Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная организация и транскрипция генома теплокровных животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная организация и транскрипция генома теплокровных животных"

я/е

Ордена Ленина и ордена Дружбы Народов Академия наук УССР

текулярной биологии и ген^трси

/Ы&

^уС} С Налравах рукописи

УДК 547563 3 5112123 57852

ТАРАНТУЛ Вячеслав Залманович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ТРАНСКРИПЦИЯ № $3 ГЕНОМА ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Каев -1989

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР (Отдел молекулярной эмбриогенетики и клеточной дифференцировки)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

B.М. Кавсан

доктор биологических наук . К. А. Кафиани доктор биологических наук

C.А. Лимборская

Ведущая организация - Институт цитологии АН СССР

Защита состоится " " 1989 г. в часов

на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени доктора наук Д016Л1.01. Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, Киев, ул. Заболотного, 150

С диссертацией можно ознакомиться в.библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разослан " "

1989 г.

Ученый секретарь спецсовета кандидат биологических наук

/I

О

L

Л. Л. Лукаш

Актуальность проблеми. Основная задача молекулярной генетики -изучение структуры и функции генома, который является основой наследственности. Исследование молекулярной организации генома,эу-кзриот направлено в лерзу» очередь на выяснение механизмов работы генов, принципов их регуляции в дифференцированных и дифференцирующихся клетках, а также на раскрытие закономерностей эволюции организмов.

Многочисленные исследования строения и функционирования генома эукаршт, проведенные в последние десятилетия,значительно расширили представления о молекулярных механизмах работы генетического аппарата животных и растительных клеток. Обнаружение в ДНК эукариот повторяющихся последовательностей, палиндромов и гомо-полимерных участков, выделение и анализ индивидуальных генов, обнаружение в них экзонов и интронов, детальный анализ элементов, контролирующих и регулирующих транскрипцию различных последова-тельносей ДНК, исследование структуры гетерогенной ядерной РНК и механизма сплайсинга, выделение и характеристика большого числа индивидуальных мРНК, обнаружение обратной транскрипции - все это явилось большим вкладом в решение вопросов структурно-функциональной организации генома эукарист и основных принципов регуляции экспрессии генов.

В отличие от прокариот, молекулярные механизмы функционирования и организация генома эукариот обладают рядом особенностей: разобщенность процессов транскрипции и трансляции; наличие специальных механизмов, обеспечивающих дифференцировку клеток; большая избыточность нуклеотидных последовательностей в геноме, в первичных продуктах транскрипции и даже в мРНК. Все эти важные структурно-функциональные особенности генома эукариот были использованы при создании различных гипотетических моделей организации, экспрессии и регуляции экспрессии генов (Georgiev, 1969; Davidson et al., 1977; Davidson, Britten, 1979; Scherrer et al., 1979)-. ' Однако до сих пор ни одна из них не стала общепризнанной, подобно модели Жакоба и Моно для прокариот.

Со структурными и.функциональными проблемами тесно связан вопрос об эволюции генома эукариот и отдельных его элементов. 3 течение двух последних десятилетий этот вопрос также привлекал к себе пристальное внимание. Был достигнут существенный прогресс в изучении консерватизма различных типов последовательностей и не-

стабильности генома. Однако в целом проблема, па-прежнему, далека от своего полного решения.

К началу настоящей работы (1970 г.) еще только разрабатывались подходы"к углубленному исследованию структуры и функции генома высших эукариот. Появились лишь первые данные о молекулярной организации генома и продуктов его транскрипции. В такой ситуации была очевидной потребность в более детальном исследовании структуры генома эукариотических организмов и его экспрессии на уровне РНК. Это могло служить основным подходом к решению проблемы регуляции экспрессии генов в дифференцированных и дифференцирующихся клетках, проблемы, которая была и остается одной из центральных в современной молекулярной генетике. Выполнению такого рода работ способствовала постоянная разработка принципиально новых подходов и усовершенствование методов исследования - ре-ассоциация ДКК, различные варианты гибридизации ДНК-РНК, обратная транскрипция, генная инженерия, трансгеноз.

Одновременно с этим шел поиск новых моделей исследования. В лаборатории, где проводилась настоящая работа, еще в конце 60-х годов были начаты молекулярно-генетические исследования на системе эритроидных клеток голубя, которая являлась удобной моделью для изучения молекулярных процессов, происходящих при терминальной дифференцировке клеток (Сагагуап, 1982). В конце. 70-х годов в нашей и других лабораториях были разработаны подходы для переноса чужеродных генов в геном целых животных с помощью микроинъекций в зиготы и ранние эмбрионы. Трансгенные организмы стали новой моделью для изучения структуры и экспрессии генов,' регуляции экспрессии генов при развитии организмов, а также для выяснения вопросов, связанных со стабильностью генома.

Цели и задачи исследования. Основная цель настоящей работы - выяснение принципов молекулярной организации генома высших организмов (теплокровных животных) и закономерностей транскрипционных и посттранскрипционных процессов, отражающих регуляцию экспрессии генома при дифференцировке клеток.

. - В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи, для решения которых использовались некоторые оригинальные экспериментальные подходы и широкий спектр современных молекулярно-генетических методов:

1. Установить особенности молекулярной организации генома

птиц (голубь, курица); охарактеризовать консервативные последовательности, присутствующие в геномах, птиц и млекопитающих (мышь, человек).

2. Определить специфику структуры участков генома, с которыми интегрирует чужеродная ДНК после ее введения в зиготы млекопитающих (мышь, кролик); для оценки стабильности этих участков проследить за структурой трансгенов в онтогенезе и в ряду поколений, трансгенных животных.

3. Выяснить молекулярную организацию транскрибирующихся участков генома; охарактеризовать т'ранскрибируемость различных после- ; довательностей ДНК (палиндромы, тандемные и диспергированные повторы, уникальные последовательности,- глобиновые гены) при диф-•ференцировке эритроидных клеток голубя.

4. Определить характер транскрипции консервативных последовательностей геномов теплокровных животных и трансгенов у трансгенных мышей.

Научная новизна и практическая ценность работы. • Прй выполнении настоящей.работы получен ряд принципиально новых данных о структуре, организации и транскрипции генома птиц и млекопитающих. Впервые детально охарактеризована молекулярная организация генома голубя. В нем обнаружены дискретные по частоте повторения классы повторов (редкие и средние повторы), необычно длинные последовательности поли(ёА)-поли(с1Т). Клонированы и охарактеризованы консервативные редко повторяющиеся последовательности, присутствующие в геномах, теплокровных животных. Показано, что эти повторы транскрибируются во многих типах клеток на разных стадиях развития организмов с характерной для каждого из них ткане-специфической эффективностью, которая сохраняется в эволюции.

Установлена структура единиц транскрипции в эритроидных клетках голубя на разных стадиях дифференцировки. Показан характер изменений, происходящих на уровне транскрипции при эритропоэзе. »

Обнаружены и детально охарактеризованы дискретные фракции стабильных ядерных РНК в эритроидных клетках голубя. Полученные данные позволили заключить, что в ходе терминальной дифференцировки (от эритробластов до эритроцитов) регуляция экспрессии генома осуществляется как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне.

Впервые в СССР выделена индивидуальная мРНК (глобиновая) и охарактеризован продукт обратной транскрипции (кДНК). С помощью

кДНК прослежена динамика синтеза и накопления глобин-кодирующих молекул РНК в различных эритроидных клетках. В результате установлено, что регуляция экспрессии глобиновых генов при дифферен-цировке зритроидных клеток осушествляется на 2 уровнях (транскрипционном и посттранскрипционном); при этом характер посттранскрипционной регуляции меняется по мере прохождения клетками разных стадий.

Проведены анализы первых б стране трансгенных мышей с генами ДНК- и.РНК-содержащих вирусов. Обнаружено специфическое поведение ДНК аденовируса SA7 в геноме трансгенных животных. Выявлены отдельные случаи перестройки структуры трансгена, происходящие при интеграции. Обнаружены и клонированы перестроенные геномные последовательности, фланкирующие трансген. Результаты анализа мест расположения трансгена в геноме животных свидетельствуют о преимущественной интеграции чужеродной ДНК с участками генома, содержащими прямые и обращенные повторы.

Результаты работы могут быть полезными для выяснения механизмов эритропоэза и трансгеноза. Полученные данные об организации генома эукариот, структуре единиц транскрипции, об консервативных участках генома и его "горячих" точках, а также клонированные консервативные повторы могут быть использованы при изучении геномов других классов организмов и, в частности, генома человека, что является в настоящее время актуальной проблемой.

Некоторые результаты работы приведены в монографии, которую используют в. качестве учебного пособия при прохождении курса молекулярной биологии развития.

Апробация результатов. Материалы диссертации докладывались на III Всесоюзном биохимическрм съезде (Рига, 19"/4), IX съезде FEB0 (Амстердам, 1974), на Советско-французском симпозиуме "Структура и функция нуклеиновых кислот (Пущино-ка-Оке, 1974), VII Всесоюзном симпозиуме "Механизмы контроля раннего эмбрионального развития" (Москва, 1974), на Советско-американском симпозиуме "Структура и функция нуклеиновых кислот" (Киев, 1975), III, IV и V Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов (Москва, 1976. 1979, 1983), VI, VII и IX Всесоюзных симпозиумах "Структура и функция клеточного ядра" (Алма-Ата, 1977, Харьков, 1980, Черноголовка, 1987), на Советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Пущино-на-Оке, 1980), IX, X и XI Международных симпозиумах по структуре и фун-

кции эритроидных клзток (ГДР, Берлин, 1980, 1983, 1986), на Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" (Пущино-на-Оке, 1982), на Международном симпозиуме по онковирусам и рабочем совещании "Ревертаза-онкоген" (Рига, 1982), II Всесоюзном совещании по ге-нэтике соматических'клеток в культуре (Звенигород, 1983), на V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.К. Вавилова (Москва, 1987), II Всесоюзной конференции по цитогенети-ке (Ленинград, 1988),на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино-на-Оке, 1988), на Советско-финском симпозиуме по биологии развития (Ташкент, 1988) и на конференции "Ак- . туальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии (Алма-Ата, 1989).

Обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 458 страницах машинописного текста и содержит 82 рисунка и 27 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 863 ссылки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Структурная организация генома теплокровных животных.

1.1. Геном голубя.

Для изучения структурной организации генома голубя был исполь- • зован комплекс взаимодополняющих подходов: фракционирование ДНК в градиенте CsCl, рестрикционный анализ, фракционирование ДНК по кинетике реассоциации, аффинная хроматография, клонирование последовательностей, гибридизация с хромосомами in situ.

Клонирование и анализ дискретных по размеру фрагментов (0у9 i. п.н.), образующихся при рестрикции ДНК голубя эндонуклеазой EcoRI, показали, что они представляют собой семейство сателлито-подоб-ных последовательности (FR1). В геноме содержится 2-4х104 копий последовательностей этого семейства, которые составляют примерно половину фракции быстро реассоциирующей ДНК.

С помощью хроматографии на поли(11)-сефарозе из ДНК голубя выделили последовательности поли(йА), размер которых достигает 270-300 п.н. Наряду с длинными гомополимерными последовательное-

тями с помощью гибридизации выявили и короткие олиго(<1А). В сумме они составляют около 3% генома. При фракционировании ДНК по кинетике реассоциации большая часть поли- и олиго(с1А) обнаруживается во фракции уникальных последовательностей. Некоторые поли-и олиго(йк)-последовательности кластеризованы в отдельных участках генома, при этом по соседсву с ними расположены короткие инвертированные повторы.

Анализ кинетики реассоциации суммарной ДНК и грубо очищенных фракций неповторяющихся и повторяющихся последовательностей генома голубя позволил провести расчеты, на основании которых фрагменты ДНК размером около 450 п.,н. расфракционировали с •'спользо-ванием оксиапатита на 4 относительно гомогенных компонента: быстро реассоциирующие последовательности (частые и обращенные ' повторы), средние повторы, редкие повторы и уникальная ДНК. В результате детального исследования этих фракций были получены данные, характеризующие структуру генома голубя. Они суммированы в табл. 1. -

•Фракция ДНК, связывающаяся с оксиапатитом при значении 10"* (нулевое связывание), содержит, главным образом, обращенные повторы (около 16% ДНК). Основная масса обращенных повторов распределена вдоль всего генома голубя. Половину фракции частых пов торов составляют тандемно расположенные повторы семейства ПЛ.

Согласно данным, полученным при фракционировании ДНК, около 11% генома представлено умеренными повторами, состоящими из 2 дискретных классов: средних и редких. На рис. 1 приведены кривые реассоциации этих двух изолированных классов повторов. Результаты фракционирования ДНК голубя и анализа полученных фракций позволили нам впервые показать, что в геномах некоторых эукариоти-ческих организмов существуют (1) классы повторов, гомогенные по частотам повторения входящих в них семейств последовательностей, и (2) классы повторов с редкими (<100) частотами повторения последовательностей.

Средние повторы тлеют ОС-содержание (39%) близкое к СС-содер-жанию суммарной ДНК, а редкие повторы состоят из последовательностей с высоким ОС-содержанием (55%). Эксперименты по плавлено выделенных фракций ДНК после их реассоциации показали, что средние повторы образуют несовершенные дуплексы, а редкие - совершег ные. Следовательно, семейства, входящие в класс редких повторов представлены в геноме голубя высокогомологичными повторяющимися

Таблица I. Кинетические компоненты генома голубя, выявленные в результате анализа кинетики реас-социации суммарной ДНК, фрагментированной до 450 пар нуклеотидов,

и изолированных фракций

Кинетический \ Фракция, компонент \% суммарной ДНК 1 Константа скорости, л/мольхсек Сс**/2' мольхсек/л Частота повторяемости

Обращенные повторы 16,0 МО4

Частые повторы 3,0 20,0 0,05 | 30000

Средние повторы 4,0 2,5 • 0,4 4700

Редкие повторы 6,85 2,74x10 | 36,5 51

Уникальные последовательности ■ 68,2 5.32ХЮ-4 1800,0 1

Нереассоциирую-щие последова- | тельности 2,0

Рис.1. Оптические кривые реассоциации фракций средних повторов

(1) в 0,24 М фосфатном буфере при 62* к редких повторов

(2) в 1 М ИаСЮ,, 0,01 М Трис-НС1, рН 7,5 при 70е. Неэквивалентный С01. Сплошные линии - теоретические кривые реакций 2-ого порядка.

о

о'-'-----'-----

2 4 6 в чаи

Длина фрагментов, тыс.п.н.

Рис.2. Зависимость от длины фрагментов уровня реассоциации мече ной суммарной ДНК голубя с избытком немеченых фрагментоЕ размером 450 п.н.

Реассоциацию проводили до С01-36,5. Получаемые значен поправляли на "нулевое" связывание и на количество несвг зывающейся с оксиапатитом ДНК. Сплошные линии - линейное приближение экспериментальных, данных по методу наименьш квадратов.

госледовательностями.

Основной по массе частью генома голубя являются уникальные по-ледовательности ДНК (68% генома). Анализ их кинетики реассоци-ции позволил точно оценить размер гаплоидного генома,' который казался равным 1,9 -пг.

Средние размеры и взаимное расположение уникальных последова-ельностей и 2 классов умеренных повторов были определены с по-ощью эксперимента, результаты которого приведены на рис. 2. В рисутствии избытка коротких немеченых фрагментов была выяснена ависимость доли реассоциирующих меченых фрагментов ДНК от их лины. Анализ' данных позволил заключить, что около 23% генома го-убя представлено уникальными последовательностями размером 3,7 ыс. п.н., перемежающимися с умеренными повторами размером 2 тыс. .н. Около 50% генома состоит, из уникальных последовательностей азмером свыше 13,5 тыс. п.н. Определение длин повторов, проведен-эе с помощью реассоциации длинных фрагментов ДНК до разных зна-зний C0t и обработки нуклеазой S1,показало, что длины дуплексов, Зразуемых средними и редкими повторами, варьируют в диапазоне г 0,6 до 4,5 тыс.п.н.

С помощью клонирования и анализа клонированных редких повторов )лее детально исследовали организацию последовательностей этой ¡акции генома. Используя в качестве зонда фрагмент ДНК, кло-¡рованный из фракции редких повторов (содержит повтор семейства 18), из библиотеки генов голубя выделили протяженные последова-¡льности ДНК с повторами этого семейства. На рис. 3 приведены ¡зультаты анализа двух клонированных фрагментов. В обоих случаях [и представляют собой протяженные кластеры повторяющихся элемен-в. Между разными кластерами лишь 1 участок (R), соответствующий втору Г48, имеет гомологию. Внутри кластера повторов- I сущест-ет гомология между последовательностями, расположенными с двух орон от участка R, что обнаружено с помощью кросс-блот-гибриди»-ции. Частоты повторения разных последовательностей в кластерах личаются, но уникальная последовательность имеется лишь на ле-м конце кластера II. Интересна одна общая для обоих кластеров кономерность: во всех 9 обнаруженных случаях сайты узнавания я рестриктаз Bgll и BglII совпадают. Это указывает, вероятно, сущесЬование внутри кластеров одинаковых коротких повторяющих-участков. Используя клонированные кластеры умеренных повторов качестве зондов,установили, что в геноме голубя наряду с дис-

а 1 р

б и

И if63,^

Ва Ва

S V

К

р ^¡¡в J, I t

Bg,

U-

Bg в

a б

i

в

"гттс .

pB p вр I I 1

BQpB:

в +

+

-V—W/—»—>//■//////' ■ »

■PK G

н +

+

+

I +

+ +

в

+

+ +

J +

+

А

+

+ +

р

1,,,J

н

ц

Р В в Е

¥

¥

-ПС1—^ТН-г

Р В Р В Р. 31

J_I I

.■■» 1>/////Л-

D

В +

+

Р JO + + ?

+ +

с +

в +

+ + +

А +

+

У

5

Рис. 3. Структура и рестриктные карты двух клонированных фрагментов генома голубя (I и II), содержащих кластеры умеренных повторов.

а - рестриктные карты, б - расположение Pstl-фрагментов. Е '- EcoRI, Н - HindllI, Y - EcoRV, В - Bgll, Bg-BglII, Ва - BamHI, S - Smal, S1 T SalGI, P - Pstl.

Районы, отмеченные штриховкой, содержат большое число некартированных сайтов для Pstl. Темные квадраты - участки, гомологичные повтору р48. Стрелками объединены Pstl-фрагменты с взаимной гомологией. Знаками (+) под Pstl-фрагмэнтами указаны относительные частоты повторения соответствующих фрагментов в геноме голубя.

пергированными повторами и повторами, кластеризованными в разном сочетании, содержатся кластеры, в которых организация.повторяющихся последовательностей постоянна.

С помощью гибридизации in situ определили расположение на крупных митотическиХ хромосомах повторов, гомологичных содержащимся, в кластерах I и II. Сайты гибридизации группируются'в при-теломерных и прицентромерных блоках гетерохроматина и в других гетерохроматиновых сегментах.

Таким образом, разнообразные подходы, использованные для анализа ДНК- голубя, позволили получить детальную картину структурной организации генома этого организма. Выявлены некоторые новые специфические особенности: существование дискретных классов повторов, наличие редко повторяющихся последовательностей, умеренно длинный период перемежаемости повторов и уникальных участков, кластеризация части умеренно повторяющихся последовательностей, присутствие протяженных последовательностей поли(с1А)-поли(<ЗТ).

1.2. Структурная организация консервативных элементов геномов теплокровных животных.

Как показала гетерологичная гибридизация, около 6,7% уникальных последовательностей и 13,8% редких повторов генома голубя имеют гомологию с ДНК курицы. Среди этих консервативных повторов находятся и повторы, содержащиеся в клонированных нами кластерах I и II (рис. 3). При гибридизации этих кластеров повторов голубя с митотическими хромосомами курицы гомологичные последовательное- . ти выявляются преимущественно в R-сегментах.

' Другое семейство консервативных умеренных повторов (Т1) обнаружено нами в геноме мыши. Анализ одного из членов этого семей-сва показал, что он относится к типу длинных диспергированных повторов. С помощью секвенирования внутри клонированного повтора семейства Т1 обнаружена последовательность олиro(clG)J7, характерная для некоторых ранее изученных длинных диспергированных повторов грызунов. Используя в качестве зонда клонированный повтор семейства Т1, из библиотек генов голубя, мыши и человека выделили рекомбинантные фаги, содержащие гомологичные последовательности. Их анализ показал, что повторы семейства Т1 у всех 3 видов организмов перемежаются с уникальнными последовательностями, но сгруппированы в отдельных областях геномов.

Таким образом, в геномах теплокровных животных нами обнаружены 2 неописанных ранее семейства консервативных редких повторов. Кроме того, клонированы и охарактеризованы области геномов, содержащие повторы этих двух семейств. Консервативные повторы сохранили в эволюции не только свою последовательность, но и характер организации, который, однако, отличается у разных семейств. Высокий консерватизм семейств'Т1 и Г48 указывает на их древнее происхождение и большую эволюционную стабильность. По этому параметру, а также по характеру расположения на хромосомах и транск-рибируемости (см. далее) обнаруженные повторяющиеся последовательности можно отнести к элементам субгенома "домашнего хозяйства" (Holmquist, 1987). "

1.3. Участки генома, интегрирующие с чужеродной ДНК ("горячие" точки), и трансгены.

Появление трансгенных животных открыло новые возможности для исследования организации генома эукариот. В частности, стало возможным изучать структуру участков генома, с которыми интегрирует чужеродная ДНК после ее введения в зиготы, а также самих"'' трансгенов, как искусственных элементов генома, их стабильность и наследование. В СССР первые трансгенные животные были получены в нашей лаборатории. Ддя переноса в мышей использовали ДНК аденовируса SA7 и рекомбинантные плазмиды, содержащие ген тимидинкина-зы вируса герпеса (HSV) с длинными концевыми повторами (LTR) различных провирусов как промоторами, а также ген гормона роста быка, ген релизинг-фактора гормона роста человека и эмбриональный глобиновый ген курицы.

Как Показал анализ ДНК SA? у трансгенных мышей, полученных в 2 больших независимых сериях экспериментов (41 и 209 животных), ^ имеются определенные закономерности в характере ее переноса, сохранения и передачи по наследству. Во-первых, в геномах трансгенных мышей часто присутствовали лишь фрагменты переносимой виру-, сной ДНК, а не целые молекулы. При этом преимущественно интегрировал левый конец ДНК SA7, содержащий онкоген. Во-вторых, в Fc-поколении у всех проанализированных трансгенных мышей вирусная ДНК не обнаруживалась в таких органах как мышцы, сердце и хвост, хотя имелась в других органах и передавалась по наследству по законам Менделя. В-третьих, в отдельных случаях, когда интегриро-

вали целые молекулы ДНК SA7, при передаче по наследству происходили перестройки трансгена. Параллельно с этим прекращалась элиминация ДНК SA7 из мышц, сердца и хвоста. Выявленная нестабильность трансгена аденовирусной природы в значительной мере обусловлена, по-видимому, особенностью его собственной структуры, а не участков генома, с которыми интегрировала чужеродная ДНК. Этот.вывод основан как на многочисленном воспроизведении описанных феноменов у разных трансгенных мышей, так и на результатах исследований, проведенных с использованием трансгенных животных, содержащих тр.ансгены иной природы.

При переносе рекомбинантных плазмид с тимидинкиназным геном HSV и LTR провирусов ретровирусов были получены трансгенные мыши, у которых структура трансгена отличалась от структуры переносимых плазмид. С помощью метода "спасения" плазмиды из генома трансгенной мыши, родившейся из зиготы, в которую инъецировали плазмиду рМАЗ, клонировали интегрированную часть рекомбинантной плазмиды с фланкирующими ее последовательностями геномной ДНК мыши (плазмида pMARl, см. рис. 4). В "спасенной" плазмиде содержится только векторная часть переносимой плазмиды рМАЗ и обе фланкирующие ее геномные последовательности трансгенной мыши, соединенные по сайту узнавания для BamHI, который был использован при спасении этой плазмиды из генома. Анализ фланкирующих участков показал, что в одном из них содержится редко повторяющаяся Последовательность генома мыши, относящаяся к семейству Т1 (см. выше). Наличие этого повтора и границы его расположения, указанные на рис. 4, были определены с помощью блот-гибридизации меченой pMARl с геномной ДНК (рис. 5) и меченой геномной ДНК с немеченой pMARl (рис. 6). Сравнение размеров последовательностей, комплементарных pMARl в геноме нетрансгенных мышей с рестриктазной картой этой плазмиды (рис. 4) свидетельствует о том, что в месте встраивания чужеродной ДНК произошла перестройка геномных после-1 довательностей.

Секвенироваяие участков геномной ДНК, прилежащих к трансгену, показало, что справа от трансгена имеется множество коротких прямых и обращенных повторов. Наиболее длинные из них отмечены на рис. 7. Сходные структуры были обнаружены недавно и другими авторами (Wilkie, Palmiter, 1987) в местах интеграции чужеродной ДНК. Кроме того, проведенный нами дополнительный анализ последовательностей, фланкирующих трансгены различной природы (ДНК SA7,

Рис. 4. Схемы строения и карты рестрикции инъецированной плазми-ды рМАЗ (А) и "спасенной" плазмидо pMARl (Б). Темные области -• pBR322, светлые - спаренные LTR (в А) и геномные последовательности (в Б). Заштрихованная область - ТК-ген HSV; область, отмеченная точками - кДНК RSV.

Рис.5. Рис.6.

Рис. 5. Блот-гибрздизация меченой рМАМ с суммарной ДНК контрольной мыши, рестрицированной EcoRl (1), ВатН1+Е^1 (2) или ВаюН1 (3). а - гибридизация при 65°, отмывка при 65" в 0,2хЗБС; б - гибридизация при 60°, отмывка яри 50е в 2хБ5С; в - гибридизация при 55", отмывка при 25е в 2хБ5С.

Рис. 6. Блот-гибридизация суммарной меченой ДНК мыши с р!Ш1, рестрицированной Рзи+ВазпН! (1), РэН+ЕсоК! (2), Рб11 (3).

а 1 САААМТСТАССТТААТААААССААСТААССЙААСААСАТТАТТАСАССТ 51 АСАААСАТТСАТСАСТТСАСАТТТАССААТАССАСАТСААСТААТССАСА 1 >>>>>>>>>> 1 <<<<<<<<<< 101 ТАСАТААССССААААССААТТАССАСССАТАСТААСАССААСАСТАТСАТ 151 МСОСТССтАССАСАССА(ХАТАААМССААМТАСССАСАС(КЛТТТ 201.ССАМСААСТТТТСЮСАСАСССССТААТАСТАААТСТТТАСАСТССАТАС , 251 ССТССААТАТСШ;ТССТСАА

б . 1 ССАССТССТССТССАТСТССАСССАССТССТССССССАСТАТСТССАТСС 51 САССТССАШ^С^

'!>>>>>>>>>>>>>

2 >>>>>>>>>>>>>>>>> _

101 ТСССАССАСССТС^ТСТСАСТОСТСАССТСС(^ТССтаСТСССТССТ

'■..'■'Г '.',■!. 1 <<<<<<<<<<<<<

; ';.:•; 2 <<<<<<<

3 >>>>>>>> >

151 ^АЩ^^етдхссстстАса:АСТстсш:АСТсстАССтсАт <<<<<<<<<<

>

3 <<<<<<<<<<

201 СГГСТССАСТСАТСКАТСЮАССТСАТТСТССаТААТАТСССАТАССТСТТС 251 (ЖААШТ<ХТиТСААШ(£ССАСАТиССГГССТСАСА.САТАТАШ

Рис. 7. Нуклеотидные последовательности левого (а) и правого

(б) фланкирующих участков траксгена в плазмиде рМАЙ1. > Квадратами обведены прямые повторы; стрелками указа- . но направление к расположение обращенных повторов, обнаруженных с помощью ЭВМ при (7-300, д-10 и К-1.. 1-3 - соответствующие друг другу повторы. Волнистыми линиями подчеркнуты дуплицироваяные участки, расположенные по краям прямых повторов.

ген гормона роста быка, ген релизинг-фактора гормона роста человека) у 7 трансгенных мышей и 1 кролика, осуществленный с помощью фракционирования ДНК по кинетике реассоциации и последующей гибридизации, показал, что в них во всех случаях содержатся прямые и обращенные повторы.

Таким образом, исследование трансгенов и фланкирующих их последовательностей геномной ДНК позволило выявить нестабильность в местах интеграции чужеродной ДНК. "Горячие" точки генома характеризуются наличием прямых и обращенных повторов, поскольку интеграция чужеродной ДНК осуществляется преимущественно с участками, содержащими такие элементы.

2. Транскрипция элементов генома теплокровных животных.

Исследование только структурной организации генома не дает ответа на вопрос о функции различных элементов, о закономерностях экспрессии генома и регуляции этого процесса. Для решения данных проблем необходим анализ транскрипции различных классов последовательностей ДНК и судьбы продуктов транскрипции в клетках. Наиболее удобными для этих целей являются модели, на которых транскрипцию и посттранскрипционные превращения можно изучать в процессе дифференцировки и развития организмов. Нами использовались две основные модели - эритропоэз у голубя и трансгенные мыши.

2.1. Транскрипция генома голубя при терминальной дифференци-■ ровке эритроидных клеток.

- Исследование кинетики гибридизации избытков суммарных ядерных РНК (яРНК) разных популяций эритроидных клеток с уникальной ДЙК показало, что по мере созревания клеток уменьшается сложность яРНК и падает среднее число копий каждого вида яРНК в расчете на 1 клетку (табл. 2). Поскольку основным по сложности классом моле-яРНК является гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), полученные резуль таты относятся, главным образом, к этому классу молекул.

В качестве первичных продуктов транскрипции рассматривали фракцию ядерной быстромеченной РНК с коэффициентом седиментации >45Б (>45Б гяРНК). Гибридизация >45Б гяРНК с различными изолированными фракциями ДНК голубя позволила определить, что в единицах тран

Таблица 2. Характеристика ядерных ГНК эритроидных клеток голубя.

Клетки Сложность % гибридизации с уникальной дак яРНК {Число раз-1личных мо- нуклео- ¡лекул раэ-тиды {мером 5000 {нуклеотидов ...... "набл. ¡Среднее {число . Кожид. !™пий |клетку

Эритробласты Ретикулоциты 15,0 6,5 3,6X10® ! 72000 я ! 1,6*10 ! 31000 » ! 5.2Х10-5 6,5x10"® 2ЛХ10-3 I 0,12 _3 ! 4,3x10 ! 0,04 !

Сложность уникальной Д НК « 7,8хЮ*!дальтон (1,2x10^ п.н.) ^наблюд." Рассчитаиа 419 кривых кинетик гибридизации в избытке яРНК, предполагая, что реакция протекает по кинетике 1-ого порядка.

К,

окид.

рассчитана по форцуле:

Кожид.я 2000(8,&с10^)/2>&С(СЯОЩ1ОСТЬ РНК в нухвеотидах)

Ср. число молекул на клетку *

(кол-во РНК на клетку, г)х(доля РНК в ядре)х [КнабЛ<ЛСожид<]

сложность И« (н)х330/(6,02x10^) "

Количество РНК на I эритробласт равно 2,8 пг (в ядре ЗЭ? ИЖ) Количество РНК на I ретикулоцит равно 1,28 пг (в ядре 20% РНК)

.1 I

крипции генсма содержатся все основные классы последовательностей (средние, редкие и обращенные повторы, уникальные последователь-кости). Однако содержанке разных элементов в транскриптонах отличается от их содержания в геноме в целом.

Исследование >45Б гяРНК в трех популяциях эритроидных клеток, формирующихся б ходе эритропогза (эритробласты. ретикулоциты и эритроциты), показало, что они отличаются не только сложностью, ко И по ряду других параметров. По мере созревания эритроидных клеток в синтезируемых >455 гяРНК (1) уменьшалась доля последовательностей, транскрибированных со средних и редких повторов; (2) падало содержание шпилечных структур; (3) увеличивалась доля быстро распадающихся молекул. Таким образом, при эритропоэзе в целом происходят существенные качественные и количественные" изменения в характере транскрипции генома, т.е. осуществляется регуляция на уровне транскрипции.

Исследовали содержание во фракции >45Б гяРПК молекул, несущих глобнн-кодкрующие последовательности. С помощью хроматогра-фкк на колонке с глобиновой кДНК, пришитой к целлюлозе, оценили, что в ядрах эритрсбластов и ретякулоцитов содержанке таких молекул равно примерно 2 на одно ядро. Это существенно вине, чем среднее содержанке каждого шдо молекул яРНК (1 копия ка 10 зритро-бяастоЕ или ка £5 ретикулоцитсв). Следовательно, имеет место усиленная по сравнению с другими генами транскрипция глсбаковых генов з обеих популяциях эритроидных клеток. т.е. регуляпкя экспрессии этих генов осущесвляется па уровне транскрипции и не изменяется б ходе созревания клеток.

С помощь» конкурентной гибридизации показали, что в эрятробла-стах значительно большая часть последовательностей /455 гяРНК гомологична цитоплазматическим полм(А)-содержащим РНК, чем б ре-тикулоцитах. Это указывает па снижение при эритропоэзе многообразия синтезируемых первичных продуктов транскрипции, имзевих срой-ства пре-мРНК.

При центрифугировании в градиенте сахарозы в денатурирующих условиях основная масса яРНК эрктробластос и ретикулоцктов седц-ментирует с коэффициентом около 265. Взаимоотношение между >453 гяРКК к обнаруживаемой по оптической плотности 285 яРНК выяснялось в экспериментах по конкурентной гибридизации с использованием разных кинетических Фракций ДНК. Как видно из данных рис, 6, во фракции 26Б яРНК содержатся значительные количества посдерова-

I ~

0.6-j

n 4' rg

•I 0,2'

а

ö

I

1 2 E

l NN

I

1

1 2 Ж

Рис. 8. Конкуренция мехду поли(А)" (а) к поли(А)+ (б) субфракциями меченой >45S гяРШС я избытками немеченых 28S рРНК (1) я 28S яг'КК (2) за комплементарные места на повторяющихся (I) и уникальных (II) последовательностях ДНК голубя.

Максмальная гибридизуемость в присутствии эквизалентко-го количества РНК Е. coli {принята за 1) составляла при гибридизации с повторами в обоих случаях около 30%, а с уникальной ДНК -39 и 46% соответственно. Приведены средние результаты 2-3 опытов. Средняя ошибка для 28S яРНК равна* 0,064, для 28S рРНК ±0,028.

тельностей, транскрибированных с уникальных и умеренно повторяющихся участков генома, которые сходны с no*n(A)">45S гяРНК, но лишь последовательностк 26S яРНК, считанные с повторов, сходны с mwm(A)*>45S гяРНК. Поскольку отдельные молекулы roum(A)'>45S гяРНК содержали копии с уникальных последовательностей генома, отсутствующие в поли{ А) '-молекулах, можно заключить, что посттранскрипционное полиаденилирование по крайней мере некоторых первичных продуктов транскрипции осуществляется селективно.

Как отмечалось выше, не вся гяРНК является быстро распадающейся. В эритробластах голубя доля быстро распадающейся гяРНК меньше, чем в ретикулоцитах. Для выявления РНК, задерживающейся в ядре на длительные промежутки времени, был проведен чейз-зкспе-римент ín vivo. Меченый уридин после введения голубям внутрибрю-шинно исчезает из нуклеотидного пула эритробластов уже через 5 часов. Следовательно, те молекулы яРНК, которые остаются мечеными в течение суток и более, являются стабильными (сяРНК). При ° седиментации в градиенте сахарозы сяРНК обнаруживается в виде 2 фракций с коэффициентами седиментации близкими к 28S и 18S. С помощь» гибридиэационных экспериментов, результаты которых приведены на рис. 9, изучали природу основной по массе фракции сяРНК (28S). Видно, что в 28S сяРНК отсутствуют молекулы 28S рРНК, а в суммарной яРНК содержание 28S рРНК составляет около 25%. При гибридизации 28S и 18S сяРНК с избытками изолированных фракций редких повторов и уникальных последовательностей в гибриды в сумме входит 40-60% молекул, при этом больше половины из них гибридизу-ется с редкими повторами генома. Учитывая, что период перемежаемости последовательностей в геноме голубя примерно равен длине молекул 28S сяРНК (около 5 тыс.н.), провели анализ расположения в 28S сяРНК участков, транскрибированных с умеренных повторов и уникальных последовательностей. Из данных, приведенных на рис. 10, видно, что при значениях Cet, при которых может происходить гибридизация только с умеренными повторами, 2 кинетические кривые сильно отличаются; практически все молекулы 28S сяРНК связываются при этом с оксиапатитом, а в резистентные к РНКазам гибриды входит лишь 25% последовательностей. Таким образом, в большинстве молекул 28S сяРНК участки, транскрибированные с повторяющихся и уникальных последовательностей генома, перемежаются.

С помощью гибридиэационных экспериментов показана гомология 28S яРНК с >45S гяРНК по участкам, транскрибированным как с пов-

ifi

s

I

«o

1 fc в—

1 »— -*

-Т - \ \

. „ 1 1 1 vi IV I..I

SO WO SO iOO so

Немеченая РНК/меченая РНК

iOO

Рис. 9. Конкурентная гибридизация 28S яРКК и 28S рРНК с частично очищенными умеренными повторами ДНК.

1 мкг меченой РНК гибридизовали с 1 мг ДНК с добавлением указанных количеств немеченых РНК. а - меченая 28S рРНК + РНК Е. coli (1) или немеченая 28S рРНК (2); б -меченая 28S сяРНК + немеченая 28S рРНК (1) или немеченая 2RS яРНК (2); в - меченая 28S рРНК + немеченая 28S яРНК (1) или немеченая 28S рРНК (2). Уровень гибридизации без конкурентов принят за 1: а и в - 24%, б - 26%.

Рис.

10. Кинетические кривые гибридизации меченой 283. яРНК с суммарной ДНК голубя. Гибриды выявляли по резистентности к РНКазам А и Т1 (1) или по связыванию с оксиапатитоы (2).

торов, так и с уникальных последовательностей. Используя конкурентную гибридизации,показали, что во фракции 283 сяРНК присутствуют молекулы, гомологичные цитоплазматическкм РНК. Наибольшую конкуренцию оказывали поля(А)*- и поли(А)"-субфракции 8-185 ца-тоилазматических РНК (рис. 11). Зте данные позволяют заключить, что по крайний маре часть существующих в ядрах метаболически стабильных 28Б РНК - зто £онды пезаверчивших процессинг предшественников мРНК.

Для оценки содержания глобип-кодкрующих последовательностей во фракции ЗвБ яРНК исследовали киие-гику ее гибридизации с гло-Оиновой кДНК (рис- 12). Расчет, основанный на полученных данных с учетом содержания ^85 рРНК во фракции 285 яРНК и абсолютных ко лкчеств РНК з ядрах разных популяций орятроидных клеток, показан что число молекул 285 яРНК, содержащих глсбпн-кодирующие последо вательности, равно 200 в ретикулоцитах а 40 в эритробластах. Поскольку б >453 гяРНК содержание такпк молекул было одинаковым.® обеих популяциях плеток (см. вше), а в 283 яРНК имеется 5-кратное различие, можно заключить, что в ходе эритропоэза происходит изменение в регуляции экспрессии глобшювых генов на посттранс-кришшонном уровне.

Небольшая часть С5>РНК имеет коэффициент седиментации >455. Лишь около 0,5% этих молекул содержат по/ш(А), тогда как около 1о% >455 гяРЯК имело иол<:(А). Кроме того, в отличие от поли(А)' >455 гяРНК в фракции >45-3 ср.РНК содержится большое количество шпилечных структур (1.1% вместо 1,5%). Данные, полученные при ¿.ш лизе >45Б сяРНК, говорят о том, что в стабильных иысокомолекудя] них транскриптах, также как к в нестабильных, наблюдается обрати корреляция между содержанием яоли(А)*-ыолекул и шпилечных структур. Зто также служит подтверждением сделанного ранее вывода о селективном полиадекилировании первичных продуктов транскрипции Описанные фракции сяРНК эритроидных клеток голубя обнаружены на ми впервые. Их существование отражает один из этапов посттранск рипционной регуляции в клетках при дифференцировке.

Анализ цитоплазматических РЫК эритроидных клеток поводили с помощью кДНК, синтезированной на глобиновой мРНК голубя. Эта ра бота начиналась в рамках проекта "Ревертаза". При характеристик продукта обратной транскрипции было обнаружено, что скорость ре акции гибридизации кДНК со своей матрицей на начальном этапе си но увеличена по сравнению с теоретической. Как видно из рис. 1С

> ! ) ! > j i 1_i_J_i—L

300 600 , JÖC 6770 Немеченая РНК/ шченая РНК

Ряс. 1]. Конкурентная гкбриди&ацкя меченой 20S сяРНК с кечзчекы-m!ï по«к{А)* и поли(А)" 8-13S пнтоплааматическкми РНК эрнтробластов са комплементарные мест?» на повторяющихся (а) и ухвкалыпи (б) последовательностях ЛИК.

Црмечекые FHK: 1 - !!. coli, 2 - поли(л)". 3 - поли(АГ 8-1BS ютоплзз^эт^к'ские.

Ппли(А)* и поли(А)" РНК разделяли на поли( и)-сефарозе (3,7 и 96,37- РЖ соответственно). На каждые 3,7 мкг щг-топлазкатнческой г.ота(А)* РНК добавляли 96,3 мкг РНК g coli и соответственно па каждые 96,3 мкг гат •»плазматической поли (А)" РНК - 3,7 «кг РНК Е. coli.

/

Рис. 12. Кинетические кривые гибридизации кДНК глобина голубя с глобиновой мРНК (1), 28S яРНК ретикулоцитов (2), 28S . яРНК эритробластов (3) и 23S рРНК Е. coli (4) (а), (б) то хвт нормированные кривые. I

причина этого заключается во взаимодействии комплементарных гомополимерных участков реагирующих молекул (поли(А) в мРНК и поли(Т) в кДНК). В дальнейшем при проведении кинетических экспериментов с кДНК для преодоления наблюдаемого эффекта в гибриди-зационную смесь добавляли гомополимеры (поли(А) или поли(и)). Анализ кинетик гибридизации глобиновой кДНК с цитоплазматически-ми мРНК разных популяций эритроидных клеток позволил определить в них число молекул глобиновых мРНК. В цитоплазме эритробластов содержится 3800, а в цитоплазме ретакулоцитов 18000 таких молекул. Таким образом, в цитоплазме 2 популяций эритроидных клеток, как и в 28Б яРНК, существует 5-кратное отличие в числе глобин-кодиру-ющих молекул. Совкупность полученных нами данных свидетельствует о регуляции экспрессии глобиновых генов как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне, причем по мере дйффе-ренцировки эритроидных клеток происходят изменения в регуляции на посттранскрипционном уровне.

Рис. 13. Кинетические кривые гибридизации глобиновой кДНК с мРНК без (1) и в присутствии поли(А) (2) или поли(Т) (3). 4-гибридизация кДНК с рРНК. Вставка - линейное изображение. И - относительное количество кДНК в гибридах.

Оценка сложности цитоплазматических РЖ эритроидных клеток голубя доказала, что -в ходе дифференцировки она резко снижается (от 0,9x10® нуклеотидов в эритробластах до 0,13х108 нуклеотидов в ретикулоцитах). Следовательно, по мере созревания клеток в них уменьшается разнообразие молекул мРНК. Одной из мРНК, транскрипция которой прекращается в зрелых клетках (эритроцитах), но интенсивно происходит в клерках-предшественниках (эритробластах), является, как показано.нами, мРНК, имеющая гомологию с геном эгс вируса саркомы Рауса. Вместе с тем, цитоплазматические РНК, комплементарные консервативному повтору семейства Т1, содержались примерно в одинаковом\количестве в разных популяциях эритроидных клеток. Более того, в ретикулоцитах наблюдали увеличение по сравнению с эритробластами содержания цитоплазматических РНК, гибри-дизующихся с отдельными повторами■клонированных кластеров, представленных на рис. 3.

Таким образом, в ходе созревания эритроидных клеток происходят изменения в регуляции экспрессии генов, которые приводят к . 3 разным типам изменений в содержании поли(А)* РНК цитоплазмы.

2.2. Транскрипция трансгенов у трансгенных мышей.

Как уже отмечалось, ДНК аденовируса БА7 характеризуется некоторыми особенностями поведения в геноме трансгенных мышей. Исследование ее транскрипции указывает на наличие определенной кор реляции между этим процессом и теми структурными изменениями, ко торыё происходят с ДНК БА7 в геноме трансгенных животных. Транскрипция ДНК БА7 в Р0- и Р3-поколениях мышей происходила очень редко и, если, она имела место, то лишь в 1 из проанализированных органов каждого животного (селезенка, почки или слюнная железа).

Однако анализ РНК у мышей Р4- , Р5- и Р6-поколений, у которых прекращалась элиминация ДНК БА7 из тканей мышечной природы, а также отмечались случаи перестройки траксгена, показал, что транскрипция аденовирусных последовательностей происходит у большинства трансгенных животных во многих органах. Таким образом, тра скрипция ДНК БА7, интегрированной с геномом мышей в результате трансгеноза, носит сложный характер. Вероятно в половых клетках и/кли при эмбриональной дифференцирсвке происходят такие законо мерные изменения структуры трансгека, которые оказывают влияние

на его последующую экспрессию. В связи со сходством во времени структурных и транскрипционных изменений, свойственных ДНК SA7 ■ у разных трансгенных мышей, можно считать, что все это определяется структурой ДНК SA7, а не связано с эффектом положения.•

У трансгенов иной природы наблюдали другие особенности характера транскрипции. Анализ РНК трансгекных мышей с тимидинкиназ-ным геном HSV, находящимся под контролем LTR вируса саркомы Рауса или MuLV, показал, что оба типа рекомбинантных молекул транскрибируется в печени животных ^-поколения с образованием дискретных по размерам молекул РНК. Хотя эффективность транскрипции варьирует у разных трансгенных мышей (рис. 14), максимальный уровень транскрипции одинаков для обоих рекомбинантных генов и достигает 4000 молекул в расчете на 1 клетку. При передаче по наследству (F,-поколение) эффективнось транскрипции трансгенов изменяется, причем не только в сторону ее усиления (что можно, теоретически, объяснить мозаичностью родителей)*-но'и в сторону уменьшения (вплоть до полного прекращения). Следовательно, как и в случае ДНК аденовируса SA7, картина транскрипции тимидинкиназ-ного гена' HSV меняется при передаче в ряду "поколений, однако, характер изменений, присущий двум типам трансгенов, отличается. Выявленная нестабильность транскрипции трансгенов, вероятно, связана с несколькими причинами, одной из которых может быть структурная нестабильность трансгенов или нестабильность их упаковки в хроматине.

В экспериментах на трансгенных мышах с эмбриональным £-гло-биновым геном курицы решался вопрос о механизме переключения экспрессии глобиновых генов птиц в процессе эмбриональной дафферен-цировки. Анализ РНК двух трансгенных эмбрионов 12-ого дня развития и одного трансгенного эмбриона 20-го дня развития, а также новорожденных животных, показал, что s-глобиновый ген курицы транскрибируется только на ранних стадиях развития мышей (у эмбрионов 12-ого дня). Экспрессия эмбрионального глобинового гена курицы имеет тот же характер, что и эмбрионального глобинового гена мыши. Это указывает на наличие в плазмиде с е-глобиновым геном курицы специальных регуляторных элементов, участвующих в переключении экспрессии генов в ходе онтогенеза и являющихся консервативными.

Таким образом, исследование транскрипции трансгенов разной природы позволило выявить определенную функциональную нестабиль-

рМАЗ

S» ы

O-r-0

uium

IM «-» Ti~i 10Г-1 11T-1 чи ни аи

Я 7»

Ф—j-S

4 4 i ^ 4 i

21T-i ¡П4 in-t М>-1 ЛМ !И

рТШ

гя м » га » i*

О—г-О о

ч-» Г

i ii □ i i 4 □ i ¿й ^

iw-t »i каы гтг-t m»-i mvi m*i it*-i i«

pAG-0

J>» « «T i

-a ©—r-a

UM 17*4 MM IM MM

Рис. .14, Эффективность транскрипции трансгена у трансгенных мышей при передаче по наследству.

Изображены две семьи, содержащие последовательности плазмиды рМАЗ-(тимидинкиназный ген HSV с LTR RSV), три семьи с последовательностями плазмиды рТКЮ (тимидинки-ный ген с LTR MuLV) и две семьи с плазмидой pAG-О (тимидинкиназный ген HSV с собственным промотором). В кружках - самки, в квадратах - самцы.

Уровни экспрессии трансгенов: темный знак - сильная транскрипция, заштрихованный - слабая транскрипция, не-заштрихованный - транскрипция на уровне отрицательного контроля (нетрансгенные мыши). Н - эффективность транскрипции не определялась, N - нетрансгенные мыши.

ность чужеродной ДНК в геноме. Вместе с тем, использование тран-сгенозачДало возможность заключить, что переключение экспрессии-глобиновых генов при эмбриональном развитии осуществляется с'помощью специальных регуляторных элементов, стабильных в эволюции теплокровных животных.

2.3. Транскрипция консервативных элементов генома.

Выше уже были приведены некоторые данные, свидетельствующие о эффективной транскрипции элементов генома, сохраняющихся з эволюции у теплокровных животных. В суше в геномах курицы и голубя имеется около 5,5% гомологичных последовательностей: При гибридизации меченой ДНК курицы с избытком суммарной РНК, выделенной из эритробластов голубя, в гибриды входило около 3,5% ДНК. Следовательно, даже в клетках 1 типа транскрибируется значительная часть общих для 2 видов птиц последовательностей' генома.'

Исследовали также транскрипцию 2 описанных-выше консервативных семейств редких повторов, представленных в геномах разных теплокровных.животных. Используя в качестве'зонда плазмиду рМАЙ1, с помощью гисто-блот-гибридизации анализировали транскрипцию повторов семейства Т1 (рис. 15). Комплементарные РНК обнаружены как у курицы, так и у мыши, причем наибольшее их количество содержится в одних и тех же органах (печень, почки, мозг). Как показала гибридизация,повторы другого консервативного семейства (Г48) транкрибируются со сходной эффективностью на разных стадиях диф-ференцировки эритроидных клеток голубя, но значительно сильнее идет транскрипция этих повторов в печени. Гисто-блот-гибридиза-. ция повторов Г48 со срезами эмбриона курицы и новорожденной мыши также свидетельствует о их эффективной транскрипции в печени этих животных. При этом интенсивная транскрипция повторов Г48 была выявлена у эмбриона курицы в перьевых фолликулах, а у мыши в коже. Кластер умеренных повторов, содержащий повтор семейства Г48, также эффективно транскрибируется в ооцитах курицы на стадии ламповых щеток.

Анализ различных фракций РНК эритроидных клеток голубя показал, что последовательности, транскрибированные с Г48, содержатся как в ядерных РНК, так и в цитоплазматических поли(А)*-и поли(А)" молекулах РНК.

Полученные данные указывают на то, что консервативные редкие

повторы семейств Г48 я Т1 относятся к элементам субгенома "домашнего хозяйства". Их транскрипция происходит у разных теплокровных животных во многих типах клеток и на разных стадиях развития, но с неодинаковой эффективностью. При этом для каждого семейства повторов характерна определенная тканевая специфика в эффективности транскрипции, сохраняющаяся в эволюции животных.

а б

Рис. 15. Гисто-блот-гибридизация меченого ЕсоН1/ВашН1-фрагмента плазмиды рМАМ со срезами с 14-ти дневного цыпленка (а) к новорожденной мыши (б). Верхний ряд - автографы после гибридизации, нижний ряд - фотография после окраски этих же срезов гематоксилином.

-31- •

выводы

1. Геном голубя (Columba livia) содержит следующие классы нукле-

отидных последовательностей^ которые выделены в чистом виде:

а) уникальные последовательности (68% генома);

б) умеренные повторы, которые представлены двумя гомогенными по частоте повторения классами последовательностей (средние (4% генома) и редкие (7%) повторы) с ч стотами повторения соответственно 4700 и 50 на гаплоидный геном; редкие

повторы состоят из семейств высокогомологичных GC-богатых последовательностей; в) часто повторяющиеся последовательности (-3,0% генома), значительную часть которых (~1,5%) составляет одно специфическое семейство (FR1) с частотой повторения 2-4-Ю4 на геном.

г) обращенные повторы, содержание которых (-16%) выше, чем у большинства других теплокровных животных; ' д) короткие и необычно длинные (до 300 п.н.) гомополимерные последовательности поли(с!А)-поли(с1Т), составляющие в сумме около 3% генома.

2. Анализ организации нуклеотидных последовательностей в геномах

теплокровных животных, проведенный с использованием суммарной

ДНК и изолированных фракций, показал, что

а) обращенные повторы большей частью рассеяны в геноме птиц; .у голубя имеются также кластеры коротких обращенных повторов, соседствующие с длинными последовательностями поли(с1А)-поли(йТ);

б) у голубя, как и у других птиц, тип перемежаемости большинства умеренных повторов и уникальных последовательностей является промежуточным между Xenopus- и Drosophila-типами.

Анализ клонированных последовательностей ДНК показал, что

а) основная масса частых повторов в геноме голубя (семейство FR1) расположена тандемно;

б) часть умеренных повторов в геномах птиц (голубь, курица) организована в виде протяженных кластеров," которые состоят из повторяющихся последовательностей, относящихся к разным се-мейстзам;

в) умеренные повторы семейства Т1 как у птиц (голубь), так и у млекопитающих (мышь, человек) перемежаются с уникальными последовательностями, но не равномерно распределены'по все-

му геному, а сгруппированы в отдельных участках.

3. Значительная часть редких повторов и уникальных последовательностей генома голубя имеет гомологию с ДНК курицы и мыши, т.е. является эволюционно стабильной.

Анализ клонированных консервативных редких и средних повторов, содержащихся в геномах птиц (голубь, курица) и млекопи-• ■ тающих (мышь, человек), показал, что они имеют сходство как по последовательности, так и по частотам повторения. У птиц кластеры консервативных умеренных повторов расположены преимущественно в й-областях теломерных и центромерных районе ■ митоти-ческих хромосом. Диспергированные консервативные умеренные повторы семейства Т1 имеют сходную организацию У всех 3 видов' проанализированных теплокровных животных. -

Большинство эволюционно стабильных повторяющихся последовательностей геномов транскрибируется. Транскрипция клонированных консервативных умеренных повторов поисходит с разной эффективностью во многих типах клеток на разных стадиях развития как у птиц, так и у млекопитающих. Для каждого семейства повторов характерна собственная картина эффективности транскрипции в разных типах клеток, которая в целом сохраняется в эволюции. По характеру транскрипции и хромосомной локализации многие из консервативных умеренных повторов могут быть отнесены к элементам субгенома "домашнего хозяйства", сохранившим в эволюции первичную структуру, организацию и тканеспецифичес-кую эффективность транскрипции.

4. Участки генома млекопитающих (мышь, кролик), с которыми интегрирует чужеродная ДНК после ее микроинъекции в зиготы, характеризуются нестабильностью ("горячие" точки генома). Процесс интеграции может сопровождаться перестройками генома в участках внедрения чужеродной ДНК. Иногда происходят перестройки

и структуры трансгена - в хода интеграции, в онтогенезе и при передаче в ряду поколений; может осуществляться и полная элиминация трансгена. Интеграция чужеродной ДКК осуществляется цреимущественно с областями генома, содержащими прямые и обращенные повторы, что позволяет предположить участие этих элементов в формировании "горячих" точек генома, с которыми

и взаимодействует чужеродная ДНК. Полученные данные о нестабильности трансгенов в геноме животных соответствуют представлениям, согласно которым геном высших эукариот можно • рассмативать как динамическую популяцию последовательностей.

5. Анализ транскрипции трансгенов у животных показал, что чужеродные элементы генома характеризуются большей функциональной нестабильностью, чем собственные гены организма. При передаче по наследству характер транскрипции трансгенов и их структурные изменения в значительной мере определяются природой чужеродной ДНК, а не местом ее интеграции с геномом.

6. Сравнительный анализ продуктов транскрипции в эритроидных клетках голубя на разных стадиях дифференцироЕки и в транс. генных мышах с эмбриональным глобиновым геном курицы'на

. разных стадиях развития свидетельствует о том, что при эритропоэзе у птиц регуляция экспрессии глобиновых генов осуществляется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях; при этом характер посттранскрипционной регуляции меняется по мере прохождения клетками разных стадий дифференцировки.

7. В дифференцирующих эритроидных клетках голубя транскрибируются представители всех основных классов последовательностей генома (кроме частых повторов), но в единицах транскрипции содержится больше редких повторов и меньше обращенных повторов, чем в целом геноме. Структура единиц транскрипции неоднородна. В ходе дифференцировки эритроидных клеток происходят изменения в наборе и сложности транскриптонов: в транскрибирующейся части генома снижается доля редких и средних повторов, уменьшается содержание обращенных повторов; одновременно падает сложность за счет массового выключения транскриптонов при появлении небольшого числа новых единиц транскрипции. В первичных продуктах транскрипции по мере дифференцировки клеток снижается содержание молекул, имеющих гомологию с цитоплазматическими поли(А)* РНК.

8. В эритробластах голубя обнаружено несколько фракций ста-

бильных ядерных РНК (сяРНК). Сложность этих молекул в три раза ниже сложности первичных продуктов транскрипции. Они синтезируются на участках генома, обогащенных обращенными и редкими повторами, которые перемежаются с уникальными последовательностями- Основная фракция сяРНК (28S сяРНК) содержит последовательности, гомологичные как цитоплазматическим поли(А)* РНК, так и >45S гяРНК, что позволяет рассматривать по крайней мере часть сяРНК как фонд незавершивших процессинг пре-мРНК. Стабилизация продуктов превращения первичных транскриптов и их полиаденилирование осуществляются селективно.

9. Б ходе дифференцировки эритроидных клеток голубя резко уменьшается сложность цитсплазматических поли(А)* РНК, что происходит за счет исчезновения большого числа видов мРНК (в частности РНК, гомологичной src-подобному гену). На этом фоне осуществляется накопление специфических для эритроидных клеток глобиновых мРНК. Глобиновые мРНК, выделенные из формирующихся в ходе эритропоэза ретикулоцитов голубя, и однонитевой продукт обратной транскрипции этих мРНК (кДНК) характеризуются наличием в них большого количества обращенных повторов и гомополи-мерных участков на концах (поли(А) в мРНК и поли(Т) в кДНК)

и внутри (олиго(Ю в мРНК и олиго(А) в кДНК) молекул.

10. Анализ количественных и качественных изменений в суммарных популяциях ядерных и цитоплазматических молекул РНК эритроидных клеток голубя показал, что в ходе терминальной дифференцировки регуляция экспрессии генома происходит как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тарантул В.З., Баранов Ю.Н., Прима З.И., Липасова В.А., . Газарян К.Г. Фракционирование ДНК ретикулоцитов голубя по нуклео-тяднсму составу и кинетике реассоциации// Молекулярная биология. -1973.-Т. 7.-Ы 6.-С. 847-856.

2. Тарантул В.З., Липасова В.А., Баранов Ю.Н., Газарян К.Г. Исследование долгоживущих ядерных РЖ эритроидных клеток птиц// Молекулярная биология.-1974.-Т. 8., N 6.-С. 864-870.

3. Gazaryan K.G., Tarantul V.Z,, Baranov Yu.N., Frolova L.Yu., Kisselev L.L. Elements of the secondary structure in the DNA, complementary to pigeon mRNA// Mol. Biol. Repts.-1974.-V. l.-P. 465-470.

4. Gazaryan K.G.; Tarantul V.Z., Baranov Yu.N., Frolova L.Yu., Kisselev L.L. Hybridization of pigeon globin messenger RNA with complementary DNA synthesized in vitro by reverse transcription: influence of the homopolymeric regions// Nucl. Acids Res.-1975.-

' V. 2, N 7.-P. 1203-1212.

5. Gazaryan K.G., Tarantul V.Z., Baranov Yu.N. Transcription of repetitive and unique DNA nucleotide sequences in pigeon ery-throid cells with different degrees of specialization/7/ Differentiation. -1976. -V. 6, N l.-P. 41-46.

6. Тарантул B.3., Липасова-В.А., Газарян К.Г. Выделение фрагментов ДНК голубя, содержащих последовательности, комплементарные глобиновой мРНК// Докл. АН СССР.-1976.-Т. 226, N З.-С. 719-721.

7. Баранов Ю.Н., Забойкина Т.Н., Дубовая В.И., Тарантул В.З., Газарян К.Г. Полиуридиловая последовательность в мРНК глобина голубя// Докл. АН СССР.-1977.-Т. 234, N 4.-С. 955-957.

8. Газарян К.Г., Кузнецова Е.Д., Тарантул В.З., Забойкина1 т.н. Выделение и характеристика транскрибирующихся семейств повторяющихся последовательносей генома голубя// Молекулярная биология.-1977.-Т. И, N 5.-С. 1010-1021.

9. Gazaryan K.G., Kuznetsova E.D., Tarantul V.Z., Sivak S.A. Purification and characterization of two transcribed repetitive DNA fractions from the pigeon genome// Chromosoma.-1977.-V. 61, N 2.-P. 331-394.

'10. Gazaryan K.G., Kuznetsova E.D., Fetisova I.V., Tarantul V. Z. Metabolically stable messenger-like 28S fraction in the nuclei of pigeon bone marrow cells// FEBS Letters.-1977.-V. 77, N 2.-P. 251-254.

11. Gazaryan K.G., Tarantul V.Z., Lipasova V.A. Repetitive sequences and hairpin-like structures in giant RNA of pigeon eryth-roid cells// Mol. Biol. Repts.-1977.-V. 3, N 3.-P. 213-215.

12. Gazaryan K.G., Nickolaev A.I., Tarantul V.Z. The comparison of melting properties of the 28S nuclear messenger-like RNA, 28S ribosomal RNA and 9S globin mRNA from pigeon erythroid cells// FEBS Letters.-1977.-V. 84, N 2.-P. 320-322.

13. Nickolaev A.I., Tarantul V.Z., Kuznetsova E.D., Gazaryan

K.G. Polydeoxyadenylic sequences in pigeon genome// Studia bio-physica.-1978.-V. 68, N 3.-P. 171-177.

14. Gazaryan K.G., Kuznetsova E.D., Tarantul V.Z. Are polyade-nylated and non-polyadenylated giant HnRNA molecules transcribed from different sites in the genome?// FEBS Letters.-1978.-V. 94, S l.-P. 136-138.

15« Газарян К.Г., Тарантул В.З., Кузнецова Е.Д., Стволинская Н. С., Николаев А.И., Фетисова И.В.Липасова В.А. Метаболически стабильные классы ядерной РНК информационного типа. I. Выявление и молекулярная характеристика// Молекулярная билогия.-1979. -Т. 13, К 1.-С. 16-29.

16. Газарян К.Г., Кузнецова Е.Д., Фетисова И.В., Тарантул В.З. Стабильные классы ядерной.РНК информационного типа. II. Наличие гомологии между 28S фракцией ядерной РНК, гигантскими поли(А)"-молекулами гетерогенной ядерной РНК и поли(А)*-молекулами цито-плазматической РНК// Молекулярная биология.-1979.-Т. 13, N 4. -С. 761-768.

17. Тарантул В.З., Николаев А.И., Сивак С.А., Газарян К.Г. Молекулярная организация генома голубя. Обнаружение кластеров, состоящих из длинных гомополимерных и коротких палиндромных последовательностей// Молекулярная биология.-1979.-Т. 13, N 6.-С. 1296-1302.

18. Тарантул В.З., Гольцов В.А., Газарян К.Г. Молекулярная гибридизация как метод исследования структуры и функции нуклеиновых кислот// Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР, Сер. Молекулярная биология. -1979. -Т. 16.-С. 5-52.

19. Газарян К.Г., Дубовая В.й., Незнанов Н.С., Тарантул В.З., Скобелева Н.А., Фролова Л.Ю. Последовательности, кодирующие глобин, в 28S пре-мРНК и в'цитоплазматической РНК эритроидных клеток голубя// Молекулярная биология.-1980.-Т. 14, N4.-С. 766-772.

20. Goltsov V.A., Mazo М.А., Tarantul V.2., Gazaryan K.G. Reassociation of eukaryotic DNA fragments containing interspersed repeats// J. Theor. Biol.-1980.-У. 83, 3.-P. 389-403.

21. Tarantul T.Z., Dubovaya Y.I., Neznanov N.S., Globin-coding sequnces in nuclear and cytoplasmic RNA of pigeon erythroid cells // IX International Symp. on Structure and Function of Erythroid Cells.-1980.-P. 82.

22. Gazaryan K.G., Stvolinskaya N.S., Kuznetsova E.D., Tarantul V.Z. Stable forms of the hnRNA// In Book: Macromolecules in the

unctioning cells.-Moscow (ed. A.A. Baev): Nauka, 1982.-V. 1.. 148-155.

23. Тарантул B.3., Газарлн К.Г. Гетерогенная ядерная РНК: ,стру-тура и функция7/ Усп. биол. химии.-1982.-Т. 22.-С. 26-62. .

24. Газарян К.Г., Гольцов В.А., Тарантул В.З., Кузнецова Е.Д., слов Л.С. Размер и организация повторяющихся посдедовательнос-ей в геноме голубя// Биохимия.-1982.-Т. 47, N 1.-С. 71-80.'..'

25. Тарантул В.З.. Гольцов В.А,, Кузнецова Е.Д. Структурная ор-анизация генома эукариот// Итоги науки к техники, ВИНИТИ АН ССР, сер. Молекулярная биология.-1982.-Т. 19.-С. 7-83.

26. Кузнецова Е.Д., Гольцов В.А., Тарантул В.З., Газарян-К.Г. меренно повторяющиеся последовательности в геноме эукариотов//

кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов: молекуляр-ая генетика, эволюция и генетическая инженерия.-М., Наука.-1982. С. 31-37.

27. Газарян К.Г., Тарантул В.З. Геном эукариот. Молекулярная рганизация и экспрессия// Изд. МГУ, М.-1983.-272 С.

28. Газарян К.Г., Кузнецова Е.Д., Эшкинд Л.Г., Языков А.А., арантул В.З., Баранов Ю.Н., Тихоиенко Т.И., Народицкий Б.С. икроинъекции ДНК зысокоонкогенного аденовируса обезьян в зиготы ышей: ин.еграция и передача йо наследству// Молекул, генет., икробиол., вирусол.-1983.-N 9.-С. 22-28.

29. Газарян К.Г., Генинг Л.В., Незнанов Н.С., Андреева Л.Е., акарова И.В., Баранов Ю.Н., Кучерявый В.В., Алексеева М.В., арантул В.З. Микроинъекции з зиготы мышей рекомбинантных ДНК, одержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса и последовательности НК ретровирусов// Молекул, генет., микробиол., вирусол.-1984.-

10.-С. 22-28.

"'О. Gazaryan K.G., Kuznetsova E.D., Eshkind L.G., Yazykov A.A., arantul V.Z., Tikhonenko Т.I., Naroditski B.S. Microinjection f simian adenovirus SA7 (C-8) DHA into the mouse zygotes: dif-erential distribution of viral DNA in organs//' Cell Differentia-ion.-1984.-V. 14.-N 10, P. 267-276.

31. Tarantul V.Z., Goltsov v.A., Dubovaya V.I., Baranov Yu.N., uznetsova E.D.. Neznanov N.S., Gening L.V., Gazaryan K.G. Mo-eratelly repetitive sequences of the pigeon genome transcribed n erythroid cells: transcription assessmefttPand cloning// Bio-ied. Biochim. Acta.-1984.-V. 43.-Jf 1, P. 48-50.

32. Газарян К.Г., Гольцов В.А., Набирочкин С.Д., Эшкинд Л.Г.,

Тарантул В.3., Генинг Л.В., Попов Л.С. Введение последовательностей ДНК вируса саркомы Рауса в геном дрозофилы и мыши путем микроинъекций в яйцеклетки// Молекулярная биология.-1985.-Т. 19, N З.-С. 760-766.

- 33. Тарантул В.З., Газарян К.Г. Элементы генома эукариотов, контролирующие инициацию транскрипции структурных генов// Успехи совр. 0ИОЛ.-1985.-Т. 100, N 2.-С. 163-178.

. 34. Тарантул В.З., Кучерявый В.В., Макарова-И.В., Баранов Ю.Н., Бегетова Т.В., Андреева Л.Е., Смирнова М.Б., Газарян К.Г. Клонирование фрагмента ДНК трансгенной мыши,' содержащего интегрированную рекомбинантную плазмиду// Молекулярная биология.-1986.-Т. 20, N 1.-С. 278-287.

35. Тарантул В. 3., Макарова И. В., Андреева Л. Е".Смирнова МЛ>:, Газарян Т.Г., Кузнецова Е.Д. ДНК аденовируса обезьян и ее экспрессия в органах потомства трансгенных мышей// Молекул, генет. микробиол., вирусол.-1936.-Ш,.-С. 22-26. --

36. Косиков А.И., Тарантул В.З., Макарова И.В.", Андреева Л.Е. Неклюдова И.В., Бенюмов А.О., Газарян К.Г. Транскрипция в ооцитах лягушки и трансгенных мышах рекомбинантных плазмид с длинными концевыми повторами провкрусов ретровирусов// Молекул.-генетика, микробиол., вирусол.-1986.-К 10.-С. 21-26.

37. Tarantul V.Z., Kucheriavy V.V., Makarova I.V., Baranóv Yu. N., Begetova T.V., Andreeva L.E., Gazaryan K.G. Rearrangements of microinjected recombinant DNA in the genome of transgenic mice// Mol. General Genet.-1986.-V. 203, N 2.-P. 305-311.

38. Tarantul V.Z., Makarova I.V.-, Andreeva L.E., Gazaryan К. G. A study of globin gene expression in transgenic mice: Analysis of problem// Folia Hematologica.-1987.-V. 114, N 4.-P. 504507.

39. Газарян К.Г., Андреева Л.Е., Серова И.А., Тарантул В.З., Кузнецова Е.Д., Хайдарова Н.В., Генинг Л.В., Кузнецов Ю.М., Газарян Т.Г., Смирнов А.Ф., Козикова Л.В., Ефимов A.M. Получение трансгенных кроликов и мышей, содержащих ген гормона роста быка //Молекул, генетика, микробиол., вирусол.-1988.-Н 10.-С. 23-26.

40. Макарова И.В., Тарантул В.З., Газарян К.Г. Структурные особенности сайта интеграции, чужеродной ДНК в геноме трансгенной мыши// Молекулярная биология.-1988.-Т. 22, N 6.-С. 1553-1561.

41. Тарантул В.З. Анализ содержания глобин-кодирующих последа вательностей в ядерных и цитоплазматических фракциях'РНК при тер

минальной дифференцировке эритроидных клеток голубя// Биополимеры и клетка.-1989,-Т. 5, N 1.-С. 78-80.

42. Кузнецова Е.Д., Андреева Л.Е., Серова И.А., Тренкнер А'., Тарантул В.З., Газарян К.Г. Новые данные о характере структурных изменений ДКК аденовируса обезьян, микроинъецированной в зиготы мцлей// Молекул, генетика, микробиол., вирусол.- 1989.-N4.-С. 610.

43. Тарантул В.З., Гольцов В.А., Родионов A.B., Челышева Л.А., Хутинаева М.А., Гагинская Е.Р., Газарян К.Г. Молекулярный и цитологический анализ кластеров умеренных повторов геномов птиц// Молекулярная биология.-1989.-Т. 23, N2.-С. 481-489.

44. Тарантул В.З., Родионов A.B., Макарова И.В., Гольцов В.А., Челышева Л.А., Хутинаева М.А., Гагинская Е.Р., Газарян К.Г. Молекулярный и цитологический анализ транскрипции эволюционно консервативных умеренно повторяющихся последовательностей геномов позвоночных// Цитология.-1989.-Т. 31, N 5.-С. 619-625.

45. Тарантул В.З., Кузнецоза Е.Д., Газарян К.Г. Характеристика участков генома трансгенных животных, прилежащих к интегрированным последовательностям чужеродной ДНК// Молекулярная биология.-1989.-Т. 23, N 4.-С. 1043-1047.