Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние антиоксидантов на морфофункциональное состояние гамет баранов и быков, разработка синтетических сред и приемов их криоконсервации

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние антиоксидантов на морфофункциональное состояние гамет баранов и быков, разработка синтетических сред и приемов их криоконсервации"

! 11С - ^ п {А

1.0 и п. в. Д

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА Институт физиологии

На правах рукописи

КАЗАКОВА

Юлия Михайловна

УДК 636.22.28.082.453

ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ГАМЕТ БАРАНОВ И БЫКОВ, РАЗРАБОТКА СИНТЕТИЧЕСКИХ СРЕД И ПРИЕМОВ ИХ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кишинев — 1992

Работа выполнена в лаборатории криобиологии Института физиологии Академии наук Республики Молдова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Наук Василий Архипович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Степанов Григорий Семенович,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Исайкул Николай Семенович.

Ведущая организация:

научно-исследовательский технологический институт животноводства и ветеринарии Республики Молдова НПО «ТЕВИТ»

Защита состоится « 7 » исОиЛ 1992 г. на заседании

специализированного Совета Д 012.08.01 при Институте физиологии Академии наук Республики Молдова (277028, г. Кишинев, ул. Академическая, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Академии наук Республики Молдова (г. Кишинев, ул. Академическая, 1).

Автореферат разослан « £ » ¿ЛЫОИс^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, Тугоци

кандидат биологических наук Наталья Борисовна

"í

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

г< .'-i п

■—-—J Актуальность темы. Открытие В.К.Ыиловаиовым, И.И.Соколов-

г< .'-i п

ской, И.В.Смирновым (1972) с приоритетом (1947) метода длитеяь-" кого сохранения спермы сельскохозяйственных животных в глубоко-заморояенном состоянии позволило пересмотреть систему организации их воспроизводства. Использование данного метода в практике ; животноводства позволяет интенсифицировать воспроизводство ей-вотных на основе широкомасштабной генетической селекции. Поэтому дальнейшие прогресс в повышении продуктивности животноводства в значительной степени зависит от эффективности метода криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных.

фундаментальные исследования (Нилованов, 1964; Остапгко,. 1968; 1978; Пакенас и др., 1975; Наук, 1976, 1937; llagase, Graham, Niwa, 1964; Gralisa, 1973) яегли в основу разработки, практически приемлемых технологий криоконсервации семени быков- ( производителей. Вместе с тем, еще высок процент гамет, которые не восстанавливают свои функции после деконсервации, что требу-ет.дальнейюей разработки эффективных синтетических сред и приемов технологической обработки спермы при криоконсервации.

В последние годи во многих странах мира довольно интенсивно проводятся исследования по разработке высокоэффективных способов длительного сохранения спериы баранов-производителей в гяу-бокозамороженном состоянии (Милованов и др., 1974, 1961; Наук, 1972, 1987; Касыыов, Ашимов, 1975; Платов, 1979, 1961; Salem cm, 1969,* Colas, 1975; Jones, 1975).

Отсутствие эффективного способа криоконсервации спермы ба-ранов-произёодитеяей сдерживает ускорение селекционно-племенной работы в овцеводства.

. В связи с этим важнейшей задачей в области репродукции «и-

>

вотнцх является дальнейшее выяснение структуры, метаболизма и функции гаыет различных видов кивотних в ответ на действие низких температур.

Поскольку наиболее чувствительными структурами гамет к действию низких температур являются биомембраны за счет' усиления перекисного окисления и фазовых переходов липидов, нарушения слабых связен мекду пипидами и белками (Наук, 1974, 1967), то приоритетным является поиск условии стабилизации структуры биомембран гамет животных при криоконсервации. Проведение таких исследований определяется необходимостью разработки эффективных синтетических сред и режимов криоконсервации спермы барана и быка.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение влияния антиоксидвнтов на и орфофу нкци он ал ьн ое состояние сперииев баранов и быков и на этой основе разработка синтетическая сред и; приемов их криоконсервации.

Для достижения цели намечалось решение следующих основных задач:

I.. Изучить влияние общих яипидов актиномицето^,, мексидол (СОП-1), тритона Х-ЮО и селенита натрия на морфофизиологическне показатели гамет быков и баранов-производителеИ при их криоконсервации.

2. Выявить действия условий охлаждения, замораживания и оттаивания на физиологические показатели гамет баранов.

■ 3. Разработать и испытать в производственных условиях синте-. тические среды и приемы криоконсервации гамет баранов и быков в форме гранул.

„■ Научная новизна работы. Впервые изучено действие общих липи-Дов актиноыицетов, мексидола и тритона Х-100 на морфофуикциональ-

ные показатели гамет быков и баранов при их криоконсервации. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что общие липида актиномицетов обладают как антиокислительными, так и антимикроб-' ными свойствами. Выявлены оптимальные условия технологической обработки спермы баранов при криоконсервации; охлаждение спермы с 30 до 4°С со скоростью 0,4°С/тан, выдержка при 4°С в течение 2 часов, замораживание при температуре -140°С в течение 2 минут и оттаивание с помощью аэродинамического размораживателя при температуре 60 °С.

Разработаны лактоэо-общие липиды актиномицетов глицерино-желточнед (авторское свидетельство $ 1498489), яактоэо-мексидоя-глицерино-лселточнай (авторское свидетельство $ 1634268) и яадто-зо-тритон ¡Х-100-глицерино-желточнай среда (авторское свидетельство № 1540817), проверка которых показала их вксокуп эффективность.

Теоретическое и фактическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в раскрытии особенностей влияния различных антиоксидантов на морфофутционаяьные показатели гакот бора-нов при криоконсервации и установлении у общих яипидов актиномицетов антиокислительного и антимикробного действия.

Разработанные новые синтетические среда и приемы технологической обработки спермы быка и барана при криокнеервации ее в форме гранул более эффективны по сравнешш с существующими средами для отих целей и могут быть использованы в производстве»

Основные положения, выносимые на защиту.

. I» Общие липиды актиномицетов, мекеидол (СОП-1), тритон Х-ЮО обладают защитным эффектом при криоконсервации гамет быка и барана, а общие липиды актиномицетов проявляют антиокиалитвяь-ное и антимикробное действие.

/ - '

Разработанные синтетические среды лактозо-общие липицы актин оыице т ов-глицерин о-же лт очна я и лактозо-мексидоло-глицери-на-желточная для криоконсервации спермы барана и быка более эффективные, чем существующие среды для этих целей,

3. Оптимальным режимом технологической обработки сперйи^с использованием ЛОЛАГК-среды является: охлаждение спермы с 30 до 4°С со скоростью 0,4°С/мин» выдержка при 4°С в течение 2 часов, аамораживание при температуре -140°С в течение 2 минут и оттаи-эание с помощью аэродинамического размораживателя при температуре 60°С.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены * на Всесоюзном симпозиуме "Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран" (Благовещенск, 1969), Всесоюзной конференции "Биовнтиоксидант" (Черноголовка, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа" (Киев, 1989), Всесоюзной конференции "физиология продуктивных животных" (Тарту, 1969), Республиканской конференции "Проблемы научного обеспечения животноводства" (Кишинев, |990), Международной конференции "Биологические осуовы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных" (Боровск, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Стресс, адаптация и дисфункции" (Кишинев, 1991), ежегодных заседаниях лаборатории криобиологии и Института физиологии АН РМ (1966-1991).

. Материалы диссертации опубликованы в 14 печатных работах.

Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 4 рисунке» Список использованной литературы включает источника, в том числе иностранных

уторов.1 . " ,

НЛГЕН1АШ И метода

Объектом исследований служила сперма бареиов остфризской и каракульской, а быков черно-пестрой пород.

Для исследования отбирали эякуляты с подвижностью гакет не ниже 8 баллов и концентрацией I млрд/мл для быков и 2 млрд/мл для баранов.

Оценку качества оттаянной спермы баранов и быков по подвижности гемет проводили под микроскопом при 450-кратном увеличении по 10-балльной шкале. Концентрацию гамет определяли с помощью фотоэлектрожолдориметра.

Сперму баранов и быков-производителей замораживали в форме . открытых гренуя на фторогсластовых пластинах обьэмом 0,2 и 0,1. мя соответственно.

Скорость снижения температуры в момент замораживания измеряли при помощи термопары, вмонтированной в гранулы с семенем. ■

Оттаивание сперш проводили с помощь» специального аэродинамического аппарата при температуре 60°С.

Определение оптимальной концентрации Сахаров и полиолов проводили методом треугольных систем по В.К.МиЯованову (1962), при испытании антиоксицэнтов использовали эквивалентные молярные концентрации со смещением от оптимума в сторону гипо- и гипермоляр-ности до появления отрицательных эффектов.

Антиокцелительную активность липидов определяли по методике Бурлакова Е.Б. и др. (1975).

Активность глутамино-аспарагиновой трансаминазы в плазме семени баранов-производителей определяли по методу Веу1шащ - -?гапке1, (1967), спектрофотометрически на приборе СФ-26 при длине волны БЗО нм.'

. Изучение морфологических изменений акросомы гамет баранов и

Ч '

быков проводили с помощью фазоконтрастной микроскопии с использованием интерферационного микроскопа 1Р1-5 (Польша) под иммерсией при 1500-кратном увеличении, просматривая в каждом образце по 300 гамет и рассчитывая их процент с инта'ктными акро-сомеми. •

Устойчивость гамет баранов к низкотемпературному шоку определяли по ГОСТ 20909.4-75.

Научно-производственные опыты по испытанию криозшдитных сред для криоконсервации гамет баранов проводили- в совхозе "Роза Молдавии" Леовского и "XX Партсъезд" Теленештского районов. Результаты осеменения учитывали по итогам окота овец.

Научно-производственные опыты по осеменению коров проводили в хозяйствах зоны обслуживания Страшенокого и Спикерейеного гоеппеыпредприятий по накоплению спермы сельскохозяйственных животных..

Результаты осеменения коров учитывали по итогам ректального обследования коров через 60-90 дней и отелам.

Цифровой материал обработан методом вариационной статистики по ;Е.К.Меркурьевой (1964) и Г.Ф.Лакину (1960).,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Действие общих липидов актиномицетов, мексидола,тритона Х-ЮО и селенита натрия на антиокислительную активность липидов и морфофизиологические показатели гамет баранов и быков при криоконсервации

При криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных' происходят активация цепных свободнорадиналышх реакций перекис ного окисления липидов (ПОЛ) и повышение содержания.промежуточ-'№Х продуктов этого процесса, что является одной из важных причин нарушения структуры и функции гамет в процессе их заморажн-

вания и оттаивания. ,

В связи с этим важное значение приобретает поиск эффективных способов ингибировшшя ПОЛ п интересах предотвращения нару- • шения биомембран гамет при криоконсервации.

Проведенные »гоми исследования показали, что введение в состав лэктозо-глнцерино-жеяточной среды (ЛПК) общих липидов ак-тиномицетов в оптимальной концентрации (0,015 масс./Ж) длл криоконсервации с перш барана привело к значительному пошшенип Физиологических показателей гзмет. Так, в опытной труппе (лакто-зо-общие липиды октиноиицетов-глицерино-яелточная» ЛОЛЛГЖ-среда) подвижность после оттаивания составила 4,3j_0,14, выживаемость 7,6¿P,27 и абсолютный показатель пыннваемоети 18,15^1,48 против 3,3.i0, II; 6,?¿0,29; II,20¿0,74 в контроле, гд'з была использована ЛГ1-среда.

Изучение влияния общих липидов актиномицетоп нл физиологические показатели гамет выявило пояожге'гько'з его действие и на функциональное состояние гамет бикв. Так, введение их в состав лвктозо-гяицершю-яелточноР среда в концентре»ии 0,0? иг/% привело к значительному повыпенют подвютоети гамет после оттаивания (4,0iP,I4), их выживаемости (9,50Л),53) и абсолютного показателя выживаемости гамет (?5,3jO,45), против 3,0^0,17; 6,3+1,15 и 17,06^1,08, соответственно в контрольной группе, где общие липиды актшомицетов не использовали.

Крома исследования влияния общих липидов актиномицзтов на физиологические показателя гамет быка и .барана в отдельном опы- . те нами изучалось изменение ангиокисяитеяьной активности шпти-дов гамет баранов в процессе замораживания-оттаивания (табл.1).

Приведенные, результаты исследований в табл.1 свидетельствуют о том, что общие липида актиномицетов в.составе ЛГЖ-среды'

ч

приводят к повышению антиокислительной активности липидов по . сравнению с контролем на статистически достоверную разницу. Важно также отметить, что использование в составе синтетической среда для замораживания спермы барана антибиотиков' (пенициллин, стрептомицин, стрептоцид белый растворимый, объединённых в оптимальных концентрациях под названием спермосан-3), также способствует повышению антиокислительной активности липидов.

Таблица I

Действие общих липидов актиномицетов на антиокислительную активность липидов гамет баранов при их криоконсервации, п=5

Варианты сред !Антиокисли-тельная активность липидов !гамет барана, ч/г/мл

ЛГЖ (контроль)

ЛГШ + спермосан-3 7153Д.±е8?Д

ЛГЖ + ОЛА 8857,8^709,Iю5 •

** Р^ 0,01.

Таким образом, применение общих липидов актиномицетов в составе синтетической среда для криоконсервации спермы барана и быка приводит к повышению физиологических показателей оттаянного материала, а в случае криоконсервации спермы барана наблюдается повышение и антиокйслительной активности липидов, что, по-видимому, способствует стабилизации структурно-функциональной целостности мембран и повышению функциональных показателей гамет Поскольку в состав ЛОЛАГШ-среды для криоконсервации спермы барана входят общие липида, выделенные из актиномицетов, то интересно было испытать их антимикробные свойства. Результаты

I

опытов Ьоказали, что использование для разбавления и заморалш-

вения спермы баранов криоэащитных сред ЛОЛАГЖ и ЛГЖ с добавлением спермосена-З значительно снижает общее количество микроорганизмов по сравнения с ЛГШ-средой, Их количество соответствен- • но составляет 5,5¿I,37; 8,0*4,90 и 2397,5±II7,I3 в1миллилитре с перш.

На основе полученных результатов об эффективности OJIA в составе криозащитной среды для спермы барана и быка нами бнлр предположено, что, поскольку в состав ЛГЖ-среды входят общие липицы актиномицетов, то концентрация келтка мотке т быть изменена. Проведенные исследования в этом направлении показали, что введение в состав ЛПК-среды для разбавления и замораживания спермы баранов'общих липидов актиномицетов позволяет уменьшить количество желтка до 25%. Поскольку желток куриного яйца содержит большое количество фосфолипидов, то, по-видимсиу, он наряду со свойством защиты гамет от зредного действия температурного шока обладает способностью повышения антиокислительноЯ активности ■липидов мембран гамет.

Дальнейший поиск условий повышения физиологических показателей гамет при криоконсервации спермы барана был неправлен на изучение эффективности мембраноактивных препаратов, солвбилиэа-торов мембранных структур, позволяющих стабилизировать мембраны и, таким образом, повысить устойчивость гамет к низким температурам. Проведенные эксперименты показывают, что введение тритона Х-100 в количестве 0,001^ в состав ЛГЖ-среды для криоконсервации спермы барана способствует лучшей .стабилизации подвижное-ти, выживаемости и абсолютного показателя выживаемости гамет, соответственно 3,8¿p,I?ff; 7,7iO,235f и I9,OjO,56*, против 3А± 0,09; 5,7¿0,37 и 13,0^1,57 в контроле. Защитный эффект трятона

х Различия статистически достоверны.

Х-100 может быть объяснен чем, что он, связываясь с мембранными белками посредством гидрофобных взаимодействий, модифицирует мембраны гамет и, таким образом, повышает их устойчивость к действию низких температур.

Последующие исследования по выявлению эффективности анти-оксидантов для криоконсервации спермы барана предусматривали' изучение действия мексидола. Проведенные опыты свидетельствуют о том, что мексидол в количестве-0,255 иг/% в составе ЛГЖ-средц для разбавления и замораживания спермы барана способствует лучшему восстановлению подвижности, выживаемости и абсолютного показателя выживаемости гамет после их замораживания и оттаивания. Опыты, проведенные на сперме быков, показали, что использование мексидола в качестве мембраноактивнесо вещества и антиоксиданта в составе ЛГЖ-ореды позволяет достигнуть подвижности оттаянных гамет равной 3,6*0,13 баллов, выживаемости гамет при 38°С равной 9,9^0,37х часов и абсолютного показателя выживаемости равного 25,43^1,'67* у.е., против соответственных показателей 3,8^0,14; 8,8^0,17 и 18,7^1,18 в контрольной группе.

Исследование антиокислительных свойств селенита натрия при криоконсервации спермы барана не выявили существенных различий в качестве оттаянного материала по сравнению с контрольной группой .

Таким образом, результаты исследований, представленных в первом раздеие, показывают, что общие липида вкткномицетов, тритон Х-100 и мексидол обладают антиокислительными свойствами и могут быть использованы в составе криозащитншс сред для спермы быков и баранов-производителей.

2. Разработка синтетических сред для криоконсерввции спермы баранов и быков

Развитие исследований по криоконсервации спермы сельскохозяР-стпенных животных на современном зтапе связано с выяснением фундаментальных механизмов криоповрекдениР и изысканием путей более эффективно? криозадиты гамет на разных уровнях их организации.

При исследовании различных сочетаний и соотношений полиолов (манитол, сорбитол, дульцитол) с рзфкнозоР и тиосульфатом натрия л наяда!1 вариант опыта добавляли тгелток и глицерин. Выявлено,что лучшие результаты по выживаемости гамет достигнуты при разбавлении спермы баранов изотоническими растворами рсфинозы - В0% и мвнитола - ?0%.

Полученную синтетическую среду сравнивали с известными лак-тозо-фруктозо-рафинсзо-магниево-глицерино-желточной (ЛФШГЗ) и лактозо-сорбито-тиосульфат-глицерино-желточнсН (ЛСГГЖ) средами для криоконсервации спермы быка.

Восстановление подвижности, выживаемости и абсолютного показателя выживаемости после замораживания - оттаивания спермы барана происходит на уровне контроля ЛФПяГЖ-среду (3,3^0,1?; 11,7^.1,65; 3,4^0,3? и соответственно в контроле 3,3^0,1?; II,% I,?5; 3,4^0,31).

Таким образом, удалось исключить фруктозу как дорогостоящий, дефицитны!' препарат, ¡зходящий в ЛФРМПК-среду.

Дальнейшее совершенствование' криоэащитных сред для спермы барана осуществлялось путем введения в их состав веществ, способных модифицировать клеточные мембраны. В качестве такого пре-нарата был использован тритон Х-100 (табл.?).

Результаты проведенных исследований (табл.2) показывают, что оптимальный вариант среды (авторское свидетельство 1540817)

обладает высоким криозащитным эффектом, увеличивая, таким образом, абсолютный показатель выживаемости деконсервированных гамет на 37,

Таблица 2

Эффективность использования тритона Х-100 в составе лактозо-глицерино-желточной среды при криоконсервации спермы барана, п=5

Вариант среды Физиологические показатели деконсервированных гамет

Подвижность, балл !Выживае-!мость при !ЗВ°С, час !Абсолютный пока-!затоль выкиваемос 1ти при 38 С, у.е.

ЛГЖ + тритон 3,3Д0,1В 7,2^,34 15,2^0,38***

ЯГ$ (контроль) 3,2*0,12 6,5д0,24 II,7^0,23

Р-с 0,001.

Наряду с этим препаратом были изучены в .составе синтетической ЛГЖ-среды и общие липиды актиномицетов, которые значительно повышают антиокислительнув активность липидов, .а также лучше' стабилизируют физиологические показатели гймет при криоконсервации.

Разработанную нами синтетическую лактозо-общие липиды ак-тиномицетов-глицерино-желточную среду для криоконсервации сперму барана {авторское свидетельство 1498489) испытали в лабораторных условиях в сравнении с лактозо-глицерино-желточной, содержащей антибиотики, и без ник (табл.3).

Как видно из табл.3, разработанная нами ЛОЛАГЖ-среда для ' разбавления и замораживания спермы барана в форме открытых гра пул является более эффективной. Её использование позволяет повысить подвижность гамет на 12$, продолжительность жизни после

Таблица 3

Результаты испытаний разработанной ЛОЛАГН-среды для криоконсервации спермы барана, п=14

Показатели Варианты среды

ЛГЩ контроль) !ЛИЦспермо~!ЛОЛАГЖ !сан-3 !

¡.Подвижность (балл) после

получения 7,3^0,16 7,3^,16 7,3*0,16

разбавления 7,3^,16 7,3^0,16 7,3*0,16

охлаждения 6,9^,14 6,4*0,14 7,1*0,12

оттаивания 3,3^,14 3,3^0,12 4,1*0,22*

?.Выживаемость деконсерви-^оданных гамет при 6,2^0,29 6,4^0,27 7,6*0,30**

3.Абсолютный показатель выживаемости деконсерви-|эо§енных гамет при 11,2^,74 II,2^0,55 16,5*0,12*

^.Сохранность акросом, % после:

получения 78,9±1,34 78,9*1,34 78,9*1,34

охлаждения 66,2^0,90 67.9iP.97 70,6*0,82**

оттаивания 27,5^0,95 28,8^ ,75 35,2*1,45**

5.Коэффициент устойчивости гамет к температурному току, у.е. 0,29^0,016 0,29^,018 0,36^,022*

н

0,05, ** Р ^ 0,01,

ят

0,001.

оттаивания на 23%, абсолютный показатель выживаемости на 47%, qoxpaннocть акросомы на 18$ и коэффициент устойчивости гамет к температурному шоку^на 24% по сравнению с контролем.

При совершенствовании криозащитных сред для разбавления спермы быка испытывали в качестве антиоксидаито мексидол, ¡защит-

ный эффект которого заключается в ингибировании процесса пере-кисного окисления липидов, что приводит к повышению морфофизи-ояогических показателей земороженно-огстаянных гамет. На оптимальный вариант среды (лактоза II,5, мексидол 0,003 г, глицерин 5 мл и желток ?0 мл в 100 мл бидистиллированной воды) получено авторское свидетельство I634P68. Разработанную нами ллкто-зо-мексидол-глицершо-яелтЬчную среда для криоконсерввции спер-ш барана испытали в сравнении с лактозо-глицерпно-желточной средой (табл.4).

Таблица 4

Эффективность лактоэо-мексидоло-глицерино-желточной среды при криоконсерввции спер;лы бына, п=6

Показатели !--.Варианты ?реШ--

■ 31ГЖ_¡ЛГЖ+мекскдол

Подвижность после оттаивания, балл 3,8iO,I4 3,9jj0,?2

Выживаемость при 33°С, ч 8,8jP,I7 Э.Эа-О^3®

Абсолютный показатель выживаемости при 38 С, у.е. I8,7±I,I8 ?5,4±I,67H

Сохранность акросом, % 42,8¿I,I9 44,8*1,86

к Р0,05; 0,01.

Данные'(табл.4) показывают, что йактозо-мексидол-глицерино--келточная среда более эффективна по сравнению с лагстозо-глице-рино-желточной средой, которая применяется для замораживания спермы быков в форме гранул.

Результаты исследований, представленные во втором разделе, позволили разработать новые синтетические среды для криоконсерввции спермы бьйса и барана.

3. Физиологические показатели гамет барана в зависимости от условий охлаждения, замораживания и оттаивания

Исследования скорости охлаждения разбавленной спермы барана находятся в стадии разработки и поэтому в литературе отсутствует единое мнение о режимах охлаждения, замораживания и оттаивания гамет.

Наши последующие исследования базировались на положении о том, что эффективность использования разработанных новых сред для криоконсервации спермы животных зависит от конкретных условий её технологической обработки.

В результате изучения физиологических показателей гамет барана при действии различных скоростей охлаждения 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 град/мин с 30 цо 4°С и выдерживании спермы каждого варианта при 4°С в течение 1,2,3 часа в случае разбавления ЛОЛАГЖ-средой показано, что лучшая подвижность (0,43^.0,2?,?^! 0,05) после оттаивания получена при охлаждении со скоростью 0,4°С/минуту и выдержке при 4°С в течение 2 часов по сравнению с контролем (3,?^0,28), когда сперму охлаждали в холодильнике при 4°С в течение 4 часов.

Исследование физиологических показателей оттаянных гамет барана после замораживания в ЛГЖ+тритон Х-100 среде при различных скоростях охлаждения 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 град./мин с 30 до 4^ и выдерживании спермы каждого варианта в течение 1,?,3 часов при температуре 4°С выявило, что лучшие результаты по подвижности (3,75^0,1?, Р-<. 0,05) и абсолютному показателю выживаемости при 38°С (Яг,33_ь0,97, Р-^ 0,001) получены, когда сперму охлаждали с 30° до 4°С со скоростью 0,4°С и выдерживали при 4°С в течение 3 часов по сравнению с контролем (Р,92+0,Р5) (12,79^0,99), когда сперму охлаждали при температуре 4°С в тече-

ние 4 часов.

Качество оттаянной спермы предопределяется совокупностью всех технологических элементов её криоконсервации. Одним из - таких элементов является температура фторопластовой пластины. В отдельном опыте нами изучено действие различных температур фторопластовой пластины (-100, -120, -140°С) и сроков выдержки спермы в парах жидкого азота (I минута и 2 минуты) на физиологические показатели гамет баранов.

Установлено, что имеется тенденция к лучшей стабилизации подвижности, выживаемости и абсолютного показателя выживаемости (3,6j0,7; 6,0^0,52; 14,10^1,3), когда сперму замораживали при температуре ~140°С и выдерживали в парах азота 2 минуты, по сравнению с контролем (3,4^0,?; 5,5jj0,34; I0,3±I,7) в случае замораживания при -79°С и выдержке в парах жидкого азота в те-, чение 2 минут.

Стабилизация структуры и функции гамат при сохранении спермы йивотных при -196°С в большой степени зависит от условий её оттаивания. Поскольку данный этап сопровождается рекристаллиэа-ционныш процессами, то очень важно при оттаивании как могли о быстрее отделить гадкую фазу от твердой. Поэтому для оттаивания применяли аэродинамический прибор "Размораживатель", сконструированный конструкторские бюро АН Ш. Результаты опытов представлены в табл.5.

Как видао из табл.5, более высокие показатели по подвижности после оттаивания и выживаемости получены, когда замороженную сперму баранов оттаивали при температуре 60-70°С.

Таким образом, лучшие результаты по восстановлению физиологических показателей сперыы барана получены при разбавлении её средой ЛОЛ АПК, охлаждения на поверхности фторопластовой плести-

ны в форме гранул при -140°С в течение 2 минут и оттаивании с помощью аэродинамического размораживателя при 60°С.

Таблица 5

Физиологические показатели в зависимости от температуры оттаивания спермы барана, п=5

Температура.' оттаивания, С ¡Подвижность гамет после оттавивания, ! балл !Выживаемость {при 38 С, ч ! {Абсолютный пока-{затель выживае-tмости при 38 С, ! у.е.

40 (контроль) 7*0,14 8,15*0,29 6,0*р,5

45 2,8*0,14 11,10*1,96 6,4*0,45

50 3,2*0,14 13,00*? ,83 7,0*0,35

60 3,9*0,11** 18,50*2,19 7,8^0,22 .

70 3,8*0,14iüi 19,20*1,78 7,8i0,223Oi

* Р 0,05; т 0,01.

4. Производственные испытания разработанных синтетических сред для криоконсервации спермы быка, барана и техники искусственного осеменения овец

Интенсивное развитие исследований по криоконсервации спермы барана в последние 15-20 лет показало, что эффективность искусственного осеменения овец эамороженно-отгаянной спермой барана зависит от многих факторов. Кан нами показано выше, стабилизация структуры и функции гамет в значительной степени зависит от состава защитных сред и режимов технологической обработки спермы. Наряду с этим, в последние года в связи со специфичности) строения репродуктивных органов большое внимание отводится техническим приемам искусственного осеменения овец. Поэтому нами в производственных условиях было изучено влияние глубины введения замороженно-оттаянной спермы в канал шейки матки кивот-

ного

Выявлено, что лучшие результаты по окоту (36±4%) получены при введении спермы в канал шейки матки овец на глубину 2-4 см против 29^5,5% в контроле. Это послужило основой разработки в нашей лаборатории влагалищного расширителя и геликоидного шпрн-ца-катетера для искусственного осеменения овец, которые были использованы при проведении производственных опытов.

Выполненные исследования по выяснении времени проявления охоты и кратности осеменения показывают, что более высокий показатель оплодотворяемое™ получен при однократном осеменении нивотных сразу после их выборки (46,3^7,8^) по сравнению с контрольной группой, где использовали обычную технологию выявления и осеменения овец (19,6^5,6 - различия статистически достоверны).

Проведенный научно-производственный опыт по испытанию разработанной наш синтетической среды для криококсервацни спермы барана, еодеркащей общие пнпиды актпношцетов с применением выявленных оптимальных технологических приемов осеменения, позволили установить, что результативность искусственного осеменения вше (табл.б).

Таблица 6

■ Результаты искусственного осеменения овец с использованием аамороженно-оттаянной спермы барана

Группы опыта

(Осеменено ? Объягнилось! !овец ! овец !

I.Сперма заморожена с использованием лактозо-глицерино-желточной среды (контроль)

74

34

45,9*5,79

2.Сперма заморожена с использованием лактозо-общие липиды актиномицетов-глице-рино-желточной среды (опыт) 127

36

353ЁХ 75,6^3,81

нш

Р^ 0,001

Данные, предетевпоиные в табл.6, свидетельствуют о том, что результаты осеменения овец соответствуют требованиям производства, а предложенная среда и приемы осеменения могут быть использованы при воспроизводстве животных.

В научно-производственном опыте по осеменению коров была испытана лактозо-мексидол-глицерино-желточная среда, разработанная нами для разбавления и замораживания спермы быков в форме открытых гранул (табл.7).

Таблица 7

результаты широкого производственного испытания лактозо-мексидол-глицерино-желточной среда для криоконсервации спермы быков

Среда, использованная для ¡Осеменено!Стали стельнши! • криоконсервации спермы быка!коров !после первого | % ! ¡осеменения, I ! I коров !

I.Лактозо-глицерино-желточ-цая (контроль) 291 167 61,2^2,94

Р.Дактозо-мексидол-глице-рино-женточнря (опыт) ?61 172 65,9*2,93

Данные табл.7 показывают, что при включении в состав среды мекси.дола стельность коров от первого осеменения увеличивается на 4,7% по сравнению с обычной лактезо-глицорино-яелточной сре-

дой.

Таким образом, разработанные нами иактозо-криоэапутша среды оказались более эффективными при криоконсервации спермы барана и быка.

ВЫВОДЫ

1. Установлено/что общие липиды актиномицетов, мексидол, тритон X-IOO в соответствующих концентрациях 0,015, 0,0255, 0,001 мгД повышают функциональную активность гамет барана при криоконсервации.

2. Показано, что общие липиды актиномицетов повышают антиокислительную активность липидов гамет баранов, обладают антимикробным свойством, что свидетельствует о перспективности использования его в составе синтетических сред при криоконсервации спермы животных.

3. Дополнительное введение в лактозо-глицерино-желточную среду общих дипидов актиномицетов и мексидола в соответствующих концентрациях повышает устойчивость гамет барана и быка к температурному шоку, сохранность акросом, а также их выживаемость при замораживании и оттаивании.

4. Стабилизация функциональной активности гамет барана, достигается при охлаждении разбавленной спермы в ЛОЛАГЖ-среде с 30 до 4°С со скоростью 0,4 град./мин., выдерживании её при 4°С 'в течение 2 часов, заморатаваши на фторопластовой пластине при -140°С в течение ?. минут и оттаивании с помощью аэродинамического размораживателя при 60°С.

5. Использование для разбавления спермы яантозо-общие липиды актшошщетов-глицерино-келтсчной среды (A.c.iV 1498489) и разработанных наш приемов ее технологической обработки повышает опяодотворяакцую способность гамет баранов после их криоконсервации по сравнения с существующим способом.

6. Разработанная на основе антиоксидантов лактозо-мекспцо-ло-глицерино-жеЯточная среда (a.c.ft 1634266) для замораживания спзрмы быка в форме гранул позволила повысить оплодотворяющую

способность гамет на 4,7% по сравнении с применяемой в настоя- . щее время лактозо-глицерино-желточной средой, ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ . X, С целью повышения результативности искусственного осеменения овец рекомендуем племпредгфиятиям использовать для крио-консервации спермы.баранов яактозо-общие липиды актиномицетов- 1 глицерино-жеяточну» среду следующего состава, масс./55: Лактоза -8,8

Общие липиды актиномицетов - 0,015 • '

Глицерин - 3,8

Желток куриного яйца -11,5

Вода ¿«дистиллированная до 100.

i

2. При замораживании спермы баранов в форме открытых гра-рул о использованием лактоао-общих липидов актиномицетоа-глице-рино-желточной среды рекомендуем охлаждение с 30 до 4°С проводить со скоростью 0,4°С/мин, выдерживать сперму при 4°С, в течение 2 часов, замораживать её на поверхности фторопластовой пластины при -140°С в течение 2 минут и оттаивать с помощью аэродинамического размораживателя при 60°С.

3. Для криоконсервации спермы быков в форме гранул рекомендуем использовать лактоэо-мекоидоло-гпицерино-желточную среду следующего состава, масс.Д: .

. Лактоза - 8,8

Глицерин - 3,8

Желток куриного яйца -11,5

Мексидол _ 0,0000255 Вода бидистилдированная до 100.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДОССЕРГЩИ

1. Структурные и функциональные изменения семени баранов при криоконсервации // Научные основы адаптивной системы ведения животноводства: Тез.докл. Рзсп.конф. Кишинев, 1985.

С.48-49 (в соавт.).

2. Методические указания // Способ повышения жизнеспособности гамет баранов-производителей при криоконсервации. Кишинев: Тимпул, 1986. 19 с. (в соавт.).

' 3. Производные 3-оксипиридина - эффективные криопротекторы // Биоантиоксидант: Тез. докл. Ш Всесоюз.конф. Москва, 1969. т.1. С.122-123 (в соавт.).

4. Совершенствование воспроизведения сельскохозяйственных животных // Физиология продуктивных животных: Мат.Всесоюз.конф. Тарту,- 1989. С.24-25 (в соавт.).

5. Стабилизация плазматических мембран гамет животных при криоконсервации // Реконструкция, стабилизация и репарация биологических материалов: Тез.докл. Всесоюз.симп. Благовещенск,

1989. С.126 (в соавт.).

6. Оптимизация воспроизводства сельскохозяйственных животных // Биологические основы высокой продуктивности с/х животных: Тез. Междунар.конф. Боровск, 1990. С.21 (в соавт.).

1

7. Липиды микроорганизмов при криоконсервации гамет самцов сельскохозяйственных животных // Микроорганизмы в кормопроизводстве. Кишинев: Штиинца, 1990. С.119-126 (в соавт.).

8. Физиологические и технологические аспекты получения, криоконсервации и использования семени барана // Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии. Тез.докл. конф. Кишинев,

1990. С.40-41 (в соавт.).

9. Осрбенности криорезистентности гамет самцов сельскохозяйст-

венных животных и новая технология получения, криоконсерва-ции и использования семени барана // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа: Тез. докл. Всесоюз.симп. Киев, 1991. C.I70-I7I (в соавт.).

10. Плазматическая мембрана спермиев: структура и изменение при низких стрессовых температурах // Стресс, адаптация, дисфункции: Тез.докл. 1У Всесоюз. симп. Кишинев, 1991. С.186 (в соавт.).

11. Видовые особенности криоповреждения гшет животных // Успехи современной криобиологии: Тез. докя.Междунар. конф. Харьков, 1992. С .I25-li?6 (в соавт.).

1Я. A.c. 1496439 СССР, А 61 Д 7/02 Среда для криоконсервации семени баранов (в соавт.) Заявлено 7.07.87. Опубл. 07.06.89 Бюл, № 29.. 2 с.

13. A.c. 1540817 СССР, А 61 Д 7/02 Криозацитная среда (в соавт.). Заявлено 8.12.87. Опубл. 07.02.90. Бюл.» 5. I с.

14. A.c. 1634268 СССР, А 61 Д 7/02 Среда для криоконсервации гамет (в соавт.). Заявлено 15.11.90. Опубл.15.03.91. Бюл. № 10. Р о.