Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния эритропоэтина человека и продуктов регуляторных генов ВИЧ на кроветворение у трансгенных мышей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния эритропоэтина человека и продуктов регуляторных генов ВИЧ на кроветворение у трансгенных мышей"

РГО о л

я

ГЬ > \ ' . ' - . )

российская академия сельскохозяйственных наук всероссиискш научно-исследовлтельския институт

сельскохозяйственной биотехнологии

На правах рукописи

мудрик николаи николаевич

изучение влияния эритропоэтина человека и продуктов регуляторных генов вич на кроветворение у трансгенных шлеи

( 03.00.03. - молекулярная биология )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики" ретровирусов и СПИДа Института молекулярной генетики РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, В.3.Тарантул

, ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, Б.С.Народацкий кандидат биологических наук, О.А.Ларионов

РЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: '

Медик о-генетический научные цбнтр РАШ

Защита сосотоится ■__ 1994 г. в "_на

заседании Специализированного ученого совета Д.020.40.01; при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (12*5550. Москва, ул. :Тширязевокая" 42 ')

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ВШИ

✓

сельскохозяйственной биотехнологии.

1993 г.■

С.А.Меликова

Автореферат разослан'

Учений секретарь СпециалнзироЕанного совета,-кандидат биологических наук

Актуальность темы. Кроветворная система, являющаяся одной из немногих систем взрослого организма, в которой происходит активная пролиферация и дифференцировка клеток, находится под сложным гормональным контролем и способна чутко реагировать на изменение гомеостаза, различного рода заболевания, а также на многочисленные внешние воздействия, включая такие как вирусные инфекции. Осебенно пристальное внимание в последнее время уделяется вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ),-являщемуся этиологическим агентом такого серьезного заболевания как СПИД. Известно, что под воздействием ВИЧ возникает ряд гематологических аномалий. В первую очередь следует отметить уменьшение CD4+ Т- лимфоцитов. Кроме того имеет место цитопения, которой страдают до двух третей пациентов; анемия, которой подвержены приблизительно IOX ВИЧ-инфицированных в начальный период заболевания и далее в процессе болезни анемия развивается приблизительно у 70% пациентов; костно-мозговая гиперклеточность, миелодисплазия и уменьшение абсолютного количества костно-мозговых предяед-ственников при исследовании in vitro. У ВИЧ-инфицированных больных часто наблюдается патология лимфоидной системы, проявляющаяся в возникновении различных форм В- и Т-клйТочных лиыфом. Кроне того описаны отдельные случаи гемофагоцитарного синдрома и полицитемии. Частота таких нарушений свидетельствует >66 аномальном гемопоэзе при ВИЧ-инфекции.

Однако. причины -этих разнообразных патологий кроветвер-ной системы остаются неизвестными, поскольку, во-первых, в процессе развития ВИЧ-инфекции и заболевания СПИДом больной подвергается целому ряду сопутствующих заболеваний, которые образуют СПИД-связанный комплекс инфекций и, которые в свою очередь влияют на гемопоэз. Во-вторых, не последнюю роль играет проводимая в течение заболевания терапия. А, в-третьих, влияние ВИЧа на' клетки костного мозга а периферической крови может быть непрямым.

Кроме того, результаты, полученные при анализе ВПЧ-юфщированных больных, когда проявляется аддитивное действие множества вирусных генов, не позволяют четко

f

определить эффект каждого из них.

Для решения вопроса о значении отдельных генов ВИЧ в развитии СПИДа и связанного с ним комплекса аномалий необходимо проведение исследований на новых моделях. Наиболее подходящей моделью для исследования действия отдельных генов в системах in vivo являются трансгенные животные. Следует отметить, что на этой модели уже предпринимались успешные попытки изучить влияние на организм различных клеточных. продуктов, а также целого генома ВИЧ и ■ некоторых отдельных генов ВИЧ.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась, во-первых, в том, чтобы используя модель трансгенных мышей, продемонстрировать влияние на их гемопоэз такого гена как ген эритропоэтина человека, функция которого известна, но имеющего сложную систему регуляции. Во-вторых определить возможное влияние на гемопоэз у трансгенных животных отдельных регуляторных генов ВИЧ-1, наиболее интересными из которых представляется уникальный для лентивирусов приматов ген neí, высоко экспрессирующийся по сравнению с другими регуляторными генами ВИЧ, но функция которого до сих пор окончательно не ясна, и ген tat, являющийся сильным трансдействующим активатором транскрипции и обладающий кроме всего прочего онкогенным потенциалом.

Научная новизна работы. В ходе выполнения настоящей работы впервые были получены трансгенные мыши, несущие. ген эритропоэтина под контролем собственного промотора и промотора 1,5 LTR RSV (длиный терминальный повтор вируса саркомы Рауса). У трансгенных мышей исследована экспрессия этого гена на уровне белкового продукта и показано влияние экспрессии на состав клеток костного мозга и отсутствие влияния трансгена на состав клеток крови. •

Сконсруирована плазмида MTtat, EcoRI/PstI-фрагмент которой использован для получения трансгенных мышей. Получены трансгенные мыши, несущие ген tat ВИЧ-1. Показано, что развитие аденокарцином у трансгенных мышей не влияет на состав клеток крови и костного мозга.

Впервые получены трансгенные мыши, несущие ген neí ВИЧ-1. Показано изменение пула кроветворных клеток и клеток

крови вследствие экспрессии трансгена.

Апробация работы. Основные этапы работы были доложены на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (г.Пущино, 1990г.), на УШ-ой Международной конференции по СПИДу и заболеваниям, передающимися половым путем (г. Амстердам (Нидерланды), 1992 г.), на Международной конференции "С1Щ, рак и ретровирусы человека (Санкт-Петербург, 1992 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах текста й состоит из введения, обзора литературы, главы ' "Материалы и методы", результатов исследования, выводов и списка источников литературы.. Работа проиллюстрирована 6 таблицами и 19 рисунками. Список цитируемой литературы включает 154 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Анализ трансгенных.мышей, содержащих ген'эритропоэтина.

ТрансгеннЫх мышей получали с помощью микроинъекции фрагментов ДНК в'зиготы мышей, полученных от скрещивания С57В и СВА. Плазмида ИЗУйЕро (предоставлена Крамеровой И.А., Институт биомедицинской технологии Минздрава СССР, Москва) была создана на основе вектора рШ319 и состояла из Вв1;Е11/В£111- фрагмента, содержащего структурную часть гена ЭПО человека, терминатора из ДНК вируса гепатита человека и в кэчесве регулятора транскрипции использовали длинный концевой повтор (ЬТИ) вируса саркомы Рауса (ИБУ) (ЬТИ ИБУ из плазмида рРгС 11). Для микроинъекций использовали Н1п<ЯП/5ас1-фрагмент плазмида К5Ус1Еро, не содержащий' векторную последовательность. В этом фрагменте , имеющем размер 3,8 т.п.н., присутствует единичный сайт ЕсоМ, который расположен в ЬТИ. Схема фрагмента представлена на рис. 1. Анализ ДНК 79-ти животных, родившихся у приемных самок из микроинъецированных зигот ^-поколение), проводили с помощью гибридизации в точках, а затем с помощью блот-гибридизации с плазмидой pPrC-l.5I.TR. Дальнейшую работу проводили с мышью N44 и ее потомством, полученным в результате скрещивания с интакткыми мышами.

1.5 ген ЭПО терм. - вируса гепатита

Н1пс! III

Рис. 1. Схема фрагмента, использованного для получения трансгенных мышей.

14,412.05,04.34.62,85-

Рис, 2. Б/ют-гибридизация меченоП ["Р]-рРгС-1,5 ИЯ с ДНК, рестрииированной ЕсоШ.

1 - положительный контроль (Н!п<1111/5ос1-^рог«внт плоэмиды ЯЬУЛЕро в количеств* I копия на гаплоидный геном); 2 - ДНК контрольной мыши: 3,4 - ДНК опытной мыши N44, рестрииированной ЕсоР1 и Н!пйШ соответственно; молекулярные массы в т. п. н. (Р5И-фрагменты ДНК А).

' Результаты блот-гибридизации с ДНК пиши N44 приведены на рис. 2. Полученные данные свидетельствуют об интеграции с геномом мыши HindIir/SacI-фрагмента, содержащего ген ЭПО, , поскольку размер обоих фрагментов, образующихся при рестрикции EcoRI ( в исходном фрагменте ДНК имеется 1 сайт, расположенный в LTR RSV), и Фрагмента, выявленного при рестрикции Hindlll (в исходном фрагменте нет сайта Hindlll ), превышал размер переносимого Фрагмента ДНК. Мышь N44 (самка) скрещивали с контрольными самцами и получали потомство. Трансгенных мышей Fj-поколения выявляли с помощью гибридизации в точках. Трансген обнаруживался у более .40% животных Fj-поколения, т.е. его наследование было близко к менделев-скому, что также свидетельствует об иинтеграции трансгена с геномом мыши. В результате скрещиваний всего было получено 120 потомков.

Как. показало определение ЭПО в сыворотке крови у всех трансгенных животных, являющихся потомками мыши N44, имеется высокий уровень гормона (Табл. 1). В то "же время у контрольных животных уровень ЭПО не превышал 20 мед/мл (предел чувствительности метода 10 мед/мл ), что соответствует литературным данным. Уровень биологически активного ЭПО у трансгенных животных превышает уровень ЭПО у контрольных мышей в 2,5-7,5 раз.

Такое же или менее заметное увеличение уровня ЭПО происходит и у трансгенных мышей, содержащих ген ЭПО под контролем собственного промотора и терминатор - Т-антигена SV 40. Эти животные также были получены в' процессе выполнения работы. В данном случае было получено 28 мышей после микроинъекций в зиготы линейного фрагмента Hindlll/EcoRI плазмида pSVEpo (плазмида любезно предоставлена С.А. Колобковым, МПЦ медицинской биотехнологии МЗ РФ). Пять из этих мышей оказались трансгенными по данным гибридизации в точках. Зондом для гибридизации служила плазмида pSV2. ЭПО тестировали у 5 мышей F(-поколения, потомков одной из трансгенных мышей (N 155). Уровень биологически активного ЭПО в сыворотке таких животных, хотя достоверно превышал контроль,* оказался .в среднем ниже соответствующего уровня ЭПО трансге.нных животных с геном ЭПО под контролем LTR RSV. По этой Причине в дальнейшем

Таблица 1.

Концентрация ЗПО, гематокрит и содержание гемоглобина в эритроцитах у нормальных и трансгенных мышей различного возраста

Г NN Дот эритропоэтин (мед/мл) гематокрит(%) гемоглобин (усл.ед)

1,5 м-ца 2,5 м-ца 3,5 м-цс 1,5 м 2,5 м 3,5 м 1,5 м-ца 2,5 м-цс 3,5 м-ца

44 + не изм. не ИЗМ. * не изм. не изм. 51 не изм. не ИЗМ. 31.8

462 + 150 * 50 56 51 '41 30.9 33.1 39.8

465 + 50 120 80 56 50 45 21.9 33.8 26.0

444 + 80 80 80 58 44 46 29.0 28.8 38.4

к, — <10 <10 20 63 45 48 33.2 33.1 31.1

к2 — <10 <10 <10 54 48 42 34.7 38.9 20.2

Кз —• <10 <10 <10 52 52 48 35.0 33.1 45.3

* кривая титрования превышает в низком титре контроль, но снижается по мере увеличения титра

анализировали только трансгенных мышей с геном ЭПО под контролем промотора 1,5 ЬТЯ К>У.

Следует отметить, что уровень ЭПО у трансгенных животных, несущих ген ЭПО под контролем 1,5 ЪТК ЯБУ, не является постоянным и иногда меняется в разные сроки наблюдения. Кроме того, в двух случаях наблюдалась обратная корреляция между увеличением процента сыворотки в образце и числом делений культивируемых клеток селезенки, по которому оценивали уровень ЭПО в крови (эти случаи указаны в табл. 1). Такая нестабильность' тестируемого ЭПО у трансгенных мышей может быть связана прежде всего с включением механизмов обратной связи. Нельзя исключить также присутствие в сыворотке таких животных различных ингибиторов, затрудняющих тестирование гормона. Несмотря на то, что уровень сывороточного ЭПО не во всех случаях можно было достоверно оценить, тем не менее ЭПО всегда оказывает заметное влияние на состав клеток костного мозга (см. рис. 3).

Для проверки биологического эффекта человеческого ЭПО у трансгенных мышей и у интактных животных также были определены гематокрит, содержание гемоглобина в эритроцитах и содержание .ретикулоцитов в периферической- крови (см. табл. 1). Никакого достоверного отличия в средних и дисперсиях этих величин не было обнаружено. Возможно более изощренный анализ периферической крови покажет какие-либо изменения, но в наших исследованиях даже у трансгенных мышат в возрасте 7-28 дней такой показатель, как процент ретикулоцитов в периферической Крови, достоверно не отличался от контрольных .

Наблюдаемое нами снижение процентного содержания периферических ретикулоцитов с возрастом является известным фактом. Таким образом, даже значительное увеличение уровня биологически активного ЭПО не приводит к пролонгированным изменениям в составе периферической крови.

Вместе с тем, при исследовании клеток костного мозга трансгенных мышей при отсутствии каких-либо дополнительных воздействий обнаружены значительные изменения в эритроне этих животных (рис. 3). В среднем количество клеток эритроид-ного ряда увеличилось более чем в 3 раза по сравнению с конторольными животными. Причем наибольшее статистически

Проэритроблосты "Л)'"!^ ' Баз.эритробласты

и1 3.433

Полихром.эритробл. -Щ3.1.667. к к к ¡,,1) 5 367

Нормобласты ^^

.....ё1 6.6

Ретикулоииты Миелоилн. клетки Эритроилн.клетки Лимфоииты

Миелоилн/'эритроилн - ЯЯI ^^

Р.0.76/

50 100

контрольные мыш.ШЗ транстенные мыши

Рис. 3. Процентное содержание клеток костного мозга мышеП.

- О w

достоверное увеличение произошло в количестве нормобластов и ретикулоцитов, т.е. неделящихся клеток.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что костный мозг является достаточно закрытой системой. Даже такое существенное увеличение концентрации ЭПО в сыворотке трансгенных мышей, которое наблюдалось в наших экспериментах, сильно изменяющее параметры этой системы и выводящее ее в новое функциональное состояние, не отражается на состоянии периферической крови трансгенных животных.

Приведеннные результаты, а также данные других авторов, которые появились в литературе параллельно с нашими, указывают на то, что кроветворная система у мышей активно реагирует на трансген человеческой природы и, таким образом, может быть удобной моделью для исследования функции генов, которые возмокно оказывают влияние на гемопоэз.

Получение и анализ трансгенных мышей с регуляторными генами

ВИЧ-1.

■ Трансгенные мыши с геном tat.

Для получения трансгенных мышей, содержащих ген tat, была сконструирована плазмида pMTtat,. EcoRI/Pstl фрагмент которой использовался для микроинъекций;в зиготы.

На рисунках 4 А и Б представлена^схема конструирования плазмиды pMTtat, содержащей промоторную область металлотиони-нового гена мыши (MT-I), ген tat о интроном (из провируса HIVHXB2j и LTR БИЧ-1,.а также бактериальные последовательности:, место начала репликации (ориджин fl orí), ген устойчивости к аыпицилину (Ашр R) и некоторые другие гены, которые стабилизируют структуру плазмиды (например Lac Z и Lac I).

На первом этапе конструирования из плазмиды pRIP7 (любезно предоставленной доктором Kim), содержащей полную копию провируса ВИЧ-1 (НХВ2), вырезали EcoRI/Bajifll-фрагмент с геном tat и лигировали его с EcoRI/BamHI-фрагментом плазмиды pBS (рис. 4.А). Причем в полученной таким образом плазмиде pBStat (содержащей полную последовательность рВоза исключением маленького фрагмента EcoRI/Валй!, а также 2; экзона tat и

ЕсоЫ

1-сп0о*м /

Его 01*

Лшр К

лигирование ЕсоР1/ВатН1-фрагмвнта рШр7 с ЕсоР1/ВатН1-фрагментом рВБ

и ог| '

ЕСОИ

воа

АтрЯ

Крп!

лигирование ВатН1/ХЬа1-<ррагмента pBStаt с Вд11/ХЬа1-фрагментом рЯ|р7

1-ап(1деп«

и к____

—

РяП

рт еоо 0р1 я рШр7

Л1ЧР К

С& е1 сг|

Рис. 4.А. Схема конструирования pBStatl.TR

Ашр Й

Amp в

Col El orí

вырезание Pstl/Pstl-фрагмента pBStatLTR

EcoRI Scüí юн

EcoRI

Col D orí

лигирование EcoRI/Sall-<pparMeHTa ptatD с EcoRI/Sall-фрагмвнтом pBSMT

EcoRI

Col O orí

Amp R ____

Col D on

Рис. 4.Б. Схема конструирования pMTtat.

Amp R

интрон) сайт рестрикции EcoRI оказывался перед первым экзоном tat (tat1 на рисунке б), а сайты рестрикции BamHI, Xbal "и другие сайты рестрикции из полилинкера плазмиды pBS - после второго экзона tat (tatS на рисунке 6). ..

На следумцем этапе конструирования фрагменты плазмиды pBStat, полученные при разрезании по сайтам BamHI/Xbal (оба сайта происходят чз.плазмиды pBS)., лигироеали с фрагментом Bgll/Xbal плазмиды pRIP7 (рис. 4.А). Этот фрагмент pRIPT содержит LTR БИЧ-1 и фланкирующую, последовательность из генома человека. При лигированиии по сайтам BamHI и Bgll оба эти сайта рестрикции уничтожались, а сайт Xbal оказывался между фланкирующей последовательностью и последовательностью Т3, которая происходит из плазмиды pBS. Полученнная в результате плазмида pBStatLTR содержала ген tat, LTR ВИЧ-1, а'также последовательности.pBS, кроме небольших фрагментов: участка EcoRI/BamHI и фрагмента BajnHI/Xbal, вырезанного непосреДсвен-но перед последним лигированием. Использование именно такого способа получения плазмиды обусловлено тем обстоятельством, что при непосредственном лигировании МТ . Промотора перед геном, tat в плазмиде pRIP7 по сайтам EcoRI/Sall плазмида pRIP7MT' вела себя крайне нестабильным образом.

В дальнейшем из плазмиды pBStatLTR (см. рисунок 4. Б) вырезали PetI/PstI-фрагыент, содержащий фланкирующую последовательность генома человека, и в полученной плазмиде ptatu по EcoRI/Sall сайтам вставляли металлотиониновый промотор, вырезанный по тем же сайтам из плазмиды pBSMT (любезно предоставленной Хайдаровой Н.М., ИМГ АН СССР)."В результате была получена плазмида pMTtat, содержащая ген' tat под контролем МТ-промотора и LTR БИЧ-1. EcoRI/PstI-фрагмент плазмида pMTtat, имеющий размер 3640 п.о., Использовали для получения трансгенных животных (рис. 4).

После микроинъекций EcoRI/PstI-фрагмента, содержащего ген tat (рис. 5), среди 24 животных, родившихся из оперированных зигот, было обнаружено 3 трансгенные мыши.

Трансгенных животных, родившихся из инъецированных зигот, выявляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ДНК, выделеной из хвостов мышей . Два расположенных, в первом экзоне лраймера (5' GAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGC 3' и 5"

EcoR / Sei /

Sac I Psf /

MT-I tat,

tat, i-tr

<5=840 bp:

2800 bp

О

Рис. 5. Схема строения EcoRI/Pstl-фрагмента плаэмиды pMTtat, использованного для полунения трансгенных мышей.

Рис;-6. Тестирование гена tat в ДНК мышеП с помощью flUP.

1 - ДНК фага X, рестрииированная по Psfl (маркер мол. весов) 2—12 — результаты ПЦР при добавлении:

2 - ДНК контрольной мыши с 10~5мкг/мл ДНК л/юэмиды pMTtat

(положительный контроль)

3 - ДНК контрольной мыши (отрицательныл контроль)

4-12 - ДНК мышеи, родившихся после микроиьекиий в зиготу фрагмента, содержащего ген tat.

I

1 .2 3 4 5 6 7 8. 9 10 11. 12

- U -

TCTGATGAGCTCTTCGTCGCTGTCT 3'), использованы© в ПЦР для . определения наличия гена tat у трансгенных животных, при - амплификации давали ожидаемый Фрагмент размером в 178 п.о. (рис. 6). Экспрессию трансгена • выявляли с помощью . ПЦР на комплементарной ДНК (кДНК), полученной путем обратной транскрипции поли (A J"1" FHK, выделенной из печени трансгенных мышей после 2 недель содержания на диете с ZnSO^. Тестирование экспрессии трансгена у трансгенных особей, дающих плодовитое потомство с помощью ПЦР на кДНК показало, что в печени имеется полиаденилированный РНК-продукт гена tat.

Из трех траногенных мышей, выявленных при помощи г ПЦР, только две дали плодовитое потомство, а одна мышь, оказалась стерильной. Таким образом в нашем распоряжении, оказались две линии трансгенных по гену tat мышей.

7 Fj-потомков одной из мышей (потомки мыши Я 4), полученных: скрещиванием с интактными, мышами линии СВА/С57Ь, в возрасте 6-7 месяцев были обнаружены опухоли в районе поджелудочной железы (в болече 60% случаев) и один случай опухоли в районе глаза. 7 F1-потомков другой линии трансгенных мышей (потомки мыши X 11) в том же возрасте опухолей в районе поджелудочной железы обнаружить не удалось, но также возникали опухоли в районе глаза, что говорит о неслучайном характере появления опухолей у трансгенных мышей (мыши до забоя содержались на диете с ZnSo^ в течение 15 дней). По данным цитологического анализа, проведенного Серовой И.А. (Институт цитологии и молекулярной генетики СО РАН), обнаруженные опухоли представляют собой аденокарциномы поджелудоч-, ной и слезной желез. В то же время ни одного случая появления аналогичных опухолей у большого числа контрольных мышей того хе возраста наблюдать не удалось. Таким образом полученные результаты позволяют сделать вывод о увеличении случаев опухолеобразования у трансгенных мышей с геном tat.

Анализ процентного содержания клеток крови (более 2000 ' клеток на животное) и костного мозга (более 500 клеток на животное) трех контрольных и четырех трансгенных мышей из двух разных линий в возрасте 5-6 мес показал, что никаких достоверных отличий в пуле клеток периферической крови и костного мозга контрольны* и трансгенных мышей не

- IT

наблюдается даже при содержании животных на диете с солями тяжелых металлов (ZnSO-t) в течение дьух н-д-ль по 0,72 мМ. То есть даже индукция МТ-промоторя , при которой возможная экспрессия гена tat возрастает в 1000 раз, не вызывает каких-либо значительных сдвигов в процентном содержании клеток крови и костного мозга. Фогель .и оопьт. также не обнаружили изменений в популяции Т-лимфоцитов у триног-нчых мышей с геном tat. Однако они не иналиэиров*пи содержание других типов гемопоэтических клеток;

Таким образом, экспрессия гена tat у тр^нсгенных мышей проявляется в увеличении случаев ш у х оп->>'р я ?оь и ни н, при этом соотношение форменных элементов в костном мо*г* и периферической крови этих мышей остается.без заметных изменений.

Трансгенные мыши с геном nef. .

Трансгенных животных, содержащих другой 1>~гуляторный ген БУГЧ-1 - ген nef, получали с помощью микроинт-»*кциЯ в йиготы мышей (гиОриды от скреиивяния ' (Г-Ь и СВД) PstI/EcoRT-Фрягментв размером 3,2 Кб (рис. 7) из плйзмиды pMeí. Плазмида pífeí содержала ген nef ВИЧ-1 (провирус НХВЗ), находящийся иод контролем промотора немедленно ранних генов цитомегаловируеа (CMV), а также сайт иолийд«-нилироеяния и терминатор из пренроинсулинн крысы'на З'-конц* гена (плазмида предоставлена докт. B.R. ГпТit-u, QUA).

Pst t Hind m Tag I EcoR /

CMV nef i ерм. - пре-проимсулин 1

^-1544 bp - -Е »WVWM 200 bp

755 bp ==t'i 1 k- 692 bp=ti

Рис. 7. Схема строения РэМ/Есо^-фрагмента плаэмиды использованного для полунения трансгенных мышея.

1Й -

Транегенных животных, родившихся из инъецированных зигот, выявляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ДКК, ьеделеной из хвостов мышей . Два праймера (5' GGTGGC-AAGTGGTCAAAAAGTAGTG 3' и 5' AATCAGGGAAGTAGCCTTGTGTGTG 3'), использованы* в ПЦР для определения наличия гена nef у трансгенных животных, при амплификации давали ожидаемый фрагмент размером в 367 п. о. г

После микроинъекций гена nef среди 26 животных, .родившихся из оперированных зигот, было обнаружено 4 трансгенные мыш (рис. 8). Экспрессию ген« nef в различных органах, (печень, мозг, почки,■селезенка) трансгенных мышей определяли с помощью ПЦР на комплементарной ДНК (кДНК), полученной путем обратной транскрипции поли(А)+ FHK, выделенной из . различных органов трансгенных мышей . Тестирование экспрессии трансгена у 2 трансгенных . особей с помощью ПЦР на кДНК показало, что во всех проанализированных органах имеется полиадекилированный РНК-продукт гена nef (рис. 9). На данном рисунке видно, что,экспрессия на уровне, РНК несколько различна в разных органах., хотя везде хорошо тестируется. Это соответствует имеющимся в литературе данным об универсальности CMV-промотора у трансгенных мышей.

Интересно отметить, что на рис. 9 амшшфицированная ДНК, полученная обратной транскрипцией-поли(А)+ РНК, представлена двумя полосами размерами приблизительно 370 и 240 п.о. Фрагмент размером 370 п. о. ожидаем, тогда как происхождение Фрагмента 240 п. о. не ясно. Как известно из литературных данных белок Wef может существовать в двух различных формах: _ р25 (25 kDa) и р27 (27 kDa) (см. обЗор литературы). Поскольку при амплификациии выявляются участки, принадлежащие двум формам мРНК отличающимися по длине , то, возможно, эти две различные мРНК кодируют различные белки Nef-.

У полученных трансгенных мышей . с экспрессирунцимся геном nef не было обнаружено никаких явных аномалий развития,. в Том числе и тех, которые наблюдались у трансгенных животных с геном tat. Более детально проанализировали соотношение разных типов клеток в костном мозге и ' крови контрольных (5 мышей) и трянсгенных (4 мыши) животных в возрасте 5 месяцев. Трансгенные мыши относиЛ1 ь к 2 независи-

..• --^-¡Ц^Х^. -.'с: - ^

__. ли» '

1 I 3 i ï f 7 « 9 10 11 12 13 14 13 te

Рис. 8. Тестирование гена nef в ДНК мышей с помошью ПЦР.

1,16-ДНК <рагаА, рестрииироеанная по Pstl (маркер мол.весов)

2-16 - результаты ПЦР при добавлении:

15 - ДНК контрольной мыши (отрицательный контроль)

14- ДНК контрольной мыши с 10"®мкг/мл ДНК плаэмиды pNef

(положительный контроль) 2-13 - ДНК мышей, родившихся после микроиьекций в зиготу Фрагмента, содержащего-ген nef.

3

¡il! m

«« —

ш =

339

га ^

343

12 3 4 5 6

8 9 10

Рис. 9. Тестирование транскрипции трансгена в различных органач трансгенных мышей с помошыо ПЦР.

1,10-ДНК ФагаЛ, рестрицированная по Р\и11(маркер мол.весов) 2-9 - результаты ПЦР при добавлении: 6, 8 — кДНК контрольной мыши (отрицательный контроль) 9 - ДНК контрольной мыши с 10"®мкг/мл ДНК плазмиды рЫе( (положительный контроль)

2-4 - кДНК трансгенной мыши N 10 5, 7 - кДНК трансгенной мыши N 14 Органы: 2-моаг, 3,7-печень, 4,6-почки, 5-селезенка

мо полученным линиям животных. Для анализа брали мышей N 10 и N 14 (Fq) и НИ 106, 112 (F^—потомков N10), полученных от скрещивания трансгенной мыши N10 с мышами линии СБА/С57Ь.

Изданных, представленных в табл. 2, видно, что у трансгенных мышей но сравнению с контрольными животными имеются определенные различия как в костном мозге,так и в крови. Наиболее значительно и достоверно (Р<0.001) у тракгенных мышей в обеих типах тканей увеличино относительное количество лимфоцитов. Кроме того, наблюдается достоверное уменьшение в костном мозге доли незрелых нейтрофилов (промиелоциты, миело циты и юные нейтрофилы) (Р<0,05).

В наших экспериментах изучался пул В-лимфоцитов, поскольку, как известно, основным местоположением Т-лимфоцитов является тимус и лимфатические сосуды, а в костном мозге продуцируются В-лимфоциты. К тому же изучение изменения процентного состава Т-клеток полученных нами трансгенных мышей с помощью смеси сорбированных на магнитных гранулах моноклональных. антител к CD4- и С08-поверхностному антигену Т-клеток не выявило достоверных отличий в пуле Т-клеток. В связи с вышеизложенным можно заключить, что продукт гена nef влияет на пролиферацию и дифферекцировку В-лимфоцитов. Следует отметить, что процентное содержание В-лимфоцитов увеличено и в периферической крови и в костном мозге, причем в крови наблюдается более значительное увеличение (в 5 раз). Следовательно, я отличии от трансгеккых мышей, содержащих ген ЗПО*, механизмы, участвующие в выходе аритроидкых клеток в периферическую кровь , либо подавлены, либо видоизменены, что и обуславливает наличие эффекта как в периферической крови, так и в костном мозге тринсгенных животных.

Таким образом, из функциональных расстройств, наблюдаемых у пациентов со СПИДом, таких как: .1) гилергаммаглобулинемия, 2) увеличенное процентное содержание активированных В-клеток в циркулирующей крови, 3) увеличенный титр антител к другим патогенам, 4) присутствие автоантител в сыворотке, по крайней мере значительное увеличение циркулируикдих В-лимфоцитов можно гю крайней мере частично отнести за счет действия белка Nef.

Таблица 2.

Анализ трйнгенных животных с геном пе1.

Содержание клеток, %

Клетки

контрольные мыши трансгенные мы им Р

костный мозг:

эритробласты ' 2,4±0,57 3,010,6 *

нормобласты 1,8-0,61 2,25-0,55 *

ретикулоцмты 2,5-0,78 2,2'1,3 *

нейтралилы незрелые 25,3+2,9 14,8-1,4 . <0,05

нейтрофилы палочкоядерные и се гментоядерные 45,7-2,1 42,8?2,6 Ч

моноциты Т,1-0,18 0,85-0,25 *

базофилы 0,9-0,17 0,75-0,15 *

лимфоциты 18,2т1,2 30,7*0,2 <0,001

кроьь:

эритроциты 99,16-0,та 99,Т5-0,35 *

нейтрофилы 0,075-0,0125 ■ 0,125-0,025 *

рвтикудиниты 0,«25-0,17 0,5-0,3 *

МОНОЦИТЫ 0.075-0,025 0,001-0,001 <0,05

лимфоциты 0,0625.-0,0Т5 0,25-0,05 <0,001

« Д<м:тойирных рияличий н нничения* средних нет.

Уменьшение незрелых нейтрофилов в костном мозге и моноцитов периферической крони у трансгенных мышей не представляется загадочным, поскольку известно, что уменьшение моноцитов-макрофагов происходит за счет развития в них БИЧ, а изменение в процентном составе незрелых нейтрофилов отмечается наряду с другими неспецифическими изменениями в костном мозге. Кроме того как известно КеХ-оелок,способен предотвращать индукцию IL-2 - зависимых пулов клеток. К таким относятся, в частности, и нейтрофилы, и моноциты.

Данные по аффекту гена nei, приведенные в настоящей работе, получены и опубликованы впервые в 1992 г. Б то время аналогичные исследования еще не приводились. В настоящее время появилась одна работа. (Skowrcnskl, 1993), в которой описываются трансгенные мыши с геном не/. В этий работе исследовали влияние экспрессии гена nei из различных изолятов ВИЧ на Т-лимфоциты. Итак, трансгенные мыши, несущие ген nei, при отсутствии каких-либо заметных аномалий в развитии имешт измененный пул клеток костного мозга и периферической крови.

Полученнные данные свидетельствует в пользу имеющегося предположения о том, что продукт гена nei, как и продукт гена tat, является трано-дейотвумцим и не нейтрален для организма, в котором этот ген экспрессируется.

ВЫВОДЫ

1. Получены трансгенные мыши, содержащие ген эритропоэтина . человека, находящийся под контролем регуляторных элементов вируса саркомы Рауса. У животных и Р(-поколений выпилена экспрессия трансгена на уровне белкового продукта.

В костном мозге-трансгенных мышей обнаружено увеличение процентного состава йритроидных клеток в среднем более чем\ в 3 раза по сравнению с контрольными животными. Наибольшее статистически достоверное увеличение произошло в количестве нормобластов и ретикулоиитов, т.е. неделмщихся клеток. В то же время параметры периферической кроьи у трянсгенных мышей такие как гвматокрит, количт;тво ретикулоцитов, содйриание гемоглобина в эритроцитах не изменялись i о сравнению с

-

КОТроЛЬНЫМИ животными.

2. У трансгрнных мышей с экспрессирующимся регуляторным геном ЧаГВВИЧ-1 никаких изменений в составе клеток костного мозга и периферической крови не обнаружено. Вынете с тем у значительного числа этих животных раэьиьаштся нд^нокярцино-мы, что свидетельствует об онкогенном потенциале гена tat.

3. Анализ трансгенных мышей с регуляторным геном nef вируса иммунодефицита Человека, находящимся под контролем регуля-торных »лементон цитомегаловируса, показал, что экспрессия трансгена на уровне мРНК происходит во многих органах животных. В костном мозге трансгенных мышей обнаружено статистически достоверное увеличение (F*0,001) процентного состава лимфоцитов в.1,7 раз и уменьшение процентного состава нейтро-филов в 1,2 раз {особенно незрелых нейтрофилов в ,1,7 раз). В периферической'крови трансгенных мышей выявлено 4-х кратное увеличении? процентного содержания В-лимфоцитов и. уменьшение процентного состава моноцитов в 75 раз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .

1. Мудрик H.H.i Тарантул В.З. "Биологические эффекты, вызываемые геном эритропоатина человека у трансгенных мышей." В.: Новые направления биотехнологии. Всесоюзная кои|»еренция. Тряисы докладов. 2-4 окт. 1990 г., г. Пущино. 1990г. с 29.

2. Тлринтул В.З., Мудрик H.H. "Изучение молекулярных основ патологии на модели трансгенных животных." Биополимеры и клетка. 1991. Т.7. *3, с 5-12.

3. Мудрик H.H., Эшкинд Л.Г., Монаксва Т.Е., Корялова Е.Ы.,

1йн Л.О., Тдрянтуп R.3., ГяяАрян К.Г. "Биологический -лЭД^кт г-.ритропоэтина . человека у транс генных мышей." Молекулярная генетика, микробиилохия и вирусология.1991, MIO, с 25-28.

4. Mihlrlk H.H., Amlreeva L.E., Tarantul V.Z. "Peripheral blood and bone marrow abnormalities In transgenic mice *lth nef gene of HIV-l". VIH International Conference on A7Tv>/TTT STD World Congreea, Amsterdam, the Motherland«, 1Ч-ГД July t942. Abe tract Number 000071.

Г.. Мудрик H.H., Андреева Л.Е., Дубовая В.И., Мухоян H.A.,

Тарантул В.З. "Эффект гена nef ВИЧ-I на соотношение клеток в : костном мозге и периферической крови у трансгенныХ мышей." Доклады АН. 1992. Т.325. *3, с 606-608.

6. Mudrik N.N., Tarantul V.Z., Andreeva L.E. International Conference on AIDS,' tumor, and human retroviruses. St. Peterburg, 1992, 17-19 November.