Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервация семени для сохранения и рационального использования биоразнообразия овец

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервация семени для сохранения и рационального использования биоразнообразия овец"

00460 люэ

На правах рукописи &

ЛЕСИН Сергей Александрович

КРИОКОНСЕРВАДИЯ СЕМЕНИ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ И РАЦИОНАЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ ОВЕЦ

Специальность: 03.02.07-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 СЕН 2010

Дубровицы - 2010

00460684

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Букаров Нурмагомед Г аджикулиевич;

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится «1^/» июля 2010 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадем ии.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967)65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

член-корреспондент РАСХН БагировВугар Алинияз оглы

кандидат биологических наук Вареников Михаил Владимирович

Автореферат разослан « » июня 2010 года.

Ученый секретарь совета Д 006.013.03

ИВ. Гусев

1.ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Сохранение биоразнообразия животных с применением новых биотехнологических методов является важной задачей современной сельскохозяйственной науки (Эрнст JI.K. 2003; Багиров В.А. и др., 2004).

Одним из приоритетных направлений развития сельскохозяйственной науки является сохранение и рациональное использование генофонда животных (Алтухов Ю.П., 2004; Фисинин В.И. 2005).

Системный кризис в животноводстве России в 90-х годах прошлого столетия сопровождался значительным сокращением объемов производства продукции на фоне падения численности всех видов сельскохозяйственных животных (Фисинин В.И. 2005).

В этой связи овцеводство страны оказалось в очень сложном положении. В России, не так давно считавшейся овцеводческой державой, в период с 1991г. по 2009г. года произошло резкое сокращение поголовья овец с 58 млн. гол. до 22 млн. гол.

По данным ФАО общая численность овец в мире составляет по 1484 породам овец около 1060,2 млн. голов (World Watch List for domestic animal diversity, 2000). Сегодня в России остро стоит вопрос сохранения генофонда локальных и широко разводимых в стране пород овец мясного и комбинированного направления продуктивности (Дунин И.М. и др., 2004).

Интенсивное скрещивание аборигенных овец с более продуктивными культурными породами тонкорунного и мясного направления продуктивности привело к исчезновению ряда отечественных пород. В результате чего на сегодня их число сократилась с 85 до 40. Сохранилось 15 тонкорунных, 11 полутонкорунных и 14 грубошерстных пород, в том числе 10 аборигенных. Около 70% отечественных пород овец относятся к категориям сокращающихся, малочисленных и исчезающих.

На грани исчезновения находиться 6 пород, 18 пород относиться к категории сокращающихся. Полностью исчезла опаринская порода — уникальная северная овца, созданная методами народной селекции.

Потеря пород овец влечет за собой значительное уменьшение генетического разнообразия этого вида сельскохозяйственных животных, и соответственно возможностей племенной работы. В этой связи назрела необходимость сохранения и рационального использования генетического разнообразия разных пород овец.

Целью диссертационной работы является совершенствование существующих и разработка новых биотехнологических способов сохранения и рационального использования генетических ресурсов овец.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: -выяснить биологические особенности, а также устойчивость при замораживании-оттаивании семени домашних и диких видов рода Ovis полученного разными методами: эякуляцией, электроэякуляцией и извлечением из эпидидимиса;

-усовершенствовать метод криоконсервации семени баранов, унифицировав его применительно для домашних и диких видов рода Ovis; -получить семя от снежного барана якутской популяции; -изучить морфологические и физиологические показатели сперматозоидов рода Ovis до и после криоконсервации;

-создать криобанк генетического материала домашних и диких видов рода Ovis;

-получить межвидовых гибридов снежного барана и домашней овцы; -провести сравнительную цитогенетическую и молекулярно-генетическую характеристику овец и их диких сородичей с использованием прикладных ком пьютерных программ;

Научная новизна. Выяснено, что эпидидимальное семя баранов сохраняет оплодотворяющую способность и генетическую полноценность в процессах глубокого замораживания и оттаивания - от его использования получено биологически полноценное потомство. Доказана возможность получения жизнеспособного потомства при гибридизации видов с разным числом хромосом в кариотипе - домашней овцы (2п=54)с якутским снежным бараном (2п=52). Установлены биологические различия эякулированных, электроэякулированных и эпидидимальных сперматозоидов. Дана сравнительная цитогенетическая и молекулярно-генетическая характеристика представителей рода Ovis.

Практическая значимость. Разработан фракционный метод получения эпидидимального семени от диких видов животных. Впервые в России создан криобанк семени домашних и диких видов рода Ovis. Впервые получены межвидовые гибриды от замороженно-оттаянного эпидидимального семени снежного барана якутской популяции и овцы романовской породы. Гибриды могут быть использованы для одомашнивания снежного барана при создании полярного овцеводства. Метод криоконсервации семени успешно адаптирован для замораживания эпидидимального семени снежного барана. Разработан метод внутригрубного осеменения овецкриоконсервированным семенем.

Положения, выносимые на защиту:

- усовершенствованная и унифицированная криопротективная среда для глубокого замораживания эякулированных, электроэякулированных и эпвдидимальных сперматозоидов рода Ovis, позволяющая сохранить их биологическую полноценность и оплодотворяющую способность;

- фракционный метод получения и криоконсервации эпидидимального семени, как способ сохранения и рационального использования генетических ресурсов рода Ovis;

- криобанк генетического материала домашних овец и диких видов рода Ovis;

- метод внугритрубного осеменения овец микродозами семени, как способ рационального использования и мультитиражирования уникальных генотипов;

цитогенетический и молекулярно-генетический анализ с использованием прикладных компьютерных программ, для отбора генетически полноценных особей при сохранении генетических ресурсов овец;

- получение межвидовых гибридов для создания новых селекционных

форм.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научных конференциях (Москва, Пущино, Дубровицы). По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 1 в рекомендованном ВАК РФ журнале.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 15 рисунков. Библиографический список содержит 158 источников, в том числе 77 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2006-2010гг. в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН, в ООО «Октябрьская» Пронского района Рязанской области, в Оймяконском районе Республики Саха (Якутия), в Республике Таджикистан.

Опыты проводили на разных породах овец (романовская, куйбышевская, эдильбаевская, гиссарская) и их помесях, были использованы 50 самцов в возрасте старше 2 лет. Для исследований по разработке метода криоконсервации семени были отобраны бараны, обладающие выраженными хозяйственно полезными признаками, здоровые, с крепкой конституцией, хорошо проявляющие половые рефлексы. Режим использования самцов - 2 взятия в неделю по 2 эякулята.

Семя от домашних баранов брали традиционным методом, с помощью искусственной вагины (Милованов В. К., 1962), от баранов диких видов методом электроэякуляции или извлечением сперматозоидов из эпидидимиса.

Методика получения эпидидимальных сперматозоидов включает в себя несколько этапов: отстрел барана, извлечение семенников из мошонки убитого животного, отделение эпидидимиса от семенника; препарирование эпидидимиса; выделение сперматозоидов.

Сохранение генетических ресурсов рода Ovis

4

I

Получение межвидовых гибридов методом внутритрубного осеменения овец

Сравнительный цитогенетический молекулярно-генетический анализ гибридов и исходных видов

Рис. 1. Схема проведения опытов

Подсчитывали концентрацию сперматозоидов с помощью компьютерных прикладных программ. Замораживание семени проводили на охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластине (Ющенко Н.П., 1968). Оттаивание семени осуществляли сухим методом с помощью оттаивателя, предложенного Кононовым В.П. и Нарижным А.Г.(1986).

После оттаивания оценивали сперматозоиды при +37°С путём определения подвижности через каждые 2 часа инкубации, а выживаемость -по полупериоду снижения подвижности (Милованов В.К. и др. 1981). Кроме того, проводили оценку морфологической сохранности акросом акроскопическим методом (Соколовская И.И., 1980).

Семя, имеющее подвижность не ниже 30%, полупериод выживаемости не менее 3 часов и более 50% сперматозоидов с морфологически интактными акросомами, использовали для осеменения овец в состоянии охоты, выявляемой вазэктомированным самцом.

Семя вводили во время охоты однократно в дозе 0,25 мл, содержащей примерно 20 млн. подвижных сперматозоидов.

Для рационального использования семени диких видов нами была применена методика внутритрубного осеменения микродозами криоконсервированного семени. При этом отбирали маток в состоянии естественной охоты.

Цитогенетические и молекулярно-генетические исследования проводили на гибридных потомках и исходных видах. Материалом для цитогенетического анализа служили лимфоциты периферической крови, полученные стерильно из яремной вены. В качестве митогена использовали коноковалин А (КоА производства фирмы ПанЭко, Москва). Молекулярно-генетический анализ проведен с использованием 11 микросателлитных локусов.

Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения MS Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Усовершенствование метода замораживание семени баранов

Усовершенствование метода криоконсервации семени состояло в разработке криопротективной среды, унифицированной для эякулированного и эпидидимального семени, полученного от баранов разных видов рода Ovis. Для этого методами геометрических и арифметических рядов было найдено соотношение основных компонентов.

В качестве неэлектролита нами была использована лактоза, как дисахарид, обладающий высокими антиоксидантными свойствами и способный особо прочно связывать свободную воду.

Как электролитную часть среда использовали трис-цитратный буфер, зарекомендовавший себя как устойчиво поддерживающий стабильность концентрацию водородных ионов при охлаждении семени за счет сопряженного подавления констант диссоциации трис-катиона и основных анионов (Кононов В.П.,1977). В результате этих исследований была разработана среда следующего состава с pH 7,05 (табл. 1).

Таблица 1

Состав среды для криоконсервации эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов баранов рода Ovis

Ингредиенты Химическая формула Молекулярная масса Количество вещества

Лактоза С^НггОп'НгО 360,32 2,17 г

Лимонная кислота СбН807*Н20 192,1 1,52 г

Трис сл„ж>3 121,1 2,74 г

Желток куриного яйца 15,0 мл

Глицерин СзН80з 92,09 4,0 мл

Вода бидистиллированная НзО 18 до 100мл

Результаты исследования по нахождению оптимальных концентраций криопротектора в связи с характеристиками биологической полноценности оттаянного семени показали, что оптимальная концентрация глицерина составляет 4%.

3.2. Фракционное получение эпидидималыюго семени

С целью сохранения и рационального использования диких видов овец нами был разработан метод фракционного получения эпидидимального семени, позволяющий увеличить количество получаемого генетического материала.

Суть метода заключается в следующем: хвост эпщщцшжа отделяют от семенника и осторожно освобождают от оболочек и кровеносных сосудов, оставляя чигтый клубок извитого кагала, заполненного сперматозоидами. Через надрезы кашльшв э пидидим пса получают свободно вытекающую первую фракцию.

После освобождения от первой фракции извитой канал эпидидимиса измельчают ножницами, получившуюся массу смешивают со средой и через стеклянный фильтр отделяют от кусочков эпидидимальной ткани жидкость, содержащую сперматозоиды - вторую фракцию.

Как видно из данных таблицы 2, эпидидимальное семя второй (дополнительной) фракции отличается от первой только концентрацией сперматозоидов - она ниже в три раза. В других случаях это соотношение может быть иным, в зависимости от степени разбавления измельченной ткани протока эпидидимиса средой для осуществления фильтрации. Что касается других характеристик;, то существенных различий между фракциям и не было.

Таблица 2

Основные характеристики первой и второй фракций эпидццимального _семени снежного барана __

Показатели Первая фракция Вторая фракция

Объем чистого эпидидимального семени из одного придатка, мл 3 5

Общее количество сперматозоидов, млрд. 23,5 12,3

Доля фракций в общей сумме эпидидимальных сперматозоидов, % 66 34

Концентрация сперматозоидов после разбавления, млрд. 7,8 2,5

Подвижность свежеполученных сперматозоидов,% 65+1,2 69+2,3

Подвижность сперматозоидов после разбавления,% 90+1,8 87+1,4

Подвижность сперматозоидов после эквилибрации 86+2,8 83+3,1

Подвижность семени после замораживания-оттаивания,% 45+0,8 38+1,9

Сохранность акросом, % 69+2,4 68+3,4

Таким образом, вторая фракция увеличивает число полученных эпидидимальных сперматозоидов в среднем на 34%.

Для рационального использования и сохранения генетических ресурсов овец были одновременно заморожены сперматозоиды из тела, головки эпидидимиса и тестикулярные. Замораживание эпидидимальных и тестикулярных сперматозоидов открывает новые перспективы в направлении сохранения и рационального использования генетических ресурсов овец.

3.3. Сравнительная оценка разных методов получения семени

Сравнительный анализ характеристик сперматозоидов в эякулированных, полученных электроэякуляцией и эпидидимальных (суммы фракций) приведен в таблице 3.

Таблица 3

Характеристики семени домашнего барана, полученного разными способами

Семя

Показатели оценки, % эякулиро- электроэякули- эпидиди-

ванное рованное мальное

Подвижность свежевзятого семени 90+1,8 85+2,1 68+2,3

после разбавления 84+2,0 80+1,7 80+1,7

после эквилибрации 80+1,2 76+2,2 77+2,0

после оттаивания 45+1,7 42+2,1 43+2,1

Сохранность акросом 68+2,1 65+3,2 62+2,7

Анализ данных таблицы 3 показывает, что эпидидимальное семя несколько отличается от эякулированного и электроэякулированного. В первом случае подвижность сразу после получения существенно ниже, чем в остальных. Однако, если в эпидидимальном подвижность резко возрастает после эквлибрации, то в эякулированных, взятых с помощью искусственной вагины или электроэякулятора, она снижается. Это связано с тем, что концентрация сперматозоидов в эпидидимальном семени, не разбавленном секретами добавочных половых желез, более чем в 10 раз превосходит концентрацию в эякулированном. Вследствие этого сперматозоиды испытывают острый дефицит кислорода и вынуждены обеспечивать энергетический обмен (синтез АТФ) не дыханием, а гликолизом. При этом, как известно, продукт гликолиза молочная кислота подавляет подвижность (Милованов В.К., 1962). Эквилибрации семени предшествует разбавление его нейтральной буферной средой, снимающее кислотную инактивацию подвижности.

По остальным биологическим критериям семя взятое разными способами не различается. Это дает основание для заключения, что биологическая полноценность семени не зависит от способа его получения.

В исследованиях по получению семени в искусственную вагину возникли проблемы с приучением баранов-производителей. При взятии семени с помощью электроэякулятора наблюдали случаи загрязнения его мочой, что является недостатком данного метода. Для получения семени от диких баранов пока безальтернативным методом является получение эпидидимального семени.

3.4. Сравнительный анализ кариотипов овец

Род бараны (Ovis Linnaeus, 1758), относящийся к отряду парнокопытных (Artiodactyla), к семейству полорогих (Caprinae) включает в себя несколько видов: Азиатский муфлон (Ovis orientalis), от которого пошла домашняя овца (Ovis orientalis aries), Европейский муфлон (Ovis musimon), Уриал (Ovis vignei), Архар, горный баран (Ovis ammon), Снежный баран (Ovis nivicola), Баран Далля (Ovis dalli), Толсторог (Ovis canadensis).

Виды баранов различаются и по количеству хромосом: у камчатского снежного барана - 2п=52, у снежного барана канадского подвида - 2п=54, у муфлонов - 2п=54, у архаров - 2п=56, у уриалов - 2п=58.

Кариотип домашней овцы содержит 27 пар хромосом. Из них 3 пары аутосом метацентрические, а 23 пары акроцентрики. Y-хромосома -метацентрик, Х-хромосома - крупный акроцентрик.

Рис.2. Кариотип домашней овцы. Самец. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза.

Анализ дифференциальной структуры хромосом овцы свидетельствует, что хромосома 1-й пары у О. Aries L. Соответствует 1 и 3;2-2и8;3-5и 11 парам хромосом В. Taurus L. И С. Hircus L. (Яковлев А.Ф., 1989).

и IIИII

4

|| А# II •• **

и

§* • * т» ***

mm

•ь* * «

i'S

w

Рис. 3. Метафаза и кариотип камчатского снежного барана. Самец. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза.

Однако проведенный Марзановым Н.С. и Кленовицким П.М. (1998, 2001) анализ распределения 147 общих для двух видов структурных генов и сателлитов на хромосомах показал, что у этих видов существует 36 общих групп сцепления. Этому соответствуют 10 межхромосомных перестроек, приведших к перегруппировке генетического материала в ходе эволюционного расхождения данных видов.

В ВИЖе в рамках работ по гибридизации полорогих был кариотипирован камчатский подвид снежного барана (рис. 3). В отечественной литературе по систематике выделяют обычно единый вид снежного барана (толсторога) О. Canadensis. Кариотип О. Canadensis идентичен хромосомному набору домашней овцы. Однако камчатский снежный баран (О. Nivicola nivicola) отличается от канадского толсторога по числу хромосом. Диплоидный набор его содержит 52 хромосомы. Половые хромосомы О. Nivicola nivicola идентичны половым хромосомам домашней овцы (рис. 3). Проводится работа по изучению кариотипа у снежного барана якутской популяции.

3.5. Молекулярно-генетический анализ диких и культурных видов овец

Групповое сравнение трех пород овец - романовской, эдильбаевской и куйбышевской в количестве 7 голов от каждой породы с двумя особями дикой формы, представленными самцами архара, выполненное на основе анализа 11 микросателлитных маркеров, показало некоторую обособленную группировку домашних пород овец от их диких предков (рис. 4).

artiarl

arhar2

ROMANOV

EDILBAJ

KUJBYSHEV

0.1

Рис.4. Дендрограмма генеалогического родства исследуемых пород овец

Не было обнаружено существенной разницы в генетических дистанциях между архарами и домашними представителями рода Ovis (табл. 4).

Таблица 4

Генетические расстояния между исследуемыми породами овец

Порода Романовская Эдиьбаевская Куйбышевская

Романовская *

Эдильбаевская 0,4456 #

Куйбышевская 0,4734 0,4913 *

Архар 0,7116 0,5825 0,5854

Как показано в таблице 4, эдильбаевская порода наиболее близка к диким представителям овец (58,25%), в то время как романовская порода оказалась самой удаленной от архара (71,16%).

Анализ структуры генеалогического дерева (рис. 5) показывает, что формирование кластеров и ветвей носило ярко выраженный породный характер.

0.1 1

Рис. 5. Дендрограмма индивидуального филогенетического родства овец различных пород

Как видно из рисунка 5, романовская порода овец формирует обособленный кластер (1), включающий всех представителей данной породы. Рядом с кластером 1 находится группа из четырех животных куйбышевской породы (2) к которой непосредственно примыкает ветвь, сформированная представителями дикой фауны вида Ovis (3). Овцы эдильбаевской породы совместно с некоторыми представителями куйбышевской породы образуют четвертый кластер.

3.6. Сохранение генетических ресурсов рода Ovis

С потерей разных пород и видов идет сужение генетического разнообразия. Каждая порода и вид обладает уникальным набором генов -генофондом, который во всей полноте представлен лишь в некоторой совокупности особей.

В настоящее время 30% пород овец оказались на стадии исчезновения (Shand H., 1997; The Global Strategy for the Management of Farm Animal Genetic Resources, 1999). В связи с чем возникала необходимость создания криобанка генетического материала овец.

3.6.1. Создание криобанка семени рода Ovis

На базе Всероссийского НИИ животноводства создан криобанк семени овец разных пород и снежного барана якутской популяции. Банк постоянно пополняется и к настоящему времени в нем накоплено более четырёх тысяч доз четырёх пород овец (табл. 5).

Таблица 5

Показатели семени баранов разных пород, заложенного в крнобанке

Показатели Породы

Романовская Куйбышевская Эдильбаевская Гиссарская

Накоплено

замороженного 1880 300 935 900

семени, доз

Подвижность

свежевзятого 93+1,7 82+2,7 87+2,2 90+1,8

семени, %

Подвижность

после 45+1,5 35+2,5 42+1,5 42+2,6

оттаивания, %

Сохранность акросом % 68+2,3 59+2,3 64+2,7 67+3,2

Резервы криобанка уже в настоящее время могут быть использованы в исследовательских работах по совершенствованию существующих и выведению новых пород. Однако главная задача состоит в сохранении

разнообразия генофонда овец страны. В настоящее время среди пород, генетические ресурсы, которых заложены в банке, под угрозой, если не исчезновения, то минимизации поголовья находится романовская порода. Так что накопленные к настоящему времени около двух тысяч доз семени могут совсем скоро оказаться необходимыми для освежения крови в постоянно уменьшающейся популяции.

Создание банка семени эякулированного и эпидвдимального семени баранов-производителей (Ovis), это надежный вариант по сохранению генетического биоразнообразия.

3.6.2. Сохранение генетических ресурсов снежного барана

Среди диких видов рода Ovis сохранение генетических ресурсов в виде замороженного семени начато нами со снежного барана якутской популяции. Этот вид занесен в Красную книгу и охраняется под эгидой различных международных организаций, поэтому создание банка семени - актуальная задача в работе по сохранении этого вида.

В нашу задачу входило не только получение гибридов, но и создание криобанка генетического материала снежного барана. С этой целью была организована экспедиция в Оймяконский район Республики Саха (Якутия), в результате которой получено эпидидимальное семя якутского снежного барана. Семя на месте было подвергнуто криоконсервации, доставлено во ВНИИ животноводства и заложено в криобанк.

Количество и оценочные характеристики семени якутского снежного барана, заложенного в криобанке, приведены в таблице 6.

Таблица 6

Показатели семени якутского снежного барана, заложенного в криобанке ВНИИ животноводства

Показатели Первая фракция Вторая фракция

Количество заложенного семени, доз 273 185

Объем одной дозы, мл 0,25 0,25

Общий объём заложенного семени, мл 68,25 46,25

Подвижность свежеполученного семени, % 65+1,2 69+2,3

Подвижность после замораживания-оттаивания, % 45+0,8 38+1,9

Сохранность акросом, % 69+2,4 68+3,4

Из данных таблицы 6 видно, что эпидидимальное семя снежного барана, замороженное по унифицированной технологии, по своим биологическим характеристикам ни в чём не уступает семени домашних баранов.

Таким образом, создание криобанка семени снежного барана позволяет сохранить в качестве резерва высокоценный генетический материал

биоразнообразия овец. Это открывает большие перспективы для мультитиражирования и максимальной интенсификации использования генетически уникальных производителей в ближайшее время и в будущем.

Перспективы данной работы обусловлены еще и тем, что разработанные и усовершенствованные методы криоконсервации генетического материала используются для сохранения биоразнообразия малочисленных, исчезающих и аборигенных популяций овец. В будущем в условиях постоянного изменения внешней среды овцы или их отдельные желательные гены могут быть успешно использованы для совершенствования существующих и создания новых высокоэффективных селекционных форм.

3.7. Морфометрический анализ сперматозоидов снежного барана и домашней овцы

Сравнение морфометрических показателей сперматозоидов позволяет получить наиболее полное представление об их биологических особенностях. Результаты этих исследований приведены в таблице 7.

Таблица 7

Морфометрическая характеристика сперматозоидов _у разных видов рода Ovis__

■-—-Вид животного Показатели ~~ —------- Снежный баран Баран домашний

Морфология сперматозоидов i ]

Длина сперматозоидов 60,5+0,34 59,7+0,12

Длина головки сперматозоидов 8,7+0,07 8,34+0,05

Ширина головки сперматозоидов 4,12+0,08 4,52+0,04

Площадь головки сперматозоидов 29,4+0,21 30,7+1,33

Коэффициент округлости головки сперматозоидов 1,11+0,02 1,17+0,001

Данные таблицы 7 показывают, что сперматозоиды снежного барана по основным морфометрическим характеристикам существенно не отличаются от сперматозоидов домашних баранов.

3.8. Получение межвидовых гибридов снежного барана и романовской породы овец с использованием метода внутритрубного осеменения

В дальнейшем замороженное семя Ovis nivicola lydekkeri было использовано нами для отдаленной гибридизации с целью получения новых селекционных форм. Эта работа лежит в основе исследований по созданию овцеводства в условиях Севера РФ.

Для рационального использования генетического материала при получении межвидовых гибридов нами применен метод внутритрубного осеменение овец. Были оперированы и внутригрубно осеменены 3 овцематки романовской породы - одна из них принесла двойню и одна абортировала 2-х ягнят на 4-м месяце. Эта работа лежит в основе последующих исследований по созданию полярного овцеводства

Рис. 6. Гибрид снежного барана и романовской породы овец полученный методом внугригрубного осеменения замороженно-оттаянным эпидидима-льным семенем.

Таким образам, предлагаемые нами подходы открывают новые перспективы для сохранения и рационального использования генетических ресурсов овец и являются основой в созданий новых высокоэффективных селекцио нны х ф орм.

Выводы

1. Установлено, что эпидидимальное семя якутского снежного барана обладает устойчивостью при замораживании-оттаивании, сравнимой с устойчивостью эякулированного и электроэякулированного семени домашних баранов. После криоконсервадии и оттаивания подвижность его сперматозоидов составляла 45%, а сохранность акросом - 69%.

2. Для криоконсервадии и длительного сохранения семени якутского снежного барана может быть эффективно использован метод замораживания семени домашних баранов с применением разработанной нами унифицированной криопротективной среды.

3. Доказана возможность плодотворной межвидовой гибридизации особей с разным числом хромосом. В результате внутритрубного осеменения домашней овцы криоконсервированным эпидидимальным семенем якутского снежного барана получено полноценное потомство.

4. Биологическая полноценность глубокозамороженного семени домашних баранов и якутского снежного барана позволила создать криобанк семени этих видов, которые с успехом могут быть использованы для увеличения генетического разнообразия рода Ovis.

5. Создан криобанк семени баранов-производителей романовской, куйбышевской, эдильбаевской, гиссарской породы. Дана оценка криоконсервированного семени после оттаивания: подвижность сперматозоидов составляла в среднем 35 - 45%, при этом сохранность акросом варьировала от 59% до 68%. Получено жизнеспособное потомство от замороженного семени из криобанка.

6. Использование прикладных компьютерных программ позволяет в значительной мере повысить эффективность цитогенетического анализа.

7. Молекулярно-генетический анализ показал, что романовская порода овец формирует обособленный кластер, включающий всех представителей данной породы, и наиболее удалена от диких сородичей, а эдильбаевская порода наиболее близка к диким представителям овец.

Практические предложения

1. Для сохранения генетического разнообразия рода Ovis предлагаем унифицированную криопротекгивную среду следующего состава: лактоза -2,17 г, лимонная кислота - 1,52г, трис(оксиметил)аминометан основание - 2,74 г, глицерин - 4,0 мл, желток куриного яйца - 15 мл, вода бидистиллированная - 100 мл., позволяющая сохранять при замораживании-оттаивании биологическую полноценность полученных разными методами сперматозоидов домашних баранов и дикого якутского снежного барана.

2. При проведении комплекса работ по сохранению и рациональному использованию биоразнообразия овец рекомендуем проводить генетический мониторинг для отбора полноценных особей с использованием прикладных компьютерных программ.

3. Для получения, мультигиражирования и сохранения высокоценных, уникальных генотипов при создании новых селекционных форм предлагается использовать метод внутригрубного осеменения овец.

Список опубликованных работ

1. Багиров, В.А Сохранение и рациональное использование генофонда животных / В.А. Багиров, ШН. Насибов, ПМ. Кленовицкий, С.А. Лесин, ВА. Воеводин, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, ВВ. Калашников, ВА. Солошенко//Доклады РАСХН.- 2009.-№2.-С.37-40.

2. Багиров, В А. Биотехнологические метода сохранения и рационального использования генофонда редких и исчезающих видов животных / ВА. Багиров, Ш.Н. Насибов, С А. Лесин, ПМ. Кленовицкий, ЛК. Эрнст // Биофизика живой клетки. - 2008. - Т.9. - С.21-24.

3. Багиров, ВА. Сравнительный анализ сперматозоидов разных видов животных / ВА. Багиров, ШЛ. Насибов, ПМ. Кленовицкий, СА. Лесин, В А. Воеводин, Н.А. Зиновьева, Л .К. Эрнст // Материалы международной конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения». - Дубровицы. - 2008. -С.353-356.

4. Багиров, В А. Криобанк семени редких и исчезающих видов животных / ВА. Багиров, ШЛ. Насибов, С А. Лесин, ПМ. Кленовицкий, В А. Воеводин, Н.А. Зиновьева, ЛК. Эрнст // Материалы международной конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения». - Дубровицы. - 2008. - С. 479-480.

Издательство ВНИИ животноводства 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 4967)65-15-97

Сдано в набор 10.06.2010. Подписано в печать 11.06.2010 _Заказ № 16. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ВНИИ животноводства

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лесин, Сергей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Цель и задачи исследований.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

Апробация работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Зоологическая классификация и происхождение домашних овец.

1.2. Состояние мирового овцеводства.

1.3. Состояние, динамика и тенденции овцеводства в РФ.

1.4. Современное состояние биологического разнообразия в мире.

1.5. Сохранение биологического разнообразия животных.

1.6. Общие подходы к сохранению биоразнообразия.

1.7. Криоконсервация - один из методов сохранения и рационального использования биоразнообразия.

1.8. Генетические маркеры.

1.9. Цитогенетическая характеристика рода Ovis L.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Совершенствование криопротективной среды.

3.2. Усовершенствование метода замораживание эпидидимального семени баранов как способ сохранения генетического биоразнообразия рода

Ovis L.

3.3. Сравнительная оценка разных методов получения семени.

3.4. Сравнительный анализ кариотипов овец.

3.5. Молекулярно-генетический анализ диких и культурных видов овец.

3.6. Сохранение генетических ресурсов рода Ovis L.

3.7. Создание криобанка генетического материала баранов - производителей разных пород.

3.8. Сохранение генетических ресурсов снежнего барана.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Криоконсервация семени для сохранения и рационального использования биоразнообразия овец"

Актуальность темы

Сохранение биоразнообразия животных с применением новых биотехнологических методов является важной задачей современной сельскохозяйственной науки [6,11, 12, 81].

Одним из приоритетных направлений развития сельскохозяйственной науки в РФ и сопредельных государств является сохранение и рациональное использование генофонда животных [3].

Все расширяющееся распространение высокопродуктивных промышленных пород животных ведет к вытеснению генофонда малочисленных, аборигенных пород, являющимися носителями ценного генетического материала, который все еще остался невостребованным [30, 53, 72]. Обострению этого процесса способствовала и ситуация сложившаяся в России на рубеже веков.

Системный кризис в животноводстве России в 90-х годах прошлого столетия сопровождался значительным сокращением объемов производства продукции на фоне падения численности всех видов сельскохозяйственных животных.

В этой связи овцеводство страны оказалось в очень сложном положении. В России не так давно считавшейся овцеводческой державой, в период с 1991г. по 2009г. года произошло резкое сокращение поголовья овец с 58 млн. гол. до 22 млн. гол [12].

По данным ФАО общая численность овец в мире составляет 2351порода или около 1060,2 млн. голов [54, ,71]. Сегодня в России остро стоит вопрос сохранения генофонда локальных и широко разводимых в стране пород овец мясного и комбинированного направления продуктивности [22].

В прошлом столетии интенсивно шел процесс массовой метизации адаптированных к местным условиям аборигенных овец с более продуктивными культурными породами тонкорунного и мясного направления продуктивности. В результате на сегодня число отечественных пород сократилась с 85 до 40. Из них сохранилось 15 тонкорунных, 11 полутонкорунных и 14 грубошерстных пород, в том числе 10 аборигенных. Около 70% отечественных пород овец относится к категориям сокращающихся, малочисленных и исчезающих [11].

На грани исчезновения находиться 6 пород, 18 пород относиться к сокращающимся. В XX веке были потеряны ряд ценных аборигенных пород Численность асканийской породы овец на конец 2003г. составила лишь 2700 гол., вятской 1100 гол., горьковской 300 гол., кучугуровской 100 гол, тушинской 1300 гол. Полностью исчезла опаринская порода — уникальная северная овца, созданная методами народной селекции [20].

Потеря многих пород овец влечет за собой значительное уменьшение генетического разнообразия этого вида сельскохозяйственных животных. В этой связи назрела необходимость сохранение и рациональное использования генетического разнообразия разных пород овец.

Цель и задачи исследований:

Целью диссертационной работы является совершенствование существующих и разработка новых биотехнологических способов сохранения и рационального использования генетических ресурсов овец.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: выяснить биологические особенности, а также устойчивость при замораживании-оттаивании семени домашних и диких видов рода Ovis L. полученного разными методами: эякуляцией, электроэякуляцией и извлечением из эпидидимиса; усовершенствовать метод криоконсервации семени баранов, унифицировав его применительно для домашних и диких видов рода Ovis L.; получить семя от снежного барана якутской популяции; изучить морфологические и физиологические показатели сперматозоидов рода Ovis L. до и после криоконсервации; создать криобанк генетического материала домашних и диких видов рода OvisL.; получить межвидовых гибридов снежного барана и домашней овцы; провести сравнительную цитогенетическую и молекулярно-генетическую характеристику овец и их диких сородичей с использованием прикладных компьютерных программ

Научная новизна.

Выяснено, что эпидидимальное семя баранов сохраняет оплодотворяющую способность и генетическую полноценность в процессах глубокого замораживания и оттаивания - от его использования получено биологически полноценное потомство. Доказана возможность получения жизнеспособного потомства при гибридизации видов с разным числом хромосом в кариотипе -домашней овцы (2п=54) с якутским снежным бараном (2п=52). Установлены биологические различия эякулированных, электроэякулированных и эпиди-димальных сперматозоидов. Дана сравнительная цитогенетическая и молеку-лярно-генетическая характеристика представителей рода Ovis L.

Практическая значимость.

Разработан фракционный метод получения эпидидимального семени от диких видов животных. Впервые в России создан криобанк семени домашних и диких видов рода Ovis L. Впервые получены межвидовые гибриды от замороженно-оттаянного эпидидимального семени снежного барана якутской популяции и овцы романовской породы. Гибриды могут быть использованы для одомашнивания снежного барана при создании полярного овцеводства. Метод криоконсервации семени успешно адаптирован для замораживания эпидидимального семени снежного барана. Разработан метод внутритрубного осеменения овец криоконсервированным семенем.

Положения, выносимые на защиту:

- усовершенствованная и унифицированная криопротективная среда криоконсервации семени эякулированных, электроэякулированных и эпиди-димальных сперматозоидов рода Ovis L., позволяющая сохранить биологическую полноценность семени, оплодотворяющую способность сперматозоидов;

- фракционный метод криоконсервации эпидидимального семени как метод сохранения и рационального использования генетических ресурсов рода Ovis L.;

- криобанк генетического материала рода Ovis L.;

- внутритрубного осеменения овец, как способ рационального использования и мультитиражирования уникальных генотипов;

- цитогенетический анализ как критерии отбора генетически полноценных особей при сохранении генетических ресурсов овец, с использования прикладных компьютерных программ;

- получение межвидовых гибридов для создания новых селекционных форм.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научных конференциях (Москва, Дубровицы, Пущино). По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе в рецензированном журнале — 1.

Объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 15 рисунков. Библиографический список содержит 158 источников, в том числе 77 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лесин, Сергей Александрович

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что эпидидимальное семя якутского снежного барана обладает устойчивостью при замораживании-оттаивании, сравнимой с устойчивостью эякулированного и электроэякулированного семени домашних баранов. После криоконсервации и оттаивания подвижность его сперматозоидов составляла 45%, а сохранность акросом - 69%.

2. Для криоконсервации и длительного сохранения семени якутского снежного барана может быть эффективно использован метод замораживания семени домашних баранов с применением разработанной нами унифицированной криопротективной среды.

3. Доказана возможность плодотворной межвидовой гибридизации особей с разным числом хромосом. В результате внутритрубного осеменения домашней овцы криоконсервированным эпидидимальным семенем якутского снежного барана получено полноценное потомство.

4. Биологическая полноценность глубокозамороженного семени домашних баранов и якутского снежного барана позволила создать криобанк семени этих видов, которые с успехом могут быть использованы для увеличения генетического разнообразия рода Ovis L.

5. Создан криобанк семени баранов-производителей романовской, куйбышевской, эдильбаевской, гиссарской породы. Дана оценка криоконсервированного семени после оттаивания: подвижность сперматозоидов составляла в среднем 35 - 45%, при этом сохранность акросом варьировала от 59% до 68%. Получено жизнеспособное потомство от замороженного семени из криобанка.

6. Использование прикладных компьютерных программ позволяет в значительной мере повысить эффективность цитогенетического анализа.

7. Молекулярно-генетический анализ показал, что романовская порода овец формирует обособленный кластер, включающий всех представителей данной породы, и наиболее удалена от диких сородичей, а эдильбаевская порода наиболее близка к диким представителям овец.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для сохранения генетического разнообразия рода Ovis L. предлагаем унифицированную криопротективную среду следующего состава: лактоза -2,17 г, лимонная кислота - 1,52 г, трис(оксиметил)аминометан основание -2,74 г, глицерин - 4,0 мл, желток куриного яйца - 15 мл, вода бидистиллированная - 100 мл., позволяющая сохранить при замораживании-оттаивании биологическую полноценность полученных разными методами сперматозоидов домашних баранов и дикого якутского снежного барана.

2. При проведении комплекса работ по сохранению и рациональному использованию биоразнообразия овец рекомендуем проводить генетический мониторинг для отбора полноценных особей с использованием прикладных компьютерных программ.

3.Для получения, мультитиражирования и сохранения высокоценных, уникальных генотипов при создании новых селекционных форм предлагается использовать метод внутритрубного осеменения овец.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лесин, Сергей Александрович, Дубровицы

1. Айбазов М.М., Утина М.И. Биотехнологические методы воспроизводства овец // Современные достижения биотехнологии. Ставрополь. 1996. С.24-25.

2. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. — М.: Наука, 1989. 328с.

3. Алтухов Ю.П., Захаров И.А., Столповский Ю.А. и др. Динамика по-пуляционных генофондов животных // Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях М.: Наука. 2004. С. 110-294.

4. Арсеньев Д.Д. К проблеме сохранения овец романовской породы // Технологические проблемы сельскохозяйственного производства. Яросл. гос. с.-х. акад. 2006. 4.1. С.107-111.

5. Аузбаев С.А., Нургожин А.К. Проблемы криоконсервации семени баранов-производителей // Тезисы докладов Всесоюзного научно-технического совещания «Проблемы селекционно-племенной работы в животноводстве». М. 1990. С.138-139.

6. Багиров В.А. Генетические ресурсы животноводства // Животноводство России. 2008. №2. С. 10-12.

7. Бакай А.В., Перчихин Ю.А., Семенов А.С. Кариотипические исследования сельскохозяйственных животных. Методические указания. М.: МВА. 1986. 35 с.

8. Варнавский А.Н., Варнавская В.А. Разработка протектора для глубокого замораживания семени барана // Животноводство. 1978. №9. С.65-67.

9. Васенина О.В., Самигуллина Т.А. Селекционное значение аборигенных пород: О сохранении местных пород овец Саратовской области // Совершенствование племенных и продуктивных качеств животных и птиц. М. 1999. С.22-23.

10. Ю.Владимиров Н.И., Мороз В.А. К вопросу об аборигенных породах // Зоотехния. 2006. №7. С.9-10.

11. Генетические ресурсы в России и сопредельных странах. С.-Пб.: ФАОЛОНЕП и РАСХН. 1994. 556 с.

12. Генофонды сельскохозяйственных животных: Генетические ресурсы животноводства России / Отв. ред. И.А. Захаров; ИОГен РАН. М.: Наука, 2006. 462с.

13. Гилберт С. Биология развития. М.: Мир. 1993. В 3-х томах. Т. 1.228 с.

14. Графодатский А.С., Битуева JI.C. Гомология G окрашенных хромосом млекопитающих//Генетика. 1987. Т.23. № 1. С.95-104.

15. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Особенности эволюции хромосомных наборов ряда видов сельскохозяйственных млекопитающих / Сельскохозяйственная биология. 1981. Т.16. С.435-445.

16. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. Атлас. Новосибирск.: Наука. 1988. 127 с.

17. Дарий Г.Е. Действие неэлектролитов и электролитов на физиологическую полноценность семени быков при замораживании: Автореф.дис. к.б.н / ВИЖ. Дубровицы. 1977. 23с.

18. Дзуев Р.И. Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа. Нальчик: Эльбрус. 1998. 256с.

19. Дыбан А.П., Баранов B.C. Цитогенетика развития млекопитающих. М.: Наука. 1981. 344 с.

20. Ежегодник по племенной работе в овцеводстве и козоводстве в хозяйствах Российской Федерации. — Издательство ВНИИплем, 2008. 103с.

21. Енин В.П., Сеглинып А.К. Влияние различной обработки разбавителя и Сахаров на живчиков при замораживании // Животноводство. 1972. №9. С.80-81.

22. Ерохин А.И. Состояние овцеводства и меры по его стабилизации // Овцы, козы, шерстное дело. 2003. №4. С.2-22.

23. Ерохин А.И., Карасёв Е.А. Романовская порода овец. М.: МГУП, 2001.-119с.

24. Ерохин А.С. Регуляция овуляции и соотношение полов потомства у млекопитающих: Автореф. дис. к.б.н/ВИЖ. -Дубровицы. 1982. 22с.

25. Ерохин А.С. Физиологические аспекты криорезистентности спермы баранов и быков: дис.д-ра биол. наук: 03.00.13: защищена 12.04.94 / Еро-хин Анатолий Сергеевич, п. Дубровицы Моск. обл., 1994. 314с. Библиогр.: с.254-307.

26. Жиряков A.M. и др. Научные основы восстановления и развития романовского овцеводства в российской Федерации // Овцы, козы, шерстное дело. 2002. №4. С. 1-5.

27. Забелина М.В. К вопросу эффективного использования генофонда ценных локальных пород овец Поволжья // Овцы, козы, шерстяное дело. 2004. №4. С. 11-12.

28. Захаров И.А. Генетические аспекты проблемы сохранения биологического разнообразия домашних животных // Генетические ресурсы сельскохозяйственных животных: редкие и исчезающие породы. М.: Наука, 1992. С.5-10.

29. Захаров И.А. Генетические карты сельскохозяйственных животных. Информационно-справочные материалы. М.: 1993. 62 с.

30. Зиновьева Н.А. и др. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. Дубровицы. ВИЖ. 2002. 105 с.

31. ЗЗ.Зыкунов Н.П., Багиров В.А., Кононов В.П. и др. Методические рекомендации по внутритрубному осеменению свиноматок. М.: 2003. 36 с.

32. Иванов И.И. Избранные труды. М.: Колос. 1970. 319с.

33. Касымов К.Т. Биотехнологические методы размножения ценного генофонда овец в Казахстане: Использование трансплантации эмбрионов и искусственного осеменения // Аграрная наука. 2002. №2. С. 19-20.

34. Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Нгбодо Ж.В. и др. Использование прикладных программ обработки изображений, совместимых с Windows, в цитогенетических исследованиях. Дубровицы. ВИЖ. 2002. 35с.

35. Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Марзанов Н.С. и др. Генетика и биотехнология в селекции животных. М.: 2004. 238с.

36. Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Марзанов Н.С., Зиновьева Н.А. Генные карты сельскохозяйственных животных. Дубровицы. ВИЖ. 2003. 9 с.

37. Кленовицкий П.М.и др. Компьютерная обработка изображений в цитогенетике животных. // Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства». Быково. 2002. С.228-229

38. Кленовицкий П.М., Моисейкина JI.K., Живалев И.К. Лабораторный практикум по цитогенетике животных. Элиста. 1997. 48 с.

39. Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.К., Марзанов Н.с. Цитогенетика сельскохозяйственных животных. Элиста. 1999. 141 с.

40. Кленовицкий П. М. и др. Цитогенетика животных. М.: РАСХН. 2008. 82 с.

41. Кононов В.П. Дезоксирибонуклеиновые кислоты и липиды живчиков в связи с хранением семени вне организма. Автореферат дис. к.б.н. Дубровицы. 1969. 24 с.

42. Кононов В.П. Тепловое расширение живчиков при замораживании // Доклады ВАСХНИЛ. 1982. №5. С.31-34.

43. Кононов В.П., Голышев Н.А., Нарижный А.Г. Выход трансаминаз из живчиков как показатель оплодотворяющей способности // С.-х. биология. 1978. Т.13. №1.С.104-108.

44. Лушников В.П. О сохранении аборигенных пород овец // Овцы, козы, шерстное дело. 2002. №4. С.34-36.

45. МакГрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных. М.: Мир. 1986. 367 с.

46. Максименко В.Ф. и др. Селекционно-племенные мероприятия по сохранению и совершенствованию генофонда романовской породы овец. Ярославль. 2010. 136 с.

47. Марзанов Н.С., Саморуков Ю. В. Как нам спасти вымирающие виды животных//Животноводство России. 2003. №3. С. 8-9.

48. Марзанов Н.С. и др. Методические рекомендации по использованию генетических маркеров в разведении овец. Дубровицы. 2004. 44 с.

49. Марзанов Н.С. и др. Сохранение биоразнообразия. Генетические маркеры и селекция животных // Сельскохозяйственная биология. 2006. №4. С. 3-19.

50. Марзанов Н.С. и др. Генетические маркеры в теории и практике разведения овец. М.: 2010. 184 с.

51. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных. М. 1962. 695с.

52. Моисейкина Л.Г., Мачкаева Н.Т., Трофименко С.П. Проблема сохранения и возрождения аборигенных пород овец // Проблемы сохранения ирационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов. Элиста. 2004. С. 146-148.

53. Наук В.А. Структура и функция спермиев с.-х. животных при криоконсервации. Кишинев: Штиница, 1991. 199с.58.0ливан М.П. Зоология. Позвоночные. Изд-во «Росмен». М.: 1999.341 с.

54. Паронян И.А., Прохоренко П.Н. Методические рекомендации по сохранению генофонда малочисленных пород сельскохозяйственных животных. М.: РАСХН. 1998. 31с.

55. Паронян И.А., Прохоренко П.Н. Генофонд домашних животных России. СПб.: Изд-во «Лань», 2008. 352 с.

56. Платов Е.М. О причинах низкой суягности от замороженного семени//Овцеводство. 1970.-№8. С.25.

57. Платов Е.М. Криоконсервация спермы баранов. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. Л.: Агпропромиздат. 1988. 161с.

58. Платов Е.М. Теоретические и практические основы замораживания семени производителей сельскохозяйственных животных: дис.д-ра биол. наук п. Дубровицы Моск. обл., 1972. 327 с. Библиогр.: с. 284-327.

59. Сергеев Е.Г. Изменение статуса сохранности отдельных пород в генофонде норок (Mustela vison schreber, 1777) // Вестник ВОГиС. 2007. Т. 11. №1. С.228-232.

60. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. Т.1. Пер. с англ. М.: Мир. 1998. 373 с.

61. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. Т.2. Пер. с англ. М.: Мир. 1998. 391 с.

62. Смирнов, И.В. К теории глубокого охлаждения спермы // Животноводство. 1974. № 11. С. 65-70.

63. Соколовская И.И. Может ли замороженная сперма оплодотворять и давать нормальное потомство // Доклады ВАСХНИЛ. 1947. №6. С.21-23.

64. Состояние всемирных генетических ресурсов животных в сфере продовольствия и сельского хозяйства: Краткий отчёт / под ред. Д. Пиллинга и Б. Ришковски. Рим: ФАО. 2007. 37с.

65. Столповский Ю.А. Консервация генетических ресурсов сельскохозяйственных животных: проблемы и принципы их решения. М.: ИОГен РАН, 1997. 109с.

66. Сулимова Г.Е. и др. Методы управления генетическими ресурсами доместицированных животных / Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. М.: Товарищество научных изданий КМК. 2005. С. 331-340.

67. Тайшин В.А., Лхасаранов Б.Б. Возрождение генофонда бурятской аборигенной овцы // Сохранение биологического разнообразия в Байкальском регионе: проблемы, подходы, практика. Улан-Удэ, 1996. - Т.2. -С.25-26.

68. Технология криоконсервации семени баранов: Методические рекомендации. Дубровицы: ВИЖ, 1997. 24с.

69. Тишков А.А. Теория и практика сохранения биоразнообразия: К методологии охраны живой природы в России // Экологический вестник России. 2006. №11.С.З-17.

70. Фарид А.Э. Влияние различных Сахаров солей ЭДТУК и гипертонической среды на семя быка при глубоком охлаждении// Направления и новые результаты исследований по биологии воспроизведения. Дубровицы. 1974. С.66-69.

71. Шайдуллин, И.Н.Биологические особенности акклиматизации овец и гибридизации их со снежным бараном Ovis nivicola nivicola в условиях Камчатки: дис.д-ра биол. наук: 03.00.13: защищена 12.07.94 / Шайдуллин

72. Ильяс Нургалиевич. п. Дубровицы Моск. обл., 1994. 302с. Библиогр.: с.251-296.

73. Шарипов И.К. Кариотип домашних и диких овец. Алма-Ата. Наука. 1989. 143 с

74. П1естаков А.С. Программа работы по охраняемым природным территориям Конвенции о биологическом разнообразии. Комментарии для практического применения в регионах России. М.: Всемирный фонд дикой природы (WWF). 2009.96 с.

75. Эрнст JI.K., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. М. РАСХН. 508 с.

76. Alvarez S.; Fresno М.; Capote J. Estudio para la caracterizacion de la raza ovina Palmera // Arch.Zootecn. 2000. Vol.49. №185/186. P. 217-222.

77. Anderson W., Persone P. The functional anatomy of the spermatozoon. Ed. Afzelius B. Oxford: Pergamon press. 1975. 423 p.

78. Anon. Breed structures and conservation of Portland, Manx Loghtan andHebridean sheep ARK. 1987. T. 14. № 5. P. 154-157.

79. Ansari H.A., Maher D.W., Pearse P.D. Resolving ambiguities in the karyotype of domestic sheep (Ovis aries) // Cromosoma. 1996. Vol. 105. P. 62-67.

80. Anton I., Zsolnai A., Kukovics S. Genetic polymorphisms of milk proteins in hungarian dairy sheep breeds and crosses // Sheep and goat production in central and eastern european countries. Rome. FAO of UN. 1998. P. 224-226.

81. Bagirov V.A., Klenovitsky P.M., Zinoveva N.A. Analysis of chromosome aberrations in transgenic pigs and rabbits. Book of Abstracts of the 54th Annual Meeting of the EAAP Animal Genetics Rome, Italy. Wageningen Academic Rublissher. 2003. P. 14.

82. Barker J.S.F., Bradley D.G., Fries R. et al. An integrated global programme to establish the genetic relationships among the breeds of each domestic animal species // Report of a Working Group. FAO. Rome. 1993.-28s.

83. Berg K.A., Aamdal, J. Artificial insemination with frozen semen in ewes at different times of the breeding season // Repr. Domest. Anim. 1991. V. 25. № 1. p. 27-30.

84. Broad Т.Е., Hayes H., Long S.E. Cytogenetics: physical chromosome maps. In: The Genetics of Sheep, ed. By Piper L., Ruvinsky A. Oxon. UK: CAB International. 1997. P. 241-295.

85. Callow J.A. e.a. Biotechnology and plant genetic resources. Conservation and use. Wallingford. CAB intern. 1997. ХП. 308 p.

86. Colas G. Effect of initial freezing temperature addition of glycerol and dilution on the survival and fertilizing ability of deep-frozen ram semen // J. Rer. Fert. 1975. № 2. P. 277-285.

87. Crawford R.D. Assessment and conservation of animal genetic resources in Canada// Canad. J. anim. Sc. 1984. T. 64. №2. P. 235-251.

88. Djellali A., Vu Tien Khang J., Rochambeau H.de. Bilan genetique des programmes de conservation des races ovines Solognote et Merinos precoce // Genet. Select.Evolut. 1994. Vol.26, suppl.l. P. 255-265.

89. Ehling C., Niemann H. Anlage von Genomreserven beim Schaf unter besonderer Berucksichting biotechnologischer Methoden // Zuchtungskunde, 2000; Bd.72. №2. P. 140-152.

90. Ernst L.K., Zhigachev A.I. Role of genetic factors in the occurrence of umbilical hernias in cattle. I. The incidence of the anomaly and genealogical data. Genetika. 1981. 17.

91. Evans G. Current topics in artificial insemination of sheep // Austr. J. Biol. Sci. 1988. V. 41. № 1. p. 103-116.

92. Fiser P.S., Ainsworth L., Fairfull R.W. Evolution of a new diluent and different processing procedures for cryopreservation of ram semen // Theriogenol-ogy. 1987. V. 28. № 5. P. 599-607.

93. Fresno M., Triana J.J., Torres E. Repercusiones de la aplicacion del R (CEE) № 2078/92 en la conservacion de las razas autoctonas Canarias en peligro de extinction//Arch.Zootecn. 1998. Vol.47. № 178/179. P. 381-386.

94. Gonzalez M.E., Aguado M.J., Perez-Guzman M.D. Tecnicas reproduc-tivas aplicadas a la conservacion у fomento de la raza ovina Manchega, variedad Negra //Arch.Zootecn. 1998. Vol.47. №178/179. P. 329-334.

95. Gou K.M. Sheep transgenic embryos produced by intracytoplasmic sperm injection. //Article in Chinese. Shi Yan Sheng WuXue Bao. 2002 Jun. 35.

96. Gut A., Wojtowski J., Slosarz P. Conservation breeding of old type Polish Merino Sheep // Rocz. nauk. zootechn. Inst, zootechn. Krakow. 2008. T. 35, z. l.P. 19-23.

97. Hammond K.5 Leitch H.W. The FAO global program for the management of farm animal European resources // Paper presented at: Biotechnology's Role in the genetic improvement of farm animals. Beltsville. MD. US. 1995. 25 p.

98. Henson J. The rare breeds survival trust // J. R. Agr. Soc. England.1984. T. 145. P. 93-100.

99. Hiendleder S., Каире В., Wassmuth R. Molecular analysis of wild and domestic sheep questions current nomenclature and provides evidence for domestication from two different subspecies // Proc. R. Soc. Lond. B. 2002. Vol. 269. P. 893-904.

100. Jewell P. Rare breeds of domestic livestock as a gene bank // ARK.1985. T. 12. №5. P. 158-168.

101. Joshi A. Effect of certain factors on the metabolism of ram spermatozoa at different stages of cryopreservation // Annu. rep. Central sheep and wool research inst. 1986. T. 1986. P. 47-48.

102. Joshi A., Mathur A.K., Srivastava R.S. Factors affecting metabolic behaviour of ram spermatozoa during cryopreservation // Indian J. anim. Sc. 1990. T. 60. №11. P. 1336-1337.

103. Krever V. e.a. Biodiversity conservation in Central Asia: an analysis of biodiversity and current threats and initial investment portfolio. World wide fund for nature. Almaty. Gland. 1998. 110 p.

104. Kusakin I., Zakharov L., Marzanov N. Current and prospective situation in sheep and goat breeding in Russia // Sheep and goat production in central and eastern European countries. FAO. Rome. 1998. Ser. 50. P. 244-249.

105. Langner L.L., Flather C.H. Biological diversity: status and trends in the United States. Fort Collins (Colo.). 1994. 24 p.

106. Loo J., Gorman M. Protected areas and the bottom line. Zones protegees: prudence: Proc. of the 1997 conf. of the Canad. council on ecological areas, Sept. 14-16. 1997. Fredericton (N.B.). 1999. 238 p.

107. Maijala K., Cherekaev A., Devillard J.-M. Conservation of animal genetic resources in Europe rinal report of an E.A.A.R. Working party // Livestock Product. Sc. 1984. T. 11. №1. P. 3-22.

108. Marzanov N.S. State and prospects of merino sheep breeding in the Russian Federation // Proceedings of the 6th World Merino Conference «Natural Fibre and Food for the World». Budapest. 2002. P. 44-49.

109. Matousek V. К problematice uchovani puvodnich a ohrozenych piemen//Nas Chov. 1996. R.56. c.l. P. 16.

110. Morrier A., Castonguay F., Bailey J.L. Glycerol addition and conservation of fresh and cryopreserved ram spermatozoa // Canad. J. anim. Sc. 2002. Vol.82. № 3. P. 347-356.

111. Nadler C.F., Korobitsina K.V., Hoffmann R.S. Cytogenetic differentiation, Geographic distribution, and Domesticatiopn in Palearctic Sheep (Ovis) // Z. Saugetierkunde. 1973. Vol.38. P. 109-125.

112. Neaves W.B. Asynchronous testicular cycles among Equatorial colonies of Rock Hyrax. In; Testicular development, structure and function/ Raven press, 1980, p. 411-419.

113. Nei M., Tajima F., Tateno Y. Accuracy of genetic distances and phy-logenetic trees from molecular data // Journal of Molecular Evolution. 1983.Vol. 19.

114. Neri Q.V. Intracytoplasmic sperm injection. Accomplishments and qualms. // Minerva Ginecol. 2004. Jun; 56.

115. Nguyen T.C., Morera L., Danes D. Sheep blood polymorphism and genetic divergence between French Rambouillet: and Spanish Merino: role of genetic drift//Anim. Genet. 1992. Vol. 23. P. 325-332.

116. Norway's national report on implementation of the Convention on biological diversity. Oslo. 1998. 70 p.

117. Nowak R.M. Walker's mammals of the world / Publisher: The Johns Hopkins University Press; Baltimore. 1999. 6th edition, 2015 p.

118. Ozerov M., Marzanov N., Tapio M. Microsatellite analysis of genetic diversity in Russian and Ukrainian sheep breeds // Animal Breeding in the Baltics. Tartu. -2004. P. 108-193.

119. Palermo G.D. Application of intracytoplasmic sperm injection in assisted reproductive technologies. //Reprod Biomed Online. 2003 Jun. 6. P. 11-13.

120. Palermo G.D., Cohen J., Rosenwaks Z. Intracytoplasmic sperm injection: a powerful tool to overcome fertilization failure. Fertil. Steril. 1996. May. 65.

121. Program and abstracts of the Illinois state academy of science. 92nd annual meeting, April 7-8. 2000. Rock Island. Illinois. S.l. 2000. 105 p.

122. Program and abstracts of the Illinois state academy of science. 90th annual meeting "Maintaining biodiversity". April 17-18. 1998. University of Illinois at Chicago and the Field museum. S.l. 1998. 77 p.

123. Progress report on plant and animal genetic resources conservation and utilization // 3rd meet, of the Agr. techn. coop, experts group. June 7-10. 1999. Tokyo. Japan. Asia-Pacific econ. coop. 188-199 p.

124. Purdy P.H. Preserving ram semen // Sheep!. 2007. March/April. P. 4041.

125. Rasmusen В.A. Blood groups in sheep // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1962. Vol. 97. P. 306-319.

126. Rasmusen B.A., Hall I.G. An investigation into the association beiLtween potassium levels and blood types in sheep and goats // X European Conference on Animal Blood Grps and Biochem. Polimorph. Paris. 1966. P. 453-457.

127. Report of the Global biodiversity forum. Gland. Switzerland. 7-9 October 1993. Gland (Switzerland). 1994. 115 p.

128. Rodrigo M.S., Rodrigo V.R. Evaluacion de la conservacion у compor-tamiento productvo del Banco de germoplasma de la especies ovina en Colombia // Animal genetic resources information. FAO. Rome. 2005. №36. P. 33-45.

129. Ryan J.C. Life support:conserving biological diversity. Washington. 1992. 62 p.

130. Sabev M., Nikolov I., Ivanova-Kicheva M., Sefanov R. Cryopreserva-tion of ram sperm from autochthonous breeds during a non-mating season // Journal of Central European Agriculture. 2006. Vol. 7. №4. 677-682.

131. Sapundzhiev E. Conservation of ancient breed small ruminants as frozen embryos // Bulg. J. veter. Med. 2008. Vol.11. №4. P. 251-255.

132. Shend H. Human Nature agricultural biodiversity and farm based food security. RAFI. 1997. 94 p.

133. Sherf B.D. World Watch List for domestic animal diversity. 3rd edition FAO. Rome. Italy. 2000. 107 p.

134. Srivastava R.S. C. effect of glycerol as cryoprotectant on cryosurvival of ram spermatozea // Annu. rep. Central sheep and wool research inst. 1986. T. 1986. P. 46-47.

135. Srivastava R.S., Mathur A.K., Kalra D.B. Cryopreservation of ram semen in straws // Indian J. anim. Sc. 1989. T. 59. № 8. P. 970-972.

136. Stalinski Z. Zagadnienia doskonalenia bydla w malych populacjach ze czczegolnym uwzglednieniem hodowli zachowawczej // Nowe Roln. 1986. T. 35. № 7/8. P. 40-43.

137. Swaminathan M.S., Jana S. Biodiversity Implications for global food security // Madras. Macmillan India. 1992. 55 p.

138. Tapio I., Tapio M., Grislis Z. Unfolding of population structure in Baltic sheep breeds using microsatellite analysis // Heredity. 2005. Vol. 94. P. 678682.

139. Tapio M., Miceikiene I., Vilkki J. Comparison of microsatellite and blood protein diversity in sheep: inconsistencies in fragmented breeds // Molecular Ecology. 2003. Vol. 10. P. 567-571.

140. Tasseron F., Amir D., Schindler H. Acrosome damage of ram spermatozoa during dilution cooling and freezing // J. Rer. Fert. 1977. v. 51. № 2. P. 461-462.

141. Tervit H.R., Goold P.G., James R.W. The Insemination of sheep with fresh or frozen semen // Proc. N.Z. Sci. Anim. Prod. 1984. V. 44. P. 11-13.

142. The Global Strategy for the Management of Farm Animal Genetic Resources. FAO. 1999. P. 1-43

143. Tomazic D. The Bela Krajina Pramenka sheep conservation strategies // Agriculturae conspectus Scientificus. Zagreb. 2003. Vol. 68. № 4. P. 323-328.

144. Tucci M. FAO electronic conference: Role of biotechnology for characterisation and conservation of crop, forestry, animal and fishery genetic resources in developing countries // EAAP News. 2005. P.241.

145. Veprintsev B.N., Rott N.N. Conserving genetic resources // Nature 1979. V. 280. P. 633-634.

146. Vigh-Larsen F., Liboriussen Т., Berg P. Sustainable use and conservation of farm animal genetic resources // Dias Report. 2002. P. 219-229.

147. Алексиева С. Възможности за съхраняване на генофонда за абори-генните породи овце в България // Селскостоп. Наука, 1987. Т. 25. №3. с. 5457.

148. Колинкоева А., Киров Н. Ненаситени мастни киселини в липиди от сперматозоида от Ovis amon aries L. и Sus scrofa domestica L. // Ветер. -мед. Науки. 1986. Т. 23. № 5. P. 53-59.

149. Маринов П.И., Грудова Ч.Н. Проучване на влиянието на различии протектори върху чувствителността на овчине сперматозоида при криокон-сервация//Biol. Immunol, reprod. София. 1984. Т. 9. Р. 26-31.

150. Маринов П.И., Грудова Ч.Н., Маринова Э.М. Исследование холе-стерола сперматозоидов барана при их криоконсервации // Biol. Immunol, reprod. София. 1985. Т. 11. Р. 64-69.

151. Накев С. Местните отродия овце ценен генофонд // Селскостоп. Наука, 1987. Т. 25. № 3. с. 58-63.