Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика молекулярных механизмов, регулирующих экспрессию альфа-глобиновых генов кур

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика молекулярных механизмов, регулирующих экспрессию альфа-глобиновых генов кур"

На правах рукописи УДК 576 315 42

БОРУНОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ЭКСПРЕССИЮ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в рамках программы Российско-Французского научного сотрудничества (Cotutelle de thèse) в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Института биологии гена РАН и в лаборатории хроматина, развития и канцерогенеза Института им Постава Русси, Вильжуиф, Франция

Научные руководители

чл -корр РАН, доктор биологических наук, профессор Разин С В доктор биологических наук Васецкий Е С

Официальные оппоненты

чл -корр РАН, доктор биологических наук, профессор Рысков А П доктор биологических наук, профессор Карпов В Л

Ведущая организация

Институт биоорганической химии им M M Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится-/^"декабря 2005 года в час на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан ноября 2005 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета л

канд фарм наук с—у ю ^"^Й-^^Й^Срабовская JIС

г- 6~ЭгТ

ИМИ

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы

В настоящее время практически не подлежит сомнению тот факт, что геном эукариот организован в отдельные хроматиновые домены На сегодняшний день известно, по крайней мере, два типа доменов структурные и функциональные Типичными доменами, определенными по структурному признаку, являются домены тканеспецифичных генов, характеризующиеся повышенным уровнем чувствительности к нуклеазам и повышенным уровнем ацетилирования гистонов в тех тканях, где домен активен На границах этих доменов часто расположены инсуляторы, которые ограничивают область действия позитивных регуляторных элементов и препятствует распространению репрессивных структур хроматина Типичными примерами таких «классических» хроматиновых доменов, содержащих тканеспецифичные гены, являются домены Р-глобиновых генов позвоночных и домен овальбуминовых генов кур Можно было бы предположить, что весь геном состоит из единообразно организованных доменов, однако изучение различных геномов показало, что наряду с «классическими» доменами существует и множество «неканонических» доменов, в том числе доменов с перекрывающимися генами и регуляторными системами Именно к такому типу доменов относятся домены а-глобиновых генов позвоночных Они расположены в богатых генами хромосомных областях и являются предпочтительно чувствительными к нуклеазам во всех типах клеток Такие домены было предложено называть доменами «открытого типа» или доменами с «размытыми границами»

Одним из наиболее изученных доменов открытого типа является домен а-глобиновьгх генов кур Этот домен перекрывается с геном «домашнего хозяйства» ggPRX и является одним из первых доменов, где были обнаружены некодирующие межгенные транскрипты В настоящей работе продемонстрировано, что в домене а-глобиновых генов кур межгенные транскрипты представляют собой полнодоменный транскрипт Функциональное значение такого рода транскриптов оставалось неясным Согласно одной из гипотез, они играют важную роль в поддержании активного статуса хроматинового домена Настоящая работа посвящена изучению полнодоменного транскрштга домена а-глобиновых генов кур, а именно картированию его границ и изучению феномена симметричной транскрипции 5'-концевой области домена

Следует подчеркнуть, что домены открытого типа, содержащие одновременно тканеспецифичные гены и гены домашнего хозяйства, привлекли внимание исследователей сравнительно недавно Принципы взаимодействия регуляторных механизмов, контролирующих работу разных генов в домена? эрэд^тдд^уфивд^цвдрстаточно В то же

БИБЛИОТЕКА ] С.Пегмб*»г.« . * «Э

время домены открытого типа составляют значительную часть генома Раскрытие общих принципов организации этих доменов существенно расширит наши знания о механизмах контроля экспрессии генов в эукариотической клетке Именно это определяет актуальность темы диссертационной работы

Цели и задачи исследования.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Картировать границы транскрибирующейся области домена а-глобиновых генов кур в эртроидных и неэритроидных клетках

2) Определить, является ли протяженный «межгенный» транскрипт домена а-глобиновых генов кур непрерывным, т е действительно ли он представляет собой транскрипт всего домена, включая его 5'-концевую область

3) Выяснить, происходит ли транскрипция а-глобинового домена в направлении глобиновых генов и в противоположном направлении в одних и тех же клетках и, соответственно, присутствуют ли в ядрах таких клеток комплементарные транскрипты

Научная новизна и практическое значение работы.

В работе впервые продемонстрировано существование полнодоменного транскрипта домена а-глобиновых генов кур, начинающегося от регуляторной области домена, обладающей определенными чертами области контроля локуса Показано, что данный транскрипт присутствует только в эритроидных клетках Полученные результаты являются косвенным подтверждением гипотезы Траверса, постулирующей, что постоянная транскрипция протяженных областей генома необходима для поддержания их активного статуса Полученные результаты составляют экспериментальный базис для дальнейшего развития и экспериментального подтверждения данной гипотезы В работе впервые продемонстрировано, что протяженная область генома может транскрибироваться в противоположных направлениях в одних и тех же клетках Эти результаты показывают, что в клетке существуют определенные механизмы, ограничивающие действие систем разрушения двунитевых РНК Осознание этого факта имеет большое практическое значение в силу того, что ингибирование экспрессии генов комплементарными РНК является в настоящее время одним из основных экспериментальных подходов, используемых в качестве альтернативы более трудоемкой процедуры «нокаута» генов

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции, посвященной десятилетию Московского центра медицинских исследований университета Осло «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 2004) и на международной конференции « 18th IGB Meeting Epi genetic Bases of Genome Reprogramming» (Капри, Италия, 2005)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ Из них статей 4, материалов конференций 2

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 83 страницах, содержит 12 рисунков и 2 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 100 источников

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Картирование границы эритроид-специфичиой транскрипционной единицы в 5'-концевон области домена а-глобиновых генов кур.

В эритробластах кур протяженная 5'- концевая область домена а-глобиновых генов транскрибируется в глобиновом направлении (Broders, 19876, 1990) По оценкам авторов цитированных публикаций максимальный размер соответствующих транскриптов достигал 17 тпн (Broders, 1990) Однако границы транскрипционной области домена не были определены С целью получения информации по данному вопросу представлялось необходимым картировать начало транскрибирующейся области Кроме того, представлялось интересным выяснить, существуют ли протяженные транскрипты домена а-глобиновых генов в неэритроидных клетках

Для решения этих вопросов мы воспользовались методом обратной транскрипции со специфических праймеров с последующей амплификацией тест-фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) Необходимость использования специфических праймеров для обратной транскрипции определялась тем обстоятельством, что, согласно литературным данным, изучаемая область генома может транскрибироваться в обоих направлениях Для подбора праймеров мы использовали нуклеотидную последовательность протяженного фрагмента куриной ДНК, включающего кластер а-глобиновых генов (AY016020) (Flint, 2001) Для каждой исследуемой области было выбрано несколько праймеров для обратной транскрипции, инициирующих транскрипцию с точек, находящихся на некотором расстоянии друг от друга Это было сделано для того, чтобы снизить зависимость результата от качества индивидуального праймера

В первой серии экспериментов были проанализированы препараты РНК, полученные из эритроидных клеток кур Полученные результаты представлены на рисунке 1 (секции I -IV) Во всех случаях ПЦР-амплификацию тест-фрагментов проводили на трех препаратах кДНК исходном (дорожки «а»), разведенном в 5 раз (дорожки «б») и в 25 раз (дорожки «в») Кроме того, амплификацию тест-фрагментов проводили на препаратах геномной ДНК Это делалось для того, чтобы сравнить эффективность различных пар праймеров и получить положительный контроль Представленные результаты четко показывают, что тест-фрагменты I и II (смотри схему на рисунке 1) не транскрибируются в глобиновом направлении Действительно, при использовании в качестве матрицы кДНК, синтезированной на транскрипте глобинового направления, мы не смогли амплифицировать тест-фрагменты I и II с помощью ПЦР В то же время в параллельных экспериментах были

амплифицированы тест-фрагменты П1-У1 Это свидетельствует о том, что данные фрагменты транскрибируются в глобиновом направлении Сравнивая интенсивность фрагментов, полученных при ПЦР-амплификации кДНК, взятой в различных разведениях, можно сказать, что уровни транскрипции тест-фрагментов Ш-У1 примерно одинаковы В совокупности результаты, представленные на рисунке 1, показывают, что транскрипционная единица доменного уровня, охватывающая протяженную 5'- концевую область домена а-глобиновых генов кур, начинается между тест-фрагментами II и III, т е на расстоянии 22-24 т п н перед эмбриональным глобиновым геном п Интересно, что именно в этой области находится 1X11-подобный регуляторный элемент домена а-глобиновых генов кур и заканчивается эритроид-специфичный домен предпочтительного ацетилирования гистонов, который включает всю картированную транскрибирующуюся область и собственно кластер глобиновых генов

BfiPRX

II III IV

VI

—I—

10000

VII

4:

20000

30000

40000

| —о — д

* 50000 a a

III

IV

VI

А Б В

Ьй X СХ

А Б

ъс

5 А

ъс

в a

А Б

в 5а

Б В 5 А

* « & п* ® га

Б B4?s

Рисунок 1. Картирование 5'-кониевого участка полноразмерного транскрипта кластера a-глобиновых генов кур.

В верхней части рисунка показана схема домена Обозначения на шкале расстояний (п н ) даны в соответствии с нумерацией последовательности ДНК, депонированной в базе данных GeneBank под номером АУ016020 Глобиновые гены показаны черными прямоугольниками Тест-фрагменты I-VII показаны белыми вертикальными прямоугольниками Результаты ПЦР-анализа показаны под картой На дорожки «Б», «В» наносились продукты амплификации на кДНК, разведенной в 5 и 25 раз по сравнению с количеством кДНК, использованной для ПЦР-реакции, продукты которой наносились на дорожки «А» На дорожки, обозначенные «ДНК» наносились продукты ПЦР-реакции с теми же парами праймеров на геномной ДНК

В следующей серии экспериментов мы проверяли, транскрибируется ли 5'-концевая область домена в первичных фибробластах, где отсутствует транскрипция а-глобиновых генов Для этого в качестве матрицы для обратной транскрипции и последующей ПЦР-амплификации тест-фрагментов IV, VI и VII использовали РНК из первичных куриных фибробластов Для контроля в параллельных экспериментах в качестве матрицы использовали ДНК из эритробластов Другим контролем служила амплификация тест-фрагмента IV на матрице к ДНК, синтезированной на транскрипте ggPRX-reнa Этот ген перекрывается с доменом а-глобиновых генов (включая тест-фрагмент IV) и транскрибируется во всех типах клеток в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов Полученные результаты представлены на рисунке 2

IV

VI

VII

30000 40000

ЭРИТРОБЛАСТЫ

Я ' а° аА 50000

ФИБРОБЛАСТЫ

> >

к > > Н & - X "V _ | I 5 > > 1

а.

I

> >

а. > >

= = 5 > 5

я Я

Рисунок 2. Сравнительный анализ транскрипционного статуса 5'- концевой области домена а-глобиновых генов в эригобластах и фибробластах.

Обозначения на карте домена такие же, как на рисунке 1 На фотографиях, демонстрирующих результаты ПЦР-амплификаций, -РТ обозначает контрольные препараты, в которых ПЦР-амплификация проводилась без предварительной обратной транскрипции «Анти IV» обозначает дорожки, в которых в качестве матрицы для обратной транскрипции использовалась кДНК, синтезированная в направлении идентичном направлению транскрипции глобиновых генов Белыми стрелками показаны позиции ожидаемых продуктов амплификации

Можно видеть, что в фибробластах ни один из проанализированных тест-фрагментов не транскрибируется в глобиновом направлении Как и следовало ожидать, ген ggPRX одинаково интенсивно транскрибируется в эритроидных и неэритроидных клетках (дорожки «анти IV» на рис 2) Таким образом, транскрипция протяженной области домена а-глобиновых генов кур в направлении синтеза глобиновых генов характерна только для эритроидных клеток, из чего можно предположить, что эта транскрипция необходима для поддержания активного статуса хроматинового домена

2. Анализ области транскрипции домена q-глобиновых генов кур в клетках HD3.

Для того, чтобы картировать всю область, транскрибирующуюся в глобиновом направлении в эритроидных клетках, мы провели гибридизацию по Нозерну ядерной РНК из куриных эритробластов с короткими пробами, взятыми из разных областей домена Для приготовления проб были использованы полученные ранее в лаборатории С В Разина субклопированные фрагменты домена а-глобиновых генов кур Эти фрагменты обозначены в соответствии с их позициями на рестриктной карте домена по рестриктазам Hind III и Bam Ш (см схему на рисунке 3) При этом Hind Ш и Bam HI фрагменты обозначены соответственно буквами Н и В с указанием расстояния от некой произвольно выбранной точки (конститутивного участка гиперчувствительности к ДНКазе1) в начале домена Для удобства сравнения на рисунке 3 под рестрикционной картой расположена шкала расстояний, обозначения на которой даны в соответствии с нумерацией последовательности ДНК, депонированной в базе данных GeneBank (AY016020) Представляющие интерес фрагменты ДНК были переклонированы в вектор pSP73, который содержит промоторы для SP6 и Т7 РНК-полимераз, позволяющие синтезировать РНК пробы, комплементарные разным цепям ДНК Использование набора проб, комплементарных цепи ДНК, транскрибирующейся в глобиновом направлении, позволило картировав транскрипционную единицу, направляющую синтез полнодоменного транскрипта в эритроидных клетках

Результаты гибридизации показаны в нижней части рисунка 3 Гибридизационные сигналы над рРНК-полосами наблюдались с пробами к 5'-концевой области домена (B-I, НО, Н4, Н7), л-гену (Н12), ал-гену (В18) и к участку, расположенному на расстоянии около 1 5 тпн от гена аА (В20) Сильный сигнал в области от 7 и 30 т п н наблюдался только в ядерной РНК и отсутствовал в цитоплазматической Значительно более слабые полосы с меньшим молекулярным весом видны как в ядерной, так и в цитоплазматической РНК Они скорее всего представляют собой результат неспецифической сорбции пробы на рибосомные

РНК В цитоплазматической фракции РНК полосы, соответствующие мРНК гена аА (О 6т п н) и относительно стабильному продукту неполного процессинга этой мРНК (0 7тпн) четко видны при гибридизации с пробой В18 Присутствие глобиновой мРНК является результатом спонтанной дифференцировки 1-5% клеток HD3 в неиндуцированных культурах Чтобы картировать нижнюю границу транскрибируемой области, мы выполнили гибридизацию с олигонуклеотидом, взятым из аА-гена, и имеющим такую же длину и общий нуклеотидный состав как и тестируемый олигонуклеотид из фрагмента В21 Результаты этого эксперимента ясно показывают, что фрагмент В21 не транскрибируется (рис 3, вставка справа)

Hi2 в1в вго 8-1 | Ир ЩН3||Щ| Н7 |Н10| | [ |B18||Bgi| вг4 |

30000 40000 I_I_I

50000 60000 тли _I_I_I-1

D А

а и

а □ □

В18 В-1 НЗ Н12 м цяцяцяцяця

НО Н7 Н4 В20 ця цяцяцяця

20тпн . fi ОттН

4 ?пшн

2 6тпнн

1 Впшч

1 '»И.Н-Н

2 бган-

атнгопробы В18 В21

ц Я ц я

69

Рисунок 3, Нозерн-блот анализ транскрипционной области домена о-глобиновых генов кур в клетках HD3.

В верхней части рисунка представлена карта домена Буквами В и Н обозначены позиции сайтов рестрикции BamHl и Ilindlll Названия ресгрикционных фрагментов, использованных для приготовления проб, показаны над шкалой расстояний Позиции а-глобиновых генов обозначены прямоугольниками под рестрикционной картой Результаты гибридизации показаны в нижней части рисунка Каждая проба гибридизовалась с блотом с цитоплазматической РНК (обозначена буквой «Ц» в верхней части блота) и ядерной РНК (обозначена буквой «Я») Гель, окрашенный бромистым этидием, использованный для переноса РНК на нейлоновый фильтр, показан с лева от двух групп радиоавтографов Вставка справа демонстрирует результаты гибридизации В18 и В21 - специфических олигонуклеозидных проб с фильтрами, на которые были перенесены продукты электрофоретического разделения ядерной и цитоплазматической РНК

3. Демонстрация непрерывности полнодоменного транскрипта домена а-глобиновых генов кур.

Результаты анализа по Нозерну, описанные в предыдущем разделе, могут означать, что в клетках HD3 весь домен а-глобиновых генов (включая регуляторную 5'-концевую область) транскрибируется, давая начало протяженной ядерной РНК

До настоящего момента не было ясно, существует ли непрерывная транскрипционная единица, покрывающая всю исследуемую область, или различные субдомены транскрибируются нешвисимо, как в домене ß-глобиновых генов человека Для того, чтобы картировать непрерывные транскрипты, мы использовали метод РТ-ПЦР Мы подобрали несколько наборов праймеров (по 3 праймера в каждом), чтобы инициировать синтез кДНК с различных точек домена (Н7, Н12/71-ген, В16/а"-ген, В18/ад-ген, В20, В21) Эти праймеры были использованы для обратной транскрипции на ядерной РНК Для последующей амплификации продуктов обратной транскрипции были использованы два набора праймеров для ПЦР, подобранных с целью выявить во;можное присутствие последовательностей кДНК, включающих фрагменты В-1 и НЗ

Позитивный сигнал в реакции ПЦР-амплификации служит доказательством наличия ядерных транскриптов, охватывающих область между праймерами для обратной транскрипции и праймерами для ПЦР Результаты ПЦР-анализа показывают, что кДНК, синтез которых инициирован на участках Н7-В16, содержат последовательности из фрагментов В-1 и НЗ (рисунок 4) В контрольных экспериментах при ПЦР-анализе кДНК, которая была синтезирована в противоположном направлении, начиная с участка В18, сигнал не был обнаружен ни с одним из соответствующих праймеров кДНК, синтезированная с глобиновой РНК, начиная с участка В18, содержала последовательности, присутствующие в НЗ, но отсутствующие в В-1 Это может отражать неспособность ревертазы синтезировать столь длинные цепи РНК В последующих экспериментах нам удалось амплифицировать часть фрагмента Н12 (я-ген), используя в качестве матрицы кДНК, синтезированную на ядерной РНК посредством В18- и В20-специфических праймеров, но не удалось выполнить этого с В21 -специфическими праймерами Эти результаты хорошо согласуются с отсутствием сигнала на Нозерн блоте с В21-специфичным нуклеотидом

Результаты гибридизации и РТ-ПЦР показывают, что изучаемый нами транскрипт действительно является полнодоменным Конец полнодоменной транскрипционной единицы

картируется приблизительно на границе фрагментов В20 и В21, т е на расстоянии около 1,5 т п н к 3'-концу от аА-гена С учетом описанных ранее результатов по картированию начала полнодоменной транскрипционной единицы, можно утверждать, что протяженность ее составляет около 30 т п н

30000

J_I_

40000

_I_

50000 «0000 11Ш

_I_I_I_I-

_»в | б? 7 гщ | годе

)|»4дн |14ЧЗ 60| 791 [Ш |ВЯ> _

В-1

т-У/Ч

2100 6689

. , • ' ни Вш Вго

| В., { Но ||нз|Нн7 |н1В|^ 1141^,1 в,4 |

Нз '*'•-..»

I I 7*гт Игм I ,

0 Г 4ЮШ.1П»« 1657

Глобшювое палряпление

ПЦР праймеры В1 ПЦР-праймсны НЗ Ампшфшшнх иродукюв РТ

РНК ЦЦЯЯЦЦЯЯ ЦЦ ЯЯШГЯТ ПЦР-праймеры

—+-4--Н

740

«О

-»-♦ В., НЗ

д»

1110780

740 460

|

-7« §

д•

Л»

-И-«•"

.(Ха

-В18 (а4)

Вго

.821

Рисунок 4 РТ-ГГЦР картирование протяженной транскрипционной единицы домена а-глобиновых генов кур.

В верхней части рисунка показана карта домена с позициями праймеров, использованных для ПЦР амплификации продуктов РТ Внизу показаны результаты РТ-ПЦР и их интерпретация Счева представлены блоты с продуктами ПЦР-амплификации с двумя группами праймеров В1 и НЗ В правой части рисунка находится схематическое изображение позиций использованных праймеров для РТ и интерпретация результатов ПЦР Наличие или отсутствие обратной транскриптазы в реакциях обозначено (+) и (-) соответственно

4. Одновременная транскрипция с обеих цепей ДНК в домене а-глобиновых генов кур.

В эритроидных клетках 5'- концевая протяженная область домена а-глобиновых генов кур перекрывается с геном «домашнего хозяйства» ggPRX, который транскрибируется в противоположном направлении (8]ак51е, 2000) (Ыагт, 2004) Эти данные были получены

0OPRX

ши

тт

глобииоаый ПДТ

"I-1-

12842 22842

тт

„о' „А

я а а 42842 52842

39340 40432

■

-

39873 — 40094

Рисунок 5. Схема изучаемой области.

Обозначения на шкале расстояний (п н) даны в соответствии с нумерацией последовательности ДНК, депонированной в базе данных GeneBank под номером AY016020 Горизонтальными стрелками в верхней части карты показано направление транскрипции гена ggPRX и полнодоменного транскрипта (ПДТ) домена а-глобиновых генов Область перекрывания обозначена заштрихованным прямоугольником Цифрами 1 и 2 обозначены изучаемые области В нижней части карты горизонтальными стрелками показаны позиции гибридизационных проб и толстыми линиями продукты РТ-ПЦР

с помощью анализа по Нозерну со специфичными пробами и РТ-ПЦР амплификации нескольких тест-фрагментов со специфичными праймерами В связи с этим возник вопрос о том, транскрибируется ли домен а-глобиновых генов кур в обоих направлениях в одной клетке синхронно и присутствуют ли эти транскрипты в ядре одновременно Для того, чтобы прояснить этот вопрос мы использовали метод гибридизации т situ со специфическими РНК-пробами для комплементарных цепей ДНК Для синтеза проб мы выбрали участок, расположенный близко к 3'-концу (в глобиновом направлении) симметрично транскрибирующейся области Фрагмент размером около 800 п н имеет позицию 3934040432 в последовательности ДНК, депонированной в базе данных GeneBank под номером AY0160020 (область 1 на рисунке5) Этот фрагмент был клонирован в вектор pSP73, а затем

транскрибирован в двух направлениях с использованием Sp6 и Т7 РНК-полимераз в присутствии модифицированного биотином УТФ Эти пробы гибридизовали in situ с фиксированными препаратами клеток HD3 После гибридизации сигнал выявлялся с помощью каскада антител, коньюгированных с Alexa 488, флюоресцирующей зеленым цветом На рисунке 6 видно, что обе пробы дают сильный сигнал в большинстве клеток Из

Рисунок б. In situ гибридизация НБЗ-клеток с рибопробами, узнающими транскрипт в глобиновом направлении области 1 (А-А") и в направлении гена ggPRX в той же области (Б-Б").

А, Б - окрашивание ядер DAPI А', Б' - результаты гибридизации

А", Б" - совмещение гибридизационного сигнала (черный) и ядер, окрашенных DAPI (светлый)

200 произвольно выбранных клеток 183 дали позитивный сигнал с пробой, узнающей транскрипт ggPRX, а 167 клеток дали позитивный сигнал с пробой, узнающей транскрипт глобинового направления Если учесть то обстоятельство, что эффективность гибридизации гп situ с РНК-пробами никогда не достигает 100%, то можно заключить, что во всех клетках транскрипция идет в обоих направлениях Чтобы проверить специфичность гибридизации, мы выполнили контрольные эксперименты В них гибридизацию проводили одновременно с меченой РНК-пробой и 10-кратным избытком немеченой Кроме того, препараты гибридизовали с «инертной» РНК, синтезированной с плазмиды pSP73 В обоих контрольных экспериментах сигнала не наблюдалось

Тот факт, что рибопробы, транскрибируемые с одной и той же области в противоположных направлениях, гибридизуются с большинством клеток, уже указывает на то, что в значительной части клеток транскрипция в обоих направлениях происходит одновременно, и оба транскрипта присутствуют в одной и той же клетке Чтобы подтвердить это заключение, мы выполнили дополнительные эксперименты Мы выбрали два соседних фрагмента размером около 700 и 500 п н в области с координатами 31565-32724, где также имеет место перекрывание транскриптов (область 2 на рисунке 5) Первый фрагмент был транскрибирован в направлении противоположном транскрипции глобиновых генов и помечен биотином, а второй был транскрибирован в глобиновом направлении и помечен дигоксигенином В данном случае мы синтезировали РНК разных направлений с разных участков во избежание гибридизации друг с другом проб, меченных биотином и дигоксигенином Затем смесь этих фрагментов использовалась в качестве пробы для гибридизации

Биотинилированная проба, узнающая полнодоменный глобиновый транскрипт, давала сигнал зеленого цвет, а проба, меченая дигоксигенином и узнающая транскрипт гена ^^ЛХ, красного Результаты данных экспериментов показывают, что практически все клетки содержат оба транскрипта (рис 7 Б, В) Стоит отметить, что распределение транскриптов наблюдается в основном в ядре, за исключением одной пробы, которая содержит последовательность экзона экспрессирующегося гена (рис 7Г)

Рисунок 7. Двойное окрашивание клеток НОЗ, гибридизованных с рибопробами, узнающими транскрипт глобинового направления в области 2 (Б) и с рибопробами, узнающими транскрипт в направлении гена ggPRX (В).

А - ядра, окрашенные ОАР1

Г, Д - т я*и гибридизация клеток НПЗ с пробой глобинового направления с координатами 31565-32231 Эта проба узнает экзон 4 гена ggPRX и таким образом окрашивает РНК, присутствующую в цитоплазме (Д) На панели Г представлена та же группа ядер, окрашенная ОАР1

Для того, чтобы приблизительно оценить интенсивность транскрипции в обоих направлениях мы выполнили РТ-ПЦР анализ с использованием специфических праймеров для инициации обратной транскрипции (рис 8) Несмотря на то, что этот метод является полуколичественным, можно предположить, что количество РНК, транскрибируемой с исследуемой области в противоположных направлениях примерно одинаково

участок 1 30 циклов 50 циклов

участок 2 30 циклов 50 циклов

Рисунок 8. РТ-ПЦР анализ РНК, транскрибируемой в противоположных направлениях с ДНК области 1 и ДНК области 2.

«гл» - ПЦР-амплификации на продуктах РТ, полученных в направлении транскрипции глобиновых генов

«|щРКХ» - ПЦР-амплификации на продуктах РТ, полученных в направлении транскрипции гена ¿^РЮС

«ДНК» - контрольная ПЦР-амплификация с использованием геномной куриной ДНК в качестве матрицы

«-РТ» - контрольная ПЦР-амплификация на продуктах РТ, когда в реакционную смесь для РТ обратная транскриптаза не добавлялась

Также было необходимо удостовериться в том, что пробы, используемые в последнем эксперименте являются частью более протяженного перекрывающегося транскритгга Для этого мы взяли фрагмент размером 400 п н, перекрывающий место соединения проб и провели ПЦР-амплификацию на кДНК, синтезированной в обоих направлениях В обоих случаях наблюдался позитивный результат (рис 8)

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты диссертационной работы в целом можно рассматривать как косвенное подтверждение гипотезы Траверса (Travers, 1999), постулирующей, что постоянная транскрипция протяженного геномного домена необходима для поддержания его активного статуса При этом предполагается, что элонгирующая РНК полимераза П служит своеобразным транспортным средством перемещающим вдоль домена факторы ремоделирования хроматина и комплекс ферментов, необходимых для поддержания транскрипционно активного статуса хроматина (прежде всего, гистон ацетилазы) В полном соответствии с предложенной Траверсом гипотезой мы продемонстрировали, что домен альфа-глобиновых генов кур транскрибируется в эритроидных клетках в составе полнодоменного транскрипга Следует подчеркнуть, что этот транскрипт не является предшественником мРНК альфа-глобиновых генов, так как каждый из альфа-глобиновых генов имеет собственный промотор, с которого и начинается транскрипция этих генов на более поздних стадиях эритроидной дифференцировки (Razin & Recillas-Targa, 2000) Клетки НПЗ, изученные в нашей работе, являются пре-эритробластами Они не экспрессируют глобинов на уровне белков В этих клетках отсутствую! и пропессированные транскрипты индивидуальных глобиновых генов Они появляются лишь при индукции клеток HD3 к терминальной эритроидной дифферецировке (Beug, 1979) Возвращаясь к результатам нашей работы, следует особенно подчеркнуть то обстоятельство, что полнодоменный транскрипт домена альфа-глобиновых генов кур начинает синтезироваться в области, контролирующей транскрипционный статус домена и отстоящей от первого из генов альфа-глобинового кластера на 22 т п н (Higgs et al, 1990) Это обстоятельство позволяет предположить, что основная функция удаленного регуляторного элемента домена альфа-глобиновых генов (который иногда называют также областью контроля локуса) как раз и состоит в том, что он заключает в себе промоторно-энхансерный блок, обеспечивающий начало синтеза полнодоменного транскрипта в эритроидных клетках Действительно, в этой области был картирован сильный эритроид-специфичный энхансер (Flint et al, 2001) Наше

предположение о том, что полнодоменный транскрипт домена альфа-глобиновых генов кур служит для активации этого домена в эритроидных клетках хорошо согласуется с тем, что в неэритроидных клетках такой транскрипт обнаружен не был

Наряду с характеристикой полнодоменного транскрипта важным результатом диссертационной работы является демонстрация того, что протяженная 5'-концевая область домена альфа глобиновых генов транскрибируется в противоположных направлениях в одних и тех же клетках, и соответственно в ядрах таких клеток присутствуют комплементарные цепи РНК Симметричная транскрипция является типичной для некоторых вирусов, несущих перекрывающиеся гены Подобное явление имеет место также у дрожжей (Grisanti, 1993, Aloni, 1972, 1974) Однако, у высших эукариот транскрипция в обратном направлении является одним из регуляторных механизмов, вовлеченных в процесс деградации РНК (Shibata, 2004, Alfano, 2005, Luther, 2005) И тем не менее, перекрывание генов" существует в геномах позвоночных, и некоторые из них могут бьпъ вполне функциональными (Makalowska, 2005) Наши результаты позволяют предположить, что в эукариотических клетках существует механизм, препятствующий деградации комплементарных РНК Природа этого механизма пока не ясна Одна из возможностей заключается в том, что непосредственно в ходе транскрипции комплементарных цепей ДНК новосинтезированная РНК организуется в РНП частицы, что препятствует образованию двуспиральных РНК

выводы

1 Установлено, что в эритроидных клетках транскрибируется весь домен а-глобиновых генов, включая регуляторную 5' регуляторную-обла, в результате чего образуется протяженная ядерная РНК (полнодоменный транскрипт) Верхняя граница полнодоменной транскрипционной единицы домена а-глобиновых генов кур находится на расстоянии 22-24 тпн от эмбрионального гена л Нижняя граница полнодоменного транскрипта располагается на расстоянии 1 5 тпн от аА гена Длина полнодоменного транскрипта составляет около 30 тпн

2 Полнодоменный транскрипт домена а-глобиновых генов кур не синтезируется в фибробластах

3 Транскрипционная единица домена а-глобиновых кур является непрерывной

4 Протяженная 5'-область домена а-глобиновых генов кур транскрибируется одновременно в двух направлениях в одних и тех же клетках

Г

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Бору нова В В , Юдннкова Е С , Разин С В Картирование границы эритроидспецифичной транскрипционной единицы в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур Доклады Академии Наук, 2003, Т 393, №1 стр 112-115

2 Razin S , Rynditch А , Borunova V, Ioudinkova Е, Smalko V , Sherrer К The 33Kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix J Cell Biochem, 2004, 92(3) 445-457

3 Ioudinkova E, Razin SV, Borunova V, de Conto F, Rynditch A, Scherrer К RNA-dependent nuclear matrix contains a 33 kb globin full domain transcript as well as prosomes but no 26S proteasomes J Cell Biochem, 2005, 94(3) 529-539.

4 Borunova V, Iarovaia О V, Vassetzky Y.S, Razin S V The upstream area of the chicken alpha-globin gene domain is transcribed in both directions in the same cells FEBS Lett, 2005, 579(21) 4746-4750

5 Borunova V and Youdinkova E The whole domain of chicken a-globin gene including a 20kb-long upstream area is transcribed in the globin direction in premature chicken erythroblasts Conference "Advances in molecular cell biology", Moscow, 17-18 June, 2004 5-12.

6 Borunova V, Razin S , Vassetzky Y Mapping transcriptional status of the chicken alpha-globin gene domain transcription in non-coding regions and complementary RNAs 18th IGB Meeting Epigenetic Bases of Genome Reprogramming, Capri, Italy, 8-11 October, 2005, p 37

Для заметок

Для заметок

Заказ N° 2123 Подписано в печать 1011.2005 Тираж 80 экз. Усл. пл. 0,75

ООО "Цифроиичок", тел (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 Л V/ www.cfr.ru ; е-тай:mfo@cfr.ru

W22 4 80

РНБ Русский фонд

2006-4 25927

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борунова, Виктория Владимировна

4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.Домены В-глобиновых генов человека и кур.

1.1 Общая организация доменов 6-глобиновых генов.

1.2. Идентификация области контроля локуса домена 6-глобиновых генов.

1.3. Механизм работы области контроля локуса.

1.4. Субдомены домена fi-глобиновых генов человека.

1.5. Границы домена.

2. Домены а-глобиновых генов человека и кур.

2.1. Общая организация доменов.

2.2. Расположение доменов а-глобиновых генов в перманентно открытой хроматиновой области.

2.3. Перекрывание доменов а-глобиновых генов и гена «-14».

2.4. Пространственная организация домена а-глобиновых генов.

2.5. Изменение характера ацетилирования гистонов в домене а-глобиновых генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика молекулярных механизмов, регулирующих экспрессию альфа-глобиновых генов кур"

В настоящее время практически не подлежит сомнению тот факт, что геном эукариот организован в отдельные хроматиновые домены. На сегодняшний день известно, по крайней мере, два типа доменов: структурно-функциональные и функциональные. Типичными доменами, определенными по структурному признаку, являются домены тканеспецифичных генов, характеризующиеся повышенным уровнем чувствительности к нуклеазам и повышенным уровнем ацетилирования гистонов в тех тканях, где домен активен. На границах этих доменов часто расположены инсуляторы, которые ограничивают область действия позитивных регуляторных элементов и препятствуют распространению репрессивных структур хроматина. Типичными примерами таких «классических» хроматиновых доменов, содержащих тканеспецифичные гены, являются домены р-глобиновых генов позвоночных [1], домен овальбуминовых генов кур [2], домен гена лизоцима КУР [3], домен гена аполипопротеина В человека [4]. Можно было бы предположить, что весь геном состоит из единообразно организованных доменов, однако изучение различных геномов показало, что наряду с «классическими» доменами существует и множество «неканонических» доменов, в том числе доменов с перекрывающимися генами и регуляторными системами. Именно к такому типу доменов относятся домены а-глобиновых генов позвоночных. Они расположены в богатых генами хромосомных областях и являются предпочтительно чувствительными к нуклеазам во всех типах клеток. Такие домены было предложено называть доменами «открытого типа» или доменами с «размытыми границами» [5].

Одним из наиболее изученных доменов открытого типа является домен а-глобиновых генов кур. Этот домен перекрывается с геном «домашнего хозяйства» ggPRX и является одним из первых доменов, где были обнаружены некодирующие межгенные транскрипты. Функциональное значение такого рода транскриптов оставалось неясным. Согласно одной из гипотез, они играют важную роль в поддержании активного статуса хроматинового домена.

Следует подчеркнуть, что домены открытого типа, содержащие одновременно тканеспецифичные гены и гены домашнего хозяйства, привлекли внимание исследователей сравнительно недавно. Принципы взаимодействия регуляторных механизмов, контролирующих работу разных генов в доменах этого типа, изучены недостаточно. В то же время домены открытого типа составляют значительную часть генома. Раскрытие общих принципов организации этих доменов существенно расширит наши знания о механизмах контроля экспрессии генов в эукариотической клетке.

Настоящая работа посвящена изучению полнодоменного транскрипта домена а-глобиновых генов кур, а именно картированию его границ и изучению феномена симметричной транскрипции 5'- концевой области домена.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Борунова, Виктория Владимировна

Выводы

1. Установлено, что в эритроидных клетках весь домен а-глобиновых генов, включая регуляторную 5'-область, транскрибируется, в результате чего образуется протяженная ядерная РНК (полнодоменный транскрипт). Верхняя граница полнодоменной транскрипционной единицы домена а-глобиновых генов кур находится на расстоянии 2224 тпн от эмбрионального гена я. Нижняя граница полнодоменного транскрипта располагается на расстоянии 1.5 тпн от аА гена. Длина полнодоменного транскрипта составляет около 30 тпн.

2. Полнодоменный транскрипт домена а-глобиновых генов кур не синтезируется в фибробластах.

3. Транскрипционная единица домена а-глобиновых генов кур является непрерывной.

4. Протяженная 5'-область домена а-глобиновых генов кур транскрибируется одновременно в двух направлениях в одних и тех же клетках.

3. Заключение

Из всего вышеизложенного можно заключить, что хроматиновые домены не являются единообразными. Они представляют собой динамичные структуры, геномное окружение которых влияет на их организацию и функции.

Новые данные об эукариотическом геноме согласуются с доменной теорией организации генома. Клеточное ядро, ядерные компартменты и события реорганизации хроматина являются важной составляющей частью системы контроля хроматиновой структуры и генной регуляции.

Дальнейшие исследования в этом направлении необходимы для получения информации о механизмах активации генов на начальных стадиях, хотя к настоящему моменту не вызывает сомнений тот факт, что архитектура и динамика клеточного ядра играют важную роль в этих процессах.

Глава II. Материалы и методы.

Культуры клеток.

Линию клеток, трансформированной вирусом эритролейкемии птиц HD3 (клон А6 линии LSCC) культивировали в среде DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium) с добавлением 8% фетальной бычьей сыворотки, 2% куриной сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культивирование вели при 37°С в атмосфере, содержащей 5,5% углекислоты. Плотность клеточной суспензии поддерживали в пределах 3x106 кл/мл. Первичные куриные фибробласты получали из 9-дневных куриных эмбрионов.

Выделение РНК из клеточных культур.

Суспензию клеток осаждали, промывали 1-кратным раствором PBS. Затем клетки лизировали и разделяли ядра и цитоплазму [59]. Ядра обрабатывали ДНКзой и протеиназой К. После этого выделяли РНК с помощью Trizol Reagent (Invitrogen).KneTKH ресуспендировали в реагенте Trizol (1 мл на 5-10x106 клеток) и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. После этого добавляли 1/10 часть хлороформа и центрифугировали 15 минут при 4°С. Затем отбирали верхнюю фазу, содержащую РНК, добавляли равный объем изопропанола и центрифугировали 10 минут при 4°С. Осадок высушивали и растворяли в воде.

Выделенная таким образом РНК была использована для синтеза кДНК и для анализа по Нозерну.

РТ-ПЦР анализ.

На одну реакцию брали от 0,1 до 0,5 мкг РНК, предварительно обработав ее ДНКазой1. Затем добавляли 20пмоль специфических праймеров (их состав указан в таблице 1), 2,5 мМ смесь трифосфатов, реакционный буфер и 200 единиц обратной транскриптазы. Реакция проводилась при температуре 42°С.

Прамеры для обратной транскрипции подбирались с помощью программы primer premier 5. Для этого мы использовали нуклеотидную последовательность протяженного фрагмента куриной ДНК, включающего кластер а-глобиновых генов (AY016020) [94]. Для каждой исследуемой области было выбрано несколько праймеров (два или три) для обратной транскрипции, инициирующих транскрипцию с точек, находящихся на некотором расстоянии друг от друга. Продукты обратной транскрипции использовались для дальнейшего анализа с помощью полимеразной цепной реакции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борунова, Виктория Владимировна, Москва

1. Forrester, W.C., et al., A developmentally stable chromatin strucutre in the P~globin gene cluster. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 1986. 83: p. 1359-1363.

2. Lawson, G.M., et al., Definition of 5' and 3' structural boundaries of the chromatin domain containing the ovalbumin multigene family. Journal of Biological Chemistry, 1982. 257: p. 1501-1507.

3. Jantzen, К., H.P. Friton, and T. Igo-Kimenes, The DNase I sensitive domain of the chicken lyzozyme gene spans 24 kb. Nucleic Acids Research, 1986. 14: p. 6085-6099.

4. Iudinkova, E.S. and S.V. Razin, Regulatory systems of genome domains with vague boundaries. Genetika, 2003. 39(2): p. 182-6.

5. Choi, O. and J.D. Engel, A 3' enhancer is required for temporal and tissue-specific transcriptional activation of the chicken adult jB-globin gene. Nature, 1986. 323: p. 731-734.

6. Hesse, J.E., et al., Regulated gene expression in transfectedprimary chicken erythrocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(12): p. 4312-6.

7. Foley, K.P. and J.D. Engel, Individual stage selector element mutations lead to reciprocal changes in p- vs. s-globin gene transcrption: genetic confirmation of promoter competition during globin gene switching. Genes & Developpment, 1992: p. 730-744.

8. Reitman, M., et al., Site-independent expression of the chicken ft-globin gene in transgenic mice. Nature, 1990. 348: p. 749-752.

9. Reitman, M., et al., An enhancer/locus control region is not sufficient to open chromatin. Mol. Cell. Biol., 1993.13: p. 3990-3998.

10. Mason, M.M., et al., Expression of the chicken b-globin cluster in mice: correct developmental expression and distributed control. Mol Cell Biol, 1995.15: p. 407-414.

11. Reitman, M. and G. Felsenfeld, Developmental regulation of topoisomerase II sites and DNase I hypersensitive sites in the chicken b-globin locus. Molecular and Cellular Biology, 1990.10: p. 2774-2786.

12. Chung, J.H., M. Whiteley, and G. Felsenfeld, A 5' element of the chicken b-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effects in Drosophila. Cell, 1993. 74: p. 505-514.

13. Bell, A.C., A.G. West, and G. Felsenfeld, The protein CTCF is required for the enhancer-blocking activity of vertebrate insulators. Cell, 1999. 98: p. 387-396.

14. Saitoh, N., et al., Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken fi-globin domain. EMBO J., 2000.19: p. 2315-2322.

15. Prioleau, M.-N., et al., An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken fi-globin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene. EMBO J., 1999.18: p. 4035-4048.

16. Litt, M.D., et al., Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken fi-globin locus. Science, 2001. 293: p. 2453-2455.

17. Kioussis, D., et al., P-globin gene inactivation by DNA translocation in yP thalassemia. Nature, 1983. 306: p. 662-666.

18. Curtin, P., et al., A distant gene deletion affects beta-globin gene function in an atypical gamma delta beta-thalassemia. J. Clin. Invest., 1985. 76: p. 1554-1558.

19. Tuan, D., et al., The "b-like-globin" gene domain in human erythroid cells. 1985. 82: p. 6384-6388.

20. Forrester, W.C., et al., A deletion of the human J3-globin locus activation region causes a major alteration in chromatin structure and replication across the entire fi-globin locus. Genes & Development, 1990. 4: p. 16371649.

21. Grosveld, F., et al., Position-independent, high-level expression of the human fi-globin gene in transgenic mice. Cell, 1987. 51: p. 975-985.

22. Talbot, D., et al., A dominant control region from the human b-globin locus conferring integration site-independent gene expression. Nature, 1989. 338(352-355).

23. Henikoff, S., Conspiracy of silence among repeated transgenes. Bioessays, 1998. 20: p. 532-535.

24. Ramirez-Solis, R., P. Liu, and A. Bradley, Chromosome engineering in mice. Nature, 1995. 378: p. 720-724.

25. Schlake, T. and J. Bode, Use of mutated recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry, 1994. 33: p. 12746-12751.

26. Tanimoto, K., et al., Effects of altered gene order or orientation of the locus control region on human fi-globin gene expression in mice. Nature, 1999. 398: p. 344-348.

27. Francastel, C., et al., Nuclear compartmentalisation and gene activity. Nat. Rev., 2000.1: p. 137-143.

28. Bender, M.A., et al., fi-globin gene switching and DNase I sensitivity of the endogenous ($-globin locus in mice do not require the locus control region. Mol Cell, 2000.5: p. 387-393.

29. Dillon, N., et al., The effect of distance on long-range chromatin interactions. Mol Cell, 1997.1: p. 131-139.

30. Wijgerde, M., F. Grosveld, and P. Fraser, Transcription complex stability and chromatin dynamics in vivo. Nature, 1995. 377: p. 209-213.

31. Bulger, M. and M. Groudine, Looping versus linking: toward a model of long distance gene activation. Genes Dev., 1999.13: p. 2465-2477.

32. Peterson, K.R. and G. Stamatoyannopoulos, Role of gene order in developmental control of human gamma- and beta-globin gene expression. Mol. Cell. Biol., 1993.13: p. 4836-4843.

33. Gribnau, J., et al., Chromatin interaction mechanism of transcriptional control in vivo. EMBO J., 1998.17: p. 6020-6027.

34. Trimborn, Т., et al., Mechanizms of developmental control of transcription in the murine alpha and beta-globin loci. Genes Dev., 1999.13: p. 112-124.

35. Gribnau, J., et al., Intergenic transcription and developmental remodeling of chromatin subdomains in the human beta-globin locus. Mol Cell, 2000. 5(2): p. 377-86.

36. Amrolia, P.J., et al., Maximal activity of an erythroid-specific enhancer requires the presence of specific protein binding sites in linked promoters. J. Biol. Chem., 1998.273: p. 13593-13598.

37. Bulger, M., et al., ChlPs of the b-globin locus: unravelling gene regulation within an active domain. Curr. Opin. Genet. & Dev., 2002.12: p. 170-177.

38. Langdon, S.D. and R.E. Kaufman, Gamma-globin gene promoter elements requiredfor interaction with globin enhancers. Blood, 1998. 91: p. 309-318.

39. Sawado, Т., К. Igarashi, and M. Groudine, Activation of beta-major globin gene transcription is associated with recruitment of NF-E2 to the beta-globin LCR and gene promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001. 98: p. 10226-10231.

40. Goodwin, A. J., et al., In vivo formation of the human b-globin locus control region core elements requires binding sites for multiple factors including GATA-1, NF-E2, Erythroid Kruppel-like factor and Spl. J. Biol. Chem., 2001.276: p. 26883-26892.

41. Hardison, R., et al., Locus control regions of mammalian beta-globin gene clusters: combining phylogenetic analyses and experimental results to gain functional insights. Gene, 1997. 205: p. 73-94.

42. Tewari, R., et al., Erythroid Kruppel-like factor (EKLF) is active in primitive and definitive erythroid cells ans is required for the function of 5'HS3 of the b-globin locus control region. EMBO J., 1998.17: p. 2334-2341.

43. Wijgerde, M., et al., The role of EKLF in human b-globin gene competition. Genes. Dev., 1996.10: p. 2894-2902.

44. Armstrong, J.A., J.J. Bieker, and X. Chen, A SWI/SNF-related chromatin remodelling complex, E-RC1, is required for tissue-specific transcriptional regulation by EKLF in vitro. Cell, 1998. 95: p. 93-104.

45. Zhang, W. and J.J. Bieker, Acetylation and modulation of erythroid Кгърре1-lake factor (EKLF) activity by interaction with histone acetyl transferases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 95: p. 9855-9860.

46. Bresnick, E.H. and L. Tze, Synergism between, hypersensitive sites confers long-range activation by the human beta-globin locus control region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997. 94: p. 4566-4571.

47. Elefant, F., N.E. Cooke, and S.A. Liebhaber, Targeted recruitment of histone acetiltransferase activity to a locus control region. J. Biol. Chem., 2000.275: p. 13827-13834.

48. Forsberg, E.C., et al., Requirement of an ElA-sensitive coactivator for long-range activation by the beta-globin locus control region. J. Biol. Chem., 1999. 274: p. 26850-26859.

49. Ashe, H.L., Monks, J., Wijgerde, M., Fraser, P., Proudfoot, N.J., Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev., 1997.11: p. 2494-2509.

50. Cho, H., et al., A human RNA polymerase II complex containing factors that modify chromatin structure. Mol. Cell. Biol., 1998.18: p. 5355-5363.

51. Wilson, C.J., et al., RNA polymerase II holoenzyme contains SWI/SNF regulators involved in chromatin remodelling. Cell, 1996. 84: p. 235-244.

52. Wittschieben, B.O., et al., A novel histone acetiltransf erase is an integral submit of elongating RNA polymerase II holoenzyme. Mol. Cell, 1999.1: p. 123-128.

53. Travers, A., Chromatin modification by DNA tracking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. 96: p. 13634-13637.

54. Kong, S., et al., Transcription of the HS2 enhancer toward a cis-linked gene is independent of the orientation, position and distance of the enhancer relative to the gene. Mol. Cell. Biol., 1997.17: p. 3955-3965.

55. Plant, K.E., S.J. Routledge, and N.J. Proudfoot, Intergenic transcription in the human beta-globin cluster. Mol. Cell. Biol., 2001. 21: p. 6507-6514.

56. Broders, F., A. Zahraoui, and K. Scherrer, The chicken a-globin gene domain is transcribed into a 17-kilobase polycistronic RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1990. 87: p. 503-507.

57. Herendeen, D.R., G.A. Kassavetis, and E.P. Geiduschek, A transcriptional enhancer whose function imposes a requerement that proteins track along DNA. Science, 1992. 256: p. 1298-1303.

58. Tuan, D., S. Kong, and K. Hu, Transcription of the hypersensitive site HS2 enhancer in erythroid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1992. 89: p. 11219-11223.

59. Grosveld, F., Activation by locus control regions? Curr. Opin. Genet. Dev., 1999.9: p. 152-157.

60. McMorrow, Т., et al., Activation of the fi-globin locus by transcription factors and chromatin modifiers. EMBO J., 2000.19: p. 4986-4996.

61. Gribnau, G., et al., Intergenic transcription and developmental remodelling of chromatin subdomains in the human b-globin locus. Mol Cell, 2000. 5: p. 377-386.

62. Engel, J.D. and K. Tanimoto, Looping, linking, and chromatin activity: new insights into fi-globin locus regulation. Cell, 2000.100: p. 499-502.

63. Forsberg, E.C., et al., Developmentally dynamic histone acetylation pattern of a tissue-specific chromatin domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000. 97: p. 14494-14499.

64. Forsberg, E.C. and E.H. Bresnick, Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world. Bioessays, 2001. 23: p. 820-830.

65. West, A.G., M. Gaszner, and G. Felsenfeld, Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev, 2002.16(3): p. 271-88.

66. Bell, A.C. and G. Felsenfeld, Stopped at the border: boundaries and insulators. Curr. Opin. Genet. & Dev., 1999. 9: p. 191-198.

67. Chung, J.H., A.C. Bell, and G. Felsenfeld, Characterization of the chicken /З-globin insulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997. 94: p. 575-580.

68. Ohlsson, R., R. Renkawitz, and V. Lobanenkov, CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet., 2001.17: p. 520-527.

69. Recillas-Targa, F., et al., Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken fi-globin insulator are separable activities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002. 99: p. 6883-6888.

70. Farrell, C.M., A.G. West, and G. Felsenfeld, Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human fi-globin loci. Mol. Cell. Biol., 2002. 22: p. 3820-3831.

71. Recillas-Targa, F., The chicken alpha- and beta-globin gene domains and their chromatin organization. L in Cellett, 2000(5): p. 451-467.

72. Razin, S.V. and O.V. Iarovaia, Association of transcription-active DNA fraction with the nuclear skeleton is altered during incubation of nuclei in solutions of low ionic strength. Mol Biol (Mosk), 1986. 20(3): p. 646-55.

73. Moreau, J., et al., A+T-rich linkers define functional domains en eukaryotic DNA. Nature, 1982. 295: p. 260-262.

74. Razin, S.V., et al., Non-clonability correlates with genomic instability: a case study of a unique DNA region. J Mol Biol, 2001. 307(2): p. 481-6.

75. Recillas-Targa, F. and S.V. Razin, Chromatin domains and regulation of gene expression: familiar and enigmatic clusters of chicken globin genes. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 2001.11: p. 227-242.

76. Razin, S.V., et al., Replication origins are attached to the nuclear skeleton. Nucl. Acids Res., 1986.14(20): p. 8189-8207.

77. Verbovaia, L. and S.V. Razin, Analysis of the replication direction through the domain of a-globin-encoding genes. Gene, 1995.166: p. 255-259.

78. Razin, S.V., et al., Transcriptional enhancer in the vicinity of replication origin within the 5' region of the chicken a-globin gene domain. J. Mol. Biol., 1991.217: p. 595-598.

79. Sjakste, N., et al., A novel gene is transcribed in the chicken a-globin gene domain in the direction opposite to the globin genes. Mol. Gen. Genet., 2000. 262: p. 1012-1021.

80. Brickner, H.E., X.X. Zhu, and G.F. Atweh, A novel regulatory element of the human a-globin gene responcible for its constitutive expression. J. Biol. Chem., 1991.266: p. 15363-15368.

81. James-Pederson, M., et al., Flanking and intragenic sequences regulating the expression of the rabit alpha-globin gene. J. Biol. Chem., 1995. 270: p. 3965-3973.

82. Reitman, M. and G. Felsenfeld, Mutational analysis of the chicken beta-globin enhancer reveals two positive-acting domains. Proc Natl Acad Sci U SA, 1988. 85(17): p. 6267-71.

83. Recillas Targa, F., et al., Silencer and enhancer elements located at the 3-side of the chicken and duck a-globin-encoding gene domains. Gene, 1993. 129: p. 229-237.

84. Recillas Targa, F., et al. Silencer and enhancer elements and the framing structure of the chicken a-globin gene domain, in 9th Conf. on Hemoglobin Switching. 1995. Orcas Islands, WA, USA: Intercept, Andover.

85. Stalder, J., et al., Tissue-specific DNA cleavage in the globin chromatin domain introduced by DNase I. Cell, 1980. 20: p. 451-460.

86. Weintraub, H., A. Larsen, and M. Groudine, a-globin gene switching during the development of chicken embryos: expression and chromosome structure. Cell, 1981. 24: p. 333-344.

87. Razin, S.V., C.V. De Moura Gallo, and K. Scherrer, Characterization of the chromatin structure in the upstream area of the chicken a-globin gene domain. Molecular and General Genetics, 1994. 242: p. 649-652.

88. Valadez-Graham, V., S.V. Razin, and F. Recillas-Targa, CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken {alpha}-globin gene domain. Nucleic Acids Res, 2004.32(4): p. 1354-1362.

89. Razin, S.V., et al., Functional analysis of DNA sequences located within a cluster of DNase I hypersensitive sites colocalising with MAR element at the upstream border of the chicken a-globin gene domain. J Cell. Biochem., 1999. 74: p. 38-49.

90. Flint, J., et al., Comparative genome analysis delimits a chromosomal domain and identifies key regulatory elements in the alpha globin cluster. Hum. Mol. Genet., 2001.10: p. 371-382.

91. Imaizumi, M.-T., H. Diggelmann, and К. Scherrer, Demonstration of Globin Messenger Sequences in Giant Nuclear Precursors of Messenger RNA of Avian Erythroblasts. Proceedings of the National Academy of Science USA, 1973.70: p. 1122-1126.

92. Vyas, P., Vickers, M.A., Picketts, D.J., Higgs, D.R., Conservation of position and sequence of a novel, widely expressed gene containing the major human alpha-globin regulatory element. Genomics, 1995. 29: p. 679689.

93. Sjakste, N., et al., A novel gene is transcribed in the chicken alpha-globin gene domain in the direction opposite to the globin genes. Mol Gen Genet, 2000. 262(6): p. 1012-21.

94. Sharpe, J.A., et al., Role of upstream DNase I hypersensitive sites in the regulation of human alpha globin gene expression. Blood, 1993. 82: p. 1666-1671.

95. Gourdon G, S.J., Wells D, Wood WG, Higgs DR., Analysis of a 70 kb segment ofDNA containing the human zeta and alpha-globin genes linked to their regulatory element (HS-40) in transgenic mice. Nucleic Acids Res., 1994 Oct 11. 22(20): p. 4139-47.

96. Bernet A, S.S., Picketts DJ, Ouazana R, Morle F, Higgs DR, Godet J., Targeted inactivation of the major positive regulatory element (HS-40) of the human alpha-globin gene locus. Blood., 1995 Aug 1. 86(3): p. 1202-11.

97. Buongiorno-Nardelli, M., et al., A relationship between replicon size and supercoiled loop domains in the eukaryotic genome. Nature, 1982. 298: p. 100102.

98. Svetlova, E.Y., S.V. Razin, and M. Debatisse, Mammalian recombination hot spot and DNA loop anchorage region: a model for the study of common fragile sites, in J. Cell. Biochem. 2001. p. 170-178.

99. Linskens, M.H., A. Eijsermans, and P.A. Dijkwel, Comparative analysis of DNA loop length in nontransformed and transformed hamster cells. Mutat Res, 1987.178(2): p. 245-56.

100. Ioudinkova, E., Petrov, A., Razin, S., Vassetzky, Y., Mapping long-range chromatin organization within the chicken alpha-globin gene domain using oligonucleotide DNA arrays. Genomics, 2004.

101. Anguita, E., et al., Identification of a conserved erythroid specific domain of histone acetylation across the alpha-globin gene cluster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001. 98: p. 12114-12119.

102. Sambrook J, F.E., Maniatis T, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor., 1989.

103. Engel, J.D. and J.B. Dodgson, Analysis of the closely linked adult chicken a-globin genes in recombinant DNAs. Proceeding, 1980. 77: p. 2596-2600.

104. Iarovaia, O.V., et al., Visualization of individual DNA loops and a map of loop-domains in the human dystrophin gene. Nucl. Acids Res., 2004. 32: p. 2079-2086.

105. Broders, F. and K. Scherrer, Transcription of the a-globin gene domain in normal and AEV-transformed chicken erythroblasts: mapping of giant globin-specific RNA including embryonic and adult gene. Molecular and General Genetics, 1987. 209: p. 210-220.

106. Beug, H., et al., Erythroblast cell lines transformed by a temperature sensitive mutant of avian erythroblastosis virus. A model system to study erythroid differentiation in vitro. Journal of Cell Physiology, 1979. 1: p. 195-207.

107. Higgs, D.R., et al., A major positive regulatory region located far upstream of the human a-globin gene locus. Genes & Development, 1990. 4: p. 15881601.

108. Razin, S.V., et al., The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix. J Cell Biochem, 2004. 92(3): p. 44557.

109. Ioudinkova E, P.A., Razin SV, Vassetzky YS., Mapping long-range chromatin organization within the chicken alpha-globin gene domain using oligonucleotide DNA arrays. Genomics, 2005.

110. Iarovaia, O., et al., In chicken leukemia cells globin genes are fully transcribed but their mas are retained in the perinucleolar area. Exp Cell Res, 2001.270(2): p. 159-65.

111. Ioudinkova, E.S., et al., Regulation of globin genes expression: New findings made with the chicken domain of alpha globin genes. Gene Ther. Mol. Biol., 2001.6: p. 149-157.

112. Grisanti P, F.S., Tataseo P, Palleschi C., Symmetrical transcription in the tRNA region of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet., 1993.

113. Makalowska I, L.C., Makalowski W., Overlapping genes in vertebrate genomes. Comput Biol Chem., 2005.1. Благодарности

114. Также благодарю всех сотрудников лаборатории «структурно-функциональной организации хромосом» за поддержку и помощь при выполнении работы. Особую признательность хочу выразить Петровой Наталье за личное участие в написании и оформлении диссертации.

115. Благодарю моих оппонентов д.б.н., профессора, чл.-корр. Алексея Петровича Рыскова и д.б.н., профессора Карпова Вадима Львовича за проявленный интерес, обсуждение и ценные замечания.