Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО БИОХИМИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО БИОХИМИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ ЖИВОТНЫХ"

/\-ЪОб88

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ)

V На правах рукописи "

ГУСЬКОВ Алексей Михайлович

УДК 636.22.28.082,453

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЕ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ ЖИВОТНЫХ

03.00.13 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДУБРОВИЦЫ —1993

Работа выполнена в лаборатории биологии воспроизведения Молдавского научно-исследовательского технологического института животноводства и ветеринарии и лаборатории криобиологии Института физиологии АН РМ.

Научный консультант — доктор биологических наук,

профессор В. А. НАУК

Официальные оппоненты: д. 0. н., проф. Ю. Д. КЛИНСКИИ,

д. в н., проф. Н. Н. МИХАЙЛОВ, д. б. н., проф. М. И, КЛОПОВ

Ведущая организация — Российский зоотехнический институт повышенна квалификации и переподготовки кадров.

Защита диссертации состоится «/^ »-1993 г„

в 10 часов, -на заседании специализированного Совета Д 020.16.02 при ВНИИ животноводства.

Адрес института: 142012, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «хУ » _1993 г.

г Ученый секретарь Специализированного совета к. б. и.

И. И. ШМЫГНИ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальной^ тецц- Наиболее полное удовлетворение потребностей лвдей s продуктах питания и промышленности в сырье во иаогом завяоит от интеноифякаши воспроизводства сельскохозяйственных животных. Решение этой проблемы связано с увеличению! эффективности реализации генетически детерминированных репродуктивных возможностей ышотных, что, в свою очередь, сопряжено, во-первых, о выяснением фундаментальных механизмов, происходящих в оперших процессов при их хранении вне организма, регуляции репродуктивной функции и ее нарушений , во-вторых, с выяснением причин онихевия функциональной полноценно«» сперниев щл крвояовсервации ж воолроиэводите-львей способности животных в различных условиях рваведения, в-третьих, о выявлением возможаоотай цвлевавраагенных воздействий аа эти механизма, иаыоканием подходов к управлению ими, а. в-четвертых, о разработкой высоко аффективных биотехнологий воспроизводства сельскохозяйственных животных.

В этом направлении достигнуты значительные успехи. Открыты метод хранения опериы при ультравюких температурах и^ механизмы нейро-эндокринной регуляции воспроизводительной функции, разработаны эффективные, технологии хриоконсервации спермы и воспроизводства разных видов животных.

В то же время, остаются ее до конца выясненными основные механизмы криогенных повреждений и протекши спермиев, их адаптации к низким температурам. Ни' одна из выдвинутых криобиологами гипотез не. получила исчерпывающего экспериментального подтверждения. Около подовжнб спермжев не восстанавливает своих функций пооле замораживания-огтаиванкя. Использование кряоконсервированной опериы пра воспроизводстве овец и свиней крайне ограничено. Не в полной мере установлены роль существенных для организма факторов внешней и'внутренней среды в проявлении репродуктивной функции, значение стрессов в воспроизводстве стада. Не исчерпаны резервы профилактики и терапии бесплодия, а также повышения эффективности' способов стимуляции воспроизводительных возможностей животных^ Отсюда цель и задачи наших исследований.

Hftin. И яяпячя млдмрмм*.'Tiain. работы состояла в изучении влияния различных факторов на функциональную полноценность спермиев тг пгг и^гдт^пп^гитаггЕнут Дущщут животных,а так-

МЛ1ЧИ/Я - "Л1 ¡ОТЕКА им. к, I ti-^.jjjsi

ÜM9

же в раараскягкв способов повеления эффективности воспроизводства сельскохозяйственных животных.

для достижения пап намечалось реввихе следующих задач:

1. Изучить липждный состав плазматических мембран ж его связь с функциональной полноценностью спертев быка, барана ж хряка при кржохонс ервации.

2. Выяонн*ь влияние факторов вндогенной и экзогенной природы на лшшды к морфофизнологическне показатели сперкн-ев.

3. Исвытать мембравоахтнвяые соединения при разработке способов сохранения спермиев вне орг&нжэма.

4. Выяснить влияние стрессоров различной природа на воспроизводит апьну» способность животных н наметить дуги ее повышения.

Разработать технологии воспроизведения овеа.

6. Разработать способ повышения воспроизводительной способности крупного рогатого окота.

Наувяя gopuasa наботм. Методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии установлены видовые особенности литиевого состава плазматических мембран спермиев быка, барана и хряка до и после криокоисервадии спермы. Выявлены корреляции между содержанием отдельных фракций липвдов в плазматических мембранах спермиев н их физиологическими показателями. Показано, что низкие температуры вызывает в спермк-ях быка, барана ж хряка активацию фоофолнпаз и процесса пе-рехненого окисления лнпидов (ЮЛ). Доказано, что криорезнс-тентность спермиев связана с жх адаптивными возможностями. Мембраноактавные препараты, относящиеся к автиокеждантам (мелоидол, амбиол, мвлонгозяд, ОП-6, СК-4, СК-5, БИ0-5О,ин-дандион), регуляторам проводимости (2,4 динятрофеыод), детергентам (тритон Х-100, эцульсин, ненасыщенных жирных кислот) и к средствам комплексного действия (общие липнды ак-тиномицетов и дрожжей, фосфолшщды канднды), повышает устойчивость спермиев к низкий температурам.

Выявлено влияние стрессоров различной природы на воспроизводительную функцию и показано, что антиокезданты амбиол л СК-5 сникают уровень ПОЛ в крови животных и повышают их репродуктивную способность. Эти препараты способствуют нормализации гормонального статуса животных.

Разработаны среды для криоконсервации спецш быка (а. е. # 1634266), барана (а.с. * 1498489 и * 1540617) е хряка (а.о. Л П38Г49 и » 1143413), а также средство дня повышенна воспроизводительной способности животных (положительное решение ВШИГПЭот 26*02>91 на-вндачу а.о. по заявке Л 4774697) и стимулятор репродуктивной функции животных (положительное решение ВНИИШЭ от 28.II.91 sa выдачу а.с. по заявке Jt 4929901).

n-ottffiytacuafl ^вачинкть Результата экспериментальных исследований дополнял современные знания о структуре н функции биологических мембран в различных условиях о кружащей среды, о структурной организации плазматических мембран сперма ев быка* барана и хряка, о значении липщдного компонента биомембран в функционально! полноценности клеток, о роли и механизмах развития процесса ПОД в биологических объектах, о характере действия мембраноактивных веществ с разними мем-бранотрошнми эффектами ва физиологобиохимичеокие показатели спермиев, о влиянии факторов различной природы на репродуктивную способность животных, об особенностях ее проявления и механизмах регуляции, о роли антиоковдантаоа оиотемн в этих механизмах, о механизмах действия антяоксидантов различной природы.

Материалы работы использованы щи разработке сладупцих методических рекомендаций: "Система.воспроизводства крупного рогатого скота" (Кишинев:Молдагроивформренламаf 1989 ) ; "Технологическая схема воспроизведения высокопродуктивных коров" (Кишинев : Молдагроивформреыюма, 1991) ; "Организация воспроизводства сельскохозяйственных животных в Молдове" (Кишинев, 1991) ; "Рекомендации по технологии производства продукции овцеводства" (Кишинев:Молдагроивфорыреклама,1992 ) ; "Адаптивная технология получении, криоконсервации и использования семени барана" (Кишинев¡Моднагронвфорырвкяама,1992).

"Адаптивная технология получения, криоконсервации и использования спорны барана" и "Способ повышения воспроизводительной способности животных" внедрены в производство и успешно применяются в практике.

I^TVftffîTire даббты. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II съезде физиологов МССР (Кишинев,1980), конференции молодых ученых АН МССР "Молодежь и научно-технм-

ческий прогресс" (Кишинев, 1982), 1У Всесоюзном симпозиуме по биохимии ляпидов (Киев, 1983), ХХУ съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова (Баку, 1983), Всесоюзной конференции "Стресс v адаптация z функциональные нарушения" (Кишинев, 1984) .Всесоюзной конференции "Механизмы криоповреадения и кряозащнтн биологических объектов" (Харьков, 1984), XIX съезде физиологов МЗСР (Кишинев, 1985), II Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант'* (Москва, 1986), У съезде генетиков я селекционеров Молдавии (Кишинев, 1987), ХУ въезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987), У съезде Всесоюзного общества генетиков в селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987), Ш Всесоюзной конференции "Еиоантиоксидант" (Москва, 1969), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных в продовольственная програша" (Киев, 1989), Международной конференции "Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных" (Калуга, 1990), Всесоюзной симпозиуме "Физиология продуктивных животных решению продовольственной программы СССР" (Таллин, 1990), конференциях по овцеводству (Ставрополь, 1991, 1992), Всесоюзной научно-технической конференции "Использование гормональных препаратов в животноводстве" (Дубровины, 1991), научно-производственной конференции "Проблемы интенсификации производства молока" (Минск, 1991), Всесоюзной конференции "Стресс, адаптация и дисфункции" (Кишинев, I99X), Международной конференции криобиологов (Харьков, 1992), 1У Всесоюзной конференции "Биоанти-оковдант" (Москва, 1992), заседаниях Ученых советов Института физиологии АН РМ (1978-1989) и Молдавского научно-исследовательского технологического института животноводства и ветеринарии (1989-1992), НТО МСХШ fM (I988-I99I), комиссии "Медикамент" (1992), республиканских, научно-практических конференциях и семинарах (1978-1992).

Работа удостоена Первой премии Президиума Академии наук Республики Молдова.

fTvrtmrgfflmif результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 70 научных работ.

На защиту вынооятпя ^тгуишиа основный радожания:

X. Видовые особенности лишмдного состава плазматических мембран и криорезистентности спермнев быка, барана к хряка.

2. Механизмы криогенных изменение лшшдов к фуншшональ-ного состояния сперыиев быка, барана и хряка.

3. Криоэащитные среды для замораживания спермы быка, барана в хряка.

4* Препарат амбиол, повышающий воспроизводительную способность животных.

Структура и ft*«» тги^латутятт. Диссертация изложена на 363 страницах машинописного текста, иллюстрирована 85 таблицами и 18 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы, вклгчащего 623 источника, в том числе 236 на иностранных языках.Кроме того, в диссертации входят приложения на 7 страницах.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ооновнымн объектами исследований служили круши! рогатый скот, овцы и свиньи, а также кровь ж сперма в тих видов животных.

При планировании, подготовке, постановка опытов и оценке их результатов руководствовались рекомендациями В.К. Ын-лованова (1962), Ю.Д. Клинского (1975, 1989), Л. Андерсона (1975), Ч: Хендерсона (1975), Р.Фута (1975), М. Кейтса (1975), Э. Мэдди (1979), М.Б. Стефаиик'и соавт. (1985).

Крноконсервайию спермы быка и барана проводили в средах ЛТК (Платов, 1965), ЛАМЕК (а.с. Л 1634366), ЛОЛА (а.с. * 1498489), ЛТРИ (а.с. Л I5408I7), а хряка - БНХ-11 {Кононов, Голышев, Хачалуридзе, 1975), БСМ (а.с. Л II38I49) ' л БСЭНХЕС (а.с. Ji 1143413).

Температурный отресс вызывали путем помещения 0,1 мл спермы в I мл изотонического раствора цитрата натржя, охлажденного до 0-2°С, Коэффициент устойчивости к температурному стрессу рассчитывали как отношение показателей подвижное-ти спермы стрессированной и натнвкой и выражали в % или условных единицах.

Физиологические показатели сперкиев оценивали общепринятыми методами wí подвижности, выживаемости и абсолютному показатели выживаемости spa 38°С, а морфологическое состояние акросоыы фаэоконтраотной микроскопией при 630-кратном

уВ&КЕЧвНИН.

Богатые фракции плазматических мембран опершее (65-70Jt частоты по маркерннм ферментам) получали методом I*»-пот, РгоЛгот (1961). Он предусматривает использование двухфазной полимерной системы, состоящей из двкстрана (Т-600) я полиэткленгликоля (Т-6) производства фирмы фугаса- . Еув (Швейцария). О степени чистоты выделению: фрахта судам оо активности магний2*( натрий"1" + калиЁ+)-АТФа8ы, нуклеотвдаэы и щелочной фоофатазы.

Содержанке белка определяли по lowri et ai. (1951). Дипидн экстрагировали по Bligh, Dyer (1959). Фракционировали .—1шдн методом высокоэффективной тбнкослойной хроматографии на вдаотивах 6 X в ом о микрофракцией сшшкагедя 15 140 ("ШШ" ) в системах хлороформ : метанол : вода (I надрамгенйе) и хлороформ:метанол:25£ ашиак (II направление). Михроснлшшгель (10 мкм) получали седиментацией салнхагеля Л 5 1 40 (Стефви*к и соавт., 1985). Идентифицировали лжшрда о применением специфических реакций окрашивания, предусматривающих использование следуици реактивов: Васьковекого ; Дитмера, Лестера в модификации Васьковского я Крстеяюого ; Драгендорфа ; фосфорномолнбденовая. кяолота-ххорвд олова ; нин-тидриновый ; дифенкдаминовый ; аатроновый ; верная кислота ; реагент для оОнаруження гвксозо- к триозофоофагов ; резорциновый. Для подтверждения результатов идентификации попользовали свидетелей (холестерин к пальмитиновая кислота - коммерческие препарата, а фоофатидилхолив и фоофвтждтлэтавола-мвн получали, хроматогрефически из желтка куриного яйца) и величины Bf . Содержание фоофсишшщов определяли no Shi-ъм?« iaao et al. (1967), a остальных.лхпидов-по ïibrit, 1953. Спектры ЭПР записывали на радиоспектрометре Э-сантиметрового диапазона РЭ-1307. Содержание продуктов перевисного окисления лнпкдов определяли методами, описанными U.A. Владимировым и А.В.Арчаювш(1972).0 степени окисленности липидов судили но отношению оптических плотностей Д233/Д2Ю

соавт*, 1967). Величину антиокисяи— тельной аюгийности липидов определяли по их способности тормозить окисление метияолеата (Бурлакова и ооавт., 1975).

Содержание прогестерона,'эстрадиола, тестостерона, ти-

роксина и трийодтиронина в сыворотке.крови определяли редио-иммунологичес кии методом о использованием набора реактивов производства Института биоорганяческой химии АН Беларуси. При выяснении концентрации прогестерона и эстрадиола применялись антисыворотки, полученные при иммунизации кроликов с заменой стандартов, приготовленных на сыворотке человека, на приготовленные на сыворотке быка. Подсчет радиоактивности проводили на гажа-спектрометре типа РКА-300 $нрыы "Тракор Европа".

Количество повторностей лабораторных опытов и животных в научно-производственных - выбирали в зависимости от целей. экспериментов и вариабельности признаков. Результаты обрабатывали, методом вариационной статистики по Е.К. Иеркурьевой (1964).

РЕЗУЛЬТАТУ исследования

I. Дипиды плазматической мембраны и функциональная Полноценность спероев быка, барана и хряка при криоконс ервации

Методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии из плазматических мембран спермнев быка, барана и хряка было выделено 17 и идентифицировано 15 фракций лшщдов. Лишщы плазматических мембран вклкчагт фракции фосфолипидов - фос-фатидилсерин (ФС), сфингомиалин (СФМ), фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидашсолин+фоофатвдилоернн (фх+фс), * сфингомиелин+фбсфа-тидоисерин (сфм+фс), фосфатидшга*аноламкн (фэа), фосфатвдная кислота (фк), кардиолишн (ЮО. лизофоофатцпидхолин (ЛИ) и лизофооф&твдилзтаноламин (1фэа); гликосфшголипидов - цереб-розид-I (Ц-1), цереброэид-2 <Ц—2) и цереброзвд-3 <Ц—3); холестерин' (LI); яеэстери^шшровашне лирные кислоты (5ЭХК) к две фракции неидентифицированных липидов (НИЛ-1 и НИЛ-2).1ФХ проявлялся главным образом на старте,и мы'его количество не определяли. Таким образом, 13 фракций относятся к сложным ли-пидам и подразделяются на фосфолшщды, гликосфинголипиди » стеровды (табл. I, 2, 3)..

Бидоёые особенности липидного состава плазматических мембран заключаются в разной хроматографической подвижности

Таблица I

Содержание лишидов в плазматической мембране спермиев быка после разбавления и замораживания-оттаивания оперны, мкг/мг белка

Лшшдн ! Разбавленные ! SiliiiiSEilSii30-

' ^ | д. аочащушш,, | оттаянные

Фосфолипиды

Сфингомиелин 84,7±5,5 66,1±4,6*

Фосфатидилхолив+ фосфатидилсерин- 122,8±7Д 109,8±4,4

Фосфатидилэтаноланин 94,1±3,8 114,4 ±5,8*

Кардиолишш 68,4±5,5 90,8±9,2

Фосфатидная кислота 48,2±3,5 98,8±3,5JBat

Всего 418,2 ±15,7 479,8±10,1*

Глико сфянгОЛЯПИДЫ *

Цереброзвд-1 136,0 ±18,0 98,6 ±11,6

Цереброэид-2 87,9 ±15,1 104,3 ±2,9

Цереброэвд-З 72,5± 16,0 71,4± 13,4

Всего 295,4±34,2 274,2 ±16,7

Холестерин 324,6 ±14,2 259,8 ±29,7

Неэстернфишрованные жирные кислоты 328,8±19,9 474,0±II,8®

Н&идентифицированный линид-1 48,4±5,7 79,0 ±14,5

НеидентифицированныЙ липид-2 85,9 ±19,1 92,7 ±15,1

Всего лшшдов 1501,3 ±36,9 1651,3 ±51,2

Различия статистически достоверны по сравнению с мембранами разбавленных спермиев: * - Р<го,05 ; *** - Р< 0,001.

Таблица 2

Содержание лшидов в ддаэматжчеокой мембране сдераю барана после разбавления к ааморажжванжя-оттаявання спермы, мкг/иг бажва

ЛДДВДН_} Разбааденнь» }

Фоофояшяди

Фоофатидвлс ерин 25,9 ±4,6 39,8 ±4,1

Сфкнгомиеяин 61,614,5 61,6 ±3*0

Фосфатндилхолжн 167,6 ±13,3 150,2 ±10,9

Фоофатидилвтаноламнн 112,4 411,5 79,6 ±5,1

Фосфатидвая кислота Э7,8±8,0 57,6 ±10,2

Кардиолшшн 56,6±6,1 47,4 ±6,2

Всего 461,9 ±26,3 436,2 ±29,4

ГЛИКОСфИНГСЛЕШЦЫ

Цереброзид-1 273,8±Э0Д 252,0 ±70,1

Цереброэид-2 112,3±26,9 96,5 ±19,4

Цереброзид-Э 115,4 ±43,4 56,8 ±24,7

Всего 501,5 ±58,1 405,3 ±69,3

Холестерин 327,0±15,5 364,6 ±40,6

Неэотерифнцированные

жирные кислоты 764,8 ±65,8 933,2±57,7

Всего лнпидов 2055,2 ±97,4 2139,3±И2,

Т&бджца 3

Содерхаше янадоз в ижцшящмкоЙ мембране свершив хряка поме рмбавхенхя ■ заморвжжввння-оттажвания опэрмн, ижг/мг белка

! Заморомшо-, оттаянные

фоофаыдпоараш ПО,? ±9,6 105,5 ±6,6

*юфетжддлхоин 128,1 ±8.2 152,1 ±21,5

♦оофвтщдиаяшодамя 173,7 ±14,9 158,8 ±10,2

Лвофоофацдктетааол-

«и 57,5 ±6,9 96.3 ±9,2*

«оофагадвая кислота 119,8 ±6,2 176,7±8,2®1

Всего 589,8 ±15,8 689,4 ±29,3*

Гшоофкаголшшда

Цер#броаид-2 247,4 ±76 »3 218,3 ±35,3

Н»реброввд-3 391,2 ±63,9 362,8±70,4

Всего 638,6 ±99,3 581,1 ±89,7

Холестерин 468,4 ±39,1 507,1 ±69,9

Нввстервфицнрованные

ерш» кислоты 663,7±21,Э 805,9 ±56,6

Во его лшщяов 2360,5 ±129,8 2583,5 ±175,0

Разлогов статистически достоверен по сравненяв с цпй рааанк раздавленных опермяев; *-р<0,05; и-Р<0,01.

ОС, СФЫ и ФХ в используема нами системах. У спермиев барана эта фосфолипвдн хорошо разделяется, у быка ФС вадмияж »мосте с СФМ, а у хряна с - ФХ* Лжзофоофвтвдн в спермаи бака в барана представлены ЛФ2, а 7 дрека тага 1ФЭА. Однако в мембране последнего нет ЕЯ ■ Ц-1.

В мембране спермиев быка в наибольшем количестве орс* сутствум1 фосфолжпиды, а в мембранах барана я хряка кх содержание сопоставимо с количеством цлреброзидов. Првче«, в содержании общего количества лшщдов, в расчете ва базок, мембраны располагаются в ряду хряк> баран > бык, а та крк>-резистентностн спермиев в строго цротивопохозаом порядке.

По лшлдному составу шгазматнческке меибраны сперииа представляют собой классические биологические мембраны. В то же время, следует отметить характерные особенности: большое содержание гликосфинголипядов - типичнее компонентов мембран клеток нервных тканей, НЭХК - представителей активно метаболизируицях систем, КЛ - характерного главным образом для митоховдриальных мембран (кроме хряка) я отсутствие фосфатвдвйннозятола.

Большое содержание НЭКК в мембранах после разбавлении спермы указывает на значительный репарйтсвзнй котедагал с перше в, поскольку они являются субстратов для синтеза слоивах лзшидов. Это подтверждается и присутствием фосфатедпо£ кислоты - промежуточного продукта, общего для биосинтеза трг-ашиглицеринов я глицерофосфолшгадов. В плавкяткческкх иааб-ранах разбавленных спермиев быка содержится гораздо Meta.se НЭКК, чем у барана к хряка, что делает последние более уязвимыми для усиления перекионого окисления лмшдов. В результате криоконсервации содержание НЭХК увеличивается в декбро» нах всех видов. В мембранах спермиев быка в хряка повивается содержание как ФЕС, так в общего количества фосфолшядов. Охлаждение сопровождается изменением соотношения фосфолвпддов в мембранах.

Были выявлены существенные различия в криорэзистентнос-ти спермиев (табл. 4). По сохранению ультраструктур и физиологических пбказателей лучшие данные у сперма ев быка, худшие - у хряка, а сперши ¿арана занимают промежуточное положение.

Математический анализ результатов позволил установить, что содержание НЭЖК в плазматических мембранах находится в

отрицательно! коррежяцо о внжжваеюотьп деконсервированных спермиев бкка (Р^ 0,001), барана (?< 0,05) ■ хряка (Р<0,05). {фоне того, в спермжях быка после зашражжвання-отгаяванжя обнаружены положительные корреляции между подвижностью и содержанием фракции ФХ+ФС (р^ 0,05), выживаемостью и содержанием Ш-1 (Р< 0,01), Ж (Р< 0,05) к Ц-3 (Р< 0,05), а также отрицательная корреляция между выживаемостью ж содержанием XI (Р<0,05). Следовательно, функциональное состояние опер-киев зависит от содержания отдельных липидов в плазматических мембранах.

Таблица 4

Морфофигиологические показатели сперкиев быка, барана I хряка после резбавмння н замораживания-оттаивания спермы

Вжд опермнев, I Подвижность, ! Выживаемость, I Сохранность этап обработки ! балл I ч ! акросом, %

Бык

После разбавления 7,5±0,18 - 67,6 ±2,23

После замора-

живания-оттаи-

вання 3,7±0,Я)* 6,4± 0,59 43,4±1,48* Еарая

После разбавления 7,3 ±0,39 - 73,3±0,39

После замора-

живанжя-оттаи- __ „

ванжя 3,Э±0,16 * 5,1 ±0,28 33,9±0,84*"

Хряк

После разбавления 7,4±0,20 - 72,3 ±1,10

После замораживания-оттаивания_2,7±0,13 3,3 ±0,18 28,0 ± 2,11

Различия статистически достоверны по сравнению с показателями после разбавления: * - Р< 0,05 ; эвт- Р< 0,001,

Увеличение в процессе крвоконсерващш содержания Л®ЭА и НЭ2К является следствием активации фосфолипазы А2, а ФК ~ фосфолипазы Д. Активация фосфолипаэ при замораживании,видимо .объясняется лабнлизацней мембранной структуры, что облегчает образование фермент-субстратного комплекса. Фоофолнпа-вы принимают участие в регуляции фосфолжшцщого состава биомембран. В свою очередь, гидролитическая деятельность этих ферментов создает условия для усиления процесса перекнсного окисления лншщов. Важно отметить, что вопреки активации фосфолипаз содержание фоофолипидов в плазматических мембранах спермиев бака и хряка увеличивается в процессе криояон-сервадии, а барана - остается неизменным. Поэтоцу становится очевидным присутствие процессов структурной модификации, плазматических мембран, которые вероятно направлены на повышение криореэиотентности спермиев.

2. Влияние факторов экзогенной и эндогенной природа на и морфофизиологжческие

показатели спермиев

Для развития положения о существенной роли аадитных возможностей спермиев был проведет опыт,в котором сперму быка, барана и хряка разбавляли в криозащитннх средах и охлаждали до 4°С в течение 4 ч. В результате этого сперма всех видов разделялась на три фракции (верхняя, средняя ж нижняя). Каждую фракцию замораживали. Лучшие показатели функционального состояния были у всех видов деконсервиро-ванных спермиев нижней фракции, где концентрировались малоподвижные и обездвиженные холодом гаметы, а худшие - у верхней, на подвижность которых не влияла низкая температура. Показатели вредней фракции занимали промежуточное положение. Подвижность и выживаемость деконсервировавиых спермиев быка, барана и хряка нижней фракции были выше, чем у верхней соответственно в 2,6 ; 2,5 ; 2,3 и 4,3 ; 3,6 ; 3,3 раза. Следовательно, способность спермиев снижать двигательную активность в ответ на действие холода яаляетоя адаптивной реакцией. Видовые особенности криореэиотентности спермиев коррелируют с фракционной динамикой их физиологических показателей.

В.следутвм опыте неразбавленную и разбавленную в крио-вацитвой среде сперму быка и барана охдадцали и замораживали. На разных этапах технологической обработки отбирали образце оперш к подвергали их т емцературному стрессу. Установлено,' что в процессе охлаждения спермин быка и барана как в присутствии защитной среды, так и без утрачивают чувствительность к температурному стрессу. При »том у более криорезис-тентных.спермиев быка этот процесс и более ярко выражен.Крона, того,. криозащитвая среда более эффективна для спермиев »того вида. Ва оперших барана ее действие проявляется только поел« охлаждения до 5°С в течение 4 ч.

. Ввщду реваяВД* роли липидов в адаптации клеток к изме-нящмоя условиям ореды, мы изучили криогенные изменения фоофолнпидов к холестерина в. зависимости от температурных условий а состава протектора. Перед экстракцией липидов спермиев двукратно отмывали раствором сахарозы и однократно дистиллированной водой путем чередования, процедур ресуспен-дированжя и осаждения центрифугированием. Фактически удаляли рнтлосвязанные липяди - кандидаты для элиминации.

Нопытали быстрый (3 град./миН) и медленный (0,125 град./ мне) режимы охлаждения' спермы быка, барана и хряка. Результат показали, что медленное охлаждение спермы способствует лучшему .сохранении липцдов, однако статистически достоверные различия при о равнении исследуемых способов были 'обнаружены лишь в содержании $Х, К1 ж 491.

В результате исследования действия различных режимов. охлаждения (охлаждали от 30 до 15°С в течение 1,2 и 4 ч), замораживания (замораживали при температурах -60, -60, -100, -120,-140 и -160°С) и оттажвания (20, 40, 50, 60 и 80°С) спермы хряка на общее содержание фбофодипвдов в оперших выявлено, что оптимальна« параметрами технологической обработки яввяртоя охлаждение до 15°С в течение 4 ч, заыора-жжаан1в.при -1000С и опаивание при 60°С.

Когда сперму быка и хряка замораживали в разных криозащитных оредах, менькие потери фоофолипвдов наблпдалн при использовании сред, способствуяцих лучшему сохранению мор-фофизшологичводнх показателей спермиев.

В следующем опыте сперму, хряка охлаждали в течение 4 ч в атмосфере водорода, кислорода и воздуха. В замороженйо-от-

таянных оперших отмечалась предпочтительная сохранность фэо* фолшшдов пра охлаждении в атмосфере водорода*

Одним из наиболее существенных факторов, предопределяю» щих фкэикохимические и функциональные модификации шшброя, является фазовый переходлювдов. Наряду о другими биохимическими характеристиками, температура фагового перехода в значительной степени зависит от соотношения фоофсипшидов. и холестерина. Нами установлено, что в пропеоое охлаадения, замораживания и оттаивания спермы бака, барана и хряка в сперших наблюдается тенденция к смещению молярного отношения холеотерив/фоофолипиды в сторону увеличения (табл. 5).

Таблица 5

д^нмчц^ отношения холестернн/фосфолипады в сперхиях при разбавлении, охлаждении* н замораживании спермы быка, барана и хряка, %

Вид животно- } _Йтад обработки_

го_| разбавление ¡охлаждение ¡замораживание

Бык 100 П5,6±2,3 135,5 ±3,4

Баран 100 Г07Д±1,7* ЮВ,9±1,9*"

Хряк 100 107,4 ±4,2 И2,0±2,6в

Различия статистически достоверны по сравнению с показа! елями сиермнев быка: к - Р<0,05 ; я* - Р<0,01; за« - Р< 0,001.

Учитывая, что увеличение молярного отношения перемещает фазовый переход липпдов в зону более низких температур, можно думать о возможном участии эндогенного изменения отношения холестерин/фоофолипиды в адаптации сдеркиев х низким температурам. В спермвях быка этот процесс более заметен.

Это послужило основанием для, проведения опыта по выяснению влияния экзогенного холестерина и альфа-токоферола ва лишщшй состав и криорезистентность спермиев быка. Альфа-токоферол получали непосредственно перед применением путем гидролиза альфа-токоферолацетата.

Установлено, что введение в состав криозаиитной среда альфа-токоферола способствует лучшему сохранению лшшдов к восстановлению подвижности спврынев после оттаивания. Холестерин обеспечивал стабилизацию только эндогенного ХЛ.

В процессе криоконсервации в сперме повшается концентрация свободных радикалов и образование продуктов перекнсно-го окисления лшшдов (1Ю1),' поглоадицих в волновом диапазоне от 230 до 280 вм. Многократное замораживание-оттаивание спермиев приводит к значительному увеличению содержания продуктов ПОЛ, а использование аятиоксидаятов ингибирует процесс,

фкзяко-химкчеокая система регуляции окислительных реакций в лжшдах мембран, одним из важнейших параметров которой является величина антиокислительной активности лшшдов,представляет собой основу защитных механизмов клетки против повреждающего действия стрессоров. Мы изучили видовые особенности аатиоквслительной активности лшшдов (АОАЛ) спермпев быка, барана и хряка, а также влияние на этот показатель процесса криоконсервации. Установлено, что самой высокой JL0AS обладают сперши быка, величина которой превышает данные .спермиев хряка и*барана в 2,2 и 4,2 раза соответственно. Криокоясервация снижала АОАЛ спермиев быка в 1,8 раза, хряка - в 1,7 раза, а у барана не менялась.

Изучили влияние антиоксиданта мексидол на уровень ПОЛ в деконсервированных саершях быка, барана и хрлка. В большем количестве малоновый диальдегид (МДА) содержался в де-консервированных спермиях хряка, то деть уровень ПОЛ превышал таковой в сперме быка и барана в 1,4 и 2,2 раза соответственно. Таким образом, более устойчивые к холоду спермии быка обладают наибольшей АОАЛ, а более чувствительная сперма хряка содержит большее количество продуктов ПОЛ после деконс ервацйи» Антиокскдант ингибщювал ПОЛ .в процессе замораживания в сперме всех видов.

При введении в криозащитную среду катализатора ПОЛ (ионов двухвалентного железа) отмечали существенное концен-Трационно-зависимое снижение функциональной полноценности спермиев в процессе криоконсервации. Уже при концентрации железо снижало устойчивость спермиев к низким температурам, а при содержании более 10"% делало их беззащитными против холода*

3. Мембраяоактивные соеданения в разработка способов сохранения спермиев вне организма

Посколюку на действие стрессора живая клетка отвечает изменением проводимости плазматичеокой мембраны* мы провали исследования с целью выяснения возможности регуляции этого механизма при криоконсервации сперкиев сельскохозяйственных животных. Изучили влияние на устойчивость спермиев быка и барана к температурному стрессу препаратов, изменяющих проницаемость биомембран - каналоформера ам$отеришша В, образующего в мембране нес элективные каналы,» йротонофора 2,4 дннитрофенола. Препараты вводили в криоэащитную среду в разных концентрациях и при разном соотношении ингредиентов, меняющих тоничность раствора.

Полученные результаты показали, что введение в состав крио защитной среды амфотерицина В делало спермин беззащитными против холодового стресса, а 2,4 динитрофенола, напротив, оказывало позитивное действие. Негативный эффект амфотерицина В проявлялся во всех случаях, а когда его вводили в среду без желтка, температурный стресс приводил к гибели 100? спермиев быка и барана. Протонофор 2,4 динитрофенол увеличивал устойчивость спермиев быка и барана к температурному стрессу в 1,4 и 1,6 раза соответственно. Таким образом, только повышение специфической проводимости плазматических мембран увеличивает резистентность спермиев к холоду,

Известно, что препараты, обладавшие солюбилизирупцим действием, увеличивают пластичность биомембран и способствуют гомеовяэкостной адаптации. Мы изучили влияние на крио-резистентность спермиев детергентов додецилсульфата натрия (критическая концентрация мицеллообразования 8,2 Ш),тритона 1-100 (0,24 Ш) к смеси ненасыщенных жирных кислот (0,02-0,05 ОД), которую выделяли из подсолнечного масла и вводили в криоэащитную среду в виде эмульсин (ЭНХК).

Додецилсулъфат натрии не был достаточно Эффективен при замораживании спермы: показатели опытных груди незначительно превышали данные контроля.- Тогда как тритон Х-100 (алкилфенилполиэтиленгликоль) проявлял высокие криозагантнне Свойства при замораживании спермы. В результате была раэра-

ботана ореда ЛТ№ дяя эажорегавания спермы барана следупце-го состава, мас.£: лактоза 8,8; глицерин 3,8 ; желток кури-вого яйца 14,2 ; тритон 1-100 0,001; вода бидистиядированная до 100 (а.с, * 15408Г?). Широкие испытания ЛТРИ среди в лабораторных и производственных условиях показали, что она повышает абсолютный показатель выживаемости и оплодотворяющую способность деконсервированннх спермиев барана на 37,3 и 0,7/6 соответственно.

ЭЕ8Х не защищала спермиев от температурного стресса и не была аффективна при замораживании спврш быка и барана. Однако выявили позитивное действие препарата при врюконсер-ваши спермы хряка. Это послужило основанием для разработки ВСЭЕКК среды следущего состава, мае.?: сорбит 3,0 ; глюкоза 0,7 ; натрий лимоннокислый трехзамещегяай пятиводный 0,25 ; 'вивший сернокислый 0,25 ; ЭДГА натриевая соль 0,35 ; трис (оксиметал) аминометан 0,05 ; глицерин 3,5 ; ЗНХК до 100» Для получения ЭВПС подсолнечное масла (ТОСТ 1129-73) встряхивают В течение I тс дистиллированной водой в соотношении 1:2 (масло:вода), затем центрифугируют при 1,5-2,0 тыс. об./мин в течение 15-20 мин для разделения слоев, верхний слой удаляют водоструйным насосом, а »"«чрв используют для приготовления среды. БСЭКЕК среда (а.с. Л II434I3) увеличивает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированннх спермиев хряка на 12*5, 35,3 в 21,1% соответственно.

Многочисленные иосладоэанжя, проведенные наш и другими авторами из разных стран, позволили выявить большое количество антиокоидаатов, проявлявших криопротекторные свойства. Было установлено, что природные автиоксаданты и их синтетические аналог* жмеют значительные преицуцества перед синтетическими и михрозлементами оря кряоконсервацки спермы евльсжехозяйстееявнх животных.

Испытали природные антиоксиданты (мелонгозщд, кавеико-юд и сульфированный триозид аеотигогейина), относящиеся к классу стероядных гликозидов. Лучшие результаты были получены в случае использования мелонгозида щя криоюноервации спермы хряка. В результате этих исследований разработали криовадитнув среду ВСМ, включающую следущие ингредиенты, мае.*! сахароза 4,29 } глюкоза 0,69 ; фруктоза 0,63 ; ЭДТА нат-

риевая соль 0,34 ; натрий лимоннокислый трехэамещевный пяти-водный 0.26 ; аммоний сернокислый 0,17 ; трис (оксиметил). амкнометан 0,05 ; глицерин 3,43 ; желток куриного яйца 4,29 ; мелонгозвд /(25 Р)-фурост-5-ен-3-бета, 22д, 26 триол-26-0-бета-Д глюкопираноэид/ 0,00004 ; вода бидиотюшгрованная до 100. БСМ среда (а.с. * II38I49) повышает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способность деконс ервированных спермиев хряка на 50,0, 37,5 и 23$ соответственно.

Высокие криозащитные свойства при замораживании сперш быка, барана и хряка проявляли антиоксиданты из классов 3-оксипнридинов (первичная структура витамина Bg) и бенэнмида-золов (первичная структура витамина В^).

В частности.мексидол (сукшшат 2-етил-б-метжл-З-оксипн-ридин).повышал криореэистентность спермкев, ингибируя ПОЛ в сперме. Содержание в деконсервироваиной сперме хряка снижалось по сравнение с контролем на 62,7$, барана - на 30,9*, а быка - на 28,Мексидол снижал образование как первичных, так и вторичных продуктов ПОД (первичные поглощают при длине водны 233 нм, а вторичные - 270. нм) и, соответственно, уменьшал степень окисленности лнлндов (табл.6), а также повышал на 7,IJ( антиокислятельную активность свертев. Отмечено позитивное влияние препарата на сохранение ультраструктур свертев в процессе замораживания: сохранность акросон спермиев быка, барана к хряка была выше. по сравнению с контролем соответственно на 4,7, 9,3 и 27,2#* Выявлена концентрационная видо специфичность действия нексидола; оптимальная концентрация для сперш быка в 10 раз меньше таковой для спермы барана.

На основании проведенных исследований была разработана среда ДАМЕК для криоионсервашш спермы быка, включающая следующие ингредиенты, мао.£: лактоза 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток единого яйца 11,5 ; мексидол 0,0000255 ; вода бидистилга-рованная до 100.

Среда JIAMEK (а.с. Jl 1634268) в сравнительном испытании характеризовалась' способность» повышать показатели функнжог нального состояния спермиев и ингибировать ПОД в процессе технологической обработки спермы быка: выживаемость, абсолютный показатель выживаемости и оплодотворявшая способность спермиев увеличивались соответственно на 12,5, 35,8 и 7,7%,

а образование 1ОДА снижалось на 29,

Таблица 6

Влияние мексидола на уровень перекисного окисления лишдов в деконсервированннх спермиях

! Длина волны (нм)~ ) Степень окисленнос-

Вариант , оптическая плотность (Д) \ ти липидов, у.е. опыта

! <хм ! очл !

Нативные 0,232 ± 0.057 ± 0,142 ± 0,035 ±

(ю£5ль) 0,037 0,005 0,033 0,005

233 | 270.

0,232± 0,057±

0,037 0,005

1,027 0,214 ±*

0,041 0,031

0,548 ± 0,180±*

0,124 0,025

Д233^2Ю!Д270^2Ю

Заморожен- 1,027 ±** 0,214 ±* 0,577 ±™ 0,120 ±*

ио-оттаян- о,041 0,031 0,015 0,012

Заморожен- 0,548± 0,180±* 0,347± 0,ИЗ±

но-оггая ныв с ме сидолом

0»124 0,025 0,109 0,026

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: *- Р< 0,05 ; т- Р< 0,01.

Аналогичные по существу исследования были проведены с другими представителями класса 3-оксипиридинов (ОП-6, СК-4* и СК-5), а также бензимидазолаш (амбиол и ЕИ0-50). Чтобы выяснить какой класс соединений имеет больше перспектив в криобиология спермы, мы провели сравнит ельноэ испытание. Препараты использовали в пределах оптимальных концентраций. Результаты испытаний показали, что бензимвдаэолы и 3-окси-пирвдинн, по существу, в равной степени эффективны при крио-хонсервации спермы быка (табл. ?), Однако лучшие данные были у амбиола (2-метил-4-диметилйминометил-бензимидазол-5-ол-дигидрохлорид). Важно, что амбнол защищал от разрушения в процессе криоконсерваодм улътраструктуры спермиев: сохранность акросом увеличивалась по сравнению с контролем на 1136. Способствовал сохранению акросом и З-оксшшрчдин ОП-6, Ащиоксидантные свойства амбиола объясняются подвижностью атома водорода гвдроксилыюй группы при С6.

Таблица 7

Влияние бензимидаэолов и 3-оксиинродннов на морфо-фнзиологические показатели сперыиев быка в процессе криоконс ервацин

Антиокои-дант . • | Ковцент- 1 Подвижность, {рация, Mrjtj балл ¡Выживае-{мость, ч {Сохранность 'акросом, %

Контроль О 3,2±0,08 7,2±0,14 36,2±0,41

Амбнол 0.7 3,6±0,07м 8,4±0Д71вв40»2±0,64ИВ|

14,0 3.7±0,13в 8,510,18*® 39,610,67 е1

ЕШ-50 0*8 3,7±0Д2в 7,8 ±0,14* 35,8 ±0,49

***** 16,0 3,3 ±0,09 7,9 ±0,19* 37,3 ±0,54

ОП-6 0,45 3,4±0,0в 7,6 ±0,28 39,3±0,37жв

9,0 3,2 ±0,09 7,5 ±0,24 37,6 ±0,48

ОК-4 0,5 3,810,09*8,310,14™» 86,2*0,41

10,0 3,4 ±0,07* 8,5i0)I8BB8S,8t0,49

СК-6 0,5 3,5 ±0,08 7,9±0,19* 38,8 ±1,46

_Г1 _ 9,0 3,3±0,07 9,3±0»16л37.2±0,54

Различия статистжчеоет достоверны ос сравнению с контролем: *-Р<0,05 ; »-Р<0,01; Р<0,001.

Учитывая больиую роль дшпдов в защите сперииев от негативного действия низких температур* т изучили эффективность общих лшшдов (OIA) и фосфолипдцов (ФЛА) ахтааомвце-тов (Actiaoinyces griseua) общих лшщдрв (ОЛЛ) и фоофоди-пидов (ФДД) дрожжей (Sachar оиусвв cerevieiae) н фоофс-лэтидов кандиды (ФЛК) (o«tfid*etoll*pqmóMttl).

В результате исследований установлен высокий кршозащитный эффект у OIA. Позитивное влияние на функциональное состояние спериев при криохоноервации отмечалось у MR ж QJOU тогда как ФЛД повышали выживаемость, но снижали подвижность деконсервированных гамет, ФЛА снижали выживаемость деконсер-вированных шермиев.

На статистически достоверные величины ОМ повышали, по срввнению с контролем, у дековсервированаых спермиев барана показатели подвижности, выживаемости, абсолютного показателя выживаемости, сохранности ахросок и антиокислительной активности дшшдов, у быка - подвижности, выживаемости и абсолютного показателя выживаемости, а у хряка - сохранности ак-росон и антиокислительной активности липвдов. То есть ОЛА наиболее эффективны для повышения криорезистентности спермиев барана. Это послужило основанием для разработки среды ЛОЛА для замораживания спермы барана следухщего состава, Mac.í*. лактоза 8,& ; глицерин 3,0 ; желток куриного яйца II,5; ОМ 0,015 ; вода бвдистиллированвая до 100. ОЛА получают из биомассы актиномицетов, которую выращивают как'кормовую добавку на биохимических заводах по традиционной технологии. Способ приготовления ОЛА позволяет получать стабильный препарат, содержащий фосфолипиды, moho-, ди- и триацилглицери-ны, .стерины, неэстерифицированные жирные кислоты, эфиры сте-ринов, воски и природные антиоксиданты, ЛОЛА среда (а.с. Jí 1498489) повышает результативность искусственного осеменения овец на 24,9%.

Наряду с криозащитными средами,была разработана ЩОИ-6 среда для. разбавления спермы барана следущего состава,мае.%•. глюкоза 0,7 ; натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный 2,4 ; желток куриного яйца 12,2 ; ОП-в (хлоргидрат-2-этил-б-метил-З-оксипиридин) 0,009 ; вода бидисталлированная до 100* Среда повышает выживаемость, сохранность акросом и оплодотворяющую способность спермиев на 45,9, 3,1 и 7,9% соответственно . Степень охисленности липкдов снижается по первичным продуктам ПОД на 12,7%, а по вторичным - на 36,

Таким образом, мембраноактивше соединения являются высокоэффективными ингредиентами защитных сред дня сохранения спермы сельскохозяйственных вне организма*

Препараты, относящиеся к 3-оксипиридинам и бензимвдазо-лам синтезированы в Институте химической физики РАН (разработчики: доктор химических наук, профессор Л.Д. Смирнов, кандидаты химических наук Л.Г, Столярова и Ю.В. Кузнецов), стероидные гликозиды в Институте экологической генетики AHM (д.х.н., профессор П.К* Кинтя), а липлдн микроорганизмов получены в Отделе микробиологии AHM (к.б.н. С.А, Бурцевой и

«

Л.П. Ковальчук).

4. Влияние стрессоров на воспроизводительную способность животных и пути ее повышения

В случной сезон было сформировано две группы овцематок цигайской породы. Первая (опыт) содержалась в загоне без выпаса в скученном состоянии н получала вволю зеленую массу люцерны, а вторая (контроль).в течение 12-14 ч в $утки выпасалась по люцерне. Все овцы получали по 100 г/гол./дн. концентратов. Охоту выявляли дважды - утром н вечером. Осеменяли спермой, разбавленной 1Ц0П-6 средой сразу после выявления охоты и повторно через 24 ч. В результате гиподинамии сократилось количество животных, проявляющих эотрус в течение 17 дней, на 17,7^, а их оплодотворяемое» - на 2$,4? (табл. 8).

Таблица 8

Влияние гиподинамии на воспроизводительную

функцию овцематок

Вариант I Количест-1Пришло в охоту в течение!

опыта ¡во овец, :17 дн.___Окотилось, %

__!ш, 1_I_1_

Опыт 205 125 61,0 ±4,2* 53,143,5***

Контроль 197 146 74,1±3,1 72,1±3,2

Различия статистически достоверны пб сравнению с контролем: Р< 0,05 ; ж*- Р< 0,001,

Учитывая, что отлучение от отары (нарушение стадности) является для овец одним из наиболее мощных психологических (социальных) стресс-факторов, мы проводили осеменение с применением. разработанной нами установки, устранявшей этот раздражитель. Овцематок в охоте контрольной группы выделяли из отары, перетаскивали в пункт искусственного осеменения,фиксировали в станке и проводили осеменение. То есть, в опытной группе были исключены выделение из отарн, перетаскивание и жесткая фиксация животных. В предложенной нами установке, движения овцематки ограничены только размером платформы для

осеменения. До результатам окота ошюдотворяемость овцематок в опытной груше была выше на II,

Для выяснения влияния температуры спермы, вводимой в шейку дотки, овцематок осеменяли спермой, имеющей температуру 20°С (контроль) и 38°С (опыт). Доведение температуры спермы до физиологических норы повысило количество окотившихся животных на 22,3$.

Известно, что при стрессе усиливается процесс ПОЛ. С целью выяснения влияния антиовсиданта амбиол и нитратов на качество спармопродукции зевотных было сформировано три группы баранов. Первая группа контрольная, вторая - получала дополнительно нитрат натрия в дозе 5490 мг/кг комбикорма в день и третья - амбиол в дозе I кг/кг комбикоре. Бараны получали добавки в течение 35 дней. Полученные данные показали, что введение в корм амбиола способствовало увеличению объема эякулята, количестве сперигеи и зляуляте, иодиижиоо-ти и сохранности акрооом опермиаа аа 30,0, 44,8, 6,1 и 5,5$ соответственно. Нитрат натрия сникал подлинность и выживаемость деконсервировавных сцермиав на 13,6 и 7,4$ соответственно. При этом, амбиол существенно снижал степень окаслеи-ности липидов и образование НД1 в сперме, а нитрцт натрия овавывал противоположное действие.

Сформировали три грутоы овцематок породы текеель, завезенных из Голландии. В результате изменения климатических, а также условий содержания и кормления они в течение трех месяцев не приходили в охоту. Первую группу овцематок обработал. амбиолом, вторую - СК-б, а третья служила контролем. Препараты вводили, однократно внутримышечно в виде водного раствора (I кг/мл), в дозе 0,4 мд/гол. Через два дня пооле обработки у всех «квотных веяли образцы крови для определения содержания продуктов ШЯ и гормонов. Применение препаратов заметно повысило оплодотворяемооть (в первой груше на 9,3$, а во второй - на 13,3$) и снизило уровень ПОЛ в крови овец (табл. 9).

Различий в содержании эстрадиола, тестостерона и прогестерона между группами не обнаружено, однако амбиол существенно увеличивал содержание трийодтироюша. Таким образом, повышение репродуктивной способности животных совпадает со снижением уровня ШЛ в крови.

Таблица 9

Влияние антиоксидаятов на уровень перекисного окисления лигадов плазмы крови овцематок

1 Степень окноленаооти лжпидов, ! Содержание ММ» Вариант | . {д/^ . ш-2

опыта 1-—-[-—-1 г30^

_( Д233/Д2Ю I Д270^2Ю |_

Амбиол 18,7±0,12ШЁ 5,7±0,091ВИ( 1,2 ± 0,07 СК-б 18,010.05*** 5,1 ±0,07™* 0,910,04** Контроль 23,0 ±0,20 6,5±0,15 1,6±0,0б

Различия статистически достоверен по сравнению о контролем: »ее-Р<0,001.

В следующем опыте нами била поставлена задача выяснить эффективность совместного применении амбяола и дигитола, представляадего собой смесь эстрогенов, андрогенов в вхэфи-ров. В анэстральвдй период сформировали четыре группы овцематок, первую из которых обработали амбиолом, вторую - ди-гатолом, третью - амбиолом и дигитолом, а четвертая служила контролем.. Препараты вводили однократно внутримышечно в следующих дозах, мл/100 кг массы тела: амбиол 0,4 ; дигитол 2. Результаты исследований показали, что препараты оказали заметный стимулирувдий эффект (пришло в охоту в течение 8 дн. в I группе 30,0*, во II - №,6$, в III - 76,в 1У -8,5$), который у дигитола был предпочтительней. Лучше результаты по стимуляции получены в третьей группе, обработанной амбиолом и дигитолом. Оплодотворяемость в группах составила соответственно 85,0 , 62,5 , 75,8 и 80,0)6. Дигитол снизил результативность осеменения, а амбиол способствовал повышению оплодотворяемости.

Далее препарат был испытан на коровах. Для изучения его эффективности и механизма действия определяли содержание в плазме крови коров Прогестерона, эстрадиола, тестостерона, трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4) и малонового диаль-дегида(МДА), а также Степень окисленнОсти липвдов. Кроме

этого учитывали проявление охоты в течение 20 дней после обработки, ошгодотворяемоеть н продолжительность сервис-перио-ДД.

Сформировали пять групп коров с продуктивностью за последнюю лактацию 4000 кг молока (одна контрольная в четыре опытных). Коровам опытных групп'на 25-30 да. после отела однократно внутримышечно ввел амбнол в следующих дозах; 0,2; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 цп/100 кг массы тела. Через семь дней после обработки взяли пробы крови для исследований. В результате опыта, на основании данных по проявлению эструса (50£), оп-лодотворяемости (60$) (в контроле соответственно 30,0 ж 33,3^) и низкому:уровню МДА в крови (66^ от показателей контрольной группы), установлено, что оптимальной является доза 0,4 мн/100 кг массы тела.

Этот опыт был повторно проведен на коровах с продуктивностью 5000 кг молока за последнюю законченную лактацию, который подтвердил правильность оптимальной дозы амбиола. Использование препарата позволило сократить период от отела до проявления признаков охоты на II ,4 дня, а сервис период - на 23,6 дня. Причем показатели непроизводительного периода у коров всех опытных груш были меньше, чем у контрольных.

Пятьдесят коров с продуктивностью евшее -7000 кг молока и содержанием жира в молоке не менее 3,8? разделили по принципу аналогов на две равные группы. Животных опытной группы " обрабатывали амбиолом через каждые 14 дней, начиная с.запуска до прихода в охоту в дозе 0,4 мл/100 кг массы тела. В • опытной груше период от отела до начала охоты и сервис-период составили 59,5 и 80,6 дня, а в контрольной - 78,6 и 103,2 дня соответственно.

Изучили влияние амбиола на восстановление половой цикличности у коров, не' приходящих в, охоту в течение 60 дней после отела, из которых сформировали четыре группы. В первую и третью группы вошли коровы с гипофункцией яичников, а во вторую и четвертую - с персистентным желтым телом, Ливот-ных первой и второй груш обработали амбиолом (0,4 мп/100 кг Установили, что амбиол проявляет стимулирующее'действие, повышает оплодотворяемость и снижает продолжительность сервис-периода. Больший эффект от применения амбиола достигается на животных с гипофункцией яичников. Препарат снижал степень

окисленности лнпкдов плазмы крови коров на 16,2-18,151, а образование МДА - на 21,3$. В то же время, он способствовал созданию гормонального, фона, обеспечивающего проявление половой охоты (по прогестерону и зстрадиоду). В опытных группах воэрасло'на 71,4-165,содержание в крови тироксина и на 59,3-85,4$ - трийодтнронина.

В соответствии с решением НГС МСХиП Республики Молдова в 1991-1992 гг. было проведено широкое комиссионное испытание препарата амбяол в 26-ти хозяйствах, результат представлены в таблице 10,

Таблица 10

Результаты комиссионного испытания амбиола

Группа

| Обра-! } бота- |—

: во. :

НО, | I ГОД. |

Прошло в охоту, %

т

Опыт

Контроль

1. С целью подготовки к отелам, коровам вводили через каждые 14

дн. начиная с запуска 4093 55,7±0,8

2. Для стимуляции охоты, коровам с нормальным течением родового и послеродового периодов вводили однократно через 25-30 дн. после

отела 2257 71,8±0,9

3% Для восстановления половой цикличности, коровам, не проявившим эструс в течение 60 дн. после'отела,вводили однократно в день ректального обследования 6105 49,4±0,6

4. С палью стимуляции охоты,овец обрабатывали однократно 349 55,5 ±2,7

29,8±0,7

44,7 ±1,0

17,5±0,5 8,5±1,5

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: эв»- Р<0,001,

ВНИИШЭ признал разработку амбиола изобретением н принял решение выдать авторское свидетельство от 26,02.91 по заявке А 4774697.

Амбиол является хлоргидратной формой бенимидазола, поэтому в следутищх исследованиях мы испытали хлоргвдратный вариант З-окнспнрвдива - СК-б (хлоргвдрат-2-третбутил-3~ окоипвридян). Во всех опытах препарат вводили внутридашечно в виде водного раствора с концентрацией I мт/мл.

Из коров с продуктивностью за последнюю законченную лактации 3500-4000 кг молоха и нормальным течением родового и послеродового периодов было сформировано 6 груш. Первая группа контрольная, а животным остальных - вводили СК-5 соответственно в следующих дозах: 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ; 1,0 мл/100 кг масон тела. Лучше результаты по оплодотворяемостн и продолжительности периода от отела до проявления охоты, а также оервис-периода были получены при использовании СК-5 в дозе 0*4 ил/100 кг.

Дяя выяснения эффективности СК-5 в сравнении с известным антиокоидантом феноэанЧС, сформировали три группы коров с продуктивностью 4800-5500 кг молока. Препараты вводили в дозе 0,4 мя/100 кг. Через семь дней после обработки у животных брали кровь для определения степени.окисленности липи-дов и содержания малонового дкальдегида. Установили, что СК-5 снижал по сравнению с фенозаном-К и контролем продолжительность сервис-периода на 5,75 и 7,91 да. соответственно. В груше животных, обработанных СК-5, были заметно ниже степень окисленности липцдов плазмы крови и содержайие ММ.

Далее было сформировано две группы коров с продуктивностью 5000-6000 кг молоха. Коровам первой грушш вводили СК-5 в дозе 0,2 мл/1СЮ кг через каждые 14-дней после отела в до прихода в охоту. Вторая группа служила контролем.Кровь щи исследований брали через' 2-3 дня после начала охоты.Установлено онижеаяе (по сравнению с контролем) сервис-перно-да на 25,3* и увеличение оплодотворяемостн на 35%. Применение СК-5 привело к изменению содержания стероидных гормонов (тай*, п). и снижению уровня ПОЛ в крови.

В следующем опыте испытали СК-5 х дигитол на коровах, не проявлявдих признаков вструса в течение 60 да. после отела, из которых сформировали три группы. В каждую группу входили животные с гипофункцией яичников и персхотентннм желтым телом. Коров первой группы обработали СК-б (0,4 мл/ 100 кг), второй - дигитолоы (I мв/100 кг), а третья служила

контролем. Кровь брали через 2 дня после начала охот.

Таблица II

Влияние СК-5 на гормональный статус коров

_^_:_I__ -^'Лро М1 !_

СК-5 0,98±039,61 ±4,Й 2,8410,13 0,71 ±0,09 Контроль 0,60±0,09 66,34±7,68 3,08±0,24 0,59±0,10

Различия статистически достоверны по сравнению о контролем: *- р< 0,05 ; »- Р<0,01.

Препараты не способствовали повышению овлодотворявиоо* тя и не были аффективны для коров с персистентным калтны телом. Однако, дигитоп на 29,увеличивал восстановление цикличности у воров с гипофункцией яичников, а СК-б - на 27, По содержанию стероидных и тнреоидных гормонов существенных изменений не обнаружено. Только дигжтол снижая уровень прогестерона у коров о персистентным желтым телом. В то же время, как СК-5, так и дигитол заметно снижали уровень ДОЛ в крови коров.

На разработанный нами способ повышения воепроизводительной способности животных с применением СК-5 получено положительное решение ВШИГШ от 28.11.91 на выдачу авторского свидетельства по заявке Я 4299601.

5. Основные принципы адаптивной технологии получения, ¡фиохонсервацки и использования спермы барана

Технология включает оледущие разделы: получение спермы ; разбавление а криоконсервация спермы; организация участка искусственного осеменения, выявление овцематок в охоте и их осеменение. Она предусматривает использование биологических факторов и технических средств, .способствующих повышению результативности искусственного осеменения овец.

Эффективность технологии обеспечивается разработавшая способом повышения качества спермопродукции, установкой для получения спермы, крио защитной средой, способом выявления овцематок в охоте, установкой для искусственного осеменения и комплектом инструментов.

Содержание баранов-производителей небольшими (5-6 гол.) постоянными по составу группами позволяет устранять (или смягчать) стресс-факторы, которые имеют место при индивидуальном и крушогрупповом содержании и перегруппировках. Активный моцион и полноценное кормление профилактируют соответственно гиподинамию и кормовой стресс. Введение в рацион амбиола повивает адаптивные возможности животных. Сперму получают от всех баранов каждой группы в один и тот же день в определенное время с помощью установки, включающей платформу для получения спермы, которая располагается на высоте, облегчающей работу технолога. Преимущество установки перед напольными вариантами заключается в том, что на производителя, во время подготовки к садке я непосредственной эякуляции, не оказывают отвлекающего влияния остальные производители.

Для разбавления спермы, используемой при температурах выше 0°С, применяют среду ЩОП-6, а для криоконсервации -среду ЛОЛА. Предложенные среды и приемы технологической обработки повышают эффективность хранения спермы вне организма.

Способ выявления овцематок в охоте и установка для искусственного осеменения предотвращают влияние таких экстремальных воздействий, которые связаны с выделением овец из отары, их перетаскиванием к месту осеменения и жесткой фиксацией. Предусмотренное технологией присутствие самца при осеменении повивает его результативность за счет комплекса нейро-сексуальных воздействий, способствующих усилению моторики матки и продвижению спврмаев в половых путях. Следовательно, размещение на установке для искусственного осеменения барана, способствует не только непринудительному перемещению овцематок, но и реализации физиологических механизмов оплодотворения. Установка расположена снаружи пункта. Осеменение проводят через саншлюз, поэтому осеменяемая овцематка находится за пределами пункта и не в полной мере

воспринимает манипуляции технолога. Сбоку от нее находится овцематка, ожидающая осеменения, а перед - баран, передающий специфические звуковые, поведенческие и обонятельные (посредством феромонов) сигналы. Движения овцематки ограничены только размером платформы и не вызывают особой тревоги (болевых и илюбилязацноюшх воздействий).

Инструменты для действенного осеменения сконструиро-ваяяы с учетом физиологических и анатомических особенностей овец. Комплект включает размораживатель, вагиносжЛ, прибор дня осеменения ж набор кювет. Конструкция размораживателя обеспечивает быстрое отделение жидкой фазы от твердой,что предотвращает температурный стресс при оттаивакга спермы, Ире бор для осеменения устраняет температурное стресс ированве вейки матки (температура спермы ж катетера поддерживается на уровне 38°С автоматически), что способствует увеличению глубины введения катетера в канал лейки и дальнейшему продвижению спермиев:если температура катетера я спермы ниже физиологической, ханах вейки матки сжимается в моторака матки прекращается. Использование подогретого до Э6-42°С н смоченного физраствором вагивоскопа (обеспечивается биотермостатем с физраствором), диаметр которбго меньше среднего диаметра влагалища овцы, приближают процедуру осеменения к естествен-нш физиологическим параметрам.

Кроме этого, технология значительно снижает трудоемкость Искусственного осеменения, что имеет не последнее значение для его широкого внедрения в практику. Адаптивная технология позволяет получать 45,9-64,7? плодотворных осеменений овец и успешно используется на пяемпредприятиях и в овцеводческих хозяйствах (акт внедрения от 22.04.91).

6. Способ повышения воспроизводительной способности животных

Основной принцип способа повышения воспроизводительной способности животных заключается в следующих двух составляющих:

I. Предотвращать или смягчать действие стрессоров и осуществлять мобилизацию эндогенных защитных в регуляторных систем организма средствами различной природы;

2. Прк ивеоком уровне экстремальных воздействий, когда организм животного не в состояло противостоять стрессорам I возникая! функциональные нарушения, следует щямвнять средства специфического дейотвия, окаэнващие позитивное чид» на поврежденный орган, систему или функциональна! дисбаланс,

В качестве средства неспецв)Еичесюого действия ш впервые предложили использовать препарат амбиол, который обладает антиокскдантными свойотвакк, а также стимулирует проявление. эструса, повшвает опподотворяемооть и качество спериэ-продугами. Амбиол успешно прошел лабораторные и производственные испытания, выпускается серийно и применяется в производстве по следущей схеме:

1. Подготовка коров к отелам - вводят по 1,5 мл на голову вцутртавечно каждые 14 дней начиная о запуска.

2. Коровам с нормальным течением родового и послеродового пересдав вводят внутримышечно по 2 мл на голову однократно на 25-ЭО-й день после отела.

3. Коровам, не проявивши охоту в течение 60 дней после отела, вводят внутримшечво по 2 мл на голову в день ректального обследования.

В интересах создания оптимальных условий для собственных регуляторных механизмов животных предлагается комплекс следупцих мероприятий*, активный моцион предоставляют всем коровам через три дня после отела на расстояние 5-7 км; за два месяца до предполагаемого отела животным вводят каждые 10 дн. по 10 мл тривитамина или тетравита ; на 25-30-й день после отела трехкратно с интервалом в сутки применяют массаж матки и яичников ;.при задержании последа рекомендуется применять дигитол, стимуляции секреции ЛГ - сурфагон, при наличие персистентного желтого тела и фолликулярной кисты - фла-волиз, а гипофункции яичников - прогестерон и дигитол. С целью активации секреторной функции эндометрия, сохранения жизнеопособности зиготы, обеспечения условий для ее имплантации и развития эмбриона, животных обрабатывают прогестероном. Для профилактики эндометритов и субинволщии матки предлагаем использовать ихглюковит.

Разработанный способ успешно используется в практике. В процессе внедрения было выявлено, что использование препа-

рата амбнол с целью стимуляции репродуктивной функции снизило сервис-период на 7,4 дня и повысило ошгодотворяешоть хоров на 5,6$. Применение амбиола в комплексе с другими методами повышения воспроизводительной способности животных обеспечило увеличение выхода телят на 4,7$ (акт внедрения от 30.12.92).

Таким образом, в результате фундаментальных и прикладных исследований ; разработки технических средств и технологических приемов была Достигнута цель настоящей работы.

В Ы В 0 Д. Ы

I. Экспериментально установленные в данном исследовании видовые особенности липидного состава плазматических мембран спермиев быка, барана и хряка заключаются в разных соотношениях фракций лишщов. Кроме того, лизофоофатиды в плазматической мембране спермиев хряка представлены лизофосфатвдил-холином и. лизофосфатидилэтаноламином, а у быка и барана -только лнзофосфатидилхолином; в плазматической мембране спермиев хряка отсутствуют кардиолипин н цереброззд-Х.

. 2. В процессе криоконсерващга в плазматических мембравах спермиев изменяется соотношение фракций фосфолипндов. 7 спермиев быка после разбавления фосфолипиды распределятся в ряду фоофатидвлхолин+фосфатадилсерин > фосфатвдилэтанола-мия> сфингомиел1Ш> кардиолипин> фоофатидная кислота, а после замораживания-оттаивания - фоефатцщштанола*ян> фоофати-далхолин-н$осфатндвлсерин> фоофатидная кислота ? кардиолипин > сфингомиелив, а у барана соответственно - фосфатидилхолии > фо сфатидилэтаноламин > сфингомиелин > кардиолипин ,> фоофатидная хислота> фосфатидилсерин и фосфатидилхолии > фосфатвдил-этаноламин> сфингомиелин> фосфатидная кислота> кардиолипин > фосфатидилсерин, & у хряка - фосфатидилэтаноламин > фосфати-дилхолин> фоофатидная кислотам сфингомиелин+фосфатидилсерян >лизофоофатядклэтаноламин и фоофатидная кислота > фосфатидил-9таноламин> фосфатвдилхолин> сфингомиелин+фоофатидилсерин > лизофосфатидилэ таноламин. После оттаивания в плазматической мембране спермиев быка в 1,2 раза больше содержится, фосфати-дилэтаноламина и в 1,3 раза меньше - сфингомиелина, а у хря-

ка в 1,7 раза больше - лизофобфатидилэтаноламива. Лишдннй состав плазматической мембраны спермиев барана отличается большей стабильностью, чем у быка и хряка.

3. Подвижность я выживаемость спермиев коррелируют с содержанием в плазматических мембранах фосфатидилхолина, фоофатидилсерина, фосфатидной кислоты, холестерина, церебро-эида-3 и неэстери$ицарованных жирных кислот на разных стадиях технологической обработки спермы,

4. Криоконсервация приводит к акгивавд фосфолипаз (увеличивается содержание лизофосфатвдилэтаноламина, неэс-1ерифицированных жирных кислот и фосфатидной кислоты), процесса перекисного окисления липидов (увеличивается степень окисленное ти липидов и образование мйлонового диальдегида; снижается антиокислительная активность липидов) и.увеличении в опермиюс соотношения хслестерин/фосфолшгады.

5. Видовые особенности криореэистентности спермиев связаны с динамикой в процессе замораживания, существенных для них характеристик (уровень перекисного окисления липидов, соотношение различных фракций липидов, состояние акросокы, двигательная активность, устойчивость к температурному стрессу). При крноконсервации спермы, наряду с криоповревдениямя, имеют место реакции спермнев, направленные на поддержание их функционального гомеостаза. Спермин быка имеют большую, чем спе!юи барана и хряка, криорезистентность, антиокислитель--ную активность липидов и выраженность увеличения в процессе технологической обработки молярного отношения холестерин/ фоофолшщцы.

6. Нембраноактивные соединения (антиоксиданты, регуляторы проводимости, детергенты и комплексного действия) повышают криорезистентность спермиев. Разработанные с их использованием среда для замораживания.спермы быка, барана и хряка способствуют улучшению восстановления функционального состояния спермиев после замораживания-оттаивания.

7. Стрессоры различной природы (гиподинамия, нарушение стадности, физические и химические воздействия) повышают уровень перекисного окисления в крови животных, что совпадает со снижением их воспроизводительной способности,

8. Антиоксиданты амбиол и СК-5 снижают степень окислен-* ности липидов и образование малонового диальдегида в крови

животных, сокращают сервис-период, повывают оплодотворяеиость, улучшают качество сиермопродукции и способствуют нормализации гормонального статуса,.

9, На основании проведенных экспериментов достигнуто улучшение воспроизводства стада путем увеличения эффективности хранения спермы вне организма, применения антиоксидантов и препаратов, корректирупцих гормональный статус, а также снижения уровня экстремальных воздействий при воспроизводстве животных.

- ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДДОЖШИЯ

1. Для повышения эффективности хранения спермы вне организма предлагаем использовать следующие защитные среды:

а). Среда JUMBC (а.о. Л 1634266) для кри&консервации спермы быка следущегб состава, мас.£: лакто>а 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 11,5 ; мексидол 0,0000255 ; вода бидистиллированная.до 100.

б).Среда ЛОЛА (а.с, * 1498489) для криоконсервацни спермы барана следуодегб состава, мас.£: лактоза 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 11,5 ; ОЛА {общие лшщды акткноми-цетов) 0,015 ; вода бидистиллированная до 100.

в). Среда ЩНК-6 для разбавлении и хранения спермы барана при температурах выше 0°С, включающая следущие ингредиенты, мас.£: глюкоза 0,7 ; натрий лимоннокислый трехзвмещенный пятиводный 2,4 ; желток куриного яйца 12,2 ; 0П-6 (хлор-гидрат-2-эт жл-6-метил-З-оксицириднн) 0,009 ; вода бидистиллированная до 100.

2. Рекомендуем применять препарат амбиол (положительное решение ВНИИГПЭ от' 26.02.91 на выдачу а.с. по заявке

Л 4774697) для стимуляции репродуктивной функции коров и овец в дозе 0,4 мл/100 кг массы тела.

3. Предлагаем для широкого применения в практике технологию воспроизведения овец, вкяючащую следупцие разделы: подготовка инструментов, посуды, помещений и животных ; получение спермы ; криококсервация спермы ; организация участка искуоотвенногоосейенення, выявление овцематок в охоте н их осеменение ; меры предосторожности; учет результатов (Рекомендации: Адаптивная технология получения, криоконсервацни и ис-

пользования семени барана// Кишинев:Молдагроинформреклама, 1992. 32 е.).

По теме диссертации опубликовано -70 работ* основные положения изложены в следующих:

1. Гуськов ¿.И. Количественные изменения фосфолншщов при низкотемпературном замораживании гамет хряков-производителей// Второй съезд физиологов МХР. Кишинев:Штикнца, 1980. С. 127-128.

2. Наук В.А., Гуськов A.M. Особенности перекисного окисления липидов при замораживании спермы, быков- и хряков— производителей// Доклады ВАСХНИЛ., 1983. К 2. С. 27-29.

3. Наук В.А., Гуськов A.M. Концентрация. свободных радикалов в сперме хряков при замораживании// Доклады ВАСХНИД. 1983. » 8. С. 37-38.

4. Гуськов A.M. Криогенные изменения липидов и их влияние на функциональную полноценность гамет хряка и быка// Стресс, адаптация и функциональные нарушения. Кишинев: Штиинпа, 1984..С. 274.

5. Наук В.А., Гуськов A.M., Борончук Г.В. Криорезистент-вость гамет самцов сельскохозяйственных животных в зависимости от содержания эндогенных липидов// Известия АН МССР: Сер. биол. ж зим. наук. 1984. Л 5. С. 56-61.

6. Наук В.А., Гуськов A.M., Калистру В.Ф. и др. Среда для разбавления и замораживания семени сельскохозяйственных животных// Авторское свидетельство * II38I49. М., 1985. Бол. * 5.

7. Наук В.А., Гуськов A.M. Среда для разбавления и замораживания спермы 'хряков// Авторское свидетельство * II434I3. М., 1985. Вол. в 9.

8. Гуськов А.М, Физико-химическое состояние липидов и адаптация гамет самцов сельскохозяйственных животных к низким температурам// Научные основы адаптивной системы ведения животноводства. Киаинев:Штиинца, 1985. С. 23-24.

9. Наук В.А., Гуськов A.M. Криогенные изменения липидов и морфо-функциональных показателей гамет самцов сельскохозяйственных животных// Известия АН МССР: Сер. биол. и хим. наук. 1968. Л I. С. 35-38.

ч

10. .Гуськов A.M., Диитренно Н.Г.,-Букарчук М.Г, Дишды ллазштяческой мембраны и функциональная полноценность гамет быка про криоконсервациа// Известия AB МССР: Сер.биол. н .хим. наук. 1988..* 6. С. 46-49.

11. гуськов A.M., Дкитренко Н.Г., Букарчук М.Г. Особенности криогенных изменений липидов плазматических мембран и функционального состояния гамет быка н хряка// Доклады ВАСХНИЛ. 1989. * 2. С. 26-28.

12. Наук В.А., Борончук Г .В., Гуськов A.M. и др. Проблемы и перспективы консервации генома сельскохозяйственных животных// Сельскохозяйственная.биология. 1989. А 2. С,25-32.

13. Гуськов A.M., Наук В.А., Еукарчук М.Г. н др. Антиокио-лительная активность липидов и функциональная полноценность гамет самцов сельскохозяйственных животных при криоконсервации// Биоантиоксидаят. М., 1989. С. 215-216.

14. Гуськов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Среда для криоконсервации семени барана// Авторское свидетельство Jf'1498489. М., 1989. Бил. #.29.

15. Гусысов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. н др. Кряоза-¡цитная среда// Авторское свидетельство * I5408I7. М. ,1990. Бюл. К 5.

16. Гуськов A.M. , Пуэнна Г .И., Секргй W.H. Фиаиолого-биохимические н технологические аспекты воспроизведения сельскохозяйственных животных// Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1990. Ч. И. С. I0-II.

17. I^CbKOB A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Лнпцды микроорганизмов при криоконсервации гамет самцов сельскохозяйственных животных// Микроорганизмы в кормопроизводстве. Кишинев:Штиинца, 1990. С. II9-I26.

18. Гуськов A.M. Разработка технологии осеменения овец// Зоотехния. 1991. * 4. С. 53-67.

19. Гуськов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Среда для криоконсервации гамет// Авторское свидетельство

* 1634268. М., 1991. Бюл. Л 10.

20. Гуськов А., Пузына Г. Влияние антиоксядантов на воспроизводительную функцию коров// Молочное и мяоное скотоводство. 1991. JS 5. С. 23-24.

21. Гуськов А.К. Адаптивная технология воспроизведения овец// Рекомендации по технологии производства продукции овцеводства в Республике Молдова. Кипшн9в:Ноддагроинформ-решима, 1392. С. 63-72.

22. Гуськов A.M. Некоторые механизмы криогенных повреждений, протекции, стресса и адаптации гамет к низким температурам// Биотехнологические аспекты развития животноводства. Кишинев:Агроиаформреклама, 1992. С. 84-87.

. 23. Гуськов A.M., Дарий Г.Е., Пузана Г .И. и др. Повышение воспроизводительной функции высокопродуктивных коров стабилизаторами эндогенных гормонов и витаминов// Вопросы теории и практики животноводства Молдовы. Кишинев: Атроивформреклама, 1992..С. 82-83.

21* Гуськов A.M. Криопротекторный эффект мексидола и его практическое значение// Бюллетень Всесоюзного научного центра по. безопасности биологически активных веществ. М., 1992. С. 46.

25.. Гуськов A.M., Дарий Г.Б., Казакова Ю.М., Еукарчук 1.Г. Адаптивная технология получения, криодонсэрвапии_и использования семени барана. Рекомендации (русск. ,рум.). Кишинев: Молдагроннформрвклама, 1992. 32 с.

Заказ I32y. Timas; 160 экз. Типография Шшстанкопроыа.