кодирующим белки и ферменты: ТР, РТР!, РТР2, РТРЗ, АРВ, АМ1, РА, СР, РОМ I, С АК ОС, N1'

Исследования электрофоретических вариантов белков подтверждают уникальность животных серой степной породы. Так, нами выявлено 5 аллелей и 15 фенотипов транеферрина, что является нетипичным для других по-

род КРС. Нехарактерный для европейских пород аллель TF F является обычным для серой породы, обнаружен он также и у серого венгерского скота. Аллель TF F, вероятно, можно считать специфичным маркером всей группы серого степного скота.

Мы проанализировали отклонения наблюдаемых частот гетеро- и гомозигот от теоретически ожидаемых по наиболее многоаллельному локусу TF. Если в Асканийском стаде серого скота достоверно сохраняется равновесие, то в «Черте» и «Поливановке» имело место преобладание наиболее распространенных и редких гетерозигот и недостаток гомозигот, причем в Чергинской группе такое отклонение от теоретически ожидаемого достоверно. Полученные данные свидетельствуют о том, что локус TF в Чергинской группе животных находится под давлением отбора, направленного в сторону гетерозигот. Вероятно, в данном случае мы наблюдаем картину сбалансированного полиморфизма, поддерживаемого за счет адаптивного преимущества гетерозигот.

По частотам встречаемости аллелей PTF1 и PTF2 выявлены достоверно значимые (Р<0,005 и Р<0,001) различия между стадами серой степной (украинской) породы в «Аскашш-Нова», «Поливановке» и «Черге».

Кроме пяти известных полиморфных систем плазмы крови КРС (ALB, РА, TF, PTF1 и PTF2), нами у серой стенной породы был обнаружен новый полиморфный белок, ранее в литературе не описанный. С помощью семейного анализа установлено, что все три фенотипа посттрансферрина 3 контролируются двумя кодоминантными аллелями PTF3 F и PTF3 S. Фенотипичеекое проявление гетерозиготы FS в виде пяти полос, две из которых совпадают по подвижности с основными аллелями F и S, а три имеют промежуточную активность, указывает на вероятную тетрамерную четвертичную структуру белка.

•« - *• J» t

«IJi .je • '# •

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 6. Фосфоглюкомутаза I (PGM-I). Фенотипы: 1 - BX; 2 - AB; 3 - АА; 4 - АА; 6-AB; 7-ВВ; 8-АА

Фермент фоефоглюкомутаза представлен двумя кодоминантными аллелями с разной электрофоретической подвижностью: PGM IА и PGM I В. Помимо двух описанных в литературе вариантов PGM I у КРС, нами у серого скота обнаружен новый аллель, условно обозначенный как «X». Из шести возможных фенотипов выявлено пять: АА, AB, Ii В, АХ, ВХ (рис.6.).

При сопоставлении генетических структур исследуемых групп скота наибольшее значение генетического расстояния (рассчитанного по биохимическим маркерам по методу М. Нея, 1972) обнаружено между животными из «Аскании-Нова» и «Поливановки» (DN = 0,030), тогда как между последними и животными из «Черти» расстояние оказалось существенно ниже (D = 0,003). Эти данные представляют интерес, поскольку в создании Чергииской группы на Алтае участвовали животные именно из «Поливановки» (Украина). Наблюдаемые значения генетических расстояний можно объяснить более высокой степенью родства у вывезенных животных, чем у суммарно исходного асканийского генофонда.

Генетическая структура по 12 генетико-биохимическим системам исследуемых групп серого степного скота отображена на рис. 7.

При изучении генетической структуры серой степной породы было отмечено как сходство ее различных отродий, так и ряд специфических особенностей по полиморфным системам. Установлено, что на структуру породы существенно влияет временной фактор, наблюдается пространственная подразде-ленность генетической и фенетической структур. Полученные данные позволяют предполагать наличие механизмов, поддерживающих внутрипородное разнообразие серого степного скота. Pix исследования могут способствовать разработке и оптимизации методов сохранения генетического разнообразия в генофондах исчезающих видов и пород.

Acntmn-Hon Пошшинок» Черт*

Рис. 7. Генетическая структура серого степного скота, разводимого в Аскании-

Нова, По л ивановке, Черге: 1 — ALB А; 2 — GC А; 3 — TF А; 4 — TF D1; 5 _ тр D2; 6 — TF F; 7 — PTF-1 F; 8 — PTF-2 F; 9 — PTF-3 F; 10 — NP II; 11 — CP A; 12—AM В

3.3.3. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого степного скота

В последние годы в популяционной генетике широкое использование получили новые методы прямого исследования полиморфизма различных участков ДНК, такие, как оценки полиморфизма фрагментов рестрикции (RFLP), микросателлитных локусов (SSR), фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами случайных декануклеотидов (RAPD), или последовательностей микросателлитов (ISSR). Преимущества последних двух методов обусловлены тем, что они позволяют получать многолокусные и высокополиморфные спектры фрагментов генома, однако к их недостаткам следует отнести доминантный характер наследования регистрируемых фрагментов.

Для того, чтобы оценить внутривидовой размах изменчивости по полиморфизму участков ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов у серого степного скота, нами выполнены исследования иолилокусных спектров, полученных с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием в качестве праймеров фрагментов ди- и тринуклеотидных микросателлитных последовательностей, отличающихся коро-выми мотивами (ISSR-PCR маркеры).

При использовании четырех тринуклеотидных праймеров в ISSR-PCR спектрах наблюдали от 8-ми до 32-ти ПЦР-продуктов (ампликоиов). Наибольшее количество амиликонов (фрагментов ДНК) располагалось в пределах длин 2600 - 520 п.н. Отмечается неодинаковая представленность ПЦР-продуктов этих групп у исследованных животных, в зависимости от пукиео-тидной последовательности, участка микросателлитного локуса, взятого в качестве праймера в ISSR-PCR. Так, при использовании в качестве праймера последовательностей (ACC)6G и (AGC)6G отмечается тенденция к относительно повышенной встречаемости ампликоиов малой длины, последовательности (GAG)6C — наблюдается отчетливое преобладание в спектрах легких по массе ПЦР-продуктов, а при использовании в качестве праймера фрагмента микросателлитного локуса (СТС) С обнаруживается относительно увеличенное количество амиликонов из области длин в 3250-1550 п.н. (табл. 2.).

Использование в качестве праймера последовательности (ACC)6G позволило суммарно получить наибольшее количество ПЦР-продуктов и наибольшую долю полиморфных локусов среди них (таб.3). Праймер (GAG) С суммарно у животных позволил выявить 17 локусов в спектрах продуктов амплификации, среди которых полиморфными оказалось только 47 %. При использовании праймера (AGC)6G получен спектр ампликоиов, среди которых оказалось наименьшее количество полиморфных локусов (25 %). При использовании в качестве праймера последовательности (СТС)6С суммарно обнаружено 16 фрагментов ДНК, однако по большинству из них (94 %) наблюдался выраженный полиморфизм среди исследованной группы животных.

Таблица 2. Вклад (в %) ампликонов разной длины в спектры йвП-РС!* у серой

степной породы крупного рогатого скота при использовании в качестве праймеров фрагментов тринуклеотидных микросателлитных локусов

Длины ампликонов Частота ампликонов, %

Праймер (АСС)^

3250-1550 25

1550-1000 31

1000-320 44

Праймер (САй^С

3250-1550 24

1550-1000 35

1000-320 41

Праймер (АСС)„С

3250-1550 38

1550-1000 19

1000-320 44

Праймер (СТС)„С

3250-1550 50

1550-1000 19

1000-320 31

Таблица 3. Наличие полиморфных локусов в спектре ампликонов (ЮБИ-РСР

метод), полученных при использовании тринуклеотидных праймеров у серой степной породы крупного рогатого скота

Праймер Число исследованных голов Количество ампликонов в спектре Доля (в %) полиморфных ампликонов в спектре Р1С

{АСС)6С 28 32 97 (31 ампликон) 0,280

(йАС)6С 16 17 47 (8 ампликонов) 0,233

{АСС)6С 6 16 25 (4 ампликона) 0,162

(СТС)6С 21 16 94 (15 ампликонов) 0,300

Примечание: Р1С — полиморфное информационное содержание локуса

Полученные данные свидетельствуют о том, что каждый используемый праймер в КЯЛ-РСК методе приводил к формированию высоко специфичных спектров продуктов амплификации именно для данного праймера, как по количеству ампликонов, так и по доле полиморфных локусов. Их полиморфизм не был прямо связан с количеством выявляемых локусов и был наибольшим в спектрах ампликонов, выявленных с помощью праймеров (АСС)60 и (СТС)6С, но сравнению со спект рами, полученными при использовании праймеров (ОАО)6С и(АСС)60.

Обращают на себя внимание выраженные отличия спектров, полученных при использовании в качестве праймеров последовательностей (GAG)6C и (СТС)6С, принадлежащих к так называемым нурин/пиримидииовым трак-гам, способным формировать тринлексные структуры, предположительно, принимающие участие в регуляции генной экспрессии (Kalish et al., 2005). При примерно одинаковом количестве ампликонов в спектрах (17 для (GAG)6C и 16 для (СТС)6С), они существенно отличались по доле полиморфных ло-кусов, а также по представленности в спектрах ампликонов разной длины (табл. 2.). По-видимому, это может свидетельствовать об относительно повышенной консервативности у исследованных животных коротких фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором (GAG)6C, по сравнению с фрагментами, фланкированными повтором (СТС)6С. Во всяком случае, полученные данные свидетельствуют о существенных отличиях в распределении данных повторов по геномам исследованных животных серой степной породы.

Следует отметить, что анализ полилокусных спектров ампликонов ÏSSR-PCR, позволяет наблюдать в ряде случаев их выраженные отличия у разных полов. Так, в исследованной группе животных серой степной породы присутствовали четыре быка. Полученные у этих животных спектры ПЦР-продуктов с праймером (ACC^G существенно отличались от выявленных у коров по присутствию шести локусов, по которым наблюдались отличия и между быками — фрагменты длиной 2950, 1500, 1050, 690 п.н. выявлены только у одного из них.

Использование в качестве праймеров в PCR фрагментов четырех трину-клеошдных и двух динуклеотидных микросателлитных локусов позволил получить воспроизводимые и надежно выявляемые спектры продуктов амплификации. Среди выявленных 102 локусов в геномах животных серой степной породы 58 (57 %) оказались полиморфными. Усредненные по спектру каждого праймера значения полиморфного информационного содержания (Р1С) по локусам спектра варьировали в пределах от 0 до 0,300. Полностью консервативными оказались спектры ампликонов праймера (GA)9C, наиболее изменчивыми — праймера (ACC)fG. Более того, именно в спектре праймера (ACC)fG обнаруживаются отличия между коровами и быками серой степной породы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие или отсутствие полиморфизма участков генома, фланкированных инвертированными повторами, определяется нукяеотидным мотивом фланга. Выраженные отличия между спектрами по количеству ампликонов, предпочтительности их длины, а также в их полиморфизме у исследованных животных, свидетельствуют об их принадлежности к структурно-функциональным участкам генома, отличающимся по своей консервативности. Это требует предварительной оценки эффективности использования в качестве праймера разных микросателлитов, что может позволить отобрать те из них, которые позволяют получать наиболее информативные полилокусные спектры для. суммарной характеристики

генофонда породы. По-видимому, разработка такой характеристики, позволяющей судить о наличии «оптимума» (Livshits et al., 1985; Leary, 1989 et al., 1987) гетерозиготности в генофонде вида, породы, популяции требует для каждого конкретного случая поиска геномных участков, полиморфизм которых наиболее объективно будет отражать динамические генофондные процессы.

Следует подчеркнуть, что сравнительный анализ маркирования внутри-породного разнообразия свидетельствует о том, что все типы такого маркирования дают сходные оценки внутрипородного разнообразия, однако маркеры полиморфизма ДНК имеют очевидное преимущество, поскольку позволяют в одной ПЦР одновременно оценивать полиморфизм нескольких локусов, то есть, осуществлять полилокусное генотшшрование животных.

3.4. Эффективность использования для оценок внутрипородного

полиморфизма электрофоретических вариантов белков и ДНК

маркеров (ISSR-PCR маркеров) у овец романовской породы.

Помимо серого стенного скота еще на одной породе было выполнено сравнение методов выявления внутрипородного полиморфизма. В целях исследования эффективности использования для генофонднош анализа различных типов молекулярно-генетических маркеров в настоящем разделе выполнена оценка генофондов разных групп животных романовской породы с применением различных молекулярно-генетических маркеров (электрофоретические варианты белков, фрагменты ДНК, фланкированные инвертированными повторами дииуклеотидиых микросателлитиых локусов).

Полиморфизм электрофоретических вариантов белков регистрировался по таким транспортным белкам как трансферрин (TF), гемоглобин (НВ); ферментам метаболизма экзогенных субстратов лейцинаминопептидазе (LAP), эстеразе (EST), регуляторному локусу лактатдегидрогеназы (LDR) и ферменту, участвующему в антиоксидантной системе, диафоразе (DP).

В результате выполненных исследований у романовской породы овец выявлено 5 аллельных вариантов но локусу трансферрина, среди которых преобладали аллельные варианты TF С и TF D (TF А—0.038; TF В — 0.077; TF С — 0.593; TF D — 0.287; TF Е — 0.005). По локусу гемоглобина с преобладающей частотой встречался аллельный вариант IIBА (ИВА — 0.703, НВВ — 0.297). У исследованной группы овец примерно с равной частотой встречались аллельные варианты Н и L по регуляторному локусу лактатдегидрогеназы, детерминирующие высокую и низкую активность субъединицы А данного фермента (LDR Н — 0.467; LDR L — 0.533). По локусу лейцинаминопептидазы с более высокой частотой встречался медленно мигрирующий аллельный вариант (LAP А — 0.298; LAP В — 0.702); по локусу диафоразы — наоборот, быстрый алелльный вариант (DP F — 0.800; DP S — 0.200). По локусу эстеразы обнаруживалась более высокая частота встречаемости аллельного варианта A (EST А — 0.670; EST В — 0.330), и это был единственный локус из 6-ти рассмо-

тренных, по которому обнаруживалось статистически достоверное (Р<0.05) отклонение от равновесного состояния в сторону дефицита гетерозигот. По вышеуказанным полиморфным локусам средний уровень гетсрозиготности у исследованных овец романовской породы был 0.439 (S.E. 0.025), что соответствует данным, полученным по другим аутохтонньш породам овец.

Генетическая структура популяции романовской овцы была исследована также с использованием оценок полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами фрагментов динуклеотид|iых микроса-теллитных локусов (TC)9G и (CT)9G.

Среди продуктов амплификации, полученных при использовании в ПЦР в качестве праймера последовательности (AG)9C, наиболее надежно выявлялись 13 фрагментов ДНК, каждый из которых в дальнейшем рассматривался как отдельный локус. В спектре продуктов амплификации, полученных при использовании в качестве праймера последовательности (GA)9C, выполнялось гентотипирование животных по 8 фрагментам ДНК (локусам), длина которых варьировала от 600 до 200 п.н.

Уровень средней гетсрозиготности (PIC) по 8 ампликонам, полученным с помощью праймера (GA),C, практически не отличался у овец из разных хозяйств (0,355-0,359). В спектрах продуктов амплификации, полученных с последовательностью праймера (AG)9C, с высокой частотой присутствовали фрагменты ДНК длиной около 1000 п.н. Расчет PIC по спектру продуктов амплификации, полученных с использованием в качестве праймера последовательности (AG)9C, показал, что уровень ожидаемой средней гетрозигот-ности фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором данной последовательности, несколько ниже, чем при использовании в качестве праймера (GA)9C. Так, расчетная гетерознготноеть по спектрам, полученным с последовательностью (AG)9C у романовских овце находилась в пределах от 0,264 до 0,3,74.

Полученные нами данные свидетельстует о том, что уровень внутри- и межгрупповой генетической гетерогенности у исследованных групп достаточно высок, как по доле полиморфных локусов, так и величинам средней гетсрозиготности (наблюдаемой по электрофоретическим вариантам транспортных белков и ферментов; ожидаемой по полиморфизму фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов). Относительно высокий уровень генетической гетерогенности позволяет предполагать наличие возможностей для успешной селекции среди сохранившихся романовских овец. Можно ожидать, что генотипированне животных с использованием молекулярно-генетических маркеров будет способствовать контролю, коррекции и, таким образом, ускорению селекционной работа в целом.

Таким образом, выполненные нами исследования позволяют прийти к заключению о том, что по таким понуляцнонно-генетическим параметрам, как оценки уровня генетической гетерогенности, генетические взаимоотношения между различными внутрипородными группами животных и разными поро-

дами эффективность использования разных типов молекулярно-генетических маркеров качественно не отличается друг от друга. В то же время, применение 188К-РСЯ маркеров расширяет количество одновременно генотипируемых ло-кусов в одном геноме, что способствует увеличению точности генофондных исследований.

3.5. Генетический мониторинг внутрипородной и межпородной изменчивости по изв^РСЯ маркерам

На сером степном скоте и романовкой породе овец показана возможность применения КБИ-РСК маркеров для анализа их генофондов. В целях изучения возможностей применения 18811-фш1герпринтинга для внутри- и межпородных исследований генофондов, рассмотрены результаты оценок с использованием внутрипородной генетической дифференциации между 18-тью группами тувинской короткожирнохвостой овцы, а также 19-тью породами КРС.

3.5.1. Разработка универсальной шкалы для мониторинга генофондов и видов сельскохозяйствнных животных с использованием ЮБИ-РСЯ маркеров

Для более точной оценки длин выявленных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами (ГС)9С и (СТ)9С, на основании сравнительного анализа спектров продуктов амплификации у КРС и овец, разработана универсальная шкала, где применена градация фрагментов ДНК по молекулярным массам. В зависимости от зоны («тяжелые», «средние», «легкие» фрагменты) использовался определенный шаг от 10 до 200 пар нуклеотидов (п.н). В результате выделено 38 зон с фиксированным интервалом, которые позволяют достаточно точно определять молекулярную массу для 38 ПЦР-продукгов разной длины (Табл.4).

Таблица 4. Универсальная шкала для мониторинга генофондов пород и видов домести цированных животных с использованием 15БР-РСВ маркеров (п.н.)

А/61 2500- -2300 А/С 13 1050- -1000 А/в 26 460- -440

А/С 2 2100- •2000 А/в 14 990- -940 А/С 27 430- -410

А/вЗ 1900- -1800 А/С 15 930- -880 А/С 28 400- -380

А/в 4 1750- -1700 А/С 16 870- -820 Д/(3 29 370- -360

А/в 5 1650- -1600 А/С 17 810- -760 А/б 30 350- -340

А/С 6 1550- -1500 А/018 750- -720 А/в 31 330- -320

А/С 7 1450- -1400 А/С 19 710- -680 А/О 32 310- -300

А/С 8 1350- -1300 А/С 20 670- -640 А/в 33 290- -280

А/С 9 1290- -1240 А/в 21 630- -600 А/С 34 270- -260

А/С 10 1230- -1180 А/С 22 590- -560 А/С 35 250- -240

к/С 11 1170- -1120 А/С 23 550- -530 А/С 36 230- -220

А/С 12 1110- -1060 А/С 24 520- -500 А/С 37 210- -200

А/С 25 490- -470 А/С 38 180- -160

Разработка такой единой универсальной шкалы для оценки длин продуктов амплификации ДНК позволила выявить закономерности в распределении фрагментов и в дальнейшем выполнять сравнительные исследования внутри-и межпородных отличий, а также видовых генофондных особенностей.

3.5.2. Анализ генетической структуры популяций тувинской

короткожирнохвостой овцы с использованием метода ЮвН-РСИ

Создание универсальной шкалы распределения длин продуктов амплификации позволило оценить возможности использования КвЯ-маркеров для контроля и мониторинга дифференциации генетической структуры породы по отдельным хозяйствам на примере тувинской жирнохвостой овцы, выявления породоспецифичных сочетаний генотипов по разным локусам, для оценок генеалогических связей между отдельными популяциями.

С помощью нраймера (АС)9С у тувинских овец выявлен 21 фрагмент, из них 67,7 % оказались полиморфными. Обнаружено шесть наиболее типичных амгшико-нов ДНК, которые, как правило, встречаются в геноме впугрипородпых групп тувинских овец единым блоком, их частота встречаемости варьировала от 0,658 до 1,000. К ним относятся фрагменты с молекулярной массой 750-720 п.н. (частота встречаемости — 0,932), двойной фрагмент: 630-600 п.н. (0,993) и 590-560 п.н.(0,956), фрагменты 490-470 п.н. (0,976) и 430-410 п.н. (0,933) можно отнести к категории «породоспецифичных» (рис. 8). С большой частотой практически во всех популяциях встречается амшшкои с молекулярной массой ог 1180 до 1230 п.н. (от 0,574 до 1,000). Сравнительный анализ БЭЛ-РСЛ спектров амплификации показал значительные внутрипородные различия у изучаемых групп тувинской овцы. Частоты встречаемости «средних» по длинам фрагментов от 300 до 1200 п.н. маркируют генетические структуры конкретных популяций и вносят наибольший вклад в генетическое внутрипородное разнообразие исследованных животных.

Для упрощения анализа разнообразия генотипов по 18811-РСЯ маркерам, сложный характер которого выявлен на примере 18-ти популяций тувинской овцы, мы предлагаем ввести три понятия: «генофопдный профиль», «породо-специфический паттерн» и «генофопдный стандарт».

Под генофондиым профилем подразумевается совокупность всех выявленных фрагментов и частот их встречаемости у породы. На рисунке 8 показан генофондный профиль тувинских овец, который можно условно разделить на две части: часто встречающиеся фрагменты (частота более 0,4) и редко встречающиеся (частота менее 0,4). Для определения породоспецифи-ческого паттерна породы нами предлагается использовать только наиболее часто встречающиеся фрагмент ы (частота более 0,4).

Генофондный стандарт породы включает в себя совокупность выявленных фрагментов ДНК, во внутрипородных группах, которые по данным анализа наиболее приближены либо к спектру продуктов амплификации наиболее древней группы (протогенофонду), или усредненному генофонду породы в целом.

1,0

0,8

0,2

Длина фрагмента

Рис. 8. Частота встречаемости фрагментов различной длины межмикросателлит-ной ДНК праймера (АО)9С у тувинских овец, рассчитанная как средняя частота по всем виутрипородным группам. Вертикальными линиями отмечены доверительные интервалы (Р=95 %)

Информация о нопуляционных частотах фрагментов амплификации тувинских овец была использована для анализа параметров генеалогических связей и расчета индекса сходства (генетических расстояний) между популяциями (Иен, 1972). Но данным кластерного анализа в современной популяции тувинской короткожирнохвоетой овцы наиболее типичные, то есть сходные с усредненным генофондом тувинской овцы, животные сосредоточены в хозяйствах: ГУП «Бай-Тал» (индекс генетического сходства с тувинской овцой составил 0,997), ГУП «Моген-Бурен» (0,995).

Таким образом, «генофондный стандарт» тувинской короткожирнохвоетой породы овец по праймеру (АО)9С соответствует ампликонам, независимо от их частоты, в двух вышеуказанных хозяйствах (ГУП «Бай-Тал» и ГУП «Моген-Бурен»), где по данным кластерного анализа сосредоточены наиболее типичные тувинские овцы. «Генофондный стандарт» тувинской короткожирнохвоетой породы овец состоит из 17 фрагментов ДНК: А2, АЗ, А4-7, А8-11, А14-20.

При попарном сравнении наименьшее генетическое расстояние выявлено между популяциями ГУП «Торгалыг» и МУП «Чаалаты» (DN = 0,003), наибольшее отмечено между животными СПК «Дуза» и КФХ«Ондар» (0,130). Наименьшее генетическое расстояние с усредненным генофондом тувинской овцы имеют овцы «Бай-Тал» (ГЖ = 0,003), «Моген-Бурен», (ГЖ = 0,005), наибольшее расстояние «Деспен» (БЫ = 0,035), «Даг-Ужу» (ТЖ = 0,037).

Полученные данные по индексам генетического сходства и генетическим расстояниям в популяциях овец представляют интерес не только для частной генетики вида (породы), но имеют важное селекционное значение, так как позволяют из всего массива, в рассматриваемом случае тувинских овец, выделить отары, где разводят типичных для породы животных, определить их родственные связи, выделить изолированные и синтетические группы животных, оценить генофондную ситуацию по породе в целом и предложить селекционную стратегию на будущее.

При более детальном рассмотрении генетических взаимоотношений выделяются генетически близкие друг к другу отары тувинской овцы из хозяйств: СПК «Амырлан» и КФХ «Оидар»; СПК «Бай-Хол» и ООО МТС «Кызыльская»; ГУП «Малчын» и ГУП «Моген-Бурен». Генетически обособленные группы создают несколько мини кластеров, что позволяет констатировать, что в популяциях овец республики Тыва сформировалось несколько генетически консолидированных групп, связанных между собой благодаря регулярному обмену овцематками и баранами-производителями, а также обособленные изолированные группы животных (рис. 9)

Рис.9. Генетические дистанции между 18 популяциями тувинской овцы, полученные с помощью программы 5(гис1шс 2.3.3. на основании данных 15811-РСИ анализа

Важную оценку эффективности использования КвЯ-РСЯ маркеров дает анализ их использования при изучении межпородной дифференциации внутри

вида, поскольку именно породный уровень является наиболее оптимальной единицей при решении проблем сохранения внутривидового разнообразия генетических ресурсов сельскохозяйственных видов (FAO, 2007). В этой связи в следующем подразделе рассматривается результативность подилокуеиого ге-нотипирования по ISSR-PCR маркерам разных пород КРС.

3.5,3. Оценка генофондной дифференциации пород крупного рогатого скота с использованием ISSR-PCR маркеров.

Выполнен сравнительный анализ полилокусных спектров ISSR — PCR маркеров с использованием двух праймеров (AG) С и (GA)9C у 19-ти пород и одного отечественного селекционного типа КРС. Суммарно по двум типам ISSR-маркеров выявлено 66 фрагментов ДНК разной длины. С помощью прай-мера (AG)9C обнаружено 37 ПДР-продуктов, (GA)9C — 29 ампликонов в диапазоне длин от 2500 до 160 п.н. (рис. 10).

В основном породы отличались между собой но частоте встречаемости фрагментов ДНК разной длины или группировались по принципу: «есть фрагмент или его нет».

1 — Бестужевская;

2 — Бурая швицкая (кавказский тип);

3 — Голштинофризская;

4 — Калмыцкая;

5 — Костромская;

6 — Черно-пестрая;

7 — Серый степной скот;

8 —Ярославская;

9 — Якутская;

Рис. 10. ГЗиЯР-фингерпринт 9 пород КРС (праймер (АО)9С)

На рисунке 11 представлены генофондные профили (все выявленные ГЩР-продукты в породе — черный и серый цвета) и породоспецифические или типичные для породы паттерны (частота встречаемости фрагмента более 0,4 -черный цвет) для 19 пород КРС, полученные с помощью Аб-КвЯ маркеров.

На основании этих данных можно выделить генофондные стандарты для каждой породы. Хорошо видно, что количество фрагментов, по которым одна порода отличается от другой не так велико. Для породосиецифического паттерна оно варьирует от 0 до 5 фрагментов. Например, соответственно: «монбельярд-ская и нормандская», «серая степная и скот Гоби» отличаются по фрагментам, обозначенным по универсальной шкале как А6; А9; А17; А27; А37. Отличия по генофондным профилям более выражены и находятся в пределах от 2 до 15 фрагментов. Такие различия обнаруживаются между «голштнно-фризской и фризской» (А27 и А31); «н-дама и норвежская красная» (А2; Л9—11; А14; А18-19; А21-23; А26-27; АЗО; А38.). При сопоставлении спектров генофондов исследованных пород выделяются породоспецифичные сочетания фрагментов ДИК, которые могут рассматриваться как породный ДНК «штрихкод».

Для более детального рассмотрения генетических взаимоотношений между породами мы применили методы многомерного шкалирования и главных компонент, которые позволяют с одной стороны определить генетические взаимоотношения между породами, с другой — наглядно увидеть расположение исследуемых групп животных в пространстве (рис. 12.).

Анализ полученных данных показал, что изменчивость по спектрам АО-ШвЯ-маркеров позволяет отличать популяции, принадлежащие к разным видам (Во.ч Шт.ч и Во.ч тсНсгич). На рисунке 12 по этим спектрам породы формируют три группы (облака). Первая является основной, в ней сконцентрировалось большинство пород — по расположению на плоскости это «среднее облако». Вторая группа — «верхнее облако», куда вошли следующие породы: две популяции монгольского скота, серый степной, калмыцкий, красная эстонская, костромская порода и популяция кавказского типа бурой швицкой породы (СПК «Дружба»). И третья группа, или «нижнее облако», которое образовали четыре породы: сахивал, тапаркер, хариана и якутский скот. Месторасположение популяции кавказского типа бурого швицкого скота (ГУП «Дылымское») свидетельствует о том, что этот генофонд значительно отличается от всех исследованных в данной работе пород и, по всей видимости, в большей степени представлен уникальным генофондом местного скота Дагестана.

Фрагменты Голштино- Кос70омшя Крашя _ Норвежская Бестужевская фрКзсная калмыцкая эстеисн« ^РС Гоби Монбвльярд Н-длиа «р*сн»я Нормандская Сгхивал Серая Черно-пестрая Ярославская олшвя степная Тлрпаркяр фризская Хариана Хоторого Якутская длвкк:

А1 2500-2300 „ ММ НВ "л * *

АЗ 1900-1800 —

А5 1650-1600 тшт ттшт

А7 А8 1450-1400 1350-1300 »вши ' ~ шшш

А9 АЮ 1290-1240 1230-1180 шяшшт тштт .я г

АН 1170-1120 шмафшшшг.- тштш» штя ш - шив

А12 1110-1060 ттшт ) ' л*

1050-1000

А14 990-940 М »

А16 870-820 ..............................д......■——............................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................................................................

А1В А19 А2 0 750-720 710680 670-640 тшят "тяти ................. -ак^авэв жз—гш шкзш» • тшт ее ш анм* т яшшшш-тштт штшт шшшт» ^ -лгал

А21 А22 А23 630-600 590-560 550-530 штат ше » т я. шшшшшшш ттшт •ЙШ ' р-шткя1 «■■» ШвШ!»

А24 520-500

А25 490-470 аашшманиамвмнвмнншнишнаншишшанп швиам яшшив шнмнш мшншв ашшннв яимвнив марн мшнащр нпнпм

А26 460-440 «мша» шк ш шттш тттж шттт

А27 А28 430-410 ттмшмтжш шшншшл шяшшттжтт ттшт шшшш шшшт

А АЗО 370-360 350-340 штшт и......ищи аш» ----------------------------------------------------'==£

А31 330-320 хгт-ЕШ- ®тгтж тшаы» штштшж£> тмтж ттшт

А32 310-300 я ¡Маш а я ню шшшш

290-280

А34 270-260 ттшт штат

АЗЬ 250-240

А36 230-220

А37 210-200 щщмт тшт» тттшт шшштт шяшшт шттт штат» шттт шттш

А38 180-160 тт,, штшт тшт»

ШИММИ частота встречаемости равна или более 0,4 ШШШШШ частота встречаемости менее 0,4

вместе: черные и серые бзнды формируют "генетический профиль" породы, черные — ее "породоспецифический паттерн'

Рис. 11. Генофондный профиль и. породоспецифический паттерн,\ подученные с помощью нраймера (Ав)9С у 19 пород крупного рогатого скота

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4

см | 0,2

I 0,0

§ -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2 -1,4

■1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Измерение 1

Рис. 12. Результаты многомерного шкалирования на плоскости, выполненные на основе данных, полученных с праймером (АО)9С. Список популяций (пород): ¡.Фризская; 2. Калмыцкая; 3. Черно-пестрая; 4. Ндама; 5. Бестужевская; 6. Бурая швицкая (Дружба); 7. Бурая швицкая (Дылымское); 8. Голштино-фризская; 9. Костромская; 10. Красная эстонская; 11. Монбелиард; 12. Монгольская Гоби; 13. Монгольская Хогорого; 14. Норвежская красная; 15. Нормандская; 16. Сахивал; 17. Тарпаркер; 18. Хариана; 19. Якутская; 20. Ярославская; 21. Серый степной скот

Для получения общей картины взаимоотношений между породами, был объединен весь набор КЗЛ-маркеров (АО и ОА) и получена проекция на плоскости главных компонент (рис. 13).

Анализ расположения пород в большинстве случаев подтвердил результаты, полученные с помощью метода многомерного шкалирования. Три породы — тарпаркер, серый степной скот, калмыцкая и кавказский тип бурого швицкого скота занимают крайние положения на плоскости, тем самым их генофонды отличаются от генофондов большинства исследованных популяций КРС, представленных преимущественно европейскими породами. В связи с этим можно предположить: вышеуказанные популяции произошли не от европейского предка, а от азиатского прародителя или имеют полифилетнческое происхождение.

I I

-—---—---—........\—■—————,——-—'

1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1.5 2,0 Компонента 1:22,5%

Рис. 13. Породы KPC в пространстве пивных компонент по общему набору маркеров, полученных с помощью праймеров (AG)9C и (GA),C. Список пород тот же (см. рис. 12)

Информацию о популяционных частотах фрашетов ДНК изученных пород мы использовали в целях определения возможностей этого метода для выяснения филогении пород. Согласно принципу популяционных систем, сформулированному в работах Ю.П. Алтухова и Ю.Г. Рычкова, генетическое разнообразие современных популяций соответствует некоторой предковой «пра-популяции», генофонд которой можно условно назвать «протогенофондом». Для реконструкции «протогенофонда» предложено использовать усреднение частот генов по всем изученным популяциям. В соответствии с этим принципом, нами был построен «nporoi енофопд» крупного рогатого скота, куда включены породы Bos (aunts и Bos inciicus.

На рисунке 14 показаны полигоны изученных пород КРС, полученные на основании полиморфизма, выявленного по AG-ISSR маркерам. Из всех исследуемых популяций наибольшее сходство с «протогенофондом» имеют породы: фризская (0,015), черно-пестрая (0,015) и монгольская порода хогорош (0,016). Полученный результат, по-видимому, закономерен, так как соответствует известным фактам по филогенезу пород.

Для оценки генетического разнообразия среди пород мы использовали традиционные показатели генетического разнообразия по Кимура (1964), Ле-вонтину (1972), Нею (1973) (Yeh et а]., 1999; Nei, 1973, 1987; 2000).

2 -0,5

о *

-1,0 -1,5

-2,0

В целом по генетическому разнообразию у всех пород по спектрам ампли-конов, полученных с (ЛО)9С и (ОЛ)9С праймсрами, обнаруживаются сходные результаты. По индексам Нея (11) и Шеннона (I), для 66 ПНР-продукгов КРС по двум праймерам (ЛО)9С (37 ПЦР-продуктов) и (ОА). С (29 ПЦР-продуктов) получены следующие данные с учетом полиморфизма, соответственно, Ь = 0,169 и 0,113; I = 0,274 и 0,191. Разнообразие по Нею для (АО)9С праймера находится в пределах (0,164-0,039) и для (ОА)9С праймера — (0,107-0,003), по Шеннону соответственно (0,222-0,052) п (0,161-0.007). Среди 19 пород низкими показателями разнообразия по спектрам (АО),С праймера выделяется серый степной скот. Известно, что серый стенной (украинский) скот в России длительное время находится в изоляции и имеет но классификации ФАО по численности критический статус, иными словами находится на грани исчезновения. Полученные нами данные по 188К-марксрам подтверждают данный факт.

Исходя из полученных нами данных, по-видимому, для пород КРС «оптимальными» показателями значения среднего на локус генного разнообразия следует считать: для АСТ-18ЙЯ маркерам — 0,10-0,15 (по Нею) и ОА-188К маркерам 0,04-0,05 (по Шеннону). Можно ожидать, что отклонения от указанного выше «оптимума» в меньшую сторону свидетельствуют о процессах, связанных с инбридингом или генофондной эрозией, отклонения в большую сторону, скорее всего, говорят о синтетическом происхождении популяции или направленном отборе в сторону сохранения генетического разнообразия в силу естественных или искусственных причин.

Полученные оценки полиморфизма полнлокусных геномных участков могут служите объективными характеристиками изменчивости, консолидирован-ностн и уникальности генофондов домашних животных, в частности, пород КРС, стать основой для идентификации породы и отгределе-ния ее «генофоид-ного стандарта». Представленные молекулярно-генетические характеристики могут способствовать разработке критериев для определения следующих основополагающих селекционных параметров: породной принадлежности, отличимости, консолидированности и устойчивости породы, что крайне важно при регистрации новых пород, чистопородном разведении или сохранении породы как резерва определенных наследственных качеств.

____ _ _

Фризская Калмыцкая Черно-пестрая НДама Бестужевская \ \

\ \ \ \

Серый степной \ \

скот \ \ \

\ \ ^

0.015 0.032 0.015 0.048 0.041 \VVjPs

\ 0.051 \

\ ^ \

а .......- \ \ \ \

Ярославская 0 \ \ \

0.070

Якутская

/ !

\ 4 ''

I / Бурая швицкая / / / (Дружба)

/ / /

. / / 0.052 /<: / / /

/ / / /к ^ / / /тес' Бурая швицкая

' ' ' ; ЬЬ (Дылымское)

^Ур^. 0.087--------"Протогенофонд" %

0.039 ......

Хариана

Голштино-

'У-л V 0.038

/,0У/ / </ /

Тарпаркер / / /

/ / /

<\ 0.036 0.020 0.016 0.076 0.024

^ / /

Сахивал / /

\ \ 0.035 фризская \\\

\ 0.066 \ \ \ Костромская

\ \ \ \

\ Красная эстонская

Ч^, -;.....---

Нормандская Норвежская Монгольская Монгольская Монбелиард красная Хогорого Гоби

Рис. 14. Полигоны, построенные на основании полиморфизма, выявленного по праймеру (АС),С у 19 пород и одного селекционного типа КРС

3.5.4 Оценка ценности породы, ее вклада в общее генетическое разнообразие на примере данных 1Б8Я-фингерпринтинга КРС

На основании анализа генофонднмх профилей, породных стандартов и породоспецифических паттернов, нами предложен способ оптимизации планирования программ сохранения конкретных пород. Если исходить из

постулата, что сохранение породы достигается путем сохранения как можно большего внутрипородного разнообразия, то необходимо рассчитать общее разнообразие имеющегося набора пород, а также вклад каждой породы в это общее разнообразие. Полученные оценки могут стать критериями при выборе пород для программ сохранения.

Для того, чтобы оценить вклад каждой породы в общую изменчивость крупного рогатого скота, мы воспользовались правилом сложения дисперсий, согласно которому общая дисперсия признака <7^ равна сумме межгрупповой дисперсии 82 и средней внутршруиповой дисперсии О"', т.е. сГр = с? 2 + ¿>2. Величины дисперсий в этой формуле можно оценить по формулам

Оо2 = - = ъ2 = - «О2.

где X — среднее значение, N— общий объем выборки, п — количество групп, - численности групп.

В нашем случае признак х — это диаллельный генетический локус, состояние которого обозначено нулем или единицей, частоты аллелей равны q и 1-3, а общая дисперсия для двух аллелей равна ожидаемому уровню гетерози-готности признака 2<7(1 — <7). Таким образом, формулы дисперсии как меры генетического разнообразия имеют следующий вид:

<7д = 2 <7(1 — ¡7) — общее разнообразие

_2 1 т-,

о~ — —£ (1 — Ц-) — среднее внутригрупповое разнообразие

О = — £(<7, ~~Ч)г —межгрупповое разнообразие.

Та часть общего разнообразия Сд, которая приходите^ на какую-то конкретную породу или группу, составляет (1 — ¡7{) + "0?; — ~Ч)2> причем первое слагаемое — это участие породы во внутрипородном, а второе — в межпородном разнообразии вида. Поделив первое слагаемое, второе слагаемое и их сумму на общее разнообразие (Тр, получим долю разнообразия, которое приходится на конкретную породу в общем разнообразии вида, а также внутрипородную и межпородную составляющие этой доли.

На диаграмме показаны доли в общем разнообразии конкретных пород. Из исследованных групп КРС по А(}-18$ К-маркерам наибольший вклад в общее разнообраие КРС вносят животные норвежской красной, нормандской и бурой швицкой (кавказский тип) (Рис.15).

Стоит отметить, что доля внутрипородного разнообразия дня всех пород составила бб %, а межпородного 34 %.

Полученные оценки позволяют количественно характеризовать ценность каждой породы и по-новому взглянуть на проблему сохранения важнейших генетических ресурсов животных.

Рис. 15. Вклад отдельных пород в общее генетическое разнообразие КРС на основании данных AG-ISSR-маркеров

3.6. Оценка дифференциации генофондов видов сельскохозяйственных животных с использованием метода ISSR-PCR

Одна из центральных проблем в работе с сельскохозяйственными видами связана с разработкой простых и надежных тест-систем для генотипирова-ния отдельных животных, на основании которых можно не только исключать ошибки в их происхождении, но и оценивать видовую и породную принадлежность животных, контролировать процессы изменений генетических структур под влиянием факторов естественного и искусственного отборов. Видовая идентификация может быть необходима при ветеринарной и судебной экспертизе продуктов животноводства. К таким тест-системам, по нашему мнению, относятся ISSR (Inter-Simple Sequence Repeal), основанный на полилокусном геногапировании с использованием оценок длин фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами нуклеотидных последовательностей.

Для того чтобы оценить эффективность такого подхода, в настоящем разделе выполнен сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК, фланкированных микросателлитными локусами, шести видов сельскохозяйственных животных.

В исследования были включены образцы крови животных КРС (род Bos, виды: Вт tawvs u Bos indicus, в нашем случае эти группы объединены в оди-ну), яки (род Bos, вид Bos mutus), овцы (род Ovis, подвид домашней овцы Ovis ammon aries), козы (род Cap ra, вид Capra aeqagus), свиньи (Sus scrofa feriis), верблюды (<Camelas, семейство Camelidae отряд мозоленогих Tylopoda).

В работе рассмотрены спектры продуктов амплификации, полученные с помощью метода ISSR-PCR, в качестве праймеров использовали (AG)9C и (GA)9C к мнкроеателлитпым локусам (ТС)п и (CT)il. Анализ полученных спектров продуктов амплификации позволил выявить межвидовые различия у 6 доместицированных видов.

Обнаружены как общие, так и вндоспецифические фрагменты. Наиболее широкий спектр ПЦР-продуктов у изученных представителей шести видов выявили по (AG)9C праймеру у КРС (37 фрагментов), овец (33 фрагмента) и коз (26 фрагментов).

Видослецифичность ПЦР-продуктов выражается как в отсутствии фрагмента ДНК, так и по его частоте встречаемости, в том числе и «эксклюзивной» встречаемости. Так, видоспецифичные фрагменты, в частности, те, которые не выявлены у животных других видов, обнаружены только у КРС по праймеру (AG)9C — фрагменты с молекулярной массой 2500-2300 и 1900-1800 п.н. Отсутствие «тяжелых и легких» фрагментов, соответственно по (AG)9C и (GA)9C праймерам в популяциях свиней может рассматриваться, как специфическая характеристика вида (Sus scrofa férus). Для упрощения анализа полученных данных по ISSR-маркерам мы разделили фрагменты по их частоте встречаемости на две категории. Первая — фрагменты ДНК, частота встречаемости которых составила 1,000. Вторая — частота встречаемости составляет > 0,4, что соответствует введенному нами понятию «видовой» паттерн.

На рисунке 16 представлены фрагменты ДНК, которые выявлены у всех особей в том или ином доместинированном виде (100 % встречаемость). Фрагменты ДНК с частотой встречаемости 1,000, в свою очередь образуют вндоспецифические спешры ПЦР-продуктов для 6 доместицированных видов. Наличие видосиецифических фрагментов ДНК существенно варьировало среди 6 исследованных видов от 12 фрагментов в популяциях верблюдов до трех у овец. Большая часть видоспецифических фрагментов получена с помощью праймера (AG)9C — 23 фрагмента ДНК, праймер (GA)9C синтезировал 14 ви-доспецифичных ПЦР-продукта.

Сравнительный анализ полиморфизма спектров продуктов амплификации, полученных с (AG)9C и (GA)9C праймерами, позволил обнаружить группы фрагментов ДНК, дифференцирующие виды. Совокупность выделенных фрагментов может рассматриваться как ДНК «штрихкод» геномов шеста видов доместицированных животных (верблюдов, коз, овец, свиней, яков, КРС), а также использоваться для описания генофондов видов, их внутривидового разнообразия.

Фрагменты Верблюд Коза Овца Як КРС Свинья

A/G 1 2500-2300

A/G 2 2100-2000 ......ТТГГ^"

A/G 3 1900-1800

А/в 4 1750-1700

A/G 5 1650-1600

A/G 6 1SSO-1SOO

AJG 7 1450-1400

A/G 8 1350-1300

A/G 9 1290-1240 «мм

A/G 10 1230-1180

A/G 11 1170-1120

A/G 12 1110-1060 ем

A/G 13 1050-1000 ММ МИ ММ

A/G 14 930-940 MM

A/G 15 930-880

A/G 16 870-820 .........

A/G 17 810-760 янж

A/G 18 750-720 ММ* j

A/G 19 710-680

A/G 20 670-640 «Mi *

A/O 21 630-600 mam пят

A/G 22 590-560 MM

A/G 23 550-530 "W.4PJ

A/G 24 520-500

** шяш

A/G 25 490-470 'jHf* шшшшшшя эжш мм «ММ

A/G 26 460-440 ■мм

A/G 27 430-410 ■■ тот ММ

A/G 28 400-380

A/G 29 370-360 ■мм

A/G 30 350-340

A/G 31 330-320

A/G 32 310-300

A'G 33 290-280 мм

A/G 34 270-260 шит

A/G 35 250-240 ммп

A/G 36 230-220

A/G 37 210-200 Ш

A/G 38 180-160

МММ прайме? (AG},C * нет у одного ЖИВОТНОГО

í «MR праймер (GA),C ** нет у пяти животных

. 16 Межвидовые различия в спектрах ПНР-продуктов (частота встречаемо

1,000), полученных методом 18511-РС11, с помощью праймеров (AG),C

(ОА)9С у б доместшщрованных видов.

Подученные данные позволяют сделать вывод о том, что полилокусность маркеров К8К-РСК. удобна и, по-видимому, наиболее оптимальна при межвидовых сравнениях.

В таблице 5 представлены универсальные оценки генетического разнообразия у разных видов, выполненные с использованием ВвЯ-РСК. маркеров. Общее генное разнообразие Ш по Нею (1Че1, 1987) подразделяется на виутри-

популяционное (Не), между популяциями внутри группы (Des) и между группами популяций (Dst), т.е. Ht=Hc+Dcs+Dst. Величина Gst=Dst/Ht представляет собой долю межгруппового разнообразия в общем, Gct=Dcs/Hs — долю вну-трипопуляционного разнообразия внутри групп, a Hc/Ht — долю внутрипопу-ляционного разнообразия среди особей. Двухуровневый анализ разнообразия и оценка долей Не, Des, Dst в величине Ht показал, что общее генное разнообразие выше у КРС, овец и составило соответственно Ht = 0,168 ± 0,007 и 0,151± 0,010, внутрипопуляционное разнообразие выше у свиней (Н.) = 0,100 ± 0,009, а доля межпопуляционного разнообразия — у яков Gsl = 0,459.

Межпопуляционная изменчивость у пяти видов, исключая свиней, значительно выше внутрипопуляционной изменчивости. Данный факт можно использовать при подборе и отборе (межпопуляционных и внутрипопуляци-онных скрещиваниях) животных, при разработке селекционной стратегии для поддрежания генетической изменчивости.

Таблица 5.Параметры генетического разнообразия у шести доместицированных

видов животных (праймер (AG)9C)

Ht Hs Gst

КРС 0,168 ± 0,007 0,093 ± 0,002 0,443

Яки 0,081 ± 0,007 0,044 ± 0,002 0,459

Овцы 0,151 ± 0,010 0,096 ± 0,005 0,365

Верблюды 0,124 ± 0,013 0,090 ± 0,007 0,273

Козы ' 0,095 ± 0,010 0,057 ± 0,004 0,396

Свиньи 0,110 ± 0,011 0,100 ± 0,009 0,089

Ж — средняя на локус гетерозиготность (общее генное разнообразие) Не — внутрипопуляционное разнообразие

СвТ — доля межпопуляционного разнообразия в общем разнообразии

3.7. Применение метода ISSR-PCR для оценки популяционной

структуры, индентификации и сходства генофондов пород и видов

Целью данного исследования стало определение возможностей совместного использования программы Structure v2.2 и метода ISSR-фингерпринтинга для анализа популяционной структуры доместицированных видов, а также для анализа генеалогии, сходства генофондов, оценки чистоты пород и внутрипо-родных групп сельскохозяйственных животных.

Обзор межвидовых, внутривидовых, меж- и внутрипородных популяци-онных структур и их взаимодействий на основе ISSR-фингерпринтинга мы начали с анализа межвидовых различий среди представителей пяти пород пяти одомашненных видов: крупного рогатого скота (серая степная порода), овцы (романовская), козы (советская шерстная), яка (тувинский сарлык), верблюда (тувинский верблюд). На рис.17а показана четкая кластеризация пяти видов животных, полученная с помощью Structure v2.2 .

Величина сходства особей а) Межвидовой уровень

с генофондом популяции

1 — Серая степная порода КРС (Горный Алтай)

2 — Романовская овца (Ярославская область)

3 — Советская шерстная коза (Тыва)

4 —Яки (Тыва)

5 — Верблюды (Тыва)

Породы крупного рогатого скота:

1 — Серый степной скот

2 — Бурая швицкая порода, кавказский тип

3 — Костромская

4 — Бестужевская

Величина сходства особей в) Внутрипородный уровень

с генофондом популяции

Каждый столбик соответствует одной особи.

Генофонды внутрипородных типов окрашены в разные оттенки

(бурая швицкая порода, кавказский тип)

Рис. 17. Результаты анализа генофондов на основе популяционно-статистической обработки данных ISSR-фингерпринтинга с использованием программы Structure v2.2. а — на межвидовом уровне, для пяти доместицированных видов животных; б — на межпородном уровне, для четырех пород крупного рогатого скота; в — на внутрипородном уровне, анализ чистопород-ности и консолидированности кавказского типа бурой швицкой породы КРС (Дагестан). Генофонды внутрипородных типов окрашены в разные оттенки. Каждый столбик соответствует одной особи.

Каждая особь представлена на гистограмме единственным вертикальным столбиком. Все исследуемые животные образовали пять монолитных кластеров, во всех случаях особь или группа особей того или иного вида после анализа Structure v2.2 присоединялась к популяционной структуре своего вида.

Следующий анализ данных по ISSR маркерам с помощью популяционно-статистической обработки включал межпородный уровень. Для этой цели были проанализированы популяции, представляющие четыре породы КРС: серый степной скот, кавказский тип бурой швицкой, костромская и бестужевская породы.

На рис. 176 показано разделение исследуемой совокупности, состоящей из особей четырех пород, на четыре кластера. Каждая порода сформировала

1.004 0.80-1 0.60J

0.4СЦ

0.204

O.OOJ

1 2 3 4 5

Величина сходства особей 6) Межпородный уровень

с генофондом популяции

собственный кластер. Однако, если в популяции серого степного скота была •зарегистрирована однородная картина, то в бурой швицкой, костромской и бестужевской были отмечены генотипы с чужеродной примесыо (см. неоднородно окрашенные столбики).

Наиболее интересным и ранее мало изученным уровнем анализа стал вну-трипопушпшонный или внутрипородный уровень. С этой целью мы провели исследованта данных ISSR-фингерпринтинга популяции кавказского типа бурого швицкого скота.

На рис. 17в показано, что в исследуемой популяции бурого швицкого скота (кавказский тип) семь животных не соответствуют г енофонду породы. Возможно, эти особи принадлежат к генофонду горного скота Дагестана. На гистограммах ось ординат разделена на градации, позволяющие определять как чистоту, так и процент чужеродных примесей у особи, индивидуальный номер которой представлен на оси абсцисс. Важно, что предложенный метод позволяет выявить конкретных животных, несущих в своем генотипе примеси чужеродных генофондов. Из совокупностей особей легко вычислить процент гштродуцироваиных генотипов на уровне популяции и тем самым сделать заключение о чистоте и консолидации породы в целом.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные проблемы сокращения биоразнообразия, в том числе генетических ресурсов сельскохозяйственных видов, существенно затронувшего животноводческий сектор России, требуют разработки новых подходов к их контролю и сохранению. В этих целях в работе выполнен поиск «центров» породного разнообразия России, выделено 5 регионов, в которых представлено наибольшее количество отечественных пород. Рассмотрены возможные организационные пути для их сохранения и устойчивого развития. Однако программы оптимизации использования отечественных генетических ресурсов нуждаются в разработке принципов отбора ггород, конкретных популяций и животных, сохранение которых будет соответствовать поставленным задачам. Необходимым условием для принятия таких решений является создание системы мониторинга генетических ресурсов сельскохозяйственных видов животных. В связи с этим выполнен сравнительный анализ различных методов генетического мониторинга, начиная от фенологического и включая генотипирование животных по полилокусным спектрам фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов.

Исследования полиморфизма и распределения частот фенов, аллсльных вариантов структурных генов позволяют выявлять фенотипические и генетические особенности внутрипородных и породных групп сельскохозяйственных видов животных и специфические межлокусные ассоциации, которые в некоторых случаях могут обладать повышенной селективной ценностью и использоваться при сохранении уровня генетической изменчивости в стадах, сохраняемых in situ.

Выполненное сравнение спектров ПЦР-продуктов с использованием в качестве праймеров фрагментов микросателлитных локусов (TC)9G и (CT)9G свидетельствует о том, что в ряде случаев длина фрагментов ДНК, фланкированных ими, консервативна и сохраняется у разных видов.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что метод ISSR-фингерпринтинга, в сочетании с программой Structure v2.2, могут быть использованы для решения нескольких задач. Во-первых, для проведения молекулярно-генетической экспертизы по видовой и породной принадлежности животных. Во-вторых, для определения характеристик генетических структур породы, популяции: их однородности, консолидироваипости, «чистоты», а также соответствия отдельных особей г енофонду породы. В-третьих, предложенные алгоритмы по сравнительному анализу искусственно созданных популяций с генетической структурой реальных внутрипородных q>ynn позволяют выявлять совокупности животных, наиболее близкие как к «прагенофонду», так и к современному генофонду породы. «Искусственные популяции», созданные на основании сочетания видоспецифических фрагментов ДНК, позволяют' выявлять из «анонимных выборок» животных популяции того вида, на основе которого были созданы искусственные выборки. В-четвертых, появилась новая возможность определять генеалогические связи между популяциями, оценивать их внутри- и межпопуляционные взаимоотношения.

Сочетание полилокусного генотипирования животных и использование для его анализа программы Structure v2.2 позволяет оценивать генофондную специфичность видов, пород, а, главное, получать ясные математические критерии для определения принадлежности особи к различным внутриио-родным популяциям, к породам. Такой подход может значительно облегчить работу селекционера но поддержанию «чистоты» и консолидироваипости стада, его породного стандарта, а также стать основой для выработки определенных селекционных стратегий. Например, генетический мониторинг сохранения «древнего типа» породы, или размножения животных, по генетической структуре наиболее близкого к желательному для селекционера типу. Расширение спектра праймеров, с учетом геномной структуры различных видов, позволит получать более разнообразный спектр ПЦР-продуктов. При накоплении данных по ISSR-фингерпршгпшгу генофондов сельскохозяйственных видов возможно получить надежные математические критерии для оценки консолидации пород по многим десяткам локусов, а также сформулировать генетически обоснованные понятия «синтетическая» и «чистопородная» группы животных.

Исследование большего числа видов и пород будет способствовать созданию банка данных по их генофопдным характеристикам, что позволит сформировать представления о нрагенофондах, современных генофондах, выявлять эрозию и генетическую изменчивость пород и внутрипородных групп сельскохозяйственных видов животных, определять тактику и стратегию управления и сохранения пород и видов сельскохозяйственных животных, а также в необ-

ходимых случаях надежно определять видовое происхождение товарных продуктов животноводства.

5. ВЫВОДЫ

1. Анализ динамики количественного и качественного состояния доместици-рованных видов животных в России за последние 20 лет свидетельствует о значительном сокращении количества аугохтонных (местных) пород, их внугрипородной численности. Эрозия, истощение и истребление генетических ресурсов сельскохозяйственных животных приводит к ограничению в использовании разнообразных агроэкологических территориий Российской Федерации.

2. Сопоставление происхождения 198 пород 33-х доместшшрованных видов позволило локализовать на территории России пять основных центров наиболее интенсивного породообразования: северно-европейский, центрально-европейский, южно-европейский, кавказский и западно-сибирский. Принадлежность пород к вышеуказанным центрам необходимо учитывать при разработке стратегии сохранения генофондных ресурсов сельскохозяйственных видов животных

3. Сочетания фенов, аллелей структурных генов, полилокусных спектров «анонимных» последовательностей ДНК позволяют надежно дифференцировать породы, выделять генофондный «стандарт» породы, что может быть использовано для контроля динамики и сохранения генофондов редких и исчезающих пород.

4. Проведенный феиетический анализ позволил впервые обнаружить у аборигенных пород крупного рогатого скота отдельные фены, встречающиеся у близкородственных диких видов полорогих. У крупного рогатого скота показано, что распределение частот встречаемости отдельных морфологических фенов может быть использовано как дополнительная породная характеристика.

5. При мониторинге состояния породы у ряда пород крупного рогатого скота выявлены по отдельным системам редкие аллельные варианты (в частности, аллель Б в системе трансферрина, полиморфизм фосфоглюкомутазы, посттрансферринов), оценено их распределение и установлена вовлеченность в эволюцию пород. Так, аллель ТТ Р встречался только у локальных пород, при создании которых принимал участие серый степной скот (например, бурая карпатская). Генотипирование таких моногенных локусов, с известной иммунной и биохимической функцией, позволяет выявлять нуги межпородных взаимодействий в процессах их распространения и преобразования.

6. Впервые разработана общая универсальная шкала длин фрагментов ДНК, фланкированных динуклеотидными микросателлитами (ТС)90 и (СТ),<1 для 6 видов парнокопытных, позволяющая надежно генотипировать животных одновременно по 38 фрагментам и выполнять внутри-, межпородные

и межвидовые сравнения, временной и пространственный мониторинг генофондов.

7. Сравнительный анализ полиморфизма спектров продуктов амплификации, полученных с праймерами (AG)9C и (GA)9C, позволил обнаружить группы фрагментов ДНК, дифференцирующие виды. Совокупность выделенных фрагментов могут рассматриваться как ДНК «штрихкод» геномов шести видов доместицированных животных (верблюдов, КРС, яков, овец, коз, свиней), а также использоваться для описания генофондов видов, их внутривидового разнообразия.

8. Впервые выполненные сравнительные исследования полшюкуспых спектров фрагментов ДНК, фланкированных участками микросапгеллитных ло-кусов (ISSR-PCR), ряда пород крупного рогатого скота позволили выявить консервативные и вариабельные участки, а также породоспецифические характеристики полученных спектров. Анализ полиморфизма и полиморфного информационного содержания (PIC) 102 фрагментов привел к выделению групп, которые могут использоваться для описания породного «стандарта» таких отечественных пород, как серый степной, костромской скот, ярославская, бестужевская породы и др.

9. В спектрах ISSR-фингепршгпшга одомашненных животных обнаружено четыре типа ПЦР-продуктов. Первые — видоспецифические фрагменты, которые выявляются у всех животных данного вида. Вторые — породоспецифические фрагменты с различной частотой встречаемости, обнаружены у конкретных пород. Третьи — редко встречающиеся фрагменты, их частота менее 0,4. Четвертые — фрагменты, которые являются результатом мутационного процесса, их частота встречаемости ничтожна мала. Различные сочетания четырех типов ПЦР-продуктов образуют специфические совокупности ISSR спектров, благодаря которым формируются генофондные профили вида и породы, видо-породоспецифические паттерны, генофонд-ный стандарт породы.

10. Сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК разной длины у 19-ти пород крупного рогатого скота свидетельствует о наибольшей межпородной консервативности спектров ампликонов праймера (GA)9C по сравнению со спектрами фрагментов ДНК, полученных при использовании в качестве праймера (AG)9C. При сопоставлении спектров генофондов исследованных пород выделяются породоспецифичные сочетания фрагментов ДНК, которые могут рассматриваться как породный ДНК «штрихкод».

11. Сопоставление меж- и внутривидовых, меж- и внутрипородных полилокус-ных спектров ISSR-PCR маркеров полиморфизма геномной ДНК у пород овец и популяций яков свидетельствует о существенных отличиях генофоид-ных ресурсов и закономерностях внугрипородной и виутрипопуляциоштой дифференциации в связи, в частности, с эколого-географическими особенностями разведения у таких пород овец как романовская и тувинская корот-кожирнохвостая, а также в популяциях яков Саяно-Алтайского региона.

12. Использование мультилокусного межмикросателлитного анализа (ISSR-PCR) совместно с методом к-клаетеризации популяционных структур (программы Structure v2.2.) стало основой ряда тестов молекулярно-генетической экспертизы и исследования генофонда доместицироваиных видов животных. Показаны возможности анализа популяшюнной структуры доместицироваиных видов на различных уровнях (межвидовом, межпородном и внутрипородном), анализа сходства и различия генофондов пород (внутрипородных групп), их идентификации и наглядной оценки консолидированное™, чистопородности и генеалогических связей.

13. На основании анализа генетических структур стад 40 геиофондных хозяйств базовых домеетицированиых видов выделены 30 хозяйств, в которых содержатся чистопородные наиболее консолидированные животные той или иной породы.

14. Предложена концепция сохранения генетических ресурсов доместицироваиных видов, основанная на новой организационной структуре и принципах генетического мониторинга, популяционно-генетических методах и идеологии природоохранной генетики.

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Использование мультилокусного межмикросателлитного анализа (ISSR-PCR) совместно с методом к-кластеризации популяциоиных структур позволили предложить метод для молекулярно-генетической экспертазы и оценки популяциошюй структуры, идентификации, установления сходства генофондов пород и видов доместицироваиных животных. Рекомендован новый метод оценки чистопородности и консолидации животных и пород КРС и овец на основе последовательностей ДНК (1SSR-PCR).

2. При сохранении пород in situ предлагается учитывать изменения средней гетерозиготности по ISSR-маркерам, как показателя сохранения популяционно-генетичеекой структуры породы (популяции).

3. В результате выполненного сравнения шести сельскохозяйственных видов животных получены и оценены полилокусные спектры фрагментов ДИК разной длины, из них отобраны участки, фланкированные инвертированными повторами микросателлитных локусов и их отдельные сочетания, которые могут служить надежными видовыми, а также групповыми маркерами для исследованных групп животных. Отобранные фрагменты ДНК могут быть использованы для создания макробиочипов в целях ускорения и облегчения генотипировапия животных.

4. Разработана система действий по оценке и сохранению генетического разнообразия породы в генофондных хозяйствах. Для оптимизации планирования программ сохранения для конкретных пород предложена оценка ценности породы, ее вклада в общее генетическое разнообразие на примере данных ISSR-фингерпринтинга.

Список работ, опубликованых по теме диссертации Монографии

1. Уханов C.B., Столповский Ю.А., Банникова JI.B. и др. Генетические ресурсы крупного рогатого скота / Под. ред. И.А. Захарова М.: Наука, 1993.170 с.

2. Столповский Ю.А. Консервация генетических ресурсов сельскохозяйственных животных: проблемы и принципы их решения / Под ред. И.А. Захарова. М.:Эребус, 1997. 112 с.

3. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Курбатова О.Л. ... Столповский Ю.А. и др. Динамика иопуляционных генофондов при антропогенных воздействиях / Под ред. Ю.П. Алтухова. М.: Наука, 2004. 618 с.

4. Моисеева И.Г., Уханов C.B., Столповский Ю.А. и др. Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России / ред. И.А. Захаров. М.: Паука, 2006.466 с.

5. Столповский Ю.А., Захаров И.А. Генофонды отечественных пород — национальное богатство России. М.: 2007.48 с.

6. Козирь B.C., Барабаш B.I. ... Столповский Ю.А. и др. Cipa yspaipcbKa худоба: ми-нуле, сучасне, майбуше / Шц ред. Академша УААП B.C. Козиря. Дншропетровськ.: Украшська Акаде.\йя Аграрних Наук, 1нститут Тваришшвдва Центральных Райошв, 2008. 243 с.

Статьи

1. Столповский Ю.А., Скрипниченко О.М., Кирин Г.Н. и др. Создание генофонда редких видов диких млекопитающих, птиц и аборигенных пород домашних животных в целях сохранения, гибридизации и доместикации / Генетика — народному хозяйству. Новосибирск, 1990. С. 57-63

2. Stolpovskii Yii.A., Stolpovskaja O.B.Polymoiphism of phosphoglueomutase in Grey Ukrainian cattle // Izozyme Bulletin. 1991.vol. 24. P.54.

3. Stolpovskaja O.B., Stolpovskii Vu.A. Transferrins of blood serum in cattle of Grey Ukrain-ion breed (B.t. primigenius) // Izozyme Bulletin. 1990. vo].23. P. 23:93

4. Stolpovskii Vu.A., Stolpovskaja O.B. Blood serum post-transfemn-3 (PTF-3) in Grey Ukrainion cattle // Izozyme Buíletm.1991. vol.24. P. 54

5. Столповский Ю.А. Генетический мониторинг и рациональное использование генофонда серой украинской породы крупного рогатого скота. Автореф. Дисс. канд.биол. наук.С-ПБ, 1992. 19 с.

6. Столповская О.Б., Столповский Ю.А., Годованец Л.В., Чуй Р.Ф. Сравнительное исследование белкового полиморфизма серой украинской породы. // Цитология и генетика. 1992. т. 26. № 5. С. 11-18.

7. Столповский Ю.А. Сохранение генетических ресурсов крупного рогатого скота // Генетические ресурсы крупного рогатого скота Í Под. ред. И.А. Захарова. M.: Паука, 1993. С. 5-19.

8. Столповский Ю.А. Фенетический подход в изучении популяций сельскохозяйственных животных на примере серой украинской породы крупного рогатого ewra (Bos tanrus prim igenius) // Сельскохозяйственная биолог ия. 1996. N 6.

9. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Тараскж С.И. и др. Изучение особенностей бурой карпатской породы — местной исчезающей породы крупного рогатого скота Западной Украины // Генетика. 1996. Т. 32, N5. С. 668-676.

10. Глазко В.И.,Столповскин IOÀ, Тарасюк С.И., Букаров Н.Г., Попов H.A. Генетическая структура породы пшщгау в карпатском регионе // Генетика. 1996. Т. 32, N 5. С. 676-684.

И. Столиовский Ю.А. Популяционно-фенетический анализ серой украинской породы крупного рогатого скота. // Популянионная фенетика. М.". Наука, 1997. С.135-148.

12. Столповский Ю.А., Глазко В.И., Облап Р.В., Кушнир D.A. Фенотиппческая и генетическая структура серой украинской породы крупного рогатого скота // Цитология и генетика. 1998 Т.32, N 5. С.67-74.

13. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Дымаш» Т.Н.,.Кушнир А.В Пространственная и временная подраздеденность генетической и фенегаческой структуры серого украинского скота//Док. HAH Украины. 2000. N7. С. 183-187.

14. Карамчакова О.Н., Столиовский Ю.А. Молекулярно-генегический анаши вариантов каппа-казеина у коров красной горбаговской породы // Вестник РУДН серия Сельхоз. науки. Животноводство. 2001. № 6. С. 22-23.

15. Малиенк» В А, Столповский Ю.А., Литвак О.О., Глазко В.И. Генетика и ссяекция на Украине / HAH Украины, Укр., т-во генепшов и селекционеров. К.: Логос, 2001. XI. С.272-276.

16. Катков Л.В, Саморуков Ю.В., Чубарь Н.М., Столповский IO.A. и др. Программа сохранения рационального использования генофонда красной горбаговской породы КРС / рец. В.К.. Чернушенко, Д.В. Карликов, Н.Ф. Лось. МСХ РФ. Дубровицы, 2001. 50 с.

17. Столповский Ю.А. Сохранение культурного биоразнообразия / Биоразнообразие и сохранение генофонда флоры, фауны и народонаселения Центрально-Азиатского региона.: ТувИКОПР СО РАН. Кызыл, 2003. С. 90 94.

18. Алтухов ЮЛ, Захаров И.А., Столповский Ю.А. и др. Динамика популяциоштых генофондов животных / В кн. «Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях» (под ред. акад. Ю.П. Алтухова). М.: Наука, 2004. С. 110-294.

19. Захаров И.А., Сулимова Г.Е., Столповский Ю.А. и др. Мониторинг генофондов популяций животных в связи с задачами селекции и изучением филогении. М.: РАН, 2005. С. 96-98.

20. Сулимова Г.Е., Столиовский Ю.А., Каштанов CH., Моисеева И.Г., Захаров И.А. Методы управления генетическими ресурсами домеепщированных животных / фундаментальные основы упраштения биологическими ресурсами. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2005. С. 331-340.

21. Столповский Ю.А., Захаров И.А. Генетические аспекты проблемы сохранения биологического разнообразия домашних животных // Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России / ред. И.А. Захаров. М.: Наука, 2006. С. 8-22.

22. Уханов C.B., Столповский Ю.А., Сулимова Г.Е. и др. Породы рогатого скота и их генофонды // Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России / ред. И.А. Захаров. М.: Наука, 2006. С.23-123.

23. Столповский Ю.А. Сокращение породного разнообразия КРС // Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России / ред. И.А. Захаров. М.: Наука, 2006. С. 168 175.

24. Столповский Ю.А. Як Bos mutas // Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России / ред. И.А. Захаров. М.: Наука, 2006. С.175-186.

25. Столиовский Ю.А. Сохранение «культурного» биоразнообразия //Генофонды сельскохозяйственных животных: генетические ресурсы животноводства России / ред. И.А. Захаров. М.: Наука, 2006 С. 389-410.

26. Захаров-Гезехус, Столповский Ю.А., Уханов C.B., Моисеева И.Г. Сулимова Г.Е. Мониторинг генофондов популяций животных в связи с задачами селекции и изучении филогении. Биоразнообразие и динамика генофондов // Динамика генофондов. ФИАН. 2007. С. 122-124.

27. СулимоваГ.Е., Столповский Ю.А., Лазебный O.E., Захаров-ГезехусИ.А. Мониторинг-генофондов популяций животных в связи с задачами селекции и изучением филогении/ Программа фундаментальных исследований РАН. Москва. 2007. С. 154-156.

28. Столповский Ю.Л. Ключевой вопрос в сохранении «культурного» биоразнообразия животных — сохранение породного многообразия // Известия ТСХА. N 5. 2007. С. 125.....134.

29. Столповский Ю.А., Лапшин A.B., Кол Н.В., Сулимова Г.Е., Глазко В.И. Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров у овец романовской породы // Известия ТСХА, N 2. 2008. С. 125-134.

30. Сулимова I .E., Столповский Ю.А., Рузина М.А., Захаров-Гезехус И.А. Мониторинг генофондов популяций животных в связи с задачами селекции и изучением филогении / Биоразиообразие и Динамика генофондов. Москва, 2008. С. 211- 214.

31. Столповский Ю.А., Кол Н.В., Рузина М. II, Столповский К.Ю., Сулимова Г.Е. Сравнительный анализ генетической изменчивости пяти отечественных пород крупного рогатого скота с использованием AG-ISSR маркеров / Сборник трудов КСХА, Кара-ваево. 2009. С. 184-190.

32. Баранов A.C., Столповский ЮА., Яблоков A.B., Баранов A.B. К сохранению генетических ресурсов с\х пород и сортов России / Сборник трудов КСХА, Караваево. 2009. С. 28-32.

33. Столповский Ю.А., Захаров И.А. Генофонды отечественных пород — национальное богатство России //Вюник 1нституту тваршшинтва цеитралышх райотв УААН, вип.5, Дшпропегровсыс, 2009. С. 124-141.

34. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Феофилов Ф.В., Кол Н.В. Распределение фрагментов ДИК, фланкированных инвертированными повторами ли — и трииуклеотидиых микросателлитов, в геномах серого украинского скота // Известия ТСХА. N 1. 2009. С. 155-162.

35. Сулимова Г.Е., Ахани Азари М., Столповский Ю.А., Лазебный O.E., Максименко В.Ф. Сравнительное исследование полилокусных спектров фрагментов ДНК, фланкированных участков микросателлитных локусов (ISSR-PCR) стад и линий ярославской породы крупного рогатого скота. Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных /под ред. В.Е. Кремина. Ярославль, 2009. С. 159- 163.

36. Столповский Ю.А., Ахани Азари М., Кол Н.В., Рузяна М.Н., Столповский К.Ю., Сулимова Г.Е., Глазко В.И. Сравнительное исследование полилокусных спектров фрагментов ДНК, фланкированных участками микросателлитных локусов (ISSR-PCR) у пород крупного рогатого скота //Известия ТСХА. N3. 2009. C.S9-97.

37. Столповский ЮЛ., Шимиит Л.В.,Кол Н.В.,Евсюков А.Н., РузинаМ.Н., Чургуй-оол О.И., Сулимова Г.Е. Анализ генетической изменчивости и филогенетических связей среди популяций тувинской короткожирнохвостой овцы с использованием ISSR маркеров / Сельскохозяйственная биология. N6.2009. С. 34 43.

38. Глазко В.И., Столповский Ю.А. Получение подборки ДНК для макробиочипов удобных для одновременного гепотипироваиия крупного рогатого скота / Методические рекомендации. МСХ РФ. РГАУ.........МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва.

2009. 34 с.

39. Столповский Ю.А. Новые организационные система и принципы сохранения генофондов домесгицированных видов животных // Вестник РАСХН. N6. 2009. С.80-81.

40. Столповский ЮА., Лазебный O.E., Столповский К.Ю., Сулимова Г.Е. Применение метода ISSR-PCR для оценки попудяциошюй структуры идентификации и сходства генофондов пород и видов доместицированных животных // Генетика. 2010, Т. 46, N 6. С. 1-9.

Автореферат

Столповский Юрий Анатольевич

«ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

СОХРАНЕНИЯ РЕСУРСОВ ГЕНОФОНДОВ ДОМЕСТИЦИРОВАИНЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ»

Заказ № 51-а/08/10 Подписано в печать 18.08.2010 Тираж 100 эю. Усл. гг.л. 3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

У/

• $ >' www.cfr.ru; e-maiUinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Столповский, Юрий Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие аспекты проблемы сохранения биологичес-кого разнообразия домашних животных.

1.2. Основные аргументы в пользу сохранения генофонда локальных пород.

1.3. Общие принципы сохранения генетического разнообразия.

1.4. Сохранение генофондов сельскохозяйственных животных.

1.4.1. Селекция и сохранение пород.

1.5. Генетическая изменчивость, методы ее контроля.

1.5.1. Электрофоретические варианты белков.

1.5.2 ДНК маркеры.

1.6. Способы сохранения «культурного» биоразнообразия.

1.6.1. Единица сохранения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. СОСТОЯНИЕ «КУЛЬТУРНОГО» БИОРАЗНООБРАЗИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

3.1. Оценка качественных и количественных характеристик породного разнообразия России.

3.2. Динамика численности и породного разнообразия основных сельскохозяйственных видов России.

3.3. Породное разнообразие сельскохозяйственных видов как основной показатель генетических ресурсов животноводства России на примере крупного рогатого скота.

3.4. Сравнительный анализ породного состава эколого-географи-ческих регионов России для выявления отечественных центров породного богатства.

3.5. Оценка направлений поисков новых организационных систем и принципов сохранения генетических ресурсов животноводства России.

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПОРОДНОГО ГЕНОФОНДА.

4.1. Краткая характеристика серой степной (украинской) породы (модельного объекта).

4.2. Популяционно-фенетический анализ генофондного разнообразия серой степной (украинской) породы.

4.3. Популяционно-генетический анализ внутрипородного разнообразия серого степного скота с использованием оценок полиморфизма электрофоретических вариантов белков плазмы крови.

4.4. Внутрипородное разнообразие серого степного скота по электрофоретическим вариантам эритроцитарных белков и ферментов.

4.5. Пространственная и временная подразделенность генетической структуры серой степной породы, оцененные по фенетическим и молекулярно-генетическим характеристикам.

4.6. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого степного (украинского) скота.

4.7. Эффективность использования для оценок внутрипородной дифференциации электрофоретических вариантов белков и ДНК маркеров (188К-РСК маркеров) у овец романовской породы.

ГЛАВА 5. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВНУТРИПОРОДНОЙ

И МЕЖПОРОДНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ

ПО ISSR-PCR МАРКЕРАМ.

5.1. Генетический мониторинг пространственной дифференциации тувинской короткожирнохвостой овцы с использованием ISSR-PCR маркеров.

5.2. Оценка генофондной дифференциации пород крупного рогатого скота с использованием ISSR-PCR маркеров

5.3. Сравнительный анализ полиморфизма ISSR-маркеров в иопуляциях яка (Bos mutus) саяно-алтайского региона и гибридов F( между яком и КРС.

5.4. Оценка дифференциации генофондов видов сельскохозяйственных животных с использованием метода ISSR-PCR.

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ISSR-PCR ДЛЯ ОЦЕНКИ ПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И СХОДСТВА ГЕНОФОНДОВ ПОРОД И ВИДОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Популяционно-генетические основы сохранения ресурсов генофондов доместицированных видов животных"

Основоположником современных представлений о центрах доместикации растений и животных, зарождения аграрной цивилизации, является Н.И. Вавилов. Он же впервые определил как глобальную задачу необходимость мобилизации генетических ресурсов для нужд селекции (Вавилов, 1935,1965). Его работы приобретают особое значение в настоящее время, в период активной глобализации и индустриализации сельского хозяйства. Индустриальные системы характеризуются стандартизацией продукции и высокой степенью контроля условий производства. Они высоко специализированы и разбиваются на блоки, составляющие производственные цепочки, от получения исходного сырья до продажи конечного продукта: в них оптимизируются параметры продукции по одному или ограниченному количеству показателей. Как следствие, в развитых странах, в которых индустриализация животноводства и растениеводства проводилась в течение нескольких десятилетий, обычно возникает существенная эрозия пород и сортов.

Ориентация на мировую тенденцию индустриализации сельского хозяйства несет в себе множество рисков. Один из них — это сокращение национальных генетических ресурсов животных и растений (доктрина продовольственной безопасности РФ, 2010). Так, рыночная потребность расширения производства для уменьшения себестоимости и цены конечной продукции неизбежно будет приводить к тому, что блоки цепочек индустрии, в частности, в животноводстве, будут связаны с увеличением концентрации большого количества животных в ограниченном пространстве. Это создает среду, в которой легко распространяются инфекционные болезни. Следовательно, индустриальные единицы имеют тенденцию к высокому использованию ветеринарных препаратов, которые могут попадать в пищевые цепи и оказывать неблагоприятный эффект на здоровье человека. Гигиенические требования в больших животноводческих хозяйствах влекут за собой использование высоких доз агентов химической очистки и других препаратов, таких как фунгициды, которые, при неправильном применении, становятся дальнейшим потенциальным источником загрязнения окружающей среды. Включение в отечественное сельское хозяйство транснациональных животноводческих индустрии создает опасность сокращения собственных генетических ресурсов сельскохозяйственных видов, зависимость от импорта, а также угрозу глобализации распространения инфекций и скрытых генетических дефек тов. В то же время, создание индустриальных цепочек производства продовольствия уменьшает эффективность использования богатства экологических ниш, особенно разнообразных на территории России, и тормозит развитие биоорганического сельского хозяйства. Устойчивое развитие отечественного производства продовольствия и сырья базируется на том, что в целом по России через 10 лет должно производиться не менее 80 процентов от всех основных видов продуктов питания, потребляемых в стране (доктрина продовольственной безопасности РФ, 2010). Отсюда следует нарастание важности сохранения генофондов отечественных сельскохозяйственных видов животных.

Под сохранением генофондов сельскохозяйственных видов подразумевается, прежде всего, сохранение породного разнообразия, которое за последние 100 лет значительно сократилось. Только в Европе и на Кавказе исчезли 481 порода млекопитающих и 39 пород птиц. Из 7616 пород (включая 6536 местных и 1080 трансграничных) домашнего скота и птицы, зарегистрированных в базе данных ФАО, 190 вымерли за прошлые 15 лет, а 1491 порода находится на грани исчезновения. При этом отсутствуют данные о размерах популяции 36 % пород (FAO, 2009).

Сегодня проблемы контроля и управления породами сельскохозяйственных животных приобретают международное значение, поскольку затрагивают многие страны мира, особенно обладающие большой территорией, различными агроэкологическими и экономическими условиями.

Проблему сохранения генетических ресурсов местных пород и сортов растений мировое сообщество тесно связывает с необходимостью сохранения культурных традиций, для биологизации сельского хозяйства, с продовольственной безопасностью, устойчивым развитием сельского хозяйства и агроэ-коландшафтов в мире и его отдельных регионах, а также качеством жизни в целом (FAO, 2007, 2009; Slow Food, 2006,2010). Изучение и осознание важности сохранения генетических ресурсов, его целей, методов, задач, действий стало прерогативой международной продовольственной и сельскохозяйственной организации ФАО (FAO), созданной при ООН, и многочисленных региональных организаций, например ЕЕАР (Европейская Ассоциация животноводства, ЕАЖ), а также общественных организаций, таких как Slow Food International и др. Наиболее полным источником о генетическом разнообразии доместици-рованных видов на глобальном уровне является Система информации о разнообразии домашних животных (http://dad.fao.org).

Важность сохранения «культурного» биоразнообразия подтверждена в международной конвенции о биологическом разнообразии, принятой на форуме «Повестка дня на XXI век». Понятие биологического разнообразия включает вариабельность живых систем всех иерархических уровней организации от организма до биосферы (Павлов и др.,2009). В конвенции подчеркивается значение сохранения и регионального использования генетических ресурсов для продовольствия и сельского хозяйства, с учетом взаимозависимости стран, обладающих этими ресурсами, для продовольственной безопасности планеты (КБР, 1992, 2002). Исходя из положений Международной конвенции о биологическом разнообразии (статьи 1 и 6) и Национальной стратегии сохранения биоразнообразия России, одной из первоочередных задач, формулируемых данными документами, является «сохранение, устойчивое использование и инвентаризация генетических ресурсов живых организмов». Приоритетными объектами охраны в агробиоценозах должны стать сорта культурных растений и локальные породы одомашненных животных (Концепция национальной стратегии сохранения биоразнообразия России, 2001).

В основном сокращение породного разнообразия связано с интенсификацией животноводства, отсутствием знаний и оценки местных пород, неоправданного их замещения при доминировании на рынке высокопродуктивных пород и репродуктивных биотехнологий (World Watch List, FAO/UNEP 2000). В глобальном масштабе системы индустриального животноводства в настоящее время включают 67 % продукции мяса птиц, 42 % свинины, 50 % производства яиц, 7 % говядины и телятины, и 1 % баранины и козлятины (FAO, 2007, 2009).

Темпы распространения коммерческих пород и связанных с ними новых технологий содержания и разведения животных очень высоки и требуют унификации ряда зоотехнических характеристик животных. Это приводит к двум важным последствиям. Во-первых, к жесткому отбору среди коммерческих пород той части их генофонда, носители которого в принципе совместимы с промышленными технологиями. В результате происходит сужение внутрипородной изменчивости и распространение по всему миру мутаций, вновь возникающих у отдельных выдающихся представителей таких пород. Глобальное перемещение в новые регионы ограниченной части генофонда породы со своим генетическим грузом, с сопровождающим ее специфическим набором патогенов, в конечном итоге, приведут к необходимости ориентации на генофонды локальных пород, менее продуктивных, но более адаптированных к региональным особенностям условий разведения. Во-вторых, глобальное распространение генофондов выдающихся производителей коммерческих пород неизбежно приводит к «генетической» эрозии генофондов доместицированных видов, к вытеснению локальных, более древних пород, что реализуется через прямую замену пород или поглотительные скрещивания локальных с представителями коммерческих. Получение таких помесей далеко не всегда приводит к желательным эффектам и требует дальнейшей длительной селекционной работы.

В 2007 году международное сообщество приняло первый план Глобальных действий и Интерлакенскую Декларацию (ИД) о генетических ресурсах животных. ИД включает в себя 23 стратегических приоритета, направленных на борьбу с эрозией генетического многообразия животных и устойчивое использование их генетических ресурсов (РАО, 2007).

В последнее время в регионах нашей страны начали создаваться ге-нофондные хозяйства, призванные восстанавливать и разводить в чистоте локальные (региональные) породы. В настоящее время на территории Российской Федерации разводится более 400 пород (официально в МСХ РФ на 01.01.2007 зарегистрировано 394), относящихся к 46 видам сельскохозяйственных животных — млекопитающих, птиц, рыб и насекомых. Из них 198 пород среди 33-х доместицированных видов относятся к региональным (отечественным) породам (Государственный реестр селекционных достижений России, 2007). ^

Сегодня в России нет надежной системы (организационной и биологической) сохранения генетических ресурсов доместицированных видов. Современные подходы к сохранению биоразнообразия не дают четкого ответа на вопросы: «какие породы необходимо сохранять и какие должны быть принципы сохранения». При наличии представлений о фенотипическом «стандарте» породы, отсутствуют данные и принципы выявления генетического, гено-фондного «стандарта» породы, нет четкого представления о таких понятиях, как «единица, эффективность и потенциал сохранения, ожидаемое и краевое разнообразие, генетические: уникальность, мониторинг и паспортизация», об оценке генетического разнообразия на молекулярно-генетическом уровне и т.д. Отсутствие фундаментальных знаний, концепций, стратегий, тактик и законов о сохранении генетических ресурсов животных в целях обеспечения продовольственной безопасности препятствует согласованным действиям на региональном, федеральном и международном уровнях, формированию надежных и современных механизмов сохранения и управления породным разнообразием и породообразовательным процессом в Российской Федерации.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Цель и задачи исследования.

Основная цель исследования заключалась в разработке концепции и принципов сохранения генофондов аутохтонных пород доместицированных видов, единой организационной системы сохранения и генетического мониторинга на основе популяционно-генетических и статистических методов.

Конкретные задачи нашего исследования сводились к следующему:

• Определить породообразовательные центры в Российской Федерации;

• Разработать принципы генетического мониторинга и оценок межпородного и видового генетического разнообразия, а также чистопородности пород, сохраняемых в генофондных хозяйствах;

• Разработать генетические характеристики видов и пород, в том числе ге-нофондный стандарт породы на основе ISSR-фингерпринтинга;

Объект исследования. Породы и внутрипородные группы одомашненных видов: крупного рогатого скота, овец, свиней, коз, яков, верблюдов в различных эколого-географических регионах.

Научная новизна полученных результатов: Сопоставление происхождения 198 пород 33-х доместицированных видов впервые позволило локализовать на территории России пять основных центров наиболее интенсивного породообразования. Впервые на основании выявленных породообразовательных центров сформулирована концепция и организационная схема сохранения генофондов доместицированных видов in situ. Предложена система генетического мониторинга, основанная на популяционо-генетическом анализе морфологических признаков, полиморфизма структурных генов и полилокусных маркеров ДНК. Впервые выполнены комплексные популяционно-генетические исследования генофондов целого ряда видов и пород, которые позволили оценить генетическое разнообразие и выявить видо- и породоспецифические характеристики. Сочетания фенов, аллелей структурных генов, полилокусных спектров последовательностей ДНК позволяют надежно дифференцировать породы, выделять породоспецифические признаки, породоспецифические аллели структурных генов, отслеживать изменения генетического разнообразия во времени и пространстве. Впервые разработана общая шкала длин фрагментов ДНК, фланкированных динуклеотидными микросателлитами (GA)9С и (AG)<)C для 6 видов парнокопытных, которая позволяет надежно генотипировать животных одновременно по 38 продуктам ПЦР, выполнять внутри- и межпородные, межвидовые сравнения, проводить мониторинг генофондов, определять параметры генетического разнообразия, контролировать чистопородность животных. Впервые выпол-ненны сравнительные исследования спектров полилокусных фрагментов ДНК, фланкированных участками микросателлитных локусов (ISSR-PCR), ряда пород крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, яков, верблюдов, которые позволили выявить консервативные ПЦР-продукты, вариабельные, а также породоспецифические спектры фрагментов. На основании полученных данных впервые сформулированы понятия: «генофондный профиль» вида (породы), «видо- и по-родоспецифического паттерна», «генофондного стандарта породы». Использование мультилокусного межмикросателлитного анализа (ISSR-PCR) совместно с методом к-кластеризации популяционных структур стало основой для создания ряда тестов молекулярно-генетической экспертизы и исследования популя-ционной структуры доместицированных видов животных. Впервые с помощью ISSR-маркеров показаны возможности анализа популяционной структуры доместицированных видов, сходства и различия генофондов пород (внутрипородных групп), их идентификации и наглядной оценки консолидированности, чистопо-родности и генеалогических связей. На основании полученных данных вычислен протогенофонд» крупного рогатого скота, установлены наиболее приближенные к «прапопуляции» породы и филогенетические связи между исследуемыми группами животных, что позволяет устанавливать приоритеты в сохранении породного разнообразия. Анализ параметров генетического разнообразия позволил обосновать предположение, что в популяциях крупного рогатого скота существует некий «оптимум» средней гетерозиготности или благоприятные показатели по определенным генетическим параметрам. Их колебания могут сигнализировать о различных процессах, происходящих в популяции, или стать генетическим инструментом контроля над генофондом породы.

На примере пород КРС предложен метод оценки пород, как генетического объекта сохранения и метод определения вклада конкретной породы в общее разнообразие но ISSR-маркерам, что может стать одним из критериев при выборе пород для сохранения in и ex situ.

Теоретическое и практическое значение полученных результатов.

Разработана новая организационная схема для сохранения генофондов отечественных пород, основанная на международном и отечественном опыте, современных структурных реалиях и географическом расположении породообразовательных центров в Российской Федерации. Предложена концепция генетического мониторинга — комплексный метод анализа и контроля генетической структуры пород доместицированных видов, основанный на популяционно-генетических методах и оценке параметров генетического разнообразия.

• прапопуляцию породы, что важно при сохранении изначальной генетической структуры породы;

• принадлежность популяции (индивидуальной особи) к той или иной породе, виду;

• наиболее типичных для породы популяции (особей) с точки зрения современной сформировавшейся генетической структуры;

• чистопородные и синтетические стада (популяции). Предложенный алгоритм исследования позволяет в зависимости, от поставленных задач выбирать селекционную тактику при разведении и сохранении пород in situ, в том числе контролировать процесс восстановления породы, после интродукции в нее производителей других пород.

На основании разработанных подходов выполнен анализ генетических структур стад 40 хозяйств базовых доместищгрованных видов, претендующих на получение генофондного статуса, позволивший выделить среди них наиболее консолидированные и наиболее гетерогенные.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Разработка концепции сохранения и управления генофондами домести-цированных видов животных требует качественно новых, геномных методов их мониторинга. В связи с этим к основным положениям диссертационной работы, выносимым на защиту, относятся следующие:

1. Предложена универсальная шкала, которая позволяет надежно генотипировать 38 ПЦР-продуктов, полученных методом ISSR-PCR. Использование межмикросателлитного анализа совместно с методом к-кластеризации популяционных структур является основой тестов молекулярно-генетической экспертизы и исследования генофонда доместицированных видов животных.

2. Выявление и одновременная оценка не менее 20-30 независимых локусов в одном геноме с помощью ISSR-маркеров позволяют выявлять генофондные особенности на уровне популяций, пород, помесных групп животных и видов, что может быть использовано как- компонент комплексного генетического мониторинга динамики генофонодов и сохранения разнообразия доместицированных видов.

3. В полученном методом 188К-РСЕ. спектре ПЦР-продуктов выделяются сочетания фрагментов ДНК, ассоциированные с генеалогическими связями между исследованными группами животных, а также эволюционно консервативные у разных видов.

4. С помощью 18811-фингерпринтинга получены оценки, которые позволяют количественно характеризовать ценность каждой породы. На основе молекулярио-генетических данных предложен критерий для выбора пород, подлежащих сохранению.

5. Анализ динамики количественного и качественного состояния доместицированных видов в России за последние 20 лет свидетельствует о значительном сокращении количества аутохтонных (местных) пород, их внутрипородной численности. В основных одомашненных видах доминируют несколько высокопродуктивных пород, что приводит к дисбалансу в породном разнообразии. Генофонд отечественных пород систематически подвергается генетической эрозии благодаря интродукции экзотических пород. Эрозия, истощение и истребление генетических ресурсов сельскохозяйственных животных приводит к ограничению в использовании разнообразных агроэкологических и экономических территорий Российской Федерации.

Апробация работы.

Результаты исследований были представленны и докладывались на Ш-й школе-семинаре по генетике и селекции животных (Новосибирск-Горно-Алтайск, 1989), Российско-украинском совещании по генетике сельскохозяйственных животных (Аскания-Нова, 1992), на I, II международных конференциях «Молекулярно-генетические маркеры животных» (Киев, 1994, 1996); 46-ом конгрессе ЕААР (Прага, 1994); международной конференции «Проблемы сохранения редких пород домашних животных и близкородственных диких видов» (Пущино, 1996); международной конференции «ДНК-технологии» (Киев, 1997), первой научной школе-конференции «Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва-Минск, 2001), международном конгрессе по сохранению биологического разнообразия (Неаполь, 2003), I и II международных научно-практических конференциях «Биоразнообразие и сохранение генофонда флоры, фауны и народонаселения Центрально-Азиатского региона» (Кызыл, 2003,2007), международном форуме Terra Madre I, II, Ш (Турин,

2004, 2006, 2008), конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005), Всероссийском учредительном съезде-конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006), научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития звероводства» ВВЦ «Золотая Осень» (Москва, 2007), международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова— фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), заседании конвивиума «Суздаль-Нива» международной организации «Слоу-Фуд» (Суздаль, 2007), Семинаре ФГОУ ВПО МГВМиБ им. Скрябина и ВННИЖ «Новый порядок аттестации племенных хозяйств, правила определения видов организаций по племенному животноводству. Проблемы, возникающие при работе с импортным скотом, и пути их решения» (Дубровицы, 2008), 59 и 60-ой международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе» (Кострома, 2008,2009), международной конференции «Продуктивность, ветеринария, агроэкономика и продовольственная безопасность» (Черногория, 2008), V всероссийском съезде генетиков и селекционеров (Москва, 2009), семинаре животноводов в республике Алтай (Кош-Агач, 2009). Материалы исследования были использованы в учебном процессе — курсе лекций «Генетика сельскохозяйственных животных» для студентов сельскохозяйственного факультета Российского Университета Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы, в рабочей программе «Генофонд сельскохозяйственных животных и его использование в селекции» ГОУВПО «Новгородский государственный университет им. Ярослава Мудрого», в учебном процессе Тувинского государственного университета (кафедра зоотехнии).

Публикации.

По материалам работы опубликовано 86 научных работ — 6 монографий, 61 статья в научных и научно-популярных журналах, сборниках трудов,.научных вестниках, международных бюллетенях и 19 сообщений в материалах и тезисах отечественных и международных конференций.

Связь работы с научными программами, планами, темами.

Работа выполнена соответственно тематического плана научных исследований Института Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН, в рамках следующих программ:

1. «Сохранение и генетический мониторинг генофондов человека, животных, растений и микроорганизмов» 2. «Базы данных о генофондах человека, животных, растений и микроорганизмов» 3. Фундаментальные исследования ОБН РАН «Генетические основы управления биологическими ресурсами». Тема: «Отечественные породы и популяции сельскохозяйственных животных — как ценные генетические ресурсы» 4. Разработка генетических основ сохранения биоразнообразия. Тема: «Генетическое разнообразие сельскохозяйственных животных» 5. Динамика генофондов растений, животных и человека. Тема: «ДНК-мониторинг генофондов и популяций животных в связи с задачами селекции и изучением филогении» 6. «Создание биотехнологических тест-систем для использования в программах по оздоровлению крупного рогатого скота в отношении лейкоза и улучшения качества молока» 7. «Генетический мониторинг аборигенных пород доместицированных животных России». 8. Программы «Старт 06». 9. Подпрограммы «Генофонды и генетическое разнообразие» программы Президиума РАН «Биологические разнообразие». 10. Гранта поддержки ведущих научных школ (школа И.А. Захарова-Гезехуса — НШ-10122.2006.4). 11. Госконтракг № 02.740.11.0281 от 07.07.2009 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

Объем и структура работы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Столповский, Юрий Анатольевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании выполненных исследований предлагается концепция и принципы генетического мониторинга для сохранения отечественных пород сельскохозяйственных видов животных.

Предлагаемая нами концепция генетического мониторинга генофондов доместицированных видов основана на семи взаимосвязанных блоках и включает в себя: фенетический, биохимический, цитогенетический, молекулярный, зоотехнический, ветеринарный и математический методы оценки генофондной изменчивости. Мониторинг генофондов сельскохозяйственных видов должен отвечать трем основным требованиям. Во-первых, способствовать сохранению качественного разнообразия и структуры генофондов пород (популяций). Во-вторых, иметь дело с генетическими системами, данные по изменчивости которых можно использовать при подборе генотипов таким образом, чтобы добиться их репрезентативности при минимальной численности. В-третьих, методы мониторинга должны дополнять друг друга, сочетать в себе относительную простоту и воспроизводимость с наибольшей результативностью.

Мониторинг (от латинского слова monitor — напоминающий, надзирающий) — система наблюдений, оценки и прогноза состояния различного рода процессов, происходящих в разных сферах: от биологии до социологии. В нашем случае речь идет о генетическом мониторинге, который является частью биологического или экологического мониторинга. Основными объектами биологического мониторинга являются популяция, вид, экосистема, биосфера. С помощью генетического мониторинга отслеживают меж- и вну-трипопуляционные генные потоки. Специфика мониторинга при сохранении пород доместицированных видов заключается в том, что объектом долговременного контроля являются внутри- и межпородное генетическое разнообразие, оценка и прогнозирование его динамики, определение оптимума и пределов допустимых изменений. Генетический полиморфизм (фенов, структурных генов, полилокусных последовательностей ДНК, хромосомных и геномных мутаций) маркирует генетическую структуру породы и тем самым становится генетическим ориентиром при сохранении генофонда редких и исчезающих пород.

При общепризнанном мнении, что мониторинг особенно важно проводить в малочисленных стадах или в тех популяциях, где одна порода замещается другой, принципы такого рода исследований нельзя считать достаточно разработанными. На наш взгляд, определение основных положений, элементов, структуры, методов генетического мониторинга должно стать ключевым звеном в программах по сохранению и улучшению генофонда одомашненных животных.

При сохранении пород in situ основная задача состоит в том, чтобы сохранить специфические генные комплексы или сбалансированную систему генов, которые обуславливают фенотипические породные характеристики, связанные с экстерьерными особенностями, продуктивностью, жизнеспособностью, резистентностью животных. Именно вышеперечисленные особенности, отличающие местные породы от широко распространенных импортных пород, необходимо сохранять в генофондных хозяйствах.

Очевидно, что без тщательного контроля, систематического наблюдения, разработки методов прогноза за состоянием генофонда пород невозможно смоделировать процесс разведения и выбрать оптимальную программу сохранения in situ редких исчезающих и малочисленных пород животных. Для этого необходимы четкие критерии и эффективные средства оценки. Генетический мониторинг может носить локальный характер, то есть исследование конкретных стад, популяций в породе, или иметь глобальную задачу, когда контролируется все породное разнообразие региона, страны.

Предлагаемая нами концепция генетического мониторинга для генофондных (редких и исчезающих) пород и породного разнообразия в целом основана на семи блоках, тесно связанных между собой и образующих единую многоуровневую систему контроля, наблюдения, прогнозирования и в дальнейшем на основе полученных данных, управления процессом сохранения (рис. 74).

Рисунок 74. Концепция и принципы генетического мониторинга для гено-фондных животных

Первый блок — это мониторинг фенов и структурных генов. Феиетиче-ский метод подразумевает выявление и контроль за генетически детерминированными дискретными (альтернативными) признаками (фенами) (Тимофеев-Ресовский др., 1973; Яблоков и др., 1988). У сельскохозяйственных животных можно перечислить десятки дискретных вариаций признаков, контролируя которые возможно поддержание уникальности генофонда породы в широком диапазоне морфологической изменчивости, что соответствует решению задачи сохранения и поддержания генетического разнообразия в популяциях домашних животных (Столповский, 1997).

Структурные гены несут информацию о последовательности аминокислот в белковой молекуле. Одомашненные виды обладают достаточно высоким полиморфизмом по структурным генам. Оценка полиморфизма электрофоре-тических вариантов белков и ферментов, а также эритроцитарных антигенов позволяет оценить их распределение и установить вовлеченность в эволюцию пород, проводить индивидуальную паспортизацию, выводить генетически маркированные линии и контролировать происхождение животных. Сочетание им-муногенетической оценки генетического сходства между особями с анализом их генотипов повышает эффективность селекционной работы-(Максименко и др., 2005). Более того, исследования белкового полиморфизма различных пород показало, что с их помощью можно определить пространственную и временную подразделенность генетической структуры популяций, а также ее дифференциацию между коммерческими и местными породами (Глазко и др., 1996, 2000). Генотипирование моногенных локусов, с известной иммунной и биохимической функцией, позволяет выявлять пути межпородных взаимодействий в процессах их распространения и преобразования.

Второй блок — мониторинг генофонда с помощью ДНК-маркеров, которые можно разделить на два класса: монолокусные (STMS, SNP, SSCP) и мультилокусные (RAPD, AFLP, ISSR) маркеры. Микросателлиты STMS (Sequence Tagged Microsatellite Site) относятся к диспергированным тандемно-повторяющимся последовательностям (ди-, три- и тетрануклеотидам). По многочисленным микросателлитным локусам в геномах доместицированных видов выявлен высокий уровень полиморфизма, что позволило ISAG (International Society for Animal Genetics) рекомендовать их для индивидуального генотипи-рования и паспортизации пород крупного рогатого скота, лошадей и т.п. (Сули-мова, 1993).

Мультилокусные маркеры основаны на полимеразной цепной реакции с применением одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD — Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), праймеров с искусственно добавленными последовательностями (AFLP —Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR — Inter-simple-sequence-repeats). Среди перечисленных типов маркеров наиболее привлекателен метод ISSR-анализа. Для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК, что важно для малоизученных видов. Полученные паттерны ПЦР-продуктов как правило видо- и (что очень важно) породоспецифичны. Сравнительные исследования полило-кусных спектров фрагментов ДНК, фланкированных участками микросател-литных локусов (ISSR-PCR) привели к выделению групп маркеров, которые могут использоваться для описания «генофондного стандарта», «генофондного профиля», «породоспецифического паттерна» и «генетического оптимума» сохраняемых in situ пород (Столповский и др., 2010). Очевидно, что полилокус-ность маркеров ISSR-PCR удобна и, по-видимому, незаменима при межгеномных сравнениях.

Третий блок — мониторинг главных генов количественных признаков (Quantitive Trait Loci). Поиск генов, ассоциированных с продуктивностью, типирование известных генов, таких как: каппа и бета — казенны {CSN1,2), пролактин (PRL), альфа-лактальбумин (LALBA), гормон роста (GH), CAST (гены кальпаинов, контролирующее нежность мяса у КРС), CAPN3 (ген, связанный с регенерацией мышц у овец), FABP (ген, оказывающий влияние на сальные характеристики у свиней), CREB (фактор регуляции транскрипции, участвующий в адипогенезе), PPARA (рецептор, контролирующий внутриклеточный липидный метаболизм), PKAG3 (ген ассоциирован с содержанием гликогена в мышцах свиней), ген RYR-J — стресс-синдром у свиней (PSS) и др. Сюда же могут быть причислены гены иммунного ответа, такие как Bola DRB3, которые связаны с устойчивостью КРС к конкретным заболеваниям и общей резистентностью организма (Сулимова и др., 1995, Моисеева и др., 2006, FAO, 2007).

Четвертый блок — мониторинг генных и хромосомных мутаций. В международный список летальных дефектов у КРС занесено около 50 аномалий, большинство из которых обусловлены рецессивными мутантными генами. В целом, сужение внутрипородной изменчивости среди доместицированных видов за счет доминирования нескольких заводских пород приводит к стремительному распространению мутаций, возникающих у отдельных высокопродуктивных животных. Глобальное перемещение генофондов коммерческих пород (например, КРС), их интродукция в различные регионы требуют постоянного мониторинга таких мутаций как: BLAD (дефицит лейкоцитарной адгезии), Mulefoot (мулье копыто), Dumps (дефицит уридинмонофосфатсинтазы), С FM (комплексный порок позвоночника), Citrullinaemia (Цитрулинэмия) и др., а также скрининг классических робертсоновских транслокаций (например, 1/29), связанных с воспроизводительными функциями и жизнеспособностью. В то же время, известна мутация гена миостатина — nt821(delll), связанная с формированием мышечной массы, приводящая к феномену «двойной мускулатуры». У овец, также как и у крупного рогатого скота, выявлено несколько мутаций, связанных с увеличением мышечной массы, в частности, аутосомная мутация CLPG (calli pyge в переводе «прекрасные ягодицы»).

Пятый блок — мониторинг ветеринарных и зоотехнических параметров, подразумевает систему наблюдений за заболеваниями, анализ морфометриче-ских характеристик (экстерьера), хозяйственно-ценных признаков и их динамики, численность животных и качество поголовья. Возможно использование линейных методов оценки производителей по качеству потомства для получения несмещенных оценок и повышения темпов генетического улучшения породы по экономически ценным признакам (BLUP — метод) (Катков и др., 2001). Основная цель зоотехнического мониторинга — выделить уникальные свойства продуктивности той или иной породы и сохранять их в поколениях. С точки зрения ветеринарии — диагностика и отбор устойчивых к эпизоотиям особей на основе ветеринарных тестов, а также выявление основ резистентности местных пород к целому ряду заболеваний.

Генетический мониторинг взаимосвязан с математическим и компьютерным методами. Современный пакет компьютерных программ позволяет работать с большим объемом информации (данных, характеристик) и предоставляет возможность достаточно быстро рассчитывать коэффициенты инбридинга, эффективный размер популяции, проводить кластерный анализ, определять нарушения генетического равновесия, генетические дистанции, дивергенцию, оценивать процесс взаимодействия между генофондами внутри и между породами. Поэтому математический и компьютерный анализы являются неотъемлемой частью мониторинга, или шестым блоком, аккумулирующим систему наблюдения и контроля над сохранением in situ пород доместицируемых животных.

Седьмой блок — метод планирования или моделирования процесса разведения, обоснование и выбор оптимальной стратегии сохранения in situ. На основе полученных данных комплексного наблюдения за исследуемой популяцией, породой можно принимать аргументированные решения по статусу, сохранению как отдельных животных, так и породы в целом. И, главное, на научной основе создавать программы сохранения и сформулировать понятия генофондная ценность» особи, популяции, породы.

В генетическом мониторинге важную роль играет наличие системы ге-нофондных хозяйств, которая в настоящее время очень медленно, но формируется на территории Российской Федерации. Сегодня около 80 хозяйств имеют федеральный статус «генофондных», это очень мало для нашей страны. По нашему мнению для того, чтобы решить вопрос сохранения собственных генетических ресурсов в животноводстве, таких хозяйств должно быть от 600 до 1000. Наш расчет базируется на наличии российских селекционных достижений в государственном реестре РФ, где на 1.01.08 г. было зарегистрировано 198 отечественных пород среди 33-х одомашненных видов. Для полноценного сохранения и разведения породы необходимо 3-5 хозяйств, объединенных единой системой сохранения, селекционным планом и находящихся под систематическим контролем с помощью унифицированных и эффективных методов генетического мониторинга. Генофонд местных пород — это важнейший ресурс для настоящей и будущей селекции, который тесно связан с генетической и продовольственной безопасностью.

Предложенная концепция генетического мониторинга для сохранения in situ пород доместицированных видов животных аккумулирует в себе известные на сегодняшний день основные генетические инструменты, способные выявлять как генетические аномалии, так и большое количество генетических маркеров с различными функциями. Это, безусловно, будет стимулировать развитие так называемой «маркер опосредованной селекции» в животноводстве, когда селекционер может отбирать животных не только по фенотипу, но и по генотипу, анализируя молекулы ДНК, их полиморфизм и конкретные гены. Сек-венирование геномов основных доместицируемых видов позволяет надеяться, что генетический мониторинг развивается или скоро обогатится методами относительно нового направления генетики — геномики, которое изучает геном, индивидуальные гены и их экспрессию.

Генетический мониторинг позволяет сделать обоснованный выбор и получить так называемый «первый срез», а затем определить оптимум и пределы допустимых изменений. В дальнейшем накопленные знания по структурным генам, полилокусным спектрам ампликонов ДНК, мутационной изменчивости и т.п. у редких и исчезающих пород могут стать незаменимыми источниками информации для фундаментальных геногеографических исследований и при выборе генетических стратегий как для программ по сохранению пород, так и для создания новых селекционных достижений с определенными признаками.

Выполненные нами исследования позволяют сделать следующее заключение о наиболее важных и приоритетных направлениях действий на федеральном уровне для последовательной реализации стратегии сохранения «культурного биоразнообразия» России.

Сохранение и рациональное использование отечественного генофонда возможно при наличии федеральной политики или национальной стратегии и плана действий по сохранению «культурного» биоразнообразия, которых на сегодняшний день в России нет. Для реализации этой политики необходимы разработка, утверждение и исполнение комплекса научных исследований, организационно-хозяйственных и правовых мер, выделение материально-технических и финансовых средств.

России необходима национальная доктрина по сохранению «культурного» биоразнообразия. Необходима государственная программа, где найдут свое отражение стандартизированные руководящие принципы для каждого вида домашних животных по идентификации, научно-исследовательские проекты, контроль за сохранением ex situ и in situ, системы получения, анализа и хранения данных, создание банка информации, генов, эмбрионов, ДНК, любого другого биологического материала, межрегиональная и межведомственная координация и взаимодействие, пропаганда на местном и федеральном уровнях идеологии сохранения биоразнообразия, источники финансирования.

В связи с этим, возможно, потребуется создание новых государственных и общественных организаций, которые будут поддерживать целевую активность по решению проблем сохранения биоразнообразия. Эти структуры должны осуществлять связь с правительственными и неправительственными организациями так же, как и со сторонними организациями, работающими над проблемой генетических ресурсов животных внутри России и за ее пределами. Новые организации должны включать в себя криогенные банки генетического материала, банки генетических данных по животным, и активно способствовать созданию на территории России региональных историко-культурных центров агропарков) по сохранению агробиоразнообразия, что приведет к развитию эффективной партнерской сети из региональных экспертов, производителей и сформирует устойчивый рынок органических продуктов.

Необходимы программы обучения национальных кадров для выполнения различных задач, включая обучение аспектам генетики и менеджмента в животноводстве, разработку соответствующих планов создания, сохранения, рационального использования пород, приемы размножения, обработку данных, взятия образцов у животных-доноров, обработку спермы и эмбрионов, контроль состояния здоровья животных.

Учитывая вышеизложенное, предстоит решить следующие задачи:

• разработать законодательные акты, обеспечивающие сохранение традиционных методов природопользования, агроландшафтов, пород и сортов растений в историко-экологических центрах земледелия и животноводства;

• разработать и применить принципы комплексной инвентаризации генетического разнообразия ценных локальных пород для выработки стратегии и тактики использования и сохранения их геноресурсов;

• осуществить правильный (объективный) выбор видов, пород для сохранения;

• разработать генетические принципы мобилизации генетических ресурсов и осуществить сбор биологических образцов от наиболее ценных пород, породных групп на территории Российской Федерации;

• разработать комплексные системы наблюдения (мониторинг) или долговременное слежение за состоянием популяционных генофондов (внутри и межпородного и видового генетического разнообразия);

• провести оценку и прогнозирование динамики генофондов доместициро-ванных видов во времени и в пространстве;

• разработать и применить экспресс-методы комплексного изучения фено-типического разнообразия и выявить наиболее значимые центры разведения объектов «культурного» биоразпообразия;

• выявить геногеографические закономерности изменчивости, и характер наследования хозяйственно-полезных признаков;

• провести анализ структуры генофонда домашних животных по основным видам сельскохозяйственных животных;

• разработать программы по сохранению (управлению) генетических ресурсов домашних животных — in situ с учетом их биологических особенностей и зависимости от региональной специфики;

• разработать новые технологии надежного долговременного сохранения генетических ресурсов «культурного» биоразнообразия на основе создания криогенных банков, генотек (клонотек) — ex situ.

• создать федеральный информационный банк о генетических ресурсах «культурного» биоразнообразия (ценного для сельского хозяйства России), создать российскую информационную систему, которая войдет в глобальную информационную систему (Domestic Animal Genetic Diversity — DAD-IS) или сеть уникальных баз данных, охватывающих глобальную инвентаризацию, данные мониторинга ресурсов видов, пород, генобанков, организаций.

Формулируя наши предложения в области сохранения и исследования генофондов домашних животных или «культурного» биоразнообразия, мы понимали, что для их эффективной реализации необходимо решение целого ряда важных вопросов: от источников финансирования, экономического обоснования до создания и оптимизации законодательной базы сохранения генетических ресурсов. В нашей работе мы предложили пути для решения двух фундаментальных задач. Первая — создание научной базы для популяционно-генетического обоснования программ сохранения и мониторинга ресурсами генофондов доме-стицированных видов. Вторая — создание организационных основ для долгосрочной программы по устойчивому использованию и управлению российскими генетическими ресурсами сельскохозяйственных животных.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Столповский, Юрий Анатольевич, Москва

1. Адамец Л. Общая зоотехния. Сельхозгиз, Москва-Ленинград, 1933. 531 с.

2. Айала Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику. М.: Изд-во Мир, 1984. 230 с.

3. Алексанян С. М. Агробиоразнообразие и геополитика. СПб.: РАСХН. ВНИИР им. Н. И. Вавилова, 2002. 360 с.

4. Алексанян С. М. Государство и биоресурсы. СПб.: РАСХН. ВНИИР им. Н.И. Вавилова, 2003. 177 с.

5. Алтухов Ю.П. Внутривидовое генетическое разнообразие: мониторинг и принципы сохранения. // Генетика. 1995. Т. 31, № 10. С. 1333-1357.

6. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. 2-е изд. М.: Наука, 1989. 328 с.

7. Алтухов Ю.П., Захаров И.А., Столповский Ю.А. и др. Динамика популя-ционных генофондов животных / В кн. «Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях» / под ред. академика РАН Ю.П. Алтухова. М.: Наука, 2004. С. 110-294.

8. Алтухов Ю.П., Корочкин Л.И., Рычков Ю.Г. Наследственное биохимическое разнообразие в процессах эволюции и индивидуального развития // Генетика. 1996. Т. 32, № 6. С. 1450-1473

9. Алтухов Ю.П., Рычков Ю.Г. Популяционные системы и их структурные компоненты. Генетическая стабильность и изменчивость // Журнал общей биологии. 1970. Т. XXXI. № 5. С. 507-526.

10. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 38, № 9. С. 1173-1195.

11. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Курбатова О.Л. и др. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / Под ред. Ю.П. Алтухова. М.: Наука, 2004. 618 с.

12. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Рябова Е.А. и др. Факторы дифференциации и интеграции генетической структуры системы субпопуляций нерки в озере Азабачьем (р. Камчатка) // Журн. Обш. Биологии. 1983. Т. 44, № 3. С. 316-331

13. Аржанкова Ю.В. Изучение дерматоглифов носогубного зеркала у молочных пород скота в связи с продуктивностью и происхождением / дисс. Канд. с\х наук. Великие Луки. 2002. 129 с.

14. Банникова Л.В., Зубарева Л.А. Генетическая структура некоторых аборигенных и заводский пород крупного рогатого скота (Воз 1аигиз) Евразии // Генетика. 1995. Т. 31, № 5. С. 697-708

15. Беляев Д.К. Проблемы и перспективы исследований по генетике и селекции животных // Генетика. 1987. Т. 23, № 6. С. 937-946.

16. Бердичевский Н.С., Машуров А.М., Сороковой П.Ф. и др. Проблема учета аллелофонда популяций сельскохозяйственных животных. Сообщ. IV. Генетическая характеристика скота пинцгау СССР по антигенам эритроцитов // Генетика. 1985. Т. 21, № 8. С. 1346-1351.

17. Боголюбский С.Н. Происхождение и преобразование домашних животных. М. Советская наука, 1959. 593 с.

18. Боронникова C.B. Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края. Афтореф. докт. дисс. Уфа. 2009.

19. Браунер A.A. (ред.) Животноводство: История животноводства в степной Украине. Одесса.: Всеукр. Госиздат, 1922. 341 с.

20. Букаров Н.Г. Использование полиморфизма антигенов эритроцитов и Главного комплекса тканевой совместимости в разведении и совершенствовании крупного рогатого скота // Дис. докт. биол. наук. Дубровицы. 1995. 300 с.

21. Вавилов Н.И. Селекция как наука. Теоретические основы селекции растений. М.-Л:: 1935.

22. Вавилов Н.И. Избранные труды. M.-JL: 1965.

23. Васин Б. Н. Генетика овец. В 4-х кн. М.: 1928-1932.

24. Вепринцев Б.Н., Ротт H.H. Стратегия сохранения животного и растительного мира земли // Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1991. С. 5-18

25. Веревочкин П.С., Едренин H.H. РГммуногенетика в селекции КРС. Куйбышев. 1988. 102 с.

26. Габидулин Э.М., Пилипчук Н.И. Лекции по теории информации. М.: МФТИ, 2007. 214 с.

27. Гайдышева В.Д. Эффективность гибридизации яков с шортгорном pi симментальским скотом Горного Алтая. Автореферат дисс. Канд. с.-х. наук. Фрунзе, 1968. 18 с.

28. Глазко В.И. Биохимическая генетика овец. Новосибирск.: Наука, 1985. 167 с.

29. Глазко В.И. Генетика изоферментов сельскохозяйственных животных. М.: ВИНИТИ, 1988. 212 с.

30. Глазко В.И. Амбросьева Е.Д., Подоба Б.Е., Созинов A.A. Сравнительный анализ изменчивости различных генетико-биохимических систем у сельскохозяйственных животных // Цитология pi генетика. 1992. №3. С. 40-48.

31. Глазко В.И., Созинов И.А. Генетика изоферментов животных и растений. Киев: Урожай, 1993. 568 с.34.

Информация о работе

Столповский, Юрий Анатольевич
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Популяционно-генетические основы сохранения ресурсов генофондов доместицированных видов животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы