Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадей

Феофилов, Антон Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадей
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадей"

На правах рукописи

полиморфизм фрагментов днк, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота,

лошадей

03.02.07,- Генетика

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 ОКТ 2012

Дубровицы - 2012

005053210

Работа выполнена в Центре нанобиотехнологий ФГБОУ ВПО «Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева».

Научный руководитель: Глазко Валерий Иванович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАСХН (иностранный член)

Официальные оппоненты: Калашникова Любовь Александровна, доктор

биологических наук, профессор, заведующая лабораторией ДНК-технологий ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Кленовицкий Павел Михайлович, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории репродуктивной криобиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт коневодства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится « 9 » октября 2012 г. в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132. Московская область. Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии; тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « 6 » сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.013.03

И.В. Гусев

1. общая характеристика работы

Актуальность темы. Успешность решения задач общей и частной популяционной генетики многих видов, в том числе и сельскохозяйственных, зависит от изученности особенностей полиморфизма различных элементов генома (Харченко, Глазко 2006; Эрнст, 2008; Калашникова, 2010). В последнее время для этих целей широко используются микросателлитные маркеры (Зиновьева, Гладырь, 2009, 2011; Багиров и др., 2009), которые позволили по-новому взглянуть на организацию генома как целого (Зайцев, Храброва, 2011). Достижения в этой области способствовали появлению методов геномного сканирования, т.е. одновременного анализа от десятков до нескольких сотен генетических локусов (Nosil et al., 2009). Хотя к настоящему времени геномы ряда сельскохозяйственных видов полностью секвенированы, и для картирования главных генов количественных признаков широко используются оценки разнообразия по сотням тысяч однонуклеотидных замен (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) («геномная селекция», Weller, Ron, 2011), эффективность применения таких методов в селекционных программах (GEBV) не очень высока. К тому же она варьирует в зависимости от породной принадлежности (Flori et al., 2009) и эколого-географических условий разведения животных (Hammami et al., 2009).

Альтернативным направлением геномного сканирования может бьггь использование оценок полиморфизма длин фрагментов ДНК, фланкированных короткими инвертированными повторами; поскольку они широко представлены в геномах, такой подход позволяет охарактеризовать геном как целое. Применение микросателлитных последовательностей в качестве праймеров в ПЦР для геномного сканирования получило название ISSR-PCR (Inter-Simple Sequence Repeat). Эти маркеры нашли широкое применение в популяционно-генетических исследованиях различных объектов (Глазко, 2009; Зиновьева и др., 2011). Однако, поскольку геномное распределение микросателлитов существенно отличается у разных таксонов (Santana et al., 2009), а возможные причины таких отличий до сих пор недостаточно изучены, перед использованием ISSR-PCR для геномного сканирования необходимо исследовать полиморфизм спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от корового мотива микросателлита, а также видовой и породной принадлежности животных, эколого-географических условий их воспроизводства. В связи с этим в настоящей работе выполнен сравнительный анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров, полученных с использованием в качестве праймеров различных микросателлитных мотивов, у ряда видов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась разработка и оптимизация методов использования ISSR-PCR маркеров для выявления и контроля генетического разнообразия генофондов некоторых видов и пород сельскохозяйственных животных.

Для этого были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Провести сравнительный анализ спектров продуктов амплификации, получаемых с использованием в качестве праймеров участков различных микросателлитов, у крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также некоторых представителей диких видов семейства Bovidae;

2. Оценить информативность спектров фрагментов ДНК, получаемых при использовании различных праймеров для геномного сканирования доместицированных видов Вом'к1аг, а также домашней лошади;

3. Дать характеристику исследованных групп животных по доле полиморфных локусов, полиморфному информационному содержанию спектров продуктов амплификации КБЯ-РСЯ маркеров в зависимости от нуклеотидной последовательности микросателлитов, используемых в качестве праймеров;

4. Выявить получаемые в результате ИБЯ-РСК генетические локусы, участвующие в межвидовой и внутривидовой (межпородной) генетической дифференциации;

5. Оценить возможные источники отличий в распределении КвЯ-РСЯ маркеров путем анализа особенностей их локализации в секвенированных последовательностях геномной ДНК с использованием международной базы данных СепВапк;

6. Изучить последовательности ампликонов, демонстрирующих разнообразие на внутривидовом уровне, с целью выявления возможных причин наблюдаемых различий.

Научная новизна. В работе впервые выполнен сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК, получаемых методом КЭТ^-РСЯ анализа, для представителей доместицированных и диких видов копытных. Рассмотрены особенности генетической дифференциации крупного рогатого скота, овец, лошадей по полиморфизму «анонимных» фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами участков микросателлитных локусов. Впервые у исследованных групп животных изучены особенности спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от нуклеотидной последовательности флангов. Получены данные о видовой и породной специфичности, консервативности и изменчивости отдельных фрагментов ДНК, присутствующих в ИБЯ-РСЯ спектрах, о возможной связи наблюдаемого полиморфизма со спецификой локализации микросателлитов в различных частях генома. Путем секвенирования показано, что источником появления отдельных фрагментов ДНК в КЗЯ-РСЯ спектрах может быть рекомбинация между участками эндогенных ретровирусов. Один из таких фрагментов у лошадей оказался ассоциированным с присутствием хромосомы У.

Практическая значимость. Подобраны наиболее информативные полилокусные сочетания КЗЯ-РСЯ маркеров, позволяющие проследить родственные отношения между группами животных, разработать видовые, внутривидовые, породные и внугрипородные «генофондные стандарты» -совокупности ДНК фрагментов разной длины в ^ЗЯ-РСЯ спектрах, присутствие/отсутствие которых отличает одну группу животных от другой. Полученные результаты дают возможность предложить генетически обоснованные программы сохранения биоразнообразия редких и исчезающих видов и пород, контролировать динамику генофондов сельскохозяйственных животных в условиях искусственного и естественного отборов. Обнаруженный фрагмент ДНК в геноме лошади, ассоциированный с присутствием хромосомы У, может быть использован для пренатальной диагностики пола эмбриона методом ПЦР-анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты геномного сканирования при генотипировании нескольких десятков фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (ТЗЭК-РСЯ маркеры) отражают популяционно-генетические

взаимоотношения между группами животных на межвидовом, внутривидовом (породном) и внутрипородном уровнях.

2. Участки генома, фланкированные инвертированными повторами микросателлитов, позволяют создавать тест-системы, устанавливающие принадлежность животного к конкретной (видовой, породной, по признаку пола) группе.

3. Полиморфизм ISSR-PCR маркеров может быть тесно связан с перемещениями и рекомбинацией мобильных генетических элементов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2011», Москва; на Международных московских конференциях по вычислительной молекулярной биологии (МССМВ'09, МССМВ'11); на Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию зоотехнической науки Беларуси, Жодино, 2009; на Национальной научной конференции по генетике, Болгария, 2009; на 7-ой и 8-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома и системной биологии (BGRS'10 и BGRS'12), Новосибирск; на Международной научной конференции «24-е генетические дни», Брно, 2010; на IX Съезде Териологического общества при РАН, Москва, 2011; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология», 2011; на конкурсе молодых ученых на лучший инновационный проект по вопросам биотехнологии, Подольск, ВИЖ, 2012.

Публикация результатов исследования. Основные результаты работы опубликованы в 21 научной статье, в том числе 9 из них в журналах, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 148 страницах и включает введение, главы «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», заключение, выводы, предложения производству, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей, 19 рисунками. Список литературы включает 167 публикаций, втом числе 108 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В работе были проанализированы образцы ДНК, выделенной из крови крупного рогатого скота: серой украинской породы (34 головы (гол.), Украина, 45 гол., респ. Алтай), красной эстонской породы (23 гол., Псковская обл.), черно-пестрой голштинизированной породы (23 гол., хозяйство РГАУ-МСХА) и якутской породы (11 гол., респ. Саха); овец: эдильбаевской породы (бирликского внутрипородного типа - 50 гол., суюндукского - 50 гол., Волгоградская обл.), романовской породы (209 гол., разводимых в хозяйствах Ярославской и Ивановской областей), кулундинской породы (70 гол., респ. Алтай); лошадей: алтайской породы (96 гол., респ. Алтай), рысистых пород (48 гол., Московская обл.). Также были исследованы популяции монгольских местных пород (крупный рогатый скот - 14 гол., овцы - 32 гол., яки - 14 гол., козы - 22 гол.), разводимых на территории Южного Гоби, и группы этих же видов животных, обитающие в биосферном заповеднике Хубсугул.

Схема исследования представлена на рис. 1.

Крупный рогатый скот Серая Украинская ЧejTHo 'Пс си і/кія Красная Эстонская Яклінская Овцы Романовская Ку.туноіаіская Эдилъбаессквз Лошади Лттаиская Рысисппле Монгольские местные породы крупного рогатого скота, овец. ко?, яков

1 і 1 і

Выделение геномной ДНК из крови

ISSR-PCR анаши / - Электрофорез в агарозком геле —¥ Визуализация спектров ПЦР-фрагментов в УФ f N Анализ спектров V У

Бело-голубая селекция колоний 4 Трансформация клеток Е. Cotí, шіямм JM109 4 Клонирование в плазмнде pUClP 4- ( \ Выделение ампликонов из геля

/ Выделение плазмиднои ДНК ч, Секвенпровзкпе фрагыенга-вегшкн ' \ Вьир.ткніїе ВСГ^ЮЖШТЧ. ИСТОЧНИКИ ОПНЧИП 4- ч Поиск гомологии в GeiiBank и базах данных повторов

Рис 1. Схема исследований

Выделение ДНК. Экстракцию геномной ДНК из лейкоцитов крови проводили с использованием набора реагентов «ДНК-экстран» («Синтол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. В ряде случаев был использован метод выделения ДНК с использованием фенол-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984).

ISSR-PCR анализ. Для проведения ISSR-PCR анализа приметали методику, разработанную Зеткевичем и др. с некоторыми модификациями (Zietkiewicz Е. et al. 1994). В качестве праймеров использовали последовательности (AG)9C, (GA)9C, (GAG)9C, (СТС)9С, (AGC)6G, (ACC)6G («Синтол», Россия). Один ампликон спектра рассматривали как один локус ДНК. Полиморфизм такого локуса оценивали по наличию-отсутствию ампликона соответствующей длины в спектрах. Программа амплификации включала в себя первичную денатурацию (t = 94°С, 2 мин.); 30 циклов денатурации (t = 94°С, 30 е.), отжига праймера (t = 55°С, 30 е.), элонгации цепи (t = 72°С, 2 мин.); а также финальную элонгацию (t = 72°С, 10 мин.), ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технологии», Россия).

Разделение продуююв амплификации. Электрофорез продуктов амплификации проводили с использованием 1,5% агарозного геля в 1х ТВЕ-буфере (89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0,5 мкг/мл со следующими параметрами: сила тока составляла 50 мА, напряжение 100 В, время 1,5 часа.

Визуализация результатов электрофореза. Гели фотографировали в ультрафиолете, X. = 312 нм (трансиллюминатор УВТ-1, «Биоком», Россия).

Обработка полученных результатов. Для каждого спектра строили матрицу, отражающую присутствие/отсутствие в нем конкретных ампликонов. Расчеты частот доминантных/рецессивных аллелей в выборке выполняли с помощью Microsoft Excel; популяционно-генетические расчеты производили в программе TFPGA (Miller, 1997).

Расчет индекса PIC (polymorphism information contents). Индекс PIC характеризует уровень гетерозиготности локусов - продуктов амплификации, исходя из представлений о том, что по каждому локусу исследованная группа животных находится в состоянии, соответствующем равновесию Харди-Вайнберга. Для индивидуальных локусов значения индекса рассчитывали по формуле, предложенной Botstein и др. для диаллельных локусов (Botstein et al., 1980), для которых PIC=2fl;i-f), где f- частота одного из двух аллелей. Ее вычисляли исходя из доли носителей рецессивных гомозигот по формуле^, где R - количество

носителей рецессивных гомозигот, N - количество исследованных животных.

Поиск гомологии. Поиск гомологичных последовательностей в GenBank осуществлялся с помощью алгоритмов семейства BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov1- в базах данных повторяющихся последовательностей - с помощью программ Censor (www.girinst.org/censor/1 и RepeatMasker (www, repeatmasker. org/1.

Выделение ДНК из геля. Ампликоны спектра выделяли из геля с помощью набора для элюции ДНК из агарозных гелей («Изоген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Клонирование, селекция колоний, выделение плазмидной ДНК. Некоторые ампликоны выделили из геля и амплифицировали с использованием праймера 5'-CAGCTGCAG(AG)8C-3', содержащего на 5'-конце сайт рестрикции для Pstl. ПЦР-продукг клонировали в плазмиде pUC19 по Pstl, которую размножали затем в клетках Е. coli штамма JM109. Клонирование, селекцию колоний и выделение плазмидной ДНК выполняли в соответствии со стандартной процедурой (Маниатис и др., 1984).

Секвенирование ДНК проводилось с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems на базе Межинститутского Центра коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН. Секвенирование осуществляли с использованием праймеров к фагу М13: F(-40) -5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3R(-40) - 5 '-С AGGAAACAGCTATG АС-3'. Результаты секвенирования анализировали с помощью компьютерной программы BioEdit v. 7.0.5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Изучение межвидовой дифференциации методом ISSR-анализа

На первом этапе, с целью получить наиболее насыщенные спектры продуктов ISSR-PCR с высокой воспроизводимостью, была выполнена оптимизация условий геномного сканирования. Тестируемые праймеры содержали последовательности ди- и тринуклеотидных микросателлитных мотивов с добавлением якорного нуклеотида на З'-конце. В реакционной смеси варьировали концентрацию магния, Taq ДНК полимеразы, количество ДНК-матрицы, в программе амплификации варьировали температуру отжига праймера, количество циклов и длительность этапов отжига праймера и элонгации цепи. Оптимальные для всех исследованных видов условия приведены в разделе «Материалы и методы». Спектры, получаемые с использованием ди- и тринуклеотидных микросателлитных мотивов в качестве праймеров, оказались в равной степени

насыщены ампликонами, хотя предполагалось, что спектры динуклеотидных праймеров должны быть более сложными.

Для изучения межвидовой дифференциации была поставлена дополнительная задача: протестировать образцы геномной ДНК видов млекопитающих и птиц, представленных на фореграмме (рис. 2). Тестирование по каждому из использованных праймеров позволяло надежно отличать один вид от другого по присутствию уникальных ампликонов. В качестве примера на рис. 2 приведены спектры ампликонов, получаемые с использованием праймера (АСЭ^С.

1 2 3 4 М 5 ,6 7 8 9 М 10 11 12 13

Фф

200 —

Рис. 2. Спектры ампликонов, получаемые при использовании праймера (AG)9C в ISSR-PCR. М - маркер молекулярных масс (длины фрагментов ДНК указаны слева), 1- каборга, 2 - лань, 3 - северный олень, 4 - снежный баран, 5 - овцебык, 6 - лошадь, 7 - овца, 8 - крупный рогатый скот, 9 - як, 10 - зубр, 11 - лось, 12 -косуля, 13-дрофа.

На основании совокупности данных спектров четырех ISSR-PCR праймеров были рассчитаны величины генетических дистанций (Nei, 1972) и построена дендрограмма (рис. 3).

I-1-1-1-1

.7 .525 .35 .175 0,000

--даурские журавли

--японские журавли

--дрофы

—— --крупный рогатый скот

---яки

_ I--овцы

--—.— лошади

Рис. 3. Дендрограмма межвидовых взаимоотношений между представителями видов, принадлежащих различным классам животных, построенная на основании генетических расстояний, рассчитанных по ISSR-PCR маркерам.

Оказалось, что дендрограмма адекватно отражает существующие представления о филогенетических взаимоотношениях между классами и видами.

гС

Из этого следует, что полиморфизм «анонимных» фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами разных микросателлитов (суммарно-186 локусов) объективно отражает генетическую дифференциацию между разными группами животных.

3.2. Особенности генетической дифференциации на внутривидовом (межпородном) уровне 3.2.1. Породы крупного рогатого скота и яки

Использование ^Я-РСЯ маркеров позволило получить у пород крупного рогатого скота спектры продуктов амплификации (ампликонов), характеристики которых представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики спектров ампликонов, полученных в ИБК-РСЯ у пород крупного ___рогатого скота_

Праймер Порода Количество ампликонов в спектре Границы длин локусов спектра, п.н. Количество полиморфных ампликонов Доля полиморфных ампликонов в спектре, % РІС

(АО,С серая украинская 11 1200-220 5 45 0,175

черно-пестрая 9 1050-280 4 44 0,171

красная эстонская И 1250-480 5 45 0,154

(СА)9С серая украинская 10 1500-240 0 0 0

черно-пестрая 6 600-210 3 50 0,221

красная эстонская 12 1100-300 3 25 0,105

(ОАС)6С серая украинская 17 3000-280 8 47 0,233

черно-пестрая 16 1050-280 6 38 0,133

красная эстонская 21 1300-360 9 43 0,170

(СТС)бС серая украинская 16 3100-310 15 94 0,300

черно-пестрая 14 1350-310 7 50 0,210

(АСС)6С серая украинская 16 2600-380 4 25 0,162

(АСС)6С серая украинская 32 3250-320 31 97 0,280

Обнаружено, что каждый используемый праймер в ^БЛ-РСЯ методе приводил к формированию специфичных спектров продуктов амплификации, причем их полиморфизм не был прямо связан с количеством выявляемых локусов. У серой украинской породы спектр праймера (АСС)6С оказался существенно более полиморфным у быков по сравнению с коровами. Выявлены выраженные отличия между спектрами праймеров (ОАО)6С и (СТС)6С. Эти последовательности принадлежат к так называемым пурин/пиримидиновым трекам, способным формировать триплексные структуры, предположительно, принимающим участие в регуляции генной экспрессии. При почти одинаковом количестве ампликонов в спектрах доля полиморфных локусов была существенно выше у последнего, а по структуре спектров в случае (ОАО)6С преобладали "легкие" (до 1000 п.н.) ампликоны, в то время как для (СТС)6С были характерны "тяжелые" (от 1550 до 3250 п.н.) фрагменты ДНК. Полученные величины Р1С для этих спектров качественно совпадали с результатами оценки доли полиморфных локусов: наибольшие значения Р1С обнаруживаются в спектрах праймеров (АСС)6С и

(СТС)6С по сравнению со спектрами, полученными при использовании других праймеров.

У представителей черно-пестрой голштинизированной породы выявлено от 6 до 16 ампликонов, при этом доля полиморфных локусов была примерно одинаковой. Максимальное число ампликонов наблюдали в спектре праймера (GAG)6C, минимальное - при использовании праймера (GA)9C, при этом значения индекса 'PIC для них были наименьшим (0,133) и наибольшим (0,221) соответственно. То есть, несмотря на небольшое количество локусов, выявляемых праймером (GA)9C, их полиморфизм имеет большее информационное содержание.

У животных красной эстонской породы спектры праймера (GA)9C оказались наименее полиморфными - значение индекса PIC было наименьшим среди всех исследованных групп крупного рогатого скота. В спектрах, полученных с использованием праймера (AG)9C, присутствовали ампликоны длиной в 710, 690 и 560 п.н., до этого не наблюдавшиеся нами в спектрах этого праймера у других пород крупного рогатого скота. В совокупности, были выявлены ампликоны, характерные для каждой породы, например, локус 370 п.н. для красной эстонской породы и локус 410 п.н. для черно-пестрой (рис. 4) в спектре праймера (AG)9C.

Для сопоставления со спектрами ISSR-PCR маркеров у близкородственных видов рода Bos нами были дополнительно проанализированы образцы геномной ДНК яков (19 гол., респ. Саха). Выявлены общие и отличающиеся между группами продукты амплификации. Так, например, в спектрах праймера (GAG)6C фрагмент длиной в 650 п.н. присутствовал у 12 из 19 исследованных яков, у половины представителей черно-пестрой породы и у большинства представителей красной эстонской породы. Фрагмент длиной 480 п.н. отсутствовал у черно-пестрой породы, но наблюдался у якутской породы и у 79% яков. Фрагмент длиной 400 п.н. был выявлен примерно у половины животных черно-пестрой породы, у всех животных якутской породы, у 91% животных красной эстонской породы и у 74% яков. Фрагменты длин в 280 и 380 п.н. наблюдали только у коров якутской и черно-пестрой породы соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о том, что оценки полиморфизма ISSR-PCR маркеров позволяют выявлять совокупность фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами разных микросателлитных локусов, сочетание которых отличает одну породу крупного рогатого скота от другой, а также от яков.

3.2.2. Генетическая дифференциация пород овец по ISSR-PCR маркерам

Нами выполнен анализ образцов геномной ДНК овец эдильбаевской породы, полученные характеристики ISSR-PCR спектров представлены в таблице 2. Обращает на себя внимание высокий полиморфизм в спектрах праймера (СТС)6С, а также небольшое общее количество и сравнительно малая длина ампликонов в спектрах праймера (GA)9C. Между спектрами праймеров (GAG)6C и (СТС)6С у

юоо

Рис. 4. Фрагмент спектра ампликонов, полученных с праймером (Ав^С. 1-5 — черно пестрая порода, 6 - красная эстонская, М - маркер молекулярных масс

исследованных овец, так же как и у крупного рогатого скота, обнаруживались выраженные отличия по доле полиморфных локусов и диапазонам длин ампликонов (табл.2).

Таблица 2

Характеристики спектров ампликонов, полученных в ^Я-РСЯ у пород овец

Праймер Количество ампликонов в спектре Границы длин локусов спектра, п.н. Количество полиморфных ампликонов Доля полиморфных ампликонов в спектре, % РІС

Эдильбаевская

(Ай)9С 10 1200-280 7 70 0,274

(ОЛ)9С 5 600-200 4 80 0,297

(ОАОбС 8 850-400 3 38 0,231

(СТС)бС 17 1700-280 17 100 0,399

Романовская

(АО)9С 26 1270-225 18 69 0,314

(ОА),С 9 640-215 7 78 0,356

Среди продуктов амплификации, полученных в спектрах праймеров (АО)9С и (ОА)9С, у животных романовской породы наиболее надежно выявлялись 13 и 8 ампликонов соответственно. В спектрах праймера (АО^С с высокой частотой присутствовали фрагменты ДНК длин 1000 и 600 п.н. Уровень средней гетерозиготносте по продуктам спектра праймера (АО)9С у романовских овец из разных хозяйств варьировал от 0,265 до 0,373 при среднем значении 0,314, в то время как в спектрах праймера (ОА)9С он практически не отличался: 0,355-0,359. Обращает на себя внимание сходство доли полиморфных локусов и границ длин ампликонов у эдильбаевской и романовской пород (табл. 2).

Несколько отличался от эдильбаевской спектр продуктов амплификации по праймеру (ОА)9С у кулундинской овцы. Спектр праймера (ОА)9С этой породы был относительно больше обогащен длинными фрагментами ДНК, по сравнению с эдильбаевской овцой: размер ампликонов находился в пределах 2500-300 п.н. Суммарно выявлено 6 продуктов амплификации. В спектрах праймера (АО)9С, наблюдалось 11 ампликонов длинами от 600 до 2500 п.н.

Для сравнения нами были также проанализированы представители близкородственного дикого вида - снежного барана (6 гол., респ. Саха). В результате в спектрах праймера (АС)9С выявлены ампликоны, присутствие которых отличалось у домашней овцы и снежного барана Так, специфичным для кулундинской породы овец оказался ампликон длиной в 2500 п.н. Ампликоны длиной в 2200 и 900 п.н. выявлены только у снежного барана. Продукты амплификации размером 1700, 1000 и 600 п.н. были общими для обоих видов. Фрагмент длиной 600 п.н. был обнаружен нами как постоянно присутствовавший у кулундинской овцы и снежного барана В спектрах праймера (ОА)9С из 7 ампликонов в интервале 2000-500 п.н. фрагменты длиной 1600 и 1700 п.н. выявлены только у кулундинской породы, а длиной 1400 и 500 п.н. - только у снежного барана

Выполненные сравнения генетических структур пород овец и близкородственного дикого вида — снежного барана — свидетельствуют о том, что полилокусные спектры ІЗБЯ-РСЯ маркеров имеют выраженную видовую и породную специфичность, их полиморфизм зависит от используемого в качестве

праймера фрагмента микросателлитного локуса и позволяет выявлять не только специфические особенности полиморфизма различных геномных участков, но и консервативные по длине фрагменты ДНК, фланкированные инвертированными повторами одних и тех же микросателлитов, в геномах близкородственных видов.

3.2.3. Полилокусные спектры ISSR-PCR маркеров у пород лошадей

Выполнен сравнительный анализ генетических структур по полилокусным спектрам продуктов амплификации ISSR-PCR маркеров пород лошадей, отличающихся по направлению их использования. Местная алтайская порода была представлена животными двух хозяйств, из СПК «Энчи» (48 гол.) и СПК «Чингиз» (48 гол.). Лошади спортивных рысистых пород включали группы животных американских (7 гол.), русских (6 гол.), орловских (4 гол.) рысаков и помесей русских и американских рысаков (31 гол.). Результаты выполненных исследований представлены в табл. 3.

У исследованных лошадей отмечается сходный диапазон длин фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами разных микросателлитных локусов (табл. 3), в отличие от пород крупного рогатого скота и овец (табл. 1, 2). В спектрах ISSR-PCR маркеров у животных алтайской породы были обнаружены ампликоны, присутствующие с более высокой частотой у лошадей одного хозяйства по сравнению с другим: 320 и 380 п.н. в спектрах маркера (AG)9C; 1280, 1180 и 920 п.н. в спектрах маркера (GAG)6C; 980 п.н. в спектрах маркера (СТС)6С, однако значения PIC оказались близкими у лошадей обоих хозяйств.

Таблица 3

Характеристики спектров ISSR-PCR маркеров у пород лошадей _

Праймер Порода Количество ампликонов в спектре Границы длин локусов спектра, п.н. Количество полиморфных ампликонов Доля полиморфных ампликонов в спектре, % PIC

(AG),C алтайская 13 1250-320 10 77 0,325

рысистые 9 1200-320 7 78 0,251

(GA)9C алтайская 9 1000-370 7 78 0,318

рысистые 8 1000-360 7 88 0,352

(GAG)6C алтайская 13 1280-360 12 92 0,366

рысистые И 1400-180 8 73 0,296

(СТС)бС алтайская 13 1500-440 11 85 0,349

рысистые 7 1100-350 3 43 0,156

У лошадей рысистых пород спектры ампликонов, полученные при использовании в качестве праймеров участков тринуклеотидных микросателлитов, в целом, оказались * менее полиморфными по сравнению со спектрами динуклеотидных праймеров (табл. 3). Интересно отметить, что у жеребцов уровень полиморфизма спектров праймера (AG)9C был существенно ниже, чем у кобыл: у первых полиморфными оказались только два локуса (длиной в 320 и 380 п.н.). Между жеребцами и кобылами наблюдались различия в локусах 750 и 620 п.н. спектров праймера (GA)9C: частоты присутствия в спектрах фрагментов ДНК с такой длиной у жеребцов равнялись 0,087 для обоих локусов, в то время как у кобыл они встречались с частотой в 0,592 и 0,512 соответственно.

При сравнении спектров ампликонов лошадей алтайской породы со спектрами представителей трех рысистых пород наибольшее сходство между всеми исследованными группами лошадей выявлено по спектрам праймера (GA)9C. Обнаружено 8 общих локусов (фрагментов ДНК) у разных пород и помесей. Различие наблюдалось лишь по фрагменту ДНК длиной в 740 п.н., представленном в спектрах ампликонов только у лошадей алтайской породы. Наибольшее различие между породами выявлено в спектрах праймера (GAG)6C: у рысистых пород отсутствовали четыре локуса (длиной в 1180, 920, 780, и 430 п.н.), а у лошадей алтайской породы не были найдены ампликоны длиной в 300, 250 и 180 п.н. Количество ампликонов в спектрах, получаемых с использованием праймера (СТС)6С, у лошадей рысистых пород оказалось существенно меньшим по сравнению с алтайской породой: 6 общих локусов, из которых по четырем полиморфизм отсутствовал. По-видимому, наблюдаемые отличия могут быть обусловлены линейным разведением и относительно меньшим генетическим разнообразием используемых жеребцов при разведении рысаков по сравнению с местной алтайской породой.

Значения индекса PIC лошадей алтайской породы, а также американских, русских и орловских рысаков и их помесей представлены в табл. 4. Оказалось, что уровень гетерозиготности по спектрам всех четырех праймеров сходен у обеих групп алтайских лошадей и заметно выше, чем у группы рысистых пород. Интересно отметить сходство по значениям PIC спектров ампликонов спектров разных праймеров у лошадей алтайской породы. По сравнению с этими лошадьми, значение индекса у рысистых пород ниже, особенно в спектрах праймера (СТС)6С.

Таблица 4

Полиморфное информационное содержание (Р1С) спектров продуктов амплификации у _исследованных групп рысаков и лошадей алтайской породы _

Праймеры Рысаки Алтайская порода п=96

Американский п=7 Русский п=6 Орловский п=4 Помеси 11=31 По всем животным п=48

(AG)9C 0,111 0,180 0,248 0,229 0,251 0,325

(GA)9C 0,272 0,239 0,125 0,343 0,352 0,318

(GAG)6C 0,270 0,204 0,203 0,252 0,296 0,366

(СТС)бС 0,120 0,161 0,059 0,156 0,156 0,349

В среднем 0,193 0,196 0,159 0,245 0,264 0,340

В целом, алтайская порода лошадей отличалась от рысаков более высоким уровнем гетерозиготности и, соответственно, меньшей генофондной консолидированностью, что, по-видимому, может быть обусловлено меньшей интенсивностью искусственного отбора по сравнению со спортивными рысистыми породами. Обнаружено, что у лошадей рысистых пород основной вклад в значения Р1С вносят ампликоны ^БЯ-РСЯ спектров (ОА),С и (ОАО)6С (табл. 4). У помесных рысаков уровень Р1С был заметно выше (0,245), чем у родительских пород (0,159-0,196; табл.4). При суммарном расчете Р1С у рысаков значения индекса рассчитывали по спектрам всех праймеров отдельно. Поскольку по полиморфизму некоторых ампликонов группы рысаков отличались друг от друга, суммарные значения Р1С, как правило, были больше, чем по отдельным группам.

По КБЛ-РСЯ маркерам нами рассчитаны генетические дистанции по М. Нею и построены дендрограммы взаимоотношений указанных групп лошадей (рис. 5). Кластеризация групп лошадей, принадлежащих к разным породам и помесям, наглядно свидетельствует о том, что такое полилокусное генотипирование (суммарно по 48 локусам) по ^БЯ-РСЯ маркерам с высокой точностью соответствует истории происхождения групп исследованных животных. По-видимому, даже при таких сложных скрещиваниях и генофондных пересечениях в истории формирования групп исследованных животных (русские рысаки исходно выведены из помесей орловских и американских рысаков), использование совокупности полилокусных спектров 188Я-маркеров позволяет реконструировать генофондные взаимоотношения даже между малочисленными группами животных.

I-1-1-1-1

.3 .225 .15 .075 0.000

I- помеси русских и американских рысаков

'- русские рысаки

- американские рысаки

- орловские рысаки

- алтайская порода, СПК «Чингиз»;

- алтайская порода, СПК «Энчи».

Рис. 5. Дендрограмма генетических взаимоотношений групп лошадей алтайской и рысистых пород, построенная на основании генетических расстояний, рассчитанных по суммарному полилокусному генотипированию КБЯ-РСЯ маркеров.

В этой связи далее мы рассмотрели возможности использования полилокусных КБЯ-РСЯ маркеров для оценки внутрипородных особенностей генетической дифференциации сельскохозяйственных видов животных.

3.2.4. Генетические структуры внутрипородных типов эдильбаевской

породы овец

Таблица 5

Распределение частот встречаемости некоторых ампликонов у внутрипородных типов _ овец эдильбаевской породы_

Длины ампликонов, п.н. Внутрипородный тип

бирликский(п=50) суюндукский (п=50)

+ 1 — + I -

Спектр праймера (Ав^С

780 1 0 0,776 0,224

280 0,250 0,750 0,329 0,671

Спектр праймера (ОА)9С

400 0,134 0,866 0,082 0,918

290 0,315 0,685 0,452 0,548

200 0,681 0,319 1 0

Примечание. Знаком «+» обозначено присутствие ампликона, «—» его отсутствие. Цифрами в ячейках таблицы указаны частоты присутствия/отсутствия ампликонов разной длины (левая колонка) у исследованных внутрипородных типов эдильбаевской породы овец.

С использованием ^БЯ-РСЯ маркеров выполнен сравнительный анализ генетических структур двух внутри породных типов эдильбаевской породы овец -бирликского и суюндукского.

В спектрах ампликонов выявлена генетическая дифференциация между этими типами по частотам встречаемости фрагментов различных длин: 780 п.н. в спектре праймера (АС)9С, и 200 и 290 п.н. в спектре праймера (ОД)9С (табл. 5). Интересно отметить, что ампликон размером в 900 п.н., выявленный у животных обоих внутрипородных типов, ранее обнаруживался только у снежного барана и не наблюдался в генофондах ни у одной из пород овец, описанных нами по ^БЯ-РСЯ маркерам.

Полученные данные свидетельствуют о том, что полилокусное генотипирование по ^Я-РСЯ маркерам позволяет выявить дифференциацию между двумя типами внутри одной породы. Основной вклад в такую дифференциацию могут вносить особенности происхождения животных (эффекты основателей), как это наглядно обнаруживалось при оценках генетической дифференциации пород и помесей рысаков (рис. 5), и может быть обусловлено влиянием разных факторов отбора.

Для того, чтобы оценить возможности использования полилокусного генотипирования ББЯ-РСЯ маркеров для выявления действия факторов экологического стресса, далее выполнено сравнение генетических структур групп животных, воспроизводящихся в условиях зоны «рискованного животноводства» (Южное Гоби с сухим, резко континентальным климатом, большими сезонными и суточными колебаниями температуры воздуха, дефицитом кормовых ресурсов) и природном заповеднике Хубсугул (Монголия, озеро Хубсугул с участками хвойной тайги).

3.3. Генетическая дифференциация животных, воспроизводящихся в разных эколого-географических условиях

Выполнен сравнительный анализ генетических структур групп животных монгольских местных пород 4-х видов, воспроизводящихся в условиях зоны рискованного животноводства Южного Гоби и в условиях биосферного заповедника Хубсугул, с использованием КЗЯ-РСЯ маркеров (табл.6).

Таблица 6

Параметры спектров продуктов амплификации исследованных групп животных, полученных при использовании праймера (АО)<)С

Диапазон длин

локусов, п.н.

Яки

Гоби Хубсугул

Крупный рогатый скот

Гоби Хубсугул

Овцы

Гоби Хубсугул

Козы

Гоби Хубсугул

2500-1200

0 2

0 3

2 4

1200-600

600- 180

2 9

4 10

10 14

2 9

3 10

Р1С

0,039

0,040

0,035

0.067

0,118

0,071

0,018

0,038

Примечание. Верхнее число указывает количество полиморфных фрагментов, нижнее - общее количество фрагментов

В спектрах продуктов амплификации праймера (AG^C у исследованных групп яков, крупного рогатого скота, овец и коз суммарно выявлено 38 локусов (табл. 6). Обращает на себя внимание небольшое количество полиморфных локусов в целом, а также большая доля «легких» ампликонов у всех исследованных видов.

На дендрограмме, построенной по генетическим расстояниям М. Нея, рассчитанным по ISSR-PCR маркерам (рис.6), яки образуют общий кластер с крупным рогатым скотом, другой относительно автономный кластер образуют группы овец и коз. Это соответствует межвидовым эволюционным взаимоотношениям и согласуется с принадлежностью яков и крупного рогатого скота к одному роду Bos (быки), домашней овцы (род Ovis) и домашней козы (род Сарга) — к общему подсемейству Caprinae.

I-1-1-1-1

0,6 0,45 0,3 0,15 0,000

г- козы (Гоби) L козы (Хубсугул)

- овцы (Хубсугул)

--- овцы (Гоби)

г- яки (Гоби) яки (Хубсугул)

- крупный рогатый скот (Гоби)

- крупный рогатый скот (Хубсугул)

Рис. 6. Дендрограмма генетических взаимоотношений между группами животных, воспроизводящихся в зоне рискованного животноводства (Южное Гоби) и биосферном заповеднике Хубсугул.

Для дополнительной оценки внутрипородной дифференциации под влиянием разных эколого-географических условий нами выполнен (Т.Т. Глазко с соавт., 2012) сравнительный анализ этих же групп животных с использованием микроядерного теста (подсчет частот встречаемости эритроцитов с микроядрами в мазках периферической крови). Оказалось, что у всех видов в группах животных в зоне рискованного животноводства (Южное Гоби), этот показатель статистически достоверно (Р<0,05) ниже, чем у животных того же вида, воспроизводящихся в более благоприятных условиях. Результаты микроядерного теста свидетельствуют о том, что исследованные группы животных дифференцируются не только по ISSR-PCR маркерам, но и по частотам цитогенетических аномалий - показателям геномной нестабильности. Можно ожидать, что в условиях зоны рискованного животноводства (Южного Гоби) воспроизводится только часть исходного генофонда, носители которого отличаются относительно повышенной стабильностью генетического аппарата.

3.4. Оценка возможных источников полиморфизма ISSR-PCR маркеров

Выполненные нами исследования свидетельствуют о высоком полиморфизме ISSR-PCR маркеров и зависимости получаемых спектров фрагментов ДНК от нуклеотидной последовательности микросателлита, используемой в качестве праймера. Наиболее наглядно отличия обнаруживались у крупного рогатого скота и овец по спектрам ампликонов праймеров (AG)9C и (GA)9C (табл. 1, 2). В целях выяснения возможных источников наблюдаемых отличий нами выполнен поиск гомологии к прямым и инвертированным повторам каждого праймера на основе секвенированных последовательностей геномов крупного рогатого скота, овец, представленных в GenBank, с использованием компьютерной программы BLASTn (100% совпадений). Для (AG), выявлено 22 участка гомологии, в основном в группе генов II класса комплекса гистосовместимости, для пары (GA)9-(TC)9 участков гомологии не обнаружено. Большинство совпадений для праймера (AG)9C локализовалось в генах иммунной системы. По литературным данным известно, что GA микросателлиты являются мишенью связывания белков фолдинга хроматина (GAF, CTCF), что может приводить в итоге к относительно повышенному консерватизму таких последовательностей. То есть, отличия в спектрах ISSR-PCR маркеров могут быть обусловлены особенностями геномной локализации микросателлитов, используемых в качестве праймеров.

В целях выяснения нуклеотидньгх последовательностей, фланкированных инвертированным повтором (AG)9C, нами выполнено выделение, клонирование и секвенирование фрагментов ДНК, содержавшихся в отдельном сегменте агарозного геля, в котором выполнялось электрофоретическое разделение ампликонов спектра (AG)9C генома домашней лошади. Среди секвенированных фрагментов ДНК, выделенных из этого сегмента, присутствовал участок, длиной в 416 нуклеотидов. Далее были подобраны лидирующий и терминирующий праймеры, включавшие фланговую последовательность (AG)9C, 6 и 8 нуклеотидов из прилегающих к инвертированным флангам секвенированного фрагмента лошади соответственно. В полимеразной цепной реакции с использованием этих праймеров обнаруживался только один продукт амплификации и только у жеребцов (рис.7), что позволило нам прийти к заключению о его локализации в хромосоме Y.

« 2 3 4 5 Ь '7 8 9 Ю 11 12 ІЗ 14

■■ - м - - "Л-;

.-г.-- >■:.. ' ' " ass ■

, - . ■ ','■' : V :

Ш " ' ' Ч ' 1 '

. ' ' ■ Г

Рис. 7. Продукты амплификации, полученные в ПЦР у лошадей. М - маркер молекулярных масс; 1, 5, 6, 7, 8, 13, 14 - жеребцы; 2, 3, 4,9, 10, 11, 12-кобылы.

Поскольку в ОепВапк содержится информация о первичной последовательности ДНК только кобылы, в нем не удалось найти гомологичных участков к секвенированному нами фрагменту длиной в 416 п.н. Однако этот

фрагмент содержит последовательность длиной около 250 нуклеотидов, которая (в отличие от целого фрагмента) в геноме домашней лошади встречается с высокой частотой, причем в каждой хромосоме количество участков гомологии к ней статистически достоверно коррелирует (г=0,93; Р<0,001) с ее длиной.

Высокая частота встречаемости в хромосомах домашней лошади позволяет полагать локализацию фрагмента длиной в 250 п.н. в составе диспергированного повтора. Для его выявления в секвенированном фрагменте ДНК длиной в 416 п.н. с помощью программ Censor и RepeatMasker выполнен поиск повторов. В результате обнаружены три участка с высокой гомологией к фрагментам различных мобильных генетических элементов: один к фрагменту ДНК транспозона Danio rerio (Bao, Jurka, 2008), второй к консенсусу длинного терминального повтора ретровирус-подобного элемента млекопитающих, ERV3 (MLT1G2, Smit, 1993). Третий фрагмент со степенью дивергенции в 4-11% совпадал с лидирующим участком эндогенного ретровируса ERV1 лошади (Jurka, 2008).

Полученные данные свидетельствуют о том, что один из механизмов возникновения видоспецифичных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, может быть связан с геномным расселением мобильных генетических элементов. Разнообразие по геномной локализации микросателлитных локусов, их возможные ассоциации с мобильными генетическими элементами могут быть источниками отличий в полиморфизмах спектров продуктов амплификации ISSR-PCR маркеров, получаемых с использованием в качестве праймеров микросателлитов с разными коровыми мотивами и «якорями».

3.5. Заключение

Выполнено геномное сканирование пород и внутри породных групп сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, овцы, лошади) с использованием ISSR-PCR (в среднем около 40 локусов на группу животных). Выявлена видовая и породная специфичность присутствия, а также консервативности и полиморфизма отдельных участков ДНК определенной длины, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов. Дендрограммы, построенные по генетическим расстояниям М. Нея, рассчитанным суммарно по всем выявленным ISSR-PCR маркерам, соответствовали генетической дифференциации между исследованными группами животных, поскольку совпадали с известной историей расхождения видов, формирования пород, помесей. При сравнительном анализе спектров ISSR-PCR маркеров обнаружены отличия в сложности спектров (количестве продуктов амплификации) и их полиморфизме. Такие отличия в спектрах, в частности, праймеров (AG)9C и (GA)9C у крупного рогатого скота и овец, могут быть обусловлены особенностями геномной локализации микросателлитов: присутствием AG повторов в высокополиморфных генах иммунной системы, GA последовательностей - в консенсусах ДНК-связывающих белков. Выраженных отличий между спектрами праймеров, основанных на динукпеотидных микросателлитных мотивах, и основанных на тринуклеотидных мотивах не выявлено. Результаты секвенирования свидетельствуют о том, что одним из механизмов формирования полиморфных ISSR-PCR маркеров могут быть процессы рекомбинаций между мобильными генетическими элементами и ассоциированными с ними микросателлитами.

4. выводы

1. Сравнительный анализ геномной ДНК ряда пород крупного рогатого скота, овец и лошадей по полилокусным спектрам ИБЯ-РСЯ маркеров с использованием в качестве праймеров фрагментов микросателлитных локусов (АО)9С, (ОА)9С, (ОАО)6С, (СТС)6С свидетельствует о видо- и породоспецифичных особенностях сочетаний фрагментов ДНК разной длины, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов.

2. Доли полиморфных локусов, индекс полиморфного информационного содержания (Р1С) спектров КВЯ-РСЯ маркеров зависят от нуклеотидной последовательности микросателлита, используемого в качестве праймера, а не от длины его элементарного повтора. Так, у исследованных групп животных отличия в показателях полиморфизма спектров ампликонов праймеров (ОА)9С, и (АО)9С, (СТС)бС и (ОАО)бС были не меньше, чем в общем между спектрами ди- и тринуклеотидных праймеров.

3. Доля полиморфных локусов и значения Р1С по спектрам всех праймеров были близкими у всех исследованных животных: у пород крупного рогатого скота от 0 до 97% и от 0 до 0,300 соответственно; у пород овец от 69% до 100% и от 0,071 до 0,399 соответственно; у пород лошадей от 43% до 92% и от 0,059 до 0,366 соответственно. В то же время, наблюдались видовые отличия вклада в полиморфизм спектров ^БЯ-РСЯ, полученных с разными праймерами. Так, у крупного рогатого скота и овец одним из наиболее полиморфных спектров был спектр праймера (СТС)6С, наименее - праймера (ОА)9С; у лошадей наиболее полиморфными были спектры праймера (ОАО)6С.

4. Выявлены ампликоны и их сочетания, присутствие которых типично для одной исследованной группы животных, представляющих определенную породу (крупного рогатого скота, овец, лошадей), и отличает их генофонды от животных других пород (например, фрагмент ДНК длиной в 370 п.н. у красной эстонской породы, фрагмент длиной в 410 п.н. у черно-пестрой в спектрах ампликонов праймера (АО)9С). Обнаруженное нами соответствие взаимоотношений между генофондами пород, оцененное на основании дендрогамм, известной истории происхождения пород, позволяет проводить поиск молекулярно-генетических маркеров «генофондного стандарта» исследованных пород с использованием полученных нами данных.

5. Сравнительный анализ КЗЯ-РСЯ маркеров у овец свидетельствует о возможности их использования для выявления генофондной дифференциации не только пород, но и внутрипородных типов, таких как бирликский и суюндукский внугрипородные типы эдильбаевской овцы.

6. Кластеризация групп трех пород рысаков и двух групп лошадей алтайской породы на дендрограммах полностью совпала с историей их формирования, что свидетельствует об эффективности использования полученных нами полилокусных спектров КБИ-РСЯ маркеров для реконструкции происхождения в различных по численности группах животных.

7. Результаты поиска последовательностей, гомологичных к праймерам (ОА)9С, и (АО)9С, в секвенированных последовательностях геномов крупного рогатого скота и овец свидетельствуют о том, что различия в полиморфизме в спектрах ампликонов этих праймеров частично обусловлены их локализацией в определенных геномных районах: праймера (АО)9С в интронах генов II класса

главного комплекса гистосовместимости, a (GA)9C — в участках связывания белков, ответственных за упаковку хроматина (GAF, CTCF).

8. Секвенирование фрагментов ДНК из спектра продуктов амплификации лошади с использованием праймера (AG)9C позволило обнаружить ДНК фрагмент длиной в 416 п.н., участок которого длиной около 250 п.н. в большом количестве включений присутствует во всех секвенированных последовательностях хромосом лошади. Число локализаций гомологичных фрагментов коррелировало с длиной хромосом лошади (г=0,93, Р<0,001). Этот фрагмент имел высокую степень гомологии с лидирующим участком эндогенного ретровируса ERV1 лошади. Подбор праймеров по флангам секвенированного продукта длиной в 416 п.н. с последующей его амплификацией указывает на его локализацию в хромосоме Y исследованных лошадей. Полученные данные свидетельствуют о том, что одним из механизмов формирования полиморфных ISSR-PCR маркеров являются рекомбинации между мобильными генетическими элементами.

Предложения производству

Научным учрёждениям при использовании ISSR-PCR в целях геномного сканирования рекомендуется проводить предварительное изучение параметров получаемых спектров продуктов амплификации геномной ДНК. При анализе генофондов крупного рогатого скота и овец рекомендуется использовать в качестве праймеров последовательности (СТС)6С и (AG)9C; генетической структуры лошадей — последовательность (GAG)6C.

Научным учреждениям, принимающим участие в племенной работе, предлагается использовать метод ISSR-PCR наравне с другими методами полилокусного генотипирования ввиду представленных в данной работе возможностей адекватно оценивать генетическую дифференциацию даже небольших групп животных, связанную как с особенностями их происхождения, так и влиянием факторов окружающей среды.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

1. Глазко, В.И. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого украинского скота / В.И. Глазко, Ю.А. Столповский, A.B. Феофнлов, Н.В. Кол // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2009. - №1. -С.155-162.

2. Феофилов, A.B. Структурно-функциональная организация и полиморфизм AG, GA повторов (ISSR-PCR) в геноме крупного рогатого скота / A.B. Феофилов, В.И. Глазко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2010. - №4. - С. 104-108.

3. Ельсукова, И.А. Генетическая дифференциация суюндукского и бирликского внутрипородных типов эдильбаевской породы овец / И.А. Ельсукова, A.B. Феофнлов, Ю.А. Юлдашбаев, В.И. Глазко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2010. - № 6. - С. 84-89.

4. Глазко, В.И. Структурно-функциональные особенности микросателлитов в геномах крупного рогатого скота и овец / В.И. Глазко, А.В. Феофилов, Ю.А. Столповский, Т.Т. Глазко // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 1. - С. 41-44.

5. Феофилов, А.В. Дифференциация генофондов пород лошадей мясного и спортивного направлений / А.В. Феофилов, Н.В. Бардуков, В.И. Глазко // Генетика. - 2011. - Т. 47. -№ 9. - С. 1230-1235.

6. Глазко, В.И. Видоспецифичные ISSR-PCR маркеры и пути их формирования / В.И. Глазко, А.В. Феофилов, Н.В. Бардуков, Т.Т. Глазко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2012. -№ 1. - С. 118125.

7. Глазко, Т.Т. Внутрипородная генетическая дифференциация местных пород монгольского крупного и мелкого рогатого скота в разных эколого-географических условиях разведения / Т.Т. Глазко, Е.Е. Астафьева, А.В. Феофилов и др. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2012. - № 2. -С. 36-39.

8. Glazko, V.I. Polymorphism of ISSR and IRAP Markers in Genomes of Musk-Oxen (Ovibos Moschatus) and Horse (Equus Caballus) of Altaic Breed / V.I. Glazko, N.V. Bardukov, A.V. Pheophilov et al. // Izvestiya of Timityazev Academy. -2012.-Special Issue-P. 16-26.

9. Глазко, В.И. Информационная оценка полиморфизма по ISSR и IRAP-маркерам у различных видов животных, находящихся под действием искусственного и естественного отбора / В.И. Глазко, Т.П. Сипко, А.В. Феофилов и др. // Информационные и телекоммуникационные технологии. - 2012. - №16. - С. 100108.

Статьи в других изданиях.

10. Феофилов, А.В. Полиморфизм "анонимных" фрагментов ДНК и позиционирование инвертированных повторов в секвенированных последовательностях генома овцы / А.В. Феофилов // материалы докл. XVI Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев.]. - М.: МАКС Пресс, 2009. -[Адрес ресурса в сети интернет: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2009/]. - Секция «Биоинженерия и биоинформатика». Подсекция «биоинформатика». - С. 27.

И. Pheophilov, A.V. Polymorphism of ISSR-PCR markers and positioning of reverse repeats of microsatellites in sequences of Bovidae family / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2009. - Moscow. - P. 292-293.

12. Феофилов, А.В. Полиморфизм ISSR-PCR-маркеров и позиционирование инвертированных повторов в геномах овец и крупного рогатого скота / А.В. Феофилов, В.И. Глазко // Стратегия развития зоотехнической науки: тез. докл. междунар. науч.-практической конф., посвящ. 60-летию зоотехнической науки Беларуси (22-23 октября 2009 г.). - Науч.-практический центр Нац. Акад. Наук Беларуси по животноводству, 2009. Жодино. - С. 160-161.

13. Феофилов, А.В. Закономерности полиморфизма ISSR-PCR маркеров в геномах крупного рогатого скота и овец / А.В. Феофилов // Материалы Междунар. молодежного науч. форума «ЛОМОНОСОВ-2010». / Отв. ред. И.А. Алешковский,

П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2010. [Адрес ресурса в сети интернет: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2010/]. - Секция «Биоинженерия и биоинформагика». Подсекция «Биоинформатика».

14. Pheophilov, A.V. Polymorphism of Invert Microsatellite Repeats (ISSR-PCR) and Their Relation with the Mechanisms of Gene Transcription Regulation / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // Proceedings of the Seventh International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure \ Systems Biology, 2010. -Novosibirsk.-P. 225.

15. Pheophilov, A.V. Inverted repeats and their role in nuclear mechanisms / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // Book of Abstract of the XXIV,h Genetic Days 2010. -Mendel University in Brno. - 2010. - P. 8.

16. Бардуков, H.B. Подбор ДНК маркеров для оценки генетической структуры группы лошадей рысистых пород / Н.В. Бардуков, Г.К. Коновалова, А.В. Феофилов, В.И. Глазко // Териофауна России и сопредельных территорий. Международное совещание (IX Съезд Териологического общества при РАН, Москва, 1-4 февраля 2011 г.). - М.: Товарищество научных изданий КМК. - 2011. - С. 41

17. Феофилов, А.В. Генетическая структура эдильбаевской овцы и снежного барана по ISSR-PCR маркерам / А.В. Феофилов, И.А. Ельсукова, Ю.А. Юлдашбаев и др. // Териофауна России и сопредельных территорий. Международное совещание (IX Съезд Териологического общества при РАН, Москва, 1-4 февраля 2011 г.). - М.: Товарищество научных изданий КМК. - 2011.-С. 499.

18. Феофилов, А.В. Использование ISSR-PCR маркеров для выяснения особенностей генофондов некоторых сельскохозяйственных и диких видов животных / А.В. Феофилов // Материалы VI Московского междунар. конгресса, ч. 1 (Москва, 21-25 марта, 2011 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ имени Д.И. Менделеева. -2011.-С. 431-432.

19. Феофилов, А.В. Генотипирование пород крупного рогатого скота и овец с помощью ISSR-PCR / А.В. Феофилов // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» Секция «Биология» / Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, М.В. Чистякова. [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс. - 2011. - С. 99.

20. Pheophilov, A.V. Inverted Repeats in Surveyed and Sequenced Cattle and Sheep / A.V. Pheophilov // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2011. - Moscow. - P. 283-284.

21. Pheophilov, A.V. Recombination of Mobile Genetic Elements as Possible Source of New ISSR-PCR Markers / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // The Eighth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure \ Systems Biology: Abstracts, 2012. -Novosibirsk. - P. 240.

Отпечатано с готового оригипал-макета

Формат 60х84'/|6 Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 382.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-26-90, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Феофилов, Антон Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Биоразнообразие сельскохозяйственных видов животных.

1.1.1. Биоразнообразие в глобальном масштабе.

1.1.2. Проблема сохранения генетического разнообразия пород.

1.1.3. Генетически обоснованные программы сохранения генофондов исчезающих пород.

1.2. Поколения молекулярно-генетических маркеров в исследованиях генофондов пород.

1.2.1. Полиморфизм отдельных локусов.

1.2.2. Микросателлиты, их представленность в геномах и возможные функции.

1.2.3. Полилокусные маркеры ДНК.

1.2.4. Геномное сканирование.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадей"

Актуальность темы. Успешность решения задач общей и частной по-пуляционной генетики многих видов, в том числе и сельскохозяйственных зависит от изученности особенностей полиморфизма различных элементов геномов (Харченко, Глазко 2006; Эрнст, 2008; Зиновьева, 2008; Калашникова, 2010). В последнее время микросателлитные последовательности ДНК широко используются для генотипирования особей, исследования генофондов растений и животных, описания их изменений под влиянием факторов естественного и искусственного отборов, установления происхождения, поисков связей с фенотипическими признаками, картирования главных генов количественных признаков (Зиновьева, Гладырь, 2009, 2011; Храброва, 2008; Багиров с соавт. 2009). Работы с использованием микросателлитных последовательностей ДНК внесли определенный вклад в развитие новых направлений и нового взгляда на организацию генома как целого (Зайцев, Храброва, 2011). Геномика в нано-масштабе, или геномное сканирование - метод одновременного генотипирования внутри одного генома от десятков или пары сотен маркеров до истинного геномного сканирования путем полного секвени-рования геномов (Nosil et al., 2009). К настоящему времени геномы ряда сельскохозяйственных видов полностью секвепированы, широко используются оценки полиморфизмов по сотням тысячам мононуклеотидных замен (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) в целях картирования главных генов количественных признаков, полиморфизм которых можно использовать для прогноза желательного проявления хозяйственно ценных признаков («геномная селекция», Weller, Ron, 2011). В то же время, оказалось, что эффективность прямого включения результатов генотипирования нескольких десятков тысяч SNP в селекционные программы (genomic breeding values - GEBV) не очень высока и варьирует в зависимости от породной принадлежности (Flori et al. 2009) и эколого-географических условий разведения животных (Hammami et al. 2009). Поскольку у крупного рогатого скота были выявлены множественные сегментные дупликации (Gibbs et al. 2009), которые, предположительно, связаны с эффектами искусственного отбора, выполняются геномные сканирования по полиморфизму изменчивости числа копий нуклео-тидных последовательностей длиной от 100 до 1000 пар нуклеотидов (п.н.) в геномах крупного рогатого скота (Seroussi et al. 2010).

Альтернативным направлением геномного сканирования может быть использование оценок полиморфизма длин фрагментов ДНК, фланкированных короткими инвертированными повторами, поскольку, как правило, изменчивость по копийности нуклеотидных последовательностей ассоциирована с их наличием (Fleischmann et al. 1995; Kim et al. 2010). Применение мик-росателлитных последовательностей в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для геномного сканирования получило название ISSR-PCR (Inter-Simple Sequence Repeat - Polymerase Chain Reaction). Co времен появления метода (Zietkiewicz et al. 1994) эти маркеры нашли широкое применение в популяционно-генетических исследованиях различных объектов, от растений и животных, различных инфекционных агентов до оценок нестабильности генетического аппарата при онкологических патологиях (Глазко 2009; Зиновьева с соавт. 2011). В то же время, геномное распределение микросателлитов и их инвертированных повторов существенно отличается у разных таксонов (Santana et al. 2009; Zhang De-Xing, Hewitt, 2003), возможные причины таких отличий до сих пор остаются недостаточно исследованными. Накоплено много данных, свидетельствующих о том, что сложность спектров продуктов амплификации TSSR-PCR маркеров, их полиморфизм, может зависеть от особенностей корового мотива микросателлита, используемого в качестве праймера, в частности, от его термодинамических характеристик (Wiesner, Wiesnerova, 2004). Это приводит к тому, что перед использованием ISSR-PCR для геномного сканирования необходимо предварительно исследовать полиморфизм спектров продуктов амплификации фрагментов ДНК, фланкированных участками инвертированных повторов микросателлитов, в зависимости от корового мотива микросателлита, видовой и породной принадлежности животных, эколого-географических условий их воспроизводства. В этих целях в настоящем исследовании выполнен сравнительный анализ полиморфизма 18811-РСК маркеров, полученных с использованием в качестве праймеров участков различных микросателлитов, у ряда видов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась разработка и оптимизация методов использования ^БК-РСЯ маркеров для выявления и контроля генетического разнообразия генофондов некоторых видов и пород сельскохозяйственных животных.

Для этого были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести сравнительный анализ спектров продуктов амплификации, получаемых с использованием в качестве праймеров участков различных микросателлитов, у крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также некоторых представителей диких видов семейства ВоУ1с1ае;

2. Оценить информативность спектров фрагментов ДНК, получаемых при использовании различных праймеров для геномного сканирования доме-стицированных видов Воу'1с1ае, а также домашней лошади;

3. Дать характеристику исследованных групп животных по доле полиморфных локусов, полиморфному информационному содержанию спектров продуктов амплификации 18811-РС11 маркеров в зависимости от нуклеотид-ной последовательности микросателлитов, используемых в качестве праймеров;

4. Выявить получаемые в результате ^БЯ-РСЯ генетические локусы, участвующие в межвидовой и внутривидовой (межпородной) генетической дифференциации;

5. Оценить возможные источники отличий в распределении 188Я-РСЯ маркеров путем анализа особенностей их локализации в секвенированных последовательностях геномной ДНК с использованием международной базы данных ОепВапк;

Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые выполнен сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК, получаемых методом ^БЛ-РСЛ анализа, для представителей доместицированных и диких видов копытных. Рассмотрены особенности генетической дифференциации крупного рогатого скота, овец, лошадей по полиморфизму «анонимных» фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами участков микроса-теллитных локусов. Впервые у исследованных групп животных изучены особенности спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от нуклео-тидной последовательности флангов. Получены данные о видовой и породной специфичности, консервативности и изменчивости отдельных фрагментов ДНК, присутствующих в 188К-РСЯ спектрах, о возможной связи наблюдаемого полиморфизма со спецификой локализации микросателлитов в различных частях генома. Путем секвенирования показано, что источником появления отдельных фрагментов ДНК в 188Я-РСЯ спектрах может быть рекомбинация между участками эндогенных ретровирусов. Один из таких фрагментов у лошадей оказался ассоциированным с присутствием хромосомы У.

Практическая значимость работы заключается в том, что в результате выполненных исследований подобраны наиболее информативные полило-кусные сочетания 188К-РСЯ маркеров, позволяющие проследить родственные отношения между группами животных, разработать видовые, внутривидовые, породные и внутрипородные «генофондные стандарты» - совокупности ДНК фрагментов разной длины в ^ЗЯ-РСЯ спектрах, присутствие/отсутствие которых отличает одну группу животных от другой. Полученные результаты дают возможность предложить генетически обоснованные программы сохранения биоразнообразия редких и исчезающих видов и пород, контролировать динамику генофондов сельскохозяйственных животных в условиях искусственного и естественного отборов. Обнаруженный фрагмент ДНК в геноме лошади, ассоциированный с присутствием хромосомы У, может быть использован для пренатальной диагностики пола эмбриона методом ПЦР-анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты геномного сканирования при генотипировании нескольких десятков фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (18811-РС11 маркеры) отражают популяционно-генетические взаимоотношения между группами животных на межвидовом, внутривидовом (породном) и внутрипородном уровнях.

3. Полиморфизм ^БЯ-РСЯ маркеров может быть тесно связан с перемещениями и рекомбинацией мобильных генетических элементов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и представлены: на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва; на Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (МССМВ'09); на Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию зоотехнической науки Беларуси, Жодино, 2009; на Национальной научной конференции по генетике, Болгария, 2009; на Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010», Москва; на 7-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома и системной биологии (Вет^'Ю), Новосибирск; на Международной научной конференции «24-е генетические дни», Брно, 2010; на IX Съезде Териологического общества при РАН, Москва, 2011; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология», 2011; на Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2011», Москва; на Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (МССМВ'11); на конкурсе молодых ученых на лучший инновационный проект по вопросам биотехнологии (ВИЖ, 2012); на 8-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома и системной биологии (В0118'12), Новосибирск.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Феофилов, Антон Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ геномной ДНК ряда пород крупного рогатого скота, овец и лошадей по полилокусным спектрам ISSR-PCR маркеров с использованием в качестве праймеров фрагментов микросателлитных локу-сов (AG)ç>C, (GA)9C, (GAG)ôC, (СТС)6С свидетельствует о видо- и поро-доспецифичных особенностях сочетаний фрагментов ДНК разной длины, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов.

2. Доли полиморфных локусов, индекс полиморфного информационного содержания (PIC) спектров ISSR-PCR маркеров зависят от нуклеотидной последовательности м икр о сателлита, используемого в качестве праймера, а не от длины его элементарного повтора. Так, у исследованных групп животных отличия в показателях полиморфизма спектров ампликонов праймеров (GA)qC, и (AG)9C, (СТС)бС и (GAG)gC были не меньше, чем в общем между спектрами ди- и тринуклеотидных праймеров.

3. Доля полиморфных локусов и значения PIC по спектрам всех праймеров были близкими у всех исследованных животных: у пород крупного рогатого скота от 0 до 97% и от 0 до 0,300 соответственно; у пород овец от 69% до 100% и от 0,071 до 0,399 соответственно; у пород лошадей от 43% до 92% и от 0,059 до 0,366 соответственно. В то же время, наблюдались видовые отличия вклада в полиморфизм спектров ISSR-PCR, полученных с разными праймерами. Так, у крупного рогатого скота и овец одним из наиболее полиморфных спектров был спектр праймера (СТС)бС, наименее - праймера (GA)9C; у лошадей наиболее полиморфными были спектры праймера (GAG)6C.

4. Выявлены ампликоны и их сочетания, присутствие которых типично для одной исследованной группы животных, представляющих определенную породу (крупного рогатого скота, овец, лошадей), и отличает их генофонды от животных других пород (например, фрагмент ДНК длиной в 370 п.н. у красной эстонской породы, фрагмент длиной в 410 п.н. у чернопестрой в спектрах ампликонов праймера (AG)9C). Обнаруженное нами соответствие взаимоотношений между генофондами пород, оцененное на основании дендрогамм, известной истории происхождения пород, позволяет проводить поиск молекулярно-генетических маркеров «генофондно-го стандарта» исследованных пород с использованием полученных нами данных.

5. Сравнительный анализ ISSR-PCR маркеров у овец свидетельствует о возможности их использования для выявления генофондной дифференциации не только пород, но и внутрипородных типов, таких как бирликский и суюндукский внутрипородные типы эдильбаевской овцы.

6. Кластеризация групп трех пород рысаков и двух групп лошадей алтайской породы на дендрограммах полностью совпала с историей их формирования, что свидетельствует об эффективности использования полученных нами полилокусных спектров ISSR-PCR маркеров для реконструкции происхождения в различных по численности группах животных.

7. Результаты поиска последовательностей, гомологичных к праймерам (GA)9C, и (AG)9C, в секвенированных последовательностях геномов крупного рогатого скота и овец свидетельствуют о том, что различия в полиморфизме в спектрах ампликонов этих праймеров частично обусловлены их локализацией в определенных геномных районах: праймера (AG)9C в интронах генов II класса главного комплекса гистосовместимости, а (GA)9C - в участках связывания белков, ответственных за упаковку хроматина (GAF, CTCF).

8. Секвенирование фрагментов ДНК из спектра продуктов амплификации лошади с использованием праймера (AG)9C позволило обнаружить ДНК фрагмент длиной в 416 п.н., участок которого длиной около 250 п.н. в большом количестве включений присутствует во всех секвенированных последовательностях хромосом лошади. Число локализаций гомологичных фрагментов коррелировало с длиной хромосом лошади (г=0,93, Р<0,001). Этот фрагмент имел высокую степень гомологии с лидирующим участком эндогенного ретровируса ЕЯУ1 лошади. Подбор праймеров по флангам секвенированного продукта длиной в 416 п.н. с последующей его амплификацией указывает на его локализацию в хромосоме У исследованных лошадей. Полученные данные свидетельствуют о том, что одним из механизмов формирования полиморфных 188Я-РСЯ маркеров являются рекомбинации между мобильными генетическими элементами.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Научным учреждениям при использовании 188Я-РСЯ в целях геномного сканирования рекомендуется проводить предварительное изучение параметров получаемых спектров продуктов амплификации геномной ДНК. При анализе генофондов крупного рогатого скота и овец рекомендуется использовать в качестве праймеров последовательности (СТС)6С и (АО^С; генетической структуры лошадей - последовательность (САС)6С.

Научным учреждениям, принимающим участие в племенной работе, предлагается использовать метод 188Я-РСЯ наравне с другими методами полилокусного генотипирования ввиду представленных в данной работе возможностей адекватно оценивать генетическую дифференциацию даже небольших групп животных, связанную как с особенностями их происхождения, так и влиянием факторов окружающей среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполнено геномное сканирование пород и внутрипородных групп сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, овцы, лошади) с использованием 18811-РС11 (в среднем около 40 локусов на группу животных). Выявлена видовая и породная специфичность присутствия, а также консервативности и полиморфизма отдельных участков ДНК определенной длины, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов. Дендрограммы, построенные по генетическим расстояниям М. Нея, рассчитанным суммарно по всем выявленным ^БЯ-РСЫ маркерам, соответствовали генетической дифференциации между исследованными группами животных, поскольку совпадали с известной историей расхождения видов, формирования пород, помесей.

При сравнительном анализе спектров 188Я-РСЯ маркеров обнаружены отличия в сложности спектров (количестве продуктов амплификации) и их полиморфизме. Такие отличия в спектрах, в частности, праймеров (Ав^С и (ОА)9С у крупного рогатого скота и овец, могут быть обусловлены особенностями геномной локализации микросателлитов: присутствием АО повторов в высокополиморфных генах иммунной системы, ОА последовательностей - в консенсусах ДНК-связывающих белков. Выраженных отличий между спектрами праймеров, основанных на динуклеотидных микросателлитных мотивах, и основанных на тринуклеотидных мотивах не выявлено. Результаты се-квенирования свидетельствуют о том, что одним из механизмов формирования полиморфных ^ЗЯ-РСЯ маркеров могут быть процессы рекомбинаций между мобильными генетическими элементами и ассоциированными с ними микросателлитами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Феофилов, Антон Владимирович, Москва

1. Азаров, С. Г. Овцеводство Таджикистана: Монография. М.: Сель-хозгиз. 1930. 129 с.

2. Багиров В.А., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К., Кленовицкий П.М., и др. Сохранение и рациональное использование генетических ресурсов яка (Bos mutus) // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология растений. Серия: Биология животных. 2009. № 2. С. 37-42.

3. Багиров В.А., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М. и др. Сохранение и рациональное использование генофонда животных // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2009. № 2. С. 37-40.

4. Бакай Ф.Р., Семенов A.C. Анеуплоидия у голштинизированного крупного рогатого скота в связи с показателями воспроизводительной способности//Естественные науки. 2009. №2. С. 189-193.

5. Бородина Т. Основные методы детекции аллельных вариантов SNPs. Электронный ресурс. URL: http://molbiol.edu.ru/review/0403.html.

6. Бузыкина А., Стародумов М. О русской породе замолвите слово // «Золотой мустанг». 2003. № 4. С. 56-60.

7. Быкова A.C., Зиновьева H.A., Гладырь Е.А. Экспресс-диагностика аллелей BOLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью крупного рогатого скота к лейкозу // Проблемы биологии продуктивных животных. 2011. № 1. С. 12-15.

8. Васин Б.Н. Генетика овец. В 4 кн. М., 1928-1932.

9. Гладырь Е.А., Горелов П.В., Маурчева В.Н. и др. Оценка результативности тест-системы на основе микросателлитов в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота // Достижения науки и техники АПК. 2011. №8. С. 51-54.

10. Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Эрнст JI.K. и др. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных // Зоотехния. 2009. № 8. С. 26-27.

11. Глазко В.И., Созинов И.А. 1993. Генетика изоферментов животных и растений. Киев: "Урожай". 526 с.

12. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Феофилов A.B., Кол Н.В. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди-и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого украинского скота // Известия ТСХА. 2009. № 1. С. 155-162.

13. Глазко В.И., Шульга. Е.В., Дымань Т.Н., Глазко Г.В. ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих. Белая Церковь. 2001. 488 е.;

14. Грикшас С.А., Черекаева Е.А., Калашникова JI.A. и др. Использование современных методов ДНК-диагностики для определения стрессчувстви-тельности свиней // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2006. № 4. С. 76-84.

15. Гузеев Ю.В., Гладырь Е.А., Зиновьева H.A. и др. Генетический мониторинг популяции серого украинского скота с использованием ДНК-маркеров // Проблемы биологии продуктивных животных. 2011. № 1. С. 1719.

16. Денискова Т.Е., Гладырь Е.А., Зиновьева H.A., Сизарева Е.И. Моделирование системы мультиплексного анализа ISSR-маркеров свиней // Достижения науки и техники АПК. 2011. № 10. С. 55-56.

17. Дымань Т.Н., Городиая A.B., Тарасюк С.И. и др. Участие маркеров структурных генов и анонимных последовательностей ДНК в генетической дифференциации у видов рода Ovis aries hivicola borealis // Цитология и генетика, 2000. № 6. С. 49-59.

18. Ермеков М. А. Курдючные овцы Казахстана: Монография / М. А. Ермеков, А. В. Голодное. Алма-Ата: Кайнар, 1976. 285 с.

19. Ерохин А.И. Овцеводство: Монография / А. И. Ерохин, С. А. Ерохин. М.: Изд-во МГУП, 2004. 453 с.

20. Ерохин А.И., Карасев Е.А., Ерохин С.А. Романовская порода овец: состояние, совершенствование, использование генофонда. М.: Росинформагро-тех, 2005.

21. Дмитриев Н.Г. Каталог пород крупного рогатого скота по странам мира//Ленинград: ВИРГЖ. 1973. 70 с.

22. Дмитриев Н.Г. Породы скота по странам мира // Ленинград: Колос 1978.350 с.

23. Зиновьева H.A. Молекулярно-генетические методы и их использование в свиноводстве // Достижения науки и техники АПК. 2008. № 10. С. 3436.

24. Зиновьева H.A., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов // Достижения науки и техники АПК. 2011. № 9. С. 19-20.

25. Зиновьева H.A., Костюнина О.В., Гладырь Е.А. и др. Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных // Зоотехния. 2010. № 1. С. 8-10.

26. Зиновьева H.A., Стрекозов Н.И., Молофеева Л.А. Оценка роли ДНК-микросателлитов в генетической характеристике популяции черно-пестрого скота // Зоотехния. 2009. № 1. С. 2-4.

27. Калашников В.В., Пустовой В.Ф. Практическое коневодство. М.: Колос, 2000. 376 с.

28. Калашников В.В., Храброва Л.А., Зайцев A.M. и др. Изучение полиморфизма сателлитной ДНК лошадей заводских и местных пород // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2010. № 6. С. 48-50.

29. Калашникова Jl.А. Геномная оценка молочного скота // Молочное и мясное скотоводство. 2010. № 1. С. 10-12.

30. Калашникова JI.A., Хабибрахманова Я.А., Тинаев А.Ш. Влияние полиморфизма генов молочных белков и гормонов на молочную продуктивность коров черно-пестрой породы // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2009. № 3. С. 49-52.

31. Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т. 34. № 4. С. 279-296.

32. Калинкина Г.В., Крешихина В.В. Реализация генетического потенциала в орловской рысистой породе // Коневодство и конный спорт. 2010. № 3. С. 12-15.

33. Калинкина Г.В., Орлова Ю.А. Совет по племенной работе с орловской рысистой породой // Коневодство и конный спорт. 2008. № 1. С. 5-7.

34. Камбегов Б.Д., Балакшин O.A., Хотов В.Х. Лошади России: полная энциклопедия. М.: Издательство «РИЦ МДК». 2002. 240 с.

35. Канапин К. Курдючные грубошерстные овцы Казахстана: Монография. Алматы: Кайнар, 2000. 196 с.

36. Козловский Б. В Горном Алтае // Коневодство и конный спорт. 1984. №6. С. 32.

37. Корочкин Л.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И. и др. Генетика изофермен-тов. 1977. М., Наука, 275 с.

38. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984. М. Мир, 479 с.

39. Моисейкина Л.И., Трофименко С.П., Кленовицкий П.М. Связь групп крови с продуктивностью у овец // Зоотехния. 2009. № 5. С. 23-24.

40. Насибов Ш.Н., Багиров В.А., Кленовицкий П.М. и др. Сохранение и рациональное использование генофонда снежного барана // Достижения науки и техники АПК. 2010. № 12. С. 63-65.

41. Насибов Ш.Н., Воеводин В.А., Багиров В.А. и др. Биологические особенности гибридов яка с крупным рогатым скотом // Проблемы биологии продуктивных животных. 2010. № 4. С. 113-115.

42. Романов П.Л. Охрана и использование генофонда якутского скота // Якуткнигиздат. 1984. С. 144.

43. Свечин К.Б. и др. Коневодство. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Колос, 1992. 271 с.

44. Серебровский A.C. Генетика и животноводство // Классики советской генетики. Л.: Наука. 1968. С. 325-354.

45. Серебровский A.C. Геногеография и генофонд сельскохозяйственных животных // Науч. слово. 1928. № 8. С. 7-42.

46. Скотоводство. Крупный рогатый скот, т. 1, М., 1961

47. Соколов В.В., Куц Г.А. "Мировое овцеводство". Справочник. Ижевск. Издательство Удмуртского университета, 1994.

48. Столповский Ю.А. Популяционно-генетические основы сохранения ресурсов генофондов доместицированных видов животных. автореферат докт. дис. Москва: ИОГЕН 2010. 50 с.

49. Столповский Ю.А., Кол Н.В., Лапшин A.B. и др. Полиморфизм моле-кулярно-генетических маркеров у овец романовской породы // Известия ТСХА. 2008. № 2. С. 48-54.

50. Столповский Ю.А., Лазебный O.E., Столповский К.Ю., Сулимова Г.Е. Применение метода ISSR-PCR для оценки популяционной структуры, идентификации и сходства генофондов пород и видов доместицированных животных//Генетика. 2010. Т. 46. № 6. С.825-833;

51. Уханов C.B., Столповский Ю.А., Банникова Л.В. и др. Генетические ресурсы крупного рогатого скота: редкие и исчезающие отечественные породы//М., Наука. 1993. С. 170.

52. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии. М.: Воскресенье, 2006. 480 с.

53. Храброва JI.A. Использование генетических исследований в коневодстве // Коневодство и конный спорт. 2010. № 2. С. 11-13.

54. Храброва JI.A., Зайцева М.А., Калинкова JI.B. Генетическая дифференциация чистокровных пород лошадей по микросателлитным локусам // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология растений. Серия: Биология животных. 2008. № 2. С. 31-34.

55. Храброва JT.A. Оценка гомозиготности лошадей с разным уровнем инбридинга по локусам микросателлитов ДНК // Зоотехния. 2010. № 9. С. 23.

56. Эрнст JI.K. Роль биологии в развитии животноводства в XXI веке // Достижения науки и техники АПК. 2008. № 10. С. 7-8.

57. Abajian C., University of Washington, Seattle Электронный ресурс. URL: http://espressosoftware.com/sputnik/index.html.

58. Bao W., Jurka J. DNA transposons from zebrafish // Repbase Reports. -2008. Vol.8, N.l 1. P. 1720

59. Benson G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences // Nucleic Acids Res. 1999. No. 27. P. 573-580.

60. Boian S. Alexandrov, Vladimir Gelev, Yevgeniya Monisova, et al. A nonlinear dynamic model of DNA with a sequence-dependent stacking term // Nucleic Acids Research. 2009. Vol. 37. No. 7. P. 2405-2410.

61. Botstein D., White R.L., Scolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism // Am. J. Hum.Genet., 1980. Vol. 32. P. 314-331.

62. Brookes A.J. The essence of SNP // Gene. 1999. No. 234. P. 177-186.

63. Butchart S.H.M., Walpole M., Collen B. et al. Global Biodiversity: Indicators of Recent Declines // www.sciencexpress.org 29 April 2010.

64. Campa A., Giansanti A. Experimental tests of the Peyrard-Bishop model applied to the melting of very short DNA chains // Phys. Rev. E. 1998. 58, 3585.

65. Cuadrado A., Schwarzacher T. The chromosomal organization of simple sequence repeats in wheat and rye genomes // Chromosoma. 1998. Vol.107. P. 587-594.

66. Dauxois T., Peyrard M. and Bishop A.R. Entropy-driven DNA denatura-tion // Phys. Rev. E Stat. Phys. Plasmas Fluids Relat. Interdiscip. 1993. Topics, 47, R44-R47.

67. Davydov A.S. The theory of contraction of proteins under their excitation // J. Theor. Biol. 1973. No. 38 P. 559-569.

68. Delgrange O., Rivals E. STAR: an algorithm to search for tandem approximate repeats // Bioinformatics. 2004. No. 20. P. 2812-2820.

69. Deshpande A.M., Newlon C.S. DNA replication fork pause sites dependent on transcription. 1996. Science. No. 272. P. 1030-1033.

70. Dujon B., Alexandraki D., Andre B. et al. Complete DNA sequence of yeast chromosome XI //Nature. 1994. No. 369. P. 371-378.

71. Dujon B., Sherman D., Fischer G. et al. Genome evolution in yeasts // Nature. 2004. No. 430. P. 35-44.

72. Elsik C.G., Tellam R.L., Worley K.C. The Genome Sequence of Taurine Cattle: A Window to Ruminant Biology and Evolution // Science. 24 April 2009: Vol. 324 No. 5926. P. 522-528.

73. Englander S.W., Kallenbach N.R., Heeger A.J. et al. Nature of the open state in long polynucleotide double helices: possibility of soliton excitations // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1980. No. 77. P. 7222-7226.

74. Epplen C., Melmer G., Siedlaczck I. On the essence of 'meaningless' simple repetitive DNA in eukaryote genomes // In: DNA Fingerprintin: State of the Science. Birkhauser Verlag, Basel Switzirland. 1993. P.29-45.

75. Farah J. A., Hartsuiker E., Mizuno K. et al. A 160-bp palindrome is a Rad50. Rad32-dependent mitotic recombination hotspot in Schizosaccharomyces pombe // Genetics. 2002. No. 161. P. 461-468.

76. Flori L., Fritz S., Jaffrezic F. et al. The Genome Response to Artificial Selection: A Case Study in Dairy Cattle // PLoS ONE. 2009. Vol. 4, No.8. e6595.

77. Freeman J.L., Perry G.H., Feuk L. et al. Copy number variation: New insights in genome diversity // Genome Res. 2006. No. 16. P. 949-961.

78. Gabig M., Wegrzyn G. An introduction to DNA chips: principles, technology, applications and analysis. Acta Biochimica Polonica. 2001. Vol.48. No. 3. P. 615-622.

79. Garcia-Etxebarria K., Jugo B.M. Genome-Wide Detection and Characterization of Endogenous Retroviruses in Bos Taurus // J. Virol. 2010. Vol. 84. P. 10852-10862.

80. Garza J.C., Slatkin M., Freimer N.B. Microsatellite allele frequencies in humans and chimpanzees, with implications for constraints on allele size // Molec. Biol, and Evol. 1995. Vol.12. P.594-603.

81. Gautier M., Laloe D., Moazami-Goudarzi K. Insights into the Genetic History of French Cattle from Dense SNP Data on 47 Worldwide Breeds // PLoS ONE 2010. Vol.5, No. 9. el3038

82. Gifford, R., Kabat P., Martin J. et al. Evolution and distribution of class II-related endogenous retroviruses // J. Virol. 2005. Vol. 79. P. 6478-6486.

83. Guo Z, Zhang L, Li Y Increased Dependence of Humans on Ecosystem Services and Biodiversity//PLoS 2010. Vol. 5,No.l0. el3113.

84. Hancock J.F. Plant Evolution and the Origin of Crop Species. 1992. Pren-ticeHall, Englewood Cliffs, New Jersey.

85. Hazell P., Wood S. Drivers of change in global agriculture // Phil. Trans. R. Soc. B 2008. Vol. 363. P. 495-515.

86. Hurst D., Zuiverloon C., Hafner C. et al. A SNaPshot assay for the rapid and simple detection of four common hotspot codon mutations in the PIK3CA gene // BMC Research Notes. 2009. No. 2. P. 66.

87. International HapMap Consortium. The International HapMap Project. Nature. 2003 Dec 18;426(6968):789-96.

88. Iruela M., Rubio J., Cubero J.I. et al. Phylogenetic Analysis In The Genus Cicer And Cultivated Chickpea Using RAPD And ISSR Markers // Theoretical and Applied Genetics TAG. 2002. T. 104. № 4. C. 643-651;

89. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 1985. No. 314. P.67-73.

90. Jern P., Coffin J. Effects of retroviruses on host genome function // Annu. Rev. Genet. 2008. Vol.42. P.709-732.

91. Jurka J. Putative non-autonomous ERVl-type endogenous retrovirus from horse // Repbase Reports. 2008. Vol.8, No.5. P.601.

92. Kalendar R., Grob T., Regina M. et al. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques // Theoretical and Applied Genetics. 1999. Vol. 98. P. 704-711.

93. Kalendar R., Schulman A.H. IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting //Nature Protocols. 2006. V. 1. № 5. P. 2478-2484.

94. Kolpakov R., Bana G., and Kucherov G. mreps: efficient and flexible detection of tandem repeats in DNA // Nucleic Acids Res. 2003. No. 31. P. 36723678.

95. Kostia S., Ruohonen-Lehto M., Vainola R. et al. Phylogenetic information in inter-SINE and inter-SSR fingerprints of the artiodactyla and evolution of the bov-tA S //Heredity. 2000. Vol.84, Pt 1. P. 37-45.

96. Kozal M.J. et al. Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nat Med. 1996. Vol. 2. No.7. P.753-759.

97. Kuhn R.M., Clarke L., Carbon J. Clustered tRNA genes in Schizosaccharomyces pombe centromeric DNA sequence repeats // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. No. 88. P.1306-1310.

98. Van der Kuyl A.C. Characterization of a Full-Length Endogenous Beta-Retrovirus, EqERV-Betal, in the Genome of the Horse (Equus caballus) // Viruses 2011. Vol.3. P. 620-628.

99. Lai E Application of SNP technologies in medicine: lessons learned and future challenges // Genome Research. 2001. No. 11. P. 927-929.

100. Lewis J., Abas Z., Dadousis C. et al. Tracing Cattle Breeds with Principal Components Analysis Ancestry Informative SNPs // PLoS ONE 2011. V.6, N.4. el8007.

101. Li Y.C., Fahima T., Korol A. Microsatellite diversity correlated with eco-logical-edaphic and genetic factors in three microsites of wild emmer wheat in North Israel // Molec. Biol, and Evol. 2000. Vol.17. P.851-862.

102. Li Y.C., Fahima T., Peng J.H. et al. Edaphic microsatellite DNA divergence in wild emmer wheat, Triticum dicoccoides, at a microsite: Tabigha, Israel//Theor. and App. Genet. 2000. Vol.101. P. 1029-1038.

103. Li Y.C., Ruder M.S., Fahima T. et al. Climatic effect on microsatellite diversity in wild emmer wheat, Triticum dicoccoides, at Yehudiyya microsite // Israel: Heredity. 2002. Vol.89. P.127-132.

104. Li Y.C., Korol A., Fahima T., Nevo E. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review // Molecular Ecology. 2002. P. 2453-2465.

105. Lipshutz R.F. et al. Advanced DNA sequencing technologies. Curr Opinion in Structural Biology. 1994. No. 4. P.376-380.

106. Litt M., Luty J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am. J. Hum. Genet. 1989. No. 44. P. 397-401.

107. Lobachev K.S., Gordenin D.A., Resnick M.A. The Mrell complex is required for repair of hairpin-capped double-strand breaks and prevention of chromosome rearrangements // Cell. 2002. No. 108. P. 183-193.

108. Lobachev K. S., Stenger J.E., Kozyreva O.G. et al. Inverted Alu repeats unstable in yeast are excluded from the human genome // EMBO J. 2000. No. 19. P. 3822-3830.

109. Long E.O., Dawid I.B. Repeated genes in eukaryotes // Ann. Rev. Biochem. 1980. No. 49. P.727-764.

110. Marton-Lefevre J. Biodiversity Is Our Life // Science. 2010. Vol. 327. P. 1179.

111. Mattioni C., Casasoli M., Gonzalez M. et al. Comparison of ISSR and RAPD markers to characterize three Chilean nothofagus species // Theoretical and Applied Genetics. 2002. V. 104. № 6-7. P. 1064-1070.

112. McClare C.W. A quantum mechanical muscle model. Nature. 1972. No. 240. P. 88-90.

113. Metzgar D., Bytof J., Wills C. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA // Gen. Res. 2000. Vol.10. P.72-80.

114. Migliore L., Colognato R., Naccarati A, Bergamaschi E. Relationship between genotoxicity biomarkers in somatic and germ cells: findings from a biomonitoring study // Mutagenesis. 2006. V.21. №2. P. 149-152.

115. Miller M. Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. 1997.

116. Molder A., Eesti punace veisetou aretus, Tallinn, 1966.

117. Nag D.K., and A. Kurst. A 140-bp-long palindromic sequence induces double-strand breaks during meiosis in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1997. No. 146. P. 835-847.

118. Narayanan V., Mieczkowski P. A., Kim H.M. et al. The pattern of gene amplification is determined by the chromosomal location of hairpin-capped breaks // Cell. 2006. No. 125. P. 1283-1296.

119. Nasar F., Jankowski C., Nag D.K. Long palindromic sequences induce double-strand breaks during meiosis in yeast // Mol. Cell. Biol. 2000. No. 20. P. 3449-3458.

120. Nei M. Genetic distance between populations // American Naturalist. 1972. Vol. 106. No. 949. P. 283-292.

121. Peelman L.J., Mortiaux F., Van Zeveren et.al. Evaluation of the genetic variability bovine microsatellite markers in four Belgian cattle breeds // Anim. Genet. 1998. Vol.29, №3. P.161-168.

122. Pereira E., Bardosa L., Rosa A. Influencia de fatores geneticos de meio empesos de bovinos de rasa nelore criados no estado de San-paulo // Rev. Soc. Bras. Zootech. 1989. Vol.18, №2. P. 103-111.

123. Perrings C., Duraiappah A., Larigauderie A., Mooney H. The Biodiversity and Ecosystem Services Science-Policy Interface // Science. 2011. Vol. 331. P. 1139-1140.

124. Peyrard M., Bishop A.R. Statistical mechanics of a nonlinear model for DNA denaturation // Phys. Rev. Lett., 1989. No. 62. P. 2755-2758.

125. Pritham E.J., Feschotte C. Massive amplification of rollingcircle transposons in the lineage of the bat Myotis lucifugus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. No. 104. P.1895-1900.

126. Pritham E.J., Putliwala T., Feschotte C. Mavericks, a novel class of giant transposable elements widespread in eukaryotes and related to DNA viruses // Gene. 2007. No. 390. P. 3-17.

127. Prokopowich C. D., Gregory T. R., Crease T. J. The correlation between rDNA copy number and genome size in eukaryotes // Genome. 2003. No. 46. P. 48-50.

128. Redon R., Shumpei Ishikawa, Karen R. Fitch et al. Global variation in copy number in the human genome // Nature. 2006 November 23; 444(7118): 444-454.

129. Richard G.-F., Kerrest A. and Dujon B. Comparative Genomics and Molecular Dynamics of DNA Repeats in Eukaiyotes // Microbiology And Molecular Biology Reviews, Dec. 2008, Vol. 72, No. 4, P. 686-727.

130. Richard, G.-F., Hennequin C., Thierry A. et al. Trinucleotide repeats and other microsatellites in yeasts//Res. Microbiol. 1999. No. 150. P. 589-602.

131. Rubes J., Horinova Z., Gustavson 1. et al. Somatic chromosome mutations and morphological abnormalities in sperms of boars // Hereditas. 1991. V. 115. P. 139-143.

132. Saiki R.K; Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science Dec 20, 1985.230(4732): 1350-1354.

133. Samadi S., Erard F., Estoup A. et al. The influence of mutation selection and reproductive systems on microsatellite variability: a simulation approach // Genet. Res. 1998. Vol.71. P. 213-222.

134. Schlotterer C., Wiehe T. Microsatellites, a neutral marker to inter selective sweeps. In: Microsatellites: Evolution and Applications (eds Goldstein D.B., Schlotterer C.) // Oxford University Press. 1999. P. 238-247.

135. Schlotterer C., Wiehe T. Zangerl B. et al. Distribution of dinucleotide microsatellites in the Drosophila melanogaster genome // Molec. Biol, and Evol. 1999. Vol. 16. P. 602-610.

136. Schulze A., Downward J. Navigating gene expression using microarray a technology review // Nature cell biology. 2001. Vol. 3. P. 190-195.

137. Sebat J., Lakshmi B., Jennifer Troge et al. Large-Scale Copy Number Polymorphism in the Human Genome // Science 23 July 2004: Vol. 305 No. 5683 P. 525-528.

138. Seroussi E., Glick G., Shirak A. et al. Analysis of copy loss and gain variations in Holstein cattle autosomes using BeadChip SNPs // BMC Genomics. 2010. Vol. 11. P. 673-701.

139. Sharp P., Lloyd A. Regional base composition variation along yeast chromosome III: evolution of chromosome primary structure // Nucleic Acids Res. 1993. No. 21. P.179-183.

140. Smit A.F.A., Hubley R., Green P. RepeatMasker Ореп-З.О. 1996-2010 Электронный ресурс. URL: http://www.repeatmasker.org.

141. Smit A.F. Identification of a new, abundant superfamily of mammalian LTR-transposons //Nucleic Acids Res. 1993. Vol.21, N.8. P.1863-1872.

142. Smith P.J. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) // Stock identification methods. Application in fishery science. 2005. P. 371-387.

143. Takahashi K., Murakami S., Chikashige Y. et al. A large number of tRNA genes are symmetrically located in fission yeast centromeres // J. Mol. Biol. 1991. No. 218. P.13-17.

144. Templeton A. Nested clade analysis of phylogenetic data: testing hypotheses about gene flow and population history // Mol. Ecol. 1998. Vol.7. P. 381-397.

145. Thomas K., Bebeli P. Genetic diversity of Greek Aegilops species using different types of nuclear genome markers // Mol Phylogenet Evol. 2010 Sep;56(3):951-61. Epub 2010 May 5.

146. Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis // Genome Research. 2000. Vol.10. P.417-432.

147. Tyler-Smith, C., Willard H.F. Mammalian chromosome structure. Curr. Opin. Genet. Dev. 1993. No. 3. P. 390-397.

148. Vos P., Hogers R., Bleeker et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting //Nucleic Acids Research. 1995. 23(21): 4407-4414.

149. Wade C.M., Giulotto E., Sigurdsson S. et al. Genome Sequence, Comparative Analysis, and Population Genetics of the Domestic Horse // Science 6 November 2009: Vol. 326 No. 5954 P. 865-867

150. Wahls W.P., Moore P.D. Homologous recombination enhancement conferred by the Z-DNA motif d(TG)30 is abrogated by simian virus 40T antigen binding to adjacent DNA sequences // Molecular and Cellular Biology. 1990. Vol.10. P. 794-800.

151. Wahls W.P., Moore P.D. Relative frequencies of homologous recombination between plasmids introduced intoDNA repair deficient and other mammalian somatic cell lines // Somatic Cell and Molecular Genetics. 1990. Vol.16 (a). P. 321-329.

152. Walker P.M.B. Origin of satellite DNA // Nature. 1971. No. 229. P. 306308.

153. Wang D., Coscoy L., Zylberberg M. et al. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002 Nov 26;99(24): 15687-92. Epub 2002 Nov 12.

154. Waterston R.H., Lindblad-Toh K., Birney E. et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome // Nature. 2002. No. 420. P. 520-562.

155. Weiner A.M., Deininger P.L., Efstratiadis A. Nonviral retroposons: genes, pseudogenes, and transposable elements generated by the reverse flow of genetic information // Annu. Rev. Biochem. 1986. No. 55. P. 631-661.

156. Weller P., Jeffreys A.J., Wilson V. et al. Organization of the human myoglobin gene // EMBO J. 1984. No.3. P.439-446.

157. Wenzl P., Carling J., Kudrna D. et al. Diversity Arrays Technology (DArT) for whole-genome profiling of barley // Proc Natl Acad Sci USA. 2004 June 29; 101(26): 9915-9920.

158. Wicker T., Sabot F., Hua-Van A. et al. A unified classification system for eukaryotic transposable elements //Nat. Rev. Genet. 2007. No. 8. P. 973-982.

159. Williams J.G. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. 1990 Nov 25;18(22):6531-5.

160. Wyman A.R., White R. A highly polymorphic locus in human DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. No. 77. P.6754-6758.

Информация о работе

Феофилов, Антон Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы