Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ГЛУБОКОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ БЫКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСОНАТОВ, АМИНОКИСЛОТ И ВИТАМИНОВ.

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ГЛУБОКОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ БЫКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСОНАТОВ, АМИНОКИСЛОТ И ВИТАМИНОВ."

■Я-33 ізч

На правах рукописи ПАНЫШШ Сергей Сергеевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ГЛУБОКОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ БЫКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСОНАТОВ, АМИНОКИСЛОТ И ВИТАМИНОВ.

03.00,13 - Физиолога»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, Московская область, 2003

Работа выполнена в отделе биологии воспроизведения и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ)

Научи ый руководитель:

кандидат биологических наук Николай Захарович Жильцов

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор Юрий Дмитриевич К лине кий кандидат биологических наук Николай Петрович Зыкунов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Защита диссертации состоится « $ » ^¿ся-сР^х 2003 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 006.013.01 ори Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства

Адрес института: 142І32, Московская область, Подольский район, п. Дубро-вицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться «г ТїИЖа.

Автореферат разослан \

Ученый секрете,^ Диссертадиошісг^ соїупа, Кандидат биологических нау*'

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Уже в течение нескольких десятков лет в мире успешно применяют замороженную сперму быков, а в разпяшх странах замороженной спермой осеменяют до 100 % поголовья коров и тйлок. Замораживание семени дает ощутимые экономические выгоды, существенно снижает транспортные расходы при перевозке криоконсервированного материала. В скотоводстве проблему криоконсер-внрованш спермы можно считать вполне решённой однако, технология замораживания непрерывно совершенствуется, определяя для исследователей новые вопросы и залздц.

Важным элементом технологии является криоэащитная среда для разбавления, замораживания и оттаивания спермы. В последнее время возникла необходимость заняться усовершенствованием синтетических сред для замораживания семени быка в соломинках и гранулах с использованием новых веществ, которые бы обеспечили большую биологическую полноценность опаянных живчиков, лучше сохраняли акросомалъный чехлкк и тем самым повышали оплодотворяющую способность заморожено-оттаянного семени.

С этой целью в синтетические среды, используемые для сохранения семени вне организма, нами предложено введите некоторых металлов в виде комплек-сонатов с ЭДТА, с целью стабилизации в разбавленном семени физиологического баланса катионов, снижения нуклеазпой активности желтка, а так же стабилизации мембран спермиев, которую могут оказывать эти металлы. Известно, что как криопротекгоры и защитники обменных процессов е живчиках при глубоком замораживании семени быка, могут с успехом использоваться такие вещества как холин-хлорид и бетаин.

Основу всех жизненных процессов спермы составляют белки, которые вступают в комплексы с другими соединениями (Мялованов В.К, 19623. Отсюда, большой интерес представляет изучение аминокислот, как веществ, обладающих вполне эффективными криозащигными свойствами, и способных включаться в белки сперматозоидов.

Применяемые в нашей среде защитные вещества, могут оказывать на выживаемость живчиков в процессе замораживания-оттаивания не только положительное влияние присущее им как отдельным компонентам, но, имея тесную химическую друг с другом связь, производить совместный защитный эффект.

Цель н задачи исследований.

Целью наших исследований являлось дальнейшее совершенствование технологии глубокого замораживания семени быка к повышение результативности осеменения коров и тёлок замороженным семенем. Для достижения поставлен-ш« целей решали следующие задачи:

- Разработать новую синтетическую среду для замораживания семени быка, которая обеспечивала бы снижение нуклеазной активности в семени перед замораживанием, равышенда-бнолошчажоИ полноценности живчиков и их оплодопюряющий'способноцн ЕагМСХА

фондда^

- Провести сравнение режимов эквилибращш (охлаждение разбавленного семени до 0° С) начиная с 1 часа и до 3-4 часов.

- Определить нухлеазную активность в разшвлсшюм и оттаянном семсни, определить абсолютный показатель живучести живчиков после оттаивания в новых и хошрольных средах.

- Провести исследования проверки результативности искусственного осеменения коров семенем замороженным в новой и контрольной средах.

Научная новизна исследований заключается в том, что впервые была разработана среда для глубоко!« замораживания семени быков снижающая нукдеязную активность желтка куриного яйца. Впервые при замораживании семени Зыков применили такие вещества как холш-хлорид, бетаин, мстионюг и люин.

Практическая ценность работы. Предложена среда для сохранения семени быков в глубокозамороженном состоянии, снижающая ферментативную активность желтка, сохраняющая акросомальный чехлик, способствующая лучшей подвижности и оплодотворяющей способшетк семени быков. Основные положения, выноекмые на защиту': - среда для хранения семени быка при температуре -1 %°С ;

- экспериментальные данные по проверке результативности осеменения хоров живчиками, замороженными в новой компяексонатной среде.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований были доложены, обсуждены и получили положительную оценку;

На ежегодных конференциях аспирантов и молодых ученых «Достижения молодых учёных» (2001, 2002 гг. ВИЖ>;

На ежегодных международных научно-практических конференциях «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2001,2002гг., ФГОУ РАМЖ);

На научной конференции отдела биологии воспроизведения ВИЖа (5 ав1уста 2003г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы. Структура и объём работы. Диссертация состоит го введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста фермата А4, содержит 22 таблицы 1 рисунок, 2 схемы и 3 графика. Список литературы включает 259 источников, в том числе 239 отечественных л 20 иностранных.

2. Матерная п методы исследований.

Объектом исследования служило семя быков-производителей чёрно-пёстрой, аГшшрской и голттинской пород принадлежащих ЦСИО. Семя брали с помощью искусственной вагины. Каждый эякулят оценивали по объему, подвижности и концентрации жнвчнкда.

Для лабораторных исследований исполкюм.-т так называемый расщеплённый эякулят, (то есть для всех вариантов ссмя брали да одного и того же эякулята) с

подвижностью живчиков не ниже 8 баллов и конадгитрацней не меньше

0.7.лрд./мл.

Степень разбавления семени быков рассчитывали так, чтобы перед замораживанием в каждой дозе было не менее 20 милшюнов живчиков с прямолинейным поступательным движением. Замораживание семени проводили по общепринятым методикам - па сухом льду в гранулах, либо в парах жидкого азота в соломинках но 0,25 мл.

Замороженное семя, как в соломинках, ток и в гранулах оттаивали в водяной бане, ври температуре 40° С, Для оттаивания гранул использовали 2,9 % - ный растлор лимоннокислого натрия.

Для разбавления использовали две среды, В качестве контрольной, была взята ЛЦГЖ (лактозо-цитрат-глицррш го-желточ I юя среда), приметаемая в последние 10 лет в большинстве племпредприятнй страны, в том числе и на ЦСИО. Второй средой служила предложенная нами комплексонатная среда Используемые в опытах комплексонаты кальция, меди и ганка были синтезированы во Всероссийском институте химических реактивов и особо чистых веществ (ИРил). Аминокислоты лизин, метиония и бетаин, а также холин-хлорнд были получены от компаний Хоффман Ля Рот, Рон Пуленк и Дегусса.

Для определения ценности компонентов и их сочетания в новой синтетической среде, а также условий технологической обработки ссмени быков при низкотемпературном его замораживании и оттаивании нами были изучены;

1. Оишмалъные сочетания и соотношения исследуемых компонентов (ком-плекеонатов металлов, аминокислот и витаминов) при разработке опытной синтетической среды для разбавления и сохранения семени быксв при температуре минус 196° С.

2. Сохранность акросомаиьного чехлика в опытной и контрольной средах, а также 1[уклсазной активности семени, сред, желтка.

3. Сравнительное испытание синтетических сред для разбавления и замораживания семени в соломинках и гранулах.

4. Эффективность различной продолжительности периода эквияибрации семени при +4" С.

5. Подвижность живчиков на разных стадиях технологической обработки ссмени.

6. Абсолютный показатель живучести живчиков и длительность жизни в часах при 37° С,

Научно-производственные опыты по изучению эффективности разработанной нами синтетической среды для разбавления и замораживания семени быков-производителей в соломинках и гранулах в сравнении с опытной средой, в настоящее время используемой для этих целей, проводили в хозяйствах Подольского района и Тульской области.

Определение оптимального состава синтетической среды для разбаатения и замораживания семени быков в соломинках и гранулах.

Для разработки оптимальной апггетической среды используемой для разбавления и замораживания семегщ быков в соломинках и гранулах нами были получены изотонические растворы комптексонатов меди, цинка и кальция, а также аминокислот лизина, мешонина, витамина холнп-хлорвда и бстаииа. Бы-

ло изучено влияние (склоничеехих растворов этих веществ на нереживаемость живчиков при температуре +37ЙС.

Изотонические концентрации новых компоненте® сред устанавливали криоско-шгееошм (расчетным) методом с последующим уточнением биологическим методом, ш подвижности и выживаемости живчиков при инкубации вне организма, При составлении новых разбавляющих сред нельзя допускать изменения осмотического давления в сперме. Для расчётов юотокичносга растворов опытных веществ, мы руководствовались правилом Ватн-Гоффа и Рауля.

Для более точного определения оптимальной концентрации спермы быка мы проверяли вычисленные концентрации биологическим методом. Для определения оптимального состава среды нами была изучена живучесть штчтов после замораживания-оттаивания семени методом треугольных систем по В. Мияокшову (1962) при величине интервалов в 20 % я л 10% при всех соотношениях Трёх компонентов {66 вариантов). Данный метод применялся для определения оптимального состава комияексонатов и аминокислот. Таким же образом мы поступали, определяя наилучшее соотношение растворов аминокислот. Оптимальную объёмную долю холин-хлорида определяли, добавляя разные объемы его к комплексонатно-аминокисяотиому рецепту.

Определение сохранности акросомального чехлика ц, опытной и уои-урояьдай средах, а также активности вуклеаз еащ сред, жрлжз.

Важным условием достижений высокого процента оилодотворепия, является наличие у наибольшего числа спермиев неповреждённого в результате замораживать -оттаивания акросомного аппарата, так как содержащиеся в кем ферменты пвдуронидаэа я акршии играют важную роль в обеспечсшш продвижения спермия к прозрачной оболочке яйцеклетки и её разжижения. Поэтому среда в большей степени сохраняющая данную структуру должна обладать и лучшей опло дотворяемоетью. Сохранность акросом мы определяли акроскопиче-ским методом разработанным И.И, Сокололской и др. (экспресс метод определения оплодотворяющей способности живчиков),

Нуклеазную активность семени, сред, желтка определяли по степени деградации кошролыюго образца ДНК (ш длине в процентах). В качестве субстрата исполшсваии ДНК фага Я. Электрофорез продукта» гидролиза ДНК проводили по методике описанной Кузнецовой И.В. (Кузнецова Й.В., Кузнецов А.В. и др., 1993). Определение активности других ферментов проводили: про-тооднтическая активность - но методу Аксона; активность пероксидазы определяли по методу ГШ, Симакова; амилазная активность определялась по методу Вольгемута; активность каталазы исследовали но методу Баха и Зубковой; но методу Мета определяли активность липазы. Опыты проведены при совместном участии сотрудника биологии воспроюдадсщад сельскохозяйственных животных А.В. Чичилова.

Изучение влияния времени охлаждения семени на качество живчиков росле заморазкшшшя-отгаивания д их оплодотворяющую способность.

Целью данных исследований служило определение оялшального времени выдержки семени при плюс 2 - 4" С (времени эквияибрации).

После разбавления семя расфасовывали в солоищшш а разделяли на следующие группы;

] группа - семя разбавляли ком! Елексонатиой средой, содержащей глицерин, и охлаждали 1 час при температуре + 4° С.

2 группа—аналогично первой но охлаждали семя 2 часа;

3 группа - аналогично первой, но охлаждали семя 3 часа;

4 )руша - аналогично первой, но охлаждали семя 4 часа;

5 группа - аналоги но первой, ш охлаждали семя 5 часов;

6 группа - аналогично первой, но охлаждали семя б часов;

7 группа - контроль, Для контроля служило семг, разбавленное лакчозо-желточной средой, содержащей пшцершь Перед замораживанием его выдерживали о холодильники при + 4® С в течение 4 чей®.

Нзуч но-произвол стаенньш опыт по осеменешгео животных.

По окончании лабораторных опытов, в которых были выяснены условия, необходимые для замораживания семени быков в разработанной нами синтетической среде, был поставлен научно-производственный опыт в хозяйствах Плавского района Тульской области к Подольского района Московской области.

Для осеменения использовали семя поело оттаивания с оиеккой не шже А бад-лов. Коров « подопытные и шгтрольные ¡руппы подбирали по принципу аналогов.

Опыт проводши по следующей схеме:

1. Группа ~ обычное разбавление ЛГЦЖ (лакгозо-щпрат-глнцершю-желточная) средой. Охлаждали 4 часа и замораживали в форме гранул (контроль).

2. Груш га - для разбавления применяли комплексе! штную среду. Семя также охлаждали 4 часа к замораживали в форме гранул (опит).

3. Группа - то же, что и группа №1, только семя замораживали в соломинках (контроль).

4. Группа - аналогично груш к №2, но сели замораживали в соломинках (опыт). Ежедневно осеменяли коров ректоцервикапъным способом, контрольным и подопытным семегюм. Опыт по осеменению животных проводили по следующей схеме:

I Наименование Число осеме-1 Иї лих по- Стельных Пршшг

групп опыта ненных ЖИ- | пторіші 0X0- через 60-90 стельних

1 вопгых |ТУ дней

Результаты осеменения учитывали по:

1. Проценту коров не повторивших охоту после первого осеменения;

2. Итогам ректального исследования спустя 60-90 дней после первого осеменения.

3. Результаты собственных исследований.

3.1. Определение оптимального состри синтергческой, среды лля разбавления и

Пол ожительное влияние отдельных хомшгексонатов металлов в составе синтетических сред для замораживания семени быка бшо установлено еще в 1982 году в исследованиях В.К. Мшюванова и Л,С. Жильцовой. Среда, сконструированная ими на базе юмпяексонатоа кальция, меди и цинка дала в опыте швьнншие оплодотворяемоега коров по сравнению с лакгозной средой. Вместе с тем, продолжения и широкого производственного шпыташш эта исследования не получили. Первоначально мы установили изотоническую концентрацию всех комплехсонатов металлов для семени быка криоскопия еским (расчётным) и биологическим методами.

Поденные данные гю определению живучести семени быка в юотоннчных растворах комплекса шов кальция, цинка и меди при 37° С по средним данным 5 опытов представлены в таблице 1

Таблица 1

Живучесть семени быка в изотоничных растворах компяексенатов при 37й С

(а-5)

Комплексонаты Изотопическая концентрация (%) Живучесть и часах. Абсолютный показатель живучести.

Кальция 3,9 5,0*0,5 2,12±0,2

Цинка 4,0 5,2±0,7 2,48±0,2

Меди 4,1 4,0*0,5 2,1±(3,2

Лактоза (контроль) 11,5 5,0±0,5 2^2±0,3

Данные таблицы 1 показывают, что наивысшей живучестью обладает семя быта в растворе шмшкксоната щшка - 5,2; в контроле -5,0. Абсолютный показатель живучести в комплексе! ше цшжа был 2,48, то есть несколько выше, чем в растворе комнлешлща меди, но немного ниже данного показателя в лактозе.

Далее мы установили влияние различных концентраций комплексонатон цинка, кальция и меди на подвижность и живучесть датчиков быка после заморажива-гая к оттаивания. Сем« замораживали в соломинках, абсолютный показатель живучести определяли при температуре +37° С. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

з

Таблица 2

Влияние на подвижность и живучесть сперматозоидов быка после замораживания и оттаивания растворов комплексодатов раз пой концентрации.

<п=5)

Концентрация растворов (%) Подвижность сперматозоидов в среде (баллы) Абсолютный показатель живучести в среде

2п ЭДТА СаЭДТА СиЭДГА! 2п ЭДТА Са ЭДГА СиЭДТА

3,7 2,0 2,0 2.0 3,1 ±0,1 1,5 ±0,4 0,8 ± 0,2

3,9 3,0 2,0 2,0 3,3 ±0,3 3,8 ±0,2 1,0 ±0,3

4,1 3,0 3,0 2,0 3,6 ±0,2 2,3 ±0,1 1,3 ±0,3

4,3 3,0 3,0 2,0 3,7 ±0,1 2,9 ± 0,2 1,8 ±0,2

4,5 4,0 3,0 3,0 4,3 ± 0,3 3,7 ±0,2 2,1 ±0,2

4,7 4,0 3,0 3,0 4,8 ±0,3 3,9 ±0,1 2,6 ±0,1

4,9 5,0 4,0 4,0 6,2 ±0,2 4,0 ±0,3 3,1 ±0,3

5,1 5,0 4,0 4,0 6,3 ± 0,3 4,4 ±0,3 4,4 ±0,3

5,3 4,0 4,0 4,0 5,2 ±0,1 4,7 ±0,2 3,7 ±0,2

5,5 3,0 5,0 3,0 3,9 ± 0,2 6,7 ±0,4 2,4 ± 0,4

5,7 3,0 4,0 3,0 3,5 ±0,2 5,0 ±0,3 1,7 ±0,1

5,9 2,0 3,0 *> 3,4 ± 0,4 4,2 ± 0,3 1,5 ±0,4

Из данных таблицы 2 видно, что подвижность и живучесть семени после глубокого замораживания в растворах комшекоонатов цинка, меди и кальция, близких но концентрации к расчётной изотонии, несколько изменились под влиянием введения глицерина. Сперматозоиды после оттаивания обладали лучшей подвижностью и живучестью в 5,0 % -ном растворе комшексошта шшка, 5,1 % -ном растворе комшгексоната меди и 5,5 % -ном растворе комлек-соната кальция.

Для дальнейшего определения состава среды, с учётом полученного влияния на изотонию глицершіа, нами Сила изучена возможность оптимального сочетания трех компоненто» (цинка, кальция и меди ЭДГА) в средах для замораживания.

При раэбавлешш ссмеїга, предварительно оценённого по активности и концентрации, мы использовали растворы вышеуказанных комплексонатов при всех возможных их сочетаниях и соотношениях через 10 % по методу треугольных систем (по Милованову В.К., 1962). Результаты исследования показаны в графике I,

Из данных полученных при использовании метода треугольника с интервалом 10 % (график 1) видно, что наилучшие условия для жизни живчиков (по сохранению ими подвижности и іфодолжительности выживания при +37" С), обеспечивает раствор, находящийся в 39 варианте, СО следующим соотношением изотонических концентраций комплексонатов:

- Э ДТА Са - 20 %

- ЭДГА Си-20%

- ЭДТА 7,п - 60 %

График треугольной диаграммы для комплексонатов металлов СаЭДТА, гпЭДТА, и СиЭДТА с интервалом 10 %.

СаЭДТА

График № 1. Треугольная диаграмма для изучения состава среды.

5а >3,5

Ба >3,0 ішш

5а >2,5

5а <2,5

ю

На основании этих данных, в лабораторных опытах нами были получены оптимальные сочетания трёх комплексен атов в среде для замораживания семени быка. Пересчитав объёмные соотношения на весовые, мы получили следующий вариант комплексоматной синтетической среды для разбавления семени быков (на один литр дистиллированной воды):

- ЭДТАСа- 11,8 г

- Э ДТА Си - 11 г

- ЭДТА 2л - 30 г

Результаты наших исследований совершенно совпадают с результатами опытов, полученными Жильцовой Л.С. и др. в период с 1982-1987 годы н проверенными по результатам осеменения коров спермой замороженной при таком сочетании комплексонатов.

Последующие наши усилия были направлены на добавление к комплек-сонатной основе аминокислот (лизина, метионина и бетаина), а также витамина В4 - холнн-хлорида. С использованием криоскопического метода 11 последующим уточнением с применением биологического метода были определены изотопические концентрации искомых аминокислот предлагаемых при конструировании новой среды. В результате для искомых аминокислот мы получили следующие изотонические растворы: изотонический раствор лизина - 4,86 %; метионина - 3,9 %; бетаина - 4,4 %; и холин-хлорида - 3,56 %.

Методом встречных рядов мы попытались ввести в состав комплексонат-ной синтетической среды новые биологически активные вещества - аминокислоты: лизин, метионин, бетаин и витамин В4 - холин-хлорнд. Примеры введения этих веществ, приведены в таблицах № 3 - 6. При разбавлении семени для замораживания к опытной среде добавляли по 20 мл желтка и 10 мл глицерина. Семя замораживали в соломинках.

Таблица 3

Биологический уровень лизина в среде для замораживания семени быка (изотонический раствор лизина 4,86%). (п= 12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 г 9 10 1! 12

Среда с комплек-сокатами % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р. ли зима 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100

Подвижность све-жеразбавленного семени, % 80 80 80 70 70 60 50 40 40 40 40 80

Подвижность после оттаивания, % 50 55 55 45 40 35 30 15 10 10 10 50

Живучесть свеже-разбавленного(ч ас) 18 21 20 9 10 6 5 2 1 1 1 15

Живучесть оттаянного при 37°С,(час) 8 11 10 7 6 3 2 1 0 0 0 6

и

Таблица 4

Биологический уровень метионина в среде для замораживания семени (изотонический раствор метионина 3,9 %)

(п=12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Среда с комплек-сонатами % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль лгцж

Изотонический р-р. метионина 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 100

Подвижность све-жеразбзвленного семени,% 80 80 80 70 70 60 50 50 50 50 50 80

Подвижность по-слеоттаивания, % 50 55 55 45 40 40 40 30 20 15 10 50

Живучесть свеже-разбав ленного (час) 18 23 22 16 15 8 5 3 1 1 1 15

Живучесть оттаянного при 37° С, (час) $ 11 10 7 6 4 2 1 0 0 0 6

Из данных таблицы 3 видно, что лучшей подвижностью и живучестью обладают живчики, если в растворе сочетаются 90 % комплсксонатов и 10 % лизина. Были также проведены исследования по более точному биологическому уровню с интервалом 5 %. В результате проведённых исследований методом биологического контроля, нами был определен уровень лизина в средах для замораживания семени быка, который равен 10 % от изотонии.

Данные таблицы 4 свидетельствуют, что сочетание 10 % метионина и 90 % комплексонатов наиболее благоприятно сказывается на жизнеспособности сперм пев, а это значит, что биологический уровень метионина в средах для замораживания семени быка равен 10% от 3,9 % изотонического раствора.

При определении биологического уровня для бетаина лучшие результаты были получены с применением более точного исследования с интервалом в 5 %, о чём свидетельствует таблица 5. Отсюда следует, что 5 % от 4,4 % изотонического раствора бетаина является его биологическим уровнем в средах для замораживания се мен и быка.

Таблица 6 показывает, что биологический уровень холи к-хлорида в средах для замораживания семени быка равен I %.

Таблица 5

Биологический уровень бетаина в среде для замораживания семени (ида топический раствор бетаина 4,4 %)

<п=12)

На Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 !

Среда с комплексом атам и % 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р. бетаина 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 100

Подвижность све-жеразбав ленного семени, % 80 80 75 75 70 65 60 60 60 55 55 80

Подвижность после оттаивания. % 50 55 55 50 50 40 40 35 35 35 30 50

Живучесть свеже-разбавленного (час) 18 23 22 16 15 12 П 9 8 7 6 15

Живучесть оттаянного при 37° С, (час) 8 9 8 7 6 5 4 4 3 3 2 6 .....

Таблица 6

Биологический уровень халин-хлорида в среде для замораживания семени (изотонический раствор холин-хлорвда 3,56 %) (п=12)

№ Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Среда с комклек-сонэтами % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль ЛГЦЖ

Изотонический р-р, холин хлорида 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100

Подвижность све-жеразбавленн ого семени, % 80 80 80 70 70 55 40 35 30 20 20 80

Подвижность после оттаивания, % 50 55 50 50 50 35 20 15 4 10 1 10 1 ЕП 1 50 15

Живучесть свеже-разбавленного (час) 18 21 20 12 10 5 4

Живучесть оттаянного при 37" С, (час) 8 12 И 6 5 3 2 I 0 0 0 6

Дальнейшее совершенствование новой синтетической среды проводилось посредством введения в состав новых компонентов. Установление биологического уровня исследуемых аминокислот проводилось методом треугольника по Милованову В.К.. Целью применения данного метода являлось определение оптимального соотношения изотонических растворов аминокислот, необходимых для прибавления к комплсксонатнон основе. Расчетными явились изотонические растворы для: лизина - 4,8 % (А), метионина - 3,9 % (В), бетаина - 4,4 %<С).

Был проведён 21 опыт определения живучести в смесях по методу треугольника с интервалом 20 % изотонических растворов указанных выше аминокислот. Результаты исследования эффективности разных сочетаний искомых аминокислот, показаны в графике 2.

11а основании данных, полученных, из графика 2 установлено, что смеси изотонических растворов - А (лизана), В (метионина) и С (бетаина) по восстановлению подвижности и выживаемости живчиков при 37" С, после замораживания-оттаивания, являются наиболее благоприятными для живчиков быка в 12-й и 17-й пробирках (таблица 7).

Таблица 7

Соотношение растворов А, В и С в пробирках с оптимальной живучестью.

(чг-ао)

Номер пробирки А В I с

12 20 60 20

17 0 80 ... і 20

Из данной таблицы следует, что после разбавления семени быка средой, состоящей из лизина, метионина и бетаина при указанных соотношениях, подвижность живчиков сохраняется в пределах 50 %, в остальных же 19 сочетаниях семя гибнет немедленно после разбавления.

Если считать пробирки № 12 и № 17 синтетическими средами, то их состав представлен в таблице № 8,

Таблица 8

Состав сред из аминокислот на 100 мл. воды.

Ингредиенты № 12 (г) № 17 (г)

Лизин 0,96 -

Метионин 2,34 3,12

бетаин 0,88 0,88

График треугольной диаграммы для аминокислот лизина, метношша и бетаина с интервалом 20 %.

Лизин

10

■-:----------{ 21

Мегионин

Бетаин

График № 2. Зоны биологических уровнен для аминокислот лизина, мстиокипа и бетаина по треугольнику с интервалом 20 %.

100 % - лизина —

100%-бетаина —

100%-метионина-

На основании выявленных зон биологического уровня на треугольнике с 20 % - ным интервалом, мы определили живучесть семсии но схеме треугольника с интервалом 10 % (график № 3 и таблица №9).

Таблица 9

Соотношение растворов Л, В и С в пробирках с интервалом 10 % к подвижность живчиков после разбавления._(пН2)_

№ пробирки А в С Активность

37 20 80 0 Н

38 20 70 10 Н

46 10 90 0 н

47 10 80 10 и

48 10 70 20 н

49 10 60 30 н

50 10 50 40 н

57 0 10 90 н

58 0 90 10 1)

59 0 70 30 н

60 0 60 40 н

61 0 50 50 н

Как видно из данных таблицы, подвижность отсугствуст во всех имеющихся соотношениях аминокислот, а это, по всей видимости, означает, что биологические уровни изотонических растворов исследуемых аминокислот лежат в пределах ог 0 до 10 %.

На основании данных полученных из предыдущей таблицы, нами были предприняты попытки, смоделировать синтетическую среду путем добавления изотонических растворов аминокислот х утке имеющейся комнлексонатиой основе (среда Жильцовой Л.С.), за счёт снижения изотоничности данной среды. Было проведено 5 опытов, подвижность неразбавленного семени - 8,0; семя замораживали в соломкнках. Результаты опытов представлены в таблице 10.

Таблица 10

Соотношение уровня изотоничности комнлексонатной среды с вариациями изотонических растворов А, В и С в пределах уровня от 10 % и ниже, (п=5)

№ Пробирки Уровень изотонического раствора (%) Подвижность (баллы)

Комплексов атная среда лизин мстио-нин Бетаин Разбавление Экв и либрация Оттаивание

1 80 3 10 7 6,2±0.1 5,1 ±0,1 2,0*0,1

2 80 2 10 8 б.2±0,1 5,1±0,1 2,3±0,2

3 90 2 4 4 б,2±0,1 5,1±0,1 2,5±0,1

4 90 1 5 4 6,2±0,1 5,1*0,1 2.4±0,2

5 100 0 0 0 7,8±0,2 7,3±0,3 4,9±0,1

1Ь

График №3 треугольной диаграммы дли аминокислот лизина, мешоиина и бетаина с интервалом 10 %.

Как видно из таблицы 10, ни в одном из вариантов среды с добавлением аминокислот не произошло улучшения выживаемости смермиев в процессе замораживая ия-отта и вания, по сравнению с контрольной комплексонатной средой. Эти данные свидетельствуют, что создание изотонии среды за счёт частичной замены комплексоматов приводит к негативным результатам но подвижности семени после оттаивания.

Исходя из отрицательных результатов, полученных в предыдущем эксперименте, в последующем мы попытались смоделировать синтетическую среду посредством объемных введений незначительного количества исследуемых веществ. Для этого к определённым объёмам комплексонатной основы, мы присоединяли различные уровни изотонических растворов аминокислот - лизина, метионина и бетаина. Нами были исследованы 12 различных сочетаний аминокислот и комплексонатов. Результаты опыта показаны в таблице 11.

Как видно из данных таблицы 11, лучшей подвижностью и выживаемостью после процесса замораживания-оттаивания обладает семя в девятом варианте синтетической среды. После 6 часов инкубирования оттаянного семени при 37е С подвижные живчики (а=1,0) были в пробирке №9 и №4, где семя обладало единичной подвижностью (Еп). Это говорит о том, что соотношение данных уровней комплексонатов и аминокислот является наиболее эффективным для сохранения живчиков при воздействии низких температур. Проведённые исследования позволили нам смоделировать синтетическую (комплсксо-натно - аминокислотную) среду, в состав которой были включены комнлексо-наты металлов - цинка, меди, кальция, и аминокислоты - лизин, метионин, бетаин.

В состав новой среды был также включён, раствор витамина В* — холин-хлорид. Для определения оптимальной объёмной доли данного витамина мы поступали следующим образом. К разработанному выше рецепту (комплексо-натно - аминокислотному) добавляли разные объёмные доли холин-хлорида, и определяли показатели качества оттаянного семени. За основу нами был взят биологический уровень холнн-хлорила, определённый в таблице 6. Данные шести опытов показаны в таблице 12.

Таким образом, из проведённых исследований было выяснено, что наилучшее качество среды для замораживания семени быка получено, как видно из данных таблицы 12, при добавлении к комплексонатно - аминокислотному рецепту витамина В* холин-хлорида в количестве 1 объёмного процента. 11ри данном соотношении обеспечивается наиболее высокая подвижность, и выживаемость заморожено - оттаянного семени при 37° С в сравнении с другими количествами данного витамина.

Таблица) 1

Живучесть семени быка при добавлении к ксмплсксонатной средс разных уровней івотоіпічсских растворов аминокислот лизина (Л), мегиоішна (В) и бстаиш (С).__<п=12)_

Объёмное соотношение в пробирках, мл Подвижность живчиков (баллы) после:

Разбавления Эквшшбрации Оттаивания 2ч при 37° С

1 - 0,9К+0,1А 8,0 7,0 4,0 2,0

2 -0,9К+0,1В 8,0 7,0 4,0 2,0

3 - 0,9К+0,1С 7,0 6,0 4,0 2,0

4 -0,85К+0,05 А + 0,05В+0,05С 8,0 7,0 5,0 3,0

5 -0,8К+0,1А +0,1С 8,0 7,0 4,0 2,0

6 - 0,8К+0, Ш +0,1С 8,0 7,0 4,0 2,0

7 - 0,8К+0Д А -Ю,Ш 8,0 7,0 4,0 2,0

8 - 0,8К+0,05А +0,05В+0,Ю 8,0 7,0 4,5 2,5

9-од-юдал + 0,1В+0,05С 8,0 7,0 5,0 4,0

Х0-0,8К+0,1А +0,05В+0,05С 8,0 7,0 4,5 2,5

П-О.Ж-ЮЛА +0,1В+0,1С 7,0 6,0 4,0 Бп

І2-І.0К 8,0 7,0 5,0 2,0

Примечание к таблице 1; «К» - сумма объёмов изотонических концентрації

комплексонатов кальция, меди и цинка.

Таблица 12

Живучесть семени быка при добавлении к комштексотатно - аминокислотной среде разного количества раствора холин-хлорида.

(п=б)

Время инкуба- Подвижность оттаянного семени и компяексонатно- ]

ции опаянного семени при 37° аминокислотной среде с добавлением разного объемного уровня холин-хлорида (баллы).

с

0% 0.5% 1,0% 13% 2,0 % 2,5%

Разбавление 8,0 8,0 8,0 7,0_| 7,0 6,5

Эквилибрааия 8,0 7.5 8,0 7,0 6.5 6.0

Оттаивание 4,0 4,0 5,0 3,5 3,0 2,5

1 час при 37°С 4,0 4.0 5.0 3,5 3,0 2,0

2 часа при 37<€ 4,0 „А? 5,0 3,0 2,5 1,5

3 часа при 37°С 3,0 4.5 _2,5 2.0 . 1,0 ..

4 часа при 3 ТС 2,5 2,5 „ 4,0 2,0 1.0 1,0

5 часов при 374: 2,0 К5 3,5 1,0 1.0 Еп

6 часов при 1 1,5 1,0 3,0 0,5 Гш Еп

Пересчитав объемные соотношения, подученные нами в результате всех вышеприведённых исследованиях на весовые, мы смоделировали новую синтетическую среду для замораживания семени быка, которая выглядит следующим образом (на один ліпр дистиллнровашюй воды):

- Са ЭДТА - 11,8 (г)

- Си ЭДТА —11 (г)

- 2п ЭДТА-30 (г)

- Ліпші - 1Д (г)

- Мстионин- 1,95 (г)

- Бетаин -2,2 (г)

- Хшши-хлорнди 10% р-р. —10 (мл)

- Глицерин -100 (мл)

- Желток куриных яиц-200 (мл)

3.2. Определение,.сохргпшосга акросома.тыюго чехлика в ошлтной и контрольной средах, а также нуклеачпои активности семени, сред, желгка.

Далее нами было проведено сравшгтелыюе испытание качественных характеристик шной среды для замораживания семени быка н опытах вне оргагшзма. Последующие серии опытов мы направили на определение такого важного момента у замороженпо-отгаяиного семени, каким является целостность акросо-малыюго чехлика. От сохранности акросом зависит биологическая полноценность

ЖШЧИКОВ, (IX оплодотворяющая способность. В результате, вполне закономерным является тот факт, что среда наилучшим образом сохраняющая акросому будет' обладать и наилучшей фертилыгостью.

Соотношение живчиков с нормальной и разрушенной акросомой в новой синтетической среде и средс контрольной (в качестве контроля использовали лак-тозную среду) показано в таблице 13,

Таблица 13

Соотношение живчиков с нормальной в разрушенной акросомой в контрольной и опытной средах после замораживания - оттаивания. (п=10)

Среда Живые живчики Неподвижные живчики

Целая а кросом (%) Разрушенная акросома (%) Целая акро ____ 0,7 ±0,6 Разрушенная акросома (%>

Опыт 99,5 ± 0,3" 0,5 ± 0,3 99,3 і 0,6

Контроль 97,3 ± 0,5 2,7 ±0,5 5,9 ± 0,4 94,1 ±0,4

1 Различия достоверны по сравнению с контролем Р <0,01

Как видно из данных таблицы 13, опьшш комплсксокатггая ерзда способствует лучшей сохранности акросомального чехлнка. Посте замораживания в ней только 0,53 % подвижных живчиков имеют разрушенную акросому, тогда как в контрольной лактосшой среде данный показатс.ть равен 2,7 %. Только 0,7 % мертвых сперматозоидов в комплексонатной среде имеют целую акросому, тогда как в лактоз вой этот показатель выше и равен 5,9 % соответственно. Данное преимущество опытной среды над контролем является вполне существенным плюсом, способствующим увеличению оплодотворяющей способности сперматозоидов.

В последнее время появились работы в которых указанно, что при глубоком замораживании может происходить трансформирование Д1Ж живчиков (В. Багаров, 1997; Т. Щит, 1998). Так же было замечено, что добавленный в сред)' для замораживания жедатж куриного яйца, способствует повышению активности нуклеаэ (Н.З, Жильцов и др., 2001, 2002). Как показано на рисунке г в желтке куриного яйэд (пробирка 3 и 4) уже п первую минуту инкубирования была зафиксирована высокая нуклеазная активность, тогда как в семенной плазме (пробирка 2) ДНК фага X расщеплялась через 1 час инкубации.

Наибольший интерес в борьбе с нуклеазиой активностью представляют работа с применением в стандартной и новой средах ингибитор«® на основе ЭДТА. Проведённые исследования динамики активности ферментов в синтетических средах для замораживания темени быка с добавками лактозы, хояин-хлорида, комплексоштов меди представлены в таблице 17.

Рис 1. Электрофорез продуктов иухролиза ДНК фага к: дорожка 1 -ДНК фага X.; дорожка 2 -гидролиз ДНК фага X в семенной плазме быка, дорожки 3 и 4 -гидролиз ДНК фага ?. в желтке куриного яйда.

Как видно из рисунка № I, желтке куриного яйш (пробирка и 4) уже в первую минуту шпсу-бнроЕкшия была зафиксирован высокая нукеазная активность, то гда как а семенной плазме (про Сирка 2) ДНК (fiara А. расщеплялась через 1 час инкубации

12 3 4

По данным, отображЄнтлм в таблице 17, которые мы получили на основа-шш проведённых опытов, было установлено, что наименьшая сгешпъ нуклеаэ-ной активности среды наблюдалась в случае добавок комшексонатоа меди и разных объемов холил-хлорида.

Таблица 1

Нуклеазная активность стандартной срсды для замораживают семени бика с

добавками:______________________

Ингредиенты І Деірадация контрольного образца ДН ! I в % ! | 94 ¿ 1,6 ]

Лактоза (стандарт)

Лактоза + холил 0,2 мл i 64 ± 3,0 і

Комплексонат меди і 50 ± 2,3

Комплексонат меди + холин 0,2 мл і з ± 1,1 !

Комплексонат меди + холин 0S1 мл І 20 ± 2,4 1

Выше проведенные исследования подтверждают, что используемые в новой синтетической среде компоненты способствуют снижению пуклеазной активности желтка куриного яйш, а, следовательно, и уменьшают степень деградации ДНК живчиков. Возможно, что это будет способствовать лучшей еохрш [носи! геясгаческого материала спермиев, замороженных в новой комгпексоштной среде.

3,3. Сравнительное иеггитание уинтетнческих срел для разбавления и замораживали семени в соломинках и грандах.

Мы провели сравните.илюе испъгшше качественных характеристик новой синтетической сродн (комплсксонагаой) для замораживания ссмснн быка а опытах вгк организма. Результаты сравнительного испытания приводятся в таблице 18.

Таблица 18

Качественные показатели оттаянного семени быка, замороженного в новой (комшіексонатдай) сшггетичесхой среде в еравнеіши с показателями контрольной лактадной среды.

__(а=10)

Показатели качества семешс

Способ замораживания Подвижность после раз-бавлення (баллы! Подвижность после оттаивания іфшпй Подвижность после 5 часо инкубации при +37°С Макс»- ! Сохран- ] малыш і ность ак- ] вшкивае- 1 росом в мостъ при 1 (%) +37^ 1

Опыт (комплексо-наглая среда, Соломинки) 8,0 ±0,1 5,9 ± 0,2і 2,6 ±0,1 г 10,5 ±0,3 188,3 ±0,4

Опыт (камплексонатная среда, Гранулы) 8,0 ± 0,1 5,7 ± 0,1і 2,3 ± 0,3 10,2 ± 0,2 88±0Д

Контроль (лактозиа среда, Соломинки) 8,0 ± 0,1 8,0 ±0,1 5,5 ±0,1 5,4 ± 0,1 2,2*± 0,2 9,1 ±0,3 80,5 ±0,1

! Контроль (лактоз на ! среда, ¡Гранулы) 2,0*± 0,3 18,9 ±0,3 80,5 ± ОД

| * Для оценки подвижности семени в контрольной среде пользовались 3 % 1 раствором цитрата натрия. [ * Различия достоверны по сравнению с контролем Р < 0,05

Как мы видим ю данных таблицы 18, качество новой (опьгпюй) среды, по отделышм показателям сравнимо, а по некоторым превосходит показатели качества семени, замороженного в контрольной, лактгоной среде. Например, по активности живчиков после оттаивания и особенно но скорости движения (большее число живчиков в дозе для осеменения с сулерактішгосгью), а также по живучести оттаянного семени прн температуре тела, которая в опытной среде больше на 1,4 часа, да сравнению с контролем. Лучшая сохранность акросомадыюш чехли-ка живчиков после замораживания свидетельствует о более высоких протекторных свойствах комплексопатыой среды.

Несомненно, что практические работники отдадут предпочтение той среде, которая будет универсальной, то есть пригодной для замораживания семени и в соломинках и в гранулах. Данные таблицы 18 показывают, что предложенная нами синтетическая среда дм разбавления и замораживания семеии быков-производителей впаяне пригодна для замораживания семени и тем и другим способами.

3.4. Влцянре различней продолжительности периода ?квилибранин семени при +2 +4" С. на кячеагоо жшто1)р после,замораживания-отбивания. Чтобы лучше использовать дополнительные возможности, разработанной нами среды, было проведено исследование по определению времени о(ггимального для охлаждения семени при температуре +2 - +4° С. Возможность улучшения качества заморожено-оттаянного семени за счет умстЕьшения или наоборот увеличения периода эквилибрации была изучена посредством разбавления семени повой и контрольной средой и замораживания ею (в соломинках), после 1; 2; 3; 4; 5; и б часов эхвилибрацин в холодильнике (таблица 19)

Таблица 19

Подвижность и переживаемость живчиков быка после замораживания семени в зависимости от времени предварительного охлаждения его при +2 - +4° С.

Время оклаждени семени при +2 +4" С, (час) Подвижность живчиков (баллы):

В свежеполу-ченном семей После охлаждения После отгаива! После 5 часов ния | при +37аС

1 8,0 ±0,1 7.3 ±0,1 3,0 ±0,2 Еп

2 8,0 ±0,1 7,4 ± 0,1 4,2 ±0,3 Еп

3 8,0 ±0,1 7,6 ±0,1 5,5 ±0,1 1.0

4 8,0 ±0,1 7,5 ±0,1 | 5,3 ±0,1 2,5_

5 8,0 ± 0Л 7,3 ±0,1 1 4,0 ±0.3 1,0 ~

6 8,0 ±0,1 7,5 ±0,1 ! 4,4 ±0,1 Еп

Контроль 8,0 ±0,1 7,5 ±0,1 ! 4,9 ±0,1 2,0

После замораживания и оттаивания семени подвижность живчиков была выше во всех опытных группах по сравнению с контролем. Лучшие результаты по восстановлению подвижности были получены, когда семя выдерживали при температуре +2 - +4° С в течение 3 часов. Однако как показали дальнейшие исследования, после выдержки оттаянного семени в термостате при температуре +37° С, через 5 часов инкубации лучшая подвижность сохранялась только в опытных образцах, охлаждённых в течение 4 часов, а также в контроле. Другие опытные образцы, уже после 2-х часов инкубации в термостате имели плохую или единичную подвижность. Из таблицы 19 можно сделать вывод, что для новой среды вполне подходящим временем охлаждения нри температуре +2 - +4" С, при котором ссмя наиболее долго сохраняет подвижность, является период эквилибрации, используемый при замораживании семени в лактоэнон срсде и равный 4 часа.

11аучно-про)шолственный.<зпыт по осеменению коров.

Нами было проведено изучение оплодотворяющей способности семени быка, по осеменению коров, семенем, замороженным в предложенном варианте хомплехоонатно - аминокислотной синтетической среды и ЛЦГЖ (лактозо - цитрат - глицерина - желточной) среды. Опыт был поставлен па Еринской ферме совхоза «Знамя Подмосковья», Подольского района Московской области, опыт-пом хозяйстве Всероссийского Научно - Исследовательского института животноводства (ОПХ «Клбново-Чегодасво»), и совхозе «им. К. Маркса», Планского района Тульской области. При расфасовке семени предназначешюго да осеменения

24

в совхозах «Знамя Подмосковья» и ОПХ «Кдй юво-Чегодаево», использовали соломинки, а для совхоза «им. К. Маркса» - гранулы. Результаты по осеменению коров представлены в таблицах 21 и 22.

Таблица 23

Результаты искусственного осеменения коров семенем, замороженным

в соломитах.

Группа опыта Осеменено коров Стали стельными от первого осеменения Процент Стельности М±т

Комплексонатвая среда (опыт) 34 19 55,9 ± 7,6"

Лакгоаная среда (контроль) 70 28 40,0 ±5,8

•Различия блшга к достоверной по сравнению с контрольной группой (Р < 0,05).

Таблица 22

Результаты искусственного осеменения коров семенем, замороженным в гранулах.

[ Группа опыта Осеменено Стали стельными от Процент

( коров первого осеменения Стельности

1 i М±т

j Комплексояатная среда

! (опыт) 214 123 ,57,4

j Лакгозная среда (коп-

! тродь) 1S4 87 47,3 ± 3,6

•Различия достоверны по сравнению с контролем (Р< 0,05).

Результаты искусственного осеменения коров, как видно за данных таблиц №21 и № 22, выше, при использовании комшюксонатао - аминокислотной среды, по сравнению с применяемой лая этих же целей лактозо - цитратно - гащерзно -желточной среды (ЛЦГЖ). В среднем эти различия составили 15,9 % нри исподь-зовагпш соломинок, и J0,1 % если для замораживания семени применяли гранулы. Однако данные, полученные яри осеменении коров семенем, замороженным в соломинках можно призиать только условно достоверными. Полученные дакпые доказывают универсальность новой среды и се пригодность для различных способов замораживания (как в гранулах, так и в соломинках).

Выводы.

1. Основу сред для разбавления и замораживания семени быка могут составлять комичсксоваты кальция, цинка, меди с этилендиамитетрзукеуспой ки-

2. Добавление к комплсксонатной основе таких аминокислот как лизин, ме-тионин и препарат бетаин, а также витамина Вл - холин-хлорида в определенных объёмных долях их изотонических растворов повышает протскшв-ные свойства среды, способствует лучшей сохранности замороженно-оттаянных сперматозоидов.

3. В средах для замораживания семени быка, включающих в аюем составе желток куриного яйца, отмечается высокая нуклеазная активность, которая может быть заметно снижена включением в их состав комплексонатов и холин-хлорида.

4. Разработанная нами синтетическая среда комплексопатао-ашпкжислогно-витамино-пвщерино-желточная для разбавления и замораживания семени быков-проговодителей в полимерных соломинках и гранулах позволяет:

а) Улучшить подвижность, длительность жизни, сохранность акрооомального чехлика живчиков после опаивания, снизить активность нуклеаз желтка куриного яйца в сравнении с лактозо-щпратно-желгочно-ппщериновой средой;

б) Повысить процент стельности у коров после первого осеменения на 10,1 % при замораживании в гранулах и на 15,5 % при замораживании в соломинках по сравнению с синтетической средой ЛЦ£"Ж (57,4 ± 3,3 и 47,3 ± 3,6, соответственно Р < 0,05, гранулы,).

Практические предложения.

С целью улучшения результативности искусственного осеменения коров и тёлок провести широкое производственное испытание разработанной нами синтетической среды (комплсксонатной) для замораживания семени быков, как в соломинках, так и в гранулах.

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Паныпин С. С. Использование новых синтетических сред для замораживания семени быка./ Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» ФГОУ РАМЖ. - 2002. - Вып. 8. - С, 70-71;

2. Паныпин С.С. Моделирование новой синтетической среды для замораживания семени быка./ Материалы научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» ФГОУ РАМЖ. - 2001.- Выл7,- С. 80-82;

3. Жильцов Н.З., Субботин А.Д., Голубь B.C., Чичилов A.B., Пага>шин С.С. Усовершенствование технологии глубокого замораживания семени быка,// Наше племенное дело. - 2002. Ks 2. С, 10-12,

слотой.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 27)65-14-24, (8 - 27) 63-14-07

Сдано в набор 3.11.2003. Подписано в печать 4. И .2003 Заказ № 22. Псч. л. 1,1. Тираж 100 экз.