Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование 5'-фрагмента домена альфа-глобиновых генов кур для повышения эффективности экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование 5'-фрагмента домена альфа-глобиновых генов кур для повышения эффективности экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных"

Л п

ч; и

И *"■*

На правах рукописи

Кааулин Сергей Геннадиевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 5*-ФРАГМЕНТА ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБАНОВЫХ ГЕНОВ КУР ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03. ОО. 04 - Биохимия 03,00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канцицата биологических наук

п. Дубровнцы .Московской области 1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательск«-*-институте животноводства Расхн.

Научные руководители: академик РАСХН

Л. Е. Эрнст;

кандидат меаяжнских наук И. л. Гольдман

Официальные оппонента: доктор биологических наук.

профессор к. К. Клопов . ■ доктор биологических нагл, профессор Л. 5. Дьяконов

Ведущее учреждение - внии физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

•£■3' 1995 г. в "

Зааита состоится rsl^/jzz^l. 1995 г. в "irr* часов на

заседании Диссертационного совета Д 020.16. 02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводетва по адресу: 142012. лубровиш Подольский район, йосковская область.

С диссертацией иохно ознз ю ься в библиотеке ВНИИ хивотко-водства.

Автореферат ; осл

1996 г.-

Ученый-секрета, ь Диссертационного совета,

доктор биологических натк п. А. наум&нко

- i -

ОБЖАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тегл исследовазиа. В настоящее время. на основе технологии рекокбинаятных ДНК. получили развитие методы, позволяющие целенаправленно изменять генотип сельскохозяйственных животных плен введения в их генон чужеродных генов, которые приводят к появлению у животных новых, передающихся по наследству биологических признаков Шатег et ai.. 1985; Brem et al., 1985; Pursei et al.. 1990; Rexrcad, 1992:.

Вместе с тем, работа по получению трансгенных животных весьма трудоемка (Эрнст и др., 19933. Более того, не во всех случаях интеграция чужеродных генов сопровождается их экспрессией [Brem and Huiler, i9941. Отсутствие экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных связывают с эффектом положения трансгена, место интеграции которого в геноме случайно и заранее недредска-зуено [ClarK et al. , 1994). Исходя из функциональней организации генома предполагается, что при интеграции рекомбинантная ДНЕ может попасть либо в траяскргашионно-активкый, либо в транскрипаи-опно неактивный хроматин. Экспрессия чужеродного гена возможна лишь в случае расположения его в составе транскрипшгонно активного домена. При оценке вероятности этого события следует учитывать, что более 90 х генома высших эукариот составляет "молчаная* ДНЕ [Reeves. 1984].

Однин из возможных путей преодоления позиционного эффекта является создание генных конструкций. Функционирующих независимо от окружающих последовательностей хозяйской ДНЕ. Предполагают, что решение данной проблемы следует искать на уровне структурно -функциональной организации генома высших эукариот, электронно-микроскопические наблюдения показали, что больше участки хромосом, особенно районы зукренатика. содержат облаете, образумлю

петельные дсмекы [Gasser et ai., 1969; kazm and VassetzKy. 19923. Нолекулярно-генетический анализ протяженных геномных районов выявил соответствие между петельными доменами хроматика к ре-гуляторныки единицами генной активности [Razin and VassetzKy." 1992). Установлено, что границы этих петель закреплены кг скелетной структуре ядра - ядерном матриксе, причем специфичное взаимодействие ДНЕ с элементами ядерного скелета обеспечивается определенными нуклеотидными последовательностями, получившими название HAR (Matrix attacbmant region! элементов [Phi-Van et ai.. 1990]. Показано также, что регуляторные последовательности, находящиеся на границах структурных едшиа, определяют транскрипционный статус целого домена и делают его структурно и функционально независимым от окружавших участков ДНК [Ееllum and Shedl, 1991].

Использование для получения трансгенных животных генных конструкций, содержащих наряду со структурными генами, пограничные участки генонных доненов, может способствовать образование функционально активного мини-домена, вне зависимости от интеграции трансгена в состав эу- или гетерохроматина. Поиску такк:-: последовательностей в настоящее время уделяется большое внимание, йневтся сообщения, указывающие на то, что пограничные участки кластера бета-глобиновыг генов человека [Grosveld et ai., 1987! и локуса лкзоцимного гена кур [Phi-Van et ai., 1990] обеспечиват/х позидконко-независкмый эффект экспрессии, присоединенных к ним структурны* генов.

Л?едкологаетс# [Ra2fn et ai., 19933 , ;то одним из возможных участков да, способстмкшх позипиокно-независимой экспрессии трансгеноз. может- являться регуляторныи район длиной 1737 п. о., находящийся на границе 5'-области домена альфа-глобиновых генов кур <аи-»рагнент) [Заявка БйЖа и йБГ РАН К 93006578/13 (005503! от 03. 02. 93 на изобретение "фрагмент домена альФа-гдобиковых генов кур") (рис. 1), у которого обнаружены участки прикрепления к

,1 и X 114

УЧАСТОК НДЧЙЛЯ РЕПЛИКАЦИИ

5 т.п.».

ДТ-&СГДТЫЕ ПОСЛ.

МАЕ- ЭЛЕМЕНТЫ

ЭНХЯНСЕРЫ

ГЕНЫ И УЧАСТКИ

ПРИКРЕПЛЕНИЯ К МЙТРИКСУ /

/

ай-фрагмент (1737 п.о.)

ксшсто сштакт акатааск кшхаасс «штсссс кссасакс ссстсастк СОССТОСТОС

стс-исти» дееттштс

саттсато

еттедшхе тсштсстт стсасдсссс сасссают сссдгаш

ссасщсаа

ттсаттссса стсстттит

дссассааст «тстсс1сс асатаса??? тсткаттл иасакасс

шшете»

СА5ШТСАС саашш ксатспк асстстсш

ссгассссс

«ААКСШ теттет

аскаскк

сссссссссс скссссис

ксссасссс

гшссссс

ссссассасс стстетсст

акасатсас сассдсстса асасттссаа асгсаасас? састсссссс бтосассаса ссастссак сстсттссса сдсттши

ессисшст тсикш

стстстапт 7стс75саа5 асссиастс ДССЛДСЛСАЛ апатсасас

стстсгасс

ссаптсса5 скстаста!

ссссшт

ииаасак СЕТССТСТСС стсссссш

ссттсссга асбтсссост атссссссА тссссксст

тсиасстса шсастссг, АтТАКСС аеатс 5сс сатстстоаа сттсисш атсассссм тсакстди дсссссбетс сатсссстса саггсасгга сгсттссссс аакптси са7ассаата аттсттссст аиссттаат естгтсаггс сасассаттс ттссс1сс1* стстскаса аатиааатса

сасгпсти аоткття сссатнх5с шшссоб

кссксесс

сасакссм

ссесксш

тсстсссак КСССС-ОХГ састстсгса ттасассс7с

стстсссссс тссггст&сс

нссстасас

тессссаот

ассаст1стт ссстастсас сассссстса тсасаастсс исакгстт саатта1стс тттктатт? тиасттсдб СтеСАСЕКС АСШАСАМ атссткссс аастатосат касттааас шаатааа?

ссттоскс скисткс сссесасм

СССССКСАС САКСССОК

ксксктт шкссто

АССТСИАСТ СССА5»ССА

ссттдкс

АССАСАССАС АСАСАСССАС СССАИТСАв СТСААСССДб ССШЯШ САТТССАК» КСТСТССК ТТАТТТТСАТ АШС7АШ СТКСТСАП А5АКАТ0М KTCCIf.CC» КАСАШК ДТТСКТШ

спсттито

АСТКТИС5 ТСТТШШ САААКТСК ССА5А1АТА0

«ИТКТСб «АССТСАСА ССАКАССК ТТССССТГС ССИАКТСС САККССТС ТОТКСССА КАЮТТСС ССАКАССТС тгстссгссс АССАССТСАГ САТКААССА СССЕКДОТ СДССТСАСИ АССТСТС1Т5 ССТСАССТОС ТКСТСААСв СТСТССШТ

сститксс ктеттте

ССАСТРГПС «атсссса: «астшд5 АИСАЮТА а5«апаа» актасстта ааааастиа саадсстиа аттстсс

Рис. 1. Организация регуляторных последовательностей б :5'-концевой области домена альФа-глобиновых генов кур: П. О, А - позиции глобиноЕЫх генов; ИББ - позиции участков гипер-■ чувствительности к днказе I (показанЕы только в 5'-концевой 'области доменоЕ; длинные и короткие стрелки обозначают соответственно независящие от типа ткани и зритроиднослециФи-ческие НБЗ).

.ядернону натриксу ЕЕагт ег а!.. 1991], участок начала решшкадщ СКагШ ег а1., 1986], неспецифичный в отношении типа ткани эн-хансер tRazi.ii ег а1.. 19913, участок гиперчувствительности к ДНКазе! с«е1МгаиЬ е! а1.. 19811. а также ряд перманентно изогнутая и легкоплавких последовательностей ДНК [Краевский и др., 1992]. На культуре соматических клеток показано, что этот фрагмент изолирует геномный домен от влияния фланкируших последовательностей [КагшегаЬ. 199П.

Цель е задача исследования. В данной работе изучается возможность использования регудяторной последовательности из 5'- области домена альфа-гяобиновых генов кур (аи-фрагмент) в генных конструкциях, предназначенных для получения трансгенных животных, с пелью повышения эффективности экспрессии чужеродных генов.

Есходя та поставленной цели решались следующие задача:

- получить первичнне культуры клеток кролика, трансгенного по конструкции, несшей в своем составе ген гормона Роста крупного рогатого скота а аи-фрагмент (нтшшаш;

- исследовать особенности интеграции к зксспрессии гена гормона роста крупного рогатого скота в тканях и клеточных культурах тканей кролика, трансгенного до генной конструкции ШЬбНаи. в частности.- исследовать ДНК. ассоциированную с ядернын матриксон трансгеннш клеток;

- провести сравнительное изучение частоты экспрессии гена бета-галактозидазы Е. соИ Пасг) на культивируемых эмбрионах кроликов после кикроиньекши в мужской пронуклеус зигот генной конструкции, не инешей в своей составе аи-фрагмента 1асг). и генных конструкций, включаадпих в свой состав аи-Фрагменты (аШБУ^асгаи. аиш-хасгаи и ЕБУ-исг ♦ аинтшзнаи).

Научная новизна работа. Установлена активная экспрессия со-матотропина крупного рогатого скота в тканях и культуре клеток

-j -

кролика, трансгенного по реконбинантной генной конструкции MTlbGHatt. включающей в свой состав att-Фрагмент. На культуре. клеток соединительной ткани капсулы почки этого животного показа-; на фиксация чужеродного гена на ядерной матриксе. Ке исключено, что в данной случае может иметь место независимая от позиции интеграции экспрессия чужеродного гена, связанная с присутствием в интегрированном генном конструкте аи-фрагмента.

В модельных экспериментах на культивируемых ранних эмбрионах кроликов доказана высокая частота экспрессии гена бета-галактози-дазы Е. coll (lacZ) в составе генных конструкций, содержащих att-фрагмента ■

Практическая значимость работ Показана принципиальная возможность использования в рекомбинантных генных конструкциях. предназначенных для получения трансгенных животных, регуляторной последовательности из 5'-области домена альФа-глобиновых генов кур (att-фрагмент) с цель» увеличения эффективности экспрессии чужеродных генов, что может быть использовано в биотехнологии трансгенных сельскохозяйственных животных, получаемых с целью улучшения хозяйственно-полезных признаков, обеспечения информационного иммунитета, создания животных-продуцентов биологически активных белков Фармакологического и технологического назначения.

Апробация работ Натериалы диссертационной работы доложены на VI биотехнологической конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии". 21-26 мая 1994 года, г. Пушино.

Объен работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка сокращений. Работа изложена на loi страницах, содержит 31 рисунок, з таблицы и 2 приложения, список литературы включает 145 публикаций.

- 6 -

НАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обший план исследовательской работы представлен на рисунке г.

Рис. г. Принципиальная схема исследования '

Использованные в работе генные конструкции были созданы б Институте молекулярной биологии им. Б. А. Энгельгарта РАН и Институте биологии гена РАН под руководством академика РАН Г. П. Геор-гиева.

Для микроиньекдки использовали линейные Фрагменты ДНК, растворенные в ТЕ-буфере (W ни трис-HCl. рН-7,5; олмКЭДТА), до концентрации 2-3 ккг/нл.

Генная конструкция RSV-LacZ. включает в себя репортерный ген, кодирующий белок бета-галактозидазу Е. coli (lacZ) под управлением' длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV) СЖаданов. 19911 (рис. 3, А). -

Генные конструкции attRSV-lacZatt и attHTI-lacZatt содержат ген lacZ под управлением промотора RSV или гена металлотионеина I м;пк (йШ). и дополнительно Фланкированы att-Фрагментами (рис.

7. Б И В).

совместно с генной конструкцией RSV-lacZ в молярном соотношении 1:1 использовалась конструкция гена гормона роста крупного perdí;-:: скота (Ь6Н) под управлением промотора шНТ1, Фланкированная at'-Фрагментами (auKTIbGHatt) (рис. 3, Г).

Оплодотворенные яйцеклетки кроликов на стадии пронуклеусов получали от половозрелый животных, гормонально обработанных с пелью вызывания ■ суперовуляаии (внутримышечно СЖК flntergonan. ФРГ; из расчета 20 ИЕ/кг живой кассы, через 72 часа внутривенно хорионический гонадотропин (EKiuton, ФРГ) из расчета 70 ИЕ/кг жи-еой массы). На 18-й час после 2-х кратного естественного осеменения доноров забивали и из отпрепарированных яйцеводовФосФат-ис-буферным раствором (ФБС) вымывали яйцеклетки. Собранные яйцеклетки отделяли от эпителия яйаеводов и помешали в камеру для мик-РонанипУляаий.

Перенос чужеродного генетического материала осуществляли методом прямой микроиньекпии реконбинантной ДНК в мужской пронукле-ус оплодотворенных яйцеклеток кроликов, используя стеклянную мик-рояипетку с диаметром колшего конца 1,3-1,5 мкм. Данная манипуляция выполнялась на иквентироЕанном микроскопе Asi overt-55 í"Opton", ФРГ), оснашеннон оптикой Номарского, при. помоги микр-:-нанипуляторов КН-2 ("Биоприбор", Россия) и микроиньекторг ("Harishige". Япония).

Культивирование интгктннх и никроиньепировакнын зигот кроликов проводили в каплях модифицированной среды HF-10 ("Sigrr.a", СЗА). под слоен вазелинового масла, при температуре Зб1, С. влажности 93-95 г в воздушной атмосфере, содержащей 5'.'- C0¿ в течение 48-ми часов.

Bind III 1

9

Cli [

А :

| j, BIHH I

1-Г U ■■!

tcoK V

| Dp* II!

sä-ч:

SSV-LTE

lacZ

tr

G00 n.o.

ВаиН 1

d I

att RSV-LTE 600 n.o.

lacZ

Bi

Hlnd III

1»N 1

IIP* III

ist 1 Sic I Fvu II

t I

Pvu II

!u I

Ba»H I Pst I Pst I

Fvu U

att 600 n.o.

Крп I ist I

) Sac :

Ba»H I | fm и . | Puullj jUpnlj

tr att

EcoR I

t

_i

■Рис. 3. Физические карты генных конструкций RSV-iacz (А), . attESV-lacZatt (Б), attKTI-lacZatt (В) и attHTibGHatt с г>: : att - регуляторная последовательность из 5'-области домена альФа-глобиновыу геноЕ кур (att-фрагмент, 1719 и.о.): '

• ESV-LTE - последовательность длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (584 п.о.); ИТ - последовательность промотора гена неталлотиокеина I мыши (670 п. о.); lacZ - гек бета-галактозидазы из лактозного оперона Е. coli (3500 п. о. ); bGH - последовательность хромосомного гена гормона роста быка (2300 п. о.); tr - 3'-концевой участок гена гормона роста

• быка. содержащий сигналы сплайсинга, полиаденилирования и

• терминации транскрипции (786 п.о.).

Для получения клеточных культур использовали ткани легкого, печени, почек и соединительной ткани капсулы почки крлолика. трансгенного по конструкции МПЫШаи. После дезагрегации тканей . и отмывки клеточной с/спензии, осадск клеток ресуспендировали в питательной среде СИЕН ("С1Ьсо") с высоким содержанием глюкозы, обогазпенной ю г эмбриональной сывороткой телят и г гй гдутанина. Плученные клетки культивировали в стерильных пластиковых 25 снг Флаконах ("ВгЬЬу"), каждые 72 часа проводя смену среды.

"ред взятием проб культуральнкк сред для определения концентрации соматоттопина крупного рогатого скота, вырабатываемого клетками трансгенного кролика, культурзльную жидкость кондиционировали путем культивирования клеточного монослоя в свежей среде в течение 72-х часов.

ДНК, связанную с ядерным матриксом (ямДНЮ, выделяли из первичной культуры Фибробластов кролика, трансгенного по конструкции ШЬШаи, по модифицированной методике скаландадзе А. Г, и др., 1989]. Данная процедура включала в себя этапы выделения ядер, ядерных матриксов и непосредственно ямДНК (рис. 4).

Тритьн X—100

Нунлгм« 51)5, 2Ы НаС1 Г^"^ / 1 : Пр«ч

КЛЕТКА ЯДРО НУКЛЕОИД МаТРИСС якДНК

Рис. 4. Схема выделения ДНК, ассощщрованной с ядерный нат-риксом.

Клеточные ядра экстрагировали игген гомогенизации в буфере,

содержанки ю нй RaCl. з мН HgCid, ю нй Трис-hci (рН-7,6), обо-гашеннон I мй CuSOy и неионным детергентом Тритон X-iöO до концентрации 0,5 к. Выделение ядерных натриксов осуществляли, используя концентрированные растворы NaCl и обработку необходимым количеством никроккоковой нуклеазы.

Геномную ДНК из ткани и культуры клеток, а также ямДНК из ядерных натриксов культуры клеток трансгенного кролика выделяли по модифицированному методу Блинами СтаФФорда [Blin et al. ,1976].

Анализ ДНК тканин культураяьных клеток трансгенного кролика выполняли с помоаь» полинеразной цепной реакции (ПНР), используя две пары праймеров: DGA, DGY и BG3, BG4, ограничивашне соответственно 650 п. о. из att-фрагмента," и 705 п. .о. из гена bGH [Дворянчиков и гдр.. _ 1993]. Реакция амплификации проводилась в снеси: 1, 5 нй ИвС12; 67 нН Трис-НС1 №8, 8); 16,6 нй сульфат анонияг 0,01 z Тбин-20; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dHTP) по 0,2 иН каждый; 0,2 нкг геномной ДКК; праймеры по 0,04 икг н 2,5 ед активности ДНК-полинеразы Тач ("Биомастер"). Протяженность реакции составляла 30 циклов в режиме: 94° С - 1,5 нин.; 60® С - 2 нин.; 72° С - 3 мин.

Экспрессию гена бета-галактозидазы Е. coli оценивали как у микроинъецированных реконбинантной ДНК, так и у интактных энбрио-нов кроликов, с покошыо специфической цветной реакции обнаружения белка бета-галактозидазы на субстрате x-gal, обусловленной наличием нерастворимых в воде синих кристаяов хромофора [Bonnerot et al.. 1990; Гоголевский и др.. 1991].

Концентрацию сонатотрооина крупного рогатого скота (ЕСТ) в крови трансгенного кролика, экстрактах тканей органов и культу-ральной • жидкости определяли с помоиь» твердофазного теста типа "сэндвича"- ELISA ШмнуноФернентный анализ, 198SJ. количественную оценку БС1' проводили относительно контрольных образцов.

- 11 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. ИССЛЕДОВАНИЕ КРОЛИКА, ТРАНСГЕННОГО ПО ГЕНГЮП ЕОНСТРУЕ" .

пан кпъснаи

На первом этапе работы в качестве объекта исследования был выбран кролик, трансгеннкп по рекомбинантной генной конструкции мпкнаи. в состав которой входит хромосомный ген гормона роста крупного рогатого скота (ЬбН) под управлением промотора гена ме-таллотионеина I пиши (пНТП и изучаемый аи-фрагмент [Хаданов, 1991). '"■

Li. Молекулярный анализ хромосомной ДНК трансгенного кролика

Молекулярный анализ (ПНР) показал присутствие в геномной ДНК ткани трансгенного кролика фрагмента длиной 650 п. о. иг 5'-области домена альФа-глобиновых генов кур (аи-фрагмент).

отсутствовавшего у контрольного животного (рис. 5).

' 650 п. о.

¡1 2 3 4 5 6 7

!рис. 5. Электрой еретический анализ продуктов амплификации теномной ДНК трансгенного кролика в горизонтальной i.5 z-hom агарозном геле на присутсвие att-Фрагмента, выполненной с помощью праймеров DGA, DGV (окраска бромистым этидием): 1 -рестрицированная Нае III ДНК плазмиды PBR322, 2 - ДНК контрольного кролика (отрицательный контроль); 3-5 - ДНК кролика, трансгенного по конструкции FiTIbGHatt; б - ДНК цыпленка (положительный контроль); 7 - вода без ДНК.

1.2. йнмунофернентный анализ экспрессии гена Ъ® у трансгенного кролика

Исследование крови трансгенного кроянка, выявило наличке г ее составе соматотропина крупного рогатого скота (ест), концентрация которого достигала 55 нг/ил. Кроне того, было установлено, что при даче животному с водой 0,25 ми сульФата гп, уровень чужеродного гормона в крови в течение 5 дней повышался в 3, б раза, е затеи, после исключения цинка, приближался к начальному показателе (рис. б).

¡т/ил

Рис. б. Эффект активации экспрессии гена гормона роста крупного рогатого скота у кролика, трансгенного по контрукциг HTIbGHaU: 1 - концентрация БСТ в крови до введения цинка f питьевы» воду: 2-4 - во время введения; 5, б - после исключения шша.

Исследование экстрактов органов животного показало высоко

содержание сонатотропина крупного рогатого скота во всех взятых для исследования образцах, уровень концентрации чужеродного белка в которых был одного порядка (от 99.4 до 124,0 нг/нл), эа с лечением тканм легкого, где ¿тот показатель составил. 19.5 нг/нл,

Таким образом, приведенные данные подтверждают предположение о том, что имешкеся в аи-фрагкенте регуляторные элемента, обеспечивают высоки и не специфичный в отношение типа ткаки уровень экспрессии чужеродных генов в клетках трансгекных ятотннх, не подавляя проявление Функциональной активности нэталло-птошшо-вого промотора.

1.3. Получение и исследование кяеточшх культур ?каяз трансгенного кролика

Нз взятых образцов тканей трансгенного кролика Сыли-иолучена первичные меточные культуры ткани почки, легкого и соед1шигель-ной ткани капсулы почки. 8 результате культивирования клеток бнло установлено, что наибольшей иитотической активностью обладали клетки соединительной ткани капсулы почки, представленные Фиброб-ластами, которые остались жизнеспособными и при дальнейпй пересевах (5-12 пересев и 19-28 пересев).

йсследование содержания сокатотрошгаа крупного рогатого скота (ккнуноФериентный анализ) в образпах культурзяьнои cpfsa вле-тск трансгенного по конструкции KTIbGHait кролика показало способность клеток этого животного продуцировать чужзроднШ гор-нон и в условиях in vitro (таблица 1>.

Концентрация ВС? з культуральноп среде клеток трансгенного кролика после первого пересева соответствовала уровни содержания ЕСТ в крови и экстрактах органов животного и была одного порядка (от 53.1 до 97.5 кг/кл). После дальнейших пересевов клеток соединительной ткани капсулы почки зарегистрировано резкое повышение

- 14 -

ими продукции БСТ (£72.4 нг/нл).

Таблица 1.

Продукция соматотропина крупного рогатого скота клетками культуры ткани органов траясгенного кролика

Первичная культура клеток Содержание БСТ (нг/нл).

ранние пересевы поздние пересеБЫ

Соединительная ткань капсулы иочки 69.4 Н7гч4

Ткань легкого '„. 58.1 бб, 1

Ткань почки 97.6 - *

* - не исследовалось •

1.4. Колекулярное исследование ДНК культурэльных меток трансгенного кролика

Нетодок ПИР-анплиФикаши в геномной ДНК, полученной из ткани уха и культуры Фя&робластов ткани капсулы почки трансгенкого кролика. были обнаружены последовательности как гена гормона роста крупного рогатого скота (ьсн) (рис. 7. дорожки 1, 2), так и аи-фрагмента (рис. 7, дорожка 5), что позволило судить об интеграции рекомбинантной генной конструкции ИПЬСНаП в генон исследуемого животного с сохранением этик частей, а также об их структурной и сегрегационной стабильности.

Нолекулярный анализ янДНХ культуры Фибробластов трансгенного кролика, показал, что полученная як/Ж содержит Фрагмент длиной

i 650 П. о.

705 П. 0.

1 2 3456 7 8

Рис. 7. электрс-Форетический анализ продуктов анплнфикации геномной ДНК из уха и культуры клеток ткани трансгенного ¡кролика на присутствие траксгена НТТЪОНаи, выполненной с «помощь» праймеров (дорожки 1-4) и вва, ССТ (дорожки

(5-7): 1 - ДНК ткани уха трансгенного кролика: 2,5 - ДНК Iкультуральных клеток трансгенного кролика; з - ДНК контрольного кролика ¡отрицательный контроль); 4 - ДНК тимуса телея-¡ка (положительный контроль); 6 - вода; 7 - ДНК цыпленка (по-: ¡ложительный контроль); 8 - РэгЬрестрикты ДНК Фага лянда.

650 п, о. из домена альфа-глобиновых генов курицы (рис. 6,-дорожка 1) и фрагмент длиной 705 п. о. из гена bGH (рис. 8, дорожка 5), что указывает на связь интегрированной генной конструкции HTIbGHatt с ядерный иатриксон.

Рис. 8. электрофоретический анализ продуктоз амплификации якДНК из культуры клеток ткани трансгенного кролика на присутствие трансгена МТ1Ь5Наи, выполненной с помощью праймеров ВЙЗ, ВС4 (дорожки 1-1) и ГСА, С<¿4 (дорожки 5-8): 1,5 -ДНК культуральных клеток трансгенного кролика, ассоциированная с ядерным катряксом (ямДНК); 2,6 - ДНК контрольного кролика (отрицательный контроль); 3-7 - вода; 4 - ДНК тинуса теленка (положительный контроль); 8 - ДНК цыпленка (положительный контроль); 9 - РэН-рест^икты ДНК Фага лямда.

123456789

Вполне возможно, что связь att-фрагмента с ядерным матриксом клеток трансгенного кролика не случайна, а вызвана присутствием в исследуемой последовательности НАЕ-эленентов, прикрепление которых к ядерному матриксу обеспечило экспрессию гена bGH независимо от окружающих последовательностей хозяйской ДНК.

Однако, как известно, помимо участка прикрепления к ядерному

матриксу, изучаемый att-Фрзгиент содержит и целый ряд других

i

Функциональных элементов. Следовательно, функциональная активность этого Фрагмента может иметь комплексный характер.

В то же вреня, нельзя исключить и того, что высокий уровень экспрессии трансгена может быть также связан с наблюдаемой Фиксацией структурного гена (bGH) с ядерным матриксом.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ att-ФРАГМЕНТА НА ЧАСТОТУ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА В-ГАЛАКТОЭИДАЗЫ Е. COli В РАННИХ ЭМБРИОНАХ КРОЛИКОВ

Обнаруженый нами высокий уровень экспрессии чужеродного гена (bGH) у кролика, трансгенного по рекомбинантной генной конструкции, несушей в своем составе att-фрагмент, послужил импульсом для проведения модельных экспериментов на культивируемых эмбрионах кроликов с использованием гена бета-галактозидазы Е. сои, имевших цель дальнейшего изучения возможности использования данной регуляторной последовательности в составе геннкх конструкций с целью увеличения эффективности экспрессии чужеродных генов,

2.1. Получение оплодотворенных яйцеклеток кроликов

Используя выбранную методику подготовки кроликов-доноров, от 19-и крольчих было получено 4-51 яйцеклетки, что в среднем составляет 28,б' яйцеклеток на одно животное. Из них 76, г г были пригодны для микроиньекции.

2. 2. Культивирование интактных а кикроквьецкрованных рекон-бинантной ДНЕ зигот кроликов

Выбранные условия культивирования обеспечивали нормальное развитие интактных эмбрионов. 61 х из которых достигали стадии морулы. После микроиньекдии генных конструкций жизнеспособность эмбрионов снижалась на 25 '/■ (рис. 9).

Рис. 9. Результата 48-ни часового культизирования интактных и микроинъечированнкх рекомбинантной ДНК ранних оплодотво-■рекнкх яйцеклеток кроликов: 1 - интактные яйцеклетки (п-68); :2 - яйцеклетки после микроииьекшш рекомбинантной ДНК ; (п - 21 з),

После микроиньекшш сходных генных конструкций, принципиально отличающихся между собой только наличием а!I-фрагмента (ИЗУ-1ас 1 и ашз\г-1асгаи), был проведен анализ выживаемости никроиньекированных эмбрионов, который показал, что присутствие аи-Фрагментов в составе генной конструкции не снижало выживаемости микрокньецированных эмбрионов (таблица 2).

таблица 2.

Выживаемость эмбрионов кроликов, микроиньеиированных генными конструкциями, отличашикися между собой наличием аи-фрагмента

Показатели : Генные конструкции

I Rsv-iacz ;attRsv-iacZau

Использовано ! яйцеклеток, всего, (2) ; 46 (100) : 49 (100)

Яйцеклетки, остановив- ; аиеся в развитии, ('/■) « ; 23 (50) : 14 (28,6)

Яйцеклетки с нормаль- ! ным раз витаем, с/.) *. ; 23 (50) : 35 (71,4)

* оценка после 48 часов культивирования иикроинБёцированных зигот

1.3. Исследование экспрессии гена бета-галактозидазы Е. coll у микроиньепированных реконбинантной ДНК эмбрионов кроликов

В результате' гистохимического окралшБанпА эмбриологического материала было обнаружено, что эмбрионы, которым.была проведена микроиньекция как отдельных генных конструкций, несущих в своей составе att-Фрагменты (attRSV-lacZatt. attHTl-iacZatt), так к смеси генных конструкций, одна из которых включала в себя аи-фрагменты (RSV-lacZ + attHTIbGKatt). обладали высокой бе-та-галактозидазной активность» (соответственно 19, б '/.. зч,т/. п 23,8 г от микроиньецированных эмбрионов). В группе же эмбрионов,

никроиньецированкых генной конструкцией, не содержащей в своем составе alt-Фрагментов (RSV-lacZ), уровень экспрессии гека lacZ был существенно низе <2.1 ''■). У интактннх эмбрионов бета-галакто-зидазной активности не обнаружено (рис. ю).

юоя

■ 75% --

50%

25%

0%

7 /

/ l

/

, , II -

окрашенные ,_.

L-j . , . t- 1. эмбрионы

4 5

не окоашенные

эмбрионы

Рис. Ю, Частота экспрессии гена, бета-галактозидазы Е. coli :у эмбрионов кроликов; 1 - интактнке эмбрионы (п-53-!: 2 - эн-!брионы после никроиньекнии генной конструкции RSV-lacZ I(п=4б) ; 3 - эибрионы после микроинъекции генной конструкции |attRSV-iacZatt (п=49); 4 - эмбрионы после микроиньекшгл ген-'•ной конструкции aUliTI-lacZatt (п=5\); 5 - эмбрионы после коиньекдии генных конструкций ESV-lacZ и aUfii'IbGHatt : (П--67).

Нужно отметить, что экспрессия гека бета-галактозшш была зафиксирована как у эмбрионов, которые остановились в своей делении на 1-4-х клеточной стадии, так,и у тех, которые развивались до стадии иорулы. Окрашивание имело место в отдельных бластонерах (рис. 11).

Результаты модельного эксперимента позволили нам сделать

"заключение, что присутствие аи-фрагментов в составе генных

Рис. 11. Эмбрионы кролика, обладающие бета-галактозидазной активностью.

конструкций, введенных в мужской пронтеус яйцеклеток кроликов, не снижая Процента выживаемости микроинъепированных зигот, повышает количество эмбрионов, экспрессируших чужеродный гек 1ас2.

Данная работа является частью комплексной программы изучения возможности использования аи-Фрагмента в генных конструкциях для повышения эффективности экспрессия чужеродных генов у трансгенных животных, которая проеодится совместно Институтом молекулярной биологии РАН, Институтом биологии гена РАН и Всероссийским НИИ животноводства. Результаты выполненных экспериментов оказались многообещающими в плане дальнейших исследований роли НАй-элемен тое и 5'- фрагмента домена альФа-глобиновых генов в обеспечен«: позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов у трансгекни; сельскохозяйственных жиеоткых.

выводы

1. Негодом полинеразной цепной реакции (ПНР) установлено, что в составе геномной ДНК ткани и первичной культуре клеток кролика, трансгенного по рекомбинантной генной конструкции ШЫШаи, присутствует как ген гормона роста крупного рогатого скота (Ь0Н>. так и 5'-фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур (аи-фрагмент),

2. В крови, экстрактах тканей органов и клеточных культурах тканей кролика, трансгенного по конструкции ШЬСНаи. включашей в свой состав аи-фрагмент, зарегистрирован высокий уровень гормона роста крупного рогатого скота (в крови - 55 нг/мл, в органах - до 124,0 нг/ил. в культах клеток - до 272,4 нг/нл).

3. Экспрессия интегрированной в геном кролика „ генной конструкции НИЬШаи. несушей в своем составе аи-Фрагмент, была нетканеспезшФична и активировалась ионами пинка (в 3,6 раза). Присутствие аи-фрагмента в генной конструкции не нарушало функционального механизма НТ-промотора.

4. При исследовании ямднк культуральных клеток трансгенного кролика показана фиксация на ядерной натриксе интегрированной в геном животного рекомбинантной генной конструкции ШЬСНаи, несушей в своем составе а!1-Фрагмент,

5. Включение аи-Фрагмента в генную» конструкцию, предназначенную для получения трансгенных животных, не снижает процента выживаемости никроиньепированных рекомбинантной ДНК эмбрионов кроликов.

6. В модельном эксперименте на культивируемых эмбрионах кроликов с использованием гена бета-галактозидазы Е. сои показано, что присутствие аи-фрагментов в составе генных конструкций, введенных в мужской пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток, повышает количество эмбрионов, зкспрессируших чужеродный ген (19,6-34,7 г.

- опыт и 2. 1 '(• - контроль).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОНЕНДАШЙ

Исследованная регуляторная последовательность из 5'-области домена альФа-глобиновых генов кур (att-фрагмент) представляет интерес для генноинженерных работ в целях повышения частоты экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных.

По теме диссертации вышли следшпие публикации:

1. Эрнст л. К., Гольдман й. Л . Кадулин с. Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца // Биотехнология. - 1993. - Н .5.

- С. 2-14.

2. Гольднан И. л,, Разин с. В. ■ Эрнст л. К., Кадудин с, г., Грашук H.A. Нолекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-неза-висимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных // Биотехнология. - 1994. - Н 2, - с. 3-8.

3. Гольднан И. Л., Разин С. В.. Хаданов А. Б., Семенова В. А., Вас едкий E.G., Миталипова К. Н., Дворянчиков Г. А., Кадулин с. Г., Афанасьев В. Н. Возможный пример позишюнно-независимой экспрессии чужеродных генов, нолекулярно-биологии ¡>е исследование культуры клеток ткани кролика, трансгенного по струккии. содержашей гей гориона роста крупного рогатого скота АК-элемент//У1 конференция Российской Федерации 'Новые направ. ш биотехнологии" 24-26 ная 1994 г., г. Пушино: -.исы докладе Пушно, 1994. - С. 138.

4. Гольднан й. Л.. Эра Л. К.. Гоголевский П. А., Семенова В, А., Кадулин С. Г.. жат шов А. Б. > Дворянчиков Г. А.. Разин С. В., Кузнецов A.B., Афанасьев В.Н. Теоретические вопросы получения транс-генных животных. Эксперименты на кроликах к Сборник "Трансгенные сельскохозяйственные животные". - 1995,- В.1.- С. 93-103.