Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка генетического разнообразия лошадей Саяно-Алтайского региона с использованием ядерных и митохондриальных ДНК маркеров

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оценка генетического разнообразия лошадей Саяно-Алтайского региона с использованием ядерных и митохондриальных ДНК маркеров"

На правах рукописи

005017541

Воронкова Валерия Николаевна

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОШАДЕЙ САЯНО-АЛТАЙСКОГО РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК МАРКЕРОВ

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О

Москва, 2012г.

005017541

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Сулимова Галина Ефимовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Асланян Марлен Мкртичевич

профессор кафедры генетики Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва

кандидат биологических наук Алимов Андрей Анатольевич

доцент кафедры разведения и племенного дела Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, г. Москва

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «24» мая 2012 г. в /V,часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина, д.З. Факс: (499) 132-89-62, e-mail: aspirantura@vigg.ru. www.vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «Х&» (/'У 2012г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета, /

кандидат биологических наук/ р я Ч/Синелыцикова Татьяна Аркадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Изучение генетического полиморфизма пород лошадей имеет большое значение для поддержания разнообразия в популяциях, улучшения селекционной работы и определения их происхождения. Особенно важным является исследование аборигенных пород лошадей, имеющих в своем геноме редкие аллели и являющихся выносливыми и хорошо приспособленными к условиям среды обитания. Монгольская лошадь была приручена около 6000 лет назад и благодаря походам Чингиз-хана и его потомков приняла участие в формировании многих пород на территории Европы и Азии. Она является аборигенной породой и разводится только в монгольских степях, в связи с чем, плохо изучена. Бурятская, алтайская, забайкальская и тувинская породы лошадей также являются аборигенными и даже в наши дни они остаются незаменимыми благодаря приспособленности к суровым условиям обитания. Недостаточная изученность лошадей Центральной и Восточной Азии не позволяет точно локализовать основные области, где начался процесс доместикации (Warmuth et al., 2011).

В начале XX века в России насчитывалось более 20 млн. голов лошадей, к настоящему времени численность конного поголовья сократилась до 1,3 млн. (Федеральная служба государственной статистики, 2008). Резкое снижение численности поголовья лошадей в XX веке не могло не отразиться на уровне генетического разнообразия, в связи с чем, необходимо использовать современные подходы для оценки и поддержания высокого уровня генетического разнообразия для сохранения пород во избежание неблагоприятных последствий инбридинга и эффекта «бутылочного горлышка».

Одним из наиболее эффективных подходов оценки генетического разнообразия популяций является использование молекулярных маркеров ДНК. Наиболее информативными для популяционно-генетических исследований являются мультилокусные ДНК маркеры, позволяющие одновременно изучать большое число локусов. Анализ последовательностей мтДНК позволяет определять происхождение и генетическое сходство пород по материнской линии. Различные варианты аллелей гена миостатина (MSTN) определяют скоростные качества и выносливость лошадей. Представляет интерес выяснить, какие аллели и генотипы преобладают у аборигенных пород лошадей.

При сохранении пород in situ основная задача состоит в том, чтобы сохранить специфические генные комплексы и сбалансированную систему генов и аллелей, которые обуславливают фенотипические породные

характеристики, связанные с экстерьерными особенностями, продуктивностью, жизнеспособностью, резистентностью животных. Именно вышеперечисленные особенности, отличающие местные породы от широко распространенных импортных пород, необходимо сохранять в генофондных хозяйствах (Столповский, 2010).

Цель исследования

Цель данной работы состояла в изучении генетического разнообразия лошадей (Equus caballus) монгольской, алтайской, забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород на основе мультилокусного межмикросателлитного анализа ДНК и анализа нуклеотидной последовательности мтДНК, а также типировании исследуемых образцов по однонуклеотидной замене (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина.

Задачи исследвания:

1) Сравнить информативность ISSR-маркеров, полученных с использованием различных праймеров, для изучения полиморфизма лошадей.

2) Оценить генетическое разнообразие монгольской, алтайской, забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород лошадей на основании результатов ISSR-анализа.

3) Определить нуклеотидную последовательность фрагментов гипервариабельного района мтДНК монгольской, алтайской, забайкальской, бурятской и тувинской пород лошадей.

4) Оценить генетическое разнообразие и филогенетическое сходство исследуемых пород лошадей.

5) Провести типирование изучаемых образцов по гену миостатина (MSTW), оценить частоты нуклеотидных замен и генотипов и сравнить их с частотами у других изученных пород.

Научная новизна

Впервые проведена оценка информативности ISSR-маркеров, разработанных с использованием праймеров к динуклеотидным и тринуклеотидным повторам, для изучения генетического разнообразия пород лошадей. Показано, что для исследования генофондов лошадей наиболее информативны ISSR-маркеры, полученные на основе тринуклеотидных, а не динуклеотидных микросателлитных повторов, которые более информативны для всех других домашних копытных.

Впервые проведена оценка генетического разнообразия аборигенных пород лошадей Саяно-Алтайского региона (монгольской, алтайской,

забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород) с использованием ISSR-анализа. Показан высокий уровень генетического разнообразия (по Нею) алтайской популяции «Амальдива» и тувинских лошадей из хозяйств «Ямаалыг» и «Кошкорлыг».

Впервые определены нуклеотидные последовательности D-петли мтДНК местных пород лошадей РФ и были выявлены гаплотипы, идентичные древним гаплотипам лошадей Китая и Монголии, среди монгольской, забайкальской и тувинской пород лошадей. В целом показан высокий уровень полиморфизма мтДНК в изученных выборках при сравнению с ранее исследованными популяциями.

Впервые у аборигенных пород лошадей продемонстрировано наличие С-варианта однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина, ассоциированного с высокими скоростными качествами лошадей, с частотами от 0,03 до 0,26 (средняя частота 0,11).

Практическая значимость

Предложенный в данной работе подход для оценки консолидированности популяций (табунов) и чистопородности племенных животных с использованием разработанных ISSR-маркеров является высокоэффективным инструментом в селекции сельскохозяйственных животных и может быть использован для паспортизации пород и популяций (табунов), сертификации генофондных и племенных хозяйств, при восстановлении редких и исчезающих пород. Уже в настоящее время данный подход нашел свое применение в коневодстве и был использован при проведении молекулярно-генетической экспертизы табунов лошадей из 18 хозяйств, претендующих на получение статуса генофондного хозяйства (Результаты молекулярно-генетической экспертизы переданы в Минсельхоз РФ).

Типирование однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина позволяет оценивать скоростные качества лошадей, что может быть использовано для выведения лошадей с высокими скоростными характеристиками или для оценки потенциала скаковых лошадей. На основе данной нуклеотидной замены разработана и запатентована тест-система (Equinome Ltd, Ireland, http://www.equinome.com/).

Апробация результатов

Основные результаты работы были представлены на 7-ой международной научной конференции-школе «БиоТехЖ-2008» (Дубровицы, 2008), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 2009), на международной

молодежной конференции «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы», посвященной памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 2011), на 62nd Annual Meeting of the European Federation of Animal Science (Ставангер, Норвегия, 2011).

Декларация личного участия автора

Автор участвовала в экспедиции по сбору образцов на Горном Алтае, самостоятельно получила ДНК исследуемых пород лошадей, провела ISSR анализ исследуемых образцов, получила нуклеотидные последовательности D-петли мтДНК, провела типирование однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина для исследуемых популяций лошадей. Автор лично проводила статистическую обработку полученных результатов и оформляла результаты в виде статей. Построение сетей NeighborNet проведено совместно с к.б.н. Коноваловым Ф.А., ISSR анализ в программе STRUCTURE совместно со Столповским К.Ю.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, выводы, список использованной литературы, включающий 162 источника, и приложения. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал. В работе были изучены 15 выборок лошадей монгольской (пустыня Гоби п=48, северная Монголия п=51, Дархан п=48, центральная Монголия п= 24 ), алтайской («Амальдива» п=20, «Джумбаев» п=25, «Чингиз» п=50, «Энчи» п=52), бурятской (п=38), тувинской («Арыг-Хем» п=35, «Донгак» п=36, «Ямаалыг» п=58, «Кошкорлыг» п=56) забайкальской (п=50) и астраханской (п=50) пород. Образцы крови монгольских лошадей были получены во время экспедиции в 2008 году по Монголии, осуществлённой сотрудниками лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН при содействии доктора Цэндсурэн Цэдев, сотрудника Института биологии МАН. Образцы крови алтайских лошадей были получены во время экспедиции в 2010 году по Горному Алтаю, организованной в.н.с. лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН, д.б.н. Столповским Ю.А. Образцы крови бурятских лошадей были собраны во время экспедиции с.н.с. лаборатории сравнительной генетики животных, к.б.н. Каштанова С.Н. Образцы крови

лошадей получены из следующих фермерских хозяйств: УМСХП «Аксарайский», Астраханская область; Сельскохозяйственный кооператив «Арыг-Хем» Барун-Хемчикского кожууна Республики Тыва; Крестьянско-фермерское хозяйство «Донгак Д.В.» Кызыл ского Республики Тыва; Сельскохозяйственный производственный кооператив «Кошкорлыг» Республики Тыва; Сельскохозяйственный производственный кооператив «Ямаалыг» Республики Тыва; СПК «Победа», Еравнинский район, Бурятия, и были любезно предоставлены ООО «СКС-ТЕСТ».

Методы. Геномную ДНК выделяли из крови лошадей, используя набор Diatom™ Ргер200 и Magna Prep 200 (Лаборатория Изоген, Москва) согласно инструкции изготовителя. Реакцию амплификации проводили с использованием «сухого» набора реагентов для ПЦР «GenePak™ PCR Core» согласно прописи фирмы-изготовителя (Лаборатория Изоген, Москва).

ISSR анализ. Электрофоретическое разделение продуктов ISSR ПЦР в

агарозном геле проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

Размер и количество фрагментов в полученных ISSR-ампликонах определяли с

использованием программы «GelPro» v3.1. С помощью программы «Excel»

были созданы бинарные матрицы, в которых наличие и отсутствие каждого

фрагмента в паттерне отмечалось цифрами 1 и 0 соответственно. Вычисления

частот фрагментов, доли полиморфных локусов, индексов генетического

разнообразия по Нею (Nei, 1973) проводили в программе PopGene 1.32.

Полиморфное информационное содержание (PIC) для каждого праймера

вычисляли суммированием индивидуальных индексов PIC каждого фрагмента: к

PIC =£(1-р2 -q2), где р, q - частоты фрагментов, к- число фрагментов i

(Vijayan, 2003). При помощи программы «STATISTICA 6.0 for Windows StatSoft, Inc.» было построено пространство главных компонент на основании генетических расстояний по формуле Нея и Ли (1979), рассчитанных в программе PopGene 1.32.

Получение нуклеотидных последовательностей D-петли мтДНК. Для

очистки продуктов ПЦР контрольного региона мтДНК их фракционировали в 1 % агарозном геле (смесь 1:1 легко- и тугоплавкой агарозы) с использованием в качестве маркера молекулярных масс lkb DNA Ladder Plus Gene Rulertm (фирма «Fermentas», Канада). Экстракцию продуктов ПЦР из геля проводили с использованием набора Get Quick Gel Extraction Spin Kit/250 (Genomed"11, Германия) и фирмы «Омникс» (Санкт-Петербург) по методике фирм

изготовителей. Определение нуклеотидной последовательности в исследуемом фрагменте проводили методом автоматического секвенирования на генетическом анализаторе ABI Prism 3130x1 (Applied Biosystems, США) с использованием наборов Big DyeTM Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem, США). Выравнивание последовательностей гипервариабельного района мтДНК осуществляли при помощи программы ClustalW и обрабатывали вручную с использованием программы ChromasPro Technelysium Pty Ltd (version 1.34). Для обработки данных нуклеотидных последовательностей использовали также програмный пакет DNASTAR Lasergene (version 7.0.0). Для статистической обработки была использована программа Arlequin (version 3.5.1.2). Построение дендрограммы и частичная статистическая обработка данных были осуществлены в программе MEGA (version 5.05). Последовательности митохондриальной ДНК лошади, анализированные ранее в статье (Cieslak et al., 2010) с номерами записей из таблиц S2 и Sil, были получены из базы данных GenBank в формате FASTA с помощью Perl-скрипта на основе модулей BioPerl. Последовательности были объединены в единый файл формата FASTA вместе с полученными в настоящей работе.

Типирование g.66493737C>T SNP проводилось с использованием набора TaqMan® Sample-to-SNP™ Kit Protocol (Applied Biosystems), на приборе StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Расчёт частот нуклеотидных замен и генотипов гена миостатина осуществлялся с использованием программы «Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнение информативности различных ISSR-маркеров для оценки генетического разнообразия лошадей

Анализ спектров продуктов амплификации участков, расположенных между инвертированными повторами микросателлитных локусов, использовался для выявления межвидовых и межпородных различий крупного рогатого скота (подсем. Bovinae) (Глазко и др., 1999; Ахани Азари и др., 2006; Сулимова, Ахани Азари, 2006; Столповский и др., 2011), яков (Ахани Азари и др., 2006), овец (Столповский и др., 2010а), оленей (Кол, Лазебный, 2006) и других видов. В данной работе метод ISSR-анализа был впервые применен для изучения популяций аборигенных пород лошадей. Оценку информативности различных ISSR маркеров проводили на выборках лошадей монгольской (п=31, Монголия, район Хувсугул, фермерское хозяйство Улаан-Цуя), тувинской (п=40, республика Тыва, Кызылский район, ООО Конный завод «Сяньби-Магнут») и бурятской пород (п=15, республика Бурятия, КФХ «Новососновка»)

с целью подбора наиболее подходящих маркеров и оптимизации условий ПЦР. При изучении крупного рогатого скота и других копытных успешно применяются 18811-маркеры на основе динуклеотидных повторов (Столповский и др, 2009; Городная, Глазко, 2003; Ахани-Азари и др., 2006; Столповский и др., 2011). В этой связи первоначальные исследования генетического разнообразия лошадей также проводились с использованием праймеров, комплементарных к динуклеотидным повторам. Однако нами была показана низкая информативность маркеров данного типа для исследования популяций лошадей по причине низкого числа амплифицируемых фрагментов (табл. 1). Использование КБЯ-праймеров к тринуклеотидным повторам позволило получить спектр с большим числом фрагментов, в том числе и полиморфных. Таким образом, установлено, что число ампликонов в спектрах КБЯ-маркеров на основе динуклеотидных повторов ниже, чем в спектрах КБК-маркеров на основе тринуклеотидных повторов.

Таблица 1. Характеристика ¡ББЛ-маркеров, разработанных на основе ди- и

тринуклеотидных микросателлитных повторов.

ISSR-маркеры Общее число локусов Среднее число локусов на особь Доля полиморфных локусов (%) Дисперсия PIC*

ISSR-маркеры на основе динуклеотидных повторов

GA-ISSR 10 8,16 80,00 2,06 1,46

AG-ISSR 6 5,88 33,00 0,19 0,36

CA-ISSR 12 10,73 6,25 0,30 0,57

ISSR-маркеры на основе тринуклеотидных повторов

GAG-ISSR 20 13,33 95,00 0,23 3,61

ACC-ISSR 18 14,85 94,50 6,76 2,50

CAC-ISSR 15 13,95 12,50 0,77 0,78

GAG-ISSR-маркер и ACC-ISSR-маркер отличаются самыми высокими значениями полиморфного информационного содержания (3,61 и 2,50), что делает их оптимальными маркерами, среди исследованных нами, для изучения генетического разнообразия лошадей. В дальнейшем в нашей работе были использованы именно эти два ISSR-маркера.

Оценка генетического разнообразия лошадей с использованием ISSR-фингерпринтинга

В нашей работе впервые с помощью межмикросателлитного анализа (ISSR-фингерпринтинга) с использованием двух праймеров (ACC)6G и (GAG)6C к микросателлитным локусам (TGG)n и (СТС)п была исследована генетическая изменчивость 641 лошади из 15 выборок шести пород (четырех из Монголии, четырех из Алтая, четырех из Тывы, одной из Бурятии, одной из Забайкалья и одной из Астрахани).

Для более точной оценки длин выявленных ISSR-фрагментов на основании сравнительного анализа спектров продуктов амплификации ДНК у различных видов сельскохозяйственных животных (в том числе были привлечены и данные ISSR-анализа, полученные в данной работе) была разработана универсальная шкала, где применена градация фрагментов ДНК по молекулярным массам (Столповский и др., 2010-а; Столповский и др., 2010-6; Столповский и др., 2011). В зависимости от зоны («тяжелые», «средние» и «легкие» фрагменты) использовался определенный шаг от 10 до 200 п.н. В результате было выделено 38 зон с фиксированным интервалом, которые позволяют достаточно точно определять молекулярную массу для 38 ПЦР-продуктов разной длины и стандартизировать результаты анализа. Размеры и обозначения ПЦР-продуктов приведены в таблицах 2 и 3. Поскольку данная шкала разрабатывалась как универсальная шкала для мониторинга генофондов различных видов сельскохозяйственных животных с использованием ISSR-PCR маркеров, то у конкретных видов могут быть представлены не все ISSR фрагменты. Так у изученных пород лошадей при использовании ACC-ISSR праймера было выявлено 24 фрагмента (табл. 2), а при использовании GAG-1SSR праймера был выявлен 21 фрагмент (табл. 3).

Частоты встречаемости ISSR фрагментов сильно варьируют у различных популяций лошадей. Многие фрагменты с достаточно высокой частотой обнаруживаются у всех исследованных популяций, некоторые встречаются у одной или нескольких выборок. С использованием ACC-ISSR маркера был получен один фрагмент (А27 = 430-4Юп.н.), встречающийся у всех особей среди изученных популяций, а также четыре фрагмента (Al 6=870-820, Al8=750-720, А23=550-530, А36=230-220), встречающиеся во всех изученных популяциях у большинства особей (табл. 2). С помощью праймера (GAG^C у всех особей лошадей был обнаружен один фрагмент (G28=400-380) и три фрагмента (G12=l 110-1060, G17=810-760, G20=670-640), встречающихся во всех изученных популяциях (табл. 3).

Таблица 2. Частоты встречаемости фрагментов, полученных с использованием А СС-1Б8Я праймера для 15 популяций лошадей.

Фрагменты Индивидуальный размер фрагмента Гоби-Монголия (п=48) Сев. Монголия Ь=51) Дархан Монголия (п=48) Центр.Монголия (п=24) >8 Р « СО К ч ^ о" 3 " <1 Л « о н И а 2 ¡л е=Г-в< Чингиз Алтай (п=50) Энчи Алтай (п=52) м0 в л ет <; £ Забайкалье (п=50) Арыг-Хем Тыва (п=35) й ей Н я ей Н и- 3 ^ Кошкорлыг Тыва (п=56) Бурятия (п=38)

А1 ^500-2300

А2 2100-2000

АЗ 1900-1800

А4 1750-1700

А5 1650-1600

А6 1550-1500

А7 1450-1400 0,087 0,390 0,345 0,776 1,000

А8 1350-1300 0,236 0,196 0,184 0,051 0,084 0,600 1,000 0,303 0,629 0,684 0,577

А9 1290-1240 0,122 0,427 0,553 1,000 0,553 0,761 0,191 0,213 0,104 1,000

А10 1230-1180

АН 1170-1120 1,000 1,000 0,711 1,000 1,000 1,000 1,000

А12 1110-1060 0,684 0,434 1,000 0,064

А13 1050-100СУ 0,158 0,314 0,371 0,345 0,194 0,717 0,155 0,384 0,400 0,373 0,389

А14 990-940 0,011 0,010 0,024 0,059

А15 930-880 0,388 0,406 0,323 0,244 1,000 1,000 0,029 1,000

А16 870-820 1,000 0,802 1,000 0,691 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,329

А17 810-760 0,010 0,275

А18 750-720 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,869 0,859 0,221 1,000

А19 710-680

А20 670-640 0,856 0,860 1,000 0,789 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

А21 630-600

А22| 590-560

А23 550-530 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,869 0,859 0,166 0,430

А24 520-500 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,509 0,490 0,577 0,120

А25 490-470 1,000

А2^ 460-440 0,025 0,020 0,010 0,020 0,014 0,106

А27 430-410 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1.000

А28 400-380 0,099 0,031 0,684 0,662 0,329

А29 370-360

АЗО 350-340 0,371 1,000 0,106 0,062 0,031 0,452 0,800 0,014 0,257 0,213 0,198 0,163

А31 330-320 1,000 1,000 0,856 1,000 0,613 0,471 0,510 0,510 1,000 0,041 0,059 1,000 1,000 1,000 0,452

А32 310-300 0,500 0,152 0,576 0,200 0,755 0,761 0,842

АЗЗ 290-280 0,618 0,405 0,293 0,128 0,322 0,322 0,084 0,090 0,180 0,200 0,134 0,348

А34 270-260 0,355 0,196 0,329 0,128 0,471 0,307 0,351 0,084 0,044 0,090 0,095 0,280 0,078

АЗ 5 250-240

АЗ 6 230-220 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,600 0,761 1,000 1,000 1,000 1,000

А37 210-200

АЗ 8 180-160

Таблица 3. Частоты встречаемости фрагментов, полученных с использованием С А праймера для 15 популяций лошадей.

Фрагменты Индивидуальный размер фрагмента ^оби-Монголия (п=48) Сев. Монголия (ч=51) Дархан Монголия (п=48) 1 ь-X о 2 1? 8 к Амальдива Алтай (п=20) _ 1 Н ей и сЗ ю ^ 2 ¡Я £¡1 КГ А Чингиз Алтай №=50)____ _ Энчи Алтай (п=52) N0 а < & Забайкалье (п=50) Арыг-Хем Тыва (п=35) « а § Ф й 7 о 1 егЗ Ямаалыг Тыва (п=58) Кошкорлыг Тыва п=56) Бурятия (11=38)

2500-2300

вг 2100-2000

вз 1900-1800

1750-170(^ 1.000 0.856 1.0000 1.000 1.000 1.000

1650-1600

вб 1550-1500 1.000

1450-1400 1.000 1.0000 0.796 1.000 1.000 1.000

08 1350-1300 0.236 0.613 1.000 1.000 0.800 1.000

в9 1290-^

010 1230-1180 1.000 1.000 1.000С 1.000 1.000 1.000

011 1170-1120 0.531

0121 1110-1060 1.000 1.000 0.7500 0.711 1.000 0.654 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

013 1050-1000 1.000 1.000 0.8557 0.796 1.000 0.800 1.000 1.000 0.800 0.117 0.057 0.035 0.055 1.000

014 990-940

015 930-880 0.106 0.200

016 870-820 0.0712 1.000

017 810-760 1.000 0.515 1.0000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.859 0.391 0.764 0.492 0.557 1.000

018 750-720 0.0758 0.471

019 710-680

020 670-640 1.000 1.000 1.0000 1.000 0.776 0.717 0.800 0.800 1.000 0.576 0.439 0.592 0.459 0.622 1.0000

021 630-600 0.856 0.358 1.0000 1.000 0.010 1.000 1.000 0.842

в22 590-560 1.000 1.000 1.0000 1.000 0.684 0.717 0.800 1.000 1.000 0.831 1.000 1.000 0.866 1.000

023 550-530 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

в24 520-500 0.339 1.000 1.0000 1.000 0.776 0.717 1.000 0.800 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

025 490-470 0.1220 1.000 1.000

026 460-440

027 430-410

028 400-380 1.000 1.000 1.0000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

029 370-360

ОЗО 350-340 1.000 1.0000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

031 330-320

032 310-300 1.000 0.238 0.106 0.529 0.246 0.418

033 290-280

034 270-260

035 250-240

036 230-220

037 210-200

038 180-160

Таблица 4. Генетическое разнообразие по Нею (1973) у исследованных пород лошадей по данным 18БЯ-анализа.

Бурятия Тыва Тыва Тыва Тыва

Арыг-Хем Донгак Ямаалыг Кошкорлыг

GAG-ISSR 0,025 0,063 0,063 0,062 0,078

ACC-ISSR 0,099 0,117 0,096 0,127 0,122

Забайкалье Астрахань Монголия Гоби Северная Монголия Центральная Монголия

GAG-1SSR 0,092 0,028 0,046 0,048 0,046

ACC-ISSR 0,070 0,105 0,138 0,095 0,100

Монголия Алтай Алтай Алтай Алтай

Донгак Амальдива Джумбаев Энчи Чингиз

GAG-ISSR 0,053 0,070 0,095 0,072 0,028

ACC-ISSR 0,119 0,156 0,083 0,077 0,086

С использованием данных КБИ. анализа было рассчитано генетическое разнообразие по Нею (1973) для изученных популяций в программе РорОепе у.1.32. АСС-КЗЯ маркер позволяет выявить больше фрагментов, в том числе и полиморфных, что отражается в более высоких значения генетического разнообразия. По ОАО-185Т1 маркеру самый высокий уровень генетического разнообразия был отмечен для алтайской «Джумбаев» и забайкальской популяций, наименьший - для бурятской, астраханской и алтайской популяции «Чингиз». По данным АСС-КБЯ маркера наибольшее значение генетического разнообразия было получено для алтайской популяции «Амальдива» и монгольской Гоби, а также для двух тувинских популяций («Кошкорлыг» и «Ямаалыг»). Наименьшие значения были получены для забайкальской популяции и трех алтайских («Джумбаев», «Энчи» и «Чингиз»).

Genetic distances calculated using GAG-ISSR-marker data and analysed with a method of principal components using Statistics 6 0

Altai «íH ALE*,1

) AM ALlj /

/ MLD .....i__________ АН \

/ Mongolia \Tuva i

: MLT \ TD ; BUR

' I.ILG 1 о ,

* -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 „ дд,^ Facía 1 44.41%

Рисунок 1. Распределение выборок в пространстве главных компонент, построенном в программе Statistica 6.0 по данным GAG-ISSR маркера.

С использованием метода главных компонент по генетическим расстояниям, рассчитанным по данным GAG- и ACC-ISSR анализа, были получены схожие картины. На рисунке 1 видно, что монгольские, алтайские и тувинские популяции образуют отдельные группы. Забайкальская популяция попала в тувинскую группу, бурятская также оказалась к ней ближе. Монгольская лошадь из пустыни Гоби располагается достаточно дискретно даже внутри группы монгольских популяций, демонстрируя высокую степень консолидированности, что может быть связано с сильно отличными от остальных популяций условиями обитания и изоляцией. Наибольшие различия по обоим маркерам отмечены между монгольской лошадью из пустыни Гоби и бурятской популяцией, что также свидетельствует в пользу теории об их генетическом отличии в силу разнящихся геолого-климатических условий обитания. Монгольские и алтайские группы расположены рядом, что может свидетельствовать об их близком генетическом родстве, даже более тесном чем между ними и тувинской группой.

1 ' Забайкальская

Рисунок 2. Дендрограмма, построенная на основе популяционно-статистической обработки данных ACC-ISSR анализа с использованием программы STRUCTURE v2.3.3.

В программе STRUCTURE v2.3.3. по данным ACC-ISSR анализа была построена дендрограмма (рис. 2), топология которой оказалась схожа с дендрограммой, построенной по даным GAG-ISSR анализа. Аналогично картине, полученной с использованием метода главных компонент, алтайская группа на дендрограмме занимает промежуточное положение между монгольской и тувинской, при этом расположена ближе к монгольской группе. Монгольская лошадь из пустыни Гоби занимает самую дальнюю ветвь среди

монгольского кластера. Забайкальская популяция вновь попадает в группу тувинских лошадей. Бурятская и астраханская популяции образуют отдельные ветви от остальных групп. Таким образом, можно считать забайкальскую популяцию наиболее генетически родственной тувинской породе, бурятская же и астраханская сильно отличаются от остальных популяций.

Для разведения и сохранения генофондов отечественных пород лошадей необходимы знания об их генетической и популяционной структуре. До недавнего времени возможность применения ISSR анализа в данных целях была ограничена небольшим числом программных пакетов, пригодных для анализа доминантных типов маркеров. Однако в 2007 году появилась новая версия компьютерной программы STRUCTURE v 2.2, позволяющая работать с маркерами доминантного типа (RAPD, AFLP и ISSR) (Negrini et al., 2007).

В программе STRUCTURE были смоделированы различные структуры выборок, которые характеризуются рядом частот фрагментов ISSR локусов. Вычислительные возможности программы STRUCTURE позволяют выявить наличие субпопуляций в исследуемой популяции и наглядно продемонстрировать отношение конкретных особей ко всей выборке, выявлять гибридных и чужеродных особей, а также определять сходство популяций и исследовать родословные (Pritchard et al., 2000). Особи внутри выборки формируют кластеры - один, в случае если популяция однородна, два и более, если генотипы особей указывают на то, что популяция гетерогенна. Каждая особь в массиве данных представлена на гистограмме отдельным вертикальным столбцом (рис. 3).

На рисунке 3 показаны результаты анализа генетической структуры исследуемых популяций лошадей по данным ACC-ISSR анализа в программе STRUCTURE. GAG-ISSR маркер оказался менее информативным при анализе генетической структуры вследствие более равномерного распределения фрагментов и их частот внутри популяций. В астраханской, забайкальской и двух алтайских популяциях («Амальдива» и «Джумбаев») наблюдается общая однородность структуры, за исключением отдельных особей — одна помесная особь в популяции «Амальдива», несущая кластер характерный для тувинской породы, и одна в забайкальской популяции. Некоторые популяции, вероятно, были получены путем скрещивания двух линий, что приводит к появлению в целом однородной картины, сформированной из двух кластеров (центральномонгольская, северномонгольская, тувинская «Арыг-Хем» и «Донгак», алтайская «Чингиз» и «Энчи»), Неоднородный генетический состав (см. разноцветно окрашенные столбцы) был отмечен для двух монгольских выборок — из пустыни Гоби и Дархана, причем три особи из Дархана имеют кластеры (оранжевого цвета) характерные для алтайской породы.

1 ш 1 ■__

1 !

»><10. 30(10. JMIIOl 357(101 M*10J ХЦЮ) ж»10) »5-101 »7.10. *-«•>. <'"10. п.). S'f..'- RMO, Л-->0> 3»» 10) SMlIOl 307.10, »9

353(10) ЭИ(10) ЗШ101 Зб«10) Midi 3010) 364(10) 3M(I0) зато) 37« 1С.) 37310) 374(10) JWIO) 37*10) 300(10) ЗвДЮ) JWI0) 386(10) 30*11)

s

1

ШТшш

п;

il

Рисунок 3. Анализ популяционной структуры в программе STRUCTURE 2.2.3 (К=13) по данным ACC-ISSR маркера. Номерами снизу обозначены популяции: 1 -центральномонгольская, 2 - тувинская «Арыг-Хем», 3 - алтайская «Чингиз», 4 -алтайская «Эти», 5 - алтайская «Амальдива», б - астраханская, 7 - бурятская, 8 -алтайская «Джумбаев», 9 - монгольская Дархан, 10 - монгольская Гоби, 11 — северомонгольская, 12 - тувинская «Донгак», 13 - забайкальская

В бурятской выборке имеются особи с различной генетической структурой (однородно окрашенные столбцы двух разных цветов), что вероятно связано с недавним слиянием двух независимых популяций, т.к. всего несколько особей являются гибридными вариантами кластеров двух цветов. Одна лошадь из бурятской выборки несет характерный для тувинской породы кластер (желто-бирюзового цвета). Две алтайские популяции «Чингиз» и «Энчи» имеют схожие картины генетической структуры, что может свидетельствовать об общности происхождения и генетическом обмене между ними, т.к. они расположены в соседних хозяйствах.

Полученные молекулярно-генетические данные могут служить критериями для определения следующих фундаментальных параметров селекционных достижений в области коневодства: породной принадлежности, отличимости, консолидированности и стабильности породы, что крайне важно при регистрации новых пород (селекционных достижений), чистопородном разведении или сохранении породы как резерва определенных наследственных качеств. КБИ. анализ используется фирмой ООО «СКС-ТЕСТ» на базе НИЦ Института Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН согласно лицензии МСХ РФ № 000020 ПЖ 77 регистрационный код 774500701000 для проведения молекулярно-генетической экспертизы популяций лошадей для установления или подтверждения ее генофондного статуса. На данный момент статус генофондного хозяйства был получен 18 хозяйствами, разводящими лошадей алтайской, тувинской и кушумской породы.

Анализ нуклеотидных последовательностей Б-петли мтДНК лошадей

Были определены нуклеотидные последовательности контрольного региона (Б-петли мтДНК), отличающегося высокой скоростью мутирования и способностью отражать демографические изменения популяции (цит. по Холодова и Приходько, 2006), для 142 образцов из 6 выборок лошадей (трех монгольских: из пустыни Гоби, центральной и северной Монголии; тувинской «Арыг-Хем», забайкальской и бурятской). При секвенировании каждая последовательность считывалась с обоих концов. В анализе рассматривались нуклеотидные замены, встречающиеся более чем у 4 образцов. После обработки длина полученных нуклеотидных последовательностей составила 398 п.н. (15399-15796п.н., нумерация соответствует референтной последовательностью мтДНК 1ЧС_001640, ОепВапк). Нуклеотидные последовательности отправлены в базу данных ОепВапк, номера с 1(3936335 по .1(3936476. В сравнительном анализе с последовательностями из базы данных длина последовательностей составила 245п.н. Полученные результаты представлены в таблице 5 (жирным шрифтом выделены полученные нами нуклеотидные последовательности).

Таблица 5. Характеристики полученных нуклеотидных последовательностей в области Р-петли мтДНК.

N Монг. Гоби Север. Монголия Центр. Монголия Тыва Забайкалье Бурятия Фулани Ахалтекин-екая Анатолийская Арабская Берберийская Норв. фьордовая Якутская Вятская

Образцов 25 26 20 25 24 22 9 19 17 21 21 9 15 15

Транзиций 27 17 16 26 21 25 13 13 17 17 22 18 20 15

Трансверсий 2 2 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0

Замен 29 19 16 27 21 27 13 13 17 17 22 18 20 15

Сайтов с уникальными заменами 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 0 0 2 1

Нуклеотидное разнообразие 0,025 +/-0,014 0,021 +/-0,012 0,024 +/-0,014 0,028 +/-0,015 0,024 +/-0,013 0,025 +/-0,014 0,026 +/-0,015 0.017 +/-0,009 0,021 +/-0,012 0,013 +/-0,008 0,022 +/-0,012 0,024 +/-0,014 0,022 +/-0,012 0,018 +/-0,011

N К 3 М В о я ё Корейская чейю Китайская дебао Эксмур пони Польский коник Шотландский пони г? ё о Я П) ■а 1а ч: и я ч ё о О о ■а ■а » Я! и ё о 2 а ■а я о 2 о я о Сицилийская а о о я и лошадь Пржевальског о

Образцов 7 21 21 12 5 15 9 10 10 5 И 11 3 2

Транзиций 16 19 24 20 11 21 10 20 3 16 12 24 10 0

Трансверсий 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

Замен 16 19 24 20 11 21 И 20 3 16 12 24 10 0

Сайтов с уникальными заменами 0 1 6 3 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0

Нуклеотидное разнообразие 0,025 +/- 0,015 0,020 +/-0,011 0,024 +/-0,013 0,024 +/-0,014 0,025 +/-0,016 0.028 +/-0,015 0,011 +/-0,007 0,031 н- 0,018 0,007 +/-0,005 0,027 +/-0,018 0,023 +/-0,013 0,030 +/-0,017 0,027 +/-0,022 0,000 +/-0,000

Примечание: собственные данные выделены жирным шрифтом.

В таблице 5 представлены сводные данные по числу замен, транзиций, трансверсий и нуклеотидному разнообразию для полученных нуклеотидных последовательностей контрольного региона мтДНК и для последовательностей из базы данных GenBank. Для анализа из 1756 последовательностей современных лошадей было отобрано 267, среди которых представлены все показанные авторами (Cieslak et al., 2010) гаплотипы и разнообразные породы. Наибольшее число замен было получено для монгольской популяции из пустыни Гоби и тувинской «Арыг-Хем», наименьшее — для лошади Пржевальского, что может быть связано с небольшим числом образцов и инбредной депрессией. Сайты с уникальными заменами были обнаружены в арабской, вятской, корейской чейю, китайской дебао, эксмур, польский коник, дуэлменер, лузитано, поттока и сицилийской выборках. Наибольшие значения нуклеотидного разнообразия были получены для сицилийской (0,030) выборки и лузитано (0,031), наименьшие - для лошади Пржевальского (0,000) и породы соррайа (0,007), которая находится на грани вымирания. Нуклеотидное разнообразие изучаемых популяций Саяно-Алтайского региона находится на высоком, не вызывающем опасения о статусе породы уровне (0,021-0,028). Обнаружены 4 горячие точки мутаций (15585, 15597, 15604 и 15650), которые уже были описаны в ряде работ (Jansen et al., 2002; Lei et al., 2009; Cieslak et al., 2010).

На основе полученных нуклеотидных последовательностей была построена дендрограмма (рис. 4) методом Neighbor Joining (Saitou, Nei, 1987) в программе MEGA 5.05. В качестве корня была использована нуклеотидная последовательность D-петли осла (Equus asinus) как близкородственного вида лошади домашней, дивергенция которого от общего предка произошла около двух млн. лет назад. Оценка надежности ветвей филогенетического дерева проведена с использованием бутстрэп-анализа (Zharkikh, Li, 1992а; Zharkikh, Li, 1992b; Zharkikh, Li, 1995) с использованием 1000 случайных выборок.

57 i-Тувинская «Арыг-Хем»

90

fr

51

88

Забайкальская L Монгольская север. Бурятская Монгольская центр.

Монгольская Гоби

. Осел домашний {Equus asinus)

0.005

Рисунок 4. Дендрограмма, построенная методом Neighbor Joining в программе MEGA 4.3 по данным нуклеотидных последовательностей для шести популяций лошадей. Над ветвями указаны значения бутстрэп-поддержки > 50.

На дендрограмме (рис. 4) отдельно выделяется северный кластер пород -тувинской, забайкальской, северномонгольской и бурятской популяций. Промежуточное положение занимает центральномонгольская популяция и отдельно кластеризуется монгольская популяция из Гоби. Использование двух типов молекулярных маркеров (полиморфизм нуклеотидных последовательностей D-петли мтДНК и ISSR-маркеров) с привлечением разных методов статистического анализа данных позволило выделить монгольскую лошадь из пустыни Гоби в отдельную группу.

На основе полученных нами и представленных в базе данных нуклеотидных последовательностей 409 современных лошадей из 28 выборок и 207 древних была построена медианная сеть в программе Network 4.6.1.0 (Fluxus Technology Ltd, Великобритания) методом MJ (Median Joining, Bandelt et al., 1999) и алгоритма MP (Polzin et al„ 2003), позволяющего убрать ненужные медианные векторы и связи (рис. 5). Все настройки были стандартными за исключением опции "frequency>l", при использовании которой отражаются только гаплотипы, которые встречаются в выборке более одного раза.

Обозначения гаплотипов соответствуют приведенным в работе Cieslak et al., 2010. Всего авторами было выявлено 87 гаплотипов мтДНК лошадей, из которых 48 встречались только у древних лошадей и не обнаружены у современных. Среди полученных нами образцов было выявлено 16 гаплотипов (А, В, В1, D, D2, D3, I, Gx4, К2, K2b, K2bl, Х2, Х2Ь, ХЗ, Х3с1, Х4а). Самыми распространенными гаплотипами являются Х2 и D3.

Х2Ь

G

Х2 group

Рисунок 5. Медианная сеть на основе 409 нуклеотидных последовательностей D-петли мтДНК современных лошадей и 207 древних. Гаплотипы указаны рядом или внутри кругов. Цветами обозначены различные выборки: желтым - образцы из базы данных, белым - древние, черным - монгольская выборка из Гоби, оранжевым -северомонгольская, розовым - центральномонгольская, сиреневым - тувинская, зеленым - забайкальская, синим — бурятская.

Как видно из представленной медианной сети большинство забайкальских образцов имеют гаплотипы X3cl, Х2 и D2. Для тувинских лошадей характерны гаплотипы X2b, D3 и А. У бурятских лошадей чаще встречаются гаплотипы I, D и D3; у монгольских Гоби -А, Х2Ь, и ХЗ; у центральномонгольских - Х2Ь, А и В1; у северомонгольских - D2, D3 и К2. Как было показано Cieslak et al. (2010) большинство гаплотипов не привязано к определенной породе или географической области, в различных популяциях различается лишь набор и частоты гаплотипов. Вероятно, это связано с многократными событиями доместикации, благодаря которым мтДНК лошадей так высокополиморфна, а также активным перемещением и разведением лошадей человеком.

Изучение частоты встречаемости однонуклеотидной замены (g.66493737C>T) в первом интроне гена миостатина (MSTN)

Полиморфные варианты гена MSTN, кодирующего отрицательный регулятор мышечного роста миостатин, ассоциированы с гипертрофией мышц у различных млекопитающих (КРС, собак, мыши и человека). Группой ученых (Hill et al., 2010b) была обнаружена новая однонуклеотидная замена (g.66493737C>T) в первом интроне гена миостатина, достоверно ассоциированная (Р=4.85><10-8) с лучшей дистанцией скачек среди выигравших элитных английских чистокровных лошадей. Животные с генотипом С/С по этому SNP больше приспособлены для коротких дистанций (1,000-1,600м), С/Т - для средних дистанций (1,400-2,400м), Т/Т - для длинных дистанций (>2,000м). Анализ последовательностей в области SNP g.66493737C>T показал, что различные нуклеотидные замены могут приводить к появлению предположительного сайта связывания транскрипционного фактора Homeobox C8/Hox-3alpha и/или разрушению предполагаемых сайтов связывания следующих транскрипционных факторов: Distal-less homeobox 3, E2F и Pdxl (Hill et al., 2010a).

С использованием метода Real-Time PCR Taqman были генотипированы различные популяции лошадей по мутации в гене миостатина (MSTN), приводящей к чрезмерному развитию мышц. Фенотип с сильно развитой мускулатурой и отличными спринтерскими качествами характерен для скаковых лошадей (английских чистокровных верховых - 4KB, четвертьмильных лошадей). 4KB были выведены путем скрещивания местных британских конематок с завезенными восточными жеребцами и с начала XVIII века подвергались интенсивной селекции с целью получения лучших скаковых лошадей (Lee et al., 2006). Представляло интерес выяснить, у предка из какой руппы пород впервые появилась эта мутация и распространилась вплоть до территории Англии и в дальнейшем Америки (Bower et al., 2012).

19

Таблица б. Данные генотипирования образцов ДНК различных пород лошадей по локусу 66493 73 7С> Т) в гене миостатжа__

Популяция Регион п Частота генотипов Частота локусов

С/С С/Т Т/Т С Т

Ецииь снтш Англия 40 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Е. Сгехуч, Е. циа^а Ъое1т\1 Чехия 2 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Др. лошадиные 42 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Коннемара Ирландия 22 0,05 0,09 0,86 0,09 0,91

Хайлэнд Шотландия 21 0,05 0,09 0,86 0,10 0,90

Шотландский 1 Шотландия 16 0,38 0,25 0,38 0,50 0,50

Шотландский2 Швеция 42 0,29 0,40 0,31 0,49 0,51

Британские острова 101 0,20 0,25 0,55 0,32 0,68

Ахалтекинская Россия/ Туркменистан 18 0,00 0,11 0,89 0,06 0,94

Анатолийская Турция 19 0,00 0,11 0,89 0,05 0,95

Арабская Египет 30 0,03 0,10 0,87 0,08 0,92

Фулани Камерун 18 0,11 0,44 0,44 0,33 0,67

Туркская Туркменистан 15 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Средняя Азия и Сев. Африка 100 0,03 0,15 0,82 0,10 0,90

Алтайская Алтай 25 0,08 0,36 0,56 0,26 0,74

Монгольская северная Монголия север 30 0,00 0,07 0,93 0,03 0,97

Монгольская Гоби Монголия пустыня Гоби 25 0,00 0,20 0,80 0,10 0,90

Забайкальская Сибирь 25 0,04 0,24 0,72 0,16 0,84

Тувинская АХ Тыва 25 0,00 0,20 0,80 0,10 0,90

Тувинская 1 Тыва 29 0,00 0,14 0,86 0,07 0,93

Якутская Якутия 18 0,00 0,06 0,94 0,03 0,97

Азия 177 0,02 0,18 0,80 0,11 0,89

ЧКВ <1400м СВЯКЕ/Ыг/ША 69 0,46 0,46 0,07 0,70 0,30

ЧКВ > 1800м ОВ/1ЯЕ/Ы7УШЛ 96 0,03 0,61 0,35 0,34 0,66

ЧКВ (Австр.) Австралия 123 0,38 0,51 0,11 0,64 0,36

ЧКВ ЮОО-ЗОООм ОВ/ИШ/Ыг/ША 207 0,22 0,57 0,21 0,51 0,49

Франц. рысак Франция 46 0,00 0,02 0,98 0,01 0,99

Исландская Исландия 21 0,05 0,24 0,71 0,17 0,83

Ирландский тяжеловоз Ирландия 30 0,07 0,27 0,67 0,20 0,80

Четвертьмильная США 35 0,83 0,14 0,03 0,90 0,10

Стандартбредная США/Канада 63 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Примечание: собственные данные выделены жирным шрифтом.

Совместно с ирландскими коллегами из лаборатории Equine Science университета University College Dublin было осуществлено определение SNP (g.66493737C>T) в гене миостатина для изучаемых нами популяций аборигенных лошадей и других пород лошадей, а также ослов и зебр (табл. 6).

У зебры и осла не было обнаружено SNP g.66493737C, что позволяет сделать вывод о том, что более древним (диким типом) является именно Т-замена. Это согласуется с травоядным образом жизни диких лошадей, при котором им приходится преодолевать большие дистанции по равнинам в поисках лучших пастбищ.

У лошадей из Средней Азии и Северной Африки SNP g.66493737C встречается с частотой от 0,00 до 0,11 (средняя частота 0,03), таким образом, показано, что восточные лошади (в основном арабские) не являлись источником данной мутации при выведении английских чистокровных верховых (4KB). Судя по представленным данным, именно местные британские конематки привнесли SNP g.66493737C в чистокровную верховую породу.

SWEDEN

RUSSIA

FINLAND

■'im

NORWAY

британские

конематки . ;

¡¡цпщ««* ħ||i

BELARUS

Щ GERMANY

POLAND

UKRAINE KAZAKHSTAN MONGOLIA

MOUXX«, .

J . кошт.

. . - r

4 SPAIN .ITALY -ш --—. ; ..

, внаесЕ TURKEY p>

V" ... . ' SYRIA

IRAQ IRAN

EGYPT SAUDI

ARABIA

»

CHINA

□ C/C ■ C/T

aJ/T

Рисунок 6. Частоты генотипов гена миостатина в различных выборках лошадей. Белым обозначен генотип С/С, черным С/Т и серым Т/Т.

Среди алтайских, монгольских, тувинских и забайкальских лошадей мутантная замена «С» встречается с более низкой частотой (от 0,03 до 0,26, средняя частота 0,11), чем у британских пород. Лошади с генотипом «СС» практически не встречаются, за исключением одной лошади забайкальской породы и двух - алтайской, что свидетельствует о возможном давлении отбора. Скоростные качества для лошадей живущих фактически в естественных условиях обитания не являются ключевыми, гораздо важнее является выносливость и способность выжить в зачастую не легких условиях. Таким образом, скоростной БИР-маркер «С» стал преобладать (частота от 0,34 до 0,90) в породах скаковых лошадей после целенаправленного отбора человеком и не является типичным для диких популяций лошадей.

выводы

1. ISSR-маркеры, разработанные с использованием праймеров к тринуклеотидным повторам, более информативны для исследования генофондов лошадей, чем маркеры на основе динуклеотидных повторов, в отличие от других видов сельскохозяйственных животных. Наиболее высокие значения полиморфного информационного содержания (PIC) были получены для ISSR-маркеров с праймерами (GAG)6C и (ACC)6G- 2,50 и 3,61 соответственно.

2. Наиболее высокий уровень генетического разнообразия (по Нею) показан для алтайской популяции «Амальдива» и тувинских лошадей из хозяйств «Ямаалыг» и «Кошкорлыг» среди 15 исследованных популяций шести пород лошадей (монгольской, тувинской, алтайской, забайкальской, бурятской и астраханской) по GAG- и ACC-ISSR маркерам. Сниженный уровень генетического разнообразия отмечен для бурятской, астраханской и алтайской популяции «Чингиз».

3. Выявлены гаплотипы мтДНК, идентичные древним гаплотипам лошадей Китая и Монголии среди монгольской, забайкальской, бурятской и тувинской пород лошадей при анализе нуклеотидной последовательности гипервариабельного контрольного региона мтДНК (D-петли) для 142 образцов из шести выборок (трех монгольских: из пустыни Гоби, центральной и северной Монголии; тувинской «Арыг-Хем», забайкальской и бурятской). В целом показан высокий уровень полиморфизма исследованных нуклеотидных последовательностей при сравнении с ранее изученными образцами (база данных GenBank).

4. Продемонстрирована высокая степень генетического отличия монгольской популяции из Гоби от остальных исследуемых популяций по совокупным данным анализа последовательностей D-петли мтДНК и ISSR-анализа, которая может являться результатом изоляции, искусственного и естественного отбора на фоне специфических условий обитания.

5. Впервые у аборигенных пород лошадей Саяно-Алтайского региона продемонстрировано наличие С-варианта однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина, ассоциированного с высокими скоростными качествами лошадей, с частотами от 0,03 до 0,26 (средняя частота 0,11), хотя в естественной среде для лошадей более важным качеством является выносливость, а не скоростные качества.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Сулимова Г.Е., Столповский Ю.А., Кол Н.В., Рузина М.Н., Воронкова В.Н., Ахани Азари М., Лазебный О.Е. Применение межмикросателлитного анализа ДНК (ISSR-фингерпринтинга) для оценки консолидированности и чистоты пород сельскохозяйственных животных // 7-я Международная научная конференция-школа «БиоТехЖ-2008», 2008.

2. Воронкова В.Н., Сулимова Г.Е. Анализ генетического разнообразия лошадей турано-монгольского корня с использованием ISSR-фингерпринтинга // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, Москва, 21-28 июня 2009 г, часть I, с.70.

3. Voronkova V. and Sulimova G. Estimation of the genetic diversity level in local populations of Turano-Mongolian horse breeds. Book of abstracts of the 62nd Annual Meeting of the European Federation of Animal Science. 2011. P. 186.

4. Воронкова B.H., Сулимова Г.Е. Международная молодежная конференция «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» посвященная памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова. 2011.С. 198.

5.* Столповский Ю.А., Ахани Азари М., Евсюков А.Н., Кол Н.В., Рузина М.Н., Воронкова В. Н., Сулимова Г.Е. Сравнительный анализ полиморфизма ISSR-маркеров у пород крупного рогатого скота II Генетика. 2011. Т. 47, №2. С. 213226

6* Столповский Ю.А., Ахани Азари М, Евсюков А.Н., Кол Н.В., Рузина М.Н., Воронкова В.Н., Сулимова Г.Е. Дифференциация пород КРС с использованием данных мультилокусного межмикросателлитного анализа (ISSR) // Сельскохозяйственная биология. 2011. № 4. С. 36-45.

7.* Воронкова В.Н., Цэндсурэн Цэдэв, Сулимова Г.Е. Сравнительный анализ информативности ISSR-маркеров для оценки генетического разнообразия пород лошадей / Генетика. 2011. Т.47. №8. С. 1131-1134.

8. Сулимова Г.Е., Кол Н.В., Рузина М.Н., Столповский К.Ю., Воронкова В.Н., Бояринцева И.С., Столповский Ю.А. Разработка универсального метода оценки генетического разнообразия и паспортизации пород и популяций доместицированных видов животных II Молекулярная и прикладная генетика. Сборник научных трудов. 2011. Т.12. С.19-27.

9.* Bower М.А., McGivney В.А., Сатрапа M.G., Gu J., Andersson L.S., Barrett E., Davis C.R., Mikko S., Stock F., Voronkova V., Bradley D.G., Fahey A.G., Lindgren G., Machugh D.E., Sulimova G., Hill E.W. The genetic origin and history of speed in the Thoroughbred racehorse // Nature Communications. 2012. №3. doi: 10.1038/ncomms 1644.

* - статьи в журналах, рецензируемых ВАК.

Заказ № 115-П/04/2012 Подписано в печать 19.04.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,25

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронкова, Валерия Николаевна, Москва

61 12-3/911

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова

ВОРОНКОВА ВАЛЕРИЯ НИКОЛАЕВНА

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОШАДЕЙ САЯНО-АЛТАЙСКОГО РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК МАРКЕРОВ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.07 - генетика

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор, Сулимова Г.Е.

МОСКВА 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Использование генетических маркеров для изучения генетического разнообразия пород лошадей 9

1.1.1. Биохимические маркеры 9

1.1.2. Метод амплификации ДНК при помощи полимеразной цепной реакции 11

1.1.3. Микросателлиты 12

1.1.4. Полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs) 14

1.1.5. Мул ьтил окусные ДНК-маркеры 17

1.1.5.1. RAPD маркеры 17

1.1.5.2. Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры) 19

1.1.5.3. ISSR-фингерпринтинг 20

1.1.6. Анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК 22

1.2. Лошади и их генетическое разнообразие 25 1.2.1. Происхождение и одомашнивание лошади 25

1.2.3. Современное коневодство Российской Федерации 41

1.2.4. Генетическое разнообразие лошадей 43

1.2.5. Аборигенные породы лошадей Саяно-Алтайского региона 51

1.2.5.1. Монгольские лошади 52

1.2.5.2. . Бурятские лошади 55

1.2.5.3. Тувинские лошади 56

1.2.5.4. Забайкальские лошади 57

1.2.5.5. Алтайские лошади 58

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 60

2.1. Объекты исследования 60

2.2. Реагенты 61

2.3. Оборудование 62

2.4. Выделение ДНК 62

2.5. Определение концентрации выделенной ДНК 64

2.6. Проведение ПЦР 64

2.7. Приготовление 2%-ного агарозного геля 65

2.8. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР 65

2.9. Определение размера и количества фрагментов в ISSR-ампликонах 66

2.10. Секвенирование гипервариабельного района мтДНК 67

2.11. Определение нуклеотидной замены (g.66493737C>T) в гене миостатина 68 методом TaqMan Real-Time PCR

2.12. Статистическая обработка 70

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 72

3.1. Сравнение информативности различных ISSR маркеров 72 для оценки генетического разнообразия лошадей

3.1.1. Характеристика спектров ISSR фрагментов, полученных

с праймерами к динуклеотидным повторам 72

3.1.2. Характеристика спектров IS SR фрагментов, полученных

с праймерами к тринуклеотидным повторам 79

3.2. Оценка генетического разнообразия лошадей с использованием ISSR-маркеров 83

3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей D-петли мтДНК лошадей 105

3.4. Изучение частоты встречаемости однонуклеотидной замены (g.66493737C>T) в первом интроне гена миостатина (MSTN) 113 Заключение 118

4. ВЫВОДЫ 121 Список использованной литературы 123 Приложение 141

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КРС - крупный рогатый скот

4KB - чистокровная верховая порода лошадей

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

мтДНК - митохондриальная ДНК

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ПДРФ - RFLP - restriction fragment length polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - Polymerase Chain Reaction - полимеразная цепная реакция RAPD PCR (или AP-PCR - Arbitrarily Primed PCR) - random amplified polymorphic DNA, polymerase chain reaction - полимеразная цепная реакция со случайными праймерами

DAF - DNA Amplified Fingerprinting - фингерпринтинг на основе амплификации ДНК

УП ПЦР - ПЦР с универсальными праймерами

AFLP - amplified fragment length polymorphism - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов

ISSR - inter-simple sequence repeat - межмикросателлитный полиморфизм STR (или STMS - Sequence Tagged Microsattelite Site, SSR - simple sequence repeat) - short tandem repeat - короткие тандемные повторы, микросателлиты IRAP - inter-retransposon amplified polymorphism - межтранспозонный полиморфизм

ISAG - the International Society for Animal Genetics - Международное Общество Генетики Животных

PIC - polymorphism information content - полиморфное информационное содержание

AMOVA - analysis of molecular variance - анализ молекулярного разнообразия

Введение

Актуальность темы. Изучение полиморфизма пород лошадей имеет большое значение для поддержания разнообразия в популяциях, улучшения селекционной работы и определения их происхождения. Особенно важным является исследование аборигенных пород лошадей, имеющих в своем геноме редкие аллели и являющихся выносливыми и хорошо приспособленными к условиям среды обитания. Монгольская лошадь была приручена около 6000 лет назад и благодаря походам Чингиз-хана и его потомков приняла участие в формировании многих пород на территории Европы и Азии. Она является аборигенной породой и разводится только в монгольских степях, в связи с чем, плохо изучена. Бурятская, алтайская, забайкальская и тувинская породы лошадей также являются аборигенными и даже в наши дни они остаются незаменимыми благодаря приспособленности к суровым условиям обитания.

В начале XX века в России насчитывалось более 20 млн голов лошадей (Статистический ежегодник, 1915; Статистический ежегодник, 1916; Предварительные итоги..., 1916). В период революционных потрясений и гражданской войны часть поголовья была истреблена и численность сократилась до 12,6 млн лошадей к 1922г. За годы Великой отечественной войны поголовье лошадей сократилось более чем вдвое и составило в 1946г. всего 5,2 млн. К 1980г. сохранилось лишь 2,5 млн лошадей. В настоящее время численность конного поголовья составляет 1,3 млн (Федеральная служба государственной статистики, 2008). Таким образом, в течение XX века поголовье лошадей уменьшилось более чем на порядок.

Резкое снижение численности поголовья лошадей в XX веке не могло не отразиться на уровне генетического разнообразия, в связи с чем, необходимо использовать современные подходы для оценки и поддержания высокого уровня генетического разнообразия для сохранения пород во избежание неблагоприятных последствий инбридинга и эффекта «бутылочного горлышка».

Одним из наиболее эффективных подходов оценки генетического разнообразия популяций является использование молекулярных маркеров ДНК. Наиболее информативными для популяционно-генетических исследований являются мультилокусные ДНК маркеры, позволяющие одновременно изучать большое число локусов. Анализ последовательностей мтДНК позволяет определять происхождение и генетическое сходство пород по материнской линии. Различные варианты аллелей гена миостатина (MSTN) определяют скоростные качества и выносливость лошадей. Представляет интерес выяснить, какие аллели и генотипы преобладают у аборигенных пород лошадей.

При сохранении пород in situ основная задача состоит в том, чтобы сохранить специфические генные комплексы и сбалансированную систему генов и аллелей, которые обуславливают фенотипические породные характеристики, связанные с экстерьерными особенностями, продуктивностью, жизнеспособностью, резистентностью животных. Именно вышеперечисленные особенности, отличающие местные породы от широко распространенных импортных пород, необходимо сохранять в генофондных хозяйствах (Столповский, 2010).

Недостаточная изученность лошадей Центральной и Восточной Азии не позволяет точно локализовать основные области, где начался процесс доместикации. Если оценка генетического разнообразия лошадей в данных регионах позволит выявить популяции с более высоким уровнем полиморфизма (большим числом аллелей, гетерозиготности) чем у популяций из других областей Евразии (с учетом соответствующих археологических и исторических данных), то это может свидетельствовать о том, что именно там началось одомашнивание и оттуда в дальнейшем пошло распространение лошадей (Warmuth et al., 2011).

Целью данной работы было изучение генетического разнообразия

лошадей (.Equus caballus) монгольской, алтайской, забайкальской,

астраханской, бурятской и тувинской пород на основе мультилокусного

6

межмикросателлитного анализа ДНК и анализа нуклеотидной последовательности мтДНК, а также типирования исследуемых образцов по однонуклеотидной замене (БЫР: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина.

Для выполнения цели работы были поставлены следующие задачи:

1) Сравнить информативность ШЫ-маркеров, полученных с использованием различных праймеров, для изучения полиморфизма лошадей.

2) Оценить генетическое разнообразие монгольской, алтайской, забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород лошадей на основании результатов ^Я-анализа.

3) Определить нуклеотидную последовательность фрагментов гипервариабельного района мтДНК монгольской, алтайской, забайкальской, бурятской и тувинской пород лошадей.

4) Оценить генетическое разнообразие и филогенетическое сходство исследуемых пород лошадей.

5) Провести типирование изучаемых образцов по гену миостатина (МБТЫ), оценить частоты нуклеотидных замен и генотипов и сравнить их с частотами у других изученных пород.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

За последние пять тысяч лет лошадь сыграла более важную роль, чем любое другое одомашненное животное, в развитии человеческого общества. Разведение лошадей в неволе привело к появлению множества различных пород, отличающихся размерами, скоростью передвижения и выносливостью. В сельской местности лошади все еще остаются неотъемлемой частью уклада жизни человека, не говоря уже о том, что во всем мире лошади незаменимы для занятий спортом и отдыха.

На сегодняшний день известно более 400 пород лошадей, но фенотипически различаются они не так четко, как породы, например, собак. Породы лошадей представляют собой результаты селекции, направленной на выведение разнообразных типов, мастей и скоростных качеств. Все породы лошадей делятся на аборигенные, переходные и заводские. В свою очередь, аборигенные породы подразделяются на степные, горные и лесные. По характеру использования заводские и переходные делятся на тяжеловозные, упряжные, рысистые, верховые и верховоупряжные. Местные породы лошадей хорошо приспособлены к местным условиям и по этой причине у себя дома нередко оказываются эффективнее многих прославленных заводских пород.

Изучение генома лошадей и генов, контролирующих интересующие человека свойства, призвано значительно увеличить эффективность селекции (1лпс1§геп, 2001). Размеры популяций многих пород лошадей значительно снизились в девятнадцатом и в начале двадцатого веков (БоНз е1 а1., 2005). Подобно другим видам домашних животных, некоторые породы лошадей оказались на грани вымирания ввиду несоответствия современным требованиям сельского хозяйства и другим нуждам человека. Характеристика генетической структуры популяций может стать первым шагом к сохранению и восстановлению породы и внести вклад в ее дальнейшую селекцию (Тшапсгук е1 а1., 2006).

1.1. Использование генетических маркеров для изучения разнообразия пород лошадей

Первоначально в качестве генетических маркеров использовались фенотипические признаки, однако, количество информативных маркеров такого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды (Mohan et al., 1997). Были изучены изменчивость и наследуемость показателей резвости и экстерьерных характеристик у лошадей Орловской рысистой породы. Уровень полиморфизма показателя резвости очень высокий (45,5-46,7%), что может свидетельствовать о значительной вариабельности признака и, как следствие, о сильной зависимости его от условий внешней среды - содержания, кормления и тренинга. Коэффициент наследуемости показателя резвости колебался от 10 до 11,2%, что значительно ниже, по сравнению с экстерьерными признаками (от 12 до 39%) (Майборода, 1998).

Развитие молекулярных методов исследований позволило анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генов (белковый или биохимический полиморфизм) и генетического материала клетки (полиморфизм ДНК).

В настоящее время молекулярные маркеры используются для изучения происхождения пород и выявления различий между отдельными особями, а также популяциями, породами и более высокими таксономическими единицами.

1.1.1. Биохимические маркеры

Первые молекулярные маркеры были созданы на основе анализа белкового полиморфизма, обусловленного наличием различных молекулярных форм белка. Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволило оценить уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизма до человека) и разработать

основные теоретические положения популяционной генетики (Алтухов, 2003; Ayala, 1976, 1983; Nei, 1987).

С 1969 г. в ВНИИ Коневодства проводились работы по определению полиморфизма белков и иммуногенетических маркеров для контроля достоверности происхождения лошадей. В 1974 г. Дубровской P.M. разработан метод иммуногенетического контроля достоверности происхождения лошадей, одобренный НТС МСХ СССР 29.03.74 г. и утвержденный МСХ СССР. По этому вопросу издано "Временное положение по контролю происхождения лошадей по полиморфизму белков крови". Этой же группой ученых было проведено исследование генетической дифференциации пород лошадей по полиморфным локусам белков крови (Дубровская и др., 1992).

Однако анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. Учитывая, что у высших эукариот только 1% генома составляют кодирующие белок последовательности, очевидно, что большая часть генома ускользает от внимания исследователя. При этом не рассматриваются такие функционально значимые участки, как промоторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранслируемых областях генов, а также вне генов. Возможности метода лимитируются также низким уровнем белкового полиморфизма в популяциях домашних животных и культурных растений, ограничениями в выборе биологического материала (Сулимова, 1993, 2004). Низкий уровень белкового полиморфизма обусловлен также консервативностью последовательностей, кодирующих ферменты, т.к. мутации могут привести к неправильной работе или даже потере функции необходимых ферментов. Возникновение в популяции адаптивной формы фермента может привести к полному замещению других аллелей и, следовательно, уменьшению уровня полиморфизма (см. обзоры Сулимова, 2004,2006).

Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие. Помимо этого данная маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма. Остановимся на описании ДНК маркеров наиболее часто используемых в наше время для анализа полиморфизма.

1.1.2. Метод амплификации ДНК при помощи полимеразной цепной реакции

Мощным импульсом для создания новых типов ДНК-маркеров стало изобретение Кэри Мюллисом в 1983 г. метода амплификации in vitro определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полимеразной реакции (ПНР - полимеразная цепная реакция, англ. PCR - Polymerase Chain Reaction). В 1985 г. этот метод был впервые применен на практике для амплификации участка гена бета-глобина с помощью Большого фрагмента ДНК-полимеразы (фрагмента Кленова) (Saiki et al., 1985). Широкое распространение ПЦР началось с момента публикации в 1988 г. основополагающей работы (Saiki et al., 1988), в которой авторы использовали термофильные ДНК-полимеразы и рассмотрели теоретические основы метода. Эта статья в 1988-89 гг. стала наиболее цитируемой, а в 1993 году Кэри Мюллису была присвоена Нобелевская премия за изобретение метода ПЦР.

Метод ПЦР позволяет быстро и с небольшими затратами материальных ресурсов и времени получить более 10 миллионов копий определенной последовательности ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. Различные модификации метода ПЦР легли в

11

основу создания разнообразных типов ДНК-маркеров, широко используемых в настоящее время в различных областях биологии и медицины.

1.1.3. Микросателлиты

Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Подобно минисателлитам, микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетра-нуклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п.н.) (Litt, Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber, May, 1989). Эти маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat). Для создания маркеров на основе STR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется