Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение векторов для экспрессии чужеродных генов в трансгенных животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение векторов для экспрессии чужеродных генов в трансгенных животных"

( ; Ч кГ "1 . .'?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

на правах рукописи УЖ 577.21

Жаданов Александр Борисович

ПОЛУЧЕНИЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ.

Молекулярная биология ( 03.00.03 )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА, 1991

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук., академик АН СССР Г.П.Георгиев кандидат биологических наук Г.Н.Ениколопов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик АМН СССР, доктор биологических наук профессор Збарския И.Б.

кандидат биологических наук Тулъчинскии Е.М.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт 'молекулярной генетики АН СССР

Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР

Зашита состоится на заседании специализированного совета

в ■" часов Д.002.79.01. при

Ученый секретарь Специализированного < кандидат химических

Автореферат разослан

Актуальность проблемы. Развитие методов молекулярной

|рологии, генетической инженерии позволяет в настоящее время гёлучать трансгенных животных, содержащих в составе своего геному {'^и^адные последовательности ДНК. При наличии в составе встроив-| рекомбинантной конструкции особых регуляторных участков, ТШГРен способен зкспрессироваться , вызывая изменения в физиологических реакциях обмена зешеств, а иногда и во всей 1рограмме' развития организма. Таким образом, открывается путь к 1зучению- функциональной роли и регуляции экспрессии чужеродных ■енов на уровне целого организма.

Эксперименты, связанные с получением трансгенных швотных, проводятся во многих странах мира. Тем не менее, (есмотря на многочисленность и многообразие этих исследований, «ногие факторы, определяющие эффективность трансформации клеток ¡ардыиеЕого пути, степень мозаицизма, эффективность экспрессии )ужеродных генов в разных тканях остаются недостаточно изученными. ! связи с этим создание генно-инженерных конструкций для ¡ффективной экспрессии введенного генетического материала является 1ктуальной биотехнологической -задачей.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось создание рекомбинантных сонструкций с генами, имевшими биотехнологическое значение, ^явление характера интеграции трансгена, а также исследование ¡кспрессионной активности чужеродных генов у трансгенных швотных.

В задачи исследования входило:

- получение серии векторных кассет для экспрессии чужеродного ■енетического материала, выбор наиболее оптимального вектора (етодом экспресс-анализа САТ-Агвау и создание на его основе •енно-инженерных конструкций с генами, представлявшими интерес для ¡иотехнологии.

- скрининг трансгенных животных, родившихся после микро-[нъекций рекомбинанткоя ДН1С в оплодотворенные яйцеклетки.

В качестве инъецируемого генетического материала ^пользовались гены гормона роста быка и ген поверхностного .нтигена вируса гепатита В человека ( НВгА£ ) под контролем ¡егуляторных элементов гена металлотионеина-1 мыши. Причиной ыбора этих генов явилось медицинское и народохозяйственное 1-/ОМ

значение, которое могут иметь продукты их экспрессии.

Получение HBsAjj необходимо для создания чувствительных тест-систем при детекции анти-HBsAg антител в крови пациентов, для создания эффективной вакцины против вируса гепатита В человека. Использование бактериальных культур с целья получения полноценного HBsAg невозможно по причине отсутствия в бактериях ферментативных, систем посттрансляционноя модификации, происходящей в процессе созревания белков.

Значение bGH определяется действием, которое он может оказывать на скорость роста и продуктивность сельскохозяйственных животных. На сегодняшний день наиболее, изученным является действие экзогенного соматотропина на свиней: на 10-15Ж увеличивается среднесуточный привес, на 16-18% улучшается эффективность усвоения корма,-уменьшается содержание жира (Fursel V.G.,1989).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Данное исследование представляет собой одну из первых в СССР работ, связанных с получением трансгенных сельскохозяйственных животных и рыб. В результате проведенных экспериментов были обнаружены трансгенные кролики и зеркальные карпы. Методом блот-гибридизации по Саузерну .. была продемонстрирована интеграция чужеродных генов в хромосомы трансгенных животных.Экспрессия введенного генетического материала подтверждалась иммуноферментными исследованиями.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Х-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и свойства клеточного ядра" (Гродно, 1990) и на Всесоюзной школе по биотехнологии ¡¿агорск, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Обь ем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, зксг.ерементальноя части и обсуждения полученных результатов, вывод-в и включает в себя 21 рисунок и 6 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 163 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

На первом эгапё это я работы требовалось получить рекомби-нантные конструкции, способные экспрессировать чужеродный генетический материал в клетках тавотных. Так были созданы дЕе серии векторных кассет на основе МТ- и RSV-промотсров. Внутри каждой серии вектора отличались друг от друга благодаря присутствию различных 3'-нетранслируемых областей в составе каждого вектора.

Второй этап заключался в проверке функциональной активности каждого из созданных векторов, а также в выборе конструкции, способной обеспечить оптимальный уровень экспрессии биотехнологически важного гена. Для этого в последовательность ДНК каждого из векторов включали сигнальный ген cat (хлорамфениколацетилтрансфе-раза Е.соИ! и проводили анализ эффективности экспрессии методом "CAT-Assay". Е результате проведенной работы была выбрана базовая конструкция рМТИЗ, на основе которой затем создавались рекомбинантные вектора с геном гормона роста быка.

Третьим этапом данной работы било получение и изучение трансгекных кроликов с геном гормона роста крупного рогатого скота

Следует отметить, что конструкция pMTtiGH , использованная для получения трансгенных кроликов в дальнейшем была модернизирована путем добавления к ней специального att-участка прикрепления к ядерному матриксу." Несколько лет назад в различных лабораториях аира были обнаружены особые участки ДНК. (так называемые LAR или DCR-районь!), которые, будучи Еведены в состав, вектора для получения трансгенных животных, обеспечивают экспрессию встроившегося трансгена независимо ог природы геномного окружения сайта интеграции и прямо, пропорционально количеству встроившихся копий чужеродного гена. OCR располагаются, как правило, поблизости от семейств различных- генов, образующих домены (к примеру, ß-глобинового семейства генов). DCR могут включать в себя один или несколько сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I и в некоторых случаях- содержат участки прикрепления к ядерному матриксу (DCR гена лизоцима кур).

Мы решили включить в состав генно-инженерной конструкции участок ДНК из а-глобиисвого домена куриного генома, похожего по своим свойствам на описанные в литературе DCH. Используемый нами att (attachmentI-участок располагается исходно в 5'- области домена а- глобиновых генов, имеет в своем составе сайт

гиперчуестеитедьности к днк°3" i ii y4äc tkcl у

ядерному матриксу 1МЛШ. Кроме того, внутри att-фрагментг находится сайт инициации репликации клеточной ДНК\( Кинцурашвил^ Е,Г.,1991). Так была получена конструкция pMTk3bGHQt¡.

Помимо получения трансгенных кроликов, содержащих в составе своего генома .различные конструкции о-геном гормона роста быка, е настоящей работе описывается получение трансгенных карпов, содержащих и зкспрессирувщих ген поверхстного антигена вирусе гепатита В человека. Микроиньецируемая конструкция, вклочаюшдя е себя МТ-промотор и участок для сплайсинга и лолиаденилировани5 мРНК из области ранней транскрипции вируса SY40, была получен; исторически ранее векторных кассет, принимавших участие Б_анализ« "CAT-Assay". В дальнейшем мы заменили трейлерную область геномг вируса 5Y40 на аналогичную из гена bGH.

«

1.Создание векторных кассет с ИТ- и RSV-npoмоторами.

При конструировании векторов был ' выбран алгоритм позволяющий быстро получать векторные кассеты из промоторных i трейлерных модулей. Общая схема алгоритма такова: в сайт ХЬа: полилинкера плаэшдь/ pUC19, предварительно затупленный "по-тупому" вставляли в одном случае МТ-, а в другом HSV- проыото; в ориентации Hindlll^-x EcoEI ( 5'~-> з1 ). Аналогичным способом ; сайт полилинкера Smal вставляли 3'- концевые части различных гено; с участками, обеспечивающими процесс созревания эукариотическо мРНК. Последовательность генно-инженерных операций схематическ: изображена на Рис.1. Информация об используемых в составе рекомби наитных конструкций трейлерах представлена В Габ.1 .

. 2.Экспресс-анализ "CAT-Assay" полученных векторов.

Для проведения .анализа "CAT-Assay" в каждый и полученных векторов необходимо было вставить бактериальный -ге хлорамфеникол - ацетилтрансферазы (cat). Ген cat длиной"около 72 н.п. вырезали из исходной плазмиды рШ.24 с поыощьв рестрикта BanHI и HlnüIII. Далее фрагмент ДНК с cat-геном обрабатывал Кленовским фрагментом в присутствии dNTP и клонировали предварительно "затупленный" ВашМ-саит каждого из получении векторов серий рМТХ^ и pRSVkn Ориенташш вставки проверяли помошьо рестриктазы EcoRI. В результате были получены 'следующи вектора :

PROMOTER

R К Saal 1 1 1 (1 И 1

В

(Ibal)

PUC19 1

BamHI+Hlndlll

BamHI+Hlncflll

\/

PUC19

Jjj

» I Igase T4 ■У si h

JL

TRAILER PROMOTER

PUC19

Рис .1 Схема конструирования векторных кассет: .тарной линией выделены последовательности плазмиды рЮ9, а также 5'-промоторноя и З'-треялерной частей. Буквами обозначены сайты рестрикгаз: В-ВашН1, Н-Н1Ш11Г1, К-Крп1, й-ЕсоН1, 5-:Зас1, 31-3а1«, Х-ХЪа1.

с?- №■(

-б-

ТАБЛИЦА I.

Характеристика 3'-концевых областей, содержащих сигналы для правильного полиаденилирования и используемых при создании векторных кассет.

Название

Природа исходного гена

Размеры (н.п.)

Наличие ; сайтов ; сплайсинга <

kl k2 k3 k4 k5 kS kT

ß-глобин кролика < 2000

ген bGH i 1150

ген bGH I 780

ген bGH | 560

ген bGH l 230

Т-антиген вируса SV40 j . Ö80

Х-ген вируса гепатита В ¿ SSO

Серия векторов с МТ-лромотором pMTklcat pMTk2cat pMTK3cat pMTk4cat pMTk5cat pWTkÖcat pMTk7cat

Серия векторов с BSY-промотором pRSVklcat pRSYMcat pRSYk3cat pRSYköcat pRSYk7cat

Схематичные карты векторов с МТ-промотороы представлены

на Рис.3 и Рис.4.

-г-

5' ir_1

5' Ч

5' Н

5' Н

1с—± 5' tc_L

5'

^_I

5' _L

sm, р,т п 3'

рМТЬЗ-cat

pMTk4-cat

^иььмЛ 3pMTkS-cat

ii Dal

arall

MT promot.i САГ- ген TRAILER

pMtkö-cat pMTk7-cat

Рис.2 Схема векторных кассет (серия с МТ-промотором), принимавших участие в анализе "CAT-Assay". Буквами обозначены сайты " рэстриктаз: Н - Hind III, К - Kpn I, Pv -Pvu II, R - EcoE I, S - Sac I, Sm - Sma I.

R

-ô-

Для удобства сравнивания эффективности экспрессии конструкция одной серии между собой объем пятен на дорожке с конструкцией, содержавши трейлер ранних генов вируса SV40, принимали за единицу. Это позволяло вычислить эффективность экспрессии каждого вектора относительно выбранного стандарта для каждой из серий векторов (см Таблицу 4Ц

Данные, приведенные в Таблице 4, свидетельствуют о сходстве меаду уровнями экспрессии конструкций с различными 3'-концевыми частями гена bGH. Деления концевых 314 н.п. не оказывала существенного влияния на экспрессия cat-гена. Это согласуется с литературными данными I Pas lean L.et al.,1957), где авторы получили похожие результаты для разных трейлеров bGH, используя вектора с промоторами HSV LTE и цитомегаловируса.

Пфарр с соавторами установили, используя более точные системы анализа экспрессии, что замена 3'-концевой области ранних генов вируса SY40 на аналогичную область гена bGH усиливала экспрессии маркерного гена в 2-3 раза (Pfarr G.et al.,1966». В наших экспериментах аналогичная замена приводила к усилению экспрессии в 2.0-3.5 раза в случае с МТ-конструкцияии, и в 1.3- 1.75 раза в случае с HSY-конструкциями. Максимальный уровень экспрессии показала конструкция с З'-концевои областью Х-гена вируса гепатита В человека, объем пятен которой превышал аналогичный у варианта с трейлером вируса SY40 в 6-8 раз. Эти цифры устойчиво воспроизводились в разных сериях опытое "CAT-Assay" и мы считаем, что общие тенденции прослеживаются достаточно четко и порядковые величины, полученные в наших опытах правильно отражают реальные процессы в клетке. Проведенный анализ также подтвердил функциональную активность всех регуляторных элементов, используемых в составе векторов и, таким образом, способность созданных векторов к экспрессии чужеродного генетического материала.

Таким образом, получение рекомбинантных молекул с геном bGH проводилось в дальнейшем с учетом данных экспреср- анйиза "CAT-Assay". Конкретно это выразилось в отказе от замены в микроинъецируемой конструкции с геном гормона ' роста быка 3'-нетранслируеыои области хромосомного гена bGH на какой-либо другой трейлер.

„ * 1 J —■>•■ , - ; '""•^■•¿t: iL*s cl -Щк^ *** u

< ф \,

• Г »! f- yj

Определение CAT - активности экстрактов клеток,

трансформированных векторами серии рМТ.

Очередность нанесения: I дорожка - вектор рМТК4 cat, II дорожа --вектор pMTk5 cat, III дорожка - вектор pMTkl cat, IV дорожа - контроль lнетрансфецированные клетки I, V дорожка - вектор pMTkT cat, VI дорожка -вектор pMTk2 cat, VII дорожка - Еектор.рМТкЗ cat, VIII до рожка-вектор pMTk6cat,IX дорожка -С -хлорамфеникол.

V п

i и * ffllv v'vrtfjf

11

Рис.4 Определение САТ-активности экстрактов клеток

дородтса -"вектор pRSVkl. II - Еектор PRSVK2, III - вектор pESYK3, IV - вектор pRSVkS, V-вектор pRSYK7,VI- контроль (нетрансфецированные клетки), VII - дорожка - С -хлорамфенико.л.'

3- /С 3.1

ТАБЛИЦА '4.

Сравнение относительной эффективности экспрессии векторов.

I--5

< Название < Эффективность

i. 5

j вектора j в усл.ед.

Название \ Эффективность

вектора

в усл.ед.

pMTklcat <

pMTK2cat \ <

pMTX3cat |

pMTk4cat i

pMTk5cat |

pMTKScat ^

pMTk7cat |

0.50 3.50 2.85 2.06 2.96~ 1 .00 8.85

$ pKSmcat \

I pHSVk2cat i

< • <

j pfiSVk3cat \

% pRSVk6cat <

i pR5Vk7cat <

0.60

1.39 1.75 1.00

6.40

3.Получение трансгенных рыб.

Одним из привлекательных объектов для проведения генетической трансформации являются рыбы в силу изученности эмбриогенеза

и сравнительной простоты методических подходов.-

} > - ^

Целью нашей работы было:

- в-гкчгмгас iroaw гснстичсскои1' информации" в-' геном* рыб.

- выявление экспрессии чужеродных генов в рыбах.

В работе использовалась конструкция с геном поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Микроинъекции проводились в оплодотворенные яйцеклетки зеркального карпа. Работа выполнялась совместно с сотрудниками ИБР АН СССР на" базе рыбоводческого хозяйства г.Дмитрова.

Исследования в этой области начали проводиться еще дс проверки эффективности экспрессии различных конструкций методок "CAT-Assay", поэтому е экспериментах использовался один из первыэ

рекомбинантных векторов рМ5НВ5 (Рис.5а(.Данный вектор включал в себя МТ-проыотор длиной 650 н.п., З'-концевую область'ранних генов вируса гУ-40 длиной 2650 н.п. с донорным и акцепторным участками сплайсинга и участком для правильного полиаденилирования, последовательность гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека (штамм ауий) длиной 2300 н.п., кодирующую зрелый белок НБ5А£, а также область рге-32 белка. Ген изолировали с помощью рестриктазы Вд1П и выделенный фрагмент с геном (координаты 1986-2333) вводили в состав векторной• конструкции р}ЯЗУ.

В результате. 200 микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки карпов было получено 64 рыбы. После анализа сыворотки крови рыб удалось выявить б карпов с детектируемым количеством чужеродного белка. Блот-анализ показал,что только 3 карпа (И 34, N 75 и N 84) содержали ген в интегрированном состоянии. На Рис.56 представлен более детальный анализ ДНК этих рыб после обработки рестриктазами ВашН1„ Рг« и ЕсоН1 + Рэи.

Судя по автографу, у карпа N 75 рекомбинантная конструкция не подверглась каким-либо значительным перестройкам при интеграции в геном. Копии генов, очевидно,соединялись тандемно в ориентации "голова к хвосту".

При анализе ДНК карпа N В4 с помошьюрестриктазы выявилась только одна полоса длиной 2800 н.п. вместо двух, ожидаемых с учетом рестриктноя карты. Вероятнее всего произошла интеграция 1 копии рекомбинактной конструкции, вследствие чего произошло удлинение пограничных фрагментов вектора за счет областей эндогенной ДНК, фланкирующих сайт интеграции.

При рестриктном анализе ДНК карпа N 34 на автографе' выявляются дополнительные полосы. Существует два возможных объяснения этого результата: либо произошла перестройка ДНК внутри самого вектора, либо нарушен порядок встраивания "голова к хвосту".

При долгих экспозициях во всех трех образцах _ ДНК просвечиваются слабые полосы, .различающиеся по размеру, и, по-видимому, соответствующие сигналам от крайних членов тандема. Следует отметить, что в случае блот-анализа нерестрицированной ДНК радиоактивный сигнал обнаруживается на уровне пробега клеточной ДНК. Все эти факты позволяют с большой вероятностью предполагать, что рекомбинантная ДНК встроилась в геном рыб.

В таблице 5 приведены результаты исследований карпов на

5' 3'

М ИИ I т HI I ; .

МТ HBsAg SV40 pBR322

Рис.5а Физическая карта плазмиды pSMHB5. Буквами обозначены сайты рестриктаз: В - ВатпН|, Н - Hind III, К - Kpn I, Р - Pst I, 8 - EcoR I, X - Xba I.

" " mr-1««er «№-•«»* jStttS"

12. 5 Ч 5 б 7 I 9 1011 11 «л

Рис.50 Блот-анализ интеграции гена НВЭАг в геном трансгенки карпов. Порядок нанесения рестрицировгЕнной ДНК на дорожи: 1 ДНК исходной векторной плазмиды рМЗНВЭ, обработанная рестриктазо рзи е количестве, соответствующем 3-м копиям на геном; 1 - т же, количество 1 копия на геном; 3-5 - ДНК траНсгенного карпа N 3 ( 3 - ДНК в количестве 10 мкг, обработанная рестриктазой Рв11 4 - то же.рестриктазы ЕсоЕЦ + Ре11; 5 - то же, рестриктаза ВатН1) б - б - повторный анализ при новом выделении ДНК из плавника карпа N 34 (количество ДНК на каждой дорожке 1мкг, порядо нанесения проб сохраняется); 9 - 11 - ДНК трансгенного карпа N £ (10 мкг ДНК, порядок нанесения тот же); .12 - 14 - ДЬ трансгенного карпа N 75' (10 мкг ДНК, порядок нанесения тот же).

наличие интеграции и экспрессии гена HESAg.

ТАЕЛКйА 5.

Экспрессия MT-HBSAg в полученных карпах.

i N рыбы <

Копииность

Уровень экспрессии (нг/мл)

34 75 64

27 23 51

5 • 20

4

4 4

4

.30 20

Как следует из таблицы, у карпов с номерами N 23, N 27 и N 51 не было обнаружено интеграции рекомбинантноя конструкции в состав хромосом, хотя значительнее количество чужеродного оелка присутствовало в сыворотке крови N 23 и N 51. Этот факт можно объяснить'недостаточной чувствительностью метода' блот-гибридизации в случае встраивания трансгена не во всё клетки организма. С другой стороны, у животного-мозаика интеграция трансгена может произойти неравномерно, так что векторная ДНК может отсутствовать в клетках плавника, но может также обнаружиться в половых клетках. Разрешить эту проблему может только исследование ДНК потомков полученных рыб.

Такое исследование"было проведено с потомками карпа N 51. Работа проводилась совместно с сотрудниками группы трансгенеза Института биологии развития АН СССР. Из нескольких тысяч мальков, полученных от этого карпа, для анализа было выборочно взято 10 штук. ДНК, выделенная из этих мальков была проанализирована на предмет наличия трансгена методом PCR- реакции. Анализ выявил две трансгенных рыбы, у которых произошла интеграция конструкции в состав хромосомной ДНК. Очевидно, карп N 51 являлся мозаиком.

4. Получение трансгенных кроликов.

4.1. Выявление экспрессии продукта гена 1асг в трансгенных

эмбрионах кроликов.

Для выявления оптимального" Бремени микроинъекций чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зиготы„кролика нами совместно с сотрудниками ВИЖ ВАСХНИЛ была выполнена следующая работа: рекомбинантная конструкция рй5УкЗ 1асг (Рис.б) с репортерним геном 0-галактозидазы вводилась в оплодотворенные яйцеклетки кроликов в количестве 400-800 копии на клетку , после чего эмбрионы культивировались в течении 24 и 45 часов, а затем обрабатывались Х-Са1 на предмет выявления экспрессии бталактозидазы. '

В опыте было задеяствованно 18 крольчих - доноров породы советская шиншилла, от которых было .получено 156 зигот, из них 151 была микроинъецирована. Инъецирование зигот раствором ДНК. проводили в два срока - 14.5-17 часов (I группа опытов) и 17-19,5 часов (II группа опытов)'после осеменения доноров. В случае, когда микроинъецированные зиготы культивировали в течении 24 часов , ни один из 61 эмбриона, находящихся на 2-х, 4-х и восьми-клеточной стадиях не показал выявляемую активность гена 1ас-1'. ■

При увеличении времени культивирования

микроинъецированных геном 1асг зигот до 46 часов среди 46 эмбрионов первой опытной группы, развившихся до б-1б-ти клеточной стадии, <?ыло выявлено три эмбриона, в бластомерах которых был обнаружен продукт экспрессии гена 1ас-2(см.Табл.6).

После 43-часовой инкубации два эмбриона, состоящие, из 8~ми и 12-ти бластомеров имели всего по одному окрашенному бластомеру .Третий эмбрион представлял из себя 1б-ти -клеточную морулу в которой ген экспрессировался в 7 бластомерах. Причем два бластомера после окраски имели плотный темно-синий цвет (эти бластомеры были выявлены .через три часа инкубации в растворе Х-га1), а у оставшихся пяти краситель располагался кластерами в виде групп гранул размером 10 мкм.

Одним из возможных объяснений наблюдаемого явления является дифференциальная транскрипционная активность генома кроликов в различных бластомерах. Другими словами, район интеграции мозкет оказаться "открытым" для процессов транскрипции на стадии 16-ти клеток не во всех бластомерах. Характер экспрессии

Рис.6 Физическая карта рекомбинантноя плазмиды pRSVk3 lacZ. Буквами обозначены сайты рестриктаз: В - BamH I, С -Cla I,Pv - Pvu II. Н - Hind III, R I - EcoR I. H V -EcoR V, S - Sac I.

ТАБЛИЦА 6

Анализ экспрессии fi-галактозидазы в ранних эмбрионах кроликов.

Культивация 24 часа s Культивация 46 часов

Инъекции j Инъекции группы I > группы II

Проинъецировакно i I

61 \ 46 \ 44

зигот > s

< Обнаружена ?

i 0 |

< экспрессия ,,

з третьем эмбрионе говорят о разком количестве 0-галактозидаза, накопленном в отдельных сластомерах. Это тоже может быть следствием асинхронности транскрипции.

Время, выбранное нами для извлечения зигот 114,5-17 часор и 17-13.5 часов после спаривания), соответствовало по данным Сцолоци 5^о11ос1 Б., 1956) первому раунду репликации ДНК эмбрионального генома ¡группа 1> и фазе С клеточного цикла (группа II) соответственно. Бее трансгенные эмбрионы были получены нами при исследовании зигот I опытной группы. Очевидно, что процесс репликации ДНК в зиготе млекопитающих является одним из условия, способствующих интеграции экзогенной ДНК 2 геном животных.

Таким образом, определяемая по эффекту экспрессии интеграция гена 1ас~2 наблюдалась нами при введении его в З-фазе, на ранней стадии формирования пронуклеуса зиготы кролика.

4.2.Получение трансгенных кроликов с геном

гормона роста крупного рогатого скота.

Получение трансгенных жиеотных целесообразно не только для изучения природы генетического феномена трансгенеза, но и для направленного изменения наследственных признаков. У сельскохозяйственных животных этот биологический эффект может повысить продуктивность и племенные качества. Получение трансгенных кроликов с геном гормона роста быка представляется с этой точки зрения весьма интересным. Для микроинъекций использовались линеаризованные конструкции рМГЬСН ^ и рМТЬСН^^ с МТ-проыотором и полноценной хромосомной копией гена гормона роста быка, лишенные плазмидных последовательностей (Рис.7а и 761.

Методом блот-анализа по Саузерну среди родившихся 28-ми крольчат было выявлено животное (М 80, самка), в геном которого включилось 5-10 копий конструкции рМТЬСНсЪ. Подробный анализ ДНК трансгенной особи при помощи различных рестриктаз позеолил установить, что чужеродная ДНК интегрировалась в. в геном без каких-либо заметных перестроек, причем отдельные копии соединились при интеграции в ориентации "голова к хвосту" (Рис.8а). Блот-анализ ДНК, выделенной из различных органов этого кролика,

тчиуо гтш<"ача п миг'йЬ'гилгтк роогаиилг'п г,оуогм?;ол1гпгп иптопмя пя м

гкиишии^ш и 1 ши! ^ыпиои VI

\

отсутствие моззицизма (Рис.061.

Трансгенная по гену гормона роста крупного рогатого

Ряс.Та Физическая карта плазмиды pMTbGHch.

Рис. Тб Физическая карта плазмиды pMTbGH

Буквами обозначены следующие рестрикционные сайты: В - ВашН I, К - Kpn I, Н - Hind III, Р - Pst I, Pv -Pvj II я - EccR I S - Sac I.

ГТ"

гзп т$

шч •

-к-" И*

■V

i г 3 4$ ь 7

Рис.Ва Гибридизационныя анализ интеграции гена соматотропина быка в ДНК из ткани уха трансгенной крольчихи N 60: 1 - обработка рестриктазой Pstl, 2 - обработка рестрнктазоя PvuII, 3 -совместная обработка рестриктазами BamHI и Kpnl, 4 - обработка рестриктазой EamHI, 5 - дорожка немеченных маркеров (указаны слева), ДНК фага Л, обработана« BstEII, б - совместная обработка рестриктазами ЕсоНХ и Hlndlll. 7 - обработка вестсиктячл« нсШ.

ш-

USC -

tiso

1 2 3 У 2 6 V

; > \-1wJ s > т j

Рис.66 Гибридизационныя анализ интеграции ген;

сом&тотропина быка в ДНК из внутренних органов трансгенно; крольчихи N во (обработка рестриктазой Рз1Л) : 1 - ДНК головног мозга, 2 - ДНК ткани уха, 3 - ДНК клеток легкого, 4 - ДНК клето сердца, Э - ДНК клеток печейи, б - ДНК,клеток кишечного эпителия 7 - ДНК клеток почки, а - 9 - ДНК из ткани ушей контрольны кроликов, 10 . - ДНК крупного рогатого скота.- (положительны контроль I.

скота крольчиха N 80 родилась в помете из 6-ти крольчат и визуально была, самой крупной. Существенная разница в живой массе крольчихи N 80 с однопометными животными ( 23.3-34.8 % ) устойчиво сохранялась на протяжении всего 145-суточного периода исследования. В отличие от нетрансгенных крольчат описываемого помета крольчиха N 80 характеризовалась большим размахом изменчивости среднесуточного прироста и наибольшими efo величинами (до 40 г) по отдельным 10-суточным периодам исследования.

При исследовании экспрессии гена bGH у трансгенной крольчихи, выполненном на 74-е сутки после рождения, обнаружена низкая концентрация (0.3 нг/мл) соматотропина быка в крови животного. Это достаточно низкий уровень, но следует учесть, что экспрессия соматотропина -происходит в целостном организме, реагирующем в ответ на изменения концентрации гормона в крови, и что возраст кролика в момент исследования сыворотки крови оказали свое влияние на результаты опыта. С другой стороны, из ткани легкого трансгенной крольчихи была получена перевиваемая культура клеток, экспрессируюшая в течение 5-ти пассажей гормон роста быка с максимальным уровнем 7 нг/мл (Мусиенко М.И.и др.,1991). Это позволяет нам утверждать, что конструкция pMTbGHcft является функционально активной, будучи интегрированной в геном трансгенной крольчихи N 60.

Описанный случай, по-видимому, является первым исследованным примером усиленного роста кролика, полностью трансгенного по гену гормона роста крупного рогатого скота.

В результате проведенных микроинъекций конструкции pMTbGHatt из 25 родившихся крольчат трое оказались трансгенными. Подробный блот-аналиэ с применением рестрикционных эндонуклеаз Pst I, Pvu II и БашН I позволил охарактеризовать интеграцию чужеродной ДНК в каждом случае (Рис.Эа).

Установлено, что в геном кролика N 5 тандемно встроилось 4-6 копий рекомбинантной конструкции, не претерпевших каких-либо заметных перестроек. В геноме кролика N 7 содержится единственная копия рекомбинантной конструкции на диплоидный геном, претерпевшая перестройку в структурной области гена bGH, и, возможно, частично 2 5'— про моторной области rsna »'"таллстпонеина

Анализ ДНК, выделенной из различных тканей трансгенных кроликов N 5 и N 7 продемонстрировал идентичную картину

НП{-

рис 9а Гибридизационный анализ интеграции гена

"оиатотропина быка в ДНК, выделенной из ушей трансгенных кроликов. Порядок нанесения образцов ДНК-. обработанных различными гргтпиктпами- 1 - ДНК кролика Н 5, обработка Рв«, 2 - ДНК N обработка Р^И. 3 - ДНК кролика N 5 обработка ВатН!, 4 и 7 - ДНК кролика N 7. обработка Рз«. 5 ; ДНК кролика N 7. обработка РчиП. б - ДНК кролика И Т, обработка ВакН1, 6 и 11 ДНК кролика n 28, обработка рб«, 9 и 12 - ДНК кролика_ м обработка РуиХ1, 10 - ДНК кролика N 28, обработка. ВаШ. бака, расщепленная Рб« (положительный контроль).

13

28, днк

' ш ■

50-

;1Г ' Ь

'а. 1»',..

1 I 3 Ч 5

Рис.96 Гибридизацио'нный анализ интеграции конструк - ци: рМТЬСН а^ в ДНК из тканей ушей транс генных кролико (обработка реетриктазоя Рг11) : Г- ДНК бака (положительны контроль), 2 - ДНК трансгенного кролика N 3, (нерестрицированна хромосомная ДНК), 3 - ДНК трансгенного кролика N 5, 4 - ДН трансгенного кролика N 7, 5 - ДНК трансгенного кролика N ! нерестрицированная хромосомная ДНК), На остальные дорожк нанесены образцы ДНК нетрансгенных кроликов.

гибридизации, что свидетельствует со отсутствии мозаичной интеграция трансгена у полученных животных

В геноме третьего трансгенного кролика N 23 содержится одна копия введенной рекомбинантной конструкции, не претерпевшая структурных изменений. Анализ ДНК, выделенной из тканей правого и левого ушей, дал идентичные результаты.

Блот-анализ нерестрицированной хромосомной .ДНК трансгенных кроликов показал наличие сигнала во фракции клеточной ДНК, что подтверждает интеграцию трансгена в геном животных Рис.90).

По окончании периода полового созревания у трансгенного, кролика N 28 стали проявляться признаки акромегалии (разрастание пластинчатых костей под действием гормона роста). Мы предполагаем, что это связано с экспрессией экзогенного гормона роста быка и его последующей секрецией в кровь животного. Акромегалия у полученного трансгенного кролика N 28 характеризуется крупными размерами тела, измененной формой морды (в результате разрастания лицевых костей черепа) и удлиненными стопами лап. Кроме того, у кролика N 28 обнаружено пониженное содержание жира. Ранее такой эффект наблюдался у траисгенных свиней с интегрированным геном ЬСН I Напшкг Н.Е.е! а1., 19851)). Для кроликов же это первый случай такого мощного влияния экспрессии чужеродного гена ЬСН на общий обмен веществ и фенотип животного.

ВЫВОДЫ

1. Получены две серии векторных кассет с МТ- и Н5У-промоторами, предназначенных для экспрессии чужеродных генов в эукариотических клетках. Кавдый вектор представляет из себя плазмиду риС19, в полилинкер которой надлежащим образом встроены промоторная и трейлерная части. Уникальный сайт ВатН1, расположенный между ^ими, позволяет клонировать любой ген бактериальной или эукаряотической природы с целью его экспрессии в клетках млекопитаощих. Внутри каждой серии векторов рекомбинантные молекулы отличались лишь природой своих 3'-концевых областей,

I

несущих сигнала для правильного полиаденилирования и в некоторых случаях яоноркыя и акцепторный сайта, необходимые для сплайсинга.

2. Методом "САТ-Агзау" конструкции проверялись на способность эффективно экспрессировать чужеродные гены в клетках

млекопмташих. Разница в количестве синтезируемого белка была обусловлена, как мы предполагаем, неодинаковым временем полужизни молекул ыРНК, которое зависело от природы их 3'- нетранслируемоя области. Кроме того, мы убедились в принципиальной пригодности созданных векторов для опытов.связанных с экспрессией генов в трансгенных животных. Полученные результаты позволили нам остановить свой выбор на векторах рМТкЗ и pHSYk3, имевших в качестве трейлера 3'- концевую область гена bGH с донорным и акцепторным участками сплайсинга.

3. Получены трансгенные карпы, экспрессируюшие поверхностный антиген вируса гепатита В человека. Из 64 вылупившихся мальков шесть имели детектируемое количество чужеродного белка в крови, у троих из 6-ти подтвержден факт интеграции рекомбинантной конструк ции. Количество копий трансгена составляет от 1 до- 20. Изучение потомства одного из карпов-мозаиков позволило выявить нескольких трансгенных мальков методом PCB- реакции. В настоящее время изучение потомства продолжается.

4. С помощью микроинъекций в зиготы кроликов ДНК вектора pRSVk3 lacZ с маркерным геном fi-галактозидазы и ^последующего обнаружения трансгенных ранних эмбрионов по соответствующей цветной реакции показано,что наиболее оптимальным временем для инъекций является ранняя 3-$аза(соответствует 4-7 часам после оплодотворения яйцеклетки!. Обнаружена также специфичность экспрессии интегрированной конструкции в процессе раннего развития предимплантационних эмбрионоЕ.

5. Получены трансгенные кролики: 1 с конструкцией pMTbGHch 110-15 копий на диплоидный геном) и 3 с конструкцией pMTbGHatt, включающей att-участок прикрепления к ядерному матриксу с гиперчувствительным сайтом к ДНКазе I <1-5 копий на геном). Один кролик из вышеупомянутых трех содержит перестроенный трансген. По данным блот-аналйза перестройка произошла в середине хромосомного гена bGH. У второго кролика обнаружены признаки акромегалии, увеличение веса костей конечностей и пониженное содержание жира. В настоящее время проводится изучение потомкое данного кролика.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ас ТЕМИ ДИССЕРТАЦИИ.

1. делении А. Е., Колесников Б. А., Тихомиров A.B., Зеленина. И. А.. Еармиицев Е.А., Заданов А.Б., Грашук М.А., Городецкий С.И., Алимов A.A., Казанский A.B. Трансфекция клетск .животных с помощью высокоскоростной механической инъекции ДНК. -1989. Тезисы ссобиенил., Симпозиум СССР-США. "Структура •зукариотического генома и регуляция его экспрессии".

2. Барминцев В.А., Жаданов А.Б., Зеленина A.B., Грашук М.А., Георгиев Г.П. Сообщение "Грансгенные рыбы. Получение и анализ." Материалы 3-го совещания координаторов стран -членов СЭЕ г.о программе 5.5.6.1. КП АТП СЭВ. (Подготовка специалистов в области биотехнологии сельского хозяйства.), 1939, Прага. 2. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Семенова В.А., Моргунов С.П., Смирнов O.K., Екиколспсв Г.Н., Узданов А.Б., Базылев С.Е., Гоголевский П. А. Фенотипическия эффект трансгенности по гену гормона роста крупного рогатого скота у кролика. // Доклада ВАСХНИЛ , 1990, N б, стр.32-36.

4. Гольдман И..П., Семенова В.А., Жаданов А.Б., Морзунов С.П., Базылев С.Е., Гоголевскии П.А. Фенотипическия эффект экспрессии гена гормона роста крупного рогатого скота у кролика. // Тез. докл. Х-го Всесоюзного симпозиума "Структура и свойства клеточного ядра"., Гродно, 1990, стр.41.

5. Гоголевский П.А., Гольдман И.Л., Гусев В.В., Жздзное А.Б. и др. Исследование экспрессии гена 0-галактозидазы в трансгенных ранних эмбрионах кроликов. // Доклады ВАСХНИЛ, 1991,.N 10, стр. зг - 43.

6. Гоголевский' П.А, Гольдман И.Л., Жаданов А.Б., Морзуног С.П., Кленовицкии П.М., Эрнст Л.К.

Изучение возможности использования рестриктных эндонуклеаз для повышения частоты интеграции рекомбинантной ДНК в геном животных. '/ Доклады ВАСХНИЛ, 1991, М 12, стр.24-26.