Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение чужеродных ДНК и прилегающих к ним последовательностей генома у трансгенных мышей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение чужеродных ДНК и прилегающих к ним последовательностей генома у трансгенных мышей"

Ордена Ленива н ордена Дружбы Народов Академия наук Украинской ССР

Институт молекулярной бяологон в генетики

На правах рукописи УДК 577218:575.113:578.5

МАКАРОВА Ирина Владямнровка

ИЗУЧЕНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ ДНК И ПРИЛЕГАЮЩИХ К НИМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

03 £0.03 — молекуляраая биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1988

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР в лаборатории эыбриогенетической инженерш животных.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор К.Г.Газарян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация - Институт биомедицинской технологии МЗ СССР

на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата наук Д 016.II.01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252143, Киев-143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

В.1£.Кавсан,

доктор биологических наук К.А.Кафиани

Защита состоится "20"

в ¿О часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь спецсо кандидат биологических

Актуальность проблемы. Разработанные в последние годы методы получения трансгенных животных и использование их в качестве новой экспериментальной модели оказались существенными для решения целого комплекса научных и прикладных вопросов современной биологии. Изучение молекулярно-генетических аспектов трансгенеза таких, как механизмы интеграции трансгена с геномом животного, рекомбинационные явления> сопровождающие этот процесс, стабильность трансгена в онтогенезе и при передаче по наследству, комплекс факторов, влияющих на экспрессию трансгена, существенно углубляет наши знания о функционировании генома эукариот. Используя трансгенных животных можно картировать как новые гены, так и определять положение и свойства регуляторных элементов уже известных генов. Продукты экспрессии трансгена могут влиять на физиологический статус организма, что, в свою очередь, является новым подходом к изучению самых разнообразных • физиологических процессов и их регуляций в организме. Трансгенные мыши оказались удобной моделью для изучения некоторых вопросов канцерогенеза и инсерционного мутагенза, моделирования наследственных заболеваний человека. Перспективной является возможность применения трансгенных животных для решения задач биотехнологии в области медицины и сельского хозяйства.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена получению трансгенных мышей, несущих в своем геноме последовательности ЛНК- и РНК-содержащих вирусов, и изучению процессов интеграции и транскрипции трансгена у таких животных и их потомков.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе проведен достаточно полный анализ трансгенных мышей, несущих последовательности ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Она явля-гтся одной из первых, касающихся изучения особенностей процессов интеграции трансгенов у трансгенных животных. Показано, что воз-ложны перестройки трансгенов вирусной природы при их интеграции л при передаче по наследству. Обнаружена перестройка геномной ЛНК эколо места интеграции чужеродной ДНК. Вблизи сайта интеграции выявлено и охарактеризовано новое семейство умеренных повторов ^енома мыши. Изучены особенности транскрипции трансгена и продемонстрирована транскрибируемость вновь выявленного семейства повторов .

'Результаты работы имеют существенное значение для более детального понимания процессов интеграции и экспрессии трансгенов вирусной природы и могут бить использованы в работах по получению 'трансгенных животных, а также в исследованиях структуры "горячих" точек генома. Данные диссертационной работы будут полезны при постановке экспериментов по переносу различных вирусных генов, особенно аденовирусной природы. Клонированные и охарактеризованные консервативные умеренно повторяющиеся последовательности генома мыши можно использовать в качестве зондов для выяснения вопросов, связанных с эволюцией геномов позвоночных животных.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов и результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего П5 ссылок. Работа изложена на II? страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 5 таблицами.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на V съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва, 1987), конференции молодых ученых ИМГ АН СССР (Москва, 1987), III молодежной школе-конференции "Молекулярная генетика - народному хозяйству" (Душанбе, i988) и на совместном семинаре отдела биосинтеза нуклеиновых кислот и отдела биохимической генетики ИМБиГ АН УССР 15.08.88г.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Трансгенные мыши получены методом микроинъекций ДНК в про-нуклеусы зигот (Гаэарян и др.,1983).

Выделение геномной ДНК и тотальной клеточной РНК проводили по стандартным методикам, модифицированным в лаборатории (Гаэарян и др.,1983, Косиков и др.,1986).

Выделение плазмидной и фаговой ДНК осуществляли по общепринятым методикам (Маниатис и др.,1984).

Дот-гибридизацию ДНК и РНК проводили по модифицированным в лаборатории методикам (Газарян и др.,1983, Косиков и др.,1986).

Бмот-гибридизацию вели по методу Саузерна (Seuthem,i975) с модификациями.

Спасение плазмиды проводили по методу, описанному Ханаханоы С соавт. (Hanahan, 1980).

Скрининг фаговых клонов вели методом рекомбинации In т1т» в клетках В.ooll (Маниатис и др.,1984).

Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сенгера (Sanger et al.,1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе были получены и исследованы трансгенные лви, несущие последовательности рекомбинантных плазму содержа-нх ген тимидинкинаоы вируса герпеса и промоторные последователь-ости РНК-содержащих вирусов, а также исследованы мыши, несущие своем геноме последовательности ДНК аденовируса обезьян ЗА 7.

!. Исследование переноса последовательностей ДНК- и РНК-содержащих вирусов в геном мышей.

Методом микроинъекций в зиготы мышей вводили ДНК трех ре-омбинантных плазмид:

.pAGO - содержащую ген тимидинкиназы (ТК-ген) вируса герпеса HSV) с собственным промотором, клонированный в рВН322; .рИАЗ - содержащую кодирующую область ТК-гена HSV,последователь-ости ДНК вируса саркомы Рауса (RSV), в том числе оба длинных, онцевых повтора (ITH), и рВН322;

.р?КЮ - содержащую кодирующую область ТК-гена НЗУ^рагмент ДНК ыши с 5' -концевым участком провируса эндогенного ксенотропного • ируса мышей, несущим ИВ, ирВН322.

Анализ ДНК животныхi развившихся из оперированных зигот, 1етодом дот-гибридизации показал, что в геноме этих мышей при-:утствугат последовательности, гомологичные введеным (таблица I). Доведенный анализ позволил определить частоту переноса экзоген-юй ДНК в каждом из трех случаев, а также примерное число копий •рансгена у разных животных и в разных органах. Среди животныхj соторым вводили последовательности рекомбинантных плазмид с Ж-геном,сигнал обнаруживался в печени в 81% случаев у мышей при (нъекции рМАЗ, в 61% при инъекции рГОО и в 47% случаев при инъек-дии pAGO. Эти частоты близки или несколько выше, чем обычно наб-иодают в аналогичных экспериментах. Примерная оценка числа'копий экзогенной ДНК в печени мышей, в зиготы которых вводили ДНК 1лазмид с ТК-геном, показала разброс в количестве копий от <0,i на диплоидный геном мыши до 2,2 копий.

В отличии от очень многих случаев интеграции трансгена, описаных в ряде работ (Palmlter, Brlnrter ,{986), в наших экспериментах, при введении плазмид с ТК-геном, никогда не наблюдалось интеграции большого числа копий трансгена, а следовательно и тандемного расположения их.

з

Таблица 1. Сводные результаты опытов по микроинъекциям плазмид рАОСЬ рМ^ рТКГО в зиготы мышей и их передаче по наследству.

Плазмида рМАЗ рТКЮ рАОО

Инъецировано зигот 241 238 198

Трансплантировано зигот 142 178 143

Родилось мышей (ГО) 24 46 36

Дот-гибридизация с ДНК печени:

Анализировано мышей 21 28 17

Положительная гибридизация: 17(81%) 17(61%) 8(47%)

!<копии/ядро 9 7 2

0,5<копии/ядро<1 8 10 6

Родилось мышей (Я) 140 69 63

Развилось до 1-,5 месяцев 65 16 23

Дот-гибридизация с ДНК печени:

Анализировано мышей 15 10 5

Положительная гибридизация: 13(87%) 5(50%) 3(60%)

I копии/ядро 6 0 2

0;5^копии/ядро<1 7 5 I

Дот-гибридизация с тотальной ДНК

мышей с задержанным развитием:

Анализировано мышей 14 2 4

Положительная гибридизация:

1<копии/ядро 10 I 4

0;5<копии/ядро<1 4 I I

Методом дот-гибридизации показано^ что потомки ?1-поколения от скрещивания мышейk несущих в своем ГбДОМе последовательности вводимых плаэмид, также содержат в ДНК печени последовательности этих рекомбинантных плазмид (таблица i).

При анализе ДНК мышей ВД- и И-поколения,дающих положительный сигнал при дот-гибридизации с меченым ТК-геном,методом блот-гиб-ридизации по Cayзерну были получены результаты, свидетельствующие об интеграции последовательностей вводимых плазмид с геномом мыши (рисЛ). Однако j мы иногда получали набор гибридизующихся фрагментов, не соответствующих предполагаемым, исходя из рестрикцион-ной карты вводимых плазмид. Этот факт можно объяснить перестройками вводимых ДНК до или во время интеграции и, следовательно, встраиванием видоизмененных последовательностей. Исследование одного из таких случаев (мышь 2М) было проведено с помощью метода спасения плазмиды.Геномная ДНК этой мыши расщеплялась рестрикта-зой BamHI, для которой не было сайта в исходной плазмиде, вводимой в зиготу. Это позволило нам пронлонировать фрагмент трансгена с прилегающими к нему геномными последовательностями. Детальный анализ спасенной плазмиды рМАЯ1 в сочетании с данными блот-гибридизации с ДНК мыши 2М и ДНК контрольных мышей, расщепленными рестриктазами ВвдвШ и BooBI, позволил предположить что у мыши 2М либо внутрь трансгена внедрился участок хозяйской ДНК, либо осуществилось встраивание отдельных фрагментов экзогенной ДНК, при этом вблизи места итеграции трансгена произошла перестройка хозяйской ДНК,которая,скорее всего,представляет собой крупную делецию.

У мышей, несущих последовательности плазмид с ТК-геном, чужеродная ДНК была обнаружена в печени, почках, селезенке, сердце, мышцах. Однако, в ряде случаев в разных органах было обнаружено различное количество экзогенного материала.

Ранее в нашей лаборатории были получены трансгенные мыши^ несущие последовательности ДНК высокоонкогенного аденовируса обезьян ЗА 7 (Газарян и др.,1983, Gazarywi et al. ,1984). При исследовании ДНК, выделенной из различных органов отдельных мышей РО-РЗ-поколений, были получены следующие результаты. Во-первых, количество вирусной, ДНК в различных органах варьировало от 0,í до Í копии на диплоидный геном мыши. Во-вторых, у некоторых мышей ДНК ЗА 7 присутствовала в одних органах и отсутствовала в других.В-третьих, интересным фактом оказалось отсутствие вирусных последовательностей в ДНК сердца и скелетных мышц у всех мышей РО-РЗ-поколений, несущих последовательности ДНК SA7.

Рис. I. Блот-гибридизация меченой плазмиды рЫА.3 (2,3) и меченого фрагмента рга5-В (I) с геномными ДНК трансгенных мышей, расщепленными рестриктазами ВовЩШ и ВааН1(2,3). Мыши: I - 231М4 2 - 8МИ (обе Л-поколение)¡ 3 - 2М (/О-поколение). Маркеры - фрагменты ДНК фага Л, рестри-цированной Во«В1+ШлАШ. Здесь и далее размеры в т.п.н.

Поскольку б других органвх и тканях у всех анализированных мышей последовательности ДНК за7 присутствуют, хотя и в разном количестве, и такая картина наблюдается у четырех поколений потомков семьи 52, то в ранних работах нашей лаборатории (Оаеагуап et а1., 1984) было сделано предположение о том, что в ДНК сердца и скелетных мышц происходит полная элиминация трансгена, тогда как в других органах, вoзмoжнoi элиминируется лишь часть последовательностей трансгена. Ранее при исследовании ДНК этих мышей методом блот-гибридизации было обнаружено* что у мыши $52 (Ю-поколение) ДНК за7 размером около 33 т.п.н. интегрировала с геномом мыши без заметных ( по рестрикции) изменений-, однако у ее потомков в ?3-поколении интегрированная вирусная ДНК перестроилась (вааагуап еЛ а1. ,1984).

Дальнейший анализ УЗ-Уб-поколений мышей двух сублиний линии 52 и независимо полученной линии 29 показал (рис.2),что у мышей РЗ-поколения^ также как и у предыдущих поколений животных (?0-Р2), аденовирусная ДНК присутствовала в ДНК всех органов кроме сердца и мышц. Однако^ начиная с ?4-поколения и далее ДНК за7 обнаруживали во всех органах, включая скелетные мышцы и сердце, трансгенных животных, как в линии 52, так и в линии 29 (таблица 2). Видимо> на протяжении ряда поколений произошла определенная "адаптация" ДНК за7 к мышечным тканям* что, возможно, связано с перестройками в трансгене, которые были показаны в данной работе методом блот-гибридизации и у других мышей ЯЗ-поколения линии 52 и у мышей 15-поколения линии 29 (рис.3). Таким образом, представленные данные указывают на структурную нестабильность трансгена, содержащего последовательности ДНК аденовируса За7. ' Исследование передачи трансгенов потомкам следующих поколений проводилось, как у мышей, несущих ДНК ЗА7^ так'и у мышей, несущих последовательности плазмид с ТК-геном. Примерно 50% потомков наследовали ДНК за7 при скрещивании мышей ?0-поколения1 дающих положительный сигнал при дот-гибридизации^ с контрольными мышами (Гаэарян и др.¿1993). Это соответствует встраиванию в один сайт на хозяйских хромосомах. Такая ситуация была не раз описана в литературе (Ра1гШ:ег, Вг1пв*егЛ986) .Передача трансгена примерно 50% потомков также была показана'для мышей, в зиготы которых вводили последовательности плазмид с ТК-геном. Факт передачи трансгена потомкам может являться одним из доказательств его интеграции с геномом хозяина. Таким образом, показано что, у некоторых мышей произошла интеграция вводимой ДНК с геномной ДНК . мышей, т.е. трансген находится у них в интегрированной форме.

j^L

ь

fi%

Гffim) «

\кЧ2/11/2\ ♦

\тгт/2\.

Сч'И/31) (*}*/tQ J_

i

[*>H/¡t2/2\

* _

\mt/n\ (jnm¿)

Лихи» 52

I

_l_

(»15/11/7)^ \lffí/nM

í*>ts/twi) \K4s/m/»\

/тнвя га

Рис. 2. Схема родственных связей в двух линиях мыше^ несущих

последовательности ДНК аденовируса ЗА?. В овалах - сам-к^ в прямоугольниках - самцы.

70,5 «а« ! 9,0

6,6+ - \ 4,0 «.

! 1 I

tet)

1 I 2

I t

Рис. 3. Блот-гибридизация меченой ДНК ЗА 7 с геномной ДНК печени мыши 15/124/8 (Р5-поколение) ¡ расщепленной ВаюНК2) и HlndlII (3). Положительный контроль (Í) - гибридизация ДНК ЗА7-, рестрицированной BamHI совместно с ДНК контрольной мыши (в связи с условиями фореза не видны 2 наиболее низкомолекулярных фрагмента - í t0 и 0^8 т.п.н.).

аблица 2. Вирусспецифические последовательности в ДНК и РНК из различных органов трансгенных мышей-, несущих ДНК ЗА 7.

№ мышей Р печень тимус селезенка половые железы сердце мышцы почки

ДНК РНК ДНК РНК ДНК РНК ДНК РНК ДНК РНК ДНК РНК ДНК РНК

52/12 + - н н + - н н н н н н + -

54/31 54/61 »3 + + - + + н н + + н + + - н н - - + н н

15/124 + - н н + - н н - - н н + -

52/31/2 + + н н н н н н + + н н + +

54/31/3 :5/12/7 74 + + + + н + н + н + н + н + н н + + + н + + + + н + н +

5/12/8 + + + н + н + + + н н н + +

¡2/321/2 + + н н н н н н н н н н н н

¡4/312/2 5/128/1 У5 + + + + н н н н + н + н + н н н + н + н + н + н + н + н

5/124/8 + + н н н н + ' + + + н н н н

54/А2 + + + + н н н н + + + + н н

54/АЗ У6 + + + + + + н н + + + + Н' н

54/А6 + + н н н н н и н н н н н н

" «- положительный сигнал; " - сигнал на уровне фона^ » не определяли.

2. Особенности транскрипции трансгенов у животных ïO-поколения и их потомков.

Экспрессию трансгенов в наших опытах изучали иа уровне РНК. 8 двух линиях мышей ïO-ЯЗ-поколения, несущих ДНК SA 7, транскрипция вирусных последовательностей происходила лишь у отдельных особей в некоторых органах и с низкой эффективностью. Однако^ начиная с Г4-поколения транскрипция ДНК ЗА 7 происходила во всех проанализированных органах у всех трансгенных мышей, причем это было характерно для обеих независимых линий мышей 52 и 29 (таблица 2).Можно предположить несколько причин для объяснения столь неожиданных результатов. Во-первых, возможна взаимосвязь между перестройкой трансгена и прекращением элиминации ДНК ЗА 7 из мышечных тканей в следующих поколениях. Это, в свою очередь -, может коррелировать с изменением характера транскрипции трансгена. Поскольку сходные явления обнаружены у мышей двух разных линий, у которых трансген расположен> скорее всего, в разных местах на хромосомах, то наблюдаемые изменения^ по-видимому, обусловлены не столько положением трансгена в геноме, сколько его природой.

Для сравнения эффективности работы двух Мй как промоторов было проведено исследование транскрипции трансгенов у трансгенных мышей, несущих последовательности рекомбинантных плазмид с ТК-геном HSV и разными Xîfi (плаэмиды рМАЗ и рВДО), В îO-поко-лении независимо от типа плазмид примерно в половине случаев происходила транскрипция трансгена в печени трансгенных мышей. Уровень транскрипции при этом варьировал у разных животных. Однако, значительно более сильная разница в уровне транскрипции, была обнаружена у потомков M-поколения как между собой, так и по сравнению с родителями независимо от использованного промотора (рис. 4). Повышение уровня транскрипции у потомков обычно рассматривают как указание на мозаичность родителей ïO-поколения (UoKnight et al, Î983). Поскольку выявление при анализе мышей с рМАЗ и pïKlO максимальные уровни транскрипции заметно не различались, то, следовательно, в данных условиях опыта ХТЕ, содержащиеся в этих плазмидах имеют сравнимую эффективность. Этот факт совпадает с тем, который был обнаружен ранее при сравнении про-моторных свойств этих же двух ХТН в ядрах ооцитов ïeaopue laevia (Косиков и др.,Î983, Косиков и др.>1986). На основании исследования транскрипции рекомбинантных молекул в двух различных системах la vivo можно заключить, что ИЕ у проанализированных про-вирусов не имеют сильно выраженной видо- и тканеспецифичности, а сила их промоторов примерно одинакова.

я а

О-г-0

АА4ААААА

ВТ-1 ?Т-1 1Я-1 1ТТ-1 &*-< тм ем Я т»

® I -в

4 4 4 4 А А"

11М им ¡(Н »> у* Ч

1Я Ш I гж I 1Ж

о—г-□ о-г-я о—г-а

А А А А А А» А А А ¡г А*

№1яы 1»>1 1»-1 гтт-1 г<*-1 гам 1я-| ш-|

3* * ЯТ 0

-а о—г—а

<&——и &—[—ь

А~<Го Аи

«Т-* 17Т-* 1*-« 1»-« 24М

Рис. 4. Схема скрещивания трансгенных мышей и передачи по наследству эффективности транскрипции трансгена. Кружками обозначены самки> квадратами самцы> и - контрольные мыши. . Штриховка отражает уровень транскрипции ТК-гена. Темная область - сильная транскрипция, заштрихованная - средний уровень; светлая - отсутствие транскрипции. Н - не определялась ^ • - мышик с задержкой развития.

3.. Фенотипические проявления переноса экзогенной ДНК в мышей.

При исследовании потомства мышей^ несущих последовательности трех видов плазмид с ТК-геном НЗУ.были отмечены случаи аномального развития. Во-первых, наблюдалась ранняя эмбриональная гибель зародышей и резорбция плодов. В результате от некоторых животных так и не удалось получить рождения потомства. Во-вторыхt среди родившихся потомков иногда встречались слабые особи, которые вскоре гибли или поедались самкой. В-третьих, из числа выживших потомков некоторые очень медленно росли, долго не покрывались шерстью, не набирали вес. Обычно они погибали к 2-4 месяцу жизни. У животных 15ДМ-1 и 16ДМ-1 полученных от скрещивания самца 2М, несущего последовательности рМАЗ.с контрольной самкой, и у мыши 17ДМ-1, полученной от скрещивания с контрольной самкой самца I3M, несущего ДНК pTKiO, были обнаружены аномалии развития; проявляющиеся в задержке развития и деформациях конечностей. В большей мере все эти аномалии были характерны для потомства мышей, содержащих последовательности плазмиды p'iKiO, однако они проявлялись и в случае рМАЗ и рАОО. В нашей работе мы наблюдали некую корреляцию между транскрипцией трансгена и развитием несущих его животных. При этом аномальное развитие животных, содержащих последовательности ДНК плазмид рМАЗ и pAGO, скорее всего, не было связано с транскрипцией трансгена. При анализе РНК мышей с рТИО ни у одного нормально развивающегося животного не была обнаружена транскрипция трансгена, в то же время у аномально развивающихся мышей происходила транскрипция этой плазмиды./ В этой связи можно предположить, что продукты транскрипции (возможно,работа эндогенного LTB из плазмиды р!ГК10) каким-то образом отрицательно влияют на развитие мышей.

4. Некоторые особенности геномных последовательностей, фланкирующих трансген, у мыши 2М.

Изучение природы механизмов рекомбинационных процессов, происходящих при интеграции и передаче трансгена по наследству, а также детальный анализ структуры трансгена и прилегающих к нему последовательностей хозяйской ДНК требует клонирования трансгена вместе с фланкирующими последовательностями из генома несущего его трансгенного животного. Хорошим методом для этого является метод "спасения" плазмидь^с помощью которого мы получили из ДНК трансгенной мыши 2М плаэмиду рЫАЕ1(рие. 5). Как указывалось ранее, рестриктаза ВапНХ была специально подобрана для

а

1,05 -з

0,85 - Ц Orí

0,70 -5

3,8 -1

i,« - 2

0,35 - 6

5

BaiaHI

PtrtI

Batí

Pstl

HinilXI

Рис. 5. Спасенная плазмида pMAH1.

а - электрофореграмма ДНК плазмиды рМАН1> рестрицирован-ной Pstl. Номера фрагментов с I по 6 в соответствии с размером ( в т.п.н.).

б - Рестрикционная карта плазмиды рНАН1. Темный участок -ДНК плазмиды рВН322, светлый участок - ДНК генома мыши. Orí- место начала репликации. Отмечен повтор Tí.

Рис. 6. Блот-гибридизация меченой ДНК плазмиды рМАВ1, с суммарной ДНК контрольной мыши; расщепленной ЕооН1{1) *ВашН1+ ВоеН1 (2), ВапН1 (3).

а - гибридизация при 65°С; отмывка при 65°С в 0,2хЗЗС, б - гибридизация при 65°С^ отмывка при 65°С в 2xЗЗCi в - гибридизация при 55°С, отмывка при 25°С в 2x330.

6

6

12 12 3 12 3

"спасения" плазмиды, поскольку отсутствие сайта для нее в рМАЗ, которую вводили в зиготь^ позволило вырезать из генома мыши фрагмент ■, целиком включающий трансген. Однако, так ка^ при интеграции скорее всего произошли сильные изменения введенной ДНК и разные ее фрагменты интегрировали в различные места на хромосомах, то возможности данного метода спасения плазмиды позволили про-клонировать только тот участок трансгена, который нес ген устойчивости к ампициллину и ог1 репликации. Клонирование позволило провести анализ последовательностей геномной ДНК, прилегающих к месту интеграции.

Нами были обнаружены две интересные особенности фланкирующих трансген геномных последовательностей мыши 2М. Во-первых, произошедшая вблизи сайта интеграции фрагмента трансгена довольно крупная перестройка хозяйской ДНК (см.выше).Подобные случаи уже описаны ранее в литературе (СотаггиЪ1ав et а1. ¡1986; Иагк е* а1., 1985, «1Ш.е, Ра1т1/Ьег , 1987^ ИвуоЫок ег а1. ,1985). Во-вторых, наличие вблизи сайта интеграции повторяющейся последовательности, которая была выявлена при блот-гибридизации в условиях, описанных в работе Стейнмеца с соавт. (3*е1шае1;г et а1., 1980), и при блот-гибридизации с ДНК мышей в разных условиях гибридизации и отмывки (рис. 6). В литературе также были описаны случаи присутствия повторяющихся последовательностей вблизи локусов интеграции трансгена (СетаггиМав et а1. ,1986,И11к:1е, Ра1тЗЛег,198?). В работе Рубинштейна и Гордона показано (ВиЪ1пв1;в1а,Оогдв11>1987), что в результате рекомбинационных событий, происходящих при переносе чужеродной ДНК^преимущественно встраиваются те части вводимых молекул, которые являются А1и-повторами. В связи с этими данными, можно думать, что повторяющиеся последовательности генома эукариот обладают повышенной способностью к сайтнеспецифи-ческим рекомбинациям¡ иi возможно^ что обнаруженный нами повтор связан каким-то образом с процессом интеграции трансгена.

Анализ с помощью дот- и блот-гибридизации клонированного нами в составе плазмиды рМАВ1 повтора показал! что он не имеет гомологии с целым рядом известных часто и умеренно повторяющихся последовательностей позвоночных животных,но присутствует в геномах многих эукариот (человек; мышь; овца, голубу лосось^ дрозофила). Клонирование из библиотек генов человека, мыши и голубя фаговых клоновнесущих последовательности этого повтора, и их анализ с помощью блот-гибридизации показали, что, видимо^ у человека, голубя и мыши повторы представлены в виде гетерогенных

кластеров или полиморфных копий повтора внутри каждого кластера, рассеянных по геному. Мы определили» что выявленный нами повтор представлен МОО-ЗОО копиями на геном мыши, человека и голубя. Таким образом, анализ этого повтора (семейство Т1) позволяет отнести его к классу диспергированных и дивергировавших умеренных повторов.

Определение нуклеотидной последовательности Рэй1-фрагмента спасенной плаэмиды рМАй1, содержащего внутренний фрагмент повтора, выявило последовательность олиго(йа)^ (рис.7). Известно, что такие участки присутствуют в ряде длинных диспергированных повторов грызунов и могут останавливать процесс репликации ДНК (П^АюЪгов!» et а!»1987).

С помощью РНК/ДНК гибридизации на срезах (гистоблот) показана транскрибируемость повторов семейства Т1. Положительный сигнал при гибридизации был обнаружен в печени и почках 3-х дневного мышонка и в печени, почках и клетках крови куриного эмбриона 14 дня развития, однако, при этом не исключена частичная контаминация кровью других органов. Эти данные свидетельствуют как о консервативности повтора Т1, так и об определенной тканеспецифичности его транскрипции, которая сохранилась в эволюции.

СН6Н6СГ666 НЯТСШЭД^б 6Г1з6Т66ТТГ ббСССбйНГТ

гбббйнсстт бселнйбеее ссйсссттйй тбссбббттт ссстсесссб

Рис.7 Нуклеотидная последовательность -фрагмента спа-

сенной плазмиды рИАН1, содержащего внутренний участок повтора. Отмечена олиго(<10){7 последовательность.

выводи

I,. С помощью метода микроинъекций в зиготы мышей получены трансгенные животные, несущие в своем геноме последовательности реком-бинантных плазмид рдсо, рМА.3, рТК№, содержащих ТК-ген НЗУ. Анализ потомства этих мышей показал передачу трансгенов в ряду поколений животных. Обнаружена транскрипция гена тимидинкиназы вируса герпеса у трансгенных мышей. Уровень экспрессии в некоторых случаях отличался в разных органах трансгенных мышей, а также у родителей и их потомков.

2. Проклонирован и проанализирован фрагмент генома трансгенной мыши, в который произошла интеграция части плаэыиди рШ.3. Обнаружены перестройки геномной ДНК в области интеграции трансгена. Выявлена и охарактеризована повторяющаяся последовательность, прилегавшая к сайту интеграции трансгена (семейство Т1). Показано, что повторы семейства Т1 являются эволюциоино консервативными и транскрибируются в ряде органов и тканей мыши и эмбриона курицы.

3. Анализ трансгенных мышей, содержащих ДНК аденовируса ЗД7, выявил наличие тканеспецифической злиминацми трансгена о мышечной ткани в ГО-УЗ-поколениях, которая прекращалась, начиная с У4-поколения.

В процессе передачи трансгена по наследству наблюдались случаи его перестроек. Параллельно с происходящими изменениями в структуре последовательностей ДНК ЗА. 7 и характере ее элиминации, наблюдали изменения в транскрибируемости аденовирусных последовательностей в разных органах трансгенных мышей, таю»е начиная с 74-поколения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Газарян К.Г.. Генинг Л.В., Незнанов II.С., Андреева Л.Е., Макарова И.В., Кузнецова Е.Д., Косиков А.И., Баранов К).П., Кучерявый В.В., Алексеева М.В., Тарантул В.З. Микроинъекции в зиготы мышей рекомбинантных ДНК, содержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса и последовательности ДНК ретровирусов. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. -1984, !Н0, с.22-28.

2. Тарантул Е.З.» Макарова И.В., Андреева Л.Е.к Смирнова М.Б., Газарян Т.Г.! Кузнецова Е.Д. ДНК аденовируса обезьян и ее экспрессия в органах потомства трансгенных мышей. Молекулярная генетикаi микробиология; вирусология. -1986¡, М, с.22-26.

3. Тарантул В.З.; Кучерявый В.В., Макарова И.В.} Баранов D.H., Бегетова Т.В.* Андреева Л.Е., Смирнова М.Б.5 Газарян К.Г. Клонирование фрагмента ДНК трансгенной мыши-, содержащего интегрированную рекомбинантную плазмиду. Молекулярная биология. -i986-, Ki с.278-287.

4.Tarairtal V.Z., Kuoherlavy V.T., Иакагота I.V., Вагааат Tu.3., Begetora I.V., Andreera 1.3., Gasaryaa K.&. Eearraageneirts et mioreiajeoted reooiablaaat ШГА la the genese of ir&asgeaie aloe, Molecalar end General G-eaertlos._ 1986^ V.203i )f2j p.305-3ii.

5. Косиков А.И. j Тарантул В.З.^ Макарова И.В.4 Андреева JI.E.j Неклюдова И.В.> Бенюмов А.О.; Газарян К.Г. Транскрипция в ооци-тах лягушки и трансгенных мышах рекомбинантных плазмид с длинными концевыми повторами провирусов ретровирусов. Молекулярная генетика* микробиология> вирусология. -i986, $10-, c.2i-26.

6. Макарова И.В.* Тарантул В.З., Незнанов Н.С., Газарян К.Г. Клонирование и анализ консервативных повторяющихся последовательностей семейства TI. Тезисы докладов И Всесоюзного симпозиума "Структура и функция клеточного ядра^ Москваs 1987; с.117.

7. Тарантул В.З.s Макарова И.В.; Андреева Л.Е.; Кузнецова Е.Д.; Кучерявый В.В.j Баранов D.H. Стабильность чужеродной ДНК у трансгенных мышей. Тезисы докладов 5-го съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова; Москва,i987;T.6-,сЛ9.

8. Макарова И.В., Тарантул В.З.; Газарян К.Г. Структурные особенности сайта интеграции чужеродной ДНК в геноме трансгенной мыши. Молекулярная биология. -1988; P6S с. 1553-1561.

Технический редактор С.К. Сведяова

Т-40490. Ol.II.88. ФоЕмат 60x84/16. Уч.-изд. л. 0,8. Тнрая 120. Заказ 385.

Отпечатано в ИАЗ