Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭПИДИДИМАЛЬНОГО СЕМЕНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С РАЗНЫМ СЕЗОННЫМ РИТМОМ РЕПРОДУКЦИИ В ЦЕЛЯХ СОХРАНЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭПИДИДИМАЛЬНОГО СЕМЕНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С РАЗНЫМ СЕЗОННЫМ РИТМОМ РЕПРОДУКЦИИ В ЦЕЛЯХ СОХРАНЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ"



На правах рукописи

Шишова Наталья Владимировна

Криоконсервацня эпидндимального семени млекопитающих с разным сезонным ритмом репродукции в целях сохранения биоразнообразия

Специальность 03.00,13— физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН и в отделе воспроизводства и трансплантации эмбрионов с.-х. животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители: доктор биологических наук

Абилов Ах меда га Имаш оглм; кандидат биологических наук Гахова Эдиг Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор биологичеких наук, профессор,

Клииский Юрий .Дмитриевич; доктор биологических наук Багнров Вугар Алипияз оглы.

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии мм, К.И» Скрябина,

Защита состоится « 2006 г. в /сЛасов на заседании

диссертационного совета Д006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская обл., Подольский район, п. Дубровицы, т/факс (4967)651101

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан г ф 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических іііуі

В. П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Сперматозоиды, выделенные из половых органов павших животных, являются важным источником генетического материала для криоколлекций. Криоконсервация таких сперматозоидов - это также последняя возможность сохранить генофонд ценных особей при их неожиданной гибели.

Еще в начале XX века русский ученый И.И. Иванов обратил внимание на тот факт, что в изолированном эпидидимисе сельскохозяйственных животных живые, активные сперматозоиды сохраняются не менее 5-7 дней (Иванов, 1907). Именно Иванов первый высказал мысль, что жизнеспособные сперматозоиды, выделенные из половых органов павших животных можно использовать для спасения наследственности ценных особей.

После открытия в 1947 году возможности сохранения оплодотворяющей способности семени животных при замораживании (Соколовская, 1947), большое значение приобрело сохранение генофонда животных с помощью криоконсервации спермы.

Но только в 80-х и 90-х годах появился ряд работ по криоконсервации эпидидимальной спермы млекопитающих постморталь ного периода (Шайдулин, Ролдугин,1986; Сипко и др., 1993; Эрнст и др., 1998; Krzyvinski, 1981; Miles et at., 1992; Marks et al., 1994; Jewgenow et al., 1997; Ponce et al., 1998; Lambrechts et al., 1999; Blash et al, 2000; и др.). В этих работах ссмя использовалось в течение t-4 часов после смерти животных.

Однако в отличие от плановых отстрелов, при неожиданной гибели животных практически невозможно произвести выделение и обработку семени в столь сжатые сроки. В конце 90-х - начале 2000 годов в ряде опубликованных работ было показано сохранение оплодотворяющей способности эпидидимальных сперматозоидов в течение нескольких дней после гибели организма (Songsasen et al., 1998; Kîkuchï et al., 1998; Kishikawa et al., 1999; Yu, Leibo, 2002).

Несмотря на вышеперечисленные материалы, в проблеме криоконсервации постмортальн ого семени животных остается много неясного. До сих пор нечетко определена длительность функциональной активности эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных и границы возможного использования этих клеток для криоконсервации. Для подавляющего большинства диких видов, имеющих ярко-выраженную сезонность размножения, не определены календарные сроки, при которых возможно извлечение и криоконсервация постморггального семени. Кроме того, для криоконсервации постмортаЦЬНШU с;;иснн

основном используют методы, разраб< танн^^щ ^я^сул^гр^тИежду тем, физиология эякулированных и эпидщц: РЯД

отличий, которые могут сказаться на от шг^^щ dbtv1

- № Ж —36

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — изучить возможности использования для криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих с сезонным и непрерывным сперматогенезом в разные сроки постмортального периода на примере оленя, суслика и лабораторной мыши.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать физиологическое состояние жизнеспособных сперматозоидов в эпидшшмисе в разные сроки после смерти животного.

2. Изучить устойчивость эпидидимальных сперматозоидов, выделенных в разные сроки после смерти, к процессу криоконсервации.

3. Оптимизировать криопротектирующу ю среду для криоконсервации сперматозоидов позднего постмортального периода.

4. Сравнить жизнеспособность эпидидимального семени при хранении целых тушек или изолированных семенников.

5. Исследовать возможность криоконсервации эпидидимальной спермы вне периода гона для животных с ярко-выраженной сезонностью размножения.

Научная новизна. Впервые криоконсервировано эпдпидимальное семя оленя вне периода гона (в охотничий сезон, до 4 месяцев после окончания гона). Показана возможность криоконсервации сперматозоидов до 6 суток после отстрела оленей.

Впервые получены жизнеспособные замороженно-оттаянные сперматозоиды азиатского длиннохвостого суслика, относящегося к зимоспящим млекопитающим.

Показана возможность криоконсервации эпидидимальных сперматозоидов мыши до 5 суток после смерти организма. Обнаружено, что в постаортальный период (до 5 суток) сперматозоиды мыши снижают поступательную подвижность, но при этом сохраняют целостность клеточных мембран.

Выявлено положительное воздействие антиоксидантов в составе криозащитных сред на сохранность клеточных мембран замороженно-оттаянных сперматозоидов мыши, выделенных и замороженных через сутки после смерти животного.

Научно-практическая ценность. Работа имеет как теоретическую, так и практическую значимость. Данные о сроках выживания и физиологических изменениях эпидвдимальных сперматозоидов после смерти животных при холодовом (+4ЭС) хранении расширяют знания по физиологии эпидидимальных сперматозоидов, и могут внести вклад в понимание механизмов деградации клеток в условиях холодовой ишемии.

Результаты работы позволяют существенно увеличить интервал времени между гибелью животных и криоконсервацией постмортального семени без потери жизнеспособности сперматозоидов.

Показано, что период, при котором в половых органах обнаруживаются пригодные для криоконсервации сперматозоиды, превышает сезон гона, по крайней мере, для двух представителей разных систематических групп млекопитающих с сезонным размножением (благородный олень, азиатский

4

длиннохвостый суслик). Это существенно расширяет границы использован л я эпидидимального семени постмортального .периода для криоконсервацни, и способствует увеличению роли данного метола в сохранении генетических ресурсов.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы в работах по дгпшййшему усовершенствован ию методов криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих для создания генетических низкотемпературных коллекций.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ежегодных отчетах лаборатории крнокоисервации генетических ресурсов 11БК в 1998 - 2005 гг; на научно-практической конференции «Зоокультура л биологические ресурсы» 4-6 февраля 2004 г. Москва; на Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов», 19-22 октября 2004г, Санкт-Петербург; на научно-практической конференции «Сохранение разнообразия животных и охотничье хозяйство России» 24-25 февраля 2005 г. Москва.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на семинаре лаборатории криоконсерваши генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН (апрель, 2006) н на научной конференции отдела биологии воспроизводства и трансплантации эмбрионов с.-х. животных им. академика В.К. Мнлованова (апрель, 2006).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список использованной литературы.

Текст изложен на 120 страницах, содержит 16 таблиц и 23 рисунка. Библиография включает 176 источника, из них 70 отечественных и 106 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Для решения поставленных задач был проведен ряд экспериментов согласно схеме на рис, 1. Эксперименты выполнены в течение 1992-2005гг.

Эксперименты по выживаемости сперматозоидов в эпидидимисах пааших животных и по оптимизации методов криоконсервацяи быш выполнены на лабораторных мышах и па диких оленях.

Для исследований, связанных с сезонностью, были использованы виды с ярко выраженной сезонностью размножения - пятнистый и благородный олени (Cenms nipp/>n. Cerviiy efophus\ и азиатский длиннохвостый суслик (CiteHus undulatus). При этом выбранные виды имеют разный тип сезонной регуляции сперматогенеза.

Криоконсервация эпндидимального семени

Животные с непрерывным сперм атогенезом

Лабораторная мышь (п=160).

Жизнеспособность и криорезистстность эп идидимал ы юго семени

Качество семени в разные сроки постмортального периода

Оптимизация криокоисервации

семени постмортального _периода_

Животные с ярко выраженной сезонностью сперматогенеза

Олень (п=7) фотозависимый сперматогенез

Качество и криорезистешноегь семени в за&ксимости от сезона.

Количественные н качественные показатели семени оленя зимой.

Жизнеспособность н криорездате і ітность семени

б постморгальны Й период

Суслик (пя2]) эндогенный сезонный ритм

Количественные и качественные показатели семени в зависимости от сезона

Морфология сперматозоидов, количественные и качественные показатели семени

Криоконсервация и криореэнсгенткостъ семени в _весенний период._

Рис. 1. Схема экспериментов.

Пятнистый и благородный олени являются типичными фотозависимыми видами. Сезонная регуляция сперматогенеза этих животных происходит пол воздействием длительности светового дня, актнвируясь в осенне-зимний период при сокращении светлого периода суток.

Азиатский длиннохвостый суслик относится к знмоспяшим млекопитающим с эндогенной регуляцией сезонных циклов репродукции. Сперматогенез сусликов активен весной, после выхода из спячки. Годовые циклы репродуктивной системы сусликов не меняются при искусственном изменении фотопериодичности и температуры окружающей среды.

Эксперименты на мышах и сусликах проводили на базе лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН. Эксперименты на оленях проводили на базе отдела Воспроизводства с.-х. животных и трансплантации эмбрионов Всероссийского института животноводства и лаборатории криоконсервации геи. ресурсов ИБК РАН.

Использованы мыши линии NMRI, содержащиеся в виварии ИБК РАН, азиатские длиннохвостые суслики якутской популяции, отловленные из дикой природы и содержащиеся в виварии ИБК, и олени из дикоживущей популяции Приокско-Террасного заповедника (Московская обл.).

Изолированные половые органы оленей и мышей или тушки мышей до выделения семени хранили при +4°С. Половые органы оленей хранили в естественных оболочках, включая мошонку, без дополнительной обработки.

Семя оленя замораживали в фану л ах с использованием лактозо-желточ но-цитратн о-глиаер и ново й среды по методу, разработанному для криоконсервации спермы быков (Милованов, 1962).

Замораживание семени мышей осуществляли в соломинках, в парах жидкого азота, VOMi«l 0-203С/мин. Состав криопротектирующей среды: 0.29 М сахарозы, 0,17 М ДМСО, 5% яичного желтка, 9 мМ HEPES, рН §,8.

Элидидимальное семя суслика проверяли на холодоустойчивость. Дм этого семя, суспендированное в среде (0,11М цитрата натрия, 0,3 4М сахарозы) охлаждали до -ЫеС, и выдерживали при этой температуре 2,5 часа. Криоконсервацию семени суслика проводили в гранулах по 0,05 мл в парах жидкого азота, 10-20°С/мин. Были апробованы несколько

криопротектирующих растворов, представляющих собой различные модификации криоп рюхе котирующего раствора для замораживания семени мыши. Состав криопротектирующей среды, позволившей получить наиболее высокий процент выживаемости сперматозоидов, приведен в результатах экспериментов.

Качество сперматозоидов оценивали по нескольким параметрам. Для оценки подвижности семени визуально подсчитывали долю сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ПДЦ) и долю сперматозоидов, проявляющих любой тип движения (ОП). Переживаемость оценивали по максильному времени подвижности сперм пев в культуре in vitro при 37°С. Для определения целостности клеточных мембран использовали люминесцентный метод с применением красителя этидий бромида (ЭБ) (Мельникова, 1978), Целостность акросом сперматозоидов оленя оценивали

акроскопическим методом (Соколовская и др. ,1982). Капацитащио и целостность акросом спермиев мышей определяли люминесцентным методом по окрашиванию хлортетраци клином (Ward, Storey, 1984).

Статистический анализ проведен с использованием возможностей программ "Excel" и "Sigma-Plot".

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Качество нативного и заморрженно-оттаянного семени мыши fMus tmisculusV выделенного из тушек в разные сроки после смерти. Были исследованы физиологические характеристики нативных и замороженно-оттаянных образцов эпидидимального семени, полученного сразу после забоя животных и через 3,5 — 120 часов хранения тушек мышей при +4°С.

При хранении тушки мыши при -Ь4°С, содержащиеся в придатке семенника сперматозоиды сохраняли жизнеспособность в течение всего периода эксперимента, до 5 суток.

В таблице 1 представлены результаты исследования нативных сперм атозоидов.

Таблица 1. Зависимость физиологических показателей эпидидимальной спермы мышей от длительности хранения тушек.

Показатель Коэффициент корреляции Коэффициент регрессии или тип аппроксимации

Подвижность сперматозоид о в ППД -0,54 ±0,18 логарифм.

ОП -0,38 ± 0,18 логарифм.

Переживаемость 0,46 ±0,19 +0,48 ± 0.13 час / сутки

Отношение ППД к ОП -0,47 ± 0,15 логарифм.

Агглютинация спермиев 0,27 ± ОД 1 -

Меченные этидий бромидом 0,07 ± 0,25 +0,6 ± 1,2 %/сутки

Примечание. Коэффициент регрессии дан только в том случае, если экспериментальные данные не позволяют выявить явного отклонения от линейного типа зависимости.

Более всего длительное хранение тушек отразилось на способности сперматозоидов к прямолинейному поступательному движению (К= -0,54±0,]8)., При этом зависимость снижения доли сперматозоидов с ППД от сроков хранения тушек наиболее достоверно аппроксимировалась логарифмической кривой {рис. 2).

80% - □

70%

п л □

ч 60% -X __

1 50% ■ ♦ Г1 а

з 40% о 13 □ " и' В "0

а. V ♦

2 зо% 1 х в ♦

и

3 20% ♦

• # -----?

10% ♦

ло/ ♦ ♦

ил 24 48 72 длительность

0 96 120 хранения (час).

Рис. 2. Доля подвижных сперматозоидов в пробах, выделенных из тушек разного срока хранения. Представлена логарифмическая аппроксимация данных эксперимента, ■—♦— — ППД, — —о— — — ОП.

Наиболее значительное снижение количества подвижных сперматозоидов и происходило в первые сутки хранения. В дальнейшем двигательная активность сперматозоидов изменялась медленнее.

Окрашивание сперматозоидов этидий бромидом показало, что проницаемость клеточных мембран в течение 3-х суток не изменялась, И=-0,54±0,18 (табл.1). Количество окрашенных сперматозоидов, т.е. с поврежденными клеточными мембранами составило 19±10% клеток в первые сутки, 18±9 - в коше третьих.

Переживаемость выделенных сперматозоидов в культуре при 37*С возрастала по мере увеличения продолжительности хранения тушек мышей, 0,46±0,19 (табл. 1).

Зависимость физиологических показателей криоконсервированного семени мышей от длительности хранения тушек перед криоконсервацией (до 3-х суток) показана втаблице 2.

Подвижность (ПТЩ) оттаянных сперматозоидов, подобно незамороженным, существенно зависела от длительности хранения тушки (Я= -0,77+0Д 6).

Таблица 2. Зависимость качества замороженно-оттая нного семени от длительности хранения тушек мышей перед криоконсервацией.

Показатели Коэффициент корреляции Коэффициент регрессии, % / сут, кроме*

Подвижность сперматозоидов ППД —0,77±0,1б Логарифмич. зависимость

ОП 0,0610,25 0,5*1,2

Пережизаемость 0ДЗ±0,24 0,3110,14* час/сут

Отношение подвижности до и после консервации ППД 0,17±0Д5 3,012,7

ОП 0,21 ±0,2 4 2,812,0

Отношение переживаемости до и после криоконсервации -0,2710,24 —14,6±8,7

Меченные этидий бромидом 0,1410.25 1,311.8

Капацитировавшие сперматозоиды 0,8410.13 4,410,5

Сперматозоиды с утерянной акросомой 0,4810,22 1,0Ю,4

Суточное хранение тушек снижало ППД замороженно-оттая нного семени в 2 раза, с 20 до 11% (р<0,05), хранение в течение 48 часов — в 3 раза, до 6% (р<0.05) и в течение 72 часов - в 6 раз, до 2% (><0,01). Хранение тушек мышей в течение Зх суток практически не отражалось на общем количестве подвижных (ОП) сперматозоидов (11=0,0610,25).

Переживаемость оттаянных сперматозоидов недостоверно возрастала при увеличении сроков хранения тушки, (4,310.5 в первые часы хранения и 5.0;Ь0,8 после Зх суток хранения).

Не выявлено достоверного влияния хранения тушек на состояние клеточных мембран сперматозоидов по окрашиванию ЭБ, Корреляция этого показателя с длительностью хранения составила 0,14±0,25.

Количество капацитировавших сперматозоидов зависело как от факта охлаждения тушки, так и от длительности её хранения (рис, 3), После предварительного охлаждения тушек, в криоконсервированном семени доля капацитировавших сперматозоидов снижалась с 11 до 3% (р<0.05). При хранении тушек свыше 48 часов количество капацитировавших сперматозоидов в пробах вновь возрастало.

Выявлена зависимость целостности акросом от длительности хранения тушек перед криоконсервацией семени, 11=0,4810,22 (табл. 2). Но в целом количество сперматозоидов с утерянной акросомой было незначительным (рис. 3).

20п

Ш

I"

0

1

И 10

о.

V

с о

О 5 а

охлажденне

I I Ц 1п

■ — количество капацитировавтих сперматозоидов, □ — количество сперматозоидов, утерявших акросому; вертикальные линии — доверительный интервал для р<0,05

0ч 3,5ч 24ч 48ч 72ч

длительность хранения тушки, (час)

Рис 3. Количество капаиятировавших и лишенных акросомы сперматозоидов в образцах, замороженных в разные сроки после смерти животных.

По результатам эксперимента корреляция между количеством кападитировавших сперматозоидов и сперматозоидов с утерянной акросомой составила 0,77. Это может свидетельствовать о том, что утеря акросом происходит не за счет механических повреждений в процессе криоконсервации, а вследствие индуцированной холодом преждевременной акросомной реакции. Это является результатом либо перезревания сперматозоидов при длительном хранении, либо утери эпидидимальной плазмой факторов декалацитаяии.

В общем, поведение сперматозоидов в охлажденных тушках животных вполне согласуется с современными представлениям о механизмах клеточкой смерти при холодовой ишемии. Начальная стадия реакции клетки на ишемию - нарушение энергетических процессов и образование энергетической задолженности (Шумаков, 1975). Действительно, наши данные показывают, что быстрее и сильнее всего в постмортальный период страдает такой энергоемкий процесс, как поступательная подвижность сперматозоидов.

Полагают, что в ищемизированных тканях повышение проницаемости мембран клетки предшествует необратимым деструктивным изменениям (Шумаков, 1975, Иванов, 1995). Поэтому отсутствие существенного изменения проницаемости клеточных мембран сперматозоидов в исследуемые нами сроки позволяет! предположить, что наблюдаемые негативные изменения обратимы, хотя бы частично.

3.2. Оптимизация условий хранения семенников и крноконсервации семени постмортадьного; периода.

Мы сравнили физиологические характеристики сперматозоидов мышей при различных способах хранения половых органов для определения наиболее оптимального варианта.

Качество сперматозоидов оценивали при хранении изолированных семенников в физиологическом растворе при +4°С (0.9% МаС1), и в среде, разработанной для холодовой консервации почек (Шумаков и др., 1983) при той же температуре. В качестве контроля использовали данные эксперимента по выживаемости эпидидимальных сперматозоидов в целых тушках мышей, охлажденных до +4®С.

Не было обнаружено достоверной разницы по таким показателям, как переживаемость сперматозоидов при 37®С, общая и прямолинейно-поступательная подвижность.

Целостность клеточных мембран сильнее нарушалась при хранении изолированных семенников в растворах, чем в целых тушках (рис, 4).

Р

X 2 о.

6050 40 -3020 • 10-

хранение в тушках в физ. растворе е среде для консервации почек

Ли.ИИ"

20

40

60

60

длительность хранения, час.

Рис. 4. Целостность клеточных мембран сперматозоидов при хранении в тушках и изолированных семенниках в разных средах.

Данные эксперимента свидетельствуют, что хранение выделенных половых органов в указанных растворах не имеет преимущества по сравнению с хранением в целых тушках мышей.

На основании описанных выше результатов по криоконсервации семени мышей мы пришли к выводу, что для улучшения качества замороженного семени постмортального периода полезно ввести в среду факторы, компенсирующие негативные последствия холодовой ишемии.

Основанием для модификации криопротектирующего раствора для послужили два предположения;

-Первое основано на результатах предыдущих экспериментов, и состоит в том, что в постмортальном периоде энергетическое голодание сперматозоидов наступает гораздо раньше, чем необратимые повреждения клеток.

-Другое касается значительной роли перекисного окисления липидов в снижении криорезистентности сперматозоидов. Полагают, что перекисное окисление липидов играет существенную роль как в клеточной смерти при холодовдй ишемии в изолированных органах (Шумаков, 1975, Иванов, 1995), так и при криоконсервации сперматозоидов (Наук, 1991). Очевидно, что при криоконсервации сперматозоидов постмортального периода, когда мы имеем сочетание воздействий холодовой ишемии и криоконсервации, негативное воздействие перекисного окисления липидов может оказаться особенно значительным.

Для компенсирования негативного воздействия энергетического голодания и перекисного окисления липидов в криопротектирующий раствор были введены метабсышзируемый сахар и антиокстданты. Глюкозу добавляли в небольшой концентрации (0.5%), недостаточной для оказания криопротектирующего эффекта, но достаточной для ее использования в качестве экзогенного метаболита. В качестве антиоксвдантов в раствор добавляли водорастворимый эмохсипин с жирорастворимым а-токоферол-ацетатом. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Как видно из представленного материала, ни глюкоза, ни антиоксид анты, ни сочетание этих веществ не оказывали существенного влияния на подвижность сперматозоидов после оттаивания.

В то же время добавление антноксидантов и/или глюкозы оказывало стабилизирующий эффект на мембраны сперматозоидов в процессе криоконсервации. Как видно из табл. 3, одновременное добавление этих веществ в криопротектирующий раствор снижало количество сперматозоидов с поврежденными мембранами с 48 до 36% (р<0,05). Кроме того, об улучшении состояния мембран также говорит снижение агглютинации сперматозоидов.

3.3. Криоконсервация эпидидимального семени

оленей (С. труоп. С. е1арких}

Мы обследовали семенники оленей в течение зимнего сезона, спустя I-3 месяца после окончания гона. В течение охотничьего сезона нам удалось получить образцы от 7 животных. У большинства самцов в суспензии эпидидимиса обнаружены живые и подвижные спермин, в том числе у особей, отстреленных в феврале, в конце охотничьего сезона.

В течение трех зимних месяцев не было зафиксировано достоверной зависимости качества семени от календарных сроков отстрела (табл. 4,).

Таблица 3. Качество эпидидималыюй спермы мышей, замороженной через 24 часа после смерти. Влияние глюкозы и а ¡тюкснда! ггов.

№ группы Криопротектирущая среда п Агглютинация, баллы (0-6) Подвижность отгаяного семени Персживаемость отгаяного семени, час. Сперматозоиды меченные Э1>, %

ППД,% ОГ1,%

1 Контроль (К)1 10 3*2±1,4* 12±4 28±7 4,3±0,9 48±5**

2 К + глюкоза 8 2 ,<Ш,6 12+1 29±5 5,5±0,7 * 42±»

3 К + антиоксндантыг X 1,б±],3 13±3 25±3 3,5±0,7 * 42+6

4 К + глюкоза и ю и±о,б* 13±2 27±5 36±4**

аитиохсидапты1

1+3 Все образцы без 18 2,4±1,1 12±3 27±4 4,3+0,9 46±4*

глюкозы

2+4 Все образцы с 18 !;6±0,8 13+1 *27±3 4,6+0,9 39±5* ■

глюкозой

1+2 Все образцы без 18 2,9±1,2* 12+3 28±5 4,6±1,0 4б±4*

атиоксндантов

3+4 Все образцы с 18 1,5±0,7* 13±2 26±2 4,00±0,7 40+4*

анантиоксидантами1

Даны средние значения и доверительный интервал для р<0.05. * р<0.1. * * р<0.05.

1 В Качестве контроля использовалась сахарозо-11ЕРЕ8-желточная среда с 1,3% ДМСО. 3 В Качестве аниюкгсндаятов использован эмошшмн + А-токофератацег.

Таблица 4. Зависимость качества семени оленей от времени, прошедшего после окончания гона.

Показатель коэффициент корреляции

Подвижность эпидидимального семени до замораживания ППД - 0,33 ± 0.47

ОП - 0,19 + 0.48

Концентрация сперматозоидов в полученной суспензии - 0,44 ± 0.47

Подвижность эпидидимального семени после криоконсервации ППД - 0,08 ± 0.45

ОП 0,05 ± 0.45

Целостность акросом после криоконсервации - 0,42 ± 0.43

Отношение подвижности семени до и после криоконсервации ППД 0,38 ±0.46

ОП 0,39 ±0.46

Из таблицы 4 видно, что наблюдалась тенденция к снижению подвижности семени оленей, к уменьшению общего количества выделенных сперматозоидов к концу сезона и к снижению количества сперматозоидов с целыми акросомами. Криорезистентность 'сперматозоидов, оцененная по отношению подвижности до и после криоконсервации, не только не снижалась, но имела тенденцию к повышению.

На примере оленя также была исследована длительность выживаемости сперматозоидов после смерти животного. Семенники с придатками изолировали в течение часа после смерти и хранили при +4°С. В течение от I до б суток половые органы транспортировали в лабораторию, где проводили выделение семени из эпидидимисов.

Все исследованные образцы семени, независимо от сроков хранения семенников, содержали активные сперматозоиды, в том числе при максимальном сроке хранения - б суток. Количество сперматозоидов с поступательным прямолинейным движением колебалось от 30 до 80%.

В целом, изменение качества семени оленей (табл. 5) в разные сроки после отстрела животных подтвердило те закономерности, которые были обнаружены в экспериментах на мышах.

Как можно видеть, наиболее сильно длительное хранение семенников оленей влияло на целостность акросом (К= -0,88 ± 0.27). Согласно коэффициенту регрессии каждые сутки хранения приводили к потере почти 8% акросом.

Также, при длительном хранении семенников существенно снижалась подвижность семени оленей (ППД, Я=-0,50±0.43; ОП, И= -0,51 ±0.43).

Таблица 5. Зависимость качества семени оленя от сроков хранения выделенных половых органов.

Показатель Коэффициент корреляции Коэффициент регрессии, %/сутки, кроме*

Подвижность семени до замораживания ппд -0,29 ± 0,47 "343 ±5,49

оп -0,40 ± 0.37 -3,30 ±5,75

Концентрация сперматозоидов в полученной суспензии 0,14 + 0.49 037 ±1,51 * мли/мл/сут

Подвижность семени после криоконсервации ппд -0,50 ±0.43 -333 ± 2,81

ОП -0,51 ± 0.43 -4,89 ± 4,11

Целостность акросом после криоконсервации -0,88 ± 0.27 -7,74 ± 2,39

Отношение подвижности до и после криоконсервации ППД -030 ± 0.45 -4,10 ±4,11

ОП -0,24 ± 0.48 -4,22 ± 8,75

При увеличении длительности хранения семенников не было выявлено достоверных изменений криорсзистентности семени, которую оценивали по отношению подвижности до и после криоконс ервации.

Таким образом, в охлажденных половых органах отстреленных оленей не менее 6 суток сохраняются живые, активные сперматозоиды. Эпидидимальное семя оленей, выделенное в течение 6 суток после отстрела животных, адекватно переносит процесс криоконсервации.

Как показали наши эксперименты, эпидидимальная сперма оленей вполне пригодна для криоконсервации в течение всего зимнего периода. В целом, включая период гона, получение пригодных для криоколлекций образцов семени возможно не менее б месяцев в году, с сентября по февраль.

3.4. Качество и криорезистентность семени азиатского длиннохвостого суслика в течение весеннего сезона.

В доступной литературе информации о свойствах семени азиатского длиннохвостого суслика нет. В связи с этим работа была начата с морфологического описания сперматозоидов этих животных.

Сперматозоиды суслика имеют строение, типичное для сперматозоидов млекопитающих (рис, 5). У них можно выделить головку с акросомальной и постакросомалъной областью, шейку и хвост. Головка имеет широкую, округлую форму с размерами 9.8x7.5 мкм. Ядро занимает не более половины площади головки в горизонтальной проекции и имеет размеры 7.1x5.5 мкм. Акросомальная часть составляет = У* головки сперматозоида. Акросома имеет ярко-выраженное апикальное расширение, причем апикальное расширение акросомы расположено как бы в стороне от плоскости, в которой

16

расположено ядро сперматозоида, что придает головке сперматозоида неровную, выгнутую, «лопатообразную» форму. Хвост сперматозоида имеет длину 92.5 мкм, основная часть относительно короткая и составляет 11 мкм. Концевой отдел хвоста дифференцировать не удалось.

7.2

*->

_ч V---— / V ) -— І 5.5 ^f ,

....... 11.0 ^-у-

. 9.8 «-

Рис 5. Схема строения сперматозоида азиатского длиннохвостого суслика.

Для уточнения сроков, в течение которых в эпидидимисе сусликов можно обнаружить пригодные для криоконсервации сперматозоиды, нами были обследованы половые органы самцов, начиная с февраля по июнь. В условиях содержания животных в виварии ИБК РАН, в исследуемые годы самцы начинали пробуждаться в середине Марта и полностью переходили к активному состоянию после 24-26 марта (рис. 6 А).

Сформировавшиеся сперматозоиды в семенниках начинали появляться во второй декаде марта. В придатках семенника отдельные сперматозоиды были отмечены в середине марта. При этом эпидндимальные сперматозоиды были обнаружены только у пробудившихся зверьков. С конца марта, после пробуждения всей популяции, сперматозоиды обнаруживались у всех обследованных животных. В течение апреля зрелые сперматозоиды отмечались как в семеннике, так и в эпидидимисе. В середине мая сперматозоиды обнаружены в эпидидимисе,1 но не в семенниках. Начиная со второй половины мая и позже, сперматозоида в семенниках и эпидидимисе отсутствовали.

Как показано на рис. 6 Б, количество подвижных сперматозоидов возрастало от момента пробуждения животных до середины апреля. В середине апреля наблюдалась максимальная активность семени - нормальный поступательный тип движения имели 50-55% сперматозоидов. Общее число подвижных сперматозоидов составило 60-70%. С середины до конца апреля семя оставалось активным, в середине мая обнаруженные сперматозоиды были неподвижны.

пробуждение

гон

I ™ к/лиао— \ А

сперматозоиды в эпидидимисе

1 1 1 1 I 11 I" ■ ■ Г - I ■

03 15.01 01.04 15.04 01.05 15.05 01.06

дата

Рис. 6. Схема наличия (Л) н подвижности (Б) слерматозоидов в эпидидимисе сусликов в зависимости от календарных сроков.

в-ОПи ♦-ПДсвежевыделешюго семени;

□ - ОП семени после охлаждения в течение 2,5 часов.

В целом, активные сперматозоиды в эпидидимисе азиатского длиннохвостого суслика выявляются приблизительно в течение двух месяцев, что примерно в 2.5 - 3 раза превышает по длительности период гона у этого вида, продолжительность которого составляет 2 -2,5 недели.

В настоящее время разработанных методов криоконсервации семени суслика нет. Поэтому нами были проверены несколько способов криоконсервации семени. Протокол замораживания и криопротектирующая среда в этих экспериментах основывались на методах замораживания спермы мышей, как наиболее близкого вида.

Наиболее удачной оказалась криоконсервация семени суслика по способу быстрого замораживания (пары жидкого азота, Уочя=10-20гС/мин) в криопротектирующей среде следующего состава: №01 - 8 г/л (137 мМ),КС1 -0,2 г/л (2,6мМ), СаСЬ-0,1 г/л (0,9'мМ), МеСЬ- 0>05 г/л (0,5 мМ), КагНР04*1,15г/л(8,1мМ), КН2Р04 - 0,2 г/л (1,5мМ>, сахароза-50 г/л (0,15 М), глицерин - 60 г/л (0,32 М), к полученному раствору добавляли 20% желтка куриного яйца, р! I раствора - 6,8.

В таблицей показано изменение подвижности семени суслика до и после криоконсервации по этому методу. Сперматозоиды суслика показали низкую устойчивость к низким температурам. Тем не менее, наши данные позволяют считать доказанной способность сперматозоидов азиатского длиннохвостого суслика выдерживать глубокое замораживание.

Таблица 6. Подвижность семени суслика до и после криококсервашш.

Подвижность до замораживания, %. Подвижность после оттаивания, %,

ппд оп ППД ОП

35 (30-40) 45 (40-50) 15 (0-25) 17(0-28)

Даны средние и крайние значения.

В связи с низкой результативностью криоконсервации семенн сусликов, криорезистентность сперматозоидов суслика оценивали по подвижности после двухчасового охлаждения до +4°С, без замораживания. Охлаждение проводили в фосфатно-солевом растворе Дюдьбекко с добавлением 10% сахарозы и 20% яичного желтка.

Для анализа изменения криорезистентн ост и сперматозоидов в течение весны, весь период, при котором в эгсидидимисе наблюдались активные сперматозоиды, условно разбили на 3 части. В таблице 7 приведены данные об обшей подвижности семени суслика до_ и после охлаждения в первую, среднюю и последнюю трети периода активного сперматогенеза.

Таблица 7, Общая подвижность эпидщшмального семени суслика до и после охлаждения.

Календарные сроки Общая подвижность, %. Соотношение подвижности до к после охлаждения, %

Контроль (свежевылелеиное) после охлаждения (+4*С)

15.03-05.04 35±7 7*5±2 23±9

06.04-25.04 58±8" 9±2 16±5

26.04-15.05 45±5 15±1 33±4

Как видно из таблицы, резистентность сперматозоидов к охлаждению была наиболее низкой в середине периода активного сперматогенеза. 8 эти сроки двухчасовая выдержка при низкой температуре приводила к снижению общей подвижности семени более, чем в б раз (с 58 до 9%). К концу периода гона наблюдалась некоторая тенденция к повышению устойчивости сперматозоидов к охлаждению. В этот период холодовая эквилибрация вызывала снижение общей подвижности семени только в 3 раза (с 45 до 15%).

Аналогичные выводы о кряорсзистентности можно сделать и на основе анализа результатов криоконсервации (рис, 7). Если данные по подвижности заморожено-отгаяшщх спермиев сгруппировать по календарным срокам эксперимента, то можно видеть, что положительные результаты криоконсервадаи получены в конце периода активного сперматогенеза. Именно в эти же сроки наблюдали повышение устойчивости сперматозоидов к охлаждению (табл. 7). Возможно, выживаемость сперматозоидов суслика в процессе криоконсервацни зависит не только от способа крнокхшеервацни, но и от сроков выделения сперматозоидов.

Рис, 7. Схема результатов криоконсерадшш семени суслика в зависимости от календарных сроков получения семени: жизнеспособное (ш) и нежизнеспособное (—) семя.

Полученные данные свидетельствуют, что у азиатского длиннохвостого суслика наличие зрелых сперматозоидов в придатках семенника наблюдается несколько дольше сезона спаривания. Гон у этого суслика в природных условиях длится 2-2.5 недели. Подвижные сперматозоиды в придатках семенника обнаруживаются в течение более длительного периода - около двух месяцев.

Криорезистентность сперматозоидов сусликов меняется в течение периода активного сперматогенеза. Наиболее высокая устойчивость к охлаждению наблюдается в последнюю треть этого периода. Колебания кркорезистептности семени могут либо отражать зависимость криорезистентности от фазы сперматогенеза и связанного с ним гормонального статуса животных, либо от физиологи четкого состояния, связанного с выходом животных из спячкн.

Заключение.

В работе показано, что возможности использования генетического материала для создания криоколлекций, поддерживающих биоразнообразие, достаточно широки. У животных с выраженной сезонностью репродукции сроки, в течение которого семенники содержат пригодные для

20

криоконсервации сперматозоиды, превышает период гона. В некоторых случаях, например у оленей, весьма значительно.

Сперматозоиды в семенниках павших животных сохраняют жизнеспособность достаточно долго, что позволяет при неожиданной гибели ценных особей в отдаленных районах производить доставку постмортального генетического материала в центры по криоконсервации. Результаты исследований свидетельствуют, что качествр семени из семенников павших животных позднего постмортального периода можно повысить с помощью снижения или компенсации негативного воздействия холодовой ишемии. Показано, что в этом направлении является перспективным поиск способов компенсации энергетической задолженности и защита против перекисного окисления липидов.

4. ВЫВОДЫ:

К Сперматозоиды мыши (М ттси1ги) и оленя (С.е!а/ш) сохраняют жизнеспособность и нормальную криорезистентность не менее 5-6 суток после гибели особи-донора.

2. Хранение половых органов животных (мышь и олень) в течение 5 суток - существенно снижает способность сперматозоидов к поступательному

движению и целостность акросом, но не вызывает необратимых повреждений клеточных мембран,

3. Антиоксиданты (а-токоферол с эмоксипином) в составе крнопротектирующей среды положительно влияют на целостность клеточных мембран эпидидимальных сперматозоидов (кол-во сперматозоидов с поврежденной мембраной снижалось на 13%).

4. Эпидндимальное семя благородного оленя пригодно для криоконсервации не только в сезон гона, но и в течение Зх месяцев после его окончания.

5. Эпидидимис азиатского длиннохвостого суслика содержит подвижные сперматозоиды в течение 1,5*2 месяцев, что в 3 раза превышает период гона. В остальное время года сперматозоиды отсутствуют.

6. Криорезистентность сперматозоидов азиатского длиннохвостого суслика меняется в течение весны (с конца марта по середину мая) и повышается (>70%) в конце периода активного сперматогенеза (первая половина мая).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Криоконсервацию семени благородных оленей можно осуществлять с сентября по февраль включительно.

2. При гибели мелких животных целесообразно хранить целые неразделанные тушки, а семенники изолировать непосредственно перед выделением семени.

3. Семя суслика возможно криоконсервировать с помощью быстрого замораживания с предварительной эквилибрацией при комнатной температуре (18вС) в сахарозо-жлточной среде на основе фосфатно-солевого раствора Дюльбекко с 6% глицерина.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Сипко Т.П., Лбилов Л.И., Шишова Н.В. Криоконсервация постмортальной спермы оленей. //Биофизика живой клетки. 1994, т. 6, стр. 127-128.

2. Шишова Н.В., Каурова С.А. Криоконсервация спермы якутского длиннохвостого суслика. //Биофизика живой клетки. 1994, т. б, стр. 129130.

3. Каурова С.А., Шишова Н.В. Криоконсервация спермы мышей с использованием ДМСО и сахарозы. //Биофизика живой клетки, 1994, т. б, стр. 131-132.

4. Сипко Т.П., Ротт H.H., Абилов АЛ., Присяжнюк В.Е., Шишова Н.В., Комбарова H.A. Сохранение генетических ресурсов оленьих (CERVIDAE) путем криоконсервации половых клеток. //Известия А.Н., сер. биологическая, 1997, Xä5, стр. 546-555.

5. Шншова Н.В., Мельникова Е.В., Гахова ЭЛ. Длительность сохранения жизнеспособности сперматозоидов из придатков семенников мыши после смерти животного и возможность их криоконсервации. //Цитология, 2004, т.4б, >610, с. 886-887.

6. Шишова Н.В., Игнатьев Д,А. Репродуктивные циклы азиатского длиннохвостого суслика (Spermophilus undulaftts) и получение потомства в условиях вивария. //Материалы научно-практической конференции «Зоокультура и биологические ресурсы» 4-6 февраля 2004 г., Москва., М., 2005, стр. 263-264.

7. Шишова Н.В., Хорольская Н.Б., Утешев В.К. Возможности использования постмортального материала животных для сохранения генофонда диких млекопитающих. //Материалы научно-практической конференции «Сохранение разнообразия животных и охотничье хозяйство России» 24-25 февраля 2005г, М., 2005,247-250.

к исполнению 15/05/2006 Исполнено 16/05/2006

Заказ №382 Тираж: 120 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское т., 36 (495)975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru