Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические аспекты криорезистентности спермы баранов и быков

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические аспекты криорезистентности спермы баранов и быков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи

ЕРОХ1Ш Анатолий Сергеевич

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОРЕЗИСТЕНТГГОСТИ СПЕРМЫ БАРАНОВ II БЫКОВ

Специальность 03.00.13 — физиология человека н яашотпых

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени доктора биологических наук

п, Дуброшщы Московской обл., 1994 г.

Работа выполнена во Всероссийском научио-исследователь-скон институте племенного дела.

Научный консультант:

доктор биологических паук,

профессор В. П. КОНОНОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, профессор Ю. Д. КЛИНСКИЙ,

доктор биологических наук, профессор А. Н. УСПЕНСКИЙ,

доктор биологических наук, профессор А. И. ЖУРАВЛЕВ

Ведущее учреждение — Российская академия менеджмента в животноводстве.

Защита диссертации состоится «.. ..))..года в 10 часов на заседании специализированного Совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская обл., Подольский район, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «.

• .....года.

»

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук И. И. ШМЫГИН

I. ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ Актуальность теш. В большинстве экономически развитых стран для искусственного осеменения коров широко используется метод криоконсервации спермы.

Несмотря на достаточно высокую эффективность этого метода в скотоводстве, имеется ряд малоизученных вопросов, ответы на которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров. В частности, в процессе замораживания погибает более половины сперматозоидов. Изучение причин данного явления и разработка болев совершенных криоразбавителей для спермы быков, позволило бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе криообработ-ки и их оплодотворяшцую способность. Кроме того, это позволит увеличить запас спермодоз, заготовляемых от высокоценных в племенном отношении производителей.

Специальными исследованиями доказано, что результативность осеменения коров замороженной.спермой на 20-30$ ниже, чем от сведеполученной (А.Гордон,1988). В этой связи для дальнейшего развития и совершенствования метода криоконсервации спермы быков необходимы более основательные теоретические исследования.

Б овцеводстве метод глубокого замораживания спермы баранов разработан в меньшей степени и пока не нашел широкого применения в практике, хотя значение данного метода для овцеводства актуально не менее, чем в скотоводстве. При атом появилась бы возможность широко и с большей нагрузкой использовать высокоценных племенных баранов, в особенности, проверенных по качеству потомства. В настоящее время по Россия нагрузка на одного барана остается еще достаточно низкой и составляет не более 350 овцематок на барана. Внедрение метода глубокого замора-кивания спермы баранов в практику, позволило бы заготавливать от них сперму в течение всего года и значительно увеличить число овцематок, осеменяемых спермой выдающихся производителей. Недостаточное внедрение в практику данного метода обусловлено пониженной фертильностью «расконсервированной спермы баранов.

Биологические причины данного явления изучена, пока очень слабо и требуют дальнейших всесторонних исследований.

В этой связи особую актуальность приобретают сравнительные исследования межвидовых особенностей криоустойчивости половых клеток баранов и быков. Выяснение причин различной крноустойчн-вости и фертильности оттаянной спермы данных видов животных на более глубоком уровне, чем это делалось до сих пор, необходимо для совершенствования методов повышения криоустойчивости сперматозоидов баранов и разработки способов повышения эффективности использования их криоконсервированяой спермы.

Цель работы - совершенствование метода глубокого замораживания спермы баранов , и внедрение его в практику, а также повышение эффективности использования криоконсервированной спермы быков путем улучшения криозащитных свойств синтетических разбавителей и разработка метода прогнозирования криоустойчивости спермы быков.

ссл едований:

, I. Выяснить видовые особенности надмолекулярной структуры плазматических мембран в гаметах барана и быка и влияние на данный показатель различных факторов.

2. Изучить влияние криообработки на систему регуляции пере-кисного окисления липидов в сперме животных.

3. Проанализировать особенности криогенных изменений метаболизма некоторых фосфатов в сперме.

4. Исследовать криозащитное и ангиоксндантное действие некоторых веществ на половые клетки барана и быка.

5. Еа базе результатов теоретические исследований разработать более эффективные приемы защиты гамет барана в процессе их глубокого замораживания.

6. Изучить влияние некоторых физиологических факторов на результативность осеменения овец 1фиоконсервированной спермой.

7. Разработать более аффективную синтетическую среду для замораживания спермы быков.

8. Изучить взаимосвязь некоторых физиологических показателей спермы быков с ее криорезистентностью. -

9. Разработать более совершенный метод прогнозирования криоустойчивости спермы быков. ., -

Шй02§5_22ё152й§' Впервые с помощью ЭПР-спектроскошш выявлены особенности надмолекулярной структуры плазматических мембран сперматозоидов барана и быка и влияние на нее различных факторов.

Установлено, что криоконсервация оказывает стимулирующее действие на пероксидацию липидов, особенно в гаметах баранов.

Впервые показано, что криообработка индуцирует утечку внутриклеточного антиоксидантного фермента - супероксиддисмутазы из спермиев барака и быка.

С помощью ЯМР-спектроскошга обнаружены особенности криогенных изменений метаболизма некоторых фосфатов спермы животных.

В семенной плазме быков выявлено присутствие криостабильно-го овуляторйого фактора. Установлены принципиально новые факты криогенных изменений иммуномодулирующих свойств семенной плазмы барана.

Разработана и внедрена в практику овцеводства новая синтетическая ГНУК-трнс-буферная среда для замораживания спермы баранов (A.c. Д 1408576,1988 г.).

. Впервые выяснено, что сухие яйцецродукты оказывают высокое крнозащитное влияние на сперму животных и могут использоваться в составе криоразбавителей спермы (A.c. № 1501333,1989 г.).

Выявлен новый синтетический антиоксидант, повышающий крио-устойчивость сперматозоидов барана.

Показано, что некоторые, широко применяемые в практике компоненты синтетических сред, обладают выраженным антиоксидантным действием и могут ингибировать процессы пероксидации липидов в гаметах животных.

На основе комплексонатов металлов создана новая синтетическая среда для замораживания спермы быков.

Разработан новый способ прогнозирования рриоустойчивостм нативной спермы быков, основанный на измерении с помодью ШР--спектроскопки уровня микровязкости плазматических мембран гамет (A.c. № 1813424,1992 Г. ).

Основные положения, выносимые на защиту:

- видовые особенности криорезистентности спермы баранов и быков обусловлены уровнем микровязкости плазматических мембран половых клеток и различной устойчивостью системы рефляции ие-рекисного окисления липидов в гаметах при криоконсервации;

- разработка ноеой синтетической ГЖУК-трис-буферной среды для замораживания спермы баранов и ее практическое применение;

- фенологические приемы повышения результативности искусственного осеменения овец криоконсервированной спермой путем использования миорелаксанта и гонадолиберина;

- прогнозирование криоустойчивости спермы .различных быков-производителей возможно на основе изучения взаимосвязи ряда физиологических характеристик гамет с их устойчивостью к воздействию низких температур.

Практическое значение работы. Выяснены некоторые видовые особенности, связанные с неодинаковой кряорезистентноагью спермы баранов и быков, которые могут быть полезными при совершенствовании методов криоконсервацин спермы других видов животных. Экспериментально обоснована возможность применения некоторых современных биофизических методов для анализа биологической полноценности нативной и криоконсервированной спермы животных.

1 Применение новой ГЕУК-трис-буферной среды для заморажгаашя спермы баранов, позволяет получать удовлетворительные для практики результаты искусственного осеменения овец.

Показано, что результативность осеменения овец криоконсервированной спермой может быть улучшена с помощью некоторых физиологических приемов.

Созданная синтетическая среда для замораживания спермы быков, позволяет повысить результативность искусственного осеменения коров.

Разработанный способ прогнозирования криоустойчивости спермы быков позволяет увеличить заготовку замороженных спермодоз на одного производителя и отбирать для пдемлредприятий животных с высокой криоустойчивостьв спермы.

Реализация результатов исследований. Материалы, полученные в экспериментальной работе, использованы при разработке научно-методических и нормативно-технических документов:

I. Методические рекомендации по технологии взятия, глубок

кого замораживания и использования спермы баранов-производителей при искусственном осеменении овец. - Москва,1986 г.

2. Методические рекомендации ло технологии кормления,содор-жания,подготовки высокоценных баранов-производителей к взятию семени, его глубокому заморагиванию и максимальному использованию выдающегося отечественного и зарубенного генофонда. - ВДНХ СССР ,1989 г.

3. Наставление по применении ГКУК-трис-буферной среды для разбавления,замораживания.хранения и использования спермы баранов-производителей. - ВШИплем,1992 г. Одобрено и рекомендовано в практику Ветеринарным фармакологическим Советом ГУВ Госагро-прома СССР 13 декабря 1988 г.

4. Разработанная ГНУК-трцс-буферная среда для замораживания сперии баранов используется на племпредприятиях 33 областей России и ближнего зарубежья.

А11роба1й1Я_рабо'та. Основные пологенля диссертации долохены з одобрены на:

- П'Всесоюзном совещании по химии и применению комплексона-тов я комплексонов металлов. - Москва,1983 г.;

- Совещаниях-семинарах по искусственному осеменению с.-х. яивогтос. - Москва,ВДНХ СССР (1987-1990 гг.);

- Всесоюзной научной конференции "Использование физических д биологических факторов в ветеринарии и животноводстве". - Витебск, 1991 г.;

- 71 конференции "Биоантаоксидант" -'Москва,1992 г.;

- научных чтениях, посвященных памяти академика Шдлованова В.К. - ВИЖД993 г.;

- ежегодных научно-методических конференциях ВНИИплем (1986-1993 гг.);

- на производственной совещании специалистов ПО "Хакасское". - Абакан,1993 г.;

- научно-методической конференция лаборатории биологии воспроизведения с.-х.животных ВШИ племенного дела,январь,1994 г.

По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ в журналах "Доклада ВАСХНИЛ", "Сельскохозяйственная биология", "Зоотехния", "Овцеводство" и Трудах ВНИИплем.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения

полученных материалов, выводов, предложений производству, списка литературы и приложения. Работа изложена на 51Ц страницах машинописного текста, содержит 70 таблиц и 7 рисунков. Список литературы включает 477 источников, из них 288 иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования выполнены в лаборатории биологик воспроизввдения с.-х.животных ВШИ племенного дела,на кафедре биофизики МГУ им.Ломоносова,отделе химической и биологической кинетики Института химической физики РАН.

Научно-производственные опыты в период с 1982 по 1993 гг. бшш проведены на базе хозяйств Хакасской и Калмыцкой республик, а также Московской и Тульской областей.

Объектом исследований служила сперма баранов различных пород и быков - голштино-фризской породы.

Для изучения видовых особенностей надмолекулярной структуры плазматических мембран гамет барана и. быка'был использован метод электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов (Л.Берлинер,1979). В качестве спинового зонда использовали 5-док-силстеарат.

Исследование особенностей пероксидации липидов в спермиях барана и быка проводили с помощью метода индуцированной ионами жачеза хешотоминесценцди (Ю.А.Владимиров, М.П.Шерстнев,1989). Определение концентрации липидных гидроперекисей в образцах спермы проводили с поискав спектрофотометра СФ-26 по методу В.Б.Гаврилова и М.И.Мшкорудной (1983), а концентрацию малонового диальдегида - по методу К. 8л п. (1978).

Анализ активности супероксидцисмутазы в натквной и криокон-сервированной сперме животных проводили хешшоминесцентным микрометодом {Т. Ним. е.а ,1984). При этом использовали медицинский хемилюминометр ХЛЛ I ц-01, ФЭУ-130.

Изучение метаболизма некоторых фосфатов в нативной и крио-консервированной сперме животных проводили с" помощью метода 31Р-ЯМР высокого разрешения (С. Ье.д.,1976). Спектры . .

высокого разрешения образцов спермы регистрировали на ЯМР-спектрометре АМ-400 ("Брукер",ФРГ). Влияние глубокого замораживания на иммуносупрессивные свойства семенной плазмы бара-

нов исследовали с помощью реакции бласттрансформации аллоген-ных лимфэцатов крови в присутствии конканавалина - А и семенной плазмы (А. Лтс <. л.,1985).

Оптимальное соотношение исследуемых компонентов,при разработке синтетических сред для замораживания спермы баранов и быков, находили методом встречных арифметических рядов с последующим уточнением биологическим методом процента подвикных сперматозоидов и их выживаемости в оттаянных образцах спермы (В.К.Милованов,1962). Изотоническую концентрации веществ для спермы определяли криоскопическим и биологическим методами.

Влияние различных веществ на криоустойчквость спермы баранов и быков определяли по подвижности и выживаемости оттаянных образцов спермы и по результатам искусственного осеменения овец и коров.

Для замораживания спермы использовали эякуляты с подвиж-,( востью не менее 80? и концентрацией спермиев - не менее 2 млрд/мл для баранов и I млрд/мл - для быков. Замораживали сперму обоих видов в форме открытых гранул объемом 0,2.мл на пластине сухого льда или фторопластовой пластине.

При изучении влияния физиологических факторов на результативность осеменения овец криоконсервированной спермой испытывали влияние специфического маточного миорелаксалта - утерорелак-сана, синтетического гонадолиберяна - сурфагона и антистрессового вещества - углекислого лития. При этом сперму баранов разбавляли и замораживали и ГЖУК-трис-буферной среде. Оттаивали сперму в злектрооттаивателе при 80°С. Овец осеменяли или однократно, сразу после утренней выборки, или двухкратно: сразу после выборки и повторно, через 8 часов. Результативность осеменения учитывали по ягнению овцематок.

В экспериментах по прогнозированию кржоустойчивости натив-ной спермы быков определяли жирнокислотный состав общих лилидов' гамет с помощью газо-жидкостной хроматографии (А.Г.Верещагин и др. ,1963) и их фосфолилидный состав по |$¿-¿СР^» М. Вал-Ылу (1982). '

Механическую резистентность гамет быков к воздействию ультразвука определяли по методу В.Б.Акопяна и др. (1991).

Уровень микровязкости мембран сперматозоидов быков в связи о их криоустойчивостыо определяли с помощью метода протонной

- 8 -

магнитной релаксации (Г.В.Архипова и др.,1990).

Биометрическую обработку полученных данных проводили по Е.К.Меркурьевой (1964).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Видовые особенности крворогистентностп спермы барака и быка

3.1.1. Уровень мпкровязкостп плазматических мембран гачет

Для соворшепствовашш методов глубокого заморашшашш спермы с.-х.животных необходимо дальнейшее более глубокое изучений прачзш ее неодинаковой криоусгойчявости у разных вгдов шшотных.

Учитывая важную роль плазматических мембран в процоссе крпоконсерващш клеток, цельв наших исследований бшо сравнительное изучение параметра упорядоченности неубранных лышдов сперматозоидов барана и быка до к после крповоздействия.

Для исследования физического состояния комбран бил использован метод электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов. В таблице I представлзш дашшв по определенна параметра" упорядоченности спектра ЭПР в мембранах дативных сперматозоидов.

Таблица I

Параметр упорядоченности зонда в мембранах натпвных сперматозоидов

| !Йодвианость спертПараметр упоря-Виды животных ; п. {матозоидов (в %)¡доченкостп зов_|_|_;_|да ( ^ )_

Бараи 10 80 0,663*0,006

Бык 10 80 0,703*0,005

Установлено, что имеются видовые различия молекулярной , структуры мембранных липидов: параметр'упорядоченности, характеризующий подвижность зовда в мембране, в нативных снермато-зоидах барана ниже по сравнению с быком (Р<£0,01). Это свидетельствует о меньшей микровязкости лишдной части мембраны в сперматозоидах баранов.

Результаты экспериментов по влиянию криообработки на структурное состояние мембран спермиев животных показали, что под влиянием глубокого замораживания происходят изменения конформа-цнонного состояния их мембраны. Уже в процессе охлаждения до +4°С происходит увеличение параметра упорядоченности мембранных липидов,' вероятно, обусловленное нарушениями белково-липидннх связей в мембране и выходом части фосфолиплдов из мембраны в окружающую среду.

Процесс замораживания-оттаивания приводит к дальнейшему нарастанию биоповреждений мембраны, о чем свидетельствует повышение параметра упорядоченности.

После замораживания сперматозоидов в среде без желтка, гаметы барана 'сохраняли довольно высокую подвижность сразу после оттаивания, в то время как у быка, подвижность наблюдалась у единичных сперматозоидов. Но время сохранения подвижности было рцзко снижено по сравнению с замораживанием в среде с желтком. Вероятно, большая разупорядоченность мембранных липидов у барана и обусловливает повышение выживаемости сперматозоидов при замораживании в србде без желтка. Но с другой стороны, эта особенность юс мембраны может быть ответственна за снижение результативности осеменения овец криоконсервированной спермой.

Синтетические среды для разбавления и замораживания спермы кивотннх содержат различные гидрофильные а гидрофобные компоненты, оказывающие криозащитное влияние на гаметы.

Механизмы защитного влияния различных компонентов окончательно пока не выяснены.

В этой связи актуальным представляется изучение влияния различных веществ непосредственно на плазматическую мембрану сперматозоидов.

Результаты наших экспериментов показали, что добавление желтка в состав разбавляющей сроды приводит к снижению параметра упорядоченности спинового зовда в мембранах сперматозоидов, что свидетельствует об уменьшении микровязкостп липидной части мемб-ранй в ответ на добавление желтка. Причем, у быка отмечается более заметный результат р&зупорядующего действия желтка по сравнению с гаметами барана (Р<0,01). Возможно, это связано с тем,что мембрана нативных сперматозоидов барана характеризуется меньшей ' ыякровязкостью по сравнению с быком.

- 10 -

Разупорядочивающее действие желтка на мембрану прекращалось после отмывания гамет в безжвлточном буфере. Это свидетельствует о поверхностном взаимодействии фосфшшпидов желтка с плазматической мембраной сперматозоидов, в результате чего изменяется ее физинеское состояние. Вероятно, снижение микровязкосги мембраны под действием желтка каким-то образом и позволяет повысить крио-устойчивость сперматозоидов.

Изучение влияния на мамбрану гамет различных гидрофильных компонентов синтетических сред показало, что ош не оказывали влияние на уровень ее микровязкости.

3.1.2. Особенности перекисного окисления липидов в гаметах

Имеются данные, что криоконсервация может оказывать стимулирующее воздействие на пероксидацию липидвв (ПОЛ) в сперме некоторых видов животных, что может оказывать отрицательное влияние на ее фертильность (В.Кононов, А.НарикныЙ,1981; В.Наук, А.Гуськов, 1983). В связи с этим мы изучали влияние криоконсервадии на уровень пероксадации липидов в гаметах баранов и быков с помощью метода индуцированной хемилюминесценции.

Результаты предварительных экспериментов показали, что натнв-ные сперматозоиды барана и быка имеют очень слабую спонтанную хо-милюминесценцию (ХЛ). При добавлении же к образцам гамет ионов железа, происходила инициация ПОЛ, сопровождающаяся характерной для каждого вида животных кинетикой ХЛ.

Причем, на кривой ХЛ сперматозоидов быка удается наблюдать только быструю вспышку свечения после добавления ионов железа, развития же медленной вспышки ХЯ во происходит. В то время, как у барана можно было наблюдать быструю и медленную вспышку ХЛ.

Эти результаты свидетельствуют, что в катнвных гаметах барана ПОЛ инициируется при добавлении ионов железа значительно сильнее по сравнению с быком. Мембраны сперматозоидов быка имеют, вероятно, более мощше антиоксядантные системы, обеспечивающие устойчивость системы регуляции ПОЛ к инициирующему воздействию ионов железа.

В следующем опыте изучали влияние криообработки гамет на кинетику ХЛ (табл.2).

Таблица 2

Величина амплитуды быстрой и медленной (Н) вспышек ХЛ в суспензии оттаянных сперматозоидов

-!-Г

Группа опыта ! „ !

Бык ; Баран

! * | ^ 1 „ ¡—У Г

Н {н

До замораживания 7 0,58*0,04 0 0,74*0,07 0,83*0,04 Через 10' после . ,

оттаивания 9 0,51*0,11 0,24*0,08 0,34*0,08* 0,96*0,18

Через 30' после . . . , „

оттаивания 9 0,47*0,08 0,11*0,02 0,29*0,04** 1,00*0,15й

Через 90' после

оттаивания ' 9 0,56*0,06 0,19*0,02 0,19*0,0?** 1,10*0,17**

Через 120'после , . „

оттаивания 9 0,41*0,04 0,04*0,01 0,43*0,14* 1,10*0,15**

*Р<0,05; ** Р*0,01.

Из таблицы 2 видно,что процесс крноконсервации сперматозоидов оказал стимулирующеа влияние на пероксидацию лигшдов. Это характерно даже для более устойчивых гамет быка. Если в нативных гаметах быков не било отмечено развития медленной вспышки ХЛ, то после оттаивания она была четко выражена, но ее амплитуда снижалась по мере инкубации оттаянных сперматозоидов при 3?°С с 0,24 до 0,04 х 10 квант/с-

Амплитуда быстрой вспышки у этого вида тавотных после огта-явання была практически одинаковой на протяжении всего времени исследования. Амплитуда медленной вспышки у быков, после кратко. временного подъема сразу после оттаивания, уже через 30 минут инкубации начинала снижаться и к концу второго часа практически исчезла, что свидетельствует о возрастании активности аитиокси-дантной системы в гаметах быков в этот период.

В образцах оттаянных сперматозоидов барана амплитуда свечения быстрой вспышка снижалась сразу после оттаивания в оставалась практически на одяои уровне в течение периода наблюдения.

Амплитуда же медленней вспышки у этого вида животных сразу после оттакванжя возросла на 15^ ж к концу периода наблюдений повысилась на 32^ (Р<0,05). Это свидетельствует как об интенсификация компонентов ПОЛ, так ж об »славленая функции антиокси-

дантной системы в гаметах баранов, подвергнутых криообработке.

В следующем опыте мы изучали влияние криовоздействия на скорость спонтанной лероксвдации липидов в образцах спермы животных (табл.3).

Таблица 3

Концентрация продуктов ПОЛ в замороженно-оттаянных образцах спермы животных

Продолжительность инкубации оттаянной спермы при 37 С, мин

№Ж1/^°ШРеКИСИ' тохь/м

баран ! бык ! баран Г бык (п. =в) ) (п =4) {(¿=6) I (п=4)

Вативная!сперма 0,80*0,07 0,72^,01 6,40±0,1 4,9±0,1

5' после оттаивания • 0,78±0,07 0,43±0,01 6,2±0,2 5,3*0,1

30'после оттаивания 0,70*0,05 1,50*0,5й 7,1*0,3 4,8*0,3

60'после оттаивания 0,64*0,05 1,10*0,1 .7,7*0,4* 5,1-0,2

120'поеле оттаивания 0,40*0,04* 0,50*0,06 8,3*0,3й 5,2*0,4

35 Р<0,05. '

Показано, что в образцах спермы быка через 5 шнут после оттаивания концентрация липидных гидроперекисей несколько снизилась. Затем, через 30 минут после инкубации при 37°С она возросла в 2,1 раза (Р^.0,05). После этого их концентрация начинала снижаться и через 2 часа после оттаивания она достигла практически первоначального уровня.

Концентрация ЦДА в сперма быка после оттаивания в течение 2-х часов оставалась практически на том Ее уровне,, что и до замораживания. Вероятно, эндогенные антисксиданткые системы спермы прерывали повышенный уровень перокевдации лшщцов путем инактивации повышенной концентрации первичных продуктов ПОЛ.

В сперме жа барана концентрация МДА. через 5 минут после оттаивания была такой же, как и до замораживания (6,4 и 6,2 нмоль/мл соответственно). Но в процессе дальнейшей инкубации оттаянных спершев при 37°С, происходило нарастание концентрации МДА. Уже через 30 минут после опаивания его концентрация увеличилась.ва 14%, а через 2 часа - превышала начальный уровень на 34?!. Кон- • ценграцвя же липидных гидроперекисей к концу периода инкубации снизилась на 49$.

- 13 -

Полученные результаты свидетельствуют, что криоконсервация оказывает стимулирующее влияние на ПОЛ, особенно в сперме баранов. Это может являться одной из причин снижения фертильности крноконсервированной спермы баранов.

3.1.3. Активность супероксиддасмутазы в сперме животных

Известно, что в клетках животных спонтанное ПОЛ может индуцироваться супероксидным радикалом ( ), который является родоначальником всех активных форм кислорода (И.Б.Афанасьев,1388; Ю.А.Владимиров и др.,1991).

Большинство аэробных клеток имеет эндогенные антиоксидант-ные ферменты, ключевым из которых является супероксиддисмутаза_ (СОД).

В связи с тем, что сперматозоиды барана более подвержены пе-роксидации липидов, мы предположили, что это может быть связано с различным уровнем содержания данного фермента в сперме сравниваемых видов животных.

В связи с этим, нами были проведены эксперименты по сравнительному изучению концентрации супероксиддасмутазы в нативной и криоконсервированной сперме баранов и быков.

Результаты изучения активности СОД в нативной сперме показали^ что в гаметах барана и быка активность фермента была практически одинаковой: 22 и 25 ед.акт/109 кл соответственно.

В семенной плазме баранов и быков активность СОД соответственно составляла II и 8,7 ед.акт/мл.

Данные о влиянии' Процесса замораживания-оттаивания на активность СОД в половых клетках представлены в табл.4.

Результаты этого эксперимента показали, что процесс замораживания-оттаивания оказал значительное влияние на потерю внутриклеточного фермента половыми клетками, что сопровождалось его утечкой в инкубационную среду.

Установлено также, что имеются определенные межвидовые различия по скорости утечки внутриклеточной СОД из спермиев после их кржообработкн. Так, скорость выгода фермента из гамет баранов была заметно выше, чем у быка. Максимальный выход СОД из половых клеток барана наблюдался ухе через 60 минут после оттаивания, в

Таблица 4

Влияние криоконсервашш на утечку СОД из сперматозоидов в окружающую среду

Образцы спермы (инкубация при 37°С)

Т

Баран ( л =Ю)

Т

Бык (П=8)

!подвижность!активно сть~! подвижность!активность "гамет (в %) ! СОД !гамет(в %) ! СОД

!(ед.акт/ил ! . ! (од.акт/ьзл. ' СРЭДН) .1_• I свод»)

До замораживания

Через 15' после оттаивания

Через 60 ' после оттаивания

Через 120' после оттаивания

82±5,7 41±4,8 32±2,8 25±3,4

2,2±0,2 6,7±0,4535 •7,5*0,2** 7,0^0,3^

80*8,1 40±6,2 30±4,1 28±5,0

2,3±0,1 5,3±0,3Й 5,3*0,2? 8,2±0,4га

й Р^.0,05; ** Р^0,01.

то время как у быка - через 2 часа. Хотя скиненне подвижности гамет сразу после оттаивания и в течение инкубации у ободх видов животных было практически одинаковым. Следовательно, в шгазготических мембранах сперматозоидов барана после их огтигвания,быстрее развиваются краодеструктшзкые повреаденая, г частности, изменяется их проницаемость, следствием чего н является более быстрая утечка суперокснддисыугазы из клеток в окружающую сроду. Снижение активности СОД в спершшс в результате криоконсервашш может способствовать увеличению внутриклеточной концентрации активных кислородных радикалов, способствующих бнрдвструхдаи и инициации пероксидации липидов в спермиях, что может снижать фертилькость оттаянной спермы животных.

3.1.4. Криогенные изменения метаболизма некоторых фосфатов спермы

С целью выяснения вопроса о возможности изучения криогенных изменений метаболизма некоторых фосфатов в сперме животных с помощью метода 31Р-ЯМР-спектроскопии, были проведены опыты на • сперме баранов и быков. В результате анализа спектров 31Р^ЯМР нативных образцов спермн баранов и быков быяо установлено, что сигналы фосфора в области (+0,35) ы.д. обусловлены фосфатной

группой глицеро-З-фосфорилхолина (ГФХ), а в области (+0,6) -(+1,3) м.д. - неорганическим фосфатом ( РI ).

Результаты измерений интенснвностей сигналов ГФХ и Р^ в образцах спермы до и поело криокоисервации показали, что в натав-ной сперма барана концентрация ГФХ и Рс была вша по сравнению о таковой у быка, на 35 н 4.0% соответственно (Р>0,05). Криооб-работка но оказала влияния на содерхание в сперме обоих видов яивотных глицеро-3-фосфорклхолнна.

Более заметной была тенденция изменения концентраци; в оттаянной сперме неорганического фосфата.

Так, в сперме быков концентрация РI через 2 часа после оттаивания и инкубации при 37°С увеличилась на 22%, а в сперме баранов, за тот зе период наблюдения, его концентрация возросла на 50$ (Р>0,05). Динамика содержания изучаемых веществ в спермо после оттаивания практически не коррелировала с подвижностью га-мот. Снижение шс подвижности поело замораяиванпя-оттаявашл было сходным у обоях видов животных. Результаты данных экспериментов сввдбтельствуюх, что в спермо баранов.имеется более выраженная тенденция нарастания концентрации неорганического фосфата после замораляваная-оттаивашхя. Не исключено, что пониженная фзртзльность крзоконсервпрованной спермы баранов мояет бить связала с этпн фактом.

3.1.5. Гоиэдотрошшя активность семенной плазмы шшотных

С целью повшшпя разультаттшосгя осеменения овец краокон-сорвлрованноа слормой актуальным является изучение биоактивных веществ семондой плазмы а их сохранности в процессе залюражива-ння-оттадвандя. Недавно установлено, что в семенной плазме верблюдов содержатся вещества, индуцирующие овуляцию у самок этого' вида ( Я. СА.гп. ,1385). В этой связи мы предположили, что и в семенной шаэиа баранов и быков может содержаться подобное вещество, п не исключено, что неодинаковая криостабильность данного вещества ыояет быть связала с фертпльностью оттаянной спермы этих животных.

Для выяснения этого вопроса были проведены эксперименты на

крольчихах, которым вводили внутривлагалищно нативную, или крио-консервированную семенную плазму различных видов животных(табл.5).

Таблица 5

Влияние нативной семенной плазмы животных на овуляцию у крольчих

Вид ¡Объем ввс-¡Число кро{Число кральтОбнаружено]Количество животных ¡денной ¡льчих в ¡чих с овуля-гжелтых тел;желтых тел

¡плазмы(мл);опыте ¡цией ; (всего) '.на самку

........

Баран 1,2 10 -_.«.•

Бык 1,0 12 6 45 7,5

Жеребец 1,0 10 .1 3 3

Кролик 1,2 9 -Хряк 1,1 13

Из таблицы видно, что семенная плазма быков оказала стимулирующее влияние на овуляцию у крольчих. Овуляция наступила у. 50$ самок. Это свидетельствует о том, что в семенной плазма быков содержится какое-то вещество, индуцирующее овуляцию у кроликов.

Опыты по изучению сохранности биоактивного вещества семенной плазмы быков после крио- и высокотемпературной обработки показали, что процесс глубокого замораживания сеызншй плазмы быка не оказал ннактивирувдего влияния на активность ее овулятор-ного фактора.

Нагревание ге семенной плазмы до 90°С привело с полной инактивации данного фактора. Представляет несомненный практический интерес выяснение природы данного фактора и его влияния на репродуктивную функцию у КРС.

3.1.6. Иммуномодулирущие свойства семенной плазмы

Известно, что в семенной плазме животных содержатся ишуно-депрессанты (В.Й.Говалло,1987).

В связи с проверкой гипотезы о возможных криогенных изменениях иммуяорегулирупцих свойств семенной плазмы баранов ыы исс- ' ледовали иммуносунрессивное влияние их нативной и крноконсерви-рованной плазмы на аллогенные лимфоциты крови.

_ 17 -

. Результаты экспериментов показали, что добавление нативной семенной плазмы баранов к культуре клеток крови при разбавлении 1:200 и 1:400 оказало некоторое супрессивное влияние на бласт-трансформацгоо лимфоцитов, при этом включение %-тимидина в лимфоциты во сравнению с контролем было ниже на 18 и 12% соответственно (Р<0,05). При снижении концентрации семенной плазмы в культурной среде, начиная с разбавления 1:800, отмечено ее стимулирующее действие на включение мононуклеарачи меченого предшественника. При добавлении же в среду культивирования плазмы в разведении 1:3200, стимуляция включения %-ти:л1Дина составляла 350$ по сравнению с контролем (Р-^-0,01).

Культивирование мононуклеаров в присутствии з&чороженно-от-таянной семенной плазмы при всех разбавлениях привело к значито-льной стимуляции включения Н-тимидина.

При этом максимальный уровень включения метки был в культурах с разбавлением плазмы 1:800 и 1:1600 и превышал таковой в контроле в 6,1 и 6,2 раза соответственно (Р^-0,01). Резкое усиление иммуноактивирующих свойств семенной.плазмы после криообра-боткн, вероятно, может быть связано с понижением фертильности крноконсервированной спермы баранов.

3.2. Влияние различных веществ на криоустойчивость спермы барана

3.2.1. Действие неэлектролитных и электролитных компонентов среды '

В технологки длительного хранения спермы баранов первостепенное значение отводится разработке более совершенных криоза-цатных разбавителей.

На основе комбинации различных соотношений ксилита, лактозы, трис-(оксиметшг)-амивометава, декстрина, глицерина и желтка куриных яиц, грилона-Б.нами была разработана новая синтетическая среда для замораживания спермы баранов, названная ГЖУК-трнс--буфэрной средой (глицерино-чкелточно-углеводно-комплексонатно-трас-буфернал среда).

Оптимальный состав данной среды следующий, г/100 см3 дистиллированной воды: лактоза - 8,4; декстрин кукурузный - 5,0;

коалит - 0,26; трис-(оксиметил)-ашшометан - 0,105; трилон-Б -- 0,135; глицерин - 6,0; желток - 20,0.

Проверка криозшцитного влияния различных декстринов, цри их введении в состав новой среды, показала, что лучшими защитными свойствами на спермин барана обладает кукурузный декстрин с растворимостью 67%.

При изучении криофилектического действия на спсрму барана различных концентраций глицерина в составе ГЖУК-трис^уферной среды было выяснено, что наивысшие показатели подвижности и выживаемости оттаянных сперыиев получены при концентрации глицерина 4-6%.

Выяснение оптимального срока эквилсбрации глицерина со сперматозоидами показало, что различная продолаательность экспозиции глицерина с половыми клетками барана (5, 15, 30, 60 и 120 мин до замораживания) не оказывает значительного влияния на их подвижность сразу после оттаивания. Однако, срок выживаемости оттаянных сперматозоидов резко снижается при сокращении времени их экспозиции с глицерином до 5-15 минут. Поэтому оптимальный период инкубации спермы барана с глицерином в ГШС-тряс-бу-ферной среде должен быть не менее 60 минут.

После установления оптимальных дозировок различных компонентов и способов их введения в состав новой среды, мы проанализировали криозащитные свойства новой среды по сравнению с гуи«г-арабиковой, которая применяется в практике осеменения овец.

Было установлено, что цри замораживании спермы баранов в новой сродо, подвижность оттаянных сперматозоидов и их выживаемость была выше, чем в гуммиарабиковой среде (Р-^.0,05). Это позволяет увеличить степень разбавления свежеполученной спермы без снижения числа биологически полноценных гамет в дозе для осеменения.

Одномоментное разбавление спермы в опытной среде не оказало отрицательного влияния на подвижность гамет по сравнению с двухмоментным разбавлением в гуммиарабиковой среде.

В следующем эксперименте изучали результативность искусственного осеменения овец спермой, замороженной в ГЖУК-трис-буфар-ной и гуммиарабиковой среде.(табл.6).

Было установлено, что в опытной группа объягнился такой же. процент маток, как и в контроле, несмотря на уменьшенное число сперматозоидов в дозе для осеменения. Многоплодие маток также

- Й -

ив отличалось по группам.

Таблица б

Эффективность искусственного осеменения овец

спермой,замороженной в различных средах

!Степень{концен- ¡Осе- ¡УчтвуОбъ-;^ объяг-;Числдо , разбав-; грация ¡мене-{но ¡ягни-гнившихся; ягнят Состав среды ¡ления ;спорна- ;но ; ¡лось; ¡на мат-| спермы -.тозоидов; овец ; ; \ ¡ку ! {в дозе ; Л I после оту { } | | _|_-татаагоцг _:_

ГНУК-тряс-<5у- ,

форная 1:3 60-70 109 101 52 51*4,9 1,4*0,3

Контрольная , (гуммпарабико-

вая) 1:2 80-90 103 99 51 52*5,0 1,5*0,2

Преимуществам! новой ГЕУК-трис-буферной среды для замораживали спермы баранов, во сравнению с гуммиарабиковой, является возможность снижения числа сперматозоидов в дозе для осеменения. При этом моано на 20-25% увеличить количество заготовленных спермодоз, получаемых при замораживании спермы от одного барана. Это позволит повисать коэффициент племенного использования особо ценных производителей. Кроме того, использование данной среды более технологично по сравнению с гуимнарабиковой, т.к. допускается одномоментное разбавление спермы.

Данная среда одобрена и рекомендована к практическому применению Ветеринарном фармакологическим советом ГУВ СССР (протокол й 8 от 13 декабря 1988 г.).

3.2.2. Криозацитные свойства сухих яйцепродуктов

В задачу наша исследований входило изучение криозащитного действия сухих яйцепродуктов при замораживании спермы баранов.

Было установлено, что сухой желток и яичный порошок куриных лиц оказывает выраженное криозащнтное влияние на гаметы барана.

Лучине показатели по подвижности п абсолютному показателю выживаемости были получены при использовании сухих яйцепродуктов в концентрации 4%. Поэтому, именно с этой концентрацией яйцепродуктов в составе ШК-трис-буферной среды были проведет дальнейшие лабораторные и производственные испытания.

В следующем эксперименте изучали возможность совместного хранения сухих яйцепродуктов с другими компонентами синтетической ГЖУК-трис-буферноЙ среды при различных температурах, а также влияние сроков хранения на их криопрогективные свойства.

Изучение возможности совместного хранения сухих яйцепродуктов с другими компонентами ГЖУК-трис-буферной среда при различных температурных режимах показало, что температурный режим хранения оказывает значительное влияние на биологическую полноценность препаратов. При температуре 4°С срок хранения сухого порошка и желтка удлиняется. Совместное хранение яйцепродуктов с другими компонентами синтетической среды неблагоприятно влияет на биологическую полноценность криоконсервировакной спермы. Максимальный срок хранения сухого желтка составляет 6-9 месяцев, а яичного порошка - 3 месяца при температуре 4°С.

Затем были проведены производственные опыты по осеменению овец спермой, замороженной с сухими яйцепродуктами в составе, ГЕУК-трис-буфорной среды (табл.7).

Таблипд 7

Результативность осеменения овец спермой,замороженной с сухими яйцепродуктами

•¡Кокцен-|Освме}выбшю{УчтетОбъяг-^ объят-|Получе-Группа опыта ¡трация ;нено ¡из опы+но ,нилось,нившихся;но яг-¡яйцепро-говец ,та , } ; ,нят на _¡ду|т0в,| ¡"_| |_{ [овцу

Сухой желток 4 72 2 70 33 47±5,9 1,42±0,1

Яичный порошок 4 128 4 124 65 52,4*4,5 1,45±0,3 Контроль

(натвный жел- ' ,

ток) 20 181 8 173 87 50±3,8 1,45±0,1

Из таблицы 7 видно, что замораживание спермы баранов с сухими яйцепродуктами не оказало отрицательного влияния на биологическую полноценность сперматозоидов. В опытных группах процент ягнения овец был практически одинаков с контролем* что свидетельствует о высоком криозащитном влиянии испытанных препаратов. '

Экономический эффект от применения сухих яйцепродуктов в составе синтетических сред для спермы животных складывается из

снижения себестоимости среды и сокращения расхода куриных яиц для целей искусственного осеменения.

3.2.3: Влияние антибиотиков

Одним из факторов, оказыващих влияние на результативность осеменения овец является степень 'ее микробной загрязненности.

Использование антибиотиков при криоконсервации спермы баранов сдергивалось тем, что сперши барана более чувствительны к токсическому влиянию антибиотиков по сравнению с быками. В этой связи актуальны поиски менее токсичных антибиотиков-для их спермы.

В задачу наших исследований входило сравнительное изучение влияния антибиотика "Спермосан-3" и нового антибиотика "Спер-мосан-ШШ" на биологические показатели криоконсервированной спорны.

Результативность искусственного осеменения овец спермой, замороженной с различными антибиотиками, представлена в табл.8.

Таблица 8

Влияние антибиотиков на результативность осеменения овец криоконсервированной спермой

илггппт.г.ппя1гстр ¡Доза антитОсемене-гОбъягнит^ объягшш|Получено НЙГ |биотика ¡но овец;лось ¡шихся . ягнят на антиоиотиков гыс#ед./ матку .

100 ш

Спермосан-3 25 53 23 43*6,8 1,4*0,2

50 32 9 28*7,9х 1,3*0,1

Спермосан-ППК 25 56 28 50*6,7 1,4*0,1

50 58 26 45*6,5 1*5*0,2

100 33 14 42*8,6 1,5*0,1

Контроль (без антибиотика) — 59 '29 49*6,5 1,5*0,2

й Р-40,05.

Испытания показали, что при использовании Спермосака-3 в дозе 50 тыо.ед. резко снизилась результативность осеменения: 28$ объягнившихся овец против 49£ в контроле- (Р<0,05).

- 22 -

Применение ло нового антибиотика, даже в повшешшх дозах, не привело к резкому сшшешго оплодотворяеыости маток. Лучшее влияние на результативность осеменения оказал Сперыосан-ППК в дозе 25 тыс.ед./100 ыл среды. При этом, оплодотворяемость была такой же, как в контроле. Использование данного антибиотика в дозах 25-50 тыс.ед. на 100 цл среда не оказывает отрицательного влияния на результативность осеменения овец замороженной опорной, в связи с чем он рекомендован для практики искусственного осеменения овец.

3.2.4. Действие различных антиокспдантов

В данном разделе работы било проверено криозавдтноо влияние некоторых низкомолекуляршх тнолов при замораэгвашш спермы баранов в простой лактозо-аелточно-глицериновой н более сложной - ГЕУК-трисчЗуферной средах. При этом препараты использовались в оптимальных дозировках для спермы баранов.

Установлено, что при заморапшании спермы баранов в простой лактозо-глицерино-аелточной среде с Ъ% салтка некоторые тиолы оказали высокое криозапщгное действие. Так, подшшюсть гамет, замороженных в присутствии укитиола, била вша на 11%, с цистеином - на Ё$ и с глутатионоа - на 6% по сравнению с контроля ем. Абсолютной показатель выживаемости оттаянных сперматозоидов при использовании унитиола повысился в 5 раз, а в груше с глугатиопом и цастешши - в 3 раза по сравнения с контролем (Р<0,01).

При заморагивании спермы с 10$ желтка криозащзтное блня-1ше тнолов выразилось в меньшей степени. Подвижность половых клеток после оттаивания во всех группах била практически одинаковой с контролем. Абсолютный показатель выживаемости гамег в группе с глутатионоы превышал контроль на 2Ъ%.

• При повышении концентрации гелтка в ЛГЖ-среде до 20$» защитного влияния тнолов на криоустойчивость сперматозоидов от, мечено не било. Вероятно, вовыаешщз концентрации хелтка (10-20%) оказываю? положительное влияние на криоустойчивость сперматозоидов, залипая 3 Н-группн гамет от окисления благодаря содержанию в нем эндогенных ткосоедшшшй, в частности, оеросо-дёраащх аминокислот.

В следующем опыте по замораживанию спермы баранор в более сложной ГЗУК-трпс-буферной среде было установлено, что защитного влияния тиоли на половые клетки в данной среде по сравнению с ЛГЗ-сродой практически не оказали.

Это свидетельствует о том, что использование для замораживания спорны баранов более совершенных синтетических сред, вероятно, оказывает самостоятельное'защитное влияние на сохранность SН-групл сперматозоидов, подобно высоким концентрациям желтка.

В следующей серш экспериментов изучалось влияние новых синтетических воднорастворимых антиоксидантов на криоустойчи-вость сперма баранов. Испытано действие следующих препаратов: гшфена-натрия, фзноксана, ИХФАН-2 и ИХФАН-3. Все они являются фенольнимн аптпокендантачи. В предварительных опытах были установлены минимально токсичные дозировки изучаемых препаратов дшх спермы баранов- Оказалось, что таковыми являются для анфо-на-натрия - 0,05 мг/мл, феноксона - 0,005, ИХФАН-2 - 0,01 и ИХФАН-3 - 0,02 мг/мл.

Затем было изучено защитное действие этих препаратов ка живучесть нативной спермы баранов при добавлении к ней экзогенных липидных перекисей.

Было установлено, что лучшим защитным влиянием на живучесть натпвяой спермы при добавлении к ной пэреокисленного растительного масла, обладал феноксан. При его добавлении абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов был в два раза-внпе по' сравнению с контролем (Р<С0,05).

Испытание криозасдатного действия воднорастворимых антиоксидантов в составе ГЖУК-трис-буфэрной среда на спермин барана показало, что ни одш препарат но оказал положительного влияния па подвижность оттаянных сперматозоидов или абсолютный показа- ' тель их выживаемости. Вероятно, гидрофильные антиоксиданты не препятствуют процессам ПОЛ в мембране и внутренних структурах . гамет при их криоконсервацаи. ■

В связи с тем, что в последнее время для оттаиваиия спермы баранов применяют повышенные температуры (75-80°С), которые могут ускорять ПОЛ при перегревании спермы, было проверено защитное действие гидрофильных антиоксидантов па спёрматозоиды, при их инкубации при повышенных температурах(+44°С).

Результаты этого эксперимента показали, что в условиях повышенной температуры феноксан оказал наибольшее защитное воздействие на гаметы. При этом абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов увеличился на 25$ по сравнению с контролем <Р<0,05).

Затем было изучено криозащитное действие на сперму баранов новых жирорастворимых синтетических антиоксидантов фенольного ряда: ИХФГАН-I, ИХФГАН-2, ИЙГАН-3, ИХФАН-26. Предварительное изучение различных дозировок препаратов на живучесть сперматозоидов барана показало, что оптимальные нетоксичные дозировки этих препаратов находятся в пределах 0,02-0,08 мг/мл среды.

Результаты изучения криозащитного действия этих препаратов па сперматозоиды барана, при их замораживании в Г2УК-трис-бу-ферной среде на фоне различной концентрации желтка показали, что из всех испытанных препаратов, заметным криозащитным действием обладает только ИХФГАН-3, Причем, его положительное влияние на живучесть оттаянной спермы отмечено при всех концентрациях желтка в составе среды. Оптимальное защитное действие препарат оказал в концентрации 0,04 мг/мл. Использование препарата в данной дозе при Ь% желтка повысило абсолютный показатель живучести оттаянной спермы на 33£; при I0& желтка - на 4Ь% и " "при 20$ желтка - на 33$ (P¿.0,05). Затем бшш проведет опыты по искусственному осеменению овец спермой, замороженной с оптимальной дозой ИХФГАН-3 (табл.9). Овец осеменяла однократно в течение эструса. •

Таблица 9

Влияние ИХФГАН-3 на результаты осеменения овец криоконсервированной спермой

!КонцентрацйяТОсеменено ! 'Шолуче-

Вари»» «, fi-T—l "" ! У Т »

'_I_1 I ^ i * ¡матку

Среда с ИХФГАН-3 0,004 33 13 39*6,5 1,5*0,1

Контроль 0 27 8 30*6,8 1,5*0,1

Результаты эксперимента показали, что при использовании ' антиоксиданта объягнилось на 9% больше овец, чем в контроле (Р >0,05).

- 25 -

Следовательно, использование ИХФГАН-3 в оптимальных дозах повышает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы баранов.

3.2.5. Антиокислительная активность различных компонентов синтетических сред

Механизмы протективного действия многих веществ, входящих в состав различных криоразбавитвлей спермы, окончательно пока не выяснены и требуют дальнейшего изучения.

Поэтому в задачу наших исследований входило изучение анти-окяалитедьного влияния на сперматозоиды барана некоторых компонентов, широко применяемых в составе различных криоразбавителей спермы: глюкозы, лактозы, цитрата натрия, хелатона, трис-Сокси- ' метшО-аминометана, ксилита, глицерина и декстрина.

Антиоксидантное действие веществ изучали хемилюминесцент-нш! методом, при индуцировании перекисяого окисления липидов в образце сперматозоидов барана с помощью ионов железа.

Результаты анализа кривых хеыилюминесценции в образцах сперматозоидов при добавлении различных соединений показали, что они оказывают существенное влияние на характер протекания свободпо-радикалышх окислительных реакций при индуцировании ПОЯ исками железа.

Все исследуемые вещества снижали амшштуду свечения медленной всяшки. Наиболее эффективными ингибиторами развития' медленной всшака оказались декстрин и вдтраг натрия. В их присутствии интенсивность свечения данной вспышки снижалась соответственно в 10 и 7,3 раза по сравнению с контролем (Р<0,01). Глтоза я лактоза оказали практически одинаковое ингибирующее влияние на свечение этой вспышки.

На основании подученных результатов можно заключить, что вез испнгашшз в данном опыте вещества, помимо их известных крпозагцггЕШХ механизмов действия на гаметы, обладают также вы-рааоЕпш апетоксидантннм действием.

Компонента синтетических сред для соерш животных могут оказывать на толысо актиокегдаитное, но и прооксидантное действие. В частности, в состав большинства криозадитяых сред вхйгдат желтой куриных яиц. В зависимости os сроков хранения яиц, лили-

ды желтка могут подвергаться перекисному окислению. При этом продукты реакции ПОЛ, попадая в состав разбавителей для спермы животных, могут оказывать отрицательное влияние на биологическую полноценность гамет. В связи с этим мы выясняли вопрос о накоплении продуктов пероксидации липидов в нативном желтке в зависимости от сроков хранения куриных яиц при температуре 4°С.

Анализ проведенных исследований показал, что концентрация в желтке липидных гидроперекисей и малонового даальдегвда увеличивалась в 2 раза после десяти дней хранения яиц при 4°С. В этой связи, при использовании желтка в составе синтетических сред для спермы животных, желательно использовать куриные яйца, сохраняемые не более 5-10 дней при 4°С.

3.3. Влияние физиологических факторов на результативность осеменения овец замороженной спермой

3.3.1. Увеличение глубины введения спермы в цервикальный канал с помощью утерорелаксана

Имеются данные, что глубокоцервикальное осеменение овец замороженной спермой повышает результативность их осеменения (В.К.Мидованов,1984; И.Н.Найдуллин,1979).

Нами изучалась возможность более глубокого введения спермы в цервикальный.канал овец при использовакхш спецафзческого миорелаксхшта-уторорслйксаиа.

В предварительных экспериментах изучали влияние различных дозировок препарата на глубину введения катетера в цервикальный канал овец. Было установлено, что оптимальной дозой является 3-4 мл препарата на самку. После введения данной дозы утерорелаксана овцам, удалось в 2 раза увеличить глубину введения катетера в цервикальный канал (3,5 си против 1,6 см в контроле, при Р^.0,05).

Но полностью пройти шейку ыаткн у овец и ввести обычный катетер внутриматочно, как это.возможно у коров, таким способом не удалось.

Влияние глубокоцервикального осеменения овец криоконсер-вированной спермой с применением данного метода представлено

4 42 40 16 . 40*7,6

0 46 46 14 30*6,7

4 36 36 18 50*8,4

0 45 42 22 52*7,7

в табл.10.

Таблица 10

Влияние глубокоцервикального введения спермы на суягность овец

'¡Доза уте- jОсеме j-Учте-| Обьягни|# обьяг-Группа ошта ¡рорелак- ,нено ¡но ¡лось ¡лившихся ¡сана, i ; ;мл/на овцу} j_j

Однократное осеменение: экспериментальная контрольная Двухкратное осеменение: экспериментальная контрольная

Установлено, что при однократном осеменении в опытной группе наблюдалась тенденция к повей кию результативности осеменения: 40$ объягнившихся маток против 30$ в контроле (Р> 0,05).

При двухкратном осеменении и двухкратном введении препарата на отмечено повышения результативности осеменения. Поэтому, наиболее целесообразным является однократное введение релаксанта перед осеменением овец.

3.3.2. Влияние сурфагона на результаты осеменения

В связи с пониженной выживаемостью замороженпо-оттаянных сперматозоидов в половых путях овец большой интерес представляет изучение возможности регуляции овуляции у самок с целью осеменения овец криоконсервированной спермой в оптимальное по отношению к овуляции время.

Нами было изучено влияние синтетического гонадолиберина-сурфагона на результативность осеменения овец криоконсервированной спермой.

В предварительных экспериментах быт отработана оптимальная дозировка препарата. При использовании сурфагона в дозе I мкг/иа аивотное, число объягнившихся маток повысилось ла 8$ по сравнению с контролем. Повышение дозы препарата привело к достоверному снижению результативности осеменения. Многоплодие

- 28 -

маток было практически одинаковым во всех группах.

В следующем опыте мы сравнивали действие однократного введения оптимальной дозы судатона при одно- или двухкратном осеменении овец в течение эструса (табл.11).

Таблица II

Результаты осеменения овец в зависимости от кратности введения замороженной спермы и применения сурфагона

;Доза суртОсоыетВыбЦтУчтено|Обьягни-;?5 объягнив-

Группа ¡вагона животных ¡мкг/на ¡овцу

|нено ¡ло

;лось

!

иихся

Опытная Контрольная

Опытная Контрольная

Щшо;^атное_ осеменение ~35 ~ "35~ ~ 10

42 2 40 12

Двухкратное осеменение 129 5 124 60 114 2 112 48

29*7,6 30*7,2

49*4,5 43*4,6

Оказалось, что использование сурфагона при однократном осеменении овец не оказало положительного влияния на результативность ягнения. При двухкратном же осеменении в течение эструса в опытной группе объягнилось на 6% овоц больше, чем в контроле (Р> 0,05).

Повышение результативности осеменения маток в опытной группё при двухкратном осеменении можно объяснить тем, что при утренней однократной выборке овец в охоте, некоторая часть из них попадает в начальный период эструса, когда еще не произошел предовуляторный выброс ЛГ. Введение же им сурфагона стимулирует более ранний выброс ЛГ, ускоряя тем самым наступление овуляции, что благоприятно сказывается на оплодотворяемости овоцитов.

• Кроме того, у некоторых овец может происходить запаздывание предовуляторного выброса ЛГ, что увеличивает время до овуляции. В этом случае сурфагон также оказывает положительное влияние. '

/

3.5. Разработка криоконсервирующей среды для , спермы быков

Учитывая положительное влияние некоторых металлов на крио-устойчивость спермы животных (В.П.Кононов,1982; В.К.Милованов, Л.С.Жильцова, 1982; В.А.НаукД982), целью наших исследований было создание новой синтетической среды для замораживания спермы быков на основе компяексонатов металлов.

В предварительных экспериментах проверяли влияние различных комплексонатов металлов на живучесть вативных спермиев быка. Изучалось действие кальция, цинка.и меди, закомплексованных с этплендиаминтетрауксусной, этилентриалганпентауксусной, нктрило трнметкяфосфонов ой и с оксиэтилецдифосфоновой кислотами.

Было установлено, что самая высокая живучесть спер.ыатозои- . дов быка отмечалась в комплексонатах металлов с этилендиамин-тетрауксусной кислотой. Поэтому в -дальнейшем мы работали с препаратами на основе*данной кислоты.

Результаты криоустойчивости сперматозоидов быка при замора-ггавашш их в отдельных растворах комшексокатов показали, что подвижность и живучесть сперматозоидов после оттаивания были лучшими в 5^-ном растворе (А) ЭДТА; 5,1*-яоы - .ЭДТА и 5,5^-ном - ( Со.) ЭДГА. ' -

Затем в лабораторных опытах изучали криозащитное действие на сперму быков различных сочетаний трех комплексонатов металлов: кальция, цнкка и меди с ЭДТА.. Было установлено,, что лучшая подвижность и выживаемость оттаянных сперматозоидов получе-. на при следующих процентных соотношениях изотоничлых концентраций кошяексопатов: (.?«.) ЭДГА - 60$; (Cct) ЗДТА - 20$; ( Си. ) ЭДТА - 2055 илп (¿с) ЭДТА - QO%i С&.) ЭДТА - 20£; ЭДТА -

20%. Переведя процентную концентрацию препаратов в весовые соотношения было получспо два оптимальных вариаята синтетической среды для замораживания спермы быков. В состав среды Л 1 входили следующие компоненты/ на, 100. мл дистиллированной воды: {) ЭДТА - 3 г, (Сг) ЭДТА - 1,18 г, ) ЭДТА - 1,1 г, глицерин -5 мл, желток ¿сурпного' яйца - 20 ия. Состав среда # 2¡' ( Си.) ЭДТА - 3,06 г, (Сл.) ЭДТА - 1,18 г, ЭДГА - 1,0 г, глице-.

рзн. 5 кд, гелтмс - 20 мл.

- 30 -

Изучение влияния данных сред на криоустойчивость спермы быков показало, что при замораживании спермы в опытных средах подвижность сперматозоидов и абсолютный показатель их выживаемости после оттаивания оыпи выше, чем в контроле.

Результаты осеменения коров спермой, замороженной в новых средах, приведены в табл.12.

Таблица 12

Результативность осеменения коров спермой,замороженной в комплексонатных средах

Испытуемые среды ¡Осеменено Отелилось \% оплодотво-

; коров ¡ |ряемости

Опытная ¡í I 51 3? 72*5,1

Опытная #2 67 ' 39 58*5,3

Контроль (лактозная) 100 60 60*4,5

Анализ результатов показал, что лучшая оплодотворяемость животных била получена при осеменении хоров спермой, замороженной в среде № I. При этом отелилось на I2¡¿ коров больше, чем в контроле (P<¿0,01). Это свидетельствует о перспективности использования новой среды для замораживания спермы быков.

3.6. Разработка метода прогнозирования криоустой-чивости спермы быков

• 3.6.1. Взаимосвязь жирнокислоткого и фосфолипид-ного состава липидов спермы с ее криоустойчивость»

С целью дальнейшего совершенствования методов прогнозирования устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию необходимо изучение физиологических механизмов данного явления животных с высокой и низкой криоустойчивостью гамет.

В данном разделе мы изучали взаимосвязь жирнокислотного 'состава обвдх липидов сперматозоидов и семенной плазмы у бы- , ков с различной криоустойчивостью спермы. Было отобрано две группы быков: с высокой и низкой устойчивостью гамет к глубокому замораживанию. Результаты исследований содержания жирных кислот в лшщдах гамет у быков различных групп показали, что

из насыщенных жирных кислот у быков обеих групд основная доля приходится на пальмитиновую. В составе ненасыщенных - преобладает докозагексаеновая кислота.

Бшю также установлено, что в группе с высокой криоустойчивостью спермы в липидах гамет содержалось на 7,1% больше до-козагексаеновой кислоты: 25,1% против 18,в другой группе (Р«С 0,05).

В группе быков с низкой криоустойчивостью в их гаметах было повышено содержание пальмитиновой и иактадекаяовой кислот (Р<0,05). По остальным жирным кислотам существенной разницы незду группами не отмечено. ' •

При изучении жириокислотного состава липидов семенной плазмы у бнков с высокой и низкой криоустойчивостью не было выявлено различий как в суммарном содержании кислот, так и по отдельным жирным кислотам.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что повышенное суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот в лпшдах гамет оказывает положительное влияние на устойчивость половых клеток быков к замораживанию.

Анализ фосфолилидкого состава общих липидов в спермиях двух групп быков показал, что существенных изменений по данному показателю между группами, за исключением фосфатидилсерина, не отмечено. В гаметах с высокой криоустойчивостью содержание фосфатидилсерина было на 45$ выше по сравнению с другой группой (Р<£. 0,05).

3.6.2. Механическая резистентность гамет к воздействию ультразвука

В данном эксперимента изучали параметры ультразвуковой ус-' тойчквосги половых клеток быков с различной криоустойчивостью (табл.13).

Из таблицы видно, что между группами быков имеются определенные различия. Так, время полного цитолизиса сперматозоидов в груше с высокой криоусточивостью было на 28$ короче по сравнению с другой группой (Р-£ 0,05). В этой группе также на 1% была выше средняя скорость цитолизиса сперматозоидов: 5,19 к 4,24 отн.ад. соответственно (Р-с 0,05). Вероятно, различия фази-

Таблица 13

Ультразвуковая резистентность сперматозоидов быков в связи с их криоустойчивостью

----1-р--,-——i-

¡Число ¡ИсследотСредняя {Время

Группа опыта ¡бшсов 'В£Ш0 ¡СКОРОСТЬ {полного

хухшш. ишы груп+эякуля- цитолизиса, ¡цитоли-

зе ¡tob j отн.ед. |зиса,ман

Высокая криоустойчивость . ,

спермы 5 15 5,2*0,3 1,9*0,2

Низкая ктаоустойчивость

спермы " . 5 15 4,2*0,2 2,7*0,3

ческого состояния плазматических мимбран спехматозимов у баков различных груш! ответственны за неодинаковую их устойчивость к воздействию ультразвука и низких температур.

3.6.3. Уровень мшфовязкости мембран сперматозоидов в связи с их криоустойчивостью

Следующим этапом наших исследований било изучение уровня микровязкости мембран сперматозоидов быков в связи с их криоустойчивостью.

Для изучения ыикровязкости мембран мы применяли метод протонной магнитной релаксации, поскольку ядра 'н составляют большинство в молекулах липидов, которые являются основой клеточной мембраны.'

Мы изучали вреыя спин-спиновой релаксации (Т2) неводной фракпин протонов в сперматозоидах быков с различной криоустойчивостью.

Величина Т2 является характеристикой молекулярной подвиг-ности в образце и едугит показателем уровня микровязкости мембран изучаемых объектов.

• Результаты этого эксперимента представлены в табл.14.

Анализ таблицы показал, что в, группа быков с высокой криоустойчивостью спермы, время спин-спиновой релаксации было на 162 больше по сравнению с другой группой: 0,272 мсек против 0,233 мсек (Р<0,01). Это свидетельствует о ыеныцей микровязкости плазматических мембран сперматозоидов с высокой криоус-

тойтшзостьа, тшс как бодыаоо время Т2 соответствует меньшей иикровязкости мембран.

Таблица 14

Время протонной сшш-сшшовой релаксации в образцах сперматозоидов бшсов в связи с их криоустойчивостью

-———|--п-т-1-|i ' " I--

¡Число ¡Исс-Шодвпяность {Абсолютный { ¡бшсов jлодоусперматозоидов;показатель ;

Группа слита; в гвако;__%_¡лапзучести ¡Т?;- мсек

; группе | эяку-{-до за- !РП_ГА ¡оттаянных ; I ;ля- {мората-jj;"^.{слерматозо-}

'_j j тов [вакдя )ддов,усл. ед{

Вмсокая крпо- .

устойчивость G 3S 82*2,5 48*0,4 20*0,5 0,272*0,009

Ндзюхя 1ПЗИ0- , ,

устойчивость 5 ■ 38 81*5,1 39*2,1 15,2*0,3 0,233*0,006

При этом подвишюсть отташшых сперматозоидов и абсолютный показатель их ^ивучеста в этой группе были достоверно выев 0,01). Следовательно, понигеиная микровязкость плазматической мембраны сперматозоидов быков обусловливает повышен- 1 ную их, устойчивость к глубокому за-лоразявашю.

На основе определения времени спин-спиновой релаксации в образгщх сперматозоидов нала разработан способ прогнозирования крпоустойчивости спермы бшсов (A.c. Л 1813424,1991)/

Использование данного способа позволяет увеличить количество заготовляемых спермодоз, получаемых от бшсов с высокой крпоустойчшзостыо гамет.

Данный метод молит иметь также большое значение дая отбора быков с высокой криоустойчивостью спермы при комплектовании тшотннкп племпредпрнятий и станций по искусственному осеменении дивотных.

При этом экспресс-прогноз кряоустойчивости сперматозоидов различных производителей: мокко осуществлять на основе предварительных измерений времени протонной спин-спиновой релаксации в нескольких образцах их спермы. ■

ВЫВОДЫ

1. Уровень микровязкости плазматических мембран сперматозоидов барана ниже, чем у быка. В процессе криообработки происходит увеличение микровязкости мембран в гаметах обоих видов животных. Гидрофильные компоненты сред не оказывают влияния на данный показатель. Желток куриного яйца снижает уровень микровязкости мембран сперматозоидов, что способствует повышению их криорезистенгносги.

2. Криоконсервация оказывает стимулирующее влияние на пе— роксидацию лилидов в гаметах барана.

Отличительной чертой сперматозоидов барана является меньшая устойчивость к инициации переквеного окисления лшшдов по сравнению с быком.

3. Семенная плазма и сперматозоиды бараков и быков содержат практически одинаковую активность антиоксидантного ферменг-та-супероксиддисмутазы.

Криоооработка индуцирует значительную утечку внутриклеточной СОД. Одной из особенностей гамет баранов, сопряженных с криоустойчивостью, является более высокая проницаемость их мембран для СОД.

4. Специфической особенностью криокоисервированной спермы барана является более высокая скорость нарастания в ней после оттаивания концентрации неорганического фосфата по сравнению со спермой быка. Через 2 часа после оттаивания спермы концентрация неорганического фосфата увеличилась на 50 и 22% соответственно.

5. В семенной плазме быков обнаружено присутствие криоста-бильного гонадотропного фактора, способного стимулировать овуляцию у крольчих. В плазме барана, жеребца, хряка и кролика данного фактора не обнаружено.

6. Нативная семенная плазма барана в зависимости от степени ее разбавления, оказывает иммуносупрессивное или идауноактн-вирующее влияние на аллогенные лимфоциты крови вне организма. Глубокое замораживание семенной плазмы резко усиливает ее имму-ноактивирующие свойства.

?. Разработанная ВДК-трио-буферная синтетическая среда для замораживания спермы баранов повышает криоустойчивость и

N

биологическую полноценность оттаянных сперматозоидов и позволяет получать результативность осеменения овец на практически удовлетворительном уровне (40-50$ ягнения).

8. Сухие яйцепродукты обладают высокими криозащнтными свойствами на сперматозоиды барана и способствуют значительному снижению (более чем в 2 раза) себестоимости синтетических сред для спермы животных,

9. Замораживание спермы барана со "Спермосаном-ШК" ,в дозе 25-100 тыс.ед. на 100 см3 среды,не оказывает отрицательного влияния на криоустойчивость гамет и их оплодотворяющую способность.

10. Низкомолекулярные тиолы оказывают криозащитное деИст-. вие на сперматозоиды барана при их замораживании в простых средах с низкой концентрацией желтка. Наиболее эффективное защитное действие проявляют унитиол и восстановленный глутатион.

Воднорастворимые синтетические фенольные антиоксидакти не оказали криозащитного влияния на сперматозоиды барана. Из жирорастворимых синтетических антиоксидантов лучшее криозащитное действие на сперматозоиды барана оказывает препарат ИХФГАН-3 в концентрации 0,004-0,008$. При его введении в состав ГЖУК- --гристбуферяой среда оплодотворяемость овцематок повысилась на

11. Отдельные, широко используемые компоненты синтетических сред, оказывают выраженное антиокислительное влияние на сперматозоиды барана. Наиболее эффективное действие проявляют декстрин и натриевая соль этилен-диамин-тетрауксусной кислоты.

12. В зависимости от сроков и условий хранения куриных яиц, в их желтке может происходить значительное накопление продуктов пероксидации липндов, которые могут попадать в состав разбавителей для спермы и оказывать отрицательное влияние на биологическую полноценность гамет.

Через 20 дней хранения яиц при 4°С концентрация № в желтке повышается в два раза.

13. Глубокоцервикальное осеменение овец замороженной спермой при использовании специфического маточного утерорелаксана

в дозе 4 мл препарата на животное, повысило результативность однократного осеменения овец на 10%.

14. Однократное внутримышечное введение овцам перед осеме-

нашем синтетического гонадолиберина-сур(£агона в дозе I ыкг/на животное, повысило результативность их осеменения криоконсорви-рованной спермой на 6-8$.

Ib. Использование при осеменении овец антистрессового вещества - углекислого лития, не оказало положительного влияния на результаты осеменения.

16. Синтетическая среда для спермы быков, разработанная на основе комдлексонатов металлов, повышает криоустойчивость сперматозоидов и их оплодотворяющую способность на 12$ (72$ отелившихся коров по сравнении с 60$ в контроле).

17. Раздельное замораживание эякулятов быков снижает бактериальную контаминацию оттаянной спермы.

18. Криорезистентность гамет у отдельных быков в значительной мере обусловлена жирнокислотным составом их липидов. Положительное влияние на устойчивость сперматозоидов к глубокому замораживанию оказывает повышенное содержание в их лилвдах полп-ненасыщенной докозагексаеновой кислоты.

19. Предложенный способ оценки качества спермы быков позволяет отбирать быков с высокой криорезистентиостью сперш и прогнозировать криоустойчивость их эякулятов, путем измерения с помощью метода протонной магнитной релаксации микровязкостк мембран половых клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРШ02ЕШЯ

I. С целью повышения результативности искусственного осеменения овец криоконсервированной спермой рекомендуем племпрад-приятиям для замораживания спермы баранов использовать ГЕУК--трис-бу$срлую синтотпчоехую среду следущах'й состава,г/100 см3 воды: лактоза - 8,4; декстрин - 5,0; ксилит - 0,26; трис-(окси-метал)-аминометан - 0,105; трилон-£ - 0,135; глицерин - 6,0; желток - 20,0; снермосан-ППК - 50-100 тыс.ед.

• 2. С целью снижения себестоимости синтетических сред для •замораживания спермы баранов, рекомендуем использовать в качестве криопротектора сухой яичный желток или яичный порошок в концентрации 4-5$.

3. Для повышения эффективности осеменения овец замороженной спермой предлагаем вводить сперму глубокоцервикально путем

- 37 -

использования однократной внутримышечной инъекции овцематкам за 30-60 минут до осеменения утерорелаксана в дозе 3-4 мл препарата на самку.

4. Для повышения криоустойчивости и оплодотворяющей способности спермы быков предлагаем комплексонатную синтетическую среду для еэ замораживания. Состав среды, г/100 см3 воды: gn, (ЭДТА) - 3,0; Ca. (ЭДТА) - 1,18; Си. (ЭДТА) - 1,1; глицерин. - 5,0; желток - 20,0.

5. С целью прогнозирования криоустойчивости спермы быков предлагается метод оценки качества спермы, основанный на измерении времени протонной спин-спиновой релаксации в сперматозоидах.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кононов В.П., Ерохин A.C., Нарижный А.Г. Действие многовалентных металлов на воспроизводительную функцию животных //Доклады ВАСХНШГ. - 1983. - » 5. - С.28-30.

2. Кольцова Л.С.-, Ерохин A.C., Селиверстова И.А. Замораживание спермы быка в средах с комшгексонатами металлов. //Доклада BACXffiLl. - 1985. - й I. - С.33-34.

3. Ерохин A.C. Снижение бактериальной загрязненности спермы быков-цроизводителей //Биология воспроизведения и технология искусственного осеменения с.-х.животных. - М.,1986, - С.45-48.

4. Платов Е.М., Деряженцев В.И., Ерохин A.C. и др. Методические рекомендации ш технологии взятия, глубокого замораживания и использования спермы баранов-произврдителей при искусственном осеменении овец, - М.,1986. - 16 с.

5. Ерохин A.C. Глубокоцервикальное осеменение овец замороженной спермой с использованием релаксанта //Селекция с.-х. животных по технологическим признакам. - М.,1987. - C.I6I-I64.

6. Ерохин A.C., Аванов Н.Я. Замораживание спермы баранов в среде с декстрином //Зоотехния. - 1988. - № 10. - С.46-47.

7. Платов Б.М., Балашов Н.Г., Деряженцев В.И., Ерохин A.C.

. . и др. Синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы аавотных //Авторское свидетельство Д 1408576,1988.

8. Ерохин A.C., Платов Е.М., Тимофеев К.Н., Кондаков Е.В. Структурное состояние мембраны сперматозоидов барана и быка после криовоздействия //Доклады ВАСХНИЛ. - 1989. - й 3. - С.30-31.

9. Ерохин A.C., Петрова Т.И., Ткачева 0.П. Использование яичного порошка в средах для замораживания спермы //Зоотехния. -1989. -ИЗ,- С.65-67.

10. Ерохин A.C., Семенова В.А., Тимофеев К.Н., Кондаков Е.В. О влиянии компонентов синтетических сред на плазматические мембраны сперматозоидов быка и барана //Сельскохозяйственная биология. - 1969. - а 6. - С.35-38.

XI. Платов Е.М., Ерохин A.C., Деряженцев В.И. и др. Среда для замораживания спермы животных //Авторское свидетельство 'Л 1501333,1969.

12. Ерохин A.C. Криозаиштное действие сухих яйцепродуктов на сперматозоиды барана в зависимости от условий их хранения . //Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения с.-х.животных. - М.,1989. - С.28-32.

13. Ерохин,A.C. Замораживание спермы в среде с сухим желтком //Овцеводство. - 1990. -AI.- С.22-23.

14. Ерохин A.C., Деряженцев В.И. Использование сурфагона при осеменении овец //Овцеводство. - 1990. - J» 4. - С.36-37.

15. Ерохин A.C., Кучвдша К.Д., Турбин В.Ф. Криоустойчи-вость сперматозоидов быка в связи с хкрнокислотным составом их лишдов //Доклады ВАСХШЛ. - 1991. - » 5. - С.45-47.

16. Ерохин A.C., Черных В.Я. Влияние плазмы спермы сельскохозяйственных животных на овуляцию у кроликов //Доклады ВАСХШЛ. - 1991. - Л 6. - С.48-50.

17. Ерохин A.C., Деряженцев В.И. Переписное окисление ли-пидов в сперме баранов //Овцеводство. - 1991. - Л 3. - С.17-19.

18. Ерохин A.C., Деряженцев В.И. Антибиотики при осеменении замороженной спермой //Овцеводство. - 1991. - А 5. - С.21-22.

19. Ерохин A.C., Деряженцев В.И., Аксютина М.С., Барсель В.А. Изучение перекисного окисления липвдов в сперматозоидах барана и быка методом индуцированной х ем ¡¡люминесценции //Доклада ВАСХШЛ. - 1992. - * I. - С.50-53.

20. Ерохин A.C., Деряженцев В.И. Защитное действие фенок-сана на спермии барана //Зоотехния. - 1992. - * 2. - С.17-19.

21. Ерохин A.C., Мурза Л.И., Сергеев А.И. О криоустойчи-вости сперматозоидов быков в связи с микровязкостью плазматических мембран //Сельскохозяйственная биология. - 1992. - Я 2. - С.56-61.

22. Деряженцев В.И., Ерохин A.C. Наставление по применению Г2УК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы б&ранов-производителей. -. ВНИИллем. - 1992. - II с.

23. Ерохин A.C., Чернова И.Е. Влияние тиолов на криоустой-чиеость спермы //Овцеводство. - 1992. - В 4. - С.22-23.

24. Ерохин A.C., Деряженцев В.И., Кучкина К.Д. и др. Способ оценки качества спермы быков //Авторское свидетельство

Л 1813424,1992.

25. Ерохин A.C. Изучение пероксидации липидов в компонен- • тах разбавителей спермы животных //Доклады ВАСХШЛ. - 1992. -

Й 6. - С.42-44.

26. Ерохин A.C., Никольская Т.А. Изучение иммуносупрес-сивных свойств семенной плазмы баранов //Доклады Российской академии с.-х.наук, - 1993. - № 2. - С.67-71.