Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль пространственной организации геномного локуса в феномене переключения экспрессии глобиновых генов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль пространственной организации геномного локуса в феномене переключения экспрессии глобиновых генов"

На правах рукописи УДК 576.315.42

ООЬОЫ*«"

УЛЬЯНОВ Сергей Владимирович

РОЛЬ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМНОГО ЛОКУСА В ФЕНОМЕНЕ ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005051963

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор Разин Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор Деев Сергей Михайлович

доктор биологических наук Головнин Антон Клеменсович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита диссертации состоится «12» марта 2013 года в 15 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «12» февраля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. фарм. наук

а^Ьс'

Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Настоящая работа посвящена изучению роли пространственной конфигурации геномного локуса в процессе переключения экспрессии глобиновых генов у кур. Домены альфа- и бета-глобиновых генов позвоночных животных уже в течение нескольких десятилетий остаются одними из самых популярных моделей в изучении механизмов регуляции транскрипции у высших эукариот. На сегодняшний день накоплен большой массив данных о том, какую роль в контроле транскрипции глобиновых генов играют разнообразные белковые факторы, некодирующие РНК, метилирование ДНК, а также ковалентные модификации гистонов в составе нук-леосом. Тем не менее механизм переключения экспрессии, состоящий в том, что на разных этапах онтогенеза транскрибируются разные гены внутри альфа- и бета-глобиновых кластеров, изучен далеко не полностью. Не вполне ясно, что именно является движущей силой этого переключения. В предыдущих работах было показано, что определенную роль в данном процессе играет изменение спектра транскрипционных факторов в эритроидных предшественниках, а также изменение профилей эпигенетических модификаций хроматина внутри доменов глобиновых генов. У ряда изученных организмов, например, у мыши взаимная сближенность в трехмерном пространстве ядра регуляторных участков ДНК и подконтрольных им глобиновых промоторов коррелирует с запуском транскрипции глобиновых генов в определенных клеточных типах и на определенных этапах онтогенеза. Мы использовали метод фиксации конформации хромосомы (Chromosome conformation capture, ЗС) для того, чтобы выяснить, как пространственная конфигурация доменов глобиновых генов кур соотносится с транскрипционным статусом генов, расположенных внутри этих доменов. Результаты работы свидетельствуют о том, что переключение экспрессии глобиновых генов коррелирует с определенными изменениями конфигурации активаторных хромати-новых блоков - крупных ДНК-белковых комплексов, включающих в себя ре-гуляторные элементы доменов и промоторы глобиновых генов, которые, согласно общепринятой концепции, обеспечивают запуск транскрипции глобиновых генов. В то же время наши данные свидетельствуют и о том, что в доменах глобиновых генов кур не существует однозначного соответствия между привлечением гена к активаторному комплексу и его транскрипцией. Это расширяет современные представления о том, как пространственная конфигурация геномного локуса соотносится с транскрипционным статусом расположенных внутри него тканеспецифичных генов. Следует отметить, что изучение процесса переключения экспрессии глобиновых генов важно не только с точки зрения фундаментальной науки. Нарушения сбалансированной экспрессии глобиновых генов, в том числе и связанные с несвоевременным переключением транскрипции разных представителей семейств альфа- и бета-глобиновых генов, приводят к возникновению гемоглобинопатий человека и хозяйственно-значимых животных.

Цель и задачи исследования. В данной работе мы изучали пространственную организацию доменов альфа- и бета-глобиновых генов кур в ряде клеточных типов с целью выяснить, изменяется ли спектр пространственных взаимодействий регуляторных элементов и промоторов внутри доменов при переключении программы экспрессии. Для ответа на этот вопрос были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Проанализировать спектр пространственных взаимодействий внутри домена альфа-глобиновых генов кур до момента переключения экспрессии (в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов). Сравнить результаты с ранее полученными данными о конфигурации домена в эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов, после переключения программы экспрессии.

2. Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения экспрессии.

3. Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бета-глобиновых генов кур в клетках неэритроидного происхождения. Выяснить, существуют ли в таких клетках взаимодействия удаленных элементов домена.

Для решения поставленных экспериментальных задач мы использовали метод фиксации конформации хромосомы, ранее разработанный для детектирования пространственных взаимодействий участков ДНК в хроматине (Беккег е/ а1, 2002).

Научная новизна и практическая ценность работы. Несмотря на то, что домены глобиновых генов кур в течение нескольких десятилетий являются популярными моделями в исследованиях механизмов регуляции транскрипции у высших эукариот, пространственная организация этих геномных локусов до последнего времени оставалась совершенно не исследованной. В предыдущих работах нашей лаборатории была изучена пространственная конфигурация домена альфа-глобиновых генов кур в культуре клеток куриных преэритробластов до и после индукции к терминальной дифференциров-ке и синтезу глобинов. Кроме того, была исследована пространственная конфигурация данного района генома в эритроцитах 10-дневных эмбрионов и в клетках неэритроидного происхождения. В настоящей работе впервые была охарактеризована пространственная организация домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках раннеэмбрионального типа. Сравнение пространственной организации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения программы экспрессии позволило выявить изменения в спектрах взаимодействий регуляторных элементов домена, коррелирующие с подавлением транскрипции эмбрионального альфа-глобинового гена и запуском активной транскрипции генов, кодирующих альфа-цепи гемоглобина взрослых животных. Продемонстрировано, что транскрипционно активный ген эмбрионального альфа-глобина в эритроидных клетках до переключения экспрессии не участвует в формировании ста-

бильных пространственных комплексов с удаленными регуляторными элементами домена. Эти данные важны для более полного понимания механизмов регуляции экспрессии глобиновых генов на самых ранних этапах онтогенеза.

Также в данной работе впервые были подробно картированы пространственные взаимодействия основных регуляторных элементов домена бета-глобиновых генов кур как в эритроидных клетках, так и в клетках неэритро-идного происхождения. Показано, что переключение экспрессии бета-глобиновых генов коррелирует с реконфигурацией активаторного хромати-нового блока. Продемонстрировано, что домен бета-глобиновых генов в эритроидных клетках находится в петле хроматина, образованной посредством взаимодействия пограничных инсуляторов домена. Это дает хорошее объяснение ранее сделанному наблюдению, согласно которому границы области предпочтительной чувствительности к ДНКазе I в домене бета-глобиновых генов кур совпадают с позициями инсуляторов. Показано, что, как и в случае эмбрионального альфа-глобинового гена кур, один из двух эмбриональных бета-глобиновых генов транскрибируется автономно, не участвуя в образовании комплексов с удаленными регуляторными элементами. В то же время второй ген эмбрионального бета-глобина и ген, кодирующий бета-цепь гемоглобина взрослых птиц, образуют стабильный бинарный комплекс, присутствующий также в клетках неэритроидного происхождения. Эти данные демонстрируют, что пространственные взаимодействия удаленных участков тканеспецифичных геномных доменов могут отражать некоторые общие принципы упаковки данных областей генома в составе хромосомы и не иметь прямого отношения к регуляции транскрипции.

С практической точки зрения данная работа важна для понимания базовых механизмов регуляции транскрипции глобиновых генов, что в будущем может способствовать разработке новых подходов генотерапии некоторых гемоглобинопатий.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференции "Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies" (Гиссен, Германия, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы было опубликовано 8 печатных работ. Из них - 7 статей, материалов конференций - 1.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 23 рисунка и 5 таблиц, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, включающего 189 источников.

Результаты исследований

Измерение уровня транскрипции глобиновых генов с использованием ПЦР в реальном времени. Результаты наших исследований согласуются с данными, ранее полученными с помощью полуколичественных мето-

nD ■ uA

дов (Knezetic and Felsenfeld, 1993), и показывают, что в крови 3-дневных эмбрионов присутствуют транскрипты как эмбрионального альфа-глобинового гена л, так и взрослых альфа-глобиновых генов aD и аА (рис. 1, А). Уро-

вень

транскрипции в пять

гена я

■р

рн

«|1А

■ GAPDII [i-актнн

■ 18S РНК

3 день

9 день

примерно в пять раз выше, чем генов а° и аА. Напротив, в крови 9-дневных куриных эмбрионов уровень транскрипта гена я значительно снижен (примерно в 10 раз по сравнению с третьим днем развития), уровень транскрипции генов aD и аА возрастает в несколько раз относительно третьего дня эмбрионального развития.

Результаты анализа уровня транскрипции бета-глобиновых генов (рис. 1, Б) также согласуются с ранее полученными данными

(Reitman and Felsenfeld, 1990). В крови 3-дневных куриных эмбрионов были обнаружены транскрипты только эмбриональных генов р и е, при этом уровень транскрипции гена р оказался примерно в 4,5 раза выше, чем гена е. В крови 9- дневных эмбрионов были детектированы транскрипты всех четырех бета-глобиновых генов (р- и е-транскрипты обнаружены в очень небольшом количестве), и уровень транскрипции гена (Зд, кодирующего бета-цепь гемоглобина у взрослых животных, практически на два порядка превосходил уровни транскрипции остальных бета-глобинов.

Для нормировки полученных данных мы намеривались использовать гены домашнего хозяйства, транскрипция которых, из общих соображений,

альфа-(Б) и

Рис. 1. Анализ уровня транскрипции глобиновых (А), бета-глобиновых контрольных генов (В). По вертикальной оси отложено относительное количество мРНК в образцах, вычисленное по результатам qPCR анализа библиотек кДНК, полученных из крови куриных эмбрионов 3-го и 9-го дня развития. Результаты нормированы на количество клеток, взятых в эксперимент. Количество наиболее высоко представленного транскрипта в каждой панели принято за 100. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению от среднего по двум независимым экспериментам.

должна идти на примерно одинаковом уровне в кровяных клетках как 3-дневных, так и 9-дневных эмбрионов. Однако в ходе работы выяснилось, что уровень мРНК выбранных нами контрольных генов (GAPDH, бета-актин, ген 188-рибосомальной РНК) очень сильно отличается в клетках крови эмбрионов разных стадий развития (рис. 1, В). Исходя из этого, экспериментальные данные по измерению уровня транскрипции глобиновых генов мы нормировали на количество клеток, взятых в эксперимент.

Метод фиксации конформации хромосомы.

Принцип метода. Метод фиксации конформации хромосомы (англ. Chromosome Conformation Capture, ЗС) был разработан для анализа взаимного пространственного расположения отдельных участков генома, организованных в ДНК-белковые комплексы (Dekker et al., 2002). В основе метода лежит принцип предпочтительного лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК. Экспериментальный протокол включает формальдегидную фиксацию ДНК-белковых комплексов in vivo с последующей обработкой ДНК эндонуклеазами рестрикции и религированием полученных фрагментов ДНК. Фрагменты, расположенные в непосредственной близости друг от друга, имеют большие шансы быть сшитыми лигазой. Это относится, в частности, и к фрагментам, находящимся в составе одного ДНК-белкового комплекса. Продукты лигирования очищают от белка и проводят количественный анализ с помощью ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробэми с использованием праймеров, подобранных к разным рестриктным фрагментам. Праймеры подбираются так, чтобы своим концом они были обращены к 3'-концам фрагментов - в этом случае анализируются фрагменты, лигирован-ные «голова к голове» или «хвост к хвосту», а однонаправленность праймеров исключает возможность амплификации на матрице недорестрицирован-ной ДНК. Один из фрагментов выбирается «якорным», и анализируется его взаимодействие с другими фрагментами в выбранном участке генома. Нарастание сигнала ПЦР свидетельствует о наличии соответствующего продукта лигирования, а, следовательно, и о том, что выбранная пара рестриктных фрагментов находится in vivo в составе одного хроматинового комплекса.

Результаты ЗС-анализа представляют в виде зависимости интенсивности ПЦР-сигнала от расположения якорного и анализируемого рестриктных фрагментов (рис. 2). Возрастание сигнала для выбранной пары праймеров свидетельствует о расположении соответствующих рестриктных фрагментов в пределах одного хроматинового комплекса, отсутствие пиков свидетельствует о том, что данный район генома находится в «расправленном» состоянии. При этом надо иметь в виду, что частота сшивок якорного фрагмента с фрагментами, ближайшими к нему, может быть высокой независимо от того, объединены ли эти фрагменты одним хроматиновым комплексом.

якорный праимер TaqMan-пpoбa

Рис. 2. Интерпретация результатов ЗС-анализа. Анализируется взаимодействие т. н. «якорного» (В) участка с соседними фрагментами генома (вертикальные серые прямоугольники) по нарастанию флуоресценции в ходе цРСЯ с праймерами, подобранными к З'-концу каждого фрагмента (черные указатели). Пик на кривой свидетельствует о том, что данная пара фрагментов в результате лигирования образовала ампликон, а значит, вероятно, в геноме эти участки находились в составе одного хроматинового комплекса. По вертикальной оси отложена частота сшивки в относительных единицах, прямо пропорциональная интенсивности ПЦР-сигнала от данной пары праймеров.

Количественный анализ продуктов лигирования. Для количественного анализа продуктов лигирования рестриктных фрагментов была применена техника полимеразной цепной реакции в реальном времени с ТацМап-пробами. Для определения относительных количеств ампликонов в ЗС-образцах и контроля эффективности амплификации при использовании каждой пары праймеров в параллели с опытными образцами в качестве матрицы для qPCR были использованы четыре 10-кратных разведения бакмидного стандарта, представляющего собой эквимолярную смесь всех возможных продуктов лигирования (методика приготовления бакмидного стандарта представлена в диссертации).

Для учета качественных и количественных различий независимо приготовленных ЗС-образцов данные С|РСК для каждого образца были нормированы на результаты, полученные с использованием пары праймеров к фрагментам гена домашнего хозяйства ЕЯССЗ (кодирует АТФ-зависимую ДНК-хеликазу, компонент комплекса ТРПН), расположенного в области, предположительно имеющей одинаковую структуру хроматина во всех типах клеток. Это позволило сравнивать результаты, рассматривая их в одной и той же «шкале значений».

Особенности ЗС-анализа в данной работе. В нашей работе для оценки полученных данных мы использовали дополнительный к вышеописанной методике ЗС прием, часто применяемый в том случае, когда необходимо оценить поведение полимерных молекул в трехмерном пространстве. Мы рассчитывали вероятность сшивки двух удаленных участков хроматиновой нити как функцию расстояния между этими участками, исходя из упрощенного представления, согласно которому поведение хроматиновой нити в первом приближении может быть описано в рамках модели поведения свободно сочлененной полимерной цепи (Беккег е1 а1, 2002). Вероятность случайной сшивки Х(э) двух удаленных фрагментов цепи, расположенных на расстоянии 5, задается формулой:

Х(я)=к^м(Б),

где к — некоторая константа, и ]м(я) — локальная концентрация одного фрагмента цепи вблизи другого. в рамках модели свободно сочлененной цепи может быть рассчитана по формуле:

_ ]м(з)=(3/2К<Г2>)3/2,

где <г2>=\/А?х] — среднеквадратичное расстояние между двумя выбранными фрагментами, N - число звеньев цепи, 1 - протяженность одного звена (68 нм).

Константа к отражает эффективность, с которой происходит сшивка двух фрагментов, расположенных на расстоянии е. Она может варьировать в зависимости от условий эксперимента, и, главное, в зависимости от структурных параметров данного конкретного полимера. Применительно к ДНК эта константа зависит, главным образом, от нуклеотидного состава молекулы. Для ОС-богатых регионов генома (какими являются домены глобиновых генов кур) в условиях классического протокола ЗС к ~ 2,8x106 (Оеккег е/ а1., 2002).

График функции Х(я) представляет собой вытянутую по вертикальной оси колоколообразную кривую. При наложении ее на стандартные ЗС-кривые (рис. 3-7, светло-коричневый конус), мы визуализировали область, внутри и в непосредственной близости от которой точки на ЗС-кривой считаются теоре-тически-ожидаемыми и не отражают каких бы то ни было специфических взаимодействий в составе хроматиновых комплексов.

Анализ пространственной конфигурации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов.

Взаимодействие промотора гена л с участками домена альфа-глобиновых генов. Результаты экспериментов, в которых в качестве якорного выступал рестриктный фрагмент, содержащий промотор гена тг, оказались весьма неожиданными. ЗС-кривые, на всем протяжении домена не выходят за пределы области теоретически ожидаемых частот сшивки или находятся в непосредственной близости от нее, что свидетельствует о том, что промотор активно транскрибируемого гена л не участвует в пространственных взаимодействиях ни с одним функциональным элементом домена альфа-глобиновых генов, в том числе с главным регуляторным элементом (МЯЕ) и 3'-

МА1*/М9 МА11/-90НЬ оп/СрС-островок л Т Т

аГ) аА з'-энхансср

гп—й—ЙНЗ-

А

в

х 100

I 80

I 60

А

-р—ш—

Позиция, т.п.н.

г

£

Почнцпя, т.п.н.

Рис. 3. Анализ пространственных взаимодействий промотора гена я с участками домена альфа-глобиновых генов в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов. А - общая схема домена, показывающая расположение основных структурно-функциональных элементов. Красные прямоугольники - экзоны альфа-глобиновых генов; зеленый прямоугольник - ген 1\[РКЬЗ; оранжевые прямоугольники - сайты прикрепления к ядерному матриксу, колокализованные с инсулятором «М9» и -90Н8; оранжевый эллипс - Срв-островок, содержащий точку начала репликации и промотор гена ЫРИЬЗ; красные эллипсы - МЯЕ и З'-энхансер; стрелки показывают направление транскрипции соответствующих генов. Схема построена с использованием последовательности нуклео-тидов АУО16020 (ОепВапк). Б, В, Г - результаты ЗС-анапиза, проведенного с использованием эндонуклеаз рестрикции ВатШЯ^Ш, МЬо1 и НтсПН, соответственно. По вертикальной оси отложена частота сшивки якорного фрагмента с тестовыми, выраженная в относительных единицах. Во всех экспериментах с ферментами ВатН1Л^1П за 100 принято значение частоты сшивки якорного фрагмента, содержащего МЯЕ, с фрагментом -90Ш (рис. 4, Е); во всех экспериментах с МЬо1 за 100 принято значение частоты сшивки фрагмента, содержащего МКЕ, с фрагментом, содержащим инсулятор «М9» (рис. 4, В); во всех экспериментах с НЫШ за 100 принято значение частоты сшивки друг с другом фрагментов, содержащих МКЕ и СрО-островок (данные не показаны). Темно-серые вертикальные прямоугольники - якорные рестриктные фрагменты, светло-серые - тестовые. Светло-коричневый конус - область теоретически-ожидаемых частот сшивки фрагментов, рассчитанных на основе модели свободносочлененной полимерной цепи. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению от среднего по трем независимым экспериментам.

энхансером. Это подтверждается в экспериментах как с использованием комбинации эндонуклеаз рестрикции ВатН! и В§П1 (рис. 3, Б), при обработке

которыми якорный фрагмент содержит ген я целиком и фланкирующие области, так и при переваривании ДНК ферментами Mbol или Hindlll (рис. 3, В, Г), при котором в состав рестриктного фрагмента попадают промотор и левая половина гена п. Единственное исключение - фрагмент, содержащий MAR и инсулятор «М9». На этом фрагменте в эксперименте с использованием эндо-нуклеазы рестрикции Mbol точка ЗС-кривой находится на довольно высоком

30 -10 50

Позиция, г.п.н.

Рис. 4. Анализ пространственной конфигурации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов. А - общая схема домена. Б, Г, Е - результаты ЗС-анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции ВатН1/Е^1Н. В, Д - результаты ЗС-анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции МЬо1. Все обозначения, как на рис. 3.

уровне (рис. 3, В).

Взаимодействие MRE, -9DHS и З'-энхансера с участками домена алъ-фа-глобиновых генов. Для дополнительного контроля полученных данных, мы повторили ЗС-анализ домена альфа-глобиновых генов с использованием якорных фрагментов, несущих MRE, -9DHS и З'-энхансер. Во всех трех сериях экспериментов фрагмент, содержащий ген л или его промотор, продемонстрировал низкие частоты сшивки с якорными фрагментами. Это подтверждает то, что промотор гена л в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов не взаимодействует с ключевыми регуляторными элементами домена и -9DHS. В то же время ЗС-кривые, полученные в этих экспериментах, схожи по форме с кривыми для 10-ого дня эмбрионального развития (Gavrilov and Razin, 2008), что позволяет сделать вывод о том, что до переключения экспрессии домен альфа-глобиновых генов уже организован в хро-матиновый активаторный блок, по структуре подобный блоку, характерному для взрослых стадий развития.

Действительно, при помещении якорного праймера в BamHI/BglH-рестриктный фрагмент, содержащий MRE, высокие частоты сшивки с «якорем» наблюдаются для фрагментов, несущих -9DHS, конец гена а°, и З'-энхансер (рис. 4, Б). При замене пары BamHI/BglH на Mbol, что повышает разрешающую способность метода, на ЗС-кривой возникает пик на фрагменте, несущем центральную часть CpG-островка и промотор гена NPRL3 (рис. 4, В), что говорит о наличии пространственного взаимодействия этого участка домена с якорным фрагментом, содержащим MRE.

При использовании в качестве якорного BamHI/BglII-рестриктного фрагмента, несущего З'-энхансер (рис. 4, Г), на ЗС-кривой четкие пики присутствуют на конце гена а° и -9DHS. Также относительно высокий сигнал наблюдается на MRE, что реципрокно вышеописанному эксперименту с якорем на главном регуляторном элементе домена. В эксперименте с использованием Mbol (рис. 4, Д) ЗС-кривая плавно спадает от З'-энхансера до промотора гена л. На уровне гена aD детектируется относительно высокий ЗС-сигнал, хотя пик как таковой отсутствует. По техническим причинам в этом эксперименте не удалось измерить частоту сшивки якорного фрагмента с -9DHS, поэтому в левой части домена мы детектировали взаимодействие З'-энхансера только с MRE.

В эксперименте с «якорем» на BamHI/BglII-рестриктном фрагменте, содержащем фрагмент -9DHS четкое взаимодействие наблюдается с MRE и всей правой половиной домена, включающей гены а°, аА и З'-энхансер (рис. 4, Е).

Анализ пространственной конфигурации домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках и фибробластах куриных эмбрионов.

Взаимодействие зоны контроля локуса и р/е-энхансера с промоторами бета-глобиновых генов. В основных экспериментах этой части работы мы расщепляли геномную ДНК эндонуклеазой рестрикции Mbol. Этот фермент разрезает домен бета-глобиновых генов на большое число относительно ко-

Д Конденсированный

ГОЬК1 хроматин 5'-инс.

I-1 '

Зона контроля локуса р

I * I

З'-инс. (Ж51М1

I I I ¡В—В—(\ 1п-

ЦНХ4 иНХЗ L)HS2 ЦНХ1

р/е-энхансер

35 41) Позиция, т.п.п.

30 3) 40 Позиция, т.п.и.

Эритроциты, 3 лень развития Эритроциты. 9 лень развития Эмбриональные фибробласты

Рис. 5. Анализ пространственных взаимодействий ОН82 и р/Е-энхансера с участками домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках и фибробластах куриных эмбрионов. А - общая схема домена, показывающая расположение основных структурно-функциональных элементов. Синие прямоугольники - экзоны бета-глобиновых генов; стрелки показывают направление транскрипции соответствующих генов. ИОЬЮ — ген фо-латного рецептора, активный в ранних преэритробластах. (Ж51М1 - ген обонятельного рецептора. Зеленые прямоугольники - участки гиперчувствительности к ДНКазе I (ОНв); зеленые прямоугольники с оранжевой полосой -ЭРК, колокализованные с пограничными инсуляторами домена. Оранжевый эллипс - р/е-энхансер. Схема построена с использованием последовательности нуклеотидов Ы\У_001471556 (ОепВапк). Б, В - ЗС-анапиз пространственной конфигурации домена бета-глобиновых генов с использованием якорных фрагментов, содержащих ОН82 и р/е-энхансер, соответственно. По вертикальной оси отложена частота сшивки якорного фрагмента с тестовыми, выраженная в относительных единицах. Во всех экспериментах за 100 принято значение сшивки фрагмента, содержащего промотор гена р, с фрагментом, содержащем промотор гена рА (рис. 6, Б), в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов. Темно-серые вертикальные прямоугольники - якорные рестриктные фрагменты, светло-серые - тестовые. Светло-коричневый конус — область теоретически-ожидаемых частот сшивки фрагментов, рассчитанных на основе модели свободносочлененной полимерной цепи. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению от среднего по трем независимым экспериментам.

ротких фрагментов (400-600 п.н.) так, что в подавляющем большинстве случаев функционально-важные элементы домена оказывались изолированы в отдельных фрагментах, разделенных несколькими сайтами рестрикции (результаты оценки эффективности рестрикции в использованном протоколе ЗС приведены в диссертации).

В первой серии экспериментов мы разместили якорный праймер во фрагменте, содержащем ОНЯ2 (участок зоны контроля локуса домена бета-глобиновых генов) (рис. 5, Б). В эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов этот фрагмент демонстрирует высокие частоты сшивки с промоторами генов р и рА, а также с (3/е-энхансером. Кроме того, наблюдается взаимодействие якорного фрагмента с пограничными инсуляторами домена, что особенно хо-

хроматин 5'-инс. локуса р П р

I I т *

ЧШ-ММ

Конденсированный

Зона контроля

З'-инс. СЖ51М1

I I I [П (П—Й-—Й-II ■

ОН54 ОНвЗ ОН52 Ц!«!

р/£-энхансер

ЗН5

Позиция. Т.Н.!

30 35 40

i [071шия. т.п.н.

Эритроциты. 3 день ра ши гия ^^ Эритроциты. 9 день развития Эмбриональные фибробласты

Рис. 6. Анализ пространственных взаимодействий промоторов активно транскрибируемых бета-глобиновых генов с участками домена в эритроидных клетках и фиб-робластах куриных эмбрионов. А - общая схема домена. Б, В, Г - результаты ЗС-анапиза, проведенного с использованием эндонуклеазы рестрикции МЬо1; Д - с использованием эндонуклеазы рестрикции N13111. Все обозначения, как на рис. 5.

рошо выражено для БН84, содержащего 5,-инсулятор. В то же время нам не удалось обнаружить взаимодействия ОН82 с промотором активно транскрибируемого гена е. В эмбриональных фибробластах мы не наблюдали ни одного взаимодействия ОН82 с другими участками домена. В эритроидных клетках 9-дневных эмбрионов взаимодействие ОНБ2 с промотором гена рА становится более стабильным, а также возникает взаимодействие ОШ2 с промотором гена рн. Наблюдения, сделанные в этих экспериментах, были подтверждены при перемещении якорных праймеров в рестриктные фрагменты, содержащие промотор гена р (рис. 6, Б), р/е-энхансер (рис. 5, В), а также участки, смежные с промоторами генов рА (рис. 6, В) и е (рис. 6, Г). Якорный фрагмент, содержащий промотор гена р, в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов продемонстрировал высокие частоты сшивки с ОН81-3 (участки зоны контроля локуса). В эритроидных клетках 9-дневных эмбрионов взаимодействие промотора гена р с 01181 остается практически на том же уровне, в то время как взаимодействие с 0Ш2 и БШЗ ослабевает. Интересно, что из анализа ЗС-кривой для 3-го дня следует наличие сильного взаимодействия промотора гена р с промотором гена рА, который на этой стадии развития не транскрибируется. Это взаимодействие сохраняется в эритроидных клетках 9-дневных эмбрионов, хотя в этом случае точка на ЗС-кривой расположена несколько ниже. Данный бинарный комплекс обнаружили и в эмбриональных фибробластах. Это может свидетельствовать о том, что данное взаимодействие не является функционально важным для регуляции транскрипции, и имеет отношение только к архитектуре (способу упаковки в пространстве ядра) этого участка хромосомной территории. Наличие взаимодействия промоторов генов р и рА было подтверждено в реципрокном эксперименте, в котором якорный праймер располагался во фрагменте, смежном с промотором гена рА. В эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов промотор гена рА взаимодействует с промоторами генов рн и р, в то время как сами эти промоторы не взаимодействуют друг с другом. В эритроидных клетках 9-дневных эмбрионов промотор гена рА активно взаимодействует с участками зоны контроля локуса (ОШ1-3); эти взаимодействия значительно менее выражены на ЗС-кривых для 3-го дня развития эмбриона. С р/е-энхансером промотор гена р взаимодействует только в эритроидных клетках 9-дневных эмбрионов (данные подтверждены в реципрокном эксперименте с якорным праймером, расположенным во фрагменте, содержащем р/е-энхансер).

При использовании р/е-энхансера в качестве «якоря» были выявлены его взаимодействия со всеми тремя БШ зоны контроля локуса и промотором гена р как на 3-м, так и на 9-м дне развития эмбриона, но взаимодействия с зоной контроля локуса в эритроидных клетках 9-дневных эмбрионов являются более стабильными, чем аналогичные взаимодействия на 3-м дне развития. Согласно нашим результатам, с промотором гена рн р/е-энхансер взаимодействует только в эритроидных летках 9-дневных эмбрионов. В эмбриональных фибробластах мы не зафиксировали каких-либо взаимодействий р/е-энхансера с другими участками домена.

Конденсированный Зона контроля

-й-м

й—й—6-

З'-инс. 01*51 М1

Н5А ОН54 ОНВЗ ОНБЗ DHSI

3« 3! 40 Позиция, т.п.н.

30 35 Позиция, т.п.н.

■О Эритроциты. 3 день развития ■О» Эритроциты. 9 день развития •О» Эмбриональные фибробласты

Рис. 7. Анализ пространственных взаимодействий пограничных инсуляторов с внутренними участками домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках и фиб-робластах куриных эмбрионов. Все обозначения, как на рис. 5.

Эксперименты с якорным праймером, расположенном в рестриктном фрагменте, смежном с промотором гена в, показывают, что промотор этого гена не взаимодействует с какими-либо функционально важными участками домена бета-глобиновых генов не только на 9-м, но и на 3-м дне эмбрионального развития, когда ген е активно транскрибируется. Для проверки этого неожиданного результата мы повторили ЗС-анализ с использованием эндонук-леазы рестрикции ТчПаШ (рис. 6, Д). Это фермент расщепляет домен бета-глобиновых генов таким образом, что якорный праймер может быть помещен во фрагмент, непосредственно содержащий промотор гена £. Этот эксперимент полностью подтвердил наши предыдущие результаты - промотор гена е не взаимодействует ни с какими участками домена бета-глобиновых генов ни в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов, ни в эмбриональных фиброб-ластах. Важно, что относительные частоты сшивки якорного фрагмента, несущего промотор гена е, с другими фрагментами домена были очень близки в эритроидных клетках, активно транскрибирующих ген £, и в фибробластах, где бета-глобиновые гены не транскрибируются.

Взаимодействие пограничных инсуляторов с внутренними районами домена бета-глобиновых генов. Наши результаты свидетельствуют о том, что пограничные инсуляторы домена бета-глобиновых генов кур взаимодействуют друг с другом в эритроидных клетках как 3-, так и 9-дневных эмбрионов (рис. 7); в фибробластах это взаимодействие, как и взаимодействия инсу-

14

ляторов с другими участками домена, отсутствует. Кроме того, DHS4 (содержит 5'-инсулятор домена) на 3-м дне развития взаимодействует с участками зоны контроля локуса (DHS2, 3), промоторами генов р и рА, и р/е-энхансером. З'-инсулятор на 3-м дне развития взаимодействует с DHS2 и DHS3, наблюдается слабое взаимодействие с промотором гена р. В эритро-идных клетках 9-дневных эмбрионов перечисленные взаимодействия пограничных инсуляторов сохраняются.

Обсуждение результатов

Альфа-глобиновый активаторный хроматиновый блок в эритро-идных клетках 3-дневных куриных эмбрионов. Раннее в нашей лаборатории было показано (Gavrilov and Razin, 2008), что в эритроидных клетках 10-дневных куриных эмбрионов, а также в клетках линии HD3 (линия куриной эритролейкимии, фенотипически соответствует преэритробластам взрослых животных), индуцированных к терминальной дифференцировке и синтезу глобинов, домен альфа-глобиновых генов организован в хроматиновый блок, в состав которого входят промотор гена а°, главный регуляторный элемент домена MRE, З'-энхансер, а также -9DHS и CpG-островок, внутри которого расположен участок начала репликации и промотор гена домашнего хозяйства NPRL3. При этом в недифференцированных клетках HD3 домен существует как минимум в двух альтернативных конфигурациях, а в неэритроидных клетках линии DT40 находится в практически расправленном состоянии, когда пространственно сближенными оказываются только CpG-островок и промотор гена а°.

Результаты проведенного в нашей работе ЗС-анализа конфигурации домена альфа-глобиновых генов в эритроидных клетках куриных эмбрионов 3-го дня развития показывают, что на этом этапе онтогенеза домен имеет схожую пространственную организацию (рис. 8). По всей видимости, альфа-глобиновый хроматиновый блок в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов существует как минимум в трех альтернативных конфигурациях. В первой пространственно сближенными оказываются MRE, -9DHS, ген aD и З'-энхансер, а остальные элементы домена остаются выпетленными за пределы блока. При этом данные MboI-ЗС-анализа свидетельствуют о том, что MRE формирует комплекс с внутренней частью CpG-островка, где расположены промотор гена NPRL3 и участок начала репликации, в то время как З'-энхансер с этим регионом не взаимодействует. Отсюда следует наличие второй конфигурации домена, в которой CpG-островок вытесняет З'-энхансер из блока и занимает его место. Однако из анализа BamHI/BglII-ЗС-кривых следует (рис. 4), что взаимодействие З'-энхансера с -9DHS и геном aD более стабильно, нежели с главным регуляторным элементом домена. Это позволяет предположить наличие еще одной конфигурации, в которой MRE отдаляется от основного блока и за его пределами формирует бинарный комплекс с CpG-островком. Функциональность такого взаимодействия остается не вполне по-

МЯЕ МАЯ/М9 МАК/-90Н5 островок Л аО аА З'-энхансер

—о-(В-□—ф—6—й—К-

->

<-

тия. Пояснения см. в тексте.

нятной, и на наш взгляд объяснением наблюдаемой картины взаимодействий может служить повышенная динамичность альфа-глобинового хроматиново-го блока на 3-м дне развития по сравнению с активаторным хроматиновым блоком эритроидных клеток после переключения экспрессии. Как бы там ни было, «зафиксированные» пространственные конфигурации реализуются на фоне транскрипции всех трех альфа-глобиновых генов, из которых лишь а° (взрослый альфа-глобин, в эритроидных клетках трехдневных эмбрионов транскрибируемый на невысоком уровне) оказывается вовлечен во взаимодействия с регуляторными элементами домена. Ген аА, уровень транскрипции которого на 3-м дне развития куриного эмбриона выше, чем у а°, остается за пределами активаторного комплекса, как это имеет место и в эритроидных клетках после переключения экспрессии. Поскольку нет никаких оснований полагать, что промотор гена аА на самом деле не работает, и мРНК этого гена является продуктом процессинга высокомолекулярного предшественника, синтезируемого с промотора ав, наиболее вероятным представляется сценарий, в котором промотор гена аА управляется непосредственно 3-энхансером, расположенным очень близко от него. При этом выпетливания спейсерного участка не происходит, и активация осуществляется неким альтернативным путем.

Из ранее полученных данных (Gavrilov and Razin, 2008) следует, что промотор гена я ни в эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов, ни в клетках линий HD3 не привлекается в альфа-глобиновый активаторный комплекс, что представляется вполне логичным, поскольку ген л в этих клетках не транскрибируется.

Из полученных нами данных следует, однако, что и на стадии активной транскрипции в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов промотор гена л также не участвует ни в каких пространственных взаимодействиях с удаленными регуляторными элементами домена альфа-глобиновых генов. Таким образом, это свидетельствует в пользу того, что нахождение активного тканеспецифичного промотора в составе комплекса «своего» домена не является обязательным условием его работы. На наш взгляд, этому феномену могут быть следующие объяснения.

Во-первых, не исключено, что промотор гена л в принципе не зависит от си-действующих регуляторных элементов домена альфа-глобиновых генов, и управляется исключительно теми транскрипционными факторами, которые связываются с ДНК в самой промоторной области или в непосредственной близости от нее. Сильный эмбриональный альфа-глобиновый промотор в таком случае может работать «по умолчанию» до тех пор, пока не будет инактивирован посредством какого-либо механизма, например, метилирования.

Во-вторых, в регуляции транскрипции гена л все же могут участвовать MRE и/или З'-энхансер, однако их действие может не сопровождаться вы-петливанием спейсерного участка ДНК. Активационный сигнал может распространяться от них по механизму трэкинга, когда некие ДНК-зависимые белковые моторы (к примеру, комплексы ремоделирования хроматина или РНК-полимераза II) доставляют энхансерный белковый комплекс к промотору (Hatzis and Talianidis, 2002).

Наконец, можно представить, что в хромосомном контексте промотор гена л управляется некими регуляторными элементами, локализованными за пределами домена альфа-глобиновых генов, и привлекается к транскрипционным фабрикам, работающим с теми генами, которые активны только на самых ранних этапах онтогенеза, когда тканеспецифичность промоторов еще не так критична, поскольку ткани и специализированные клеточные типы еще только начинают формироваться.

Суммируя вышеизложенное, можно сказать, что до переключения программы экспрессии домен альфа-глобиновых генов кур в ядрах эритроидных клеток организован в динамичный хроматиновый блок, включающий в себя все основные регуляторные элементы домена и имеющий несколько равновесных конфигураций. Из трех активных промоторов, располагающихся внутри домена, только промотор взрослого альфа-глобинового гена aD участвует в формировании хроматинового блока, в то время как регуляция активности промоторов генов л и аА осуществляется без пространственного взаимодействия с управляющими элементами домена.

Бета-глобиновый активаторный хроматиновый блок в эритроид-ных клетках 3-дневных куриных эмбрионов. Мы обнаружили, что как до,

так и после переключения экспрессии домен бета-глобиновых генов организован в компактный хроматиновый блок, в состав которого входят регуля-торные и пограничные элементы домена, а также промоторы активных и неактивных бета-глобиновых генов.

Первый вывод, который важно сделать при анализе полученных ЗС-кривых, заключается в том, что DHS4 и 3'HS - сайты гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенные на границах домена - взаимодействуют друг с другом (рис. 7) как на 3-м, так и на 9-м дне эмбрионального развития. Из этого следует, что домен бета-глобиновых генов находится в короткой петле хроматина как до, так и после переключения экспрессии. При этом пограничные инсуляторы домена не взаимодействуют друг с другом в эмбриональных фибробластах, то есть эта хроматиновая петля является эритроидспецифич-ной. В данной работе мы не изучали механизмы формирования петли, однако можно предположить, что взаимодействие инсуляторов реализуется с участием белка CTCF, сайты связывания которого локализованы как в DHS4, так и в 3'HS (Bell et al, 1999; Saitoh et al., 2000; Gerasimova, 2001). Нахождение домена бета-глобиновых генов в составе эритроидспецифичной хроматино-вой петли хорошо объясняет тот факт, что границы региона повышенной чувствительности к ДНКазе I в пределах домена в эритроидных клетках ко-локализуются с DHS4 и 3'HS. Интересно, что в доменах бета-глобиновых генов мыши и человека также обнаружено взаимодействие пограничных инсуляторов (Tolhuis et al, 2002; Palstra et al., 2003; Splinter et al, 2006), но в этом случае границы хроматиновой петли не совпадают с границами района повышенной чувствительности к ДНКазе I (Schubeier et al, 2000).

Из анализа ЗС-кривых на рис. 5 и 6 следует наличие как минимум двух альтернативных конфигураций бета-глобинового хроматинового блока на 3-м дне развития куриного эмбриона (рис. 9). В первой из них пространственно сближенными в ядерном пространстве в составе одного хроматинового блока оказываются промоторные области генов р и ßA, DHS2 и комплекс DHS4-3'HS, а также ß/s-энхансер и DHS3. При этом сила взаимодействия (под «силой» мы понимаем вероятность существования долгоживущего и стабильного взаимодействия) неодинакова между вышеперечисленными элементами. По всей видимости (см. рис. 6, Б), одними из самых стабильных являются взаимодействия активно транскрибируемого гена р с зоной контроля локуса и промоторной областью гена ß — пики на ЗС-кривых на соответствующих фрагментах наиболее высокие. Привлечение гена р в хроматиновый блок на 3-м дне развития хорошо согласуется с концепцией хроматинового блока как структуры, обеспечивающей активацию тканеспецифичных промоторов на соответствующих стадиях онтогенеза и только в определенных клеточных типах (de Laat et al, 2008). В то же время взаимодействие промоторов генов р и ßA является весьма неожиданным, поскольку на 3-м дне развития ген р активно транскрибируется, в то время как промотор ßA неактивен. При этом

промотор гена ßA относительно слабо взаимодействует с зоной контроля ло-куса (рис. 6, В), и, вероятно, оказывается пассивно привлечен в активаторный комплекс посредством взаимодействия с промотором гена р.

Следует отметить, что комплекс DHS4-3'HS взаимодействует с элементами активаторного блока главным образом через DHS4 - частоты сшивки «якорей» с фрагментом 3'HS практически во всех экспериментах были заметно ниже таковых для фрагмента DHS4. Привлечение DHS4 в хроматино-вый блок на первый взгляд кажется довольно необычным, поскольку в пределах этого сайта гиперчувствительности к ДНКазе I расположен пограничный инсулятор домена. Но, согласно ранее полученным данным, именно DHS4 является точкой распространения ацетилирования гистонов в домене (Litt et al„ 20016), а значит, концентрирует на себе факторы активации хроматина, такие как, например, факторы ремоделирования и комплексы гистон-ацетилтрансфераз. Возможно, наблюдаемое привлечение DHS4 в активаторный комплекс может объясняться его участием в инициации и поддержании ацетилирования гистонов на протяжении домена за счет создания высокой локальной концентрации комплексов HAT в этом ядерном микрокомпар-тменте.

Итак, первая альтернативная конфигурация бета-глобинового хромати-нового блока на 3-м дне развития в эритроидных клетках куриных эмбрионов предполагает сильное взаимодействие промотора гена р с зоной контроля ло-куса; к этому дуплексу, главным образом посредством взаимодействия с фрагментом, содержащем промотор гена р, привлекается ген ßA; к этим же элементам привлекаются ß/е-энхансер, DHS2 и DHS3. И весь комплекс перечисленных элементов целиком оказывается сближен с комплексом DHS4-3'HS, находящимся в основании хроматиновой петли, внутри которой расположен домен бета-глобиновых генов.

Вторая альтернативная конфигурация в целом повторяет первую и отличается только тем, что в ней ген ßA не входит в состав хроматинового блока, а находится за его пределами и оказывается пространственно сближенным с геном ßH. Стоит отметить, что в экспериментах ни с одним из якорных фрагментов не удалось обнаружить ни одного взаимодействия, в которое достоверно был бы вовлечен ген ßH в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов. Исключение составляет только эксперимент с якорем на участке, смежном с промотором гена ßA (рис. 6, В), то есть, ген ßA взаимодействует одновременно и с основным бета-глобиновым активаторным комплексом, и с геном, который не вовлечен больше ни в одно взаимодействие внутри домена. На этом основании и возникает эта, альтернативная первой модель, в которой наряду с основным активаторным блоком в бета-глобиновом домене на 3-м дне развития имеется довольно стабильное парное взаимодействие про-моторных областей генов ßA и ßH.

Важно, что в состав описанного выше хроматинового блока не входит ген б. Хотя он и активно транскрибируется на 3-м дне эмбрионального развития, по всей видимости, он не регулируется зоной контроля локуса. Ожидае-

мого по данным литературы взаимодействия с ß/s-энхансером тоже обнаружить не удалось. Из наших данных и результатов предыдущих исследований регуляторной системы домена (Choi and Engel, 1986; Nickol and Felsenfeld, 1987; Evans et al., 1988) следует, что, вероятно, энхансер регулирует работу гена 8 не по механизму образования петли, а как-то иначе.

Бета-глобиновый активаторный хроматиновый блок в эритроид-ных клетках на 9-м дне развития куриного эмбриона. Анализ ЗС-кривых для 9-го дня развития убедительно свидетельствует в пользу того, что конфигурация бета-глобинового хроматинового блока в значительной мере отличается от таковой для 3-го дня эмбрионального развития. Согласно полученным данным, в формировании бета-глобинового хроматинового блока на 9-м дне

Конденсированный хроматин FOLR1 1

1 5'-инс Г"

LCR

р ßH ßA 8

I ■ Ei—§4—Eb-

HSA DHS4 DHS3 DHS2 DHS1

ß/е-энхансер

-икс OR5IMI

—II—ft-

3'HS

Эмбриональные фибробласты

Эритроидные клетки 9-дневных эмбрионов

Эритроидные клетки 3-дневных эмбрионов

Рис. 9. Пространственная конфигурация домена бета-глобиновых генов в фибробла-стах и эритроидных клетках 3- и 9-дневных куриных эмбрионов. Объяснения см. в тексте. Голубые эллипсы - белковые комплексы, связанные с пограничными инсулятора-ми домена, обеспечивающие взаимодействие с З'Ш и формирование эритроидспе-

цифичной петли хроматина.

развития участвует зона контроля локуса, причем, все сайты гиперчувствительности к ДНКазе I (ОГО 1-3), комплекс генов рА-|Зн, (3/е-энхансер, а также ген р. При этом весь хроматиновый комплекс в целом остается связанным с

основанием бета-глобиновой хроматиновой петли, в котором располагаются взаимодействующие друг с другом DHS4-3'HS.

Не совсем ясным в этом случае является участие в формировании хро-матинового блока эмбрионального гена р (рис. 6, Б), транскрипция которого к этому времени в 90% эритроидных клеток, циркулирующих в кровотоке эмбриона, прекращена (Reitman and Felsenfeld, 1990). Привлечение промотора гена р к LCR на 9-м дне развития может быть пассивным и обуславливаться взаимодействием с промотором гена ßA, который на этой стадии онтогенеза находится в стабильном комплексе с зоной контроля локуса. Взаимодействие между промоторами генов р и ßA прослеживается и в эритроидных клетках 3-го дня развития, и эмбриональных фибробластах (фактически, единственное взаимодействие, зафиксированное в неэритроидных клетках). Судя по всему, связанные друг с другом промоторы генов р и ßA ведут себя как единый модуль, существующий обособленно в клетках, не синтезирующих бета-глобины, а в эритроидных клетках взаимодействующий с LCR как до, так и после переключения экспрессии, но через транскрипционные факторы, связанные с промотором гена р на 3-м, и с промотором гена ßA на 9-м дне развития эмбриона. Само же по себе взаимодействие промоторов этих генов может не иметь функционального значения в регуляции транскрипции, а являться неким структурным свойством бета-глобинового домена, имеющим отношение к его архитектуре в пространстве ядра, организации хромосомной территории.

В качестве альтернативной гипотезы, объясняющей привлечение гена р в активаторный хроматиновый блок на 9-м дне развития, можно выдвинуть предположение, что участки LCR необходимы не только для активации транскрипции, но и для ее репрессии. Косвенным подтверждением этому могут служить данные, полученные в 2005 году Wang с соавт. В экспериментах по переносу участка куриной хромосомы в ядра клеток человеческой эритро-лейкимии данными авторами было показано, что выключения транскрипции гена р не происходит, если делетированы DHS2 или DHS1. Поскольку DHS в бета-глобиновой LCR кур имеют довольно значительную протяженность (от 300 до 600 п. н.), в них могут быть локализованы в некоем, возможно, «шахматном», порядке сайты для белковых факторов как активации, так и репрессии транскрипции. Таким образом, промотор гена р, взаимодействуя с DHS1-3 как на 3-м, так и на 9-м дне развития, может перемещаться в пределах этого хроматинового комплекса от активаторных к репрессорным сайтам. Возникает вопрос, каким образом клетке удается надежно контролировать выключение гена р на 9-м дне развития, позиционируя его при этом вблизи зоны контроля локуса, где так много разнообразных активаторных факторов. Возможно, ключевым моментом здесь является то, что в процессе переключения программы экспрессии внутри домена происходит метилирование ДНК в промоторе гена р, после чего он оказывается надежно блокирован репрессор-ными комплексами, узнающими метилированный остаток цитозина в CpG-динуклетидах (Kransdorf et al., 2006).

Итак, полученные нами данные убедительно свидетельствуют в пользу того, что переключение экспрессии глобиновых генов у кур сопровождается перестройками в пространственной конфигурации геномных доменов альфа-и бета-глобиновых генов. Принимая во внимание ограничения, которые накладывают на интерпретацию экспериментальных данных внутренние свойства ЗС как метода, созданного для анализа парных взаимодействий в геноме на популяции клеток, мы не исключаем наличия большего числа альтернативных конфигураций исследованных доменов и наличия некоторых функционально важных взаимодействий, которые ускользнули от нашего внимания. Однако ясно, что перестройкам в работе регуляторной системы геномного домена в ходе инактивации одних и активации других промоторов сопутствуют изменения в структуре активаторных хроматиновых блоков, которые, возможно, создают предпосылки для таких перестроек. Важно, что, согласно полученным нами данным, промоторы активно транскрибируемых эмбриональных глобиновых генов лив (эмбриональный альфа-глобиновый и бета-глобиновый гены, соответственно) регулируются без непосредственного привлечения к активаторному хроматиновому комплексу. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что верно также и обратное утверждение: не всегда привлечение промотора в активаторный хроматиновый блок коррелирует с началом транскрипции, что расширяет наши представления о регуляции транскрипции на уровне пространственной организации доменов тканес-пецифичных генов. Возможно, следует описывать активаторный хроматиновый блок не только как структуру, необходимую для правильной регуляции транскрипции внутри домена, но и как способ упаковки данного геномного локуса в контексте архитектуры интерфазной хромосомы в целом.

Выводы

1. Продемонстрировано, что в эритроидных клетках куриных эмбрионов домены альфа- и бета-глобиновых генов имеют сложную пространственную конфигурацию, обеспечивающую возможность прямого взаимодействия промоторов и различных регуляторных элементов. Комплексы регуляторных элементов (хроматиновые блоки) собираются как до, так и после переключения программы экспрессии глобиновых генов, причем до переключения экспрессии характерным является присутствие нескольких равновесных конфигураций хроматиновых блоков.

2. Показано, что переключение экспрессии глобиновых генов у кур коррелирует со значительными изменениями структуры активатор-ного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов, в то время как организация активаторного хроматинового блока домена альфа-глобиновых генов существенно не изменяется.

3. Продемонстрировано, что активные промоторы эмбрионального альфа-глобинового (я) и бета-глобинового (е) генов работают изолировано, не взаимодействуя с удаленными регуляторными элементами доменов.

4. Показано, что домен бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3-й 9-дневных эмбрионов расположен в изолированной петле хроматина, удерживаемой посредством взаимодействия пограничных инсуляторов домена. В неэритроидных клетках это взаимодействие отсутствует.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Юдинкова Е.С., Бунина Д.А., Ульянов C.B., Гаврилов A.A., Разин C.B. (2011). Профили распределения модифицированных форм гистонов в домене альфа-глобиновых генов кур. Молекулярная биология, 45:662-667.

2. Yudinkova E.S., Ulyanov S.V.. Bunina D.A., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2011). The inactivation of the n gene in chicken erythroblasts of adult lineage is not mediated by packaging of the embryonic part of the alpha-globin gene domain into a repressive heterochromatin-like structure. Epigenetics, 6:14811488.

3. Ulianov S.V.. Marko va E.N., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2012). Insulators in vertebrates: regulatory mechanisms and chromatin structure. Biopolymers and Cells, 28:252-260.

4. Разин С.В., Ульянов С.В.. Юдинкова Е.С., Гущанская Е.С., Гаврилов А.А., Яровая О.В. (2012). Домены альфа и бета-глобиновых генов кур в контексте структурно-функциональной организации эукариотического генома. Успехи биологической химии, 52:3-36.

5. Ульянов С.В.. Гаврилов А.А. (2012). Р-глобиновые гены кур: модельная система для изучения регуляции транскрипции на уровне геномных доменов. Молекулярная биология 46:683-698.

6. Ulianov S.V.. Gavrilov А.А., Razin S.V. (2012). Spatial organisation of the chicken p-globin gene domain in erythroid cells of embryonic and adult lineages. Epigenetics and chromatin, 5:16.

7. Kulaeva O., Nizovtseva E., Polikanov Y„ Ulianov S.. Studitsky V. (2012). Distant activation of transcription: mechanism of enhancer action. Moll. Cell. Biol., 32:4892-4897

Тезисы конференций:

1. S.V. Ul'yanov, A.A. Gavrilov, and S.V. Razin. Characterization of spatial organization of the chicken beta-globin gene domain. International symposium "Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies" of Transregional Collaborative Research Centre 81. Giessen, Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p. 113.

Заказ № 19-П/02/2013 Подписано в печать 08.02.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ульянов, Сергей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.- 4

ВВЕДЕНИЕ.-5

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.- 9

1.1. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА.- 9

1.1.1. Хроматиновые домены.- 9

1.1.2. Инсуляторы.- 12

1.1.3. Регуляция транскрипции зонами контроля локуса. Хроматиновый хаб.- 14

1.2 ДОМЕН АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.- 22

1.2.1. Общая характеристика и структурно-функциональные элементы домена. - 22

1.2.2. Регуляция транскрипции внутри домена.- 25

1.3. ДОМЕН БЕТА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.- 28

1.3.1. Общая характеристика.- 28

1.3.2. Пограничные элементы домена.- 31

1.3.3. Регуляция транскрипции внутри домена.- 34

1.4. ФЕНОМЕН ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ, - 40

1.5. МЕТОД ФИКСАЦИИ КОНФОРМАЦИИ ХРОМОСОМЫ (ЗС).- 43

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.- 48

II. 1. Выделение эмбриональных эритроцитов и фибробластов.- 48

II.2. Работа с ДНК.- 48

Н.З. Работа с РНК.-49

11.4. ПЦР в реальном времени с ТацМап-пробами.- 51

11.5. ЗС-анализ.- 51

11.6. Программное обеспечение.- 53

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.- 59

III. 1. Измерение уровня транскрипции глобиновых генов.- 59

III.2. Проверка использованной последовательности домена бета-глобиновых генов на наличие несеквенированного участка в пределах БН84.- 61

Ш.З. ЗС-анализ.-62

111.4. Анализ пространственной конфигурации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3-дневных эмбрионов.- 69

Ш.5. Анализ пространственной конфигурации домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках и фибробластах куриных эмбрионов.- 73

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.- 80

IV. 1. Альфа-глобиновый хроматиновый хаб в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов.- 82

IV.2. Бета-глобиновый хроматиновый хаб в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов. Две альтернативных конформации.- 85

ГУ.З. Бета-глобиновый хроматиновый хаб в эритроидных клетках на 9-м дне развития куриного эмбриона.- 89

ВЫВОДЫ.- 92

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль пространственной организации геномного локуса в феномене переключения экспрессии глобиновых генов"

Ядерная ДНК высших эукариот на протяжении всего клеточного цикла находится в составе сложного нуклеопротеидного комплекса, называемого хроматином. В его состав входит множество белков, осуществляющих архитектурные, каталитические и регулятор-ные функции (Carey, 2005). Хроматин является относительно лабильной структурой, что обуславливает возможность перемещения участков генома в пространстве ядра. Движущие силы этих перемещений на сегодняшний день остаются неизвестны, однако ясно, что взаимное позиционирование участков ДНК, иногда разделённых расстоянием в сотни тысяч пар оснований, является одним из ключевых событий в регуляции экспрессии генов (Soutoglou and Misteli, 2007; Kumaran et al., 2008). На множестве изученных модельных систем показано, что пространственное взаимодействие промоторов тканеспецифичных генов и регуляторных элементов критически важно для запуска транскрипции на строго определённых этапах онтогенеза, и только в тех клеточных типах, где данные гены должны быть активны.

Согласно современным представлениям, геном высших эукариот имеет доменное строение. Геномный домен - это участок ДНК, содержащий один или несколько генов, а также регуляторные и пограничные (не всегда) элементы, контролирующие хроматиновый статус и транскрипцию внутри домена. Следует отметить, что часто домен не является чётко локализованным модулем - регуляторные элементы могут располагаться и на значительном расстоянии от подконтрольных промоторов, однако, и в этом случае понятие домена как некоторой обособленной функциональной единицы генома имеет смысл. В результате диффузии или энергозависимых процессов удалённые друг от друга элементы домена (промоторы, энхансеры/сайленсеры, инсуляторы, области прикрепления к ядерному матриксу и т. д.) оказываются сближенными в пространстве ядра в структурах, получивших название «хроматиновые хабы» (Laat and Grosveld, 2003). Эти ДНК-белковые комплексы, образованные при участии тканеспецифичных и конститутивных факторов транскрипции, являются структурной основой для формирования открытого инициаторно-го комплекса на промоторе и успешной активации транскрипции, и/или преодоления элонгационной паузы (Core et al., 2012). Нет данных структурного анализа, свидетельствующих в пользу того, что хабы поддерживаются за счёт прямых белок-белковых взаимодействий. Возможно, детектируемые дальние взаимодействия в геноме есть результат лишь некоторой сближенности участков интерфазной хромосомы внутри хромосомной территории (Cremer et al., 2006). Однако, как бы там ни было, нокдауны по ряду факторов транскрипции, когезину и белку CTCF (инсуляторный белок позвоночных и D. melanogas

- 5 ter) приводят к тому, что существующие хроматиновые хабы значительно меняют свою структуру или исчезают вовсе (Degner et al., 2011).

Понятие хроматинового хаба тесно связано с понятием транскрипционных фабрик - особых микрокомпартментов ядра, в которых происходит активная транскрипция, осуществляемая иммобилизованными комплексами РНК-полимераз (Bortle and Corees, 2012). Хотя внутреннее устройство транскрипционных фабрик изучено довольно слабо, можно представить, что каждая отдельная фабрика - это крупный хроматиновый хаб (или их множество), в котором могут быть сближены промоторы и регуляторные элементы сразу нескольких геномных локусов. Структура каждой фабрики, как и хроматинового хаба отдельно взятого геномного домена, представляется динамичной: на разных этапах онтогенеза и в зависимости от спектра сигналов, получаемых клеткой извне, состав фабрики может меняться. Одни промоторы оказываются инактивированы и теряют связь с фабрикой, перемещаясь в другие (к примеру, гетерохроматиновые) компартменты ядра, а их место занимают те промоторы, которые теперь должны быть активированы.

На сегодняшний день большая часть подобных описаний архитектуры транскрипционной машинерии эукариот во многом остаётся спекулятивной. Хабы и функционирующие транскрипционные фабрики не удаётся наблюдать напрямую, и все выводы, касающиеся их устройства и работы, сделаны по косвенным данным. Однако есть все основания полагать, что центральное утверждение в модели хроматинового хаба и транскрипционной фабрики - необходимость пространственной сближенности в хроматине регуля-торных элементов и подконтрольных промоторов - всё же является верным.

Одними из самых популярных объектов в изучении регуляции транскрипции эука-риотических генов на уровне хроматина являются домены глобиновых генов позвоночных животных. Исследования этих участков генома имеют длительную историю и принесли немало крупных открытий, ß-глобиновый ген кролика был первым, который удалось успешно трансфецировать в эукариотические клетки, где была изучена его экспрессия под влиянием его собственных регуляторных элементов. Исследования на мышах с использованием генетических конструкций на основе человеческого домена бета-глобиновых генов в 1980-х гг. привели к открытию зоны контроля локуса, или LCR {англ. Locus Control Region) - позитивного регуляторного элемента, обеспечивающего экспрессию трансгена в эндогенной позиции независимо от места интеграции в геном, и в прямой зависимости от числа копий. На модели домена альфа-глобиновых генов был исследован феномен полнодоменной транскрипции, которая необходима для поддержания хроматинового статуса домена, и является, судя по всему, источником длинных некодирующих РНК, участвующих в формировании ядерного матрикса (Recillas-Targa and Razin, 2001; Razin et al., 2004). На примере глобиновых доменов были изучены свойства инсуляторов - особых генетических элементов, препятствующих распространению гетерохроматина по ДНК, а также блокирующих действие энхансера на промотор (Valadez-Graham et al., 2004). В частности, 5"-инсулятор домена бета-глобиновых генов кур стал первым инсулятором, открытым у позвоночных животных (Chung et al., 1993).

Полномасштабное исследование домена бета-глобиновых генов кур было начато ещё в середине XX века, и за прошедшие десятилетия этот домен стал классическим модельным объектом в изучении регуляции транскрипции на уровне хроматина. В многочисленных работах были получены обширные сведения о роли зоны контроля локуса в механизмах активации транскрипции глобиновых генов в ходе онтогенеза, о функциональном взаимодействии управляющих элементов домена и роли эпигенетических модификаций в регуляции транскрипции (Ульянов, Гаврилов, 2012). Тем не менее, полностью отсутствуют данные о том, какова пространственная конфигурация домена в эритроидных клетках на разных стадиях онтогенеза, и является ли она эритроидспецифичной, или же спектр взаимодействий элементов домена не зависит от типа ткани.

На модели домена альфа-глобиновых генов кур были выполнены исследования по изучению влияния локальной структуры хроматина на процесс транскрипции и регуляцию активности промоторов удалёнными регуляторными элементами (Разин, Юдинкова, 2007). В более ранних работах нашей лаборатории довольно подробно охарактеризована структурно-функциональная организация домена, в частности механизмы инициации транскрипции входящих в его состав взрослых а°- и аА-глобиновых генов (Gavrilov and Razin, 2008). Изучена пространственная конфигурация домена в раковых куриных эритробластах, индуцированных к терминальной дифференцировке, и в эритроидных клетках на поздних стадиях эмбрионального развития. Выяснено, какие из регуляторных элементов, картированных в пределах домена, взаимодействуют в этих типах клеток с промоторами взрослых альфа-глобиновых генов и обуславливают их активный транскрипционный статус. Однако относительно эмбрионального альфа-глобинового гена я таких данных до сих пор получено не было. Неизвестно, необходимы ли для его экспрессии в геноме какие-либо си-действующие регуляторные элементы.

Также в пределах доменов глобиновых генов кур, как и во всех изученных глобиновых доменах теплокровных животных, был открыт феномен переключения программы экспрессии, который заключается в том, что в ходе онтогенеза происходит поочерёдная активация транскрипции глобиновых генов сначала эмбрионального, затем взрослого типа (Stamatoyannopoulos, 2005). Механизмы этого переключения на сегодняшний день во многом остаются не выясненными. Известно, что переключение сопровождается эпигенетиче

- 7 ской инактивацией эмбриональных промоторов, расположенных ближе к зоне контроля локуса. Есть основания полагать, что это критически важный этап в переключении программы экспрессии, при нарушении которого не происходит полноценной активации промоторов взрослых глобинов (Beauchemin and Trudel, 2008). Однако не известно, является ли переключение неизбежным следствием только инактивации эмбриональных генов, которые теперь выбывают из конкуренции за регуляторные участки, или же переключение происходит в результате гораздо более масштабных событий внутри домена? В данной работе мы изучали пространственную организацию доменов альфа- и бета-глобиновых генов кур в ряде клеточных типов с целью выяснить, изменяется ли спектр пространственных взаимодействий регуляторных элементов и промоторов внутри доменов при переключении программы экспрессии. Для ответа на этот вопрос были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Проанализировать спектр пространственных взаимодействий внутри домена альфа-глобиновых генов кур до момента переключения экспрессии (в эритроид-ных клетках 3-дневных куриных эмбрионов). Сравнить результаты с ранее полученными данными о конфигурации домена в эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов, после переключения программы экспрессии.

2. Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бе-та-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения экспрессии.

3. Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бе-та-глобиновых генов кур в клетках неэритроидного происхождения. Выяснить, существуют ли взаимодействия структурно-функциональных элементов домена, не являющиеся эритроидспецифичными.

Для решения поставленных экспериментальных задач мы использовали метод фиксации конформации хромосомы, или ЗС {англ. Chromosome Conformation Capture), ранее разработанный для детектирования пространственных взаимодействий участков ДНК в хроматине (Dekker et al., 2002).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ульянов, Сергей Владимирович

выводы

1. Продемонстрировано, что в эритроидных клетках домены альфа- и бета-глобиновых генов кур имеют сложную пространственную конфигурацию, обеспечивающую возможность прямого взаимодействия промоторов и различных регуляторных элементов. Комплексы регуляторных элементов (хроматиновые хабы) собираются как до, так и после переключения программы экспрессии глобиновых генов, причем до переключения экспрессии характерным является присутствие нескольких равновесных конфигураций хроматиновых хабов.

2. Показано, что переключение экспрессии глобиновых генов у кур коррелирует со значительными изменениями структуры активаторного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов, в то время как организация активаторного хроматинового блока домена альфа-глобиновых генов существенно не изменяется.

3. Продемонстрировано, что активные промоторы эмбрионального альфа (я)- и бета-глобинового (е) генов работают изолировано, не взаимодействуя с удаленными регуляторными элементами доменов.

4. Показано, что домен бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3- и 9-дневных эмбрионов расположен в изолированной петле хроматина, удерживаемой посредством взаимодействия пограничных инсуляторов домена. В неэрит-роидных клетках это взаимодействие отсутствует.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ульянов, Сергей Владимирович, Москва

1. Abruzzo L., Reitman М. (1994). Enhancer activity of upstream hypersensitive site 2 of the chicken beta-globin cluster is mediated by GATA sites. J. Biol. Chem. 269: 32565-71.

2. Beauchemin H., Trudel M. (2008). Evidence for a Bigenic Chromatin Subdomain in Regulation of the Fetal-to-Adult Hemoglobin Switch. Moll. Cell. Biol. 29: 1635-1648.

3. Beisel C., Paro R (2011). Silencing chromatin : comparing modes and mechanisms. Rev. Genet. 12: 123-135.

4. Bortle K., Corces V. (2012). Nuclear organization and genome function. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28: 163-87.

5. Borunova V., Iarovaia O., Vassetzky Y., Razin S. (2005). The upstream area of the chicken a-globin gene domain is transcribed in both directions in the same cells. FEBS Letters. 579: 4746-4750.

6. Brasset, E., Vaury C. (2005). Insulators are fundamental components of the euka-ryotic genomes. Heredity. 94: 571-576.

7. Bruns G., Ingram V. (1973). The erythroid cells and haemoglobins of the chick embryo. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 266: 226-319.

8. Bulger M., Groudline M. (1999). Looping versus linking: toward a model for long distance gene activation. Genes Dev. 13: 2465-2477.

9. Burgess-Beusse, Farrell C., Gaszner M., Litt M., Mutskov V., Recillas-Targa F., Simpson M., West A., Felsenfeld G. (2002). The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. PNAS. 99: 16433-16437.

10. Carey M. (2005). The chromatin marks and machines, the missing nucleosome is a theme: gene regulation up and downstream. Mol. Cell. 17: 323-330.

11. Carr A., Biggin M. (1999). A comparison of in vivo and in vitro DNA-binding specificities suggests a new model for homeoprotein DNA binding in Drosophila embryos. EMBO J. 18:1598-1608.

12. Chada K., Magram J., Constantini F. (1986). An embryonic pattern of expression a human fetal globin gene in transgenic mice. Nature. 319: 685-689.

13. Chapman B., Tobin A. (1979). Distribution of developmentally regulated hemoglobins in embryonic erythroid populations. J. Dev. Biol. 69: 375-387.

14. Choi O., Engel, J. (1988). Developmental regulation of P-globin gene switching. Cell. 55: 17-26.

15. Choi O., Engel, J. (1986). A 3'-enhancer is required for temporal and tissue-specific transcriptional activation of the chicken adult beta-globin gene. Nature. 323: 731-734.

16. Chung J., Bell A., Felsenfeld G. (1997). Characterization of the chicken P-globin insulator. Genetics. 94: 575-580.28.