Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ трансгенных растений вида Solanum tuberosum, устойчивых к Х-вирусу картофеля

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ трансгенных растений вида Solanum tuberosum, устойчивых к Х-вирусу картофеля"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕКЕТИМ

На правах рукописи

ГЛАГОЦКАЯ Татьяна Цезаревне

УДК 675: 577. 21: 678. 85/. 86

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯ ВИДА Б01АМЦМ ТЦВЕК05иМ, УСТОЙЧИВЫХ К Х-ВИРУСУ КАРТОФЕЛЯ.

03. 00. 03 Мзлекулярная биология .

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1902 г.

Работа выполнена в отделе клеточной селекции Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины

Научный руководитель - член-корреспондент УААН, доктор биологических ка/к Сидоров В. А. »

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Малюта С. С. - кандидат биологических наук Стехин И. Е

Ведущая организация - Киевский государтввнньй! университет

■ Ш» »« 41 шиоЧсипи

л?

Защита состоится " ^ "—-1ЭЭ£: г. в -^-час

на заседании специализированного совета Д 016.11.01. Института .молекулярной биолсгии ,и генетики АН Украины по адресу: £52627, г. Киев, уд. Забодатного, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

/Цтореферат разослан . 19.92 г

специ^эрэдаедого совета ^ кардид§| §ир^грйс|шх наук

■/¡укэд

- 1 -

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Поиск мер запеты растения от вирусной инфекции привел к разработке технологии предусматривающей инженерию растений, которые сами синтезируют эндогенный продукт, инги-бируюций развитие вируса в клетках хозяйка. Практический интерес в этом плане представляют сельскохозяйственные растения, в частности картофель.

Трад;щионные способы защиты рр.стений о? фитопатогенкых вирусов, включающм различные агротехнические мероприятия, селекцию растений, ЕыращиЕанпе безнируснсго посадочного материала, применение химических веществ, антибиотиков, вещ-гств биологического происхождения не всегда приводят к желаем: тм результатам и имеют ограничения в использовании. Тоже молно сказать и о методе перекрестной заняты растений от вирусов.

В настоящее время наиболее эффективным способом защиты растений от Еирусного поражения путем переноса чуигродных генов в растения является экспрессия гена белка оболочки различных вирусов в клетках растений. Хотя механизмы возникновения ви-русоустойчивости у таких растений еще недостаточно изучены, однако, было показано, что этот признак стабилен и наследуется в последующих поколениях. Имеются литературные данные указывающие на достаточно эффективное использование для подавления зирусной инфекции у трансгенных растений антисмысловьх РНК гена белка оболочки вирусов. ■

Недостаточно пока еще изучено влияние на фитопатогенные вирусы как экзогенного так и эндогенного интерферона, что не позволяет сделать окончательный вывод о перспективности использования такого способа защиты растений от вирусной инфекции.

Данная работа связана с изучением влияния экспрессии гена белка оболочки Х-вируса картофеля в прямой и обратной ориентации относительно промотора, а также экспрессии гена человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона на вируссустойчивость трансгенных растений картофеля к Х-вирусу картофеля.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение трансгенных растений картофеля ( Ь'о1апии ЪиЬегозигс ) сортов Темп, Львовянка, Свлтанок, Еарезо с чужеродными гена:.с1 : а) геном белка оболочки Х-вируса картофеля в прнмой ¡: обратной ори-

евхации относительно промотора j б) геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона. Изучить влияние продуктов экспрессии данных генов на вирусоустойчивость трансгенных растений. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи :

1) подобрать условия трансформации и регенерации растений картофеля ;

2) осуществить перенос и экспрессию гена белка ободочки Х-вируса картофеля в прямой и обратной ориентации в растения картофеля сортов Темп, Свитанок, Зарево и Львовянка ;

3) осуществить перекос и экспрессию гена человеческого лейкоцитарного альфа-2 интнрферона в растения картофеля сорта Льво-вянка |

4) изучить свойства., вирусоустойчивости у полученных трансгенных растений картофеля к Х-вирусу картофеля ;

Б) провести анализ трансгенных растений картофеля в полевых условиях.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получены трансгенные растения Картофеля широко районированных сортов Темп« Свитанок, Зарево и Львовянка ( вида Solanum tuberosum ) с геном белка оболочки Х-вируса картофеля в прямой ориентации относительно 35S промотора и промотора гена акотенсина моркови ; с геном Седка оболочки Х-вируса картофеля в обратной ориентации относительно 35S промотора ) и с геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона под контролем 35S промотора и промотора гена акстенсина моркови.

Впервые получены трансгенные растения широко районированных сортов картофеле, устойчивых к аараяэнвю Х-вирусом, кртофеля с чужеродными генами белка оболочки Х-вируса картофеля и геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона. Наказано, что данные трансгенные растения в разной степени обладают устойчивостью К Х-вирусу картофеде;. Впервые продемонстрирована возможность защиты трансгенных, растений картофеля с геном белка оболочки Х-вируса Картофеля » обратной ориентации относительно промотора от поражения Х-рирусом картофеля при значительных инфекционных нагрузках.

Полученные трансгенные растения были проанализированы в полевых условиях. Показано, что урожайность трансгенных растений в среднем не ниже таковой исходных ^трансформированных растений картофеля соответствующих сортов.

Дании? результаты позволяют использовать созданные трансген-ныэ растения картофеля для получения новых сортов картофеля, устойчивых к вирусной инфекции.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции " Новые направления в биотехнологии г. Пушино, 1990 ; на I Всесоюзном симпозиуме " Новые направления биотехнологии растений г« Пупдано, 1991; на Международном конгрессе по культуре клеток и тканей, г. Амстердам, 1990; на Международном симпозиуме по протопластам, г. Уппсала, 1991; а также на научных семинарах отдела клеточной селекции Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Центра " Биоиняенерия " АН СССР О. А. Щульге и Р. 3. Гизатуллину, сотрудникам ИМВиГ АН Украины Т, В. Степаниииной и ЕII Терещенко, заведующему отдела фитопатогенных вирусов растений ШВ АН Украины И. С. П^рба-тенко, заведующему группой отдела вирусных и грибных болезней растений Укр. КИИ с/х микробиологии Н. Ы. Зарицкому, а также всем сотрудникам отдела клеточной селекции Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины ва большую йомоць, оказанную при выполнении работы.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введений, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 111 наименований. Работа изложена на ЮЗ страницах (¡¡авинописного текста и содержит 21 рйсуМок и 3 таблицы.

ИАТЁРИАЛЫ И LET ОДЫ.

Характеристика растительного материала и плазмидных векторов, {»сподьзувмьас н работах по трансформации. .

В работе был использован культурный тетраплоиднкй вид Solanum tiiboroäüsn, сортов: Зарево, Свитанок, Темп, Львозянка. Материал подучен На коллекций Украинского научно-исследовательского института картофельного хозяйства ( пос. Немешаеао Киевской обл. ) и Белорусского научно-исследовательского института картофельного и Плодоовощного хозяйства ( пос. Самохваловичи Шнекой обл. ).

Трансформацию растений картофеля проводили используя плагчи-ду Bin 19 ( Eevan., 1984 ) с клонированным фрагментом кДНК вирусного генома, содержащим ген белка оболочки ХЕК с полной З'-нетранслируемой областью включая поли-(А17) и 54 нуклеотидами

б'-негрансдируемого района. 3 качестве регуляторных элементов использовали промотор и терминатор 3SS РНН ЕМЦК в конструкциях с прямой и обратной ориентацией гена относительно промотора ( Щуль-га., 1Э91 ) и промотор гена экстенсина моркови в конструкции с. прямой ориентацией гена ( Ггзатуллкн. , 1DS0 ).

Для переноса гена челсвечэского лейкоцитарного альфа-2 интерферона в растения использовали тот же плаэмлдный вектор Bin 19 с клонированным геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона под контролем 25S промотора и промотора гена экстенсина моркови ( Гизатуллин., 1990 ).

Все плаэмидные конструкции переносили в штамм Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, который в дальнейшем использовался для трансформации растений картофеля.

• Плазмидные конструкции Сули любезно предоставлены сотрудниками Центра " Еиоинженерия " О. А. Щульгой и Р. 3. Гизатуллиным.

Трансформация картофеля.

Трансформацию картофгля проводили по упрошенной схеме с модификациями путем кокультивирования стеблевых сегментов растений картофеля с A. tumefaciens, используя за основу метод, предложенный М.Де Елок ( De Block, 1988 ).

Анализ ядерной ДНК, трансформированных растений.

Выделенную и очищэнную ДНК растений-регенерантов (Dellaporta et al. ,1983) анализировали на присутствие чужеродного гена методом блот-гибридизации по Сауеерну ( Southern, 1S75 ).

Анализ РНК трансгенных растений.

Определение мРНК гена белка оболочки в суммарном препарате РНК, выделенном из тканей трансгенных растений ( Verwoerd et al., 19S9 ) проводили, используя метод РНК-ДНК' блот-гибридизации ( Ыа-ниатис и др., 1934 ).

Определение белка ободочки Х-вируса картофеля а тканях трансгенных растений.

По описанной методике ( Hoekeira et al., 1989 ) из тканей трансгена/, растений получали суммарный белковый препарат. С последующей стадией иммунобдот-анализа белок оболочки в белковом экстракте тестировали кроличьей антисывороткой.

Определение человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона в тканях трансгенных растений.

В гомогенате тканей трансформированных растений картофеля интерферон был определен стандартным иммунэферыэнтным методом

( Tijssen, 1985 ). Мышные моноклональные антитела к альфа-2 интерферону связанные с Сета-галактоэидаэой Е. col i были любезно предоставлены Терещенко М.И. ( Отдел регуляторных механизмов клетки ШБ АН Украины ).

Цитогенетический анализ.

Препараты готовили в соответствии с методами, предложенными А. Мурас и др. ( Mouras et al., 1987 ), окрашивали 0,3 Т.-ньгм красителем Гимаа.

Определение инфекционности экстрактов иэ листьев трансгенных растений на индикаторном растении,

В определении использовали киевский штамм ХВК ( Шедудько И др., 1967 ) и индикаторное растение Gomphrena globosa.

ХВК размножали на растениях дурмана Datura stramonium L..

Определение количества вирусных частиц в тканях,инокулкро-ванных вирусом растений.

Уровень накопления вирусного антигена в опытных И контрольных растениях определяли с помочью иммуноферментного метода ( Clark, Adonis, 1977 ). Для этой цели использовали готовые имму-ноферментные диагностикуш ( Научно-производственное объединение по картофелеводству, пос. Корнеево, Московская обл. ). Оценку результатов проводили с помощью фотометра ИФКО-2 ( СССР ) при длина волны 490 нм.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Шдбор условий трансформации и регенерации растений картофеля.

Были опробованы два метода генетической трансформации. Шрама базировался на использовании синергического действия хлорида 1&ГН1Ш и ПЭГ при переносе чужэ родной ДНК в протопласты картофеля ( Hesrrutiu 0t al., 1987 ).

Второй Методический путь - получить ' трансгеннда растения, Используя природную систему переноса генов A. turneГасtens ( De Block, 1989 ). Этот метод стал базовым при проведении данной работы. Селекции взли на средах, содержатих канамйцин. Концентрацию антибиотика определяли для каждого сорта. Кокультивирование с аг-робактерйями проводили, используя листья и стеблевые сегменты растений картофеля.

Цитогенетический анализ показал, что большинство морфологически нормальных форм растений-регеяерантов имеет типичный тет-раплоидный набор хромосом.

80 растений-регенерантов с нормальной морфологией нами было отобрано для дальнейших молекулярнобиологических исследований,

2. Анализ интеграции чужеродных генов белка оболочки ХВК и альфа-2 интерферона в растения картофеля.

Среди 80 линий растений, регенерировавших из к?ллусных колоний при селективном давлении канамицина, необходимо было отобрать те, которые несли желаемый ген, т.е. ген БО или ген альфа-2 интерферона.

Чтобы проверить факт интеграции чужеродных геноз была проведена Слот-гибридизация яДНК 71 линии растений, трансформированных геном БО ХВК ( рис. 1 ). Ген БО присутствовал лишь у 28 растений картофеля. Это были 17 линий сорта Львовянка : Л 1/1 j Л 6/1 ; Я 1Б/1 j Л 21/1 ; Л 22/1 ; Л 23/1 ; Л 24/1 j Л 1/15 ; Л 3/16 ; ,1.4/18 ; Л 6/15 ; Л 7/16j Л 8/15 ; Л 0/16 ; Л 10/15 ; Л 12/15; Л 113/15. Три линии сорта Темт Т 3/1 j Т 4/1 j Т 1/15. Три линии сорта Зарево : 3 1/1 j 3 2/1 j 3 Q/1. Две линии сорта Свитанок : С 1/1 ; С 3/1. Индексация после наклонной черты означают в случае 1, что растение несет ген БО в прямой ориентации относительно 35S промотора. Цифрой 15, 16 после наклонной чэрты обозначены растения, имеющие ген £0 в обратной ориентации. Выли отобраны три линии сорта Львовянка- а геном ВО в смысловой ориентации относительно промотора гена экстенсина моркови ( Л GP/2} Л GP/lQj Л Gp/18). Ген альфа-2 интерферона был идентифицирован у семи из девяти растений-регенерантов, трансформированных геном альфа-2 интерферона. Линии растений-copia Львовянка о геном'альфа-2 интерферона под контролем 35S промотора обозначены, как JU 1/65) Л1 11/56; Л! 12/65, Л1 15/55,а под контролем промотора гена экстенсвда моркови, как Л1 1/36 } Л1 a/as ;*Л1 ie/зв.. По результатам блот-гиб-ридиаации ДНК трацсгенных растений, количество копий гена БО ХВК составляло в среднем одну-две на геном растений, яДНК растений, транформированных геном альфа-2 интерферона, содержала насколько копий, интегрированного гена.

р. 1, Сравнительный характеристика уровня транскрипции гена БО JCgK £ прямой и обратной ориентации относительно 35S рроиотора.

СледувдиВ ахал в изучении неведения гена £0 ХВК в трансгенных растениях вкдачал анализ транскрипции этого чужеродного гена. Суммарный препарат мРНК был выделен и охарактеризован у тринадцати линий растений картофеля ( рис. 2 ). Обнаружилось , что ген БО ЯЗЯ не транскрибируется в растениях, относящихся к линиям Т 4/1 ,

' * * * > 0 f I I 10 _t*

Рис. 1. Влот-гибридизационньй анализ интеграции гена ВО ХВК в яДНК трансформированных растений картофеля. 1,2- положительный контроль ( Eco RI-фрагмент, 0,1 и 0,05 мкг соответственно ). Препарат суммарной ДНК ( 10 мкг ), обработанной Eco RI из растений разных линий: 3, 4 - сорта Зарево; 5, ?, 0, 10, 11 - сорта Львовянка; В - сорта Свитанок; 8 - сорта Теш. 12 - препарат суммарной ДНК ( 10 мкг ) из нетрансформировайных растений картофеля сорта Львовянка.

«I» •

. Рис. 2. Сравнительный анализ уровня транскрипции гена БО ХВК в прямой и обратной ориентации относительно 35S промотора в трансгенных растениях картофеля методом РНК - ДНК Слот-гибридизации. Препараты суммарной РНК : 1, 2, 3, 4 - из линий растений 3 2/1, С 3/1,Л 15/1, 3 1/1 (линии трансганных растений со смысловой ориентацией гена ВО ХВК ) ; 5, в, 7 - из линий рас.оний Л 10/15,Т 1/15,Л 12/15 (. линии трансганных растений с антисиыслевой ориентацией гена ЕО ХЬК ); S - ^трансформированных растений сорта Львовянка. Размеры маркеров длины указаны в тПО.

Л 13/16, Л 13/15. Уровень транскрипции гена БО ХВК растений остальных линий претерпевал значительные колебания. Как видно иэ рис. 2, уровень транскрипции гена БО в смысловой ориентации относительно 355 промотора превышает таковой в случае антисшсловой ориентации гена. Дальнейшие расчеты показывают, что уровень транскрипции гена БО ХВК у полученных трансгенных растений картофеля в случае антисмысловой ориентации гена, приблизительно в 6 раз ниже уровня транскрипции гена, наблюдаемого у растений с геном БО в смысловой ориентации.

2.2. Определение белка оболочки ХВК и альфа-2 интерферона £ трансгенных растениях картофеля.

Применяя метод иммуноблот-аналиаа, с использованием кроличьей антисыворотки к белку ободочки ХВК и ослиного антикроличьего нымунопероксидазного коньюгата, был проведен анализ синтеза белка оболочки в трансгенных растениях. В растениях с геном БО в антисмысловой ориентации белок оболочки ХВК не был обнаружен данным методом. Синтез белка оболочки изучали у растений 12 линий с прямой ориентацией гена относительно 35Б промотора ( рис. 3 ). Проведя соответствующие расчеты, мы определили, что процентное содержание белка оболочки ХВК в суммарном белковом экстракте, полученном из листьев трансгенных растений, - величина не постоянная для каждой отдельной линии. Полученные результаты приведены в таблице 1. Минимальное расчитанное значение, как видно из таблицы, соответствует 0,08 X, максимальное - 1,1 X.

Синтез альфа-2 интерферона в соответствующих трансгенных растениях определяли иммулоферментным анализом. Растения линии Л1 1/36 синтезировали интерферон, количество которого от об-щэго белка растений составляло 0,001 Ж, что по сравнению с растениями других линий соответствовало наивысшему уровню синтеза данного белка в тканях трансгенных растений картофеля.

Анализ устойчивости трансгенных растений картофеля Й вирусной инфекции ХВК.

Для Проверки на устойчивость к ХЕК были отобраны 11 трансгенных линий растений с прямой ориентацией гена БО ХВК относительно 35Б промотора, 13 линий с обратной ориентацией гена ВО ХВК относительно 35Б промотора, 3 линии с геном БО ХВК под контролем промотора гена акстенсина моркови , 4 линии с геном альфа-2 интарфзрона под контролем 35Б промотора и 3 линии с геном альфа-2 штерфэрона под контролем промотора гена акстенсина моркови .

г-аюЫ- :Г»53

в • ♦ < » » Г 1С 1С 1С

; —в» Г-ЙЭ

!

в • » « » ? «в «в <е

(

^— х." да-

С а t 1« М 1С 4«* Го

Рис, 3 . Определение белка оболочки ХВК в трансгенных растениях картофеля. Суммарный препарат белкового экстракта: 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12 - из линий растений Л 4/1, Л 22/1, Л а/1, С 3/1, Л 15/1, Л 21/1, 3 2/1, 3 6/1, Л 23/1, Т 3/1, Т 4/1, 3 1/1. С - белковый экстракт иа ^трансформированных растений картофеля. 26 кД фракция белка оболочки ХВК: 1с - 100 нг; 2с -260 нг; Зс " 500 нг.

Таблица 1. Уровень синтеза белка оболочки ХВК в трансгенных растениях картофеля.

N/M 1 2 3 4 5 6 7 8.9 10, 11 12

Линии трансгенных растений. к 4/1 Л 22/1 Л Л Л 3 0/1 16/1 21/1 23/1 1/1 э I 6/1 2/1 3/1 Т 4/1 С 3/1

Содержание ВО (X) В СБЭ. 0.15 1.1 0.32 0.6В Ö. б 0.33 0.13 0. 23 0. Бб 0.2 » ^ 0.08

ОБЭ - сбкдай Ct-.'äKOBkÜ ЗЙ^рэкг

• •»

. ' - 10 - ' Йонтроляш служили соответствующие растения-регенеранты исходных сортов. Исследуемые трансгенные линии растений испытывали на устойчивость к сильновируленткому штамму ХЕК посредством определения количества вирусных частиц в листьях инокулированных растений методом иммуноферментного анализа. С атой целью опытные и контрольные образцы инокудироваги очищенным ХВК в концентрации Е мкг/мл, и через 6, 12 и 16 дней после инокуляции определяли наличие вируса в экстракте из листьев. Опыты проводили с растениями, выращенными в оранжереи.

На рис. 4, 5 демонстрируются гистограммы накопления ХВК в трансгеяных растениях с геном ВО ХВК в прямой и обратной ориентации относительно 355 промотора. Средняя величина накопления ХШ исследуемых трансгеккьк растений с антисмысловой ориентацией гена БО составляла 16,9 % от уровня контроля, что в 2,3 раза выше среднего уровня накопления вирусных частиц в листьях трансгенкых растений со смысловой ориентацией гена при данной инфекционной нагрузке. НЬ и та, и другая полученные Средние величины характеризуют трансгенные растения картофеля , как устойчивые к поражению ХВК при инфекционной нагрузке 2 мкг/мл.

Проверка устойчивости трансгенных растений с геном БО ХШ под контролем промотора гена зкстенсина моркови при концентрация вируса в инокудюме 2 ют/мл показала, Что эти растения являются менее устойчивыми к ХВК по сравнению с растениями несущими ген ВС под контролем 355 промотора. Хотя окончательный вывод относительно вышеизложенного сделать трудно, поскольку мы исследовали липа три линии растений.

ТрансгеНныэ растения картофеля сорта ЛьвовйнКа с геном аль-фа-2 интерферона исследовали «а устойчивость' к вирусному поражению ХВК с той же инфекционной нагрузкой, что и все, подученные трансгенные растения. Средний уровень накопления вируса на 1Е день после инокуляции составил 50,8 \ от уровня контроля. Хотя полного поражения ХВК трансгеааьи растений ее наблюдалось, но пр» сравнении полученной средней величины с аналогичными данными иг анализа трансгенных растений с геном ВО ХВК, как в смысловой , так и в актисмысловой ориентации относительно 355 промотора, можно заключить, что акспрессия гена человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона не приводит к эффективному подавлению репродукции ХВК в полученных трансгенных растениях картофеля.

. О трансгенных растений были взяты для детального ксссяедова-

Ряо^ € , Ешадмазие. ХВК ( НД ) в тканях трансгенных растений с генои БО ХЕН;-.а пра^>3-,рр^^г&цди,ртяаеятряьяо 355 праштара, шшгошцювашшх вирусом через,- 5 •( , д.,1,, 12,^ В а ¿8.1 С ) дней после инокуляции при инфекционной нагрузке ,2 »кг/юквирйСА-^ ЩИШг^^г 1 *" контрольные растения; 2 - линия Л 24/1; 3 - Л 22/1; 4 -Л .4/}.;; 5 =г Л 6/1;-. 6 Т -4/1; 7 - Т 3/1; 8-3 2/1; 9 - 3 1/1; ИЗ - Сии 11 - -Щт

Рис. S » Шкоплвние 2BS ( N.Z ) в тканях траясгенных растений с геном БО ШГ в обратной ориентации относительно 35S промотора, инокулированных вирусом через 5 (А ), 12 ( В ) и 18 ( С ) дней после инокуляции при инфекционной нагрузка 2. мкг/мл вируса в инокудше . 1 - контрольные растения; 2 - линяя Л 13/15; 3 - Л 9/15; 4 - Л 4/15; 5 - Л 18/15; 6 - Л 8/15; 7 - Л Б/15; 8 -Л 11/15; 9 - Л 12/15; 10 - Л 1/15; 11 - Л 7/15; 12 - Л 10/15; 13 - Ж 13/16 ; 14 - Т 1/15.

ния накопления вирусных частиц в листьях при различной инфекционной нагрузке - 0,05 мкг/мл , 0,5 мкг/мл , 5 мкг/мл , 10 мкг/мл вирусных частиц в инокулюмэ. Для сравнения влияния экспрессии гена БО ХВК в прямой и обратной ориентации относительно 35S промотора на устойчивость растений к ХВК анализировали трансгенные растения четырех линий с геном БО ХВК в смысловой ориентации относительно 35S промотора - Л 6/1, 3 1/1, 3 2/1, С 3/1 и пяти линий с геном ВО ХЕК в обратной ориентации относительно 35S промотора - Л 12/15 , Л J/15, Л 7/15, Л 10/15, Т 1/15. Все 9 линий практически не накапливали вирус через 5, 12, 13 и 30 дней после инокуляции ХВК при инфекционной нагрузке 0,05 мкг/ил, 0,5 мкг/мл и 5 мкг/мл вируса в инокулюмэ. Высокое содержание вирусных частиц в инокуляме - 10 мкг/мл, пссле заражения трансгенных растений не вело к их полному поражению . Исключение в данном случае составила одна линия Л 1/15 с антисмысловой ориетациэй гена БО ХВК. Растения линии Л 7/15 , линии 3 2/1 и линии 3 1/1 проявляли большую чувствительность к вирусной инфекции , чем другие линии.

Из приведенных данных, следует, что трансгенные растения картофеля с геном БО ХВК проявляют устойчивость к ХВК в случае прямой и обратной ориентации гена относительно 35S промотора, и су-сэственных различий в накоплении вирусных частиц между ними не было обнаружено при малых и значительных инфекционных нагрузках на протяжении 30 дней после инокуляции.

Выли проведены эксперименты по изучению накопления инфекционного ХВК в трансгенных'растениях, способного к дальнейшему инфицированию растений. У семи линий Л 1/15, Л 7/15, Л 6/1, Л 8/15, Л 6/15, 3 1/1, 1 1/15 определяли инфекционность экстрактов из листьев на индикаторном ратеиии G. globosa после инокуляции трансгенных растений вирусом в концентрации 2 мкг/мл. Максимальное накопление инфекционного вируса было обнаружено у линии Л 1/16 -42,6 X от уровня контроля. В среднем инфекционно'сть экстрактов не превышала..16 7. от уровня контроля на 30 день после инокуляции.

Оценка урожайности трансгенных линий картофеля в полевых условиях показала, что по сравнению с контрольными образцами, у 6 ( Л1 1/3S, Л 8/15, Л 6/15, Т 1/15, Т 3/1, С 1/1 ) из 33, получанных трансгенных ляний растений tкартофеля наблюдалось лсвышяиэ среднего веса одлЗней с одного .куста. У остальных линий этот показатель оказался либо на уроще .соответствующем растениям контрольных образцов либо значительно якзэ такового.

- 14 ~ ВЫВОДЫ

1. Подобраны условия перэйоса чужеродных генов в растения картофеля путем прямой трансформации протопластов и путем агро-бактериадьной инфекции растительной ткайи.

2. Получены трансГенные растений картофеля с геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона под контролем 35S промотора и промотора гена экстенсина моркови сорта Львовякка трансгенные растения картофеля с геном белка оболочки Х-нируса картофеля в прямой ориентации относительно 35S промотора и промотора гена экстенсина Моркови, и в обратной ориентации относительно 35S промотора сортов Зарево, Свитанок, Темп и Львовянка.

3. Растения, полученные в результате генетической трансформации в большинстве своем сохраняют характерные фенотипическко признаки исходных сортов и имеют типичный тетраплоидный набор хромосом.

4. Растения картофеля с геном человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона обладают менее выраженной устойчивостью К заражению Х-вирусом картофеля, чем трансгенные растения картофеля с геном белка оболочки Х-вируса картофеля.

5. Епервые покавано, что растения с геном белка оболочки как в прямой так и в обратной ориентации относительно промотора способны к эффективному подавлению вирусной инфекции при значительных инфекционных нагрузках.

6. Полевые испытания трансгенных растений картофеля свидетельствуют о том, что данные трансгенные растения не уступал по урожайности исходным нетрансформированным растениям соответствующих сортов.

Список работ, опубликованных по теме- диссертации.

1. Глагоцкая Т. Ц., Захарьев Е11, Сидоров В. А. Особенности генетической трансформации картофеля. Современные методы и подходы в селекции растений. - Кишинев: Шгиинца. - 1991. - С. 47- 50.

2. Глагоцкая Т. Ц., Сидоров В. А., Шульга О. А., Захарьев Е U., Скрябин К. Г., Глеба Ю. Ю. Анализ экспрессии чужеродного гена белка оболочки Х-вируса картофеля у ряда сортов картофеля // Тез. док. Всесоюзной конференции " Новые направления биотехнологии Пуши-

НО, 1990. - С. ?.

3. Глагоцкая Т. Ц., Щульга О. А., Сидоров 'а А. , Захарьев Е Я , Скрябин К. Г., Глеба Ю. Ю. Трансгенные растения картофеля с эндогенным белком оболочки Х-вируса картофеля // Докл. АН СССР. -1930. - Т. 314, N 5. - С. 1240-1242.

4. Глагоцкая Т.Д., Щербатенко и. С., Сидоров В. А., Щудь-. га 0. А., -Захарьев а М., Скрябин К. Г., Глеба Ю. а Трансгенные растения картофеля, обладающие устойчивостью к вирусной инфекции // Докл. АН УССР. - 1930. - N 10, серия В. - С. В7-Б9.

5. Глагоцкая Т. Ц., Сидоров Е А., Гиэатуллин Р. 3., Эахарьев а М., Скрябин Н. Г., Глеба Ю. а Анализ интеграции и экспрессии человеческого лейкоцитарного альфа-2 интерферона в растениях картофеля // Тез. док. I Всесоюзного симпозиума " Новые методы технологии растений " , Пущино, 1991. - С. 14.

6. Sldorov V.A., Saroylov V.M., BlagotsKaya Т.Тз., Gleba Y. Y. Gens tic modification of potato oultiVars by meana ûf cybridization and transforrration // International Congres3 on Plant Tissue and Celi Culture, Areterdani, June 24-29, 1990. -

7. Sidorov V. A., Sarroylov V. M, Glagotskaya T. Ts., Gleba Y. Y. Foreign cytoplasm and sinijle genes transfer to potato via protoplast fusion and transformation // 8th International Protoplast Symposium, Uppsala, June 16-20, 1991. - P. A32.

P. 221