Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование метода глубокого замораживания семени быка с использованием комплексонатов, аминокислот и витаминов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование метода глубокого замораживания семени быка с использованием комплексонатов, аминокислот и витаминов"

На правах рукописи

ПАНЫПИН Сергей Сергеевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ГЛУБОКОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ БЫКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСОНАТОВ, АМИНОКИСЛОТ И ВИТАМИНОВ.

03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дуброввды, Московская область, 2003

Работа выполнена в отделе биологии воспроизведения и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Николай Захарович Жильцов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Юрий Дмитриевич Клинский кандидат биологических наук Николай Петрович Зыкунов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Защита диссертации состоится « » 2003 года, в 10 часов, на

заседании диссертационного совета Д 0&6.013.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубро-вицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа.

Автореферат разослан « 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических

В.П Губанова

Уву/Г

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Уже в течение нескольких десятков лет в мире успешно применяют замороженную сперму быков, а в развитых странах замороженной спермой осеменяют до 100 % поголовья коров и тёлок. Замораживание семени дает ощутимые экономические выгоды, существенно снижает транспортные расходы при перевозке криоконсервированного материала. В скотоводстве проблему криоконсер-вирования спермы можно считать вполне решённой, однако, технология замораживания непрерывно совершенствуется, определяя для исследователей новые вопросы и задачи.

Важным элементом технологии является криозащитная среда для разбавления, замораживания и оттаивания спермы. В последнее время возникла необходимость заняться усовершенствованием синтетических сред для замораживания семени быка в соломинках и гранулах с использованием новых веществ, которые бы обеспечили большую биологическую полноценность оттаянных живчиков, лучше сохраняли акросомальный чехлик и тем самым повышали оплодотворяющую способность заморожено-оттаянного семени.

С этой целью в синтетические среды, используемые для сохранения семени вне организма, нами предложено введение некоторых металлов в виде комплек-сонатов с ЭДТА, с целью стабилизации в разбавленном семени физиологического баланса катионов, снижения нуклеазной активности желтка, а так же стабилизации мембран спермиев, которую могут оказывать эти металлы. Известно, что как криопротекторы и защитники обменных процессов в живчиках при глубоком замораживании семени быка, могут с успехом использоваться такие вещества как холин-хлорид и бетаин.

Основу всех жизненных процессов спермы составляют белки, которые вступают в комплексы с другими соединениями (Милованов В.К. 1962). Отсюда, большой интерес представляет изучение аминокислот, как веществ, обладающих вполне эффективными криозащитными свойствами, и способных включаться в белки сперматозоидов.

Применяемые в нашей среде защитные вещества, могут оказывать на выживаемость живчиков в процессе замораживания-оттаивания не только положительное влияние присущее им как отдельным компонентам, но, имея тесную химическую друг с другом связь, производить совместный защитный эффект.

Цель и задачи исследований.

Целью наших исследований являлось дальнейшее совершенствование технологии глубокого замораживания семени быка и повышение результативности осеменения коров и тёлок замороженным семенем. Для достижения поставленных целей решали следующие задачи:

- Разработать новую сингстическую среду для замораживания семени быка, которая обеспечивала бы снижение нуклеазной активности в семени перед замораживанием, повышение бстгчтпт-ичпщгпй уттлуу^нигуп» ■ДГ"Т?ТТПК'Т и их

оплодотворяющий способности на 10 %. | РОС. НАЦИОНАЛЬНА*

вибдиотбка СПстфДО Чп/Л

о» тз^Л

- Провести сравнение режимов эквилибрации (охлаждение разбавленного семени до 0° С) начиная с 1 часа и до 3-4 часов.

- Определить нуклеазную активность в разбавленном и оттаянном семени, определить абсолютный показатель живучести живчиков после оттаивания в новых и контрольных средах.

- Провести исследования проверки результативности искусственного осеменения коров семенем замороженным в новой и контрольной средах.

Научная новизна исследований заключается в том, что впервые была разработай среда для глубокого замораживания семени быков снижающая нуклеазную активность желтка куриного яйца. Впервые при замораживании семени быков применили такие вещества как холин-хлорид, бетаин, метионин и лизин.

Практическая ценность работы. Предложена среда для сохранения семени быков в глубокозамороженном состоянии, снижающая ферментативную активность желтка, сохраняющая акросомальный чехлик, способствующая лучшей подвижности и оплодотворяющей способности семени быков. Основные положения, выносимые на защиту: - среда для хранения семени быка при температуре -196°С ;

- экспериментальные данные по проверке результативности осеменения коров живчиками, замороженными в новой комплексонатной среде.

Апробация работы. Материалы проведённых исследований были доложены, обсуждены и получили положительную оценку:

На ежегодных конференциях аспирантов и молодых ученых «Достижения молодых учёных» (2001, 2002 гг. ВИЖ);

На ежегодных международных научно-практических конференциях «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2001,2002гг., ФГОУ РАМЖ);

На научной конференции отдела биологии воспроизведения ВИЖа (5 августа 2003г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы. Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста формата А4, содержит 22 таблицы 1 рисунок, 2 схемы и 3 графика. Список литературы включает 259 источников, в том числе 239 отечественных и 20 иностранных.

2. Материал и методы исследований.

Объектом исследования служило семя быков-производителей черно-пёстрой, айширской и голпггинской пород принадлежащих ЦСИО. Семя брали с помощью искусственной вагины. Каждый эякулят оценивали по объему, подвижности и концентрации живчиков.

Для лабораторных исследований использовали так называемый расщеплённый эякулят, (то есть для всех вариантов семя брали из одного и того же эякулята) с

- -Ник* ■ 4

"* 'Ч t

подвижностью живчиков не ниже 8 баллов и концентрацией не меньше

0.7.лрд./мл.

Степень разбавления семени быков рассчитывали так, чтобы перед замораживанием в каждой дозе было не менее 20 миллионов живчиков с прямолинейным поступательным движением. Замораживание семени проводили по общепринятым методикам - на сухом льду в гранулах, либо в парах жидкого азота в соломинках по 0,25 мл.

Замороженное семя, как в соломинках, так и в гранулах отшивали в водяной бане, при температуре 40° С. Для оттаивания гранул использовали 2,9 % - ный раствор лимоннокислого натрия.

Для разбавления использовали две среды. В качестве контрольной, была взята ЛЦГЖ (лакгозо-циграт-глицерино-желточная среда), применяемая в последние 10 лет в большинстве племпредприятий страны, в том числе и на ЦСИО. Второй средой служила предложенная нами комплексонатная среда. Используемые в опытах комплексонаты кальция, меди и цинка были синтезированы во Всероссийском институте химических реактивов и особо чистых веществ (ИРЕА). Аминокислоты лизин, метионин и бетаин, а также холин-хлорид были получены от компаний Хоффман Ля Рош, Рон Пуленк и Дегусса.

Для определения ценности компонентов и их сочетания в новой синтетической среде, а также условий технологической обработки семени быков при низкотемпературном его замораживании и оттаивании нами были изучены:

1. Оптимальные сочетания и соотношения исследуемых компонентов (ком-плексонатов металлов, аминокислот и витаминов) при разработке опытной синтетической среды для разбавления и сохранения семени быков при температуре минус 196° С.

2. Сохранность акросомального чехлика в опытной и контрольной средах, а также нуклеазной активности семени, сред, желтка.

3. Сравнительное испытание синтетических сред для разбавления и замораживания семени в соломинках и гранулах.

4. Эффективность различной продолжительности периода эквшшбрации семени при+4° С.

5. Подвижность живчиков на разных стадиях технологической обработки семени.

6. Абсолютный показатель живучести живчиков и длительность жизни в часах при 37° С.

Научно-производственные опыты по изучению эффективности разработанной нами синтетической среды для разбавления и замораживания семени быков-производителей в соломинках и гранулах в сравнении с опытной средой, в настоящее время используемой для этих целей, проводили в хозяйствах Подольского района и Тульской области.

Определение оптимального состава синтетической среды для разбавления и замораживания семени быков в соломинках и гранулах.

Для разработки оптимальной синтетической среды используемой для разбавления и замораживания семени быков в соломинках и гранулах нами были получены изотонические растворы комплексонатов меди, цинка и кальция, а также аминокислот лизина, метионина, витамина холин-хлорида и бетаина. Бы-

ло изучено влияние изотонических растворов этих веществ на переживаемость живчиков при температуре +37° С.

Изотонические концентрации новых компонентов сред устанавливали криоско-пическим (расчётным) методом с последующим уточнением биологическим методом, по подвижности и выживаемости живчиков при инкубации вне организма. При составлении новых разбавляющих сред нельзя допускать изменения осмотического давления в сперме. Для расчётов изотоничносш растворов опытных веществ, мы руководствовались правилом Ватн-Гоффа и Рауля.

Для более точного определения оптимальной концентрации спермы быка мы проверяли вычисленные концентрации биологическим методом. Для определения оптимального состава среды вами была изучена живучесть живчиков после замораживания-оттаивания семени методом треугольных систем по В. Милованову (1962) при величине интервалов в 20 % и в 10 % при всех соотношениях трёх компонентов (66 вариантов). Данный метод применялся для определения оптимального состава комплексонатов и аминокислот. Таким же образом мы поступали, определяя наилучшее соотношение растворов аминокислот. Оптимальную объёмную долю холин-хлорида определяли, добавляя разные объёмы его к комплексонатно-аминокислотному рецепту.

Определение сохранности акросомального чехлика в опытной и контрольной средах, а также активности нуклеаз семени, сред, желтка.

Важным условием достижения высокого процента оплодотворения, является наличие у наибольшего числа спермиев неповреждённого в результате замораживания-оттаивания акросомного аппарата, так как содержащиеся в нем ферменты гиалуронидаза и акрозин играют важную роль в обеспечении продвижения спермия к прозрачной оболочке яйцеклетки и её разжижения. Поэтому среда в большей степени сохраняющая данную структуру должна обладать и лучшей оплодотворяемостью. Сохранность акросом мы определяли акроскопиче-ским методом разработанным НИ. Соколовской и др. (экспресс метод определения оплодотворяющей способности живчиков).

Нуклеазную активность семени, сред, желтка определяли по степени деградации контрольного образца ДНК (по длине в процентах). В качестве субстрата использовали ДНК фага X. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК проводили по методике описанной Кузнецовой И.В. (Кузнецова И.В., Кузнецов A.B. и др., 1993). Определение активности других ферментов проводили: про-теолитическая активность - по методу Аксона; активность пероксидазы определяли по методу П.В. Симакова; амилазная активность определялась по методу Вольгемута; активность каталазы исследовали но методу Баха и Зубковой, по методу Мегга определяли активность липазы. Опыты проведены при совместном участии сотрудника биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных A.B. Чичилова.

Изучение влияния времени охлаждения семени на качество живчиков после замораживания-оттаивания и их оплодотворяющую способность.

Целью данных исследований служило определение оптимального времени выдержки семени при плюс 2 - 4° С (времени эквилибрации)

б

После разбавления семя расфасовывали в соломинки и разделяли на следующие группы:

1 группа - семя разбавляли комплексонатной средой, содержащей глицерин, и охлаждали 1 час при температуре + 4° С.

2 группа - аналогично первой, но охлаждали семя 2 часа;

3 группа - аналогично первой, но охлаждали семя 3 часа;

4 группа - аналогично первой, но охлаждали семя 4 часа;

5 группа - аналогично первой, но охлаждали семя 5 часов;

6 группа - аналогично первой, но охлаждали семя б часов;

7 группа - контроль. Для контроля служило семя, разбавленное лактозо-желгочной средой, содержащей глицерин. Перед замораживанием его выдерживали в холодильники при + 4° С в течение 4 часов.

Научно-производственный опыт по осеменению животных.

По окончании лабораторных опытов, в которых были выяснены условия, необходимые для замораживания семени быков в разработанной нами синтетической среде, был поставлен научно-производственный опыт в хозяйствах Плавского района Тульской области и Подольского района Московской области.

Для осеменения использовали семя после оттаивания с оценкой не ниже 4 баллов. Коров в подопытные и контрольные группы подбирали по принципу аналогов.

Опыт проводили по следующей схеме:

1. Груши - обычное разбавление ЛГЦЖ (лактозо-цшрат-глицерипо-желгочная) средой. Охлаждали 4 часа и замораживали в форме гранул (контроль).

2. Группа - для разбавления применяли комплексонатную среду. Семя также охлаждали 4 часа и замораживали в форме гранул (опыт).

3. Группа - то же, что и группа №1, только семя замораживали п соломинках (контроль).

4. Группа - аналогично группе №2, но семя замораживали в соломинках (опыт). Ежедневно осеменяли коров ректоцервикальным способом, контрольным и подопытным семенем. Опыт по осеменению животных проводили по следующей схеме:________

Наименование Число осеме- Из них по- Стельных Процент

груш опыта ненных жи- вторили охо- через 60-90 стельных

вотных ту дней

Результаты осеменения учитывали по:

1. Проценту коров не повторивших охоту после первого осеменения;

2. Итогам ректального исследования спустя 60-90 дней после первого осеменения.

3. Результаты собственных исследований. 3.1.

замораживания семени быков в соломинках и гранулах.

Положительное влияние отдельных комплексонатов металлов в составе синтетических сред для замораживания семени быка было установлено еще в 1982 году в исследованиях В.К. Милованова и Л.С. Жильцовой. Среда, сконструированная ими на базе комплексонатов кальция, меди и цинка дала в опыте повышение оплодотворяемости коров по сравнению с лактозной средой. Вместе с тем, продолжения и широкого производственного испытания эти исследования не получили. Первоначально мы установили изотоническую концентрацию всех комплексонатов металлов для семени быка криоскопическим (расчетным) и биологическим методами.

Полученные данные по определению живучести семени быка в изотоничных растворах комплексонатов кальция, цинка и меди при 37° С по средним данным 5 опытов представлены в таблице 1

Таблица 1

Живучесть семени быка в изотоничных растворах комплексонатов при 37° С

(п = 5)

Комплексонаты Изотоническая концентрация (%) Живучесть в часах. Абсолютный показатель живучести.

Кальция 3,9 5,0±0,5 2,12±0,2

Цинка 4,0 5,2±0,7 2,48±0,2

Меди 4,1 4,0±0,5 2,1±0,2

Лактоза (контроль) 11,5 5,0±0,5 2,52±0,3

Данные таблицы 1 показывают, что наивысшей живучестью обладает семя быка в растворе комплексоната цинка - 5,2; в контроле -5,0. Абсолютный показатель живучести в комплексонате цинка был 2,48, то есть несколько выше, чем в растворе комплексоната меди, но немного ниже данного показателя в лактозе.

Далее мы установили влияние различных концентраций комплексонатов цинка, кальция и меди на подвижность и живучесть живчиков быка после замораживания и оттаивания. Семя замораживали в соломинках, абсолютный показатель живучести определяли при температуре +37° С. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние на подвижность и живучесть сперматозоидов быка после замораживания и оттаивания растворов комплексонатов разной концентрации.

(п=5)

Концентрация растворов (%) Подвижность сперматозоидов в среде (баллы) Абсолютный показатель живучести в среде

гпЭДТА Са ЭДТА Си ЭДТА гпЭДТА Са ЭДТА Си ЭДТА

3,7 2,0 2,0 2,0 3,1 ±0,1 1,5 ±0,4 0,8 ±0,2

3,9 3,0 2,0 2,0 3,3 ±0,3 1,8 ±0,2 1,0 ±0,3

4,1 3,0 3,0 2,0 3,6 ±0,2 2,3 ±0,1 1,3 ±0,3

4,3 3,0 3,0 2,0 3,7 ±0,1 2,9 ±0,2 1,8 ±0,2

4,5 4,0 3,0 3,0 4,3 ±0,3 3,7 ±0,2 2,1 ± 0,2

4,7 4,0 3,0 3,0 4,8 ±0,3 3,9 ±0,1 2,6 ± 0,1

4,9 5,0 4,0 4,0 6,2 ± 0,2 4,0 ±0,3 3,1 ± 0,3

5,1 5,0 4,0 4,0 6,3 ±0,3 4,4 ±0,3 4,4 ±0,3

5,3 4,0 4,0 4,0 5,2 ±0,1 4,7 ±0,2 3,7 ±0,2

5,5 3,0 5,0 3,0 3,9 ±0,2 6,7 ±0,4 2,4 ±0,4

5,7 3,0 4,0 3,0 3,5 ± 0,2 5,0 ±0,3 1,7 ±0,1

5,9 2,0 3,0 2,0 3,4 ±0,4 4,2 ±0,3 1,5 ±0,4

Из данных таблицы 2 видно, что подвижность и живучесть семени после глубокого замораживания в растворах комплексонатов цинка, меди и кальция, близких по концентрации к расчётной изотонии, несколько изменились под влиянием введения глицерина. Сперматозоиды посж оттаивания обладали лучшей подвижностью и живучестью в 5,0 % -ном растворе комплексопата цинка, 5,1 % -ном растворе комплексоната меди и 5,5 % -ном растворе комлек-соната кальция.

Для дальнейшего определения состава среды, с учетом получепного влияния на изотонию глицерина, нами была изучена возможность оптимального сочетания трёх компонентов (цинка, кальция и меди ЭДТА) в средах для замораживания.

При разбавлении семени, предварительно оценённого по активности и концентрации, мы использовали растворы вышеуказанных комплексонатов при всех возможных их сочетаниях и соотношениях через 10 % по методу треугольных систем (по Милованову В.К., 1962). Результаты исследования показаны в графике 1.

Из данных полученных при использовании метода треугольника с интервалом 10 % (график 1) видно, что наилучшие условия для жизни живчиков (по сохранению ими подвижности и продолжительности выживания при +37° С), обеспечивает раствор, находящийся в 39 варианте, со следующим соотношением изотонических концентраций комплексонатов:

- ЭДТА Са-20%

- ЭДТА Си-20%

- ЭДТА Ъа - 60 %

График треугольной диаграммы для комплексонатов металлов СаЭДТА, гпЭДТА, и СиЭДТА с интервалом 10 %.

СаЭДТА

График № 1. Треугольная диаграмма для изучения состава среды, ва >3,5

ва >3,0 рЩЩЩ Ба >2,5 [х^ГГГГГ Ба < 2,5

ю

На основании этих данных, в лабораторных опытах нами были получены оптимальные сочетания трёх комплексонатов в среде для замораживания семени быка. Пересчитав объёмные соотношения на весовые, мы получили следующий вариант комплексонатной синтетической среды для разбавления семени быков (на один литр дистиллированной воды):

- ЭДТА Са— 11,8 г

- ЭДТА Си - 11 г

- ЭДТА гп-30 г

Результаты наших исследований совершенно совпадают с результатами опытов, полученными Жильцовой Л.С. и др. в период с 1982-1987 годы и проверенными по результатам осеменения коров спермой замороженной при таком сочетании комплексонатов.

Последующие наши усилия были направлены на добавление к комплексонатной основе аминокислот (лизина, метионина и бетаина), а также витамина В4 - холин-хлорида. С использованием криоскопического метода и последующим уточнением с применением биологического метода были определены изотонические концентрации искомых аминокислот предлагаемых при конструировании новой среды. В результате для искомых аминокислот мы получили следующие изотонические растворы: изотонический раствор лизина - 4,86 %; метионина - 3,9 %; бетаина - 4,4 %; и холин-хлорида - 3,56 %.

Методом встречных рядов мы попытались ввести в состав комплексонатной синтетической среды новые биологически активные вещества - аминокислоты: лизин, метионин, бетаин и витамин В4 - холин-хлорид. Примеры введения этих веществ, приведены в таблицах № 3 - 6. При разбавлении семени для замораживания к опытной среде добавляли по 20 мл желтка и 10 мл глицерина. Семя замораживали в соломинках.

Таблица 3

Биологический уровень лизина в среде для замораживания семени быка (изотонический раствор лизина 4,86 %). (п= 12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Среда с комплек-сонатами % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р. лизина 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100

Подвижность све-жеразбавленного семени, % 80 80 80 70 70 60 50 40 40 40 40 80

Подвижность после оттаивания, % 50 55 55 45 40 35 30 15 10 10 10 50

Живучесть свеже-разбавленного(час) 18 21 20 9 10 6 5 2 1 1 1 15

Живучесть оттаянного при 37°С,(час) 8 11 10 7 6 3 2 1 0 0 0 6

и

Таблица 4

Биологический уровень метионина в среде для замораживания семени (изотонический раствор метионина 3,9 %)

(п=12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Среда с комплек-сонатами % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р. метионина 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 100

Подвижность све-жеразбавленного семени, % 80 80 80 70 70 60 50 50 50 50 50 80

Подвижность после оттаивания, % 50 55 55 45 40 40 40 30 20 15 10 50

Живучесть свеже-разбавленного (час) 18 23 22 16 15 8 5 3 1 1 1 15

Живучесть оттаянного при 37° С, (час) 8 11 10 7 6 4 2 1 0 0 0 6

Из данных таблицы 3 видно, что лучшей подвижностью и живучестью обладают живчики, если в растворе сочетаются 90 % комплексонатов и 10 % лизина. Были также проведены исследования по более точному биологическому уровню с интервалом 5 %. В результате проведённых исследований методом биологического контроля, нами был определён уровень лизина в средах для замораживания семени быка, который равен 10 % от изотонии.

Данные таблицы 4 свидетельствуют, что сочетание 10 % метионина и 90 % комплексонатов наиболее благоприятно сказывается на жизнеспособности спермиев, а это значит, что биологический уровень метионина в средах для замораживания семени быка равен 10 % от 3,9 % изотонического раствора.

При определении биологического уровня для бетаина лучшие результаты были получены с применением более точного исследования с интервалом в 5 %, о чём свидетельствует таблица 5. Отсюда следует, что 5 % от 4,4 % изотонического раствора бетаина является его биологическим уровнем в средах для замораживания семени быка.

Таблица 6 показывает, что биологический уровень холин-хлорида в средах для замораживания семени быка равен 1 %.

Таблица 5

Биологический уровень бетаина в среде для замораживания семени (изотонический раствор бетаина 4,4 %)

(п=12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Среда с комплек-сонатами % 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р. бетаина 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 100

Подвижность све-жеразбавленного семени, % 80 80 75 75 70 65 60 60 60 55 55 80

Подвижность после оттаивания, % 50 55 55 50 50 40 40 35 35 35 30 50

Живучесть свеже-разбавлснного (час) 18 23 22 16 15 12 11 9 8 7 6 15

Живучесть оттаянного при 37° С, (час) 8 9 8 7 6 5 4 4 3 3 2 6

Таблица 6

Биологический уровень холин-хлорида в среде для замораживания семени (изотонический раствор холин-хлорида 3,56 %) (п=12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Среда с комплек-сонатами % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р, холин хлорида 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100

Подвижность све-жеразбавленного семени, % 80 80 80 70 70 55 40 35 30 20 20 80

Подвижность после оттаивания, % 50 55 50 50 50 35 20 15 10 10 ЕП 50

Живучесть свеже-разбавленного (час) 18 21 20 12 10 5 4 4 1 1 1 15

Живучесть оттаянного при 37° С, (час) 8 12 11 6 5 3 2 1 0 0 0 6

Дальнейшее совершенствование новой синтетической среды проводилось посредством введения в состав новых компонентов. Установление биологического уровня исследуемых аминокислот проводилось методом треугольника по Милованову В.К.. Целью применения данного метода являлось определение оптимального соотношения изотонических растворов аминокислот, необходимых для прибавления к комплексонатной основе. Расчётными явились изотонические растворы для: лизина - 4,8 % (А), метионина - 3,9 % (В), бетаина - 4,4 %(С).

Был проведён 21 опыт определения живучести в смесях по методу треугольника с интервалом 20 % изотонических растворов указанных выше аминокислот. Результаты исследования эффективности разных сочетаний искомых аминокислот, показаны в графике 2.

На основании данных, полученных, из графика 2 установлено, что смеси изотонических растворов - А (лизина), В (метионина) и С (бетаина) по восстановлению подвижности и выживаемости живчиков при 37° С, после замораживания-оттаивания, являются наиболее благоприятными для живчиков быка в 12-й и 17-й пробирках (таблица 7).

Таблица 7

Соотношение растворов А, В и С в пробирках с оптимальной живучестью.

(п=20)

Номер пробирки А В С

12 20 60 20

17 0 80 20

Из данной таблицы следует, что после разбавления семени быка средой, состоящей из лизина, метионина и бетаина при указанных соотношениях, подвижность живчиков сохраняется в пределах 50 %, в остальных же 19 сочетаниях семя гибнет немедленно после разбавления.

Если считать пробирки № 12 и № 17 синтетическими средами, то их состав представлен в таблице № 8.

Таблица 8

Состав сред из аминокислот на 100 мл. воды.

Ингредиенты № 12 (г) № 17 (г)

Лизин 0,96 -

Метионин 2,34 3,12

бетаин 0,88 0,88

График треугольной диаграммы для аминокислот лизина, метионина и бетаина с интервалом 20 %.

Лизин

ш

Метионин

График № 2. Зоны биологических уровней для аминокислот лизина, метионина и бетаина по треугольнику с интервалом 20 %.

100 % - лизина

100 % - бетаина

100 % - метионина -

ш

л/КУууу;

На основании выявленных зон биологического уровня на треугольнике с 20 % - ным интервалом, мы определили живучесть семени по схеме треугольника с интервалом 10 % (график № 3 и таблица № 9).

Таблица 9

Соотношение растворов А, В и С в пробирках с интервалом 10 % и подвижность живчиков после разбавления.__(п=12)_

№ пробирки А В С Активность

37 20 80 0 Н

38 20 70 10 Н

46 10 90 0 Н

47 10 80 10 Н

48 10 70 20 Н

49 10 60 30 Н

50 10 50 40 Н

57 0 10 90 Н

58 0 90 10 Н

59 0 70 30 Н

60 0 60 40 Н

61 0 50 50 Н

Как видно из данных таблицы, подвижность отсутствует во всех имеющихся соотношениях аминокислот, а это, по всей видимости, означает, что биологические уровни изотонических растворов исследуемых аминокислот лежат в пределах от 0 до 10 %.

На основании данных полученных из предыдущей таблицы, нами были предприняты попытки, смоделировать синтетическую среду путём добавления изотонических растворов аминокислот к уже имеющейся комплексонатной основе (среда Жильцовой Л.С.), за счёт снижения изотоничности данной среды. Было проведено 5 опытов, подвижность неразбавленного семени — 8,0; семя замораживали в соломинках. Результаты опытов представлены в таблице 10.

Таблица 10

Соотношение уровня изотоничности комплексонатной среды с вариациями изотонических растворов А, В и С в пределах уровня от 10 % и ниже. (п=5)

№ Пробирки Уровень изотонич (% еского раствора Подвижность (баллы)

Комплек-сонатная среда лизин метио-нин Бетаин Разбавление Эквилиб-рация Оттаивание

1 80 3 10 7 6,2±0.1 5,1±0,1 2,0±0,1

2 80 2 10 8 6,2±0,1 5,1±0,1 2,3±0,2

3 90 2 4 4 6,2±0,1 5,1±0,1 2,5±0,1

4 90 1 5 4 6,2±0,1 5,1±0,1 2,4±0,2

5 100 0 0 0 7,8±0,2 7,3±0,3 4,9±0,1

График №3 треугольной диаграммы для аминокислот лизина, метионина и бетаина с интервалом 10 %.

Как видно из таблицы 10, ни в одном из вариантов среды с добавлением аминокислот не произошло улучшения выживаемости спермиев в процессе замораживания-оттаивания, по сравнению с контрольной комплексонатной средой. Эти данные свидетельствуют, что создание изотонии среды за счёт частичной замены комплексонатов приводит к негативным результатам по подвижности семени после оттаивания.

Исходя из отрицательных результатов, полученных в предыдущем эксперименте, в последующем мы попытались смоделировать синтетическую среду посредством объёмных введений незначительного количества исследуемых веществ. Для этого к определённым объёмам комплексонатной основы, мы присоединяли различные уровни изотонических растворов аминокислот - лизина, метионина и бетаина. Нами были исследованы 12 различных сочетаний аминокислот и комплексонатов. Результаты опыта показаны в таблице 11.

Как видно из данных таблицы 11, лучшей подвижностью и выживаемостью после процесса замораживания-оттаивания обладает семя в девятом варианте синтетической среды. После 6 часов инкубирования оттаянного семени при 37° С подвижные живчики (а=1,0) были в пробирке № 9 и № 4, где ссмя обладало единичной подвижностью (Еп). Это говорит о том, что соотношение данных уровней комплексонатов и аминокислот является наиболее эффективным для сохранения живчиков при воздействии низких температур. Проведённые исследования позволили нам смоделировать синтетическую (комплексо-натно - аминокислотную) среду, в состав которой были включены комплексо-наты металлов - цинка, меди, кальция, и аминокислоты - лизин, метионин, бетаин.

В состав новой среды был также включён, раствор витамина В4 - холин-хлорид. Для определения оптимальной объёмной доли данного витамина мы поступали следующим образом. К разработанному выше рецепту (комплексо-натно - аминокислотному) добавляли разные объёмные доли холин-хлорида, и определяли показатели качества оттаянного семени. За основу нами был взят биологический уровень холин-хлорида, определённый в таблице 6. Данные шести опытов показаны в таблице 12.

Таким образом, из проведённых исследований было выяснено, что наилучшее качество среды для замораживания семени быка получено, как видно из данных таблицы 12, при добавлении к комплексонатно - аминокислотному рецепту витамина В4 холин-хлорида в количестве 1 объёмного процента. При данном соотношении обеспечивается наиболее высокая подвижность, и выживаемость заморожено - оттаянного семени при 37° С в сравнении с другими количествами данного витамина.

Таблица 11

Живучесть семени быка при добавлении к комплсксонатной среде разных уровней изотонических растворов аминокислот лизина (А), метионина (В)

Объёмное соотношение в пробирках, мл Подвижность живчиков (баллы) после:

Разбавления Эквилибрации Оттаивания 2ч при 37° С

1 - 0,9К+0,1А 8,0 7,0 4,0 2,0

2 -0,9К+0,1В 8,0 7,0 4,0 2,0

3 -0,9К+0,1С 7,0 6,0 4,0 2,0

4 -0,85К+0,05А + 0,05В+0,05С 8,0 7,0 5,0 3,0

5 - 0,8К+0,1А +0,1С 8,0 7,0 4,0 2,0

6 - 0,8К+0,1В +0,1С 8,0 7,0 4,0 2,0

7 - 0,8К+0,1А -Ю,1В 8,0 7,0 4,0 2,0

8 - 0,8К+0,05А +0,05В+0,1С 8,0 7,0 4,5 2,5

9 - 0,8К+0,05А + 0,1В+0,05С 8,0 7,0 5,0 4,0

10-0,8К+0,1А +0,05В+0,05С 8,0 7,0 4,5 2,5

11 -0,7К+0,1А +0,1В-Ю,1С 7,0 6,0 4,0 Еп

12-1.0К 8,0 7,0 5,0 2,0

Примечание к таблице 1: «К» - сумма объемов изотонических концентраци

комплексонатов кальция, меди и цинка.

Таблица 12

Живучесть семени быка при добавлении к комплексонатно - аминокислотной среде разного количества раствора холин-хлорида.

(п=б)

Время инкубации оттаянного семени при 37° С Подвижность оттаянного семени в комплексонатно-аминокислотной среде с добавлением разного объёмного уровня холин-хлорида (баллы).

0% 0,5 % 1,0 % 1,5% 2,0 % 2,5 %

Разбавление 8,0 8,0 8,0 7,0 7,0 6,5

Эквилибрация 8,0 7,5 8,0 7,0 6,5 6,0

Оттаивание 4,0 4,0 5,0 3,5 3,0 2,5

1 час при 37°С 4,0 4,0 5,0 3,5 3,0 2,0

2 часа при 37ЧС 4,0 3,5 5,0 3,0 2,5 1,5

3 часа при ЪТС 3,0 3,0 4,5 2,5 2,0 1,0

4 часа при ЪГС 2,5 2,5 4,0 2,0 1,0 1,0

5 часов при 37°С 2,0 1,5 3,5 1,0 1,0 Еп

6 часов при 37°С 1,5 1,0 3,0 0,5 Еп Еп

Пересчитав объёмные соотношения, полученные нами в результате всех вышеприведённых исследованиях на весовые, мы смоделировали новую синтетическую среду для замораживания семени быка, которая выглядит следующим образом (на один лшр дистиллированной воды):

- Са ЭДТА - 11,8 (г)

- СпЭДТА-11 (г)

- 7л ЭДТА -30 (г)

- Лизин -1,2 (г)

- Метионин -1,95 (г)

- Бетаин - 2,2 (г)

- Холин-хлорида 10% р-р. -10 (мл)

- Глицерин -100 (мл)

- Желток куриных яиц — 200 (мл)

3.2. Определение сохранности акросомальпого чехлика в опытной и контрольной средах, а также нуклеазной активности семени сред, желтка.

Далее нами было проведено сравнительное испытание качественных характеристик новой среды для замораживания семени быка в опытах вне организма. Последующие серии опытов мы направили на определение такого важного момента у заморожснно-оттаянного семени, каким является целостность акросо-мального чехлика. От сохранности акросом зависит биологическая полноценность

20

живчиков, их оплодотворяющая способность. В результате, вполне закономерным является тот факт, что среда наилучшим образом сохраняющая акросому будет обладать и наилучшей фертильностью.

Соотношение живчиков с нормальной и разрушенной акросомой в повой синтетической среде и среде контрольной (в качестве контроля использовали лак-тозную среду) показано в таблице 13.

Таблица 13

Соотношение живчиков с нормальной и разрушенной акросомой в контрольной и опытной средах после замораживания - оттаивания. (п=10)

Среда Живые живчики Неподвижные живчики

Целая акросом (%) Разрушенная акросома (%) Целая акро сома (%) Разрушенная акросома (%)

Опыт 99,5 ± 0,3* 0,5 ±0,3 0,7 ±0,6 99,3 ±0,6

Контроль 97,3 ± 0,5 2,7 ±0,5 5,9 ±0,4 94,1 ± 0,4

1 Различия достоверны по сравнению с контролем Р < 0,01

Как видно из данных таблицы 13, опытная комплексонатная среда способствует лучшей сохранности акросомального чехлика. После замораживания в ней только 0,53 % подвижных живчиков имеют разрушенную акросому, тогда как в контрольной лактозной среде данный показатель равен 2,7 %. Только 0,7 % мёртвых сперматозоидов в комплексонатной среде имеют целую акросому, тогда как в лактозной этот показатель выше и равен 5,9 % соответственно. Данное преимущество опытной среды над контролем является вполне существенным плюсом, способствующим увеличению оплодотворяющей способности сперматозоидов.

В последнее время появились работы в которых указанно, что при глубоком замораживании может происходить трансформирование ДНК живчиков (В. Багиров, 1997; Т. Щит, 1998). Так же было замечено, что добавленный в среду для замораживания желток куриного яйца, способствует повышению активности нуклеаз (Н.З. Жильцов и др., 2001, 2002). Как показано на рисунке 1 в желтке куриного яйца (пробирка 3 и 4) уже в первую минуту инкубирования была зафиксирована высокая нуклеазная активность, тогда как в семенной плазме (пробирка 2) ДНК фага X расщеплялась через 1 час инкубации

Наибольший интерес в борьбе с нуклеазной активностью представляют работы с применением в стандартной и новой средах ингибиторов на основе ЭДТА. Проведенные исследования динамики активности ферментов в синтетических средах для замораживания семени быка с добавками лактозы, холин-хлорида, комплексонатов меди представлены в таблице 17.

Рис 1. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага X: дорожка 1 -ДНК фага Х\ дорожка 2 -гидролиз ДНК фага X в семенной плазме быка; дорожки 3 и 4 -гидролиз ДНК фага А. в желтке куриного яйца.

Как видно из рисунка № 1, желтке куриного яйца (пробирка и 4) уже в первую минуту инкубирования была зафиксирован высокая нукеазная активность, то гда как в семенной плазме (про бирка 2) ДНК фага X расщеплялась через I час инкубации

12 3 4

По данным, отображённым в таблице 17, которые мы получили на основании проведённых опытов, было установлено, что наименьшая степень нуклеаз-ной активности среды наблюдалась в случае добавок комдлексонатов меди и разных объёмов холин-хлорида.

Таблица 1

Нуклеазная активность стандартной среды для замораживания семени быка с

добавками:_______(п=5)

Ингредиенты Деградация контрольного образца ДН в%

Лактоза (стандарт) 94 ±1,6

Лактоза + холин 0,2 мл 64 ±3,0

Комплексонат меди 50 ±2,3

Комплексонат меди + холин 0,2 мл 3 ± 1,1

Комплексонат меди + холин 0,1 мл 20 ± 2,4

Выше проведенные исследования подтверждают, что используемые в новой синтетической среде компоненты способствуют снижению нуклеазной активности желтка куриного яйца, а, следовательно, и уменьшают степень деградации ДНК живчиков. Возможно, что это будет способствовать лучшей сохранности генетического материала спермиев, замороженных в новой комплексонатной среде.

3.3. Сравнительное испытание синтетических сред для разбавления и замораживания семени в соломинках и гранулах.

Мы провели сравнительное испытание качественных характеристик новой синтетической среды (комплексонатной) для замораживания семени быка в опытах вне организма. Результаты сравнительного испытания приводятся в таблице 18.

Таблица 18

Качественные показатели оттаянного семени быка, замороженного в новой (комплексонатной) синтетической среде в сравнении с показателями контроль-

ной лактозной среды.

__(п=Ш)

Способ замораживания Показатели качества семени:

Подвижность после разбавления (баллы) Подвижность после оттаивания (баллы) Подвижность после 5 часо инкубации при +37°С Максимальная выживаемость при +37°С Сохранность ак-росомв (%)

Опыт (комплексо-натная среда, Соломинки) 8,0 ±0,1 5,9 ± ОД1 2,6 ±0,1 10,5 ±0,3 88,3 ± 0,4

Опыт (комплексонатная среда, Гранулы) 8,0 ±0,1 5,7 ± 0,1х 2,3 ± 0,3 10,2 ± 0,2 88 ±0,2

Контроль (лактозна среда, Соломинки) 8,0 ±0,1 5,5 ±0,1 2,2*± 0,2 9,1 ±0,3 80,5 ±0,1

Контроль (лактозна среда, Гранулы) 8,0 ±0,1 5,4 ±0,1 2,0*± 0,3 8,9 ±0,3 80,5 ± 0,2

* Для оценки подвижности семени в контрольной среде пользовались 3 % раствором цитрата натрия. "Различия достоверны по сравнению с контролем Р < 0,05

Как мы видим из данных таблицы 18, качество новой (опытной) среды, по отдельным показателям сравнимо, а по некоторым превосходит показатели качества семени, замороженного в контрольной, лактозной среде. Например, по активности живчиков после оттаивания и особенно по скорости движения (большее число живчиков в дозе для осеменения с суперактивностью), а также по живучести оттаянного семени при температуре тела, которая в опытной среде больше на 1,4 часа, по сравнению с контролем. Лучшая сохранность акросомального чехли-ка живчиков после замораживания свидетельствует о более высоких протекторных свойствах комплексонатной среды.

Несомненно, что практические работники отдадут предпочтение той среде, которая будет универсальной, то есть пригодной для замораживания семени и в соломинках и в гранулах. Данные таблицы 18 показывают, что предложенная нами синтетическая среда для разбавления и замораживания семени быков-производителей вполне пригодна для замораживания семени и тем и другим способами.

3.4. Влияние различной продолжительности периода эквилибрации семени при +2 +4° С. на качество живчиков после замораживания-оттаивания. Чтобы лучше использовать дополнительные возможности, разработанной нами среды, было проведено исследование по определепию времени оптимального для охлаждения семени при температуре +2 - +4° С. Возможность улучшения качества заморожено-оттаянного семени за счёт уменьшения или наоборот увеличения периода эквилибрации была изучена посредством разбавления семени новой и контрольной средой и замораживания его (в соломинках), после 1; 2; 3; 4; 5; и 6 часов эквилибрации в холодильнике (таблица 19).

Таблица 19

Подвижность и переживаемость живчиков быка после замораживания семени в зависимости от времени предварительного охлаждения его при +2 - +4° С.

(п=15)

Время охлаждена семени при +2 +4° С, (час) Подвижность живчиков (баллы):

В свежеполу-ченном семен После охлаждения После оттаива ния После 5 часов при +37°С

1 8,0 ±0,1 7,3 ± 0,1 3,0 ±0,2 Еп

2 8,0 ±0,1 7,4 ±0,1 4,2 ±0,3 Еп

3 8,0 ±0,1 7,6 ±0,1 5,5 ±0,1 1,0

4 8,0 ±0,1 7,5 ±0,1 5,3 ±0,1 2,5

5 8,0 ±0,1 7,3 ±0,1 4,0 ±0,3 1,0

6 8,0 ±0,1 7,5 ±0,1 4,4 ±0,1 Еп

Контроль 8,0 ±0,1 7,5 ±0,1 4,9 ±0,1 2,0

После замораживания и оттаивания семени подвижность живчиков была выше во всех опытных группах по сравнению с контролем. Лучшие результаты по восстановлению подвижности были получены, когда семя выдерживали при температуре +2 - +4° С в течение 3 часов. Однако как показали дальнейшие исследования, после выдержки оттаянного семени в термостате при температуре +37° С, через 5 часов инкубации лучшая подвижность сохранялась только в опытных образцах, охлаждённых в течение 4 часов, а также в кошроле. Другие опытные образцы, уже после 2-х часов инкубации в термостате имели плохую или единичную подвижность. Из таблицы 19 можно сделать вывод, что для новой среды вполне подходящим временем охлаждения при температуре +2 - +4° С, при котором семя наиболее долго сохраняет подвижность, является период эквилибрации, используемый при замораживании семени в лактозной среде и равный 4 часа.

Научно-производственный опыт по осеменению коров Нами было проведено изучение оплодотворяющей способности семени быка, по осеменению коров, семенем, замороженным в предложенном варианте комплексонатно - аминокислотной синтетической среды и ЛЦГЖ (лактозо - цитрат - глицерина - желточной) среды. Опыт был поставлен на Еринской ферме совхоза «Знамя Подмосковья», Подольского района Московской области, опытном хозяйстве Всероссийского Научно - Исследовательского института животноводства (ОПХ «Клёново-Чегодаево»), и совхозе «им. К. Маркса», Плавского района Тульской области. При расфасовке семени предназначенного для осеменения

24

в совхозах «Знамя Подмосковья» и ОПХ «Клёново-Чегодаево», использовали соломинки, а для совхоза «им. К. Маркса» - гранулы. Результаты по осеменению коров представлены в таблицах 21 и 22.

Таблица 21

Результаты искусственного осеменения коров семенем, замороженным __в соломинках. _

Группа опыта Осеменено коров Стали стельными от первого осеменения Процент Стельности М±т

Комплекеонатная среда (опыт) 34 19 55,9 ± 7,6"

Лактозная среда (контроль) 70 28 40,0 ±5,8

* Различия близки к достоверной по сравнению с контрольной группой (Р < 0,05).

Таблица 22

Результаты искусственного осеменения коров семенем, замороженным в гранулах.

Группа опыта Осеменено Стали стельными от Процент

коров первого осеменения Стельности

М±т

Комплекеонатная среда

(опыт) 214 123 57,4 ±3,3"

Лактозная среда (кон-

троль) 184 87 47,3 ± 3,6

•Различия достоверны по сравнению с контролем (Р < 0,05).

Результаты искусственного осеменения коров, как видно из данных таблиц № 21 и № 22, выше, при использовании комплсксонатно - аминокислотной среды, по сравнению с применяемой для этих же целей лактозо - цитратно - глицерано -желточной среды (ЛЦГЖ). В среднем эти различия составили 15,9 % при использовании соломинок, и 10,1 % если для замораживания семени применяли гранулы. Однако данные, полученные при осеменении коров семенем, замороженным в соломинках можно признать только условно достоверными. Полученные данные доказывают универсальность новой среды и её пригодность для различных способов замораживания (как в гранулах, так и в соломинках).

Выводы.

1. Основу сред для разбавления и замораживания семени быка могут составлять комплексоиаты кальция, цинка, меди с этилендиаминтетрауксусной кислотой.

2. Добавление к комплексонатной основе таких аминокислот как лизин, ме-тионин и препарат бетаин, а также витамина В4 - холин-хлорида в определённых объёмных долях их изотонических растворов повышает протсктив-ные свойства среды, способствует лучшей сохранности замороженно-оттаянных сперматозоидов.

3. В средах для замораживания семени быка, включающих в своём составе желток куриного яйца, отмечается высокая нуклеазная активность, которая может быть заметно снижена включением в их состав комплексонатов и хо-лин-хлорида.

4. Разработанная нами синтетическая среда комплексонатно-аминокислотно-витамино-глицерино-желточная для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках и гранулах позволяет:

а) Улучшить подвижность, длительность жизни, сохранность акросомального чехлика живчиков после оттаивания, снизить активность нуклеаз желтка куриного яйца в сравнении с лактозо-цигратно-желточ но-глицериповой средой;

б) Повысить процент стельности у коров после первого осеменения на 10,1 % при замораживании в гранулах и на 15,5 % при замораживании в соломинках по сравнению с синтетической средой ЛЦГЖ (57,4 ± 3,3 и 47,3 ± 3,6, соответственно Р < 0,05, гранулы,).

Практические предложения.

С целью улучшения результативности искусственного осеменения коров и тёлок провести широкое производственное испытание разработанной нами синтетической среды (комплексонатной) для замораживания семени быков, как в соломинках, так и в гранулах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Паныпин С. С. Использование новых синтетических сред для замораживания семени быка./ Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» ФГОУ РАМЖ. - 2002. - Вып 8. - С. 70-71;

2. Паныпин С.С. Моделирование новой синтетической среды для замораживания семени быка./ Материалы научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» ФГОУ РАМЖ. - 2001.- Вьш.7,- С. 80-82;

3. Жильцов Н.З., Субботин А.Д., Голубь B.C., Чичилов A.B., Паныпин С.С. Усовершенствование технологии глубокого замораживания семени быка.// Наше племенное дело. - 2002. № 2. С. 10-12.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 3.11.2003. Подписано в печать 4.11.2003 Заказ №22. Печ. л. 1,1. Тираж 100 экз.

2оо з ;

"TsJfT

11837t

i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Паньшин, Сергей Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ. 1

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 3

1. Основные криоповреждения спермиев .3

2. Структурные и морфологические изменения живчиков в процессе охлаждения.8

3. Этилендиаминтетрауксусная кислота и её соли в средах для замораживания живчиков сельскохозяйственных животных .10

4. Аминокислоты лизин и метионин в среде для глубокого охлаждения семени .24

5. Роль бетаина и холин-хлорида при использовании в среде для сохранения семени быка в глубокозамороженном состоянии .29

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ . 36

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ . 48

1. Определение оптимальных сочетаний и соотношений компонентов при создании новой синтетической среды для разбавления и замораживания семени в гранулах и соломинках .48

2. Определение сохранности акросомального чехлика в опытной и контрольной средах, а также нуклеазной активности семени, сред, желтка .64

3. Сравнительное испытание синтетических сред для разбавления и замораживания семени в соломинках и гранулах .71

4. Влияние различной продолжительности периода эквилибрации семени при +2 +4° С, на качество живчиков после замораживания -оттаивания .73

5. Зависимость качества сред в связи со сроками и способами хранения реактивов в частности аминокислот, а также фирмой изготовителем .74

6. Научно-производственный опыт по осеменению коров.76

V. ОБСУЖДЕНИЕ .79

1. Выводы и практические предложения .95

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Паньшин, Сергей Сергеевич

Выводы.

1. Основу сред для разбавления и замораживания семени быка могут составлять комплексонаты кальция, цинка, меди с этилендиаминтетрауксусной кислотой.

2. Добавление к комплексонатной основе таких аминокислот как лизин, метионин и препарат бетаин, а также витамина В4 - холин-хлорида в определённых объёмных долях их изотонических растворов повышает протективные свойства среды, способствует лучшей сохранности замороженно-оттаянных сперматозоидов.

3. В средах для замораживания семени быка, включающих в своём составе желток куриного яйца, отмечается высокая нукпеазная активность, которая может быть заметно снижена включением в их состав комплексонатов и холин-хлорида.

4. Разработанная нами синтетическая среда комплексонатно-аминокислотно-витамино-глицерино-желточная для разбавления и замораживания семени быков-производителей в полимерных соломинках и гранулах позволяет: а) Улучшить подвижность, длительность жизни, сохранность акросомаль-ного чехпика живчиков после оттаивания, снизить активность нуклеаз желтка куриного яйца в сравнении с лактозо-цитратно-желточно-глицериновой средой; б) Повысить процент стельности у коров после первого осеменения на 10,1 % при замораживании в гранулах и на 15,5 % при замораживании в соломинках по сравнению с синтетической средой ЛЦГЖ (57,4 ± 3,3 и 47,3 ± 3,6, соответственно Р < 0,05, гранулы,).

Практические предложения.

С целью улучшения результативности искусственного осеменения коров и тёлок провести широкое производственное испытание разработанной нами синтетической среды (комплексонатной) для замораживания семени быков, как в соломинках, так и в гранулах.

В заключение выражаю сердечную благодарность моему научному руководителю Николаю Захаровичу Жильцову за большую помощь и поддержку, оказанную мне в выполнении и оформлении данной работы.

Ещё хотелось поблагодарить сотрудников отдела биологии воспроизведения и искусственного осеменения Виктора Сергеевича Голубя и Александра Даниловича Субботина за их большую помощь, оказанную в проведении лабораторных и научно - производственных опытов.

Часть работы выполнялась при участии сотрудника отдела биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВИЖа Алексея Валентиновича Чичилова, которому автор выражает благодарность за помощь в проведении исследований.

Автор выражает также признательность остальным сотрудникам отдела биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВИЖа за постоянный интерес к данной работе.

Автор выражает признательность директору Центральной станции искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Ескину Г.В., ведущему технологу станции Федоровой Е.В. и другим сотрудникам за помощь при проведении экспериментов.

Автор выражает большую благодарность директору СПК им. «К. Маркса» Корсакову А.Н. главному зоотехнику Феклисовой Т.А., ветеринарному врачу хозяйства Ворониной Т.В., технику осеменатору Попедовой Е.Н. за предоставленную мне возможность провести научно-производственный опыт и помощь при проведении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Паньшин, Сергей Сергеевич, Дубровицы, Мос. обл.

1. Абилов А.И., Вронская А.В. Акроскопический метод оценки оттаянного семени и критерий его оплодотворяющей способности. / Сб. науч. тр. ВИЖ. -1997. Вып. 58. - С. 64-65.

2. Акопян В.Б., Мирзоев Э.Б., Рыбакова А.А. Определение качества спермы методом ультразвуковой цитозимометрии. / Доклады ВАСХНИЛ. 1991. -№ 4. - С. 53-55.

3. Ал Ханак X., Йотова М. Влияние уровня общего белка в плазме спермы и разбавителей на биологические показатели сперматозоидов после крио-консервации. / Ветеринарный сборник. Болгария. -1989. С. 44-47.

4. Балашов Н.Т., Жильцов Н.З. и др. Сравнительное испытание сред для хранения охлаждённой спермы быков. // Ветеринария. 1969. - №10. - С. 8184.

5. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Гулевский А.К. Молекулярно-клеточная концепция криоповреждения клетки: роль трансмембранных дефектов. // Криобиология. 1987. - № 2. - С. 3 - 10.

6. Белоус A.M., Грищенко В.И., Паращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев: Наукова думка. -1986. 208 с.

7. Белоус A.M., Грищенко В.И., Паращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. / АН УССР. Институт проблем криобиологии и криомедицины, Киев: Наукова думка. -1986. 208 с.

8. Белоус В.П. К вопросу о сроках хранения глубокозамороженой спермы быков. / Биология воспроизведения и технология искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. М. -1986. С. 48-52.

9. Ю.Белькевич В.И., Ключаева З.С., Ромбе С.Т., Филаретова Н.В. О предохранении сперматозоидов быка от холодового удара. I Сб. научн. Тр. : Труды Всесоюзного института животноводства, т. XXXIII. -1959. С. 167 -172.

10. И.Бетляева Ф.Х., Зимин Г.Я. Биометрия, методические указания и рабочая тетрадь для студентов зооинженерного факультета. / Куйбышевский с/х институт. Кинель. - 1991. - 88 с.

11. Богач П.Г., Финагин Л.К., Мирошниченко З.А. Холестерин в плазматической мембране. / Биохимия животных и человека: Республиканский межведомственный сборник. Киев: Наукова думка. -1979. Вып. 3. - С. 39 - 47.

12. Борончук Г.В. Влияние амидов белков полигликолей и полисахаридов на функциональную полноценность гамет быков и баранов при замораживании: Автореф. дис. кан. биол. наук. Львов Украинский НИИФБ. 1982. -17 с.

13. Борончук Г.В. Применение новых криопротекторов при длительном хранении семени сельскохозяйственных животных при -196° С. / Совершенствование методов воспроизводства сельскохозяйственных животных. Кише-нёв: Штиинца. -1979,- С. 37-47.

14. Борончук Г.В. Эффективность использования различных криопротекторов при замораживании семени быка и барана. / Совершенствование методов воспроизводства сельскохозяйственных животных. Кишинёв: Штиинца.-1979,- С. 47-53.

15. Бугров А.Д. Повреждения спермиев при оттаивании и пути устранения. // Животноводство 1977. - №12. - С. 56-59.

16. Бугров А.Д., Скляров Л.Н. Метод размораживания и санации семени быков. И Зоотехния. 2000. - № 3 - С. 25-30.

17. Бугров А.Д., Шинкаренко Н.И. Влияние состава разбавителя и способа замораживания на качество спермы. / Тезисы докладов к научно-производственной конференции по теории и практике воспроизводства сельскохозяйственных животных. Харьков. -1972. - С. 68-71.

18. Бутанов Ф.А., Жильцова Л.С. Влияние комплексонатов ЭДТА и ионов серебра на рост бактериальных культур. / Профилактические и ветеринарные мероприятия в комплексах по промышленному производству продуктов животноводства. -1977. С. 18-19.

19. Варнавский А.Н. Влияние методов замораживания на подвижность и ультраструктуру живчиков быка и барана. // Животноводство. 1970. - № 9. С. 53 - 56.

20. Васильев Е.А. Клиническая биохимия сельскохозяйственных животных. М. - Россельхозиздат. -1982. - 253 с.

21. Вишневский В.И. Термодинамика выхода воды из спермиев при замораживании. / Научно-технический бюллетень НИИ животноводства Лесостепи и Полесья УССР. -1974,- №1. С. 14-21.

22. Вишневский В.И., Температурные остановки и выживаемость клеток при замораживании. / Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур. Киев: Наукова думка. 1977. - С.11 - 12.

23. Владимиров Ю. А., Оленев В.И., Суслова Т.Б., Потапенко А.Я. Механизм перекисного окисления липидов и его действие на биологические мембраны. // Итоги науки и техники / ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1975. - Т. 5. - С. 56-117.

24. Владимиров Ю.А. Роль изменений структуры мембран в клеточной патологии. / Труды 2-го Московского медицинского института. М. - 1977. - Т. 72. -Вып. 1. - 129с.

25. Волков А.С. Значение числа подвижных живчиков в дозе замороженного семени для результатов осеменения. / Сб. науч. работ ВИЖ. -Вып. 1. -Ч. 1. -1974. С. 33-35.

26. Волосевич А.П. Методика исследований разбавителей спермы сельскохозяйственных животных. / Методики исследований в животноводстве. Киев. -1965. - С. 220-224.

27. Воскресенский О Н., Максимович Я.Б. Холин и его биологическая роль. // Успехи современной биологии. М. -1967. - Т. 64.- Вып. 1(4). - С. 53-74.

28. Гейльбрун Л. Динамика живой протоплазмы. М. - 1957. - 173 с.

29. Георгиев Г., Цветкова Е., Монговска М., Петрова К. Исследование влияния ультранизких температур на клеточные белки в сперматозоидах быка и барана. // Симпозиум по теме: криоконсервация семени барана и хряка. 14-15.Х. 1982. -Варна; София. -1984.-64 с.

30. Голубь B.C., Жильцов Н.З. Глубокое замораживание семени быка в средах с комплексонатами металлов. / Материалы научно практической конференции: «Повышение конкурентной способности и задачи кадрового обеспечения». ФГОУ РАМЖ. -2001.- С. 75 76.

31. Голубь B.C., Жильцов Н.З., Шайдулин И.И., Гулин П.А. Технология криокон-сервации семени баранов. Дубровицы ВИЖ. -1997.- 23 с.

32. Голубь B.C., Субботин А.Д. Замораживание семени быка в сахарозо-комплексонатных средах. / Материалы научно-практической конференции: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». ФГОУ РАМЖ. 2002. - С. 72-73.

33. Грищенко В.Н., Паращук Ю.С., Дахно Ф.В. Криобиология и проблемы бесплодия. Киев: Наукова думка. 1990. - 119 с.

34. Грэхам Е.Ф. Криоконсервация и биохимическая оценка спермы быков и баранов. / Физиология воспроизведения сельскохозяйственных животных. Харьков. -1977. С. 25-51.

35. Гуськов A.M., Дарий Г.Е., Смирнов А.Д., и др. Использование антиоксидан-тов в качестве ингредиентов криозащитных сред. / Тезисы докладов IV Конференции «Биоантиоксидант». 1993. - Т. 1.- С. 19 - 24.

36. Данилова Л.В., Габер Е С. Транспорт и созревание сперматозоидов в половых путях самца и самки. / Сперматогенез и его регуляция. М. - Наука. -1983.-С. 65-97.

37. Дарий Г.Е. Новый объективный метод оценки семени быка. / Сб. науч. тр. -ВИЖ. 1997. - Вып. 58. - С. 11-12.

38. Дарий Г.Е. Действие неэлектролитов и электролитов на физиологическую полноценность семени быков при замораживании; Автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы. - 1977. - 23 с.

39. Деборин Г.А., Баранова В.З. Моделирование липидных и липопротеидных мембран // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. -1966. Т.2. -№ 2. - С. 90-95.

40. Делеу В.Г. Изменение аминокислотного состава гамет быков-производителей при низких и ультранизких температурах. / Тезисы докладов II съезда физиологов Молдавской ССР. Кишинёв. -1981. - С. 129-130.

41. Деряженцев В.И. Новая среда для замораживания спермы быка в соломинках при больших степенях разбавления. / Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения. М. -1989. - С. 38-42.

42. Евсюков М.Е. Сравнительное изучение и усовершенствование сред для хранения спермы быков. Автореф. дис. канд. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. Харьков. -1978. - 28 с.

43. Епишина Т.М. Изучение защитного действия антиоксидантов, эфиров, глицерина и комплексонатов металлов при замораживании спермы барана. Автореф. дис. канд. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. Харьков. -1996. - 19 с.

44. Ерохин А С. Физиологические аспекты криорезистентности спермы баранов и быков. Дисс. доктора биол. наук. Дубровицы. - ВИЖ. - 1994. - 314 с.

45. Ерохин А.С., Епишина Т.М. Замораживание спермы баранов в комплексо-натных средах. // Зоотехния. -1996,- № 1. С.26-27.

46. Ерохин А.С., Сейдахметов Б.С., и др. Изменение активности антиокиси-дантных ферментов в сперме баранов и быков при криообработке. // Доклады РАСХН. -1996. С. 30-32.

47. Жильцов Н.З., Белоножкин В.П., Ковалёв В.Ф., и др. Влияние кормления и содержания быков на их семяпродукцию. //Животноводство. 1977. - № 2. С. 55-57.

48. Жильцов Н.З., Субботин А.Д., Голубь B.C. Усовершенствование технологии глубокого замораживания семени быка. Киев. - 2001 - С. 10-17.

49. Жильцова Л.С., Голубь B.C., Ерохин А.С., Жильцов Н.З., и др. Влияние комплексонатов металлов на живучесть спермиев быка и барана и использование их в средах для замораживания спермы. -1987.- С. 99 -104.

50. Жильцова Л.С., Селиверстова И.А., Ларкин С.Н., Ерохин А.С. Замораживание спермы быка в средах с комплексонатами металлов. / Доклады Всесоюзной ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени академии с/х наук имени В.И. Ленина. 1985. - С. 33 - 34.

51. Жмурик Л.М. Морфологические изменения сперматозоидов под влиянием замораживания. / Физиологические и биохимические основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск. - Вып. 1. -1965. - С. 146-160.

52. Жолнин А.В. Комплексные соединения, конспект лекций по общей химии. / Челябинская медицинская академия. 2000.- 21 с.

53. Жуковская Н.В. Совершенствование методов криоконсервации и оценки качества спермы сельскохозяйственных животных. Автореф. дис. канд. биол. наук. ВНИИПлем Лесные поляны. - 1998. - 18 с.

54. Зверева Г.В., Чухрий Б.Н., Клевец, Л.А., Активность окислительных ферментов в разбавленной и сохраняемой сперме быков. / Доклады ВАСХНИЛ. 1980.-№10.-С. 26-28.

55. Зверева Г.В., Чухрий Б.Н., Клевец, Л.А. Взаимосвязь активности окислительных ферментов в сперме быков с физиологическими показателями спермиев. / Доклады ВАСХНИЛ. 1978. - № 4. - С. 24 - 26.

56. Зорин В.М. Усовершенствование способа консервирования спермы быков. Автореф. дис. канд. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. Харьков- 1974.-24 с.

57. Игнатенко О.И. Факторы повышающие способность спермиев быков и баранов переносить глубокое замораживание. Автореф. дис. канд. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. Харьков. - 1978. - 26с.

58. Ильинская Т.П. Глубокое замораживание спермы сельскохозяйственных животных. Минск. - Урожай. - 1972. - 143 с.

59. Калугин Ю.В. Изыскание новых защитных средств, предохраняющих сперму быков-производителей от повреждающего действия низких температур при её глубоком замораживании. Автореф. дис. канд. биол. наук. Харьков. 1970. -24 с.

60. Кармолиев Р.Х. Современные биохимические методы исследования в ветеринарии и зоотехнии. М. -Колос. - 1971,- 288 с.

61. Катков И.И. Связь между состоянием мембранного аппарата спермиев и их физиологическими показателями после замораживания. Автореф. дис. канд. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. Харьков. - 1985. - 25 с.

62. Кермулис А.А. Влияние яичного желтка и его компонентов на качество семени быка. / Бюллетень научно-технической информации Литовского института животноводства и ветеринарии. №1/6. - Каунас. -1960. - С. 23-29.

63. Кермулис А.А. Усовершенствование синтетической среды для семени быка. / Труды Литовского института животноводства и НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР Харьков. Харьков. - Т. 6. - Вильнюс. - 1963. - С. 136-177.

64. Клен Р. Заготовка и консервирование тканей. Прага: Госмедиздат. -1962. -283 с.

65. Козлов Т. Г. Осмотическое давление спермы быков и сред применяемых для её разбавления. Автореф. дис. канд. биол. наук. М. - МВА. - 1971г. -20 с.

66. Коновов В.П., Нарижный А.Г., Походня Г.С. Способ криопротекторной обработки спермы животных. //Животноводство. 1987,- № 12. - С. 42-44.

67. Кононов В.П. Достижения и перспективы замораживания семени в свиноводстве: Обзорная информация. М. -1983. - 75 с.

68. Корбан Н.В., Белкина Л.А., Безубова Н,И, Влияние глицерина на акросо-мальные ферменты сперматозоидов хряка при замораживании-оттаивании. / Бюл. научн. работ ВНИИРГЖ. -1978. Вып. 33. - С. 25 - 28.

69. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.М. Оценка замороженно-оттаянной спермы по морфофизиологическим и биохимическим показателям. / Сб. науч. тр. ВНИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных. -1979.-№27.-С. 24-30.

70. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.М. Оценка заморожено-оттаянной спермы по морфофизиологическим и биохимическим показателям. / Сб. науч. тр. ВНИИРГЖ. -1978. № 27. - С. 24 - 30.

71. Корбан Н.В., Прокопцев В.М., Рустенова P.M. и др. Технологические приемы повышения эффективности метода криоконсервации спермы хряков. / Криоконсервация гамет и эмбрионов сельскохозяйственных животных. Л. -1983.-С. 30-48.

72. Корбан Н.В., Прокопцев В.М., Рустенова P.M., и др. Технологические приёмы повышения эффективности метода криоконсервации спермы хряков. /

73. Криоконсервация гамет и эмбрионов сельскохозяйственных животных. -J1. -1983.-С. 30-48.

74. Кузнецова И.В., Кузнецов А.В., Сигаева В.А., Шит И.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК. // Биотехнология теоретический и научно практический журнал. 1993. - № 11-12.-С. 2-5.

75. Куроедов А. П. Свободные аминокислоты в семени племенных быков. // Сельскохозяйственная биология. 1968. - Т III. - № 6. - С. 22 -24.

76. Куроедов А.П. Свободные аминокислоты и качество спермы быков-производителей. / М. Университета дружбы народов им. П.Лумумбы. -1966.-Т. 14.-С. 246-255.

77. ЭО.Ленинджер А. Биохимия. М. - Мир. - 1974. - 800 с.

78. Лопатко М.И. Замораживание спермы животных в средах без глицерина и желтка. / Технология повышения продуктивности сельскохозяйственных животных в условиях Северного Кавказа. Ворошиловград. - 1978. - С. 6669.

79. Лопатко М.И. Совершенствование метода и технологии глубокого замораживания и длительного хранения семени быков и баранов. / Достижения науки и передовой технологии по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. Киев. - 1966. - С. 125-137.

80. ЭЗ.Лопатко М.И., Тюпина К.Ф. Способ замораживания семени быков без глицерина. //Животноводство. 1972. - №6. - С. 72 - 74.

81. Луговой В.И. Криоповреждения ферментов и ферментных систем. / Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова думка. - 1981. - С. 15 -41.

82. Луцкий Д.Я., Жаров А.В., Шишков В.П., и др. Патология обмена веществ у высокопродуктивного крупного рогатого скота. М. - Колос. -1978. - 384 с.

83. Эб.Майстер Биохимия аминокислот. М - 1961. - 530 с.

84. Малиновская В.А. Совершенствование метода замораживания спермы быков в соломинках на основе исследования режимов охлаждения. Автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы. ВИЖ. -1987. - 25 с.

85. Малиновская В.А. Оптимальные режимы замораживания спермы быков в соломинках. / Совершенствование методов воспроизводства и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. М. -1983 - С. 100 - 108.

86. Милованов В.К. Физиологические свойства мембранных липидов и устойчивость живчиков при глубоком охлаждении. // Вестник сельскохозяйственной науки. -1984. № 2. - С. 93-100.

87. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. М - Сельхозиздат,- 1962. - 695 с.

88. Милованов В.К. Сравнение трёх способов хранения глубокозаморожен-ного семени быка. Н Сельское хозяйство зарубежом. -1972. № 7. - С. 15 -20.

89. Милованов В.К., Варнавская В.А., Шайдулин И.Н. Среда для глубокого охлаждения семени. // Животноводство. -1985. № 7. - С. 39 - 41.

90. Милованов В.К., Варнавский А.Н., Наук В.А. О природе криогенных повреждений живчиков барана. // Вестник сельскохозяйственной науки. -1970. -№ 10. С. 86-93.

91. Милованов В.К., Жильцов Н.З. Свободные аминокислоты в секреции воспроизводительной системы и в семени сельскохозяйственных животных. / Труды ВИЖа -Т. 33. М. -1972. - С. 176-197.

92. Милованов В.К., Жильцов Н.З. Свободные аминокислоты в жидкости эпидидимиса в семени животных. //Животноводство. 1969. - № 10. - С. 10 -27.

93. Милованов В.К., Жильцов Н.З. Свободные аминокислоты в секреции воспроизводительной системы барана. / Доклады ВАСХНИЛ. 1970. - № 12.-С. 38-52.

94. Милованов В.К., Жильцова Л.С. Комплексонаты металлов в средах для семени сельскохозяйственных животных. // Вестник с\х науки. 1982. - № 2. С. 58 - 60.

95. Милованов В.К., Жильцова Л.С. Применение комплексонатов металлов в средах для семени с/х животных. / Тезисы докладов: Второго всесоюзного совещания по химии и применению комплексонов и комплексонатов металлов. -1983. С. 200.

96. Милованов В.К., Наук В.А., Жильцов Н.З. Связанные и свободные аминокислоты семени (барана), подвергнутого глубокому охлаждению. / Направления и новые результаты исследований по биологии воспроизведения. Дубровицы. 1974. - Ч. 1. - С. 24 - 27.

97. Милованов В.К., Селиванова О.А. Разбавители для спермы сельскохозяйственных животных. // Проблемы животноводства. 1932. - № 2. - С. 75 -86.

98. Милованов В.К., Соколовская И. И. Теория холодового удара живчиков млекопитающих. //Доклады ВАСХНИЛ. 1959. - № 8. - С. 3-9.

99. Милованов В.К., Соколовская И,И. Уровень и перспективы научных исследований. //Животноводство. -1980. № 10. - С. 48-50.

100. Милованов В.К., Соколовская ИИ. Оплодотворение сельскохозяйственных животных и среда. / Труды ВИЖ. М. - Т. XXI. - 1957. - С. 28 - 31.

101. Милованов В К., Соколовская И И. Синтетические среды для разбавления семени хряка и методы его хранения. // Животноводство. 1957. - № 2. С. 33 - 36.

102. Милованов В.К., Соколовская И.И., Смирнов И.В. Свойство живчиков млекопитающих сохранять биологическую полноценность после быстрого замораживания. Открытие СССР. ЦНИИПИ. М. -1972,- С. 28 - 29.

103. Моисеев В.А. Молекулярные механизмы криоповреждения и криозащи-ты. / Тезисы докладов международной конференции: Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины. Харьков. -1988. -С. 26 -27.

104. Молова М.В. Влияние низких температур на структурную характеристику акросомы сперматозоидов барана. /Криобиология на половине клетки. -София. -1983. С. 58-70.

105. Мороз Л.Г. Теоретические аспекты низкотемпературной консервации спермы сельскохозяйственных животных. / Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. Л. - Агропромиздат. -1988. ~0.1 - 65.

106. Мороз Л.Г., Шапиев И.М., Смирнова Л. Определение общей активности лактатдегидрогеназы в спермиях и плазме семени различных сельскохозяйственных животных. / Методические указания по исследованию физиологии и биохимии спермия. Л. - 1974. - С. 4-13.

107. Морозов В.А. О защитной роли глицерина при замораживании семени сельскохозяйственных животных. / Труды Дагестанского Научно-исследовательского института сельскохозяйственных животных. Махачкала -1965. - С. 54-61.

108. Мохамед Сами Сайед Абду Влияние разных Сахаров, солей ЭДТУК и ги-пертоничной среды на семя быка. / Направление и новые результаты исследований по биологии воспроизведения. -1974. С. 66 - 69.

109. Мохамед Сами Сайед Абду Действие ЭДТА и капроновой кислоты на живчиков быка в условиях холодового удара. / Доклады Всесоюзной ордена Ленина Академии сельскохозяйственных наук. 1968. - № 6. - С. 43 - 46

110. Мохамед Сами Сайед Абду Оплодотворение коров и тёлок от семени сохранённого в среде с ЭДТА без хпадоагентов. //Животноводство. 1968. - № 6. - С. 34 - 39.

111. Мохамед Сами Сайед Абду Этилендиаминтетраацетат в среде для хранения семени быка. // Вестник сельскохозяйственной науки. -1968. № 8. С. 134-136.

112. Намазов И., Уровень протеина и качество спермопродукции у быков. // Животноводство. -1980. № 9. - С. 50 - 51.

113. Наук В.А, Делеу В., Дарий Г.Е. Новая синтетическая среда для замораживания спермы быков в полимерных соломинках. // Молочное и мясное скотоводство. -1985. № 5. - С. 15-18.

114. Наук В.А. Криобиология спермиев сельскохозяйственных животных: достижения и перспективы. / Физиология продуктивных животных решению продовольственной программы СССР. - Таллинн. -1990.- Ч. I - С. 42-43.

115. Наук В.А. Криоконсервация семени животных консервация генетических ресурсов. / Обзор. Пущино. - 1982. - 50 с.

116. Наук В.А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации. -Кишинёв: Штиинца. -1991. -199 с.

117. Наук В.А. Действие внешних факторов на спермопродукцию быков. И Животноводство. -1984. № 6. - С. 46 - 48.

118. Наук В.А. Изменения проницаемости мембран и устойчивости белково-холестериновых комплексов под влиянием технологической обработки семени. // Сельскохозяйственная биология. -1974. -Т. 9. № 1. - С. 102 - 105.

119. Наук В.А., Криогенные изменения аминокислотного состава спермиев. // Свиноводство. 1971г. - № 11 - С. 21 - 22.

120. Наук В.А., Проблемы криобиологии сперматозоидов животных. / Тезисы докладов VI Всесоюзного совещания эмбриологов. М.: Наука. - 1981. -130 с.

121. Наук В.А. Совершенствование организации воспроизводства крупного рогатого скота. // Международный сельскохозяйственный журнал. 1983. -№ 1 - С. 58 - 60.

122. Наук В.А. Структурно-биохимические и функциональные особенности гамет самцов сельскохозяйственных животных при криоконсервации. / Известия АН МССР, Сер. биол. и хим. наук. 1987. - № 5. -С.49 - 54.

123. Наук В.А. Структурные и биохимические криоповреждения биомембран гамет самцов сельскохозяйственных животных. // Криобиология. -1985. № 2. - С. 47 - 50.

124. Наук В.А., Борончук Г.В. Длительное сохранение спермы сельскохозяйственных и диких животных. // сб. науч. тр. Консервация генетических ресурсов. Пущино. -1991,- С. 35 - 75.

125. Наук В.А., Борончук Г.В., Гуськов A.M., и др. Проблемы и перспективы консервации генома сельскохозяйственных животных. // Сельскохозяйственная биология. -1989. № 2. - С. 12-14.

126. Наук В.А., Борончук Г.В., и др. Криогенные изменения Mg++ (Na+, К+) -АТФазной активности мембран гамет сельскохозяйственных животных. // Сельскохозяйственная биология. -1990. № 5. - С. 18-22.

127. Наук В.А., Голубь B.C. Изменение амино- и жирно-кислотного состава свежеполученных живчиков барана и быка. // Сельскохозяйственная биология. -1972. Т. 7. - № 1.-С. 18-24.

128. Наук В.А., Гуськов A.M. Криогенные изменения липидов и морфофунк-циональных показателей гамет самцов сельскохозяйственных животных. / Известия АН МССР. Сер. биол. и хим. наук. 1988. - С. 35 - 38.

129. Наук В.А., Дарий Г.Е. Зависимость сульфгидрильных групп в живчиках семени быка от состав сред и технологической обработки (-196° С). / Животноводство на промышленную основу. -Кишенёв: Штиинца. - 1975.- С. 28 - 36.

130. Наук В.А., Дарий Г.Е. О целесообразности отказа от «эквилибрации» при замораживании семени быков. // Животноводство. -1 974. -№ 10. С.71 -74.

131. Новгородов В.П., Ломова Е.А. Утверждение наставления по применению холин хлорида. // Ветеринария. - 1998. - № 1- С. 47-48

132. Ожин Ф.В., Паршутин Г.В., Семаков В.Г. Справочник по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М. - Россельхозиздат. -1983.-271 с.

133. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание семени производителей. / Доклады советских учёных к V Международному конгрессу по биологии воспроизведения и искусственному осеменению животных. -М. 1964. - С. 1417.

134. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание спермы производителей. Киев.-Урожай. - 1969.-248 с.

135. Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков. / Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Харьков. - 1963. - 22 - 41.

136. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев - Урожай. - 1978. - 255 с.

137. Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков. / Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Сборник работ НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. -Харьков. 1963. - С. 22 - 40.

138. Осташко Ф.И. Харьковская технология криоконсервации эмбрионов и спермы крупного рогатого скота. / Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины: Тезисы докладов Международной конференции. Харьков. - 1988. - 77 с.

139. Осташко Ф.И., Лопатко М.И. Изучение рН спермы сельскохозяйственных животных. / Молочно-мясное скотоводство. -Киев. 1965. - Вып. 3. - С. 1320.

140. Осташко Ф.И., Павленко М П., Стрельникова Т А., Микропроцессорный способ определения качества спермы. / Новое в методах зоотехнических исследований. Харьков. -1992. - Ч. I. - С. 127-130.

141. Осташко Ф.И., Раковский Я П., Павленко М.П., Скорняков Б.А. Криоско-пические исследования спермы быков производителей. / Криобиология и криомедицина. Киев: Наукова думка. -1975. - № 1. - С. 51 - 54.

142. Осташко Ф.И., Скорняков Б.А. Нарушение ультраструктуры спермиев при низкотемпературной консервации. / Криобиология и криомедицина. -Киев: Наукова думка. 1975. - № 1. - С. 110-114.

143. Осташко Ф.И., Шикаренко В.А. Замораживание спермы быков-производителей в облицованных гранулах. I Теория и практика воспроизводства сельскохозяйственных животных. Харьков. - 1972. - С. 12-15.

144. Островский Д.Н. Молекулярная организация биологических мембран. / Биомембраны, структура, функции, методы исследования. Рига: Зинатне. -1977. - С. 7-27.

145. Пааташвили К А. Влияние некоторых синтетических сред и различных химических веществ на биологические свойства сперматозоидов быков и кроликов. Автореф. дис. канд. биол. наук. 1973.- 22 с.

146. Пакенас П., Жунда П., Илгунас Б., и др. Методические рекомендации по литовской технологии кормления, содержания, подготовки быков к взятию семени, его криоконсервации и использования. Вильнюс. -1987. - 64 с.

147. Пакенас П.И. Байсогальская технология криоконсервации семени быков. //Животноводство. -1985. № 1. - С. 16-18.

148. Пакенас П.И., Гинкявичус Р.А. Байсогальская технология замораживания и использования семени быков. / Бюл. НТИ Лит. НИИХС. 1975. - № 2. - С. 68 - 80.

149. Парез М. Глубокое охлаждение семени быков во Франции. // Сельское хозяйство за рубежом. 1967. - № 9. - С. 21-22.

150. Пиняукас В., Урбмис А. Влияние температур разбавления на физиологические показатели семени. / Физиология продуктивных животных решению Продовольственной программы СССР. Таллинн. - 1990. - Ч. II. - С. 38-39.

151. Платов Е.М. Биологический метод определения изотонической концентрации солей для живчиков быка. / Доклады ВАСХНИЛ. 1965. - № 6.- С. 45 -47.

152. Платов Е.М. Дыхание семени барана и быка после замораживания. // Вестник сельскохозяйственной науки. -1967. № 4. - С. 72 - 74.

153. Платов Е.М. Некоторые теоретические аспекты замораживания спермы. //Животноводство. 1978. - № 10. - С 64-67.

154. Платов Е.М. О механизме действия глицерина при разбавлении и замораживании семени быка. / Доклады советских учёных к V Международному конгрессу по биологии воспроизведения и искусственному осеменению животных. М. -1964. -С. 28-31.

155. Платов Е.М. Замораживание семени быка в глицериновой «компенсированной» среде. //Животноводство. -1963. № 8. -С. 92-94.

156. Платов Е.М. О предохранении спермиев от холодового удара. // Молочное и мясное скотоводство. -1969,- № 8. С. 23 -24.

157. Платов Е.М. Осмотическое действие глицерина на живчики быка. // Вестник с\х науки. -1960. № 11. - С. 59-63.

158. Платов Е.М. Криоконсервация спермы баранов. / Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. -Л. Агропромиздат. -1988. - С. 161 - 195.

159. Платов Е.М. Некоторые теоретические аспекты замораживания спермы. // Животноводство. -1978. № 10. -С. 64 - 67.

160. Платов Е.М. Теоретические и практические основы замораживания семени производителей сельскохозяйственных животных. Автореф. дис. д-ра. биол. наук. Дубровицы. -1973. - 42 с.

161. Платов Е.М., Лаптева Т.М. Влияние кристаллизации воды на сперматозоиды при замораживании семени. // Сельскохозяйственная биология. -1975.-Т. 10. -№ 1. С 92 - 95.

162. Платов Е.М., Малиновская В.А. Замораживание семени в синтетической полисахаридной среде. // Животноводство. -1977. № 7 - С. 54 - 57.

163. Платов Е.М., Шевцова А.А. Роль желтка и других факторов при глубоком замораживании семени быка и барана. / Материалы научной конференции молодых учёных ВИЖа.- Дубровицы. Вып. 5. - 1967. - С. 31-36.

164. Попов В.П., Прокопцев В.М. Применение математических методов для нахождения оптимальных соотношений компонентов разбавителей спермы. / Биохимические методы исследования спермы сельскохозяйственных животных. -Пушкин. -1973. С. 81-91.

165. Попов П.С. Сохранение семени быка в декстрозо-цитратной среде с ЭДТА и аргинином. //Животноводство. -1968. №10. - С. 66-68.

166. Преображенский О. Некоторые приёмы работы с замороженной спермой. // Молочное и мясное скотоводство. 1992. - № 5-6. - С. 25-27.

167. Пронин Б.Г. Криоконсервация спермы быков-производителей и система организации воспроизводства крупного рогатого скота. Автореф. дис. д-ра. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. — Харьков. 1991. - 39 с.

168. Пронин Б.Г., К методики определения рН в сперме и разбавителях. / Учёные записки Казанского Государственного ветеринарного института им. Н.Э. Баумана. -1971. Т. III. - С. 273-274.

169. Пушкарь Н.С., Наконечный А.А., Калугин Ю.В. Некоторые аспекты механизма действия криопротекторов. / Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга и крови. Харьков. - 1972. - С. 98 - 114.

170. Рэ Луи Консервация жизни холодом. М. -Медгиз. -1962. - С. 82 - 148.

171. Садовникова М.Т. Хранение семени хряков без хладагентов. // Свиноводство. -1966. № 5. - С. 33 - 37.

172. Садыков Р.Э., Асанбеков О.А., Учаев А.А., Учурова А С. Усовершенствование метода длительного хранения семени быков-производителей. / КиргНПОЖ. 1985. - Вып. 37. - С. 68-71.

173. Семаков В.Г. Криоконсервирование спермы быков и баранов. / Обзор ВНИИТЗИ Агропром. М. - 1991. - 52 с.

174. Семаков В.Г. Содержание натрия, калия, кальция в сперме быка и хряка при различных температурах в зависимости от синтетических сред. / Сборник научных трудов НИИСХ центр, р-нов Нечернозёмной зоны. 1978. -Вып. 42.-С. 122-126.

175. Семаков В.Г. Режимы замораживания и оттаивания спермы хряка и быка. / Сборник трудов НИИСХ центр, р-нов Нечерноземной зоны. 1980. - № 52.-С. 101-105.

176. Семаков В.Г. Активность сукцинатдегидрогеназы в процессе замораживания и оттаивания спермы быков и хряков. / Доклады ВАСХНИЛ. -1984. -№ 2. С. 25-27.

177. Семаков В.Г., Рыжков Т.Ф. Проницаемость цитоплазматических мембран сперматозоидов быка и хряка для натрия, калия, кальция и фосфора под влиянием низких температур. // Сельскохозяйственная биология. -1976.-Т. 11. -№ 2. С. 200- 204.

178. Семёнова В.А. Защитные свойства отдельных факторов желтка куриного яйца при замораживании семени животных. Автореф. дис. кан. биол. наук. ВИЖ. - Дубровицы. -1987. -24 с.

179. Семченков В.Б. Оплодотворяемость коров и тёлок в зависимости от состава среды и сроков хранения спермы. // Ветеринария. 1967. - № 6. - 84 -86.

180. Скорняков Б.А. Изучение повреждений спермиев быка при их низкотемпературной консервации. Автореф. дис. канд. биол. наук. Харьков. -1973. -С . 31.

181. Смирнов И.В. Теоретические вопросы замораживания и хранения семени. / Тезисы докладов симпозиума: Применение различных методов замораживания семени быков. Байсогала. - 1974. - С. 4-7.

182. Смирнов И.В. К теории глубокого охлаждения спермы. // Животноводство. -1974.-№11.-С. 65-70.

183. Смирнов И.В. Сохранение спермы сельскохозяйственных животных посредством глубокого охлаждения. // Советская зоотехния. 1949. - № 4. - С. 63-64.

184. Соколовская И.И. Может ли замороженная сперма оплодотворять и давать потомство. / Доклады ВАСХНИЛ. -1949. № 6 - С. 21 - 24.

185. Соколовская И.И., Дроздова Л.П. и др. Усовершенствование среды для семени сельскохозяйственных животных. / Доклады ВАСХНИЛ. 1956. -Вып. 7.-С. 17-25.

186. Соколовская И.И., Ойвайдис Р., Абилов А., и др. О значении акросомы в оценке семени самцов. //Животноводство. -1981. № 9. - С. 46-47.

187. Столбов В.М., Римарова Л.Д. Влияние введения витаминов в разбавитель на качество спермы быков после замораживания оттаивания. / Криоконсервация гамет и эмбрионов сельскохозяйственных животных. - Л. -1983. - С. 54-57.

188. Томмэ М.Ф., Мушкотело И.А. Общий аминокислотный состав и свободные аминокислоты в сперме хряков. / Доклады ВАСХНИЛ. -1968, № 6. С. 114-121.

189. Турбин В.Ф. Новые элементы технологии замораживания семени быков в полипропиленовых соломинках. / Сборник научных трудов ВИЖ. -1997. -Вып. 58. С. 74-75.

190. Турбин В.Ф. Новые элементы технологии замораживания спермы быков в полипропиленовых соломинках. / Воспроизводство и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. М. -1990. - С. 28-31.

191. Турбин В.Ф. Быстрый метод замораживания семени быков в ампулах и полистироловых пипетках. / Материалы конференции молодых учёных ВИЖа. -Дубровицы. -1967. -121 с.

192. Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. М. - Медицина. 1991.-485 с.

193. Тюпина К.Ф. Усовершенствование метода длительного хранения спермы быков. Автореф. дис. канд. биол. наук. НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР. Харьков. -1972. -18 с.

194. Успенский А.Н. Компенсированная среда с гликоколом для разбавления семени быка перед замораживанием. / Биология воспроизведения и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Дубровицы. -1966. - С. 61-65.

195. Успенский А.Н., Платов Е.М. Действие замораживания семени на содержание фосфолипидов в сперматозоидах быка и барана. / Доклады советских учёных к VI Международному конгрессу по размножению и искусственному осеменению. М. - 1968. - С. 47 - 48.

196. Фарант Д. Пересмотр некоторых криобиологических концепций. Н Криобиология и криомедицина. -1977. Вып. 3. - С. 12 - 20.

197. Флорип Т. Влияние различной температуры оттаивания семени замороженного в форме гранул, на его качество и оплодотворяющую способность. / Тезисы докладов симпозиума: Применение различных методов замораживания семени быков. Байсогала. -1974. - С 17-18.

198. Фут Р. и др. Влияние разных разбавителей на оплодотворяющую способность спермы быка. // Сельское хозяйство за рубежом. -1962. № 6. -С. 45 - 47.

199. Хабибулин И. Башкирской технологии замораживания и хранения семени 25 лет. // Молочное и мясное скотоводство. 2001. - № 1. - С. 20 - 25.

200. Хабибулин И.Х. Применение лактозо-глицерино-желточной среды при искусственном осеменении. // Животноводство. 1985. - № 9. - С. 55 - 59.

201. Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и системы, регулирующие его интенсивность. / Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М: Наука. - 1981. -С. 147-155.

202. Черных Г., Пальчиков А., Толстиков В. Влияние рациона с белком животного происхождения на семяобразование быков-производителей. И Животноводство. -1970. № 9. - С. 56 - 57.

203. Чуксина Н.П., Давыденко В.М. Влияние технологической обработки спермы на состояние акросомного комплекса у спермиев баранов и быков. / НТВ Укр. НИИЖ. -1980. Вып. 1. - С.53-54.

204. Шайдулин И.Н. Искусственное осеменение овец глубокозамороженным семенем. //Животноводство. -1977. № 8. - С. 58-61.

205. Шарапа Г.С. О взаимодействии аминокислотного состава и подвижности спермиев быков. / Разведение и искусственное осеменение крупного рогатого скота. Киев. -1986.- Вып. 18. - С. 45 - 48.

206. Шергин Н.П. Аминокислотный состав и изменение белка и других компонентов семени быка и барана в процессе хранения при низких температурах. / Труды Всесоюзного Научно-исследовательского института животноводства. -Т. III. -1959. С. 191-211.

207. Шергин Н.П. Биохимия сперматозоидов сельскохозяйственных животных. М. - Колос. -1967. - 239 с.

208. Штрауб Ф.Б. Биохимия. Будапешт. - 1965. - 612 с.

209. Ющенко Н.П. и др. Метод глубокого охлаждения спермы в капсулах над жидким азотом. / Научные труды НИИСХ Центральных районов Нечернозёмной зоны. М. -Т. 2. -Вып. 25. -1970. - С. 214-216.

210. Юцценко Н.П. Методические рекомендации по криоконсервированию, хранению и использованию семени быков, замороженного в гранулах жидким азотом. М. -1979. - 37 с.

211. Ющенко Н.П., Левин К.Л. Значение колебаний температуры в замороженном семени. // Животноводство. -1976. № 1. - С. 64 - 66.

212. Ющенко Н.П., Семаков В.Г., Левин К.Л. Замораживание спермы быков в гранулах без применения сухого льда. // Молочное и мясное скотоводство -1968.-№ 5. -С. 36-37.

213. Яцун А.С. Хранение спермы в азоте. И Сельское хозяйство Белоруссии. -1973. -№ 6. -С. 21 -25.

214. Abraham, Bhargava Обмен нуклеиновых кислот сперматозоидами млекопитающих. -Bioch. J. -1963. -86 С. 298.

215. Abraham, Bhargava Поглощение радиоактивных аминокислот сперматозоидами. Bioch. J. -1963. - 86 - С. 308.

216. Bhargava, Bishop, Work Введение Ci4 аминокислот в белки спермиев быка. - Bioch. J. - 1959. -73. -С. 247.

217. Bhargava, Bishop, Work Химический состав спермы быка, особенно в отношении нуклеиновых кислот, нуклеотидов и свободных аминокислот. -Bioch. J-1959.-73-С. 242.

218. Daw A., Farrant J., Morris G.J. Membrane Leacage of Solutes After Thermal Shock or Freezing. Criobiology 1973. Vol. 10. N 2. P. 126 -133.

219. Ibrahim M.A.R., Boldizar H. Studies on free amino acid content in seminal plasma of i. a. Bulls of different performance. Acta veterinaria academiae scienti-arum Hungraricae. t. 29. (3) p. 263-269.

220. Landi MT, Caporaso N. Sample collection, processing and storage.J Am Vet Med. Assoc. 1980 Oct. 15:177(8): 720-722.

221. Leffler KS, Walters CA A comparison of time, temperature, and refreezing variables on frozen sperm motility recovery. C. R. Seances. Soc. Biol. Fil. 1976: 170(6): 1218-1222.

222. Levitt G. A sulfhydryl disulfide hypothesis of frost injury and resistance in plants. J. Thocor. Bilb. 1962. Vol. 3. P. 355 - 391.

223. Lovelocr J. E. Denaturation of lipid-protein complexes as a cause of damage by freezing. Proc. Roy. Soc. Ser. Biol. 1957. N. 147. P. 427-433.

224. Lovelocr J. E. The mechanism of protective action of glycerol against haemolysis by freezing and thawing. Biochem. Biophys. Acta. 1953. Vol. 11. 28-36.

225. Mazur P. Basic encepts in freezing cells. Рос. l-st. item. Conf. On Deep Freezing of Boar semen. Uppsala. 1985. P. 91 111.

226. Meryman H.T. Modified model for the mechanism of freezing injury in erythrocytes. Nature. 1968. Vol. 218. P. 333 336.

227. Meryman H.T. Osmotic Stress as a Mechanism of Freezing Injury. Cryobiology. 1971. Vol. 5. N 8. P. 489-500.

228. Meryman H.T. Review of biological freezing. Cryobiology. New York: Acad. Press. 1966. P.48-58.

229. O'SheaT, Dacheux J L, Paquignon M. Metabolism of spermatozoa before, during preparation for, and after storage in liquid nitrogen. J. Androl. 1995. May-Jun; 16 (3):278 -285.

230. Saake R.G. Semen quality in relation to preservation. J. Dr. Sci. 1983. Vol. 66. № 12. P. 2635.

231. Soderquist L. ATP content and sperm motiliti of etendtd bovine semen under different storage conditions. Fertil. Steril. 1996. Feb: 65(2): 272-274.

232. Yoshida M. Conservation of sperms: current status and new trends. IARC. Sci. Publ. 1997; (142): 223-236.

233. Zhao Y, Buhr M.M. Cryopreservation extenders affect calcium flux in bovine spermatozoa during a temperature challenge. Nauchnye Doki Vyss Shkoly Biol Nauki 1991; (2): 57-64.