Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервация эпидидимального семени млекопитающих с разным сезонным ритмом репродукции в целях сохранения биоразнообразия

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервация эпидидимального семени млекопитающих с разным сезонным ритмом репродукции в целях сохранения биоразнообразия"

На правах рукописи

Шишова Наталья Владимировна

Криоконсервация эпидидимального семени млекопитающих с разным сезонным ритмом репродукции в целях сохранения биоразнообразия

Специальность 03.00.13- физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН и в отделе воспроизводства и трансплантации эмбрионов с.-х. животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители: доктор биологических наук

Абилов Ахмедага Имаш оглы; кандидат биологических наук Гахова Эдит Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор биологачеких наук, профессор,

Клинский Юрий Дмитриевич; доктор биологических наук Багиров Вугар Алинияз оглы.

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

Защита состоится (¿¿О/ОА 2006 г. в/с/часов на заседании

диссертационного совета Д006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская обл., Подольский район, п. Дубровицы, т/факс (4967)651101

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «/V» ¿¿¿¿£¿1 2006 г.

Ученый секретарь диссертационноп совета, кандидат биологических на;

В.П. Губанова

Ш>£А

MW

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Сперматозоиды, выделенные из половых органов павших животных, являются важным источником генетического материала для криоколлекций. Криоконсервация таких сперматозоидов - это также последняя возможность сохранить генофонд ценных особей при их неожиданной гибели.

Еще в начале XX века русский ученый И.И. Иванов обратил внимание на тот факт, что в изолированном эпидидимисе сельскохозяйственных животных живые, активные сперматозоиды сохраняются не менее 5-7 дней (Иванов, 1907), Именно Иванов первый высказал мысль, что жизнеспособные сперматозоиды, выделенные из половых органов павших животных можно использовать для спасения наследственности ценных особей.

После открытия в 1947 году возможности сохранения оплодотворяющей способности семени животных при замораживании (Соколовская, 1947), большое значение приобрело сохранение генофонда животных с помощью криоконсервации спермы.

Но только в 80-х и 90-х годах появился ряд работ по криоконсервации эпидидимальной спермы млекопитающих постмортального периода (Шайдулин, Ролдугин,1986; Сипко и др., 1993; Эрнст и др., 1998; Krzyvinski, 1981; Miles et al., 1992; Marks et al., 1994; Jewgenow et al., 1997; Ponce et al., 1998; Lambrechts et al., 1999; Blash et al, 2000; и др.). В этих работах семя использовалось в течение 1-4 часов после смерти животных.

Однако в отличие от плановых отстрелов, при неожиданной гибели животных практически невозможно произвести выделение и обработку семени в столь сжатые сроки. В конце 90-х - начале 2000 годов в ряде опубликованных работ было показано сохранение оплодотворяющей способности эпидидимальных сперматозоидов в течение нескольких дней после гибели организма (Songsasen et al., 1998; Kikuchi et al., 1998; Kishikawa et al., 1999; Yu, Leibo, 2002).

Несмотря на вышеперечисленные материалы, в проблеме криоконсервации постмортального семени животных остается много неясного. До сих пор нечетко определена длительность функциональной активности эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных и границы возможного использования этих клеток для криоконсервации. Для подавляющего большинства диких видов, имеющих ярко-выраженную сезонность размножения, не определены календарные сроки, при которых возможно извлечение и криоконсервация постмортального семени. Кроме того, для криоконсервации постмортального эпидидимального семени в основном используют методы, разработанные для эякулята. Между тем, физиология эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов имеет ряд отличий, которые могут сказаться на оптимизации метала ^Д^Щ^Ц^^"

БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 200&к//Я£

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить возможности использования для криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих с сезонным и непрерывным сперматогенезом в разные сроки постмортального периода на примере оленя, суслика и лабораторной мыши.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать физиологическое состояние жизнеспособных сперматозоидов в эпидидимисе в разные сроки после смерти животного.

2. Изучить устойчивость эпидидимальных сперматозоидов, выделенных в разные сроки после смерти, к процессу криоконсервации.

3. Оптимизировать криопротектирующую среду для криоконсервации сперматозоидов позднего постмортального периода.

4. Сравнить жизнеспособность эпидидимального семени при хранении целых тушек или изолированных семенников.

5. Исследовать возможность криоконсервации эпидидимальной спермы вне периода гона для животных с ярко-выраженной сезонностью размножения.

Научная новизна. Впервые криоконсервировано эпидидимальное семя оленя вне периода гона (в охотничий сезон, до 4 месяцев после окончания гона). Показана возможность криоконсервации сперматозоидов до 6 суток после отстрела оленей.

Впервые получены жизнеспособные замороженно-оттаянные сперматозоиды азиатского длиннохвостого суслика, относящегося к зимоспящим млекопитающим.

Показана возможность криоконсервации эпидидимальных сперматозоидов мыши до 5 суток после смерти организма. Обнаружено, что в постмортальный период (до 5 суток) сперматозоиды мыши снижают поступательную подвижность, но при этом сохраняют целостность клеточных мембран.

Выявлено положительное воздействие антиоксидантов в составе криозащитных сред на сохранность клеточных мембран замороженно-оттаянных сперматозоидов мыши, выделенных и замороженных через сутки после смерти животного.

Научно-практическая ценность. Работа имеет как теоретическую, так и практическую значимость. Данные о сроках выживания и физиологических изменениях эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных при холодовом (+4°С) хранении расширяют знания по физиологии эпидидимальных сперматозоидов, и могут внести вклад в понимание механизмов деградации клеток в условиях холодовой ишемии.

Результаты работы позволяют существенно увеличить интервал времени между гибелью животных и криоконсервацией постмортального семени без потери жизнеспособности сперматозоидов.

Показано, что период, при котором в половых органах обнаруживаются пригодные для криоконсервации сперматозоиды, превышает сезон гона, по крайней мере, для двух представителей разных систематических групп млекопитающих с сезонным размножением (благородный олень, азиатский

4

длиннохвостый суслик). Это существенно расширяет границы использования эпидидимального семени постмортального периода для криоконсервации, и способствует увеличению роли данного метода в сохранении генетических ресурсов.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы в работах по дальнейшему усовершенствованию методов криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих для создания генетических низкотемпературных коллекций.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ежегодных отчетах лаборатории криоконсервации генетических ресурсов ИБК в 1998 - 2005 гг; на научно-практической конференции «Зоокультура и биологические ресурсы» 4-6 февраля 2004 г. Москва; на Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов», 19-22 октября 2004г, Санкт-Петербург; на научно-практической конференции «Сохранение разнообразия животных и охотничье хозяйство России» 24-25 февраля 2005 г. Москва.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на семинаре лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН (апрель, 2006) и на научной конференции отдела биологии воспроизводства и трансплантации эмбрионов с.-х. животных им. академика В.К. Милованова (апрель, 2006).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список использованной литературы.

Текст изложен на 120 страницах, содержит 16 таблиц и 23 рисунка. Библиография включает 176 источника, из них 70 отечественных и 106 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Для решения поставленных задач был проведен ряд экспериментов согласно схеме на рис. 1. Эксперименты выполнены в течение 1992-2005гт.

Эксперименты по выживаемости сперматозоидов в эпидидимисах павших животных и по оптимизации методов криоконсервации были выполнены на лабораторных мышах и на диких оленях.

Для исследований, связанных с сезонностью, были использованы виды с ярко выраженной сезонностью размножения - пятнистый и благородный олени (Cervus nippon, Cervus elaphus) и азиатский длиннохвостый суслик (Citellus undulatus). При этом выбранные виды имеют разный тип сезонной регуляции сперматогенеза.

Рис. 1.

Схема экспериментов.

Пятнистый и благородный олени являются типичными фотозависимыми видами. Сезонная регуляция сперматогенеза этих животных происходит под воздействием длительности светового дня, активируясь в осенне-зимний период при сокращении светлого периода суток.

Азиатский длиннохвостый суслик относится к зимоспящим млекопитающим с эндогенной регуляцией сезонных циклов репродукции. Сперматогенез сусликов активен весной, после выхода из спячки. Годовые циклы репродуктивной системы сусликов не меняются при искусственном изменении фотопериодичности и температуры окружающей среды.

Эксперименты на мышах и сусликах проводили на базе лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН. Эксперименты на оленях проводили на базе отдела Воспроизводства с.-х. животных и трансплантации эмбрионов Всероссийского института животноводства и лаборатории криоконсервации ген. ресурсов ИБК РАН.

Использованы мыши линии NMRI, содержащиеся в виварии ИБК РАН, азиатские длиннохвостые суслики якутской популяции, отловленные из дикой природы и содержащиеся в виварии ИБК, и олени из дикоживущей популяции Приокско-Террасного заповедника (Московская обл.).

Изолированные половые органы оленей и мышей или тушки мышей до выделения семени хранили при +4°С. Половые органы оленей хранили в естественных оболочках, включая мошонку, без дополнительной обработки.

Семя оленя замораживали в гранулах с использованием лактозо-желточно-цитратно-глицериновой среды по методу, разработанному для криоконсервации спермы быков (Милованов, 1962).

Замораживание семени мышей осуществляли в соломинках, в парах жидкого азота, Уохл»10-20°С/мин. Состав криопротектирующей среды: 0.29 М сахарозы, 0.17 М ДМСО, 5% яичного желтка, 9 мМ HEPES, рН 6,8.

Эпидидимальное семя суслика проверяли на холодоустойчивость. Для этого семя, суспендированное в среде (0,11М цитрата натрия, 0,34М сахарозы) охлаждали до +4°С, и выдерживали при этой температуре 2,5 часа. Криоконсервацию семени суслика проводили в гранулах по 0,05 мл в парах жидкого азота, Уохл«10-20°С/мин. Были апробованы несколько криопротектирующих растворов, представляющих собой различные модификации криопротектирующего раствора для замораживания семени мыши. Состав криопротектирующей среды, позволившей получить наиболее высокий процент выживаемости сперматозоидов, приведен в результатах экспериментов.

Качество сперматозоидов оценивали по нескольким параметрам. Для оценки подвижности семени визуально подсчитывали долю сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД) и долю сперматозоидов, проявляющих любой тип движения (ОП). Переживаемость оценивали по максильному времени подвижности спермиев в культуре in vitro при 37°С. Для определения целостности клеточных мембран использовали люминесцентный метод с применением красителя этидий бромида (ЭБ) (Мельникова, 1978). Целостность акросом сперматозоидов оленя оценивали

акроскопическим методом (Соколовская и др., 1982). Капацитацию и целостность акросом спермиев мышей определяли люминесцентным методом по окрашиванию хлортетрациклином (Ward, Storey, 1984).

Статистический анализ проведен с использованием возможностей программ "Excel" и "Sigma-Plot".

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Качество нативного и замороженно-отгаянного семени мыши

(Mus musculus). выделенного из тушек в разные сроки после смерти.

Были исследованы физиологические характеристики нативных и замороженно-оттаянных образцов эпидидимального семени, полученного сразу после забоя животных и через 3,5 - 120 часов хранения тушек мышей при +4°С.

При хранении тушки мыши при +4°С, содержащиеся в придатке семенника сперматозоиды сохраняли жизнеспособность в течение всего периода эксперимента, до 5 суток.

В таблице 1 представлены результаты исследования нативных сперматозоидов.

Таблица 1. Зависимость физиологических показателей эпидидимальной спермы мышей от длительности хранения тушек.

Показатель Коэффициент корреляции Коэффициент регрессии или тип аппроксимации

Подвижность сперматозоидов ППД -0,54 ± 0,18 логарифм.

ОП -0,38 ± 0,18 логарифм.

Переживаемость 0,46 ± 0,19 +0,48 ± 0.13 час / сутки

Отношение ППД к ОП -0,47 ± 0,15 логарифм.

Агглютинация спермиев 0,27 ± 0,21 -

Меченные этидий бромидом 0,07 + 0,25 +0,6 ± 1,2 %/сутки

Примечание. Коэффициент регрессии дан только в том случае, если экспериментальные данные не позволяют выявить явного отклонения от линейного типа зависимости.

Более всего длительное хранение тушек отразилось на способности сперматозоидов к прямолинейному поступательному движению -0,54±0,18). При этом зависимость снижения доли сперматозоидов с ППД от сроков хранения тушек наиболее достоверно аппроксимировалась логарифмической кривой (рис. 2).

Рис 2 Доля подвижных сперматозоидов в пробах, выделенных из тушек разного срока хранения. Представлена логарифмическая аппроксимация данных эксперимента, —♦--ППД,---□---- — ОП

Наиболее значительное снижение количества подвижных сперматозоидов и происходило в первые сутки .хранения. В дальнейшем двигательная активность сперматозоидов изменялась медленнее.

Окрашивание сперматозоидов этидий бромидом показало, что проницаемость клеточных мембран в течение 3-х суток не изменялась, Я= -0,54±0,18 (табл.1). Количество окрашенных сперматозоидов, т.е. с поврежденными клеточными мембранами составило 19±10% клеток в первые сутки, 18±9 - в конце третьих.

Переживаемость выделенных сперматозоидов в культуре при 37°С возрастала по мере увеличения продолжительности хранения тушек мышей, 0,4610,19 (табл. 1).

Зависимость физиологических показателей криоконсервированного семени мышей от длительности хранения тушек перед криоконсервацией (до 3-х суток) показана в таблице 2.

Подвижность (ППД) оттаянных сперматозоидов, подобно незамороженным, существенно зависела от длительности хранения тушки (Я= -0,77+0,16).

Таблица 2. Зависимость качества замороженно-оттаянного семени от длительности хранения тушек мышей перед криоконсервацией.

Показатели Коэффициент корреляции Коэффициент регрессии, % / сут, кроме*

Подвижность сперматозоидов ППД —0,77±0,16 Логарифмич. зависимость

ОП 0,06+0,25 0,5±1,2

Переживаемость 0,33±0Д4 0,31±0,14* час/сут

Отношение подвижности до и после консервации ППД 0,17±0Д5 3,0±2,7

ОП 0,21±0,24 2,8+2,0

Отношение переживаемости до и после криоконсервации -0,27±0,24 -14,6±8,7

Меченные этидий бромидом 0,14±0.25 1,3±1.8

Капацитировавшие сперматозоиды 0,84±0.13 4,4±0,5

Сперматозоиды с утерянной акросомой 0,48±0,22 1,0±0,4

Суточное хранение тушек снижало ППД замороженно-оттаянного семени в 2 раза, с 20 до 11% (р<0,05), хранение в течение 48 часов - в 3 раза, до 6% (р<0.05) и в течение 72 часов - в 6 раз, до 2% (р<0.01). Хранение тушек мышей в течение Зх суток практически не отражалось на общем количестве подвижных (ОП) сперматозоидов (К=0,06±0,25).

Переживаемость оттаянных сперматозоидов недостоверно возрастала при увеличении сроков хранения тушки, (4,3±0.5 в первые часы хранения и 5.0±0,8 после Зх суток хранения).

Не выявлено достоверного влияния хранения тушек на состояние клеточных мембран сперматозоидов по окрашиванию ЭБ. Корреляция этого показателя с длительностью хранения составила 0,14±0,25.

Количество капацитировавших сперматозоидов зависело как от факта охлаждения тушки, так и от длительности её хранения (рис. 3). После предварительного охлаждения тушек, в криоконсервированном семени доля капацитировавших сперматозоидов снижалась с 11 до 3% (р<0.05). При хранении тушек свыше 48 часов количество капацитировавших сперматозоидов в пробах вновь возрастало.

Выявлена зависимость целостности акросом от длительности хранения тушек перед криоконсервацией семени, К=0,48±0,22 (табл. 2). Но в целом количество сперматозоидов с утерянной акросомой было незначительным (рис. 3).

о о

охлаждение

444

■ — количество

капацитировавших

сперматозоидов,

□ — количество сперматозоидов, утерявших акросому; вертикальные линии - доверительный интервал для р<0.05

о

0ч 3,5ч 24ч 48ч 72ч

длительность хранения тушки, (час)

Рис 3. Количество капацитировавших и лишенных акросомы сперматозоидов в образцах, замороженных в разные сроки после смерти животных.

По результатам эксперимента корреляция между количеством капацитировавших сперматозоидов и сперматозоидов с утерянной акросомой составила 0,77. Это может свидетельствовать о том, что утеря акросом происходит не за счет механических повреждений в процессе криоконсервации, а вследствие индуцированной холодом преждевременной акросомной реакции. Это является результатом либо перезревания сперматозоидов при длительном хранении, либо утери эпидидимальной плазмой факторов декапацитации.

В общем, поведение сперматозоидов в охлажденных тушках животных вполне согласуется с современными представлениями о механизмах клеточной смерти при холодовой ишемии. Начальная стадия реакции клетки на ишемию - нарушение энергетических процессов и образование энергетической задолженности (Шумаков, 1975). Действительно, наши данные показывают, что быстрее и сильнее всего в постмортальный период страдает такой энергоемкий процесс, как поступательная подвижность сперматозоидов.

Полагают, что в ишемизированных тканях повышение проницаемости мембран клетки предшествует необратимым деструктивным изменениям (Шумаков, 1975, Иванов, 1995). Поэтому отсутствие существенного изменения проницаемости клеточных мембран сперматозоидов в исследуемые нами сроки позволяет предположить, что наблюдаемые негативные изменения обратимы, хотя бы частично.

3.2. Оптимизация условий хранения семенников и криоконсервации семени постмортального периода.

Мы сравнили физиологические характеристики сперматозоидов мышей при различных способах хранения половых органов для определения наиболее оптимального варианта.

Качество сперматозоидов оценивали при хранении изолированных семенников в физиологическом растворе при +4°С (0.9% №С1), и в среде, разработанной для холодовой консервации почек (Шумаков и др., 1983) при той же температуре. В качестве контроля использовали данные эксперимента по выживаемости эпидидимальных сперматозоидов в целых тушках мышей, охлажденных до +4°С.

Не было обнаружено достоверной разницы по таким показателям, как переживаемость сперматозоидов при 37°С, общая и прямолинейно-поступательная подвижность.

Целостность клеточных мембран сильнее нарушалась при хранении изолированных семенников в растворах, чем в целых тушках (рис. 4).

60

а о

ЗЕ О. 0) с и X 2 X X

0

1 &

ш о с

8

50 -

40 -

30-

20 -

10 -

< хранение в тушках •■•О— вфиз растворе . —в среде для консервации почек

Т--' ..л >.................... X "" ]

1 1 1

о го 40 во

длительность хранения, час.

80

Рис. 4 Целостность клеточных мембран сперматозоидов при хранении в тушках и изолированных семенниках в разных средах.

Данные эксперимента свидетельствуют, что хранение выделенных половых органов в указанных растворах не имеет преимущества по сравнению с хранением в целых тушках мышей.

На основании описанных выше результатов по криоконсервации семени мышей мы пришли к выводу, что для улучшения качества замороженного семени постмортального периода полезно ввести в среду факторы, компенсирующие негативные последствия холодовой ишемии.

Основанием для модификации криопротектирующего раствора для послужили два предположения:

-Первое основано на результатах предыдущих экспериментов, и состоит в том, что в постмортальном периоде энергетическое голодание сперматозоидов наступает гораздо раньше, чем необратимые повреждения клеток.

-Другое касается значительной роли перекисного окисления липидов в снижении криорезистентности сперматозоидов. Полагают, что перекисное окисление липидов играет существенную роль как в клеточной смерти при холодовой ишемии в изолированных органах (Шумаков, 1975, Иванов, 1995), так и при криоконсервации сперматозоидов (Наук, 1991). Очевидно, что при криоконсервации сперматозоидов постмортального периода, когда мы имеем сочетание воздействий холодовой ишемии и криоконсервации, негативное воздействие перекисного окисления липидов может оказаться особенно значительным.

Для компенсирования негативного воздействия энергетического голодания и перекисного окисления липидов в криопротектирующий раствор были введены метаболизируемый сахар и антиокстданты. Глюкозу добавляли в небольшой концентрации (0.5%), недостаточной для оказания криопротектирующего эффекта, но достаточной для ее использования в качестве экзогенного метаболита. В качестве антиоксидантов в раствор добавляли водорастворимый эмоксипин с жирорастворимым а-токоферол-ацетатом. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Как видно из представленного материала, ни глюкоза, ни антиоксиданты, ни сочетание этих веществ не оказывали существенного влияния на подвижность сперматозоидов после оттаивания.

В то же время добавление антиоксидантов и/или глюкозы оказывало стабилизирующий эффект на мембраны сперматозоидов в процессе криоконсервации. Как видно из табл. 3, одновременное добавление этих веществ в криопротектирующий раствор снижало количество сперматозоидов с поврежденными мембранами с 48 до 36% (р<0,05). Кроме того, об улучшении состояния мембран также говорит снижение агглютинации сперматозоидов.

3.3. Криоконсервация эпидидимального семени

оленей (С. пюроп. С. е1арИш}

Мы обследовали семенники оленей в течение зимнего сезона, спустя 1 -3 месяца после окончания гона. В течение охотничьего сезона нам удалось получить образцы от 7 животных. У большинства самцов в суспензии эпидидимиса обнаружены живые и подвижные спермии, в том числе у особей, отстреленных в феврале, в конце охотничьего сезона.

В течение трех зимних месяцев не было зафиксировано достоверной зависимости качества семени от календарных сроков отстрела (табл. 4.).

Таблица 3. Качество эпидидимальной спермы мышей, замороженной через 24 часа после смерти. Влияние глюкозы и антиоксидантов.

№ группы Криопротектирущая среда п Агглютинация, баллы (0-6) Подвижность оттаяного семени Переживаемость оттаяного семени, час. Сперматозоиды меченные ЭБ, %

ППД,% ОП, %

1 Контроль (К)1 10 3,2±1,4* 12+4 28±7 4,3±0,9 48±5**

2 К + глюкоза 8 2,0±1,6 12±1 29±5 5,5±0,7 * 42±8

3 К + антиоксиданты2 8 1,6±1,3 13±3 25±3 3,5+0,7 * 42±6

4 К + глюкоза и 10 1,3±0,6* 13±2 27+5 4,2±1,0 36±4**

антиоксиданты2

1+3 Все образцы без 18 2,4+1,1 12±3 27±4 4,3±0,9 46±4*

глюкозы

- 2+4 Все образцы с 18 1;6±0,8 13±1 27±3 4,6+0,9 39±5* •

глюкозой

1+2 Все образцы без 18 2,9±1,2* 12±3 28±5 4,6+1,0 46±4*

антиоксидантов

3+4 Все образцы с 18 1,5±0,7* 13±2 26±2 4,00+0,7 40±4*

анантиоксидантами2

Даны средние значения и доверительный интервал для р<0.05. * р<0.1. ** р<0.05.

1 В качестве контроля использовалась сахарозо-НЕРЕв-желточная среда с 1.3% ДМСО.

2 В качестве антиоксидантов использован эмоксипин + «-токоферолацет.

«

Таблица 4. Зависимость качества семени оленей от времени, прошедшего после окончания гона.

Показатель А коэффициент корреляции

Подвижность эпидидимального семени до замораживания ПОД - 0,33 ± 0.47

ОП - 0,19 ± 0.48

Концентрация сперматозоидов в полученной суспензии -0,44 ±0.47

Подвижность эпидидимального семени после криоконсервации ППД -0,08 ±0.45

ОП . 0,05 ±0.45

Целостность акросом после криоконсервации - 0,42 ± 0.43

Отношение подвижности семени до и после криоконсервации ППД 0,38 ± 0.46

ОП 0,39 ±0.46

Из таблицы 4 видно, что наблюдалась тенденция к снижению подвижности семени оленей, к уменьшению общего количества выделенных сперматозоидов к концу сезона и к снижению количества сперматозоидов с целыми акросомами. Криорезистентность 'сперматозоидов, оцененная по отношению подвижности до и после криоконсервации, не только не снижалась, но имела тенденцию к повышению.

На примере оленя также была исследована длительность выживаемости сперматозоидов после смерти животного. Семенники с придатками изолировали в течение часа после смерти и хранили при +4°С. В течение от 1 до 6 суток половые органы транспортировали в лабораторию, где проводили выделение семени из эпидидимисов.

Все исследованные образцы семени, независимо от сроков хранения семенников, содержали активные сперматозоиды, в том числе при максимальном сроке хранения - 6 суток. Количество сперматозоидов с поступательным прямолинейным движением колебалось от 30 до 80% .

В целом, изменение качества семени оленей (табл. 5) в разные сроки после отстрела животных подтвердило те закономерности, которые были обнаружены в экспериментах на мышах.

Как можно видеть, наиболее сильно длительное хранение семенников оленей влияло на целостность акросом (Л= -0,88 ± 0.27). Согласно коэффициенту регрессии каждые сутки хранения приводили к потере почти 8% акросом.

Также, при длительном хранении семенников существенно снижалась подвижность семени оленей (ППД, Я=-0,50±0.43; ОП, Я= -0,51±0.43).

Таблица 5. Зависимость качества семени оленя от сроков хранения выделенных половых органов.

Показатель Коэффицйент корреляции Коэффициент регрессии, % / сутки, кроме*

Подвижность семени до замораживания ппд -0,29 ± 0.47 -3,33 ± 5,49

оп -0,40 ± 0.37 -3,30 ±5,75

Концентрация сперматозоидов в полученной суспензии 0,14 + 0.49 037 ±1,51 * млн/мл/сут

Подвижность семени после криоконсервации ппд -0,50 + 0.43 -333 ± 2,81

оп -0,51 ± 0.43 -4,89 ±4,11

Целостность акросом после криоконсервации -0,88 ±0.27 -7,74 ±239

Отношение подвижности до и после криоконсервации ппд -0,30 ± 0.45 -4,10 ±4,11

оп -0,24 + 0.48 -4,22 ± 8,75

При увеличении длительности храненйя семенников не было выявлено достоверных изменений криорезистентности семени, которую оценивали по отношению подвижности до и после криоконсервации.

Таким образом, в охлажденных половых органах отстреленных оленей не менее 6 суток сохраняются живые, активные сперматозоиды. Эпидидимальное семя оленей, выделенное в течение 6 суток после отстрела животных, адекватно переносит процесс криоконсервации.

Как показали наши эксперименты, эпидидимальная сперма оленей вполне пригодна для криоконсервации в течение всего зимнего периода. В целом, включая период гона, получение пригодных для криоколлекций образцов семени возможно не менее 6 месяцев в году, с сентября по февраль.

3.4. Качество и криорезистентность семени азиатского длиннохвостого суслика в течение весеннего сезона.

В доступной литературе информации о свойствах семени азиатского длиннохвостого суслика нет. В связи с этим работа была начата с морфологического описания сперматозоидов этих животных.

Сперматозоиды суслика имеют строение, типичное для сперматозоидов млекопитающих (рис. 5). У них можно выделить головку с акросомальной и постакросомальной областью, шейку и хвост. Головка имеет широкую, округлую форму с размерами 9.8x7.5 мкм. Ядро занимает не более половины площади головки в горизонтальной проекции и имеет размеры 7.1x5.5 мкм. Акросомальная часть составляет = 3А головки сперматозоида. Акросома имеет ярко-выраженное апикальное расширение, причем апикальное расширение акросомы расположено как бы в стороне от плоскости, в которой

16

расположено ядро сперматозоида, что придает головке сперматозоида неровную, выгнутую, «лопатообразную» форму. Хвост сперматозоида имеет длину 92.5 мкм, основная часть относительно короткая и составляет 11 мкм. Концевой отдел хвоста дифференцировать не удалось.

7.2 <—*

11.0 *-№

92.5

7.1 <—»

9.8

5.5

7.5.

Рис 5. Схема строения сперматозоида азиатского длиннохвостого суслика.

Для уточнения сроков, в течение которых в эпидидимисе сусликов можно обнаружить пригодные для криоконсервации сперматозоиды, нами были обследованы половые органы самцов, начиная с февраля по июнь. В условиях содержания животных в виварии ИБК РАН, в исследуемые годы самцы начинали пробуждаться в середине Марта и полностью переходили к активному состоянию после 24-26 марта (рис. 6 А).

Сформировавшиеся сперматозоиды в семенниках начинали появляться во второй декаде марта. В придатках семенника отдельные сперматозоиды были отмечены в середине марта. При этом эпидидимальные сперматозоиды были обнаружены только у пробудившихся зверьков. С конца марта, после пробуждения всей популяции, сперматозоиды обнаруживались у всех обследованных животных. В течение апреля зрелые сперматозоиды отмечались как в семеннике, так и в эпидидимисе. В середине мая сперматозоиды обнаружены в эпидидимисе,* но не в семенниках. Начиная со второй половины мая и позже, сперматозоиды в семенниках и эпидидимисе отсутствовали.

Как показано на рис. 6 Б, количество подвижных сперматозоидов возрастало от момента пробуждения животных до середины апреля. В середине апреля наблюдалась максимальная активность семени - нормальный поступательный тип движения имели 50-55% сперматозоидов. Общее число подвижных сперматозоидов составило 60-70%. С середины до конца апреля семя оставалось активным, в середине мая обнаруженные сперматозоиды были неподвижны.

сперматозоиды в эпидидимисе

1111 I

01.03 15.03 <И.М 15.04 01.05 15.05 01.06

дата

Рис. 6. Схема наличия (А) и подвижности (Б) сперматозоидов в эпидидимисе сусликов в зависимости от календарных сроков.

■ - ОП и ПД свежевыделенного семени;

□ - ОП семени после охлаждения в течение 2,5 часов.

В целом, активные сперматозоиды в эпидидимисе азиатского длиннохвостого суслика выявляются приблизительно в течение двух месяцев, что примерно в 2.5 - 3 раза превышает по длительности период гона у этого вида, продолжительность которого составляет 2 -2,5 недели.

В настоящее время разработанных методов криоконсервации семени суслика нет. Поэтому нами были проверены несколько способов криоконсервации семени. Протокол замораживания и криопротектирующая среда в этих экспериментах основывались на методах замораживания спермы мышей, как наиболее близкого вида.

Наиболее удачной оказалась криоконсервация семени суслика по способу быстрого замораживания (пары жидкого азота, Уохл=10-20°С/мин) в криопротектирующей среде следующего состава: ЫаС1 - 8 г/л (137 мМ), КС1 -0,2 г/л (2,6 мМ), СаСЬ-0,1 г/л (0,9'мМ), - 0,05 г/л (0,5 мМ),

Ма2НР04-1,15 г/л (8,1 мМ), КН2Р04-0,2 г/л (1,5 мМ), сахароза - 50 г/л (0,15 М), глицерин - 60 г/л (0,32 М), к полученному раствору добавляли 20% желтка куриного яйца, рН раствора - 6,8.

В таблице 6 показано изменение подвижности семени суслика до и после криоконсервации по этому методу. Сперматозоиды суслика показали низкую устойчивость к низким температурам. Тем не менее, наши данные позволяют считать доказанной способность сперматозоидов азиатского длиннохвостого суслика выдерживать глубокое замораживание.

Таблица 6. Подвижность семени суслика до и после криоконсервации.

Подвижность до замораживания, %. Подвижность после оттаивания, %.

под оп ппд оп

35 (30-40) 45 (40-50) 15(0-25) 17(0-28)

Даны средние и крайние значения.

В связи с низкой результативностью криоконсервации семени сусликов, криорезистентность сперматозоидов суслика оценивали по подвижности после двухчасового охлаждения до +4°С, без замораживания. Охлаждение проводили в фосфатно-солевом растворе Дюльбекко с добавлением 10% сахарозы и 20% яичного желтка.

Для анализа изменения криорезистентности сперматозоидов в течение весны, весь период, при котором в эпидидимисе наблюдались активные сперматозоиды, условно разбили на 3 части. В таблице 7 приведены данные об общей подвижности семени суслика до и после охлаждения в первую, среднюю и последнюю трети периода активного сперматогенеза.

Таблица 7. Общая подвижность эпидидимального семени суслика до и после охлаждения.

Календарные сроки Общая подвижность, %. Соотношение подвижности до и после охлаждения, %

Контроль (свежевыделеняое) после охлаждения (+4°С)

15.03-05.04 35±7 7,5±2 23±9

06.04-25.04 58±8 9±2 16±5

26.04-15.05 45±5 15±1 33±4

Как видно из таблицы, резистентность сперматозоидов к охлаждению была наиболее низкой в середине периода активного сперматогенеза. В эти сроки двухчасовая выдержка при низкой температуре приводила к снижению общей подвижности семени более, чем в 6 раз (с 58 до 9%). К концу периода гона наблюдалась некоторая тенденция к повышению устойчивости сперматозоидов к охлаждению. В этот период холодовая эквилибрация вызывала снижение общей подвижности семени только в 3 раза (с 45 до 15%).

Аналогичные выводы о криорезистентности можно сделать и на основе анализа результатов криоконсервации (рис. 7). Если данные по подвижности заморожено-оттаянных спермиев сгруппировать по календарным срокам эксперимента, то можно видеть, что положительные результаты криоконсервации получены в конце периода активного сперматогенеза. Именно в эти же сроки наблюдали повышение устойчивости сперматозоидов к охлаждению (табл. 7). Возможно, выживаемость сперматозоидов суслика в процессе криоконсервации зависит не только от способа криоконсервации, но и от сроков выделения сперматозоидов.

Д | Д выход из спячки

I-1-1-1-1-1

11 мар 21 мар 31 мар 10апр 20апр ЗОапр

Рис 7 Схема результатов криоконсервации семени суслика в зависимости от календарных сроков получения семени: жизнеспособное (■) и нежизнеспособное (—) семя.

Полученные данные свидетельствуют, что у азиатского длиннохвостого суслика наличие зрелых сперматозоидов в придатках семенника наблюдается несколько дольше сезона спаривания. Гон у этого суслика в природных условиях длится 2-2.5 недели. Подвижные сперматозоиды в придатках семенника обнаруживаются в течение боле'е длительного периода - около двух месяцев.

Криорезистентность сперматозоидов сусликов меняется в течение периода активного сперматогенеза. Наиболее высокая устойчивость к охлаждению наблюдается в последнюю треть этого периода. Колебания криорезистентности семени могут либо отражать зависимость криорезистентности от фазы сперматогенеза и связанного с ним гормонального статуса животных, либо от физиологического состояния, связанного с выходом животных из спячки.

Заключение.

В работе показано, что возможности использования генетического материала для создания криоколлекций, поддерживающих биоразнообразие, достаточно широки. У животных с выраженной сезонностью репродукции сроки, в течение которого семенники содержат пригодные для

20

криоконсервации сперматозоиды, превышает период гона. В некоторых случаях, например у оленей, весьма значительно.

Сперматозоиды в семенниках павших животных сохраняют жизнеспособность достаточно долго, что позволяет при неожиданной гибели ценных особей в отдаленных районах производить доставку постмортального генетического материала в центры по криоконсервации. Результаты исследований свидетельствуют, что качествр семени из семенников павших животных позднего постмортального периода можно повысить с помощью снижения или компенсации негативного воздействия холодовой ишемии. Показано, что в этом направлении является перспективным поиск способов компенсации энергетической задолженности и защита против перекисного окисления липидов.

4. ВЫВОДЫ:

1. Сперматозоиды мыши (М тшси1ш) и оленя (С.е/а/ги) сохраняют жизнеспособность и нормальную криорезистентность не менее 5-6 суток после гибели особи-донора.

2. Хранение половых органов животных (мышь и олень) в течение 5 суток существенно снижает способность сперматозоидов к поступательному движению и целостность акросом, но не вызывает необратимых повреждений клеточных мембран.

3. Антиоксиданты (а-токоферол с эмоксипином) в составе криопротектирующей среды положительно влияют на целостность клеточных мембран эпидидимальных сперматозоидов (кол-во сперматозоидов с поврежденной мембраной снижалось на 13%).

4. Эпидидимальное семя благородного оленя пригодно для криоконсервации не только в сезон гона, но и в течение Зх месяцев после его окончания.

5. Эпидидимис азиатского длиннохвостого суслика содержит подвижные сперматозоиды в течение 1,5-2 месяцев, что в 3 раза превышает период гона. В остальное время года сперматозоиды отсутствуют.

6. Криорезистентность сперматозоидов азиатского длиннохвостого суслика меняется в течение весны (с конца марта по середину мая) и повышается (>70%) в конце периода активного сперматогенеза (первая половина мая).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Криоконсервацгао семени благородных оленей можно осуществлять с сентября по февраль включительно.

2. При гибели мелких животных целесообразно хранить целые неразделанные тушки, а семенники изолировать непосредственно перед выделением семени.

3. Семя суслика возможно криоконсервировать с помощью быстрого замораживания с предварительной эквилибрацией при комнатной температуре (18СС) в сахарозо-жлточной среде на основе фосфатно-солевого раствора Дюльбекко с 6% глицерина.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. СипкоТ.П., АбиловА.И., Шишова Н.В. Криоконсервация постмортальной спермы оленей. //Биофизика живой клетки. 1994, т. 6, стр. 127-128.

2. Шишова Н.В., Каурова С.А. Криоконсервация спермы якутского длиннохвостого суслика. //Биофизика живой клетки. 1994, т. 6, стр. 129130.

3. Каурова С.А., Шишова Н.В. Криоконсервация спермы мышей с использованием ДМСО и сахарозы. //Биофизика живой клетки. 1994, т. 6, стр. 131-132.

4. СипкоТ.П., РоттН.Н., АбиловА.И., ПрисяжнкжВ.Е., ШишоваН.В., Комбарова H.A. Сохранение генетических ресурсов оленьих (CERVIDAE) путем криоконсервации половых клеток. //Известия А.Н., сер. биологическая, 1997, №5, стр. 546-555.

5. Шишова Н.В., Мельникова Е.В., ГаховаЭ.Н. Длительность сохранения жизнеспособности сперматозоидов из придатков семенников мыши после смерти животного и возможность их криоконсервации. //Цитология, 2004, т.46, №10, с. 886-887.

6. Шишова Н.В., Игнатьев Д.А. Репродуктивные циклы азиатского длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus) и получение потомства в условиях вивария. //Материалы научно-практической конференции «Зоокультура и биологические ресурсы» 4-6 февраля 2004 г., Москва., М., 2005, стр. 263-264.

7. Шишова Н.В., Хорольская Н.В., УтешевВ.К. Возможности использования постмортального материала животных для сохранения генофонда диких млекопитающих. //Материалы научно-практической конференции «Сохранение разнообразия животных и охотничье хозяйство России» 24-25 февраля 2005г, М., 2005,247-250.

к исполнению 15/05/2006 Исполнено 16/05/2006

Заказ №382 Тираж: 120 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

/f3$e>

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шишова, Наталья Владимировна

I Введение.

Список сокращений.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Проблема сохранения биоразнообразия.

1.2. Краткая характеристика видов - объектов исследования (олень, суслик, лабораторная мышь).

1.3. Сезонные изменения сперматогенеза и криорезистентности спермы.

1.4. Характеристика сперматозоидов из разных участков полового пути.

1.5. Выживание сперматозоидов в половых органах после смерти животного и возможные сроки их использования для криоконсервации.

1.6. Особенности эпидидимальной и эякулированной спермы и оценка значения различий при криоконсервации.

1.7. Криоконсервация семени.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. Криоконсервация эпидидимального семени животных с непрерывным годовым сперматогенезом (мышь, Mus musculus).

3.1.1. Влияние длительности хранения тушки мыши при + 4°С на качество нативного и замороженно-оттаянного семени.

3.1.2. Оптимизация методов криоконсервации семени позднего постмортального периода.

3.2. Криоконсервация эпидидимального семени животных с фотозависимым годовым ритмом сперматогенеза (олени

Cervus nippon и С. elaphus).

3.2.1. Качество и криорезистентность эпидидимального семени оленей после окончания гона.

3.2.2. Качество сперматозоидов оленя в зависимости от продолжительности хранения семенников после отстрела.

3.3. Криоконсервация эпидидимального семени животных с эндогенной регуляцией годовых циклов сперматогенеза (азиатский длиннохвостый суслик, Citellus undulatus).

3.3.1. Характеристика семени суслика в весенний сезон и его криоконсервация.

3.3.2. Изменчивость криорезистентности эпидидимальных сперматозоидов суслика.

I 3.4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Криоконсервация эпидидимального семени млекопитающих с разным сезонным ритмом репродукции в целях сохранения биоразнообразия"

Актуальность проблемы.

Криоконсервация сперматозоидов, выделенных из половых органов павших животных, является важным источником генетического материала для криоколлекций, поддерживающих биоразнообразие, и последней возможностью сохранить генофонд ценных особей при их неожиданной гибели.

Еще в начале XX века русский ученый И.И. Иванов обратил внимание на тот факт, что в изолированном эпидидимисе сельскохозяйственных животных живые, активные сперматозоиды сохраняются не менее 5-7 дней (Иванов, 1889, 1907, цитируется по Иванов, 1970). Именно Иванов первый высказал мысль, что жизнеспособные сперматозоиды, выделенные из половых органов павших животных можно использовать для спасения наследственности ценных особей.

После открытия в 1947 г возможности сохранения оплодотворяющей способности семени животных при замораживании (Соколовская, 1947), болшое значение приобрело сохранения генофонда животных с помощью криоконсервации спермы.

Но только в 80-х и 90х годах появился ряд работ по криоконсервации эпидидимальной спермы млекопитающих постмортального периода (Шайдулин, Ролдугин,1986; Сипко и др., 1993; Эрнст и др., 1998; Krzyvinski, 1981; Miles et al., 1992; Marks et al., 1994; Jewgenow et al., 1997; Ponce et al., 1998; Lambrechts et al., 1999; Blash et al, 2000; и др.). В этих работах семя использовались в течение 1-4 часов после смерти животных.

Однако в отличие от плановых отстрелов, при неожиданной гибели практически невозможно произвести выделение и обработку семени в столь сжатые сроки. В конце 90х — начале 2000 годов был опубликован ряд работ доказывающих сохранение оплодотворяющей способности эпидидимальных сперматозоидов в течение нескольких дней после гибели организма (Songsasen et al., 1998; Kikuchi et al., 1998; Kishikawa et al., 1999; Yu, Leibo, 2002).

Несмотря на вышеперечисленные материалы, в проблеме криоконсервации постмортального семени животных остается очень много неясного. До сих пор не определенадлительность функциональной активности эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных и границы возможного использования этих клеток для криоконсервации. Для подавляющего большинства диких видов, имеющих ярко-выраженную сезонность размножения, не определены сезонные сроки, при которых возможно извлечение и криоконсервация постмортального семени. Кроме того, для криоконсервации постмортального эпидидимального семени в основном используют методы, разработанные для эякулята. Между тем, физиология эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов имеет ряд отличий, которые могут сказаться на оптимизации методов криоконсервации.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить возможности криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих с сезонным и непрерывным сперматогенезом в разные сроки постмортального периода на примере оленя, суслика и лабораторной мыши. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать физиологическое состояние жизнеспособных сперматозоидов в эпидидимисе в разные сроки после смерти животного.

2. Изучить устойчивость эпидидимальных сперматозоидов, выделенных в разные сроки после смерти, к процессу криоконсервации

3. Оптимизировать криопротектирующую среду для криоконсервации сперматозоидов позднего постмортального периода.

4. Сравнить жизнеспособность эпидидимального семени при хранении целых тушек или изолированных семенников.

5. Исследовать возможность криоконсервации эпидидимальной спермы вне периода гона для животных с ярко-выраженной сезонностью размножения.

Научная новизна. Впервые криоконсервировано эпидидимальное семя оленя вне периода гона (в охотничий сезон, до 4 месяцев после окончания гона). Показана возможность криоконсервации сперматозоидов до 6 суток после отстрела оленей.

Впервые получены жизнеспособные замороженно-оттаянные сперматозоиды азиатского длиннохвостого суслика, относящегося к зимоспящим млекопитающим.

Показана возможность криоконсервации эпидидимальных сперматозоидов мыши до 5 суток после смерти организма. Обнаружено, что в постмортальный период (до 5 суток) сперматозоиды мыши снижают поступательную подвижность, но при этом сохраняют целостность клеточных мембран.

Выявлено положительное воздействие антиоксидантов в составе криозащитных сред на сохранность клеточных мембран замороженно-оттаянных сперматозоидов мыши, выделенных и замороженных через сутки после смерти животного.

Научно-практическая ценность. Работа имеет как теоретическую, так и практическую значимость. Данные о сроках выживания и физиологических изменениях эпидидимальных сперматозоидов после смерти животных при холодовом (+4°С) хранении расширяют знания по физиологии эпидидимальных сперматозоидов, и Moiyr внести вклад в понимание механизмов деградации клеток в условиях холодовой ишемии.

Результаты работы позволяют существенно увеличить интервал времени между гибелью животных и криоконсервацией постмортального семени без потери жизнеспособности сперматозоидов.

Показано, что период, при котором в половых органах обнаруживаются пригодные для криоконсервации сперматозоиды, превышает сезон гона, по крайней мере для двух представителей разных систематических групп млекопитающих с сезонным размножением (благородный олень, азиатский длиннохвостый суслик). Это существенно расширяет грашщьк использования эпидидимального семени постмортального периода для криоконсервации, и способствует увеличению роли данного метода в сохранении генетических ресурсов.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы в работах по дальнейшему усовершенствованию методов криоконсервации эпидидимального семени млекопитающих для создания генетических низкотемпературных коллекций.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ежегодных отчетах лаборатории криоконсервации генетических ресурсов ИБК в 1998 - 2005 гг; на научно-практической конференции «Зоокультура и биологические ресурсы» 4-6 февраля 2004 г. Москва; на Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов», Санкт-Петербург, 19-22 октября 2004 г.; на научно-практической конференции «Сохранение разнообразия животных и охотничье хозяйство России» 24-25 февраля 2005 г. Москва.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на семинаре лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН (апрель, 2006) и на научной конференции отдела биологии воспроизводства и трансплантации эмбрионов с.-х. животных им. академика В.К. Милованова (апрель, 2006).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в т.ч. 2 в рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Шишова, Наталья Владимировна

4. Выводы.

Сперматозоиды мыши и оленя сохраняют жизнеспособность и нормальную криорезистентность не менее 5-6 суток после гибели особи-донора.

Посмертное хранение половых органов животных (мышь и олень) в течение 5 суток существенно снижает способность сперматозоидов к поступательному движению и целостность акросом, но не вызывают необратимых повреждений клеточных мембран.

Антиоксиданты (а-токоферол с эмоксипином) в составе криопротектирующей среды положительно влияют на состояние клеточных мембран эпидидимальных сперматозоидов (кол-во сперматозоидов с поврежденной мембраной снижалось на 13%). Эпидидимальное семя благородного оленя пригодно для криоконсервации не только в сезон гона, но и в течение Зх месяцев после его окончания.

Эпидидимис азиатского длиннохвостого суслика содержит подвижные сперматозоиды в течение 1,5-2 месяцев, что в 3 раза превышает период гона. В остальное время года сперматозоиды отсутствуют.

Криорезистентность сперматозоидов азиатского длиннохвостого суслика меняется в течение весны (с конца марта по середину мая) и повышается (>70%) в конце периода активного сперматогенеза (первая половина мая).

5. Практические предложения.

Криоконсервацию семени благородных оленей можно осуществлять с сентября по февраль включительно. При гибели мелких животных целесообразно хранить целые неразделанные тушки, а семенники изолировать непосредственно перед выделением семени.

Семя суслика можно криоконсервировать с помощью быстрого замораживания с предварительной эквилибрацией при комнатной температуре (18°С) в сахарозо-жлточной среде на основе фосфатно-солевого раствора Дюльбекко с 6% глицерина.

Заключение.

В работе показано, что возможности использования генетического материала для создания криоколлекций, поддерживающих биоразнообразие, достаточно широки. У животных с выраженной сезонностью репродукции сроки, в течение которого семенники содержат пригодные для криоконсервации сперматозоиды, превышает период гона. В некоторых случаях, например у оленей, весьма значительно.

Сперматозоиды в семенниках павших животных сохраняют жизнеспособность достаточно долго, что позволяет при неожиданной гибели ценных особей в отдаленных районах производить доставку постмортального генетического материала в центры по криоконсервации. Результаты исследований свидетельствуют, что качество семени из семенников павших животных позднего постмортального периода можно повысить с помощью снижения или компенсации негативного воздействия холодовой ишемии. Показано, что в этом направлении является, перспективным поиск способов компенсации энергетической задолженности и защита против перекисного окисления липидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шишова, Наталья Владимировна, Пущино

1. Абилов А.И., Бронская Л.В., Комбарова Н.А., Герман В.Ф. Акроскопический метод оценки оттаяного семени критерий его оплодотворяющей способности. // Сб. науч. тр. ВИЖ, 1997, Вып 5, с 64-65.

2. Ахременко А.К. Зимняя спячка и гипобиотические состояния у млекопитающих экстраконтиненталыюго климата: автореферат дис. . д-ра. биол. наук. Москва, 1999,36 стр.

3. Ашурбеков А А. Эффективность круглогодового накопления спермы баранов. // Животноводство, 1990 (№6), с. 66-68.

4. Багиров В.А. Биотехнологические аспекты сохранения генетических ресурсов животных. Дисс. на соиск. доктора биол. наук. Дубровицы, 2004., 244 стр.

5. Белоус A.M., Кравченко Л.П. Актуальные вопросы фармокологической защиты органов при консервации. // Проблемы криобиологии. 1995., №3, с. 3-9.

6. Берштейн А.Д., Петропавловский В.В. Влияние неэлектролитов на переживание сперматозоидов. // Бюл. эксперимент, биол. и медицины, 1937, Вып.1, с.21-25.

7. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко A.M., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. М.: «Наука», 1983, 192 стр.

8. Вепринцев Б.Н., Малашенко A.M., Сахарова НЛО. Создание и сохранение генетических коллекций лабораторных животных. // Проблемы сохранения и поддержания генетических коллекций лабораторных животных сб.науч тр. Пущино, 1991, с. 4-6.

9. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Проблема сохранения генофонда. Серия «Консервация генетических ресурсов». Пущино., 1984, 48 стр.

10. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Стратегия сохранения животного и растительного мира Земли // Консервация генетических ресурсов. Сб науч. тр. Пущино, 1991, с. 5-18.

11. Габер Е.С., Данилова Л.В., Князева Е.Ф., Костомарова А.А., Наук В.А., Пертосьян Ж.Л., Райцина С.С., Ротт Н.Н. Сперматогенез и его регуляция. М.: «Наука» 1983,232 стр.

12. Гаврил юк Б.К. Низкотемпературная устойчивость культур клеток, изолированных из организма зимоспящих животных. // Эволюционные аспекты зимней спячки. Сб., Л.: «Наука», 1986 с. 143-145.

13. Гахова Э.Н. Генетические банки как стратегия сохранения биоразнообразия беспозвоночных. // Биофизика живой клетки т. 6. «Криоконсервация генетических ресурсов в проблеме сохранения биоразнообразия». 1994, Пущино, с. 21-28.

14. Гордиюк Н.М. Гон маралов в Башкирском заповеднике. // Периодические явления в жизни животных. Сб. науч. трудов. Отв. ред. Забродин В.А., М., 1983, с. 19-34.

15. Григорян С.Б., Назарян В.К. Результаты осеменения маток замороженным семенем, полученным по сезонам года. // Научная и практические основа повышения продуктивности с/х животных в условиях Армянской ССР. Сб.иауч.тр. Абовян, 1985., с. 34-36.

16. Громов И.М., Ербаева М.А. Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий. Зайцеобразные и грызуны. С-Петербург., 1995, 522 стр.

17. Дьякович О.Н. Сезонные изменения семени быков и их связь с биологической полноценностью сперматозоидов: автореф на соиск . кандидата биол наук, г. Дубровицы, 1996, 16 стр.

18. Желтобрюх Н.И., Ивахненко В.К., Айбазов М.М. Стимуляция репродуктивной функции баранов в весенне-летний период. // Тезисы конференции по развитию овцеводства 16-18 мая 1989г., часть II, Ставрополь, 1989, с 174-177.

19. Иванов И.И. Избранные труды. М.: «Колос», 1970, 250 стр

20. Иванов К.П. Изменение физиологических функций, механизмы их восстановления и температурные граиицы жизни при гипотермии. // Успехи физиологических наук. 1996, Т.27., №3, с. 84-103

21. Ильинский Т.П., Осипова Н.В., Безлюдников Л.Г. Влияние сезонов года на качество спермы производителей. // Научные основы развития животноводства в БССР. 1978, вып. 8, с. 16-18.

22. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. М.: "Наука", 1985, 258 стр.

23. Капланов Л.Г. Тигр, изюбрь, лось. М., изд-во МОИП, 1948, 128 стр.

24. Карнаухов В.Н. Роль биразнообразия в сохранении климата Земли. // Биофизика живой клетки т. 6. «Криоконсервация генетических ресурсов в проблеме сохранения биоразнообразия». 1994, Пущино, с. 14-17.

25. Козляков Н.И., Ерастов А.П., Рыжлв А.П., Лифшиц Ю.И. Руководство по кормлению лабораторных животных, подопытной птицы и продуцентов. М., 1968, 92 стр.

26. Конюхов Б.В. Мутантные линии лабораторных животных как модели наследственных аномалий человека. // Проблемы сохранения и поддержания генетических коллекций лабораторных животных. Сб.науч. тр. Пущино, 1991, с. 813.

27. Котенкова Е.В., Прилуцкая Л.И. Экологическая характеристика видов. // Домовая мышь. ред. Котенкова Е.В., Булатова Н.Ш., М.: «Наука», 1994, с. 178-187.

28. Красная книга СССР. Т. 1. М. Лесная промышленность. 1984. 391 с.

29. Красная книга РСФСР. М.: Лесная промышленность. 1983. 120 с.

30. Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Наук В.А. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. Л.: «Агропромиздат», 1988,156 стр.

31. Лавров Н. П., Павлов М. П. Акклиматизация — один из путей расширения ареала и увеличения численности оленей // Копытные фауны СССР (экология, морфология, использование и охрана). М.: Наука, 1975., с. 11-12.

32. Линник Т.П. Подходы и принципы создания криозащитных сред для спермы птиц и млекопитающих. // Проблемы криобиологии. 1993, №4, с. 40-47.

33. Мельникова Е.В. Флуоресцентные зонды в выявлении поврежденных клеток. Автореф на соиск . канд. биол.наук., Пущино, 1978, 16 стр.

34. Мельникова Е.В. Флюоресцентный микроанализ жизнеспособности половых клеток с целью их хранения в криобанке. // Восьмая международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» г. Пущино 31 января-4 февраля 2001г. тезисы. 2001, с. 306.

35. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственного осеменения животных. М/. Сельхозгиз, 1962. 696 стр.

36. Милованов В.К. Эксперимент к бионике эпидидимиса. ( К технологии хранения семени с/х животных). //Доклады ВАСХНИЛ. 1975, № 10 с. 26-28.

37. Милованов В.К., Парамонов Л.И., Лизунов А.Ф. и др. Использование каротиноидов при криоконсервации спермы. // Докл. ВАСХНИЛ, 1988, № 11, с. 33-35.

38. Миронова Г.Д., Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю., Кондрашова М.Н. Транспорт калия и дыхание митохондрий при выходе сусликов из зимней спячки. // Механизмы зимней спячки. Сб. Пущино, 1987, с. 39-47.

39. Мкртчаи М.Е., Ромбе С.М. Искуственное осеменение северного оленя глубокозамороженной спермой. //Животноводство. 1973, №6, с. 72-74

40. Наук В.А. Структура и функции спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации. Кишинев. 1991. 200 стр.

41. Наук В.А., Борончук Г.В., Ротт Н.Н. Длительное сохранение спермы сельскохозяйственных и диких животных. // Консервация генетических ресурсов. Сборник иауч. трудов, Пущино, 1991, с. 35-81.

42. Наук В.А., Гранч В.Г., Борончук Г.В., Брандис Б.М. Соотношение белок:липид в плазматических мембранах и устойчивость гамет быка к низким температурам. // Известия АН Молдавской ССР, сер. биологич. и хим. наук, 1989, №4, с. 32-36.

43. Пахотин. П.И. Особенности функционирования препаратов мозга гибернирующих и гомеотермных животных in vitro: автореф . д-ра биол. наук. Пущино, 1997,41 стр.

44. Присяжшок В.Е. Доместикация и проблема сохранения генофонда пятнистого оленя. // Копытные фауны СССР. М.: Наука, 1990. Т.З. с. 169-171.

45. Присяжшок В.Е., Маковкин Л.И. Двадцатипятилетний опыт учета пятнистого оленя "на реву" Лазовском заповеднике, динамика численности и проблемы сохранения генофонда вида. // Научные основы состояния животного мира. М.: Колос, 1990, с.33-36.

46. Равкин Е. С. Ресурсы диких копытных на Северном Кавказе и антропогенное воздействие на них. // Копытные фауны СССР (экология,морфология, использование и охрана). М.: Наука, 1975. с. 17-19

47. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных. Пер. с англ. М. «Мир», 1980, 255 стр.

48. Рустенов А.Р. Возрастная и сезонная изменчивость спермопродукции быков-производителей. // Бюлл. ВНИИ Разведения и генетики с/х животных. Вып. 128 Л, 1991, стр. 14-16.

49. Розанов С.И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия. // Биофизика живой клетки т.6. «Криоконсервация генетических ресурсов в проблеме сохранения биоразнообразия». 1994, Пущино, стр. 8-13.

50. Санкевич М.Н. К вопросу криоконсервации семени Марала. Науч. тр. НИИ пушного звероводства. 1982, т. 28, с.70-74.

51. Сипко Т.П., Абилов А.И., Шишова Н.В. Криоконсервация постморталыюй спермы оленей. // Биофизика живой клетки. 1994, т. 6, с. 127-128.

52. Сипко Т.П., Абилов А.И., Шурхал А.В., Ротт Н.Н. Создание криобанка спермы зубра как способ сохранения генетического полиморфизма вида. // Генетика, 1993, т.29, №12, стр. 2051-2056.

53. Смирнов И.В., Сохранение спермы сельскохозяйственных животных посредством глубокого охлаждения. Автореф. дисс. д-ра биол. наук. М. 1949.

54. Соколовская И.И. Может ли замороженная сперма оплодотворять и давать нормальное потомство. // Доклады ВАСХНИЛ. 1947, №6, с21-23.

55. Соколовская И.И., Ойвадис Р.Н., Абилов А.И., Туре У.Б. О значении акросом в оценке семени самцов. // Сельское хозяйство Таджикистана. 1982, №5-6, с.38-40.

56. Соломонов Н.Г. Сезонные аспекты экологии и физиологии грызунов и зайца-беляка в центральной Якутии. //Эколого-биологические исследования организмов высоких широт. Сборник науч. трудов., Якутск, 1976, с. 3-14.

57. Тараковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих. // Методы культивирования клеток. Сбор. науч. трудов., 1988, JL: «Наука», с. 44-63.

58. Ткаченко А.А. Крымское заповедно-охотничье хозяйство. // Заповедники Советского союза. М.: Мысль. 1969.C.24-26.

59. Фауна европейского северо-востока России, т.2, 4.1 Млекопитающие: насекомоядные, рукокрылые, зайцеобразные, грызуны. Под редакцией А.А. Естафьева. С-Петербург "Наука" 1994, 280 стр.

60. Шайдулин И.Н. Усовершенствование метода замораживания семени барана путем применения антиоксидантов: автореф. дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы, 1980. 26 с.

61. Шайдулин И.Н., Ролдугин В.Н. Возможна отдаленная гибридизация. // Овцеводство, 1986, №4, 40-41.

62. Шарыгин JI.H. Породные и сезонные изменения спермопродукции // Наше племенное дело 2004 (№1) с. 12-13.

63. Шостак С.В. Отлов и расселение европейских благородных оленей в беловежской Пуще. // Редкие виды млекопитающих СССР и их охрана. М.: Наука, 1973. С.158-161.

64. Штайнлехнер С., Пухальский В. Сезонная регуляция размножения мелких млекопитающих. // Сибирский экологический журнал. (1999) Т.6, №1, стр. 23-35.

65. Шумаков, В.И., Штенгольд Е.Ш., Онищенко Н.А. Консервация органов. М.: «Медицина», 1975, 252 стр.

66. Шумаков В.И. Фармокологическая защита трансплантата. М.: Медицина, 1983, 350 стр.

67. Янушко П.А. Динамика численности крымских оленей. // Зоол. журн. 1957, Т.37, № 8, с.1228-1235.

68. Abou-Haila A, Daulat R.P. Tulsiani. Mammalian Sperm Acrosome: Formation, contents, function.Minieview // Arch Biochem Biophys 2000, V 379, N 2, Jul, P. 173-82

69. An T. Z., Iwakiri M., Edashige K., Sakurai Т., Kasai M. Factor affecting the survival of frozen-thawed mouse spermatozoa. // Cryobiology, 2000, V.40, P. 237-249

70. Asher G.W., Adam J.L., James R.V., et al. Artifitial insemination of farmed Fallou deer (Dama Dama): fixed-timed insemination at a synchronized oestrus. // Anim. Prod. 1988,V.47, P.487-493.

71. Asher G.W., Berg D.K., Evans G. Storage of semen and artifitial insemination in deer. // Enim. Reprod. Sci., 2000, V. 62, P. 195-211

72. Austin C.R., Sperm maturation in the male and female genital tracts. // Biology of fertilization. V. 2, Biology of the sperm. Ed. С. B. Metz, A. Monroy., Academic Press., 1985, P. 121-155.

73. Bahga C.S., Knokar B.S Effect of different seasons on concentration of plasma luteinizing hormone and seminal quality vis-a-vis freezability of buffalo bulls (Bubalus bubalis). // Int J Biometeorol. 1991, N. 4, P. 222-4.

74. Balercia G, Armeni T, Mantero F, Principato G, Regoli F. Total oxyradical scavenging capacity toward different reactive oxygen species in seminal plasma and sperm cells. //Clin Chem Lab Med. 2003 V.41,N 1,P. 13-9.

75. Ball B.A., Medina V., Gravance C.G., Baumbe J. Effect of antioxidants on preservation of motility, viability and acrosomal integrity of equine spermatozoa storage at 5 degrees C. // Theriogenology, 2001, V. 56 (4), p.577-589.

76. Barnes B.N. Annual cycles of gonadotropins and androgens in the hibernating golden-mantled ground squirrel. // General and сотр. endocriniligy,1986, V.62, P. 1322

77. Bedford J.M., Calvin M.C. The occurrence and possible functional significance of S-S-crosslinks in sperm heads, with particular reference to eutharian mammals. // J. Exp. Zool. 1974, V. 188, P. 137-156.

78. Berger P.J., Negus N.C., Rowsemitt C.N. Effect of 6-methoxybenzoxazolinone on sex ratio and breeding performance in Microtus montanus. // Biol. Reprod. 1987, V. 36, N 2, P. 255-260.

79. Blash S, Melican D, Gavin W. Cryopreservation of epididymal sperm obtained at necropsy from goats. // Theriogenology. 2000, V 54(6), P. 899-905

80. Bracket B. G., Hall J. L., Oh У. K. In vitro fertilizing ability of testicular, epididymal and ejaculated rabbit spermatozoa. // Fertil. Steril., 1978, V. 29, P. 571-582.

81. Bronson F.H. Seasonal regulation of reproduction in mammals. // The Physiology of reproduction, ed. E. Knobil, J. Neill et al., Raven Press, N.Y., 1988, P. 1831-1871.

82. Buff S, Donze A, Guerin P, Guillaud J, Fontbonne A, Menezo Y. Taurine and hypotaurine in spermatozoa and epididymal fluid of cats. //J Reprod Fertil Suppl. 2001, V. 57, P. 93-5

83. Check M, Summers-Chase D, Check JH, Choe J, Nazari A. Sperm extracted and cryopreserved from testes several hours after death results in pregnancy following frozen embryo transfer: case report. // Arch Androl. 1999, V. 43, N 3, P. 235-7

84. Chen H, Cheung MP, Chow PH, Cheung AL, Liu W, О WS. Protection of sperm DNA against oxidative stress in vivo by accessory sex gland secretions in male hamsters. // Reproduction. 2002, V. 124, N 4, P. 491-9.

85. Chen H, Chow PH, Cheng SK, Cheung AL, Cheng LY, О WS. Male genital tract antioxidant enzymes: their source, function in the female, and ability to preserve sperm DNA integrity in the golden hamster. // J Androl. 2003, N 5, P. 704-11.

86. Cormier N., Bailey J.L. A differential mechanism is involved during heparin- and cryopreservation-induced capacitation of bovine spermatozoa.// Biol. Reprod. 2003, V. 69, N 1, P. 177-85.

87. Courtens J.L., Courto M., Flechon J.E. The perinuclear substance of boar, bull, ram and rabbit spermatozoa. // J. Ultrastruct. Res., 1976., V 57, P.54-64.

88. D'Alessandro A.G., Martemucci G. Evaluation of seasonal variations of semen freezability in Leccese ram. // Anim. Reprod. Sci. 2003, V. 79, N 1-2, P. 93-102.

89. Dawra R. K., Sharma O.P. Effect of seminal plasma antioxidation in spermatozoa, mitohondria and microsomes/ Biochemistry international. 1985, V. 11, N 3,

90. Dawra R. K., Sharma O.P., Makkar H.P.S. Evidence for novel antioxidant in bovine seminal plasma. // Biochemistry international V 8, No 5, 1984.

91. Dewit M., Marley W.S., Graham J.K. Fertilizing potential of mouse spermatozoa cryopreserved in a medium containing whole eggs. // Cryobiology. 2000, V. 40, N 1, P. 36-45

92. Ellis G.C., Palmer R.A., Balph D.F. The reproductiove cycle of male Uinta Ground Squirrels: same anotomical and biochemical correlates. // Comp Biohem Physiol V 74A, N 2, P 239-245, 1983.

93. Gakhova E.N. Genetic cryobanks for conservation of biodiversity. The development and current status of this problem in Russia. //Cryo-Letters. 1998. suppl. 1. P. 57-64

94. Gonzales GF. Function of seminal vesicles and their role on male fertility. // Asian J Androl. 2001, N4, P. 251-8.

95. Goss, R. S. Photoperiodic control of antler cycles in deer. I. Phase shift and frequency changes. // J. Exp. Zool., 1969, V. 170, P. 311-324

96. Graham E.F., Sehmehl M.M.L., Evensen B.K., Nelson D.V. Semen preservation in non-domestic animals. // Artificial breeding of non-domestic animals. Mammals. L., Acad. Press. 1978, P. 153-173.

97. Green C.E., Watson P.F. Comparison of the capacitation-like state of cooled boar spermatozoa with true capacitation. // Reprodaction. 2001, V. 122N 6, P. 889-98.

98. Haigh JC, Cates WF, Glover GJ, Rawlings NC. Relationships between seasonal changes in serum testosterone concentrations, scrotal circumference and sperm morphology of male wapiti (Cervus elaphus). // J Reprod Fertil. 1984, V. 70. N 2, P. 413-8.

99. Haigh J.C., Barth A.D., Bowman P. An evaluation of extender for wapiti (Cervus elafus) semen. //J.Zoo Anim. Med. 1986, V. 17, P.129-136.

100. Hanser P.L. Photoperiodic regulation of reproduction in mammals breeding during long days versus mammals during short days. // Anim Reprod Sci 9. 1985, P. 301-315

101. Hishinuma M., SuzukiK., Sekine J. Recovery and cryopreservation of sika deer (Cervus nippori) spermatozoa from epididymides stored at 4 degrees C. // Theriogenology. 2003. V.59, № 3.4, p. 813-20.

102. Hochereau-de Reviers MT, Lincoln GA.Seasonal variation in the histology of the testis of the red deer, Cervus elaphus. J Reprod Fertil. 1978, V. 54 N 2, P. 209-13

103. Holt W.V. Genetic resource banking and maintaining biodiversity // Cryobanking the genetic resource. Wildlife conservation for the future? Edited by Watson P.F., Holt W.V. London-New York: Taylor and Francis Inc. 2001, P. 9-20

104. Horabayashi M, Kato M., Aoto T, Ueda M., Hochi S. Rescue of infertile transgenic rat lines by intracytoplasmic injection of cryopreserved round spermatids. // Mol Reprod Dev. 2002, V. 62, N 3. P. 295-9

105. Holms W.G., Landau I.T. Vaginal estrus in unmated Belding's ground squirrels. // Horm Behav 1986, V. 20, N 2, P. 243-8.

106. Jacobson H., English A. Endangered species. //The Biology of Deer. Ed. R.D. Broun. N.Y. ets. Springer Verl. 1991, P. 579-580.

107. Jaczevski Z., Morstin J., Kossakowski J., et ol. Freezing the semen of red deer stags. // VIII int. Congr. Anim. Reprod & Artif. Insem. Krakow. 1976, V. 4, P.994-997.

108. Jewgenow K., Blottner S., Lengwinat T. et al New methods for gamete rescue from gonads of nondomestic felids // J Reprod Fertil. Suppl. 1997, V. 51, P. 33-39.

109. Kaabi M., Paz P., Alvarez M. et al. Effect of epididymis handling conditions on the quality of ram spermatozoa recovered post-mortem. // Theriogenology. 2003, V. 60, № 7. P, 1249-59.

110. Katkov 1.1., Kataova N., Crister, J., Mazur P. Mouse spermatozoa in high concentration of glycerol: Chemical toxicity vs osmotic shock at normal and reducsd oxygen concentrations. // Cryobiology, 1998, V. 37, P. 403-404.

111. Kenagy G.J. Interrelation of endogenous annual rhythms of reproduction and hibernation in the Golden-mantler Ground Squirrel. // J. Сотр. Physyol, 1980, V. 135, P. 333-339.

112. Kikuchi K., Nagai Т., Kashiwazaki N. et al. Cryopreservation and ensuing in vitro fertilization ability of boar spermatozoa from epididymides stored at 4 degrees C. // Theriogenology. 1998, V. 50, № 4, P. 615-23.

113. Kim JG, Parthasarathy S. Oxidation and the spermatozoa. // Semin Reprod Endocrinol. 1998;V. 16, N4, P. 235-9.

114. Kishikawa H., Tateno H., Yanagimachi R. Fertility of mouse spermatozoa retrieved from cadavers and maintained at 4 degrees C. // J Reprod Fertil. 1999, V. 116, № 2, P. 217-22.

115. Krzywinski A., Jaczevski Z. Observation on artificial breeding of red deer.// Symp. Zool. Soc. London. 1978, V.43, P. 271-275.

116. Krzyvinski A. (1981) Freezing of post mortem collekted semen from Moos and Red Deer. Acta Theriologica, V.28. P.424-426.

117. Krzivinski A., Wierzchos E. Reprodaktiv biotechnology in deer farming. // Embrionik development and manipulation in animal produktion. Trends in researct and applikations., Portland Press proseedings, The biochemical Society, London. 1992. P. 249-255.

118. Lambrechts H., van Niekerk F. E., Coetzer W. A. et al The effect of cryopreservation on the survivability, viability and motility of epididymal African buffalo (Syncerus caffer) spermatozoa. //Theriogenology. 1999. V. 52. № 7. P. 1241-9.

119. Landau I.T., Holmes W.G. Mating of captive thirteen-lined ground squirrels and the asnnual timing of estrus. // Horm Behav. 1988, V. 22. V4, P. 474-87.

120. Light P., Zucker I., Hubbard G. and Boshes M. Circannual rhythms of plasma testosterone and luteinizing hormone levels in Golden-mantled squirrels (Spermophilus lateralis). // Biol. Reprod. 1982, V. 27, P. 411-418.

121. Marks S.L., Dupuis J., Mickelsen W.D., et al. Conception by use of postmortem epididymal semen extraction in a dog. // J Am Vet Med Assoc. 1994, V. 204, № 10, P. 1639-40.

122. Maxwell WM, Johnson LA. Physiology of spermatozoa at high dilution rates: influence of seninal plasma. Theriogenology, 1999, V. 52, N 8, P. 1353-62

123. Miles P.D.N., Sympson P., Allende R.A. Post-morten recovery of semen from red deer (Cervus elaphus linuaeus) and cryopreservation in liquid vitrogen. // Revista Argentine de Production Animal 1992, V.l, P.57-64.

124. Mulley R.C., Moore M.W., English A.W. Successful uterine insemination of fallow deer with fresh or frozen semen. // Theriogenology. 1988, V.29, N5, P.l 149-1153.

125. Nakagata, N. (1993) Prodaction of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. // J. Reprod. Fertil. 1999, P. 77-80.

126. Nakatsukasa E, Inomata T, Ikeda T, Shino M, Kashiwazaki N. Generation of live rat offspring by intrauterine insemination with epididymal spermatozoa cryopreserved at -196 degrees C. Reproduction. 2001, V. 122, N3, P. 463-7.

127. Nelson, R. J., Dark J., Zucker I. (1983) Influence of photoperiod, nutrition and water availability on reprodaction of male California voles (Microtus californicus). // J. Reprod Fertil., V. 69, P. 473-477.

128. Okuyama M., Isogai S., Saga M., Hamada, H., Ogawa S. In vitro fertilisation (IVF) and artifitial ansemination (Al) by cryopreserved spermatozoa in mouse. // J. Fertil. Implant., 1990, N7, P. 116-119.

129. Penfold L.M., Moore H.D. A new method for cryopreservation of mouse spermatozoa. //J Reprod Fertil 1993, V. 99, N 1, P. 131-134

130. Pengelley E.T., Asmundson S.J. Circannual rhythmicity in hibernating mammals. // Circannual clocks., ed. Pengelley E.T., Academic Press., N.-Y., 1974., P. 95-160.

131. Sanchez-Partida LG, Setchell BP, Maxwell WM. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa. // Reprod Fertil Dev. 1997, V. 9, N. 7, P. 689-96.

132. Schwagmeeyer P.L., Parcer G.A., Mock D.V. Information asymmetries among males: implication for fertilization success in the thirteen-lined ground squirrel. // Proc R Soc Lond Biol Sci., 1998, V. 265, N 1408, P. 1861-1865.

133. Schembri M.A., Major D.A., Suttie J.J., Maxvell W.M., Evans G. Capacitation-like changes in equine spermatozoa throughout the cryopreservation process. // Reprod Fertil Dev. 2002, V. 14, N 3-4, P. 225-33.

134. Sechell B.P., Brooks D.E. Anatomy, vasculature, innervation and fluids of male reprodactive tract. // The Physiology of reproduction, ed. E. Knobil, J. Neill et al., Raven Press, N.Y., 1988, P. 837-932.

135. Soler A.J., Garcia A.J., Fernandez-Santos M.R. et al. Effects of thawing procedure on postthawed in vitro viability and in vivo fertility of red deer epididymal spermatozoa cryopreserved at -196 degrees C. // J Androl. 2003, V. 24, № 5, P. 746-56.

136. Songsasen N., Leibo S.P. Cryopreservation of mouse spermatozoa. I. Effect of seeding on fertility on fertilizing ability of cryopreserved spermatozoa. // Cryobiology 1997, V. 35, N 3, P. 240-54.

137. Songsasen N., Leibo S.P. Cryopreservation of mouse spermatozoa. II. Relation between survival after cryopreservation and osmotic tolerance of spermatozoa from three strains of mice. // Cryobiology 1997, V. 35, N 3, P. 255-269.

138. Songsasen N., Tong J., Leibo SP. Birth of live mice derived by in vitro fertilization with spermatozoa retrieved up to twenty-four hours after death. // J Exp Zool. 1998, V. 280, №2, P. 189-96.

139. Storey B.T., Noiles E.E., Thompson K.A. Comparison of glicerol, other poliols, tregalose, and raffinose to provide a defined cryoprotectant medium for mouse sperm cryopreservation. // Cryobiology 1998, V. 37, N 1, P. 46-58.

140. Sztein J. M.,Noble K., Farley J.S., Mobraaten L.E. Comparison of permeating and nonpermeating cryoprotectant for mouse sperm cryopreservation.// Cryobiology, 2001, V. 41, P. 28-39.

141. Sztein J. M., Farley J. S., Young A. F., Mobraaten L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of sowing. // Cryobiology 1997, V.35, N1, P. 46-52.

142. Suzuki M., Kaji K., Higi h. Annual clanges of testik size, seminiferouz tubules and plasma testosterone concentration of wild sika deer (Cervus nippon yesoensis Huede, 1884) in Hokkaido // J. Vet. met. sci. 1992, V. 54, N3, P.551-556.

143. Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, Т., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mause spermatozoa in presence of raffinose and glicerol. // J. Reprod. Fertil. 1990, V. 89, P. 511-516.

144. Tao J., Du J., Kleinhans F.W., Crister E.S., Mazur P., Crister J.K The effect of collection temperature, cooling rate on chilling injury and cryopreservation of mouse spermatozoa. // J Reprod Fertil 1995, V. 104, N 2, P. 231-6

145. Tramer F., Rocco F., Micali F., Sandri G., Panfili E. Antioxdant systems in rat epididymal spermatozoa. // Biology of Reproduction 1998, V. 59, P. 753-758.

146. Tsvetkov Т., Takeva T. Status on the estrus cycle of the ground squirrel (Citellus citellus L.) at experimentally induced hibernation. // Cryobiology. 1989, V. 26, N5, P. 508-11.

147. Turek E.W., Cfuter E.V. Rhythms in reproduction.// The Physiology of reproduction, ed. E. Knobil, J. Neill etal., Raven Press, N.Y., 1988, P. 1789-1830.

148. Uteshev V., Gakhova E. Gene cryobanking for cjnservation of endengered amphibian species. // Russ. J. Herpetology, 2005,12 Suppl, P. 233-235.

149. Vernet P., Aitken R.J., Drevet J.R Antioxidant strategies in the epididymis. // Mol Cell Endocrinol. 2004, V. 216, N 1-2, P 31-39.

150. Ward C.R., Storey B.T. Determination of the time course of capatitation in mouse spermatozoa using a chlortetracycline fluorescence assay. // Developmental biology, 1984, V. 104, P. 287-296.

151. White I.G. Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod fertil. Dev., 1993, N 5, P. 639-58.

152. Willoughby C.E., Mazur P., Peter A.T., Critser J.K. Osmotic tolerance limits and properties of murine spermatozoa. // Biol reprod. 1996, V. 55, N 3, P. 715-27.

153. Wood M.J., Candy C.J., Holt W.V. Gamete and embryo cryopreservation in Rodents. // In Cryobanking the genetic resource. Wildlife conservation for the future? Ed. Watson P.F., Holt W.V., London and New York, 2001, P. 228-266

154. Yu I., Leibo S.P. Recovery of motile, membrane-intact spermatozoa from canine epididymides stored for 8 days at 4 degrees C. // Theriogenology. 2002, V.57, № 3, P. 1179-90.

155. Zhao Z., Willis J.S. Maintenans of cation gradient in cold-stored erytrocytes of guinea pig and ground squirrel: impruvment of amiloride. // Cryobiology, 1989, V. 26, N 2, P. 132-137