Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические и технологические аспекты повышения воспроизводительной способности животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические и технологические аспекты повышения воспроизводительной способности животных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

с. .Ф^

ВсерЬссийский научно-исследовательский институт \ животноводства (ВИЖ)

Л 4

V

На правах рукописи

ГУСЬКОВ Алексей Михайлович

УДК 636.22.28.082.453

* ФИЗИ0Л0Г0-БИ0ХИМИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ ЖИВОТНЫХ

03.00.13-ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДУБРОВИЦЫ- 1993

Работа выполнена в лаборатории биологии воспроизведения Молдавского научно-исследовательского технологического института животноводства и ветеринарии и лаборатории криобиологии Института физиологии ЛН РМ.

Научный консультант — доктор биологических наук,

профессор В. А. НАУК

Официальные оппоненты: д. б. н., проф. Ю. Д. КЛИНСКИЙ,

д. в. н„ проф. Н. Н. МИХАЙЛОВ, д. б. н„ проф. М. И. КЛОПОВ

Ведущая организация — Российский зоотехнический институт повышения квалификации и переподготовки кадров.

Защита диссертации состоится ь/С > < —1993 г.,

в 10 часов, на заседании специализированного/ховета Д 020.16.02 при ВНИИ животноводства.

Адрес института: 142012, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан »—« --1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета к. б. н.

И. И. шмыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наиболее полное удовлетворение потребностей ладей в продуктах питания и промышленности в сырье во многом зависит от интенсификации воспроизводства сельскохозяйственных животных. Решение этой проблемы связано с увеличением эффективности реализации генетически детерминированных репродуктивных возможностей животных,что,в свою очередь, сопряжено, во-первых, с выяснением фундаментальных механизмов, происходящих в спермиях процессов при их хранении вне организма, регуляции репродуктивной функции и ее нарушений, во-вторых, с выяснением причин снижения функциональной полноценности спермивв при криоконсервации и воспроизводительной способности животных в различных условиях разведения, в-третьих, с выявлением возможностей целенаправленных воздействий на эти механизмы, изысканием подходов к управлению ими, а, в-четвертнх, с разработкой высокоэффективных биотехнологий воспроизводства сельскохозяйственных животных.

В этом направлении достигнуты значительные успехи. Открыты метод хранения спермы при ультранизких температурах и механизмы нвйро-эндокрянной регуляции воспроизводительной функции, разработаны эффективные технологии криоконсервации спермы и воспроизводства разных видов животных.

В то же время, остаются не до конца выясненными основные механизмы криогенных повреждений и протекции спермиев, их адаптации к низким температурам. Ни одна из выдвинутых криобиологами гипотез не.получила исчерпывающего экспериментального подтверждения. Около половинй спермиев не восстанавливают своих функций после замораживания-оттаивания. Использование криоконсервированной спермы при воспроизводстве овец и свиней крайне ограничено. Не в полной мере установлены роль существенных для организма факторов внешней и "внутренней среды в проявлении репродуктивной функции, значение стрессов в воспроизводстве стада. Не исчерпаны резервы профилактики и терапии бесплодия, а также повышения эффективности'способов стимуляции воспроизводительных возможностей животных. Отсюда цель и задачи наших исследований.

Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в изучении влияния различных факторов на функциональную полноценность спермиев и воспроизводительную функцию животных,а так-

ке в разработке способов повышения эффективности воспроизводства сельскохозяйственных животных.

Для достижения цел намечалось решение следупцих задач:

1. Изучить ^пядин* состав плазматических мембран и его связь с функциональной полноценностью спермиев быка, барана н хряка при криоконсервации.

2. Выяснить влияние факторов эндогенной и экзогенной природы на липиды и морфофизиологические показатели спермиев.

3. Испытать мембраноактивные соединения при разработке способов сохранения спермиев вне организма.

4. Выяснить влияние стрессоров различной природы на воспроизводительную способность животных и наметить пути ее повышения.

5. Разработать технологию воспроизведения овец.

6. Разработать способ повышения воспроизводительной способности крупного рогатого скота.

Натчная новизна работы. Методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии установлены видовые особенности ли-пвдного состава плазматических мембран спермиев быка, барана и хряка до и после криоконсервации спермы. Выявлены корреляции между содержанием отдельных фракций лишдов в плазматических мембранах спермиев и их физиологическими показателями. Показано, что низкие температуры вызывают в сперми» ях быка, барана и хряка активацию фосфолипаз и процесса пе-рекисного окисления лшщцов (ГОЛ). Доказано, что криорезис-тентность спермиев связана с их адаптивными возможностями. Мембраноактивные препараты, относящиеся к антиоксидантам (ыекоидол, амбиол, мелонгозид, ОП-6, СК-4, СК-5, Ш0-50,ин-дандион), регуляторам проводимости (2,4 динитрофенол), детергентам (тритон Х-ЮО, эмульсияг ненасыщенных жирных кислот) и к средствам комплексного действия (общие липиды ак-тиномицетов и дрожжей, фосфолищды кандиды), повышают устойчивость спермиев к низким температурам.

Выявлено влияние стрессоров различной природы на воспроизводительную функцию и показано, что антиоксиданты амбиол и СК-5 снижают уровень ПОЛ в крови животных и повышают их репродуктивную способность. Эти препараты способствуют нормализации гормонального статуса животных.

Разработаны среды для криоконсерващпт сперли быка (а. е. № 1634268), барана (а.с. № 1498489 и Jt I5408I7) и хряка (а.с. Л II38I49 и №. II434I3), а также средство для повышения воспроизводительной способнооти животных (положительное решение БНИИГПЭ от 26.02.91 на -выдачу а.с. по заявке * 4774697) и стимулятор репродуктивной функции животных (положительное решение БНИИГПЭ от 28.II.91 на выдачу а.с. по заявке й 4929301).

Практическая значимость. Результаты экспериментальных исследований дополняют современные знания о структуре и функции биологических мембран в различных условиях о кружащей среды, о структурной организации плазматических мембран спер-миев быка, барана и хряка, о значении липвдного компонента биомембран в функциональной полноценности клеток, о роли z механизмах развития процесса ПОЛ в биологических объектах, о характере действия мембраноактивных веществ с разными мем-бранотропными эффектами на физиологобиохимические показатели спермиев, о влиянии факторов различной природа на репродуктивную способность животных, об особенностях ее проявления и механизмах регуляции, о роли антиоксидантной системы в этих механизмах, о механизмах действия антиоксидантов различной природы.

Материалы работы использованы при разработке следующих методических рекомендаций: "Система.воспроизводства крупного рогатого скота" (Кишинев:Молдагроин$ормрекпама, 1989) ; "Технологическая схема воспроизведения высокопродуктивных коров" (Кишинев:Молдагроинформреклама, 1991) ; "Организация воспроизводства сельскохозяйственных животных в Молдове" (Кишинев, 1991) ; "Рекомендации по технологии производства продукции овцеводства" (Кишинев:Молдагроинформреклама,1992): "Адаптивная технология получения, криоконсервации и использования семени барана" (Кишинев:Молдагроинформреклама,1992).

"Адаптивная технология получения, криоконсервации и использования спермы барана" и "Способ повышения воспроизводительной способности животных" внедрены в производство и успешно применяются в практике.

Аптюбапия раббты. Основные положения диссертации доложены и обсуздены на II съезде физиологов МССР (Кишинев,1980), конференции молодых ученых АН МССР "Молодежь и научно-техни-

ческий прогресс" (Кишинев, 1982), 1У Всесоюзном симпозиуме по биохимии липвдов (Киев, 1983), Х1У съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова (Баку, 1983), Всесоюзной конференции "Стресс-, адаптация и функциональные нарушения" (Кишинев, 1984).Всесоюзной конференции "Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических объектов" (Харьков, 1984), III съезде физиологов МССР (Кишинев, 1985), II Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1986), У съезде генетиков и селекционеров Молдавии (Кишинев, 1987), ХУ съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987), У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987), III Всесоюзной конференции "Биоантиоксвдант" (Москва, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа" (Киев, 1989), Международной конференции "Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных" (Калуга, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Физиология продуктивных животных решению продовольственной программы СССР" (Таллин, 1990), конференциях по овцеводству (Ставрополь, 1991, 1992), Всесоюзной научно-технической конференции "Использование гормональных препаратов в животноводстве" (Дубровицы, 1991), научно-производственной конференции "Проблемы интенсификации производства молока" (Минск, 1991), Всесоюзной конференции "Стресс, адаптация и дисфункции" (Кишинев, 1991), Международной конференции криобиологов (Харьков, 1992), 17 Всесоюзной конференции "Биоанти-оксидант" (Москва, 1992), заседаниях Ученых советов Института физиологии АН РМ (1978-1989) и Молдавского научно-исследовательского технологического института животноводства и ветеринарии (1989-1992), НТС МСХиП РМ (I988-I99I), комиссии "Медикамент" (1992), республиканских, научно-практических конференциях и семинарах (1978-1992).

Работа удостоена Первой премии Президиума Академии наук Республики Молдова.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 70 научных работ.

На защиту выносятся следующие основные положения;

I. Видовые особенности липидного состава плазматических мембран и криорезистентности спермиев быка, барана и хряка.

2. Механизмы криогенных изменений лишдов и функционального состояния спермиев быка, барана и хряка.

3. Криозащитные среды для замораживания спермы быка, барана и хряка.

4. Препарат амбиол, повышающий воспроизводительную способность животных.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 363 страницах машинописного текста, иллюстрирована 85 таблицами и 18 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы, включающего 623 источника, в том числе 236 на иностранных языкаг.Кроме того, в диссертацию входят приложения на 7 страницах.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основными объектами исследований служили крупный рогатый скот, овцы и свиньи, а также кровь и сперма этих видов животных.

При планировании, подготовке, постановке опытов.и.оценке их результатов руководствовались рекомендациями В.К. Ми-лованова (1962), Ю.Д. Клинского (1975, 1989), Л. Андероона (1975), ч; Хевдерсона (1975), Р. фута (1975), М. Кейтса (1975), Э. Мэдди (1979), М.Б. Стефанихи соавт. (1985).

Криоконс ервацию спермы быка и барона проводили в сре-г дах ЛТК (Платов, 1965), НАМЕК (а.с. Л 1634268), ЛОЛА (а.о. Н 1498489), ЛТРИ (а.с. Л 1540817), а хряка - ВИЖ-Н (Кононов, Голышев, Хачапуридзе, 1975), БСМ (а.о. Л 1138149) ' и БСЭНЖК (а.с. Л 1143413).

Температурный стресс вызывали путей помещения 0,1 мл спермы в I мл изотонического раствора цитрата натрия, охлажденного до 0-2°С. Коэффициент устойчивости к температурному стрессу рассчитывали как отношение показателей подвижности спермы стрессированной и нативной и выражали в % или условных единицах.

Физиологические показатели спермиев оценивали общепринятыми методами пд' подвижности, выживаемости и абсолютному показателю выживаемости при 38°С, а морфологическое состояние акросош фазоконтраотной микроскопией при 630-кратном

увеличении.

Богатые фракции плазматических мембран спермиев (6570$ чистоты по маркерным ферментам) получали методом iva-Eov, Proiirov (1981). Он предусматривает использование двухфазной полимерной системы, состоящей из декстрана (Т-500) и полиэтилевгликоля (Т-6) производства фирмы Фулка-Буш (Швейцария). О степени чистоты выделенных фракций судили по активности магний2* (натрий+ + калий"1" )-АТФазы, 5*-нуклеотвдазы и щелочной фосфатазы.

. Содержание белка определяли по Lowri et al. (1951 ). Липиды экстрагировали по Biigji, Dyer . (1959). Фракционировали липиды методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинах 6 ! 6 см с микрофракцией сшшкагеля Л 5 X 40 ("ИШШ") в системах хлороформ:метанол:вода (I направление) и хлороформ:метанол:25? аммиак (II направлёние). Микросиликагель (10 мкм) получали седиментацией силикат еля Ж 51 40 (Стефаник и соавт., 1985). Идентифицировали липиды е. применением специфических реакций окрашивания, предусмат-ривапцих использование следующих реактивов: Васьковского ; Дитмера, Лестера в модификации Васьковского и Костецкого ; Драгевдорфа ; фосфорномолибденовая. кислота-хлорид олова ; нин-гидриновый ; дифениламиновый ; антроновый ; серная кислота ; реагент дои обнаружения гексозо- и. триозофосфатов ; резорциновый. Дня подтвервдения результатов идентификации использовали свидетелей (холестерин и пальмитиновая кислота - коммерческие препараты, а фосфатидилхолин и фосфатидилэтанола-мин- получали.хроматографически из желтка куриного яйца) и величины Bf •• Содержание фосфолипидов определяли по Shi-Ъиуа Isao et al. (1967), а остальных липидов-по Kibrik, 1953» Спектры ЭДР записывали на радиоспектрометре 3-сантиметрового диапазона РЭ-1307. Содержание продуктов перекисного окисления лишдов определяли методами, описанными Ю.А. Владимировым и А.И. Арчаковым (1972). 0 степени окисленности липвдов судили по отношению'оптических плотностей Д233/Д2Ю и Д270/Д210 (Шведова и соавт., 1987). Величину антиокисли— тельной активности липвдов определяли по их способности тормозить окисление метилолеата (Бурлакова и соавт., 1975).

Содержание прогестерона,'эстрадаола, тестостерона, ти-

роксина и трийодтиронина в сыворотке, крови определяли радиоиммунологическим методом с использованием набора реакторов производства Института биоорганической химии АН Беларуси. При выяснении концентрации прогестерона и эстрадиола применялись антисыворотки, полученные при иммунизации кроликов с заменой стандартов, приготовленных на сыворотке человека,на приготовленные на сыворотке быка. Подсчет радиоактивности проводили на гамма-спектрометре типа РИА-300 фирмы "Траяор Европа".

Количество повторностей лабораторных опытов и животных в научно-производственных - выбирали в зависимости от целей. экспериментов и вариабельности признаков. Результаты обрабатывали, методом вариационной статистики по Е.К. Меркурьевой (1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Липиды плазматической мембраны и функциональная полноценность спермиев быка, барана и хряка при криоконсервации

Методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии из плазматических мембран спермиев быка, барана и хряка было выделено 17 и идентифицировано 15 фракций липидов. Липиды плазматических мембран включавт фракции фосфолипидов - фос-фатидилсерин (ФС), сфингомиелин (СФМ), фосфатидалхолин (ФХ), фосфатидилхолин-нросфатидилсерин (ФХ+ФС), сфингомиелин+фосфа-тидилсерин (СФМ+ФС), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидная кислота (ФК), кардиолипин (КЛ), лизофосфатйдилхолин (ЛФХ) и лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭА); гликосфинголишдов - цереб-розад-1 (Ц-1), цереброзвд-2 (Ц-2) и цереброзцц-3 (Ц-3); холестерин' (ХЛ); неэстерифицированные жирные кислоты (НЭЖК) и две фракции неидентифицированных липидов (НИЛ-1 и НИЛ-2).ЛФХ проявлялся главным образом на старте,и мы его количество не определяли. Таким образом, 13 фракций относятся к сложным ли-пидам л подразделяются на фосфолшщцы, гликосфинголипиды » стероиды (табл. I, 2, 3)..

Видовые особенности липидного состава плазматических мембран заключаются в разной хроматографической подвижности

Таблица I

Содержание липидов в плазматической мембране спермиев быка после разбавления и замораживания-оттаивания спермы, мкг/мг белка

Липиды | Разбавленные ! э"

фосфолшшды

Сфингомиелин 84,7±5,5 66,1±4,6*

ФосФатидшшшш+ фосфатидилсерин 122,8±7,1 109,8 ±4,4

Фосфатидилэтаноламин 94,1 ±3,8 114,4 ±5,8 ж

Кардиолипин 68,4±5,5 90,8±9,2

Фосфатвдная кислота 48,2 ±3,5 98,8±3,5зек

Всего 418,2± 15,7 479,8±Ю,13£

Гликосфинголипиды

Цереброзид-1 135,0± 18,0 98,6±И,6

Цереброзид-2 87,9 ±15,1 104,3 ±2,9

Цереброзид-3 72,5 ±16,0 71,4±13,4

Всего 295,4±34,2 274,2± 16,7

Холестерин 324,6 ±14,2 259,8 ±29,7

Неэстерифицированные жирные кислоты 328,8±19,9 474,0±11,8ж

Неидентифицированный липид-1 48,4±5,7 79,0 ±14,5

Неидентифицированный липид-2 85,9 ±19,1 92,7 ±15,1

Всего липидов 1501,3 ±36,9 1651,3 ±51,2

Различия статистически достоверны по сравнению с мембранами разбавленных спермиев: Р<0,05 ; за» - Р< 0,001.

Таблица 2

Содержание липидов в плазматической мембране спермиев барана после разбавления и замораживания-оттаивания спермы, мкг/мг белка

Липиды

Разбавленные I "-оиох^оиша . оттаянные

Фосфолипиды

Фосфатидилсерин 25,9±4,6 39,8±4,1

Сфингомиелин 6Г,6±4,5 61,6±3,0

Фосфатидилхолан 167,6 ±13,3 150,2 ±10,9

Фосфатвдилэтаноламин 112,4 ±11,5 79,6±5,1

Фосфатидная кислота 37,8±8,0 57,6± 10,2

Кардиолипин 56,6±6,1 47,4±6,2

Всего 461,9 ±26,3 436,2±29,4

Глико сфинголипиды

Цереброзид-1 273,8 ±30,1 252,0 ±70,1

Цереброзид-2 112,3± 26,9 96,5± 19,4

Цереброзид-3 П5,4±43,4 56,8±24,7

Всего 501,5±58,1 405,3 ±69,3

Холестерин 327,0 ±15,5 364,6 ±40,6

Неэстерифицированные

жирные кислоты 764,8±65,8 933,2 ±57,7

Всего липидов 2055,2 ±97,4 2139,3 ±112,

Таблица 3

Содержание липвдов в плазматической мембране спермиев хряка после разбавления ж замораживания-оттаивания сперыы, икг/ыг белка

Ддшда_| Равбавдевнне

босфолшщдн

Сф2НГ0ИИ8ЛИН+ фосфатидасерин ПО ,7 ±9,6 105,5 ±6,6

Фосфатидшпсолпа 128,1 ±8,2 152,1 ±21,5

йосфатцдилзтанолашн 173,7 ¿14,9 158,8 ±10,2

Лиг офо сфатидилв танол-амзш 57,5±6,9

Фосфатидная кислота 119,8 ±6,2 176,7 ±8,2 &

Всего 589,8 ±15,8 689,4 ±29,3*

Цереброзид-2 247,4 ±76,3 218,3±35,3

Цереброзид-3 391,2±63,Э 362,8 ±70,4

Всего 638,6 ±99,3 581,1 ±89,7

Холестерин 468,4 ±39,1 507,1 ±69,9

Нввстерифицирозанные жирные кислоты 663,7 ±21,3 805,9 ±56,6

Всего лшшдов 2360,5± 329,8 2583,5±175,0

Различия стахист^швски достоверны по сравнению с мембранами -разбавленных сперииез: Р< 0,05 ; е»-Р<0,01.

ФС, СФМ и ФХ в используемых нами системах. У спермиев барана эти фосфолипиды хорошо разделяются, у быка ФС выделяли вместе с СМ, а у хряка с - ФХ. Лизофосфатцды в спергляях бака и барана представлены ЛФХ, а у хряка такга ЛФЗА. Однако в мембране последнего нет КЛ н Ц-1.

В мембране спермиев быка в наибольшем количества присутствуют фосфолипиды, а в мембранах барана и хряка их содержание сопоставимо с количеством цореброзидов. Прзчзм, в содержания общего количества лигшдов, в расчете на белок, мембраны располагаются в ряду хряк > баран > бык, а по крго-резистентности спермиев в строго противопологяом порядка.

По лшшдному составу плазматические мембраны спермиов представляют собой классические биологические мембраны. В то яэ время, следует отметить характерные особенности: большое содержание гликосфянголтщдов - типичных компонентов мембран ¡слеток нервных тканей, НЭ2К - представителей активно метаболизирупцзх систем, КЛ - характерного главным образом для митохондрзальных мембран (креме хряка) ж отсутствие фосфатидплинозктола.

Большое содержание НЭЖК в мембранах после разбавления спермы указывает на значительный репаративннЗ потенциал спер-глиев, поскольку они являются субстратом для синтеза слоеных лзшддов. Это подтверждается и присутствием фосфатидноЭ кислоты - промежуточного продукта, общего дня биосинтеза трз-ацалглицеринов и глзцэрофосфолиплдоз. В плазматических мембранах разбавленных спермиев быка содержится гораздо меньше НЭНК, чем у барана и хряка, что делает последние более уязвимыми для усиления перекисного окисления лшшдов. В результате криоконсервации содержание НЭЖК увеличивается в мембранах всех видов. В мембранах спермиев быка и хряка повышается содержание как ФК, так и общего количества фосфолипидов. Охлаждение сопровождается изменением соотношения фосфолипидов в мембранах.

Были выявлены существенные различия в криорезистентнос-ти спермиев (табл. 4). По сохранению ультраструктур и фззид-логических пбказателей лучшие данные у спермиев быка, худшие. - у хряка, а сперши .барана занимают промежуточное положение.

Математический анализ результатов позволил установить, что содержание НЭЕК в плазматических мембранах находится в

отрицательной корреляции с выживаемостью деконсервированных спермиев быка (Р< 0,001), барана (Р< 0,05) и хряка (Р<0,05). Кроме того, в спермиях быка после замораживания-оттаивания обнаружены положительные корреляции между подвижностью и содержанием фракции «Х+ФС (Р< 0,05), выживаемостью и содержанием НШ-1 (Р< 0,01), ®С (Р< 0,05) и Ц-3 (Р<0,05), а также отрицательная корреляция между выживаемостью и содержанием XI (Р< 0,05). Следовательно, функциональное состояние спер-миев зависит от содержания отдельных липидов в плазматических мембранах.

Таблица 4

Морфофизиологические показатели спермиев быка, барана и хряка после разбавления и замораживания-оттаивания спермы

Вид спермиев, ! Подвижность, ! Выживаемость, ! Сохранность этап обработки ! балл ! ч ! акросом, %

Бык

После разбавления 7,5±0,18 - 67,6*2,23

После замора-

живания-оттаи- „ _

вания 3,7*0,20 6,4 ± 0,59 43,4*1,48*

Баран

После разбавления 7,3*0,39 - 73,3 ±0,39

После замора-живания-оттаи-

вания 3,3*0,16*** 5,1*0,28 33,9*0,84 Хряк

После разбавления 7,4* 0,20 - 72,3* 1,10

После замора-живания-оттаи-

вания_2,7*0,13* 3,3*0,18 28,0*2,11®®

Различия статистически достоверны по сравнению с показателями после разбавления: ж - Р< 0,05 ; - Р< 0,001.

Увеличение в процессе криоконеервации содержания ЛФЭА и НЭЖ является следствием активации фосфолипазы ¿2» а ФК -фосфолипазы Д. Активация фосфолипаз при замораживании .видимо, объясняется лабилизацией мембранной структуры, что облегчает образование фермент-субстратного комплекса. Фосфолипазы принимают участие в регуляции фосфолипидного состава биомембран. В. свою очередь, гидролитическая деятельность этих ферментов создает условия для усиления процесса перекисного окисления липидов. Важно отметить, что вопреки активации фосфолипаз содержание фосфолипидов в плазматических мембранах спермиев быка и хряка увеличивается в процессе криокон-сервации, а барана - остается неизменным. Поэтому становится очевидным присутствие процессов структурной модификации. плазматических мембран, которые вероятно направлены на повышение криорезистентности спермиев.

2. Влияние факторов экзогенной и эндогенной природы на литшдч и морфофизиологические показатели спермиев

Дш развития положения о существенной роли защитных возможностей спермиев был проведен опыт,в котором сперму быка, барана и хряка разбавляли в криозащитных средах и охлаждали до 4°С в течение 4 ч. В результате этого сперма всех видов разделялась на три фракции (верхняя, средняя и нижняя). Каждую фракцию замораживали. Лучшие показатели функционального состояния были у всех видов деконсервиро-ванных спермиев нижней фракции, где концентрировались малоподвижные и обездвиженные холодом гаметы, а худшие - у верхней, на подвижность которых не влияла низкая температура. Показатели средней фракции занимали промежуточное положение. Подвижность и выживаемость деконсервированных спермиев быка, барана и хряка нижней фракции были выше, чем у верхней соответственно в 2,6 ; 2,5 ; 2,3 и 4,3 ; 3,6 ; 3,3 раза. Следовательно, способность спермиев. снижать двигательную активность в ответ на действие холода является адаптив- . ной реакцией. Видовые особенности криорезистентности спермиев коррелируют с фракционной дйнамикой их физиологических показателей.

В.следующем опыте неразбавленную и разбавленную в крио-защитной среде сперму быка и барана охлаждали и замораживали. На разных этапах технологической обработки отбирали образцы спермы и подвергали их температурному стрессу. Установлено, что в процессе охлаждения спермин быка и барана как в присутствии защитной среды, так и без утрачивают чувствительность к температурному стрессу. При этом у более криорезис-тентных-спермиев быка этот процесс и более ярко выражен.Кроме того,, криозащитная среда более эффективна для спермиев этого вида. На спермиях барана ее действие проявляется только после, охлаждения до 5°С в течение 4 ч.

Ввиду решающей роли липидов в адаптации клеток к изменяющимся условиям среды, мы изучили криогенные изменения фосфолипидов и холестерина в зависимости от температурных условий и состава протектора. Перед экстракцией липидов спермиев двукратно отмывали раствором сахарозы и однократно дистиллированной водой путем чередования процедур ресуспен-дирования и осаждения центрифугированием. Фактически удаляли рыхлосвязанные липиды - кандидаты для элиминации.

Испытали быстрый (3 град./мин) и медленный (0,125 град./ мин) режимы охлаждения'спермы быка, барана и хряка. Результаты показали, что медленное охлавдение спермы способствует лучшему сохранению липидов, однако статистически достоверные различия при сравнении исследуемых способов были 'обнаружены лишь в содержании ФХ, КЛ и ФЭА.

В результате, исследования действия различных режимов охлаждения (охлаждали от 30 до 15°С в течение 1,2 и 4 ч), замораживания (замораживали при температурах -60, -80, -100, -120, -140 и -160°С) и оттаивания (20, 40, 50, 60 и 80°С) спермы хряка на общее содержание фосфолипидов в спермиях выявлено, что оптимальными параметрами технологической обработки являются охлаждение до 15°С в течение 4 ч, замораживание при -Ю0°С и оттаивание при 60°С.

Когда сперму быка и хряка замораживали в разных криоза-щитных средах, меньшие потери фосфолипидов наблюдали при использовании сред, способствующих лучшему сохранению мор-фофизиологических показателей спермиев.

В следующем опыте сперму, хряка охлаждали в течение 4 ч в атмосфере водорода, кислорода и воздуха. В замороженйо-от-

таянных спермиях отмечалась предпочтительная сохранность фос-фолипидов при охлаждении в атмосфере водорода.

Одним из наиболее существенных факторов, предопределяющих физикохимические и функциональные модификации мембран, является фазовый переход липидов. Наряду с другими биохимическими характеристиками, температура фазового перехода в значительной степени зависит от соотношения фосфолипидов-и холестерина. Нами установлено, что в процессе охлаждения, замораживания и оттаивания спермы быка, барана и хряка в спермиях наблюдается тенденция к смещению молярного отношения холестерин/фосфолипиды в сторону увеличения (табл. 5).

Таблица 5

Динамика отношения холестерин/фосфолипиды в спермиях при разбавлении, охлаждении' и замораживании спермы быка, барана и хряка, %

Вид животно- j _Этап обработки_

го_j разбавление [охлаждение [замораживание

Бык 100 П5,6±2,3 135,5±3,4

Баран 100 I07,I±I,7K 103,9*1,9®®

Хряк 100 Ю7,4 ±4,2 112,0*2,6®®

Различия статистически достоверны по сравнению с показателями спермиев быка: ж - Р<0,05 ; - Р<0,01; 3£36Ж- Р< 0,001.

Учитывая, что увеличение молярного отношения перемещает фазовый переход липидов в зону более низких температур, можг-но думать о возможном участии эндогенного изменения отношения холестерин/фосфолипиды в адаптации спермиев к низким температурам. В спермиях быка этот процесс более заметен.

Это послужило основанием для-проведения опыта по выяснению влияния экзогенного холестерина и альфа-токоферола на липидный состав и криорезистентность спермиев быка. Альфа-токоферол получали непосредственно перед применением путем гидролиза альфа-токоферолацетата.

Установлено, что введение в состав криозащитной среды альфа-токоферола способствует лучшему сохранению липидов и восстановлению подвижности спермиев после оттаивания. Холестерин обеспечивал стабилизацию- только эндогенного ХЛ.

В процессе криоконсервации в сперме повышается концентрация свободных радикалов и образование продуктов перекисно-го окисления лшщдов (ПОЛ), поглощающих в волновом диапазоне от 230 до 280 нм. Многократное замораживание-оттаивание спермиев приводит к значительному увеличению содержания продуктов ПОЛ, а использование антиоксидантов ингибирует процесс.

Физико-химическая система регуляции окислительных реакций в лнаддах мембран, одним из важнейших параметров которой является величина антиокислительной активности липидов,представляет собой основу защитных механизмов клетки против повреждающего действия стрессоров. Мы изучили видовые особенности антиокислительной активности липидов (А0А1) спермиев быка, барана и хряка, а также влияние на этот показатель процесса криоконсервации. Установлено, что самой высокой АОАЛ обладают спермии быка, величина которой превышает данные спермиев хряка и1 барана в 2,2 и 4,2 раза соответственно. Криоконсервация снижала АОАЛ спермиев быка в 1,8 раза, хряка - в 1,7 раза, а у барана не менялась.

Изучили влияние антиоксиданта мексидол на уровень ПОЛ в деконсервированных спермиях быка, барана и хряка. В большем количестве малоновый диальдегид (МДА) содержался в деконсервированных спермиях хряка, то есть уровень ПОЛ превышал таковой в сперме быка и барана в 1,4 и 2,2 раза соответственно. Таким образом, более устойчивые к холоду спермии быка обладают наибольшей АОАЛ, а более чувствительная сперма хряка содержит большее количество продуктов ПОЛ после деконсервации. Антиоксидант ингибрровал ПОЛ в процессе замораживания в сперме всех видов.

При введении в криозащитную среду катализатора ПОЛ (ионов двухвалентного железа) отмечали существенное концен-трационно-зависимое снижение функциональной полноценности спермиев в процессе криоконсервации. Уже при концентрации 10" М железо снижало устойчивость спермиев к низким температурам, а при содержании более 10""% делало их беззащитными против холода.

3. Мембраноактивные соединения и разработка способов сохранения спермиев вне организма

Посколюку на действие стрессора кивая клетка отвечает изменением проводимости плазматичеокой мембраны, мы провели исследования с целью выяснения возможности регуляции этого механизма при криоконсервации спермиев сельскохозяйственных животных. Изучили влияние на устойчивость спермиев быка и барана к температурному стрессу препаратов, изменяющих проницаемость биомембран - каналоформера ам$отерицина В, образующего -в мембране неселективные каналы,и йротонофора 2,4 динитрофенола. Препараты вводили в криозащитнуто среду в разных концентрациях и при разном соотношении ингредиентов, меняющих тоничность раствора.

Полученные результаты показали, что введение в состав криозащитной среды ачфотерицина В делало спермии беззащитными против холодового стресса, а 2,4 динитрофенола, напротив, оказывало позитивное действие. Негативный эффект амфо-терицина В проявлялся во всех случаях, а когда его вводили в среду без желтка, температурный стресс приводил к гибели 100$ спермиев быка и барана. Протонофор 2,4 динитрофенол увеличивал устойчивость спермиев быка и барана к температурному стрессу в 1,4 и 1,6 раза соответственно. Таким образом, только повышение специфической проводимости плазматических мембран увеличивает резистентность спермиев к холоду.

Известно, что препараты, обладающие солюбилизирувдим действием, увеличивают пластичность биомембран и способствуют гомеовязкостной адаптации. Мы изучили влияние на крио-резистентность спермиев детергентов додецилсульфата натрия (критическая концентрация мицеллообразования 8,2 мМ),тритона Х-100 (0,24 ьй) и смеси ненасыщенных жирных кислот (0,02-0,05 йЛ), которую выделяли из подсолнечного масла и вводили в криозащитную среду в виде эмульсии (ЗН2К).

Додецилсульфат натрия не был достаточно эффективен при замораживании спермы: показатели опытных групп незначительно превышали данные контроля,- Тогда как тритон Х-100 (алкилфенилполиэтиленгликоль) проявлял высокие криозащитные Свойства при замораживании спермы. В результате была разра-

ботана среда ЛТРЙ для зешразгаваиия спермы барана следукще-го состава, иа.а.%: лактоза 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 14,2 ; тритон 1-100 0,001 ; вода бидистиллированная до 100 (а.с. В I5408I7). Широкие испытания ЛТРИ среды в лабораторных и производственных условиях показали, что она повышает абсолютный показатель выживаемости и оплодотворяющую способность деконсервнрованннх спермиев барана на 37,3 и 8,7% соответственно.

ЭНЖК не защищала спермиев от температурного стресса и не била эффективна при замораживании спермы быка и барана. Однако выявили позитивное действие препарата при криоконсер-вации оперш хряка. Это послужило основанием для разработки ЕСЗБЖ среды следующего состава, шс.%: сорбит 3,0 ; глюкоза 0,7 ; натрий лимоннокислый трехзвмещенный пятиводвый 0,25 ; шаганий сернокислый 0,25 ; Эф А натриевая соль 0,35 ; трис (оксиметил) аминонетан 0,05 ; глицерин 3,5 ; ЭНЖК до 100. Для получения ЭНЕК подсолнечное масло (ГОСТ 1129-73) встряхивают В течение I ч с дистиллированной водой в соотношении 1:2 (масло:вода), затем центрифугируют при 1,5-2,0 тыс. об./мин в течение 15-20 мин для разделения слоев, верхний слой удаляют водоструйным насосом, а нижиий используют дня приготовления среды. БСЭНЖК среда (а.с. * II434I3) увеличивает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способность декон-сервированных спермиев хряка на 12,5, 35,3 и 21,1$ соответственно.

Многочисленные исследования, проведенные нами и другими авторами из разных стран, позволили выявить большое количество антиоксидантов, проявляющих криопротекторные свойства. Было установлено, что природные антиоксиданты и их синтетические аналоги имеют значительные преимущества перед синтетическими и микроэлементами при криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных.

Испытали природные антиоксиданты (мелонгозид, капсшсо-звд и сульфированный триозид неотигогенина), относящиеся к классу стероидных гликозидов. Лучшие результаты были получены в случае использования мелонгозида при 1фиоконсервации спермы хряка. В результате этих исследований разработали криозащитную среду БСУ, включающую следующие ингредиенты, то,%: сахароза 4,29 ; глюкоза 0,69 ; фруктоза 0,69 ; ЭДТА нат-

риевая соль 0,34 ; натрий лимоннокислый трехзаыещетшй пяти-водный 0,26 ; аммоний сернокислый 0,17 ; трис (оксиметил). аминометан 0,05 ; глицерин 3,43 ; желток куриного яйца 4,29 ; мелонгозид /(25 Р)-фурост-5-ен-3-бета, 22д, 26 трзол-25-0-бета-Д глюкопиранозвд/ 0,00004 ; вода бидистиллированная до 100. БСМ среда (а.с. № II38I49) повышает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способность деконсервированных спермиев хряка на 50,0, 37,5 и 23$ соответственно. ■

Высокие 1фиозащитные свойства при замораживании сперма быка, барана и хряка проявляли антиоксиданты из классов 3-оксипиридинов (первичная структура витамина Bg) и бензимлда-золов (первичная структура витамина Bj2).

В'частности,мексидол (сукцинат 2-этил-б-метил-З-оксипи-ридин). повышал криорезистентность спер?,гаев, ингибируя ПОЛ в сперме. Содержание ВДА в деконсервированной сперме хряка снижалось по сравнению с контролем на 62,7$, барана - на 30,9$, а быка - на 28,8$. Мексидол снижал образование как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ (первичные поглощают при душна волны 233 нм, а вторичные - 270 нм) и, соответственно, уменьшал степень окисленности липидов (табл.6), а также повышал на 7,1$ антиокислительную активность спермиев. Отмечено позитивное влияние препарата на сохранение ультраструктур спермиев в процессе замораживания: сохранность акросом спермиев быка, барана и хряка была выше по сравнению с контролем соотвентственно на 4,7, 9,3 и 27,2$. Выявлена концентрационная вдцоспецифичность действия мексидола: оптимальная концентрация для спермы быка в 10 раз меньше таковой для спермы барана.

На основании проведенных исследований была разработана среда ЛАМЕК для криоконсервации спермы быка, включающая следующие ингредиенты, мас.$: лактоза 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 11,5.; мексидол 0,0000255 ; вода бидистиллированная до 100.

Среда ЛАМЕК (а.с. № 1634268) в сравнительном испытании характеризовалась'способностью повышать показатели функциог нального состояния спермиев и ингибировать ПОЛ в процессе технологической обработки спермы быка: выживаемость, абсолютный показатель выживаемости и оплодотворяющая способность спермиев увеличивались соответственно на 12,5, 35,8 и 7,7$,

а образование МДА снижалось на 29,7%.

Таблица 6

Влияние мексвдола на уровень перекисного окисления лишдов в деконсервированннх спермяях

| Длина волны (нм), "["степень окисленнос-

I оптическая плотность СД) \ ти липидов, у.е.

? 233 I 270 1 ^УЬчо&ж

Вариант опыта ■

Нативнне

опермии

(контроль)

Заыорожен-но-оттаян-ные

Заморожен-но-оттаян-нне с мек-сидолом

0,232± 0,037

1,027 £ 0,041

0,548 ± 0,124

гае

0,057± 0,005

0,214 ±* 0,031

0,180 ±й 0,025

0,142± 0,033

0,577 ±] 0,015

0,347± 0,109

Шк

0,035± 0,005

0,120±й 0,012

0,ИЗ± 0,026

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: ж-Р< 0,05 ; з®-Р< 0,01.

Аналогичные по существу исследования были проведены с другими представителями класса З-оксшшридинов (ОП-6, СК-4-и СК-5), а также бензимидазолаш (амбиол и Ш0-50). Чтобы выяснить какой класс соединений имеет больше перспектив в криобиологии спермы, мы провели сравнительноз испытание. Препараты использовали в пределах оптимальных концентраций. Результаты испытаний показали, что бензимидазолы и 3-окси-пиридины, по существу, в равной степени эффективны при крио-консервации спермы быка (табл. 7). Однако лучшие данные были у амбиола (2-метил-4-диметиламинометил-бензимидазол-5-ол-дигидрохлорид). Важно, что амбиол защищал от разрушения в процессе криоконсервации ультраструктуры спермиев: сохранность акросом увеличивалась по сравнению с контролем на II%. Способствовал сохранению акросом и 3-оксипиридин ОП-6. Антиоксидантные свойства амбиола объясняются подвижностью атома водорода гидроксильной группы при

Таблица 7

Влияние бензимпдазолов и З-оксишрздинов на корфо-физиологические показатели спермиев быка в процессе криоконсервациз

Антиокси-дант •¡Концент- (подвижность, ,рация,мг%|балл ¡Внаивае— ,кость, ч ¡Сохранность ¡акросом, %

Контроль 0 3,2±0,08 7,2±0,14 36,2±0,41

Амбиол 0,7 3,6*0,07^ 8,410,17^40,2*0,64

14,0 3,7 ±0,12 23 8,5±0,18ш s39,6±0,67301

ЕИ0-50 0,8 3,710,12® 7,8±0,14й 35,8±0,49

16,0 з,з±о,од 7,9±0,I9S 37,3 ±0,54

ОП-6 0,45 3,4 ±0,08 7,6±0,28 39,3±0,37^

9,0 3,2±0,09 7,5±0,24 37,6±0,48

ОК-4 0,5 3,8±0,09 ^8,3*0,14^ й36,2±0,41

10,0 3,4±0,07й 8,5±0,18и s35,8±0,49

СК-5 0,5 3,5±0,08 7,9±0,I9S 38,8 ±1,46

9,0 3,3±0,07 9,3±0,16в а37,2±0,54

Разлитая статистически достоверны по сравнению с контролем: s- Р<0,05 ; 5б?-Р<0,01; ®®-Р<0,001.

Учитывая большую роль липидов в защите спермиев от негативного действия низких температур, мы изучили эффективность общих липидов (ОЛА) и фосфолшщдов (ФДА) актиномице-TOB (Actinomyces griseus) обЩИХ ЛИПИДОВ (ОЛД) И фосфОЛИ-пвдов (ФЛД) дрожжей (Sacbarosgrces cereviaiae) и фосфс-липидов кандиди (ФЛК) (Candida ¡JullierEomiii).

В результате исследований установлен высокий криозащитный эффект у ОЛА. Позитивное влияние на функциональное состояние спермиев при кряоконеервации отмечалось у ФЛК а ОДЦ, тогда как ФЛД повышали выживаемость, но снижали подвижность деконсервироваяных гамет. ФЛА снижали выживаемость декоясер-вированных спермиев.

На статистически достоверные величины ОЛА повышали, по сравнению с контролем, у деконсервированных спермиев барана показатели подвижности, выживаемости, абсолютного показателя выживаемости, сохранности акросом и антиокислительной активности лишадов, у быка - подвижности, выживаемости и абсолютного показателя выживаемости, а у хряка - сохранности акросом и антиокислительной активности липвдов. То есть ОДА наиболее эффективны для повышения криорезистентности спермиев барана. Это послужило основанием для разработки среды ЛОЛА для замораживания спермы барана следующего состава, мае.J5: лактоза 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 11,5; ОЛА 0,015 ; вода бидистиллированная до 100. ОЛА получают из биомассы актиномицетов, которую выращивают как кормовую добавку на биохимических заводах по традиционной технологии. Способ приготовления ОЛА позволяет получать стабильный препарат, содержащий фосфолипвды, moho-, ди- и триацилглицери-ны.стерины, неэстерифицированныа жирные кислоты, эфиры сте-ринов, воски и природные антиоксиданты, ЛОЛА среда (а.с. № 1498489) повышает результативность искусственного осеменения овец на 24,9$.

Наряду с криозащитными средами,была разработана ГЦ0П-6 среда для-разбавления спермы барана следующего состава,мае.%: глюкоза 0,7 ; натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный 2,4 ; желток куриного яйца 12,2 ; ОП-6 (хлоргидрат-2-этил-6-метил-3-оксипиридин) 0,009 ; вода бидистиллированная до 100. Среда повышает выживаемость, сохранность акросом и оплодотворяющую способность спермиев на 45,9, 3,1 и 7,9$ соответственно. Степень окисленности липвдов снижается по первичным продуктам ПОЛ на 12,7$, а по вторичным - на 36,6$.

Таким образом, мембраноактивные соединения являются высокоэффективными ингредиентами .защитных сред для сохранения спермы сельскохозяйственных вне организма.

Препараты, относящиеся к 3-оксипиридинам и бензимидазо-лам синтезированы в Институте химической физики РАН (разработчики: доктор химических наук, профессор Л.Д. Смирнов, кандидаты химических наук Л.Г. Столярова и Ю.В. Кузнецов), стероидные гликозиды в Институте экологической генетики AHM (д.х.н., профессор П.К. Кинтя), а липиды микроорганизмов получены в Отделе микробиологии AHM (к.б.н. С.А. Бурцевой и

я

Л.П. Ковалъчук).

4. Влияние стрессоров на воспроизводительную способность животных и пути ее повшизния

В случной сезон было сформировано две группы овцематок цигайской породы. Первая (опыт) содержалась в загоне без выпаса в скученном состоянии и получала вволю зеленую массу люцерны, а вторая (контроль) в течение 12-14 ч в 9утки выпасалась по люцерне. Все овцы получали по 100 г/гол./дн. концентратов. Охоту выявляли дважды - утром и вечером. Осеменяли спермой, разбавленной ГЦОП-6 средой сразу после выявления охоты и повторно через 24 ч. В результате гиподинамии сократилось количество животных, проявляющих эструс в течение 17 дней, на 14,1%, а их оплодотворяемость - на 26,4$ (табл. 8).

Таблица 8

Влияние гиподинамии на воспроизводительную функцию овцематок

Вариант ¡ Количест-опыта ¡ во овец, i гол.

Пришло в охоту в течениеf

17 дн._¡Окотилось, %

гол. !_%_L

Опыт 205 125 61,0 + 4,2* 53,113,5***

Контроль 197 146 74,1±ЗД 72,1 ±3,2

Различия статистически достоверны пб сравнению с контролем: РС 0,05 ; Р< 0,001.

Учитывая, что отлучение от отары (нарушение стадности) является для овец одним из наиболее модных психологических (социальных) стресс-факторов, мы проводили осеменение с при-йенением. разработанной наш установки, устраняющей этот раздражитель. Овцематок в охоте контрольной группы выделяли из отары, перетаскивали в пункт искусственного осеменения,фиксировали в станке и проводили осеменение. То есть, в опытной группе были исключены выделение из отары, перетаскивание и жесткая фиксация животных. В предложенной нами установке, движения овцематки ограничены только размером платформы для

осеменения. По результатам окота оплодотворяемость овцематок в опытной группе была выше на 11,2%.

Для выяснения влияния температуры спермы, вводимой в шейку матки, овцематок осеменяли спермой, имеющей температуру 20°С (контроль) и 38°С (опыт). Доведение температуры спермы до физиологических норм повысило количество окотившихся животных на 22,3$.

Известно, что при стрессе усиливается процесс ПОЛ. С целью выяснения влияния антиоксидаята амбиол и нитратов на качество спермопродукции животных было сформировано три группы баранов. Первая группа контрольная, вторая - получала дополнительно нитрат натрия в дозе 5480 мг/кг комбикорма в день и третья - амбиол в дозе I мг/кг комбикорма. Бараны получали добавки в течение 85 дней. Полученные данные показали, что введение в корм а&биола способствовало уведавнию объема эякулята, количества спермизв в зякузгяте, подвижности и сохранности акросом опермиев на 50,0, 44,8, 6,1 и 5,5? соответственно. Нитрат натрия снижал подвижность и выживаемость деконсервированных спермиев на 13,6 и 7,45? соответственно. При этом, амбиол существенно снижал степень окислен-ности липидов и образование ВД& в сперма, а нитрат натрии оказывал противоположное действие.

Сформировали три группы овцематок породы тексель, завезенных из Голландии. В результате изменения климатических, а также условий содержания и кормления они в течение трех месяцев не приходили в охоту. Первую группу овцематок обработали амбиодом, вторую - СК-6, а третья служила контролем. Препараты вводили, однократно внутримышечно в виде водного раствора (I мг/мл).в дозе 0,4 мл/гол. Через два дня после обработки у воех животных взяли образцы крови для определения содержания продуктов ПОЛ и горюнов. Применение препаратов заметно повысило оплодотворяемость (в первой группе на 9,3?, а во второй - на 13,3?) и снизило уровень ПОЛ в крови овец (табл. 9).

Различий в содержании эстрадиола, тестостерона и прогестерона мелду группами не обнаружено, однако амбиол существенно увеличивал содержание грийодтиронина. Таким образом, повышение репродуктивной способности животных совпадает со снижением уровня ПОЛ в крови.

Таблица 9

Влияние антиоксидантов на уровень перекисного окисления липвдов плазмы крови овцематок

Вариант опыта

' Степень окисленности липвдов, ! Содержание !Щ,

о ! - о

у.е.

10"

Д233/Д2Ю I Д270/Д2Ю

| Д535/МЛ • 10"

Амбиол 18,7±0,12 СК-5 18,0 ±0,05 Контроль 23,0 ±0,20

ЗОВЕ

5,7 + 0,09 5,1±0,07 6,5±0,15

5,1±0,07®ей 0,9 ±0,04

1,2±0,07 0,9 ±0,04 1,6±0,05

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: шх - Р< 0,001.

В следующем опыте нами была поставлена задача выяснить эффективность совместного применения амбиола и дигитола, представляющего собой смесь эстрогенов, андрогенов и ихэфи-ров. В анэстральный период сформировали четыре грушш овцематок, первую из которых обработали амбиолом, вторую - ди-гитолом, третью - амбиолом и дигитолом, а четвертая служила контролем. Препараты вводили однократно внутримышечно в следующих дозах, мл/100 кг массы тела: амбиол 0,4 ; дигитол 2. Результаты исследований показали, что препараты оказали заметный стимулирующий эффект (пришло в охоту в течение 8 дн. в I группе 30,0$, во II - 65,6$, в III - 76,7$, в 1У -8,5?), который у дигитола был предпочтительней. Лучшие результаты по стимуляции получены в третьей группе, обработанной амбиолом и дигитолом. Оплодотворяемость в группах составила соответственно 85,0, 62,5, 75,8 и 80,0?. Дигитол снизил результативность осеменения, а амбиол способствовал повышению оплодотворяемости.

Далее препарат был испытан на коровах. Для изучения его эффективности и механизма действия определяли содержание в плазме крови крров Прогестерона, эстрадиола, тестостерона, трийодтиронина (Тд), тироксина (Т4) и малонового диаль-дегвда(ВДА), а также степень окисленности липидов. Кроме

этого учитывали проявление охоты в течение 20 дней после обработки, оплодотворяемость и продолжительность сервис-периода.

Сформировали пять групп коров с продуктивностью за последнюю лактацию 4000 кг молока (одна контрольная и четыре опытных). Коровам опытных групп'на 25-30 дн. после отела однократно внутримышечно ввели амбиол в следующих дозах: 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ид/100 кг массы тела. Через семь дней после обработки взяли пробы крови для исследований. В результате опыта, на основании данных по проявлению эструса (50$), оп-лодотворяемости (.60%) (в контроле соответственно 30,0 и 33,3$) и низкому'уровню МДА в крови (66$ от показателей контрольной группы), установлено, что оптимальной является доза 0,4 мл/100 кг массы тела.

Этот опыт был повторно проведен на коровах с продуктивностью 5000 кг молока за последнюю законченную лактацию, который подтвердил правильность оптимальной дозы амбиола. Использование препарата позволило сократить период от отела до проявления признаков охоты на 11,4 дня, а сервис период - на 23,6 дня. Причем показатели непроизводительного периода у коров всех опытных груш были меньше, чем у контрольных.

Пятьдесят коров с продуктивностью свыше -7000 кг молока и содержанием жира в молоке не менее 3,8$ разделили то принципу аналогов на две равные группы. Животных опытной группы " обрабатывали амбиолом через каждые 14 дней, начиная с запуска до прихода в охоту в дозе 0,4 мл/100 кг массы тела. В опытной группе период от отела до начала охоты и сервис-период составили 59,5 и 80,6 дня, а в контрольной - 78,6 и 103,2 дня соответственно.

Изучили влияние амбиола на восстановление половой цикличности у коров, не приходящих в,охоту в течение 60 дней после отела, из которых сформировали четыре группы. В первую и третью группы вошли коровы с гипофункцией яичников, а во вторую и четвертую - с персистентным желтым телом. Животных первой и второй групп обработали амбиолом (0,4 мл/100 кг). Установили, что амбиол проявляет стимулирующее'действие, повышает оплодотворяемость и снижает продолжительность сервис-периода. Больший эффект от применения амбиола достигается на ■ животных с гипофункцией яичников. Препарат снижал степень

окисленности липидов плазмы крови коров на 16,2-18,1$, а образование МДА - на 21,3$. В то же время, он способствовал созданию гормонального, фона, обеспечивающего проявление половой охоты (по прогестерону и эстрадиолу). В опытных группах возрасло'на 71,4-165,0$ содержание в крови тироксина и на 59,3-85,4$ - трийодтиронина.

В соответствии с решением НТС МСХиП Республики Молдова в 1991-1992 гг. было проведено широкое комиссионное испытание препарата амбиол в 26-ти хозяйствах. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10

Результаты комиссионного испытания амбиола

Группа

I Обра; бота-| но, I гол.

Пришло в охоту, %

Опыт

! Контроль

1. С целью подготовки к отелам,коровам вводили через каждые 14 дн. начиная с запуска

2. Для стимуляции охоты, коровам с нормальным течением родового и послеродового перио-•дов вводили однократно через 25-30 дн. после отела

4093 55,7 ±0,8

3. Для восстановления половой цикличности, коровам, не проявившим эструс в течение 60 дн. после отела,вводили однократно в день ректального обследования 6105

4. С целью стимуляции охоты,овец обрабатывали однократно 349

2257 71,8 + 0,9

шх

49,4 + 0,6

55,5 ± 2,7

эеве

5ЭЙЁ

29,8±0,7

44,7±1,0

17,5 + 0,5

8,5 ±1,5

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: же* - Р< 0,001.

ВНИИГПЭ признал разработку ймбиола изобретением и принял решение выдать авторское свидетельство от 26.02.91 по заявке № 4774697.

Амбиол является хлоргидратной формой бенимидазола, поэтому в следующих исследованиях мы испытали хлоргидратный вариант 3-окиспиридина - СК-5 (хлоргидрат-2-третбутил-З-оксидирддин). Во всех опытах препарат вводили внутримышечно в виде.водного раствора с концентрацией I мг/мл.

Из коров с продуктивностью за последнюю законченную лактацию 3500-4000 кг молока и нормальным течением родового и послеродового периодов было сформировано 6 групп. Первая группа контрольная, а животным остальных - вводили СК-5 соответственно в следующих дозах: 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ; 1,0 мл/100 кг массы тела. Лучшие результаты по оплодотворяемости и продолжительности периода от отела до проявления охоты, а также сервис-периода были получены при использовании СК-5 в дозе 0,4 мл/100 кг.

. Для выяснения эффективности СК-5 в сравнении с известным антиоксидавтом фенозан-К, сформировали три группы коров с продуктивностью 480Ó-5500 кг молока. Препараты вводили в дозе 0,4 мл/100 кг. Через семь дней после обработки у животных брали кровь для определения степени окисленности липи-дов и содержания малонового диальдегида. Установили, что СК-5 снижал по сравнению с фенозаном-К и контролем продолжительность сервис-периода на 5,75 и 7,91 да. соответственно. В группе животных, обработанных СК-5, были заметно ниже степень окисленности липидов плазмы крови и содержание МДА.

Далее было сформировано две группы коров с продуктивностью 5000-6000 кг молока. Коровам первой группы вводили СК-5 в доза 0,2 мл/100 кг через каждые 14-дней после отела и до прихода в охоту. Вторая группа служила контролем.Кровь для исследований брали через'2-3 дня после начала охоты.Установлено снижение (по сравнению с контролем) сервис-периода на 25,3$ и увеличение оплодотворяемости на 25$. Применение СК-5 привело к изменению содержания стероидных гормонов (табл. II). и снижению уровня ПОЛ в крови.

В следующем опыте испытали СК-5 и дигитол на коровах, не проявляющих признаков эструса в течение 60 дн. после отела, из которых сформировали три группы. В каадую группу входили животные с гипофункцией яичников и персистентннм желтым телом. Коров первой группы обработали СК-5 (0,4 мл/ 100 кг), второй - дигитолом (I мл/100 кг), а третьА служила

контролем. Кровь брали через 2 дня после начала охоты.

Таблица II

Влияние СК—5 на гормональный статус коров

ill |

Вариант j Протесте- ; Эстрадиол, j Т,, jTo, нг/мл опыта j рон, нг/мл j дг/шг j Д./100 ш j д_

ЗВ6 ft

СК-5 0,98 ±0,06 S9,6I±4,II 2,84±0,13 0,71±0,03 Контроль 0,60±0,09 66,34 ±7,68 3,08±0,24 0,59±0,Ю

Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: *- Р< 0,05 ; з»- Р< 0,01.

Препараты не способствовали повышению ошгодотворяеыос-ти и не были эффективны для коров с персистентным желтым телам. Однако, дигитол на 29,3? увеличивал восстановление цикличности у коров с гипофункцией яичников, а СК-5 - на 27,4?. По содержанию стероидных и тиреовдных гормонов существенных изменений не обнаружено. Только дигитол снижал уровень прогестерона у коров с персистентным желтым телом. В то же время, как СК-5, так и дигитол заметно снижали уровень ПОЛ в крови коров.

На разработанный нами способ повышения воспроизводительной способности животных с применением СК-5 получено положительное решение ВНИИГПЭ от 28.11.91 на выдачу авторского свидетельства по заявке № 4299801.

5. Основные принципы адаптивной технологии получения, криоконсервации и использования спермы барана

Технология включает следуицие разделы: получение спермы ; разбавление и криоконсервация спермы ; организация участка искусственного осеменения, выявление овцематок в охоте и их осеменение. Она предусматривает использование биологических факторов и технических средств, .способствующих повышению результативности искусственного осеменения овец.

Эффективность технологии обеспечивается разработанными способом повышения качества спермопродукции, установкой для получения спермы, криозащитной средой, способом выявления овцематок в охоте, установкой для искусственного осеменения и комплектом инструментов.

Содержание баранов-производителей небольшими (5-6 гол.) постоянными по составу группами позволяет устранять (или смягчать) стресс-факторы, которые имеют место при индивидуальном и крупногрушювом содержании и перегруппировках. Активный моцион и полноценное кормление профилактируют соответственно гиподинамию и кормовой стресс. Введение в рацион ■ амбиола повышает адаптивные возможности животных. Сперму получают от всех баранов каждой группы в один и тот же день в определенное время с помощью установки, включающей платформу для получения спермы, которая располагается на высоте, облегчающей работу технолога. Преимущество установки перед напольными вариантами заключается в том, что на производителя, во время подготовки к садке и непосредственной эякуляции, не оказывают отвлекающего влияния остальные производители.

Для разбавления спермы, используемой при температурах выше 0°С, применяют среду ГЦОП-6, а для криоконсервации -среду ЛОЛА. Предложенные среды и приемы технологической обработки повышают эффективность хранения спермы вне организма.

Способ выявления овцематок в охоте и установка для искусственного осеменения предотвращают влияние таких экстремальных воздействий, которые связаны с выделением овец из отары, их перетаскиванием к месту осеменения и жесткой фиксацией. Предусмотренное технологией присутствие самца при осеменении повышает его результативность за счет комплекса нейро-сексуальных воздействий, способствующих усилению моторики матки и продвижению спермиев в половых путях. Следовательно, размещение на установке для искусственного осеменения барана, способствует не только непринудительному перемещению овцематок, но и реализации физиологических механизмов оплодотворения. Установка расположена снаружи пункта. Осеменение проводят через сашгаэз, поэтому осеменяемая овцематка находится за пределами пункта и не в полной мере

воспринимает манипуляции технолога. Сбоку от нее находится овцематка, ожидающая осеменения, а перед - баран, передающие специфические звуковые, поведенческие и обонятельные (посредством феромонов) сигналы. Движения овцематки ограничены только размером платформы и не вызывают особой тревоги (болевых и иммобилизационных воздействий).

Инструменты для искусственного осеменения сконструиро-ваннн с учетом физиологических: и анатомических особенностей овец. Комплект включает размораживатель, вапшоскй!, прибор для осеменения я набор кювет. Конструкция размораживателя обеспечивает быстрое отделение жидкой фазы от твердой,что предотвращает температурный стресс при оттаивания спермы. Пргбор для осемевешЕя устраняет температурное стрессированаа сейо катка (теашэратура спермы и катетера поддерживается на уровне 33°С атокатичесст), что способствует увеличению глубины введения катетера в канал шейкп и дальнейшему продвижению спвретевгесла температура катетера и спермы ниже физиологической, канал шеЗзя катки сжимается и моторика матки прекращается. Использование подогретого до 36-42°С и смоченного физраствором вагиноскопа (обеспечивается биотермостатом о физраствором), диаметр которого меньше среднего диаметра влагалища овцы, приближают процедуру осеменения к естественным физиологическим параметрам.

Кроме этого, технология значительно снижает трудоемкость искусственного осеменения, что имеет не последнее значение для его широкого внедрения в практику. Адаптивная технология позволяет получать 45,9-64,7$ плодотворных осеменений овец и успешно используется на племпредприятиях и в овцеводческих хозяйствах (акт внедрения от 22.04.91).

6. Способ повышения воспроизводительной способности животных

Основной принцип способа повышения воспроизводительной способности животных заключается в следующих двух составляющих:

I. Предотвращать или смягчать действие стрессоров и осуществлять мобилизацию эндогенных защитных и регуляторннх систем организма средствами различной природы ;

2. При высоком уровне экстремальных воздействий, когда организм животного не в состоянии противостоять стрессорам и возникает функциональные нарушения, следует применять средства специфического действия, оказывающие позитивное влияние на поврежденный орган, систему или функциональный дисбаланс,

В качестве средства неспецифического действия мы впервые предложили использовать препарат амбиол, который обладает антиоксидантными свойствами, а также стимулирует проявление эструса, повышает оплодотворяемость и.качество спермо-продукции. Амбиол успешно прошел лабораторные и производственные испытания, выпускается серийно и применяется в производстве по. следующей схеме:

1. Подготовка коров к отелам - вводят по 1,5 мл на голову внутримышечно каждые 14 дней начиная с запуска.

2. Коровам с нормальным течением родового и послеродового периодов вводят внутримышечно по 2 мл на голову однократно на 25-80-й день после отела.

3. Коровам, не проявившим охоту в течение 60 дней после отела, вводят внутримышечно по 2 мл на голову в день ректального обследования.

В интересах создания оптимальных условий для собственных регуляторных механизмов животных предлагается комплекс следующих мероприятий: активный моцион предоставляют всем коровам через три дня после отела на расстояние 5-7 км; за два меояца до предполагаемого отела животным вводят каждые 10 дн. по 10 мл тривитамина или тетравита; на 25-30-й день после отела трехкратно с интервалом в сутки применяют массаж матки и яичников ;.при задержании последа рекомендуется применять дигитол, стимуляции секреции ЛГ - сурфагон, при наличие персистентного желтого тела и фолликулярной кисты - фла-волиз, а гипофункции яичников - прогестерон и дигитол. С целью активации секреторной функции эндометрия, сохранения жизнеспособности зиготы, обеспечения условий для ее имплантации и развития эмбриона, животных обрабатывают прогестероном. Для профилактики эндометритов и субинволюции матки предлагаем использовать ихглюковит.

Разработанный способ успешно используется в практике. В процессе внедрения было выявлено, что использование препа-

рата амбиол с целью стимуляции репродуктивной функции снизило сервис-период на 7,4 дня и повысило оплодотворяемость коров на 5,6?. Применение амбиола в комплексе с другими методами повышения воспроизводительной способности животных обеспечило увеличение выхода телят на 4,7? (акт внедрения от 30.12.92).

Таким образом, в результате фундаментальных и прикладных исследований ; разработки технических средств и технологических приемов была достигнута цель настоящей работы.

ВЫВОДЫ

I. Экспериментально установленные в данном исследовании видовые особенности липидного состава плазматических мембран спермиев быка, барана и хряка заключаются в разных соотношениях фракций липидов. Кроме того, лизофосфатиды в плазматической мембране спермиев хряка представлены лизофосфатидил-холином и. лизофосфатидилэтаноламином, а у быка и барана -только лизофосфатидилхолином ; в плазматической мембране спермиев хряка отсутствуют кардиолипин и цереброзид-1.

2. В процессе криоконсервации в плазматических мембранах спермиев изменяется соотношение фракций фосфолипидов. У спермиев быка после разбавления фосфолипиды распределяются в ряду фосфатидилхолин+фосфатидилсерин > фосфатидллэтанола-мин> сфингомиелин> кардиолипин> фосфатидная кислота, а после замораживания-оттаивания - фосфатидилэтаноламин > фосфати-дилхолин+фосфатидилсерин> фосфатидная кислота>кардиолипин> сфингомиелин, а у барана соответственно - фосфатидилхолин > фосфатидилэтаноламин> сфингомиелин > кардиолипин > фосфатидная кислота> фосфатидилсерин и фосфатидилхолин> фосфатидил-этаноламин> сфингомиелин> фосфатидная кислота> кардиолипин> фосфатидилсерин, а у хряка - фосфатидилэтаноламин> фосфати-дилхолин> фосфатидная кислотам сфингомиелин+фосфатццилсерин >лизофосфатидилэтаноламин и фосфатидная кислота> фосфатидилэтаноламин;» фосфатидилхолин> сфингомиелин+фосфатидилсерин> лизофосфатидилэтанолаыин. После оттаивания в плазматической мембране спермиев быка в 1,2 раза больше содержится фосфати-дилэтаноламина и в 1,3 раза меньше - сфингомиелина, а у хря-

ка в 1,7 раза больше - лизофосфатидилэтаноламина. Лшшдеый состав плазматической мембраны спермиев барана отличается большей стабильностью, чем у быка и хряка.

3. Подвижность и выживаемость спермиев коррелируют с содержанием в плазматических мембранах фосфатидилхолина, фоофатидилсерина, фосфатидной кислоты, холестерина, церебро-звда-3 и неэстерифицированных жирных кислот на разных стадиях технологической обработки спермы.

4. Криоконсервация приводит к активации фосфолипаз (увеличивается содержание лизофосфатидилэтаноламина, неэстерифицированных жирных кислот и фосфатидной кислоты), процесса перекисного окисления липидов (увеличивается степень окисленности липидов и образование малонового диальдегида ; снижается антиокислительная активность липидов) и увеличению в спермиях соотношения холестерин/фосфолипиды.

5. Видовые особенности криорезистентности спермиев связаны с динамикой в процессе замораживания, существенных для них характеристик (уровень перекисного окисления липидов, соотношение различных фракций липидов,- состояние-акросомы,. . -двигательная активность, устойчивость к температурному стрессу). При криоконсервации спермы, наряду с криоповрезкдениями, имеют место реакции спермиев, направленные на поддержание их функционального гомеостаза. Спермии быка имеют большую, чем спермии барана и хряка, криорезистентность, антиокислитель--ную активность липидов и выраженность увеличения в процессе технологической обработки молярного отношения холестерин/ фосфолипиды.

6. Мембраноактивные соединения (антиоксиданты, регуляторы проводимости, детергенты и комплексного действия) повышают криорезистентность спермиев. Разработанные с их использованием среды для замораживания,спермы быка, барана и хряка способствуют улучшению восстановления функционального состояния спермиев после замораживания-оттаивания.

7. Стрессоры различной природы (гиподинамия, нарушение стадности, физические и химические воздействия) повышают уровень перекисного окисления в крови животных, что совпадает со снижением их воспроизводительной способности.

8. Антиоксиданты амбиол и СК-5 снижают степень окисленности липидов и образование малонового диальдегида в крови

животных, сокращают сервис-период, повышают оплодотворяемость, улучшают качество спермопродукции и способствуют нормализации гормонального статуса..

9. На основании проведенных экспериментов достигнуто улучшение воспроизводства стада путем увеличения эффективности хранения спермы вне организма, применения антиоксидантов и препаратов, корректирующих гормональный статус, а также снижения уровня экстремальных воздействий при воспроизводстве животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для повышения эффективности хранения спермы вне организма предлагаем использовать следующие защитные среды:

а). Среда IAMEK (а.с. № 1634268) для кри&консервации спермы быка следующего состава, мас./S: лакто^д. 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 11,5 ; мексидол 0,0000255 ; вода бидистиллированная до 100.

б).Среда ЛОЛА (а.с. № 1498489) для криоконсервации спермы барана следугацегд состава, мас.%: лактоза 8,8 ; глицерин 3,8 ; желток куриного яйца 11,5 ; 0ЛА (общие липиды актиноми-цетов) 0,015 ; вода бидистиллированная до 100.

в). Среда ГЦОП-^6 дош разбавления и хранения спермы барана при температурах выше 0°С, включающая следующие ингредиенты, глас.%: глюкоза 0,7 ; натрий лимоннокислый трехзамещен-ный пятиводный 2,4 ; желток куриного яйца 12,2 ; ОП-6 (хлор-гидрат-2-этил-6-метил-3-оксипиридин) 0,009 ; вода бидистиллированная до 100.

2. Рекомендуем применять препарат амбиол (положительное решение БНИИГПЭ от' 26.02.91 на выдачу а.с. по заявке

Л 4774697) для стимуляции репродуктивной функции коров и овец в дозе 0,4 мл/ЮО кг массы тела.

3. Предлагаем для широкого применения в практике технологию воспроизведения овец, включающую следующие разделы: подготовка инструментов, посуды, помещений и животных ; получение спермы ; криоконсервация спермы ; организация участка искусственного осейенения, выявление овцематок в охоте и их осеменение ; меры предосторожности ; учет результатов (Рекомендации: Адаптивная технология получения, криоконсервации и ис-

пользования семени барана// Кишинев:Молдагроинформреклама, 1992. 32 е.).

По теме диссертации опубликовано -70 работ, основные положения изложены в следущих:

1. Гуськов A.M. Количественные изменения фосфолипидов при низкотемпературном замораживании гамет хряков-производителей// Второй съезд физиологов МССР. Кишинев:Штиинца, 1980. С. 127-128.

2. Наук В.А., Гуськов A.M. Особенности перекисного окисления липидов при замораживании спермы быков- и хряков-производителей// Доклады БАСХНИЛ. 1983. * 2. С. 27-29.

3. Наук В.А., Гуськов A.M. Концентрация свободных радикалов в сперме хряков при замораживании// Доклады ВАСХНИЛ. 1983. * 8. С. 37-38.

4. Гуськов A.M. Криогенные изменения липидов и их влияние на функциональную полноценность гамет хряка и быка// Стресс, адаптация и функциональные нарушения. Кишинев: йпшнца, 1984..С. 274.

5. Наук В.А., Гуськов A.M., Борончук Г.В. Криорезистент-ность гамет самцов сельскохозяйственных животных в зависимости от содержания эндогенных липидов// Известия АН МССР: Сер. биол. и хим. наук. 1984. № 5. С. 56-61.

6. Наук В.А"., Гуськов A.M., Калистру В.Ф. и др. Среда для разбавления и замораживания семени сельскохозяйственных животных// Авторское свидетельство * II38I49. М., 1985. Бюл. * 5.

7; Наук В.А., Гуськов A.M. Среда дая разбавления и замораживания спермы 'хряков// Авторское свидетельство № II434I3. М., 1985. Бш. в 9.

8. Гуськов A.M. Физико-химическое состояние липидов и адаптация гамет самцов сельскохозяйственных животных к низким температурам// Научные основы адаптивной системы ведения животноводства. Кишинев:Штиинца, 1985. С. 23-24.

9. Наук ВЛ., Гуськов A.M. Криогенные изменения липидов и морфо-функциональных показателей гамет самцов сельскохозяйственных животных// Известия АН МССР: Сер. биол. и хим. наук. 1988. * I. С. 35-38.

10. Гуськов A.M., Дмитренко Н.Г., •Букарчук М.Г. Литщды плазматической мембраны и функциональная полноценность гамет быка при криоконсервации// Известия АН МССР: Сер.биол. и хим. наук. 1988. № 6. С. 46-49.

11. Гуськов A.M., Дмитренко Н.Г., Букарчук М.Г. Особенности криогенных изменений липидов плазматических мембран и функционального состояния гамет быка и хряка// Доклады ВАСХНИЛ. 1989. № 2. С. 26-28.

12. Наук В.А., Борончук Г.В., Гуськов A.M. и др. Проблемы и перспективы консервации генома сельскохозяйственных животных// Сельскохозяйственная биология. 1989. №2. С.25-32.

13. Гуськов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Антиокислительная активность липидов и функциональная полноценность гамет самцов сельскохозяйственных животных при криоконсервации//. Биоантиоксидант. М., 1989. С. 215-216.

14. Гуськов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Среда для криоконсервации семени барана// Авторское свидетельство № 1498489. М., 1989. Бюл. №29.

15. Гуськов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Криоза-щитная среда// Авторское свидетельство № I5408I7. М.,1990. Бюл. № 5.

16. Гуськов A.M., Пузына Г.И., Секрий И.Н. Физиолого-биохимические и технологические аспекты воспроизведения сельскохозяйственных животных// Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1990. Ч. И. С. I0-II.

17. Гуськов A.M., Наук В.А., Букарчук М.Г. и др. Липиды микроорганизмов при криоконсервации гамет самцов сельскохозяйственных животных// Микроорганизмы в кормопроизводстве. Кишинев:Штиинца, 1990. С. II9-I26.

18. Гуськов A.M. Разработка технологии осеменения овец// Зоотехния. 1991. № 4. С. 53-57.

19. Гуськов A.M., Наук З.А., Букарчук М.Г. и др. Среда для криоконсервации гамет// Авторское свидетельство

№ 1634268. М., 1991. Бюл. № 10.

20. Гуськов А., Пузына Т. Влияние антиоксидантов на воспроизводительную функцию коров// Молочное и мясное скотоводство. 1991. № 5. С. 23-24.

21. Гуськов A.M. Адаптивная технология воспроизведения овец// Рекомендации по технологии производства продукции овцеводства в. Республике Молдова. Кишинев:Молдагроинформ-реклама, 1992. С. 63-72.

22. Гуськов A.M. Некоторые механизмы криогенных повреждений, протекции, стресса и адаптации гамет к низким температурам// Биотехнологические аспекты развития.животноводства. Кишинев:Агроинформрекяама, 1992. С. 84-87.

23. Гуськов A.M., Дарий Г.Е., Пузына Г .И . и др. Повышение воспроизводительной функции высокопродуктивных коров стабилизаторами эндогенных гормонов и витаминов// Вопросы теории и практики животноводства Молдовы. Кишинев:Агроинформреклама, 1992..С. 82-63.

24. Гуськов A.M. Криопротекторный эффект мексидола и его практическое значение// Бюллетень Всесоюзного научного центра по безопасности биологически активных веществ. М., 1992. С. 46.

25.. Гуськов A.M., Дарий Г.Е., Казакова Ю.М., Букарчук М.Г. Адаптивная технология получения, криоконсервации и использования семени барана. Рекомендации (русск.,рум.). Киши-нев:Молдагроинформреклама, 1992. 32 с.